LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKULAR

“ Ekstraksi DNA, Reaksi Berantai Polimerase PCR

dan Electroforesis ”

Oleh :

Ayu Wulan Sari

(201138015)

PROGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI PAPUA

MANOKWARI

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Komponen utama kromosom pada eukariota adalah molekul DNA dan protein

histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari

DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA.

DNA yang dijumpai di nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang

terdapat dalam sel di luar nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA

plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal.

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA terdapat

di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Ada perbedaan di antara ketiga lokasi

DNA ini, yaitu: DNA nukleus berbentuk linear dan berhubungan sangat erat

dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk

sirkular dan tidak berhubungan dengan protein histon.

DNA memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung komponen-

komponen gula pentosa, gugus fosfat, dan pasangan basa nitrogen. Satu sel

memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada

keturunannya.

Langkah pertama untuk mendapatkan DNA baik untuk kepentingan rekayasa

genetika, forensik maupun molekular lainnya tahap awal yang akan dilakukan

yaitu ekstraksi DNA, Reaksi Berantai Polimerase dan Electroforesis yang akan di

praktekkan pada praktikum kali ini.

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan praktikum biomolekular kali ini yaitu :

1. Mempelajari bagaimana mengekstraksi DNA

2. Mempelajari bagaimana proses ekstraksi DNA

3. Mempelajari bagaimana mengampiifikasi fragmen DNA.

4. Mempelajari bagaimana kerja PCR.

5. Mempelajari bagaimana melakukan analisis dengan gel agarosa dan

poliakrilamida

6. Mempelajari bagaimana kerja elektorofresis gel agarosa dan bagaimana

menentukan ukuran fragmen DNA.

7. Mempelajari bagaimana Electroforesis gel poliakrilamida bekerja.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA adalah prosedur umum memisahkan dan mengumpulkan

DNA untuk analisis rekayasa genetika, forensik, bioinformatika, komputasi,

analisis asal-usul dan antropologi. Ada beberapa teknik ekstraksi yang umum

digunakan dalam DNA teknologi termasuk teknik Chelex. Teknik ini

dikembangkan tahun 1991 dan hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR.

Meskipun memiliki keterbatasan, teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan

efektif untuk ekstraksi DNA. Metode chelex disarankan untuk preparasi DNA

karena tidak membutuhkan tabung-tabung untuk transfer. Metode ini cepat dan

menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks

PCR. Metode ini menjamin untuk menghasilkan sampel kecil sehingga disarankan

untuk semua sampel yang diuji dengan berbagai ukuran dan volume sampel.

Prinsip dasar Ekstraksi DNA adalah mengeluarkan DNA dari set. Teknik yang

biasa digunakan adalah teknik Chelex umumnya tekik ini mengeluarkan DNA

untai tunggal menggunakan prosedur penambahan suspensi "resin-chela" secara

langsung untuk spesimen (darah, noda darah, semen sebagai contoh) kemudian

melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen, magnesium. Dalam

tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya.

2.1.1 Tahap Ekstraksi DNA

Ada beberapa tahap dasar dalam ekstraksi DNA, yang rinciannya dapat

berbeda tergantung jenis sampel dan senyawa yang mempengaruhi ekstraksi dan

analisis lanjut. Berikut ini tahap-tahapnya yaitu:

- Memecahkan sel (lisis) melalui sonikasi, dan menghancurkan

lipid membran dengan penambahan detergen seperti SDS. Melakukan

vorteks dengan fenol (kadang-kadang dipanaskan) sering efektif untuk

memecahkan protein dinding sel.

- Mengeluarkan sel dan protein histon yang terikat dengan DNA melalui

penambahan protease dalam presipitasi dengan garam atau asetat

ammonium, atau dengan menggunakan ekstrasi fenol-ktoroform.

- Presipitasi DNA dalam etanol atau isopropanol dingin, DNA dapat larut di

dalam alkohol dan berikatan bersama, tahap ini juga melepaskan garam.

- Cuci pelet DNA dengan alkohol taq dan sentrifugasi untuk mendapatkan

kembali peletnya.

- Melarutkan DNA dalam buffer alkalin

Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memanaskan sejumlah

jaringan dalam larutan Chelex. Pemanasan tersebut membantu memecahkan sel

dan mendenaturasi protein. Chelex melindungi sampel dari DNAse dan mencegah

sampel dari kontaminan.

2.2 Reaksi Berantai Polimerase PCR

Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah teknik in vitro yang dapat

mengampiifikasi bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA

yang telah diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler

untuk isolasi dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran

DNA melalui replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup (seperti

E.coli atau ragi). Karena PCR merupakan teknik in vitro, teknik ini dapat

digunakan tanpa memotong DNA dan dapat dimodifikasi secara ekstensif untuk

mengikuti aturan luas manipulasi genetik.

PCR ditemukan oleh Kary Muilis tahun 1983. PCR menjadi teknik umum

yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai

keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit turunan, identifikasi

sidik-jari genetik (digunakan dalam pengujian forensik dan paternitas), deteksi

dan diagnosis penyakit infeksi dan pembentukan organisme transgenik. PCR juga

digunakan dalam biosistematika, biologi populasi, biologi konservasi, ekologi,

biologi perkembangan, dan genetika.

Keuntungan menggunakan PCR adalah (1) deteksi dan identifikasi

mikroorganisme secara cepat pada frekuensi yang sangat rendah, mikroorganisme

simbiotik, dan individu ikan dan larva avertebrata; (2) analisis cepat genom

individu untuk mempelajari populasi; (3) deteksi dan analisis "kejadian langka"

yang terjadi pada fraksi sel kecil dalam sampel jaringan atau koleksi lapangan;

dan (4) menduga kualitas air melalui deteksi virus, bakteri, dan/atau parasit

pathogen. Keuntungan lain PCR adalah mengurangi keperluan kultur yang sering

ditemukan untuk spesies atau jenis mikroba yang tidak dapat dikultur untuk

kepentingan ekologi atau biogeokimia.

2.2.1 Prinsip Dasar PCR

PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen tunggal, bagian gen, atau

urutan non-kode DNA. PCR akan membuat sekitar 40 milyar salinan dan DNA

cetakan. Kebanyakan metode PCR dapat mengamplifikasi fragmen DNA sampai

10 kilo pasang basa (kb), meskipun beberapa teknik dapat mengamplifikasi

fragmen berukuran sampai 40 kb. PCR biasanya terdiri atas 20 sampai 35 siklus.

Kebanyakan PCR dilakukan dalam tiga tahap, yang didahului satu suhu tetap

untuk awal dan diikuti satu suhu lagi untuk akhir. Tahap-tahap tersebut yaittu:

1. Tahap Inisiasi. Sebelum tahap inisiasi reaksi PCR sering dipanaskan pada

suhu 94-96°C (atau 98°C jika menggunakan polimerase termostabil),

selama 1-9 menit. Ini berguna untuk menjamin banyak cetakan DNA dan

primer terdenaturasi yaitu putusnya ikatan hidrogen basa-basa komplemen

rantai DNA untuk menghasilkan rantai tunggal DNA. Beberapa

polimerase PCR juga membutukan kondisi tahap ini untuk aktivasi (PCR

awal-panas). Setelah itu, mulai siklus dengan tahap satu pada 94-98°C

selama 20-30 detik (tahap denaturasi).

2. Tahap annealing. Dalam tahap ini suhu diturunkan sehingga primer

dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal. Gerakan Brownian

menyebabkan primer bergerak di ikatan hidrogen DNA - DNA yang

secara konstan dibentuk dan diputuskan antara dan cetakan. Ikatan stabil

hanya terbentuk bila urutan primer sangat dengan urutan cetakan. Bagian

pendek rantai ganda ini dikatalisis oleh polimerase untuk memulai sintesis

DNA. pada tahap ini bergantung pada suhu primer dan biasanya antara 50-

64 °C selama 20-40 detik.

3. Tahap ekstensi/pemanjangan yaitu polimerase memperpanjang rantai

DNA yang komplemen dengan rantai cetakan. Suhu pada tahap ini

bergantung pada DNA polimerase yang digunakan. Polimerase Taq

mempunyai suhu optimum 70-74°C. Umumnya reaksi ini menggunakan

suhu 72°C. DNA polimerase melakukan kondensasi 5'- fosfat dNTP

dengan gugus 5'- hidroksil ujung awal rantai DNA yang komplemen

dengan cetakan dalam arah 5' ke 3'. Pemanjangan bergantung pada

DNA polimerase dan panjang bagian DNA akan diamplifikasi. Tahap

elongasi akhir selama 5-15 menit (tergantung panjang cetakan DNA)

setelah siklus terakhir digunakan untuk menjamin DNA rantai tunggal

sisa diperpanjang seluruhnya. Akhimya jaga suhu 4-15°C selama waktu

terbatas untuk penyimpanan singkat seiama reaksi misalnya jika reaksi

dikerjakan semalam.

2.3 Electroforesis

Electroforesis adalah teknik laboratorium untuk memisahkan molekul

bermuatan. "Gel" merujuk pada matriks yang digunakan untuk memisahkan

molekulnya. Gel Electroforesis digunakan dalam forensik, biologi molekuler,

genetika, mikrobiologi dan biokimia. Electroforesis gel memisahkan asam

deoksiribonukleat, asam ribonukleat, dan protein melalui muatan listrik. Metode

ini biasanya digunakan untuk tujuan analitik, tetapi dapat digunakan sebagai

teknik preparasi untuk memurnikan molekul sebelum menggunakan metode lain

untuk karakterisasi lanjut seperti spektrometri massa, PCR, kloning, pengurutan

DNA, atau imunobloting.

Prinsip Dasar Electroforesis berhubungan dengan gaya gerak Iistrik yang

digunakan untuk mendorong atau menarik molekul melalui matriks gel. Molekul

bermuatan yang ditempatkan di dalam "sumur" gel dan dialiri arus listrik akan

bergerak melalui matriks dengan kecepatan berbeda, menuju anoda jika

bermuatan negatif atau menuju katoda jika bermuatan positif (catatan bahwa

Electroforesis gel bekerja sebagai sel listrik; anoda bermuatan positif dan katoda

bermuatan negative).

BAB III

METODE

3.1 Waktu dan Tempat

- Waktu : pukul 10.20- 12.30 WIT

- Tanggal : 3, 5 dan 6 Desember 2013.

- Tempat : Laboratorium Bioteknologi, Universitas Negeri Papua.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Ekstraksi DNA :

1. Mikro tube & Box sampel

2. Pinset

3. Lampu Bunsen

4. Gelas piala

5. Cawan petri

6. Freezer

7. Alat tulis & buku

8. Kamera

9. Vortex shaker

10. Block pemanas

11. Spiner

Bahan :

1. Alkohol 96%

2. Sampel Udang Galah

3. Kertas label

4. Lembar kerja Chelex

5. Larutan Cheelex 10%

6. ddH2O

7. Tisyu

8. Sarung tangan

3.2.2 Alat PCR :

1. Mesin PCR

2. Mikropipet & tip berbagai

ukuran (0,5-10 µl, 10-100µl,

100-1000 µl)

3. Mikro tube & Box sampel

4. Alat tulis dan buku

5. Kamera

Bahan :

1. ddH2O : 14.3 µl

2. MgCl2 : 2.0 µl

3. Primer 1 10mm : 1.25 µl

4. Primer 2 10mm : 1.25 µl

5. Enzim Amplitag : 0.125 µl

6. Sampel DNA template

7. Tisyu

8. Sarung tangan

3.2.3 Alat Electroforesis :

1. Termo scienific

2. Sisir agarose

3. Mikropipet & tip

4. Mesin electroforesis

5. Uv Transluminator

Bahan :

1. Agarose

2. Buffer

3. PCR Produk/ sampel DNA

4. Parafilm

5. Leader (One KB)

6. Timbangan analitik

7. Kotak gel dan sisir

8. Labu erlenmeyer

9. Gelas ukur

10. Microwave

11. Kamera

12. Alat tulis dan buku

6. Pewarna (loading die)

7. Tisyu

8. Sarung tangan

9. Masker

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Cara Kerja Ekstraksi DNA

1. Isilah lembar kerja chelex yang sudah disediakan sesuai petunjuk.

2. Ambillah tabung yang berisi 300 µl chelex 10% dari lemari pendingin.

Setiap sampel menggunakan satu tabung chelex, ditambah satu tabung

untuk kontrol. Gunakan sarung tangan dan ambillah larutan chelex

sesuai kebutuhan.

3. Tandai setiap tabung yang berisi chelex menggunakan drawing pen

pada sisi atas dan samping, sesuai dengan ID daftar sampel dalam

lembar kerja chelex dan tanggal.

4. Tuangkan alkohol 96% kedalam gelas piala untuk merendam pinset

yang akan digunakan untuk mengambil sampel. Angkat dan panaskan

di atas lampu bunsen. Lakukan hal sama sebanyak 3-4 x.

5. Setelah itu ambil sampel udang galah sebesar titik (sekecil mungkin)

pada bagia dagingnya. Kemudian masukkkan kedalam tabung yang

berisi chelex.

6. Hidupkan heating block atur suhunya hingga 95ºC. Dan masukkan

sampel DNA kedalam heating block selama 30 menit.

7. Angkat sampel DNA kemudian masukkan kedalam mesin Vortex

selama 15 detik tujuannya untuk menghomogenkan zat yang belum

tercambur rata.

8. Setelah di vortex sampel kemudian di Spin selama 10 detik. Angkat

dan bandingkan dengan hasil awal. Maka akan terdapat supernatan dan

chelex yang terpisah pada mikrotube.

3.3.2 Cara Kerja PCR

1. Keluarkan reagen: Air, dNTP, buffer PCR, MgCl2, Primer 1, dan

Primer 2 dari freezer agar mencair.

2. Isi lembar kerja PCR dengan tanggal, jumlah sampel, tipe ekstraksi,

dan catatan lain.

3. Gandakan volume dari protokol baku dengan ID, Tanggal bekerja,

Primer (dimana ID (Identitas peneliti) + Tanggal bekerja + Primer +

kontrol positif PCR + kontrol negatif Chelex).

4. Tandai dan nomori tabung PCR dalam rack. Atur sampel sehingga

berada dalam pola yang berhubungan dengan tabung PCR yang

ditandai. Atur tabung ekstra untuk kontrol.

5. Setelah bahan cair, jentikkan setiap tabung dengan jari untuk

mencampur, kocok isi hingga dasar tabung. Bila reagen hampir habis,

sentriguasi tabung untuk mendapatkan cairan sisa.

6. Buat Campuran Master Mix (MM) 1 gunakan mikropipet DNA,

tambahkan bahan sesuai dengan volume yang telah dihitung dalam

daftar di lembar PCR di tabung 1.5 ml. Gunakan tip berbeda untuk

setiap penambahan reagen untuk menjaga agar tidak kontaminan. Pipet

naik dan turun untuk mencampur reagen sepenuhnya.

7. Gunakan mikropipet DNA, buat Campuran Master Mix (MM) 1 dalam

tabung 1.5 mL terpisah, tetapi jangan tambahkan Taq. Gunakan tip

berbeda untuk setiap penambahan reagen. Pipet naik turun untuk

mencampur reagen sepenuhnya.

8. Gunakan mikropipet DNA, bagi 14 µl (MM) 2 ke dalam setiap tabung

PCR. Gunakan tip sama seluruhnya. Pipet ke dasar tabung dan untuk

menghindari gelembung pipet agak jauh dari dasar tabung.

9. Pindahkan DNA ekstrak Chelex dari ruang pendingin dan jika

sentrifugasi singkat untuk menghilangkan kondensasi dan/atau

konsentrat butiran chelex. Gunakan pipet DNA rendah, tambahkan 1

pipet DNA ekstrak untuk setiap tabung. Sampel-sampel ini termasuk

DNA ekstrak, kontrol positif PCR dan control negative Chelex. Ambil

dari atas setiap ekstrak Chelex karena tambahan butiran Chelex akan

menghambat Ganti tip untuk setiap sampel.

10. Ambil enzim Taq dan dengan hati-hati tambahkan Taq ke MM 2. Pipet

naik turun untuk mencampur.

11. Pindahkan tabung-tabung PCR sebelum memulai merunning PCR

kemudian tambahkan MM 2 ke setiap tabung sampel dan gunakan tip

yang berbeda pada setiap sampel.

12. Pilih dan mulai program PCR, setelah mesin PCR mulai membaca

tinggalkan mesin dan tunggu hingga prosesnya selesai.

13. Setelah selesai, simpan sampel pada lemari pendingin.

3.3.3 Cara Kerja Electroforesis

- Cara pembuatan Gel agarose 2 %

1. Timbang agarose sebanyak 0,8 gram dan masukkan kedalam

erlenmeyer.

2. Ukur larutan buffer sebanyak 40 ml dan tambahkan kedalam

erlenmeyer.

3. Masukkan ke dalam microwave dan tunggu hingga larutan berubah

menjadi jernih.

4. Setelah larutan menjadi jernih tuang larutan tersebut kedalam tangki

Electroforesis dan masukkan cetakan sisirnya. Tunggu hingga agar

mengeras.

5. Setelah agar mengeras, pindahkan kedalam tangki Electroforesis

khusus media Buffer, biarkan agar terendam air.

- Cara electroforesis

1. Secara perlahan-lahan tuang pewarna biru (loading die) diatas

parafilm sebanyak jumlah sampel. Ambil sampel satu-persatu dan

mix sampel DNA yang telah di PCR dengan pewarna.

2. Masukkan kedalam sumur/lubang sisir secara bergantian hingga

selesai. Selalu gunakan tip yang baru.

3. Pada ujung bagian depan, tmbahkan leader One KB sebangai penanda.

4. Tunggu running electroforesis selama 30 menit dengan kekuatan 200

volt dan kecepatan 72 ampere.

5. Setelah sampel selesai di running, masukkan gel kedalam larutan EtBr

selama 15 menit. Hati-hatilah dan gunakan sarung tangan yang tebal

saat ingin mencelupkan gel kedalam EtBr karena larutan tersebut

merupakan zat beracun dan karsinogenik.

6. Bilas kedalam air dan tunggu selama 10 menit.

7. Ambil gel dari rendaman air dan letakkan gel di atas UV

Transluminator untuk melihat hasil electroforesis apakah ben dari

sampel DNAnya terlihat/ tidak.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.2 Hasil Ekstraksi DNA

Sampel

Code UGMK (02, 03, 04 & 07) Hasil Ekstraksi DNA

Udang Galah asal Merauke

4.1.3 Hasil PCR

Gambar Keterangan

Setelah keluar dari mesin PCR

Sampel yang telah diberi reagen MM1

kemudian dimasukkan kedalam mesin

PCR. Setelah itu ditambahkan reagen

MM2. Kemudian di running sesuai

prosedur.

4.1.4 Hasil Electroforesis

Gambar Hasil pengamatan

Setelah dibuat agarose dan

memasukkan sampel DNA

kedalam lubang-lubang yang telah

dbuat, ternyata sampel DNA yang

diinginkan belum terbaca. Dapat

dilihat pada gambar disamping

bahwa yang tapak hanyalah

ben/pita dari Leader One KB saja

sedangkan pada sampel DNA tidak

tampak pitanya. Dengan kata lain

hasil ekstraksi DNA pada

praktikum kali ini GAGAL.

Supernatan

Chelex

Dilihat menggunakan sinar UV

Dilihat menggunakan sinar UV

Perbandingan hasil electroforesis

yang telah dibuat sebelumnya

sangat berbeda dengan hasil

praktikum, dapat dilihat pada

gambar disamping bahwa ben/pita

terlihat sangat jelas pada agarose,

dan dapat dihitung bahwa pita

tersebut berada pada urutan ke 7

yang berarti 700pb.

4.2 Pembahasan

Pada praktikum kali ini tahap pertama yang dilakukan yaitu Ekstraksi

DNA, tahap ini dimulai dengan mengisi lembar kerja chelex, preparasi alat dan

bahan antara lain, dalam bekerja di Laboratorium Bioteknologi, semua praktikan

diwajibkan memakan sarung tangan, tujuannnya agar melindungi diri dari zat-zat

berbahaya dan juga sebagai syarat utama agar semua yang akan kita kerjakan

selalu aseptis, setelah memakai sarung tangan kita dapat menyiapkan chelex dan

ddH2O dan memasukkannya kedalam tabung mikrotube dan sedikit chelex

kemudian mencampurnya kedalam mikrotube. Sampel yang akan kita pakai untuk

ekstraksi DNA yaitu sampel Udang Galah asal Merauke, oleh karena itu kode

untuk tabung di tuliskan UGMK dan nomor dari sampel udang tersebut contoh

(UGMK 03). Sesudah memberi ID dan Tanggal praktikum, kita dapat merendam

pinset kedalam alkohol 96% yang akan digunaan untuk mengambil sampel udang,

tujuan perendaman yaitu untuk mensterilkan pinset agar saat bekerja tidak terjadi

kontaminan dan menyebabkan DNA tidak terbaca. Hal ini sangat penting karena

untuk ke tahap selanjutnya, langkah dasar yang paling utama adalah menjaga agar

setiap alat yang akan kita gunakan steril. Setelah memastikan pinset yang akan

kita gunakan telah terendam alkohol dan telah dipanaskan dibunsen, kita dapat

mengeluarkan sampel dari botolnya dan meletakkan diatas cawan petri, kemudian

mengambil sampel udang sebesar titik di bagian dagingnya, sampel dapat

langsung dimasukkan kedalam mikrotube begitu seterusnya hingga sampel Udang

habis. Sesudah mengambil daging udang, langkah selanjutnya yaitu memasukkan

sampel kedalam hot block suhu diatur 94ºC selama 30 menit, tujuan sampel

100 pb

700 pb

dipanaskan yaitu agar membantu memecahkan sel dan mendenaturasi protein serta

mengaktifkan beberapa enzim yang hanya akan aktif jika dengan suhu yang

panas. Dengan begitu DNA dapat memisah dengan reagen chelex. Setelah di

panaskan hingga 30 menit, sampel dapat di vortex selama 15 detik dan di shaker

selama 10 detik, tujuannya yaitu mencegah adannya gelembung pada sampel dan

mengembalikan pelet. Sampel yang telah diekstraksi dapat dilihat hasilnya terlihat

bahwa chelex berada dibawah dan supernatan/ DNA berada di atas. Mengapa

dapat terjadi 2 pemisahan? Karena chelex merupakan reagen yang membantu

DNA terdenaturasi sehingga dapat melisis dan terpisah dari substratnya. Hasilnya

yaitu supernatan/ DNA yang akan diambil untuk tahap selanjutnya yaitu

Polimerase Chain Reaction/ Reaksi Berantai Polimerase (PCR). Supernatan

berada diatas karena berat molekul DNA yang lebih ringan dibandingkan dengan

chelex.

Adapun prinsip dasar dari Ekstraksi DNA yaitu:

- Memecahkan sel (lisis) melalui sonikasi, dan menghancurkan

lipid membran dengan penambahan detergen seperti SDS. Melakukan

vorteks dengan fenol (kadang-kadang dipanaskan) sering efektif untuk

memecahkan protein dinding sel.

- Mengeluarkan sel dan protein histon yang terikat dengan DNA melalui

penambahan protease dalam presipitasi dengan garam atau asetat

ammonium, atau dengan menggunakan ekstrasi fenol-ktoroform.

- Presipitasi DNA dalam etanol atau isopropanol dingin, DNA dapat larut di

dalam alkohol dan berikatan bersama, tahap ini juga melepaskan garam.

Memisahkan DNA dari set, biasannya menggunakan teknik chelex. Teknik ini

telah dikembangkan sejak tahun 1991 sebagai langkah awal untuk tahap PCR,

teknik chelex dikenal lebih cepat, efektif dan murah Metode chelex disarankan

untuk preparasi DNA karena tidak membutuhkan tabung-tabung untuk transfer

dan Chelex melindungi sampel dari DNAse dan mencegah sampel dari

kontaminan.

Tahap kedua yaitu Reaksi Berantai Polimerase (PCR) Proses PCR merupakan

proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh

enzim DNA polimerase. Enzim ini tahan sampai temperature mendidih 100°C,

dan aktifitas maksimal pada temperatur 70-72°C. Dasar siklus PCR yang utama

merupakan siklus berulang 30-35 siklus meliputi:

a) Denaturation; suhu yang dibutuhkan adalah (95°C) pada suhu ini akan

terjadi denaturasi yaitu terputusnya ikatan hidrogen basa-basa komplemen

rantai DNA pada dua untai DNA template menjadi untai DNA tunggal.

Dalam siklus ini dibutuhkan waktu ± 30 detik.

b) Annealing; pada tahap ini suhunya akan turun menjadi (55–60°C),

diharapkan primer dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal/

DNA template, suhu annealing ditentukan oleh susunan primer.

Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting

Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template. Waktu yang

dibutuhkan ± 30- 40 detik.

c) Extension/ pemanjangan; suhu yang dibutuhkan antara (72°C), pada tahap

ini DNA polimerase melakukan kondensasi 5'- fosfat dNTP dengan gugus

5'- hidroksil ujung awal rantai DNA yang komplemen dengan cetakan

dalam arah 5' ke 3'. waktu yang dibutuhkan tergantung dari panjang atau

pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk amplifikasi.

Dibawah ini merupakan gambar siklus PCR

Keteragan :

A : tahap Denaturasi, suhunya akan naik 94-95ºC.

B : tahap Anneling, suhunya akan turun pada 50ºC

C : tahap Ekstensi, suhunya akan naik lagi menjadai 72ºC

D : siklusnya di ulang sebanyak 38 x

A

B

C

D

Tahap terakhir yaitu Electroforesis, Electroforesis adalah teknik

laboratorium untuk memisahkan molekul bermuatan. "Gel" merujuk pada matriks

yang digunakan untuk memisahkan molekulnya. Electroforesis gel memisahkan

asam deoksiribonukleat, asam ribonukleat, dan protein melalui muatan listrik.

Pada tahap ini langkah pertama yang dilakukan yaitu membuat cetakan DNA

template dari Agarose. Komposisi cetakan yaitu Agarose/ agar sebanyak 0,8 gram

dan buffer/ larutan penyangga sebanyak 40 ml. Semua komponen dicampur jadi

satu kedalam erlenmeyer dan dipanaskan kedalam microwave hingga warnanya

yang putih berubah menjadi jernih. Setelah terjadi perubahan warna agarose dapat

dituang kedalam tangki electroforesis dan dipasang sisir cetakan DNA template.

Tunggu selama 15-30 menit hingga agar mengeras, angkat sisir cetakan dan DNA

template hasil running PCR dapat di masukkan kedalam sumur-sumur. Sebelum

dimasukkan kedalam tiap-tiap sumur, mix DNA template di atas kertas parafilm

dengan pewarna Loading die agar tampak jelas terbaca ketika di masukkan

kedalam mesin electroforesis, dalam mengerjakan hal ini perlu diperhatikan

kecermatan dalam mengemix pewarna dan DNA template, mengganti tip dan

dalam mengambil DNA template agar tidak salah. Setelah semua sampel DNA

dimasukkan kedalam sumur, langkah terakhir yaitu memasukkan Leader One KB

pada depan sumur sebagai penanda.

Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat

bermigrasinya molekul. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada

tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang dipakai dalam

elektroforesis kali ini yaitu gel. Gel ada yang bermacam-macam ada yang dapat

berupa pati, agarose ataupun poliakrilamid. Namun yang kita pakai dalam

electroforesis kali ini adalah agarose. Matriks agarose berfungsi untuk

memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH buffer agar muatan

protein tidak berubah.

Setelah preparasi agarose selesai, Mesin electroforesis dapat dinyalakan

dengan tegangan 200 Volt dengan kecepatan 72 Ampere selama 30 menit. Pada

saat proses elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda

negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel agarose

tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka

semakin jauh pula protein bergerak dengan kata lain mobilitisnya tinggi.

Sebaliknya, protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak

yang lebih pendek dengan kata lain mobilitisnya rendah. Berbagai jenis

protein pada suatu sampel akan terseparasi (terpisah-pisah) pada gel agarose

tergantung pada mobilitasnya. Protein dengan mobilitas tinggi akan berhenti

bergerak pada bagian yang lebih bawah gel, sedangkan protein dengan mobilitas

rendah cenderung berhenti bergerak pada bagian atas gel. Dengan demikian, pada

jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein (disebut sebagai band

atau pita protein) yang sudah terseparasi berdasarkan berat molekulnya.

Namun dalam praktikum kali ini, band tidak terlihat pada gel penyangga

agarose hal tersebut dikarenakan perbedaan nyata antara pita dipengaruhi oleh

persentase agarose, waktu electroforesis, konsentrasi Etidium bromide, derajat

superkoil dan ukuran serta kompleksitas DNA. Sedangkan pada sampel hasil

electrforesis yang sudah ada, tampak terlihat jelas bahwa band/pita terbaca pada

gel. Bisa di karenakan presentase agarosenya yang tepat, atau menggunakan gel

poliakrilamid yang khusus untuk membaca protein. Dalam praktikum Ekstraksi,

PCR dan Electroforesis memang harus dilakukan secara berulang-ulang agar

mendapatkan hasil yang maksimal, karena keterampilan dalam bekerja

dilaboratorium sangat dibutuhkan dalam mengerjakan sampel DNA.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam

langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan,

akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara

signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk

ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis

sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam

bergantung pada jenis jaringan (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari

sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak

Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan

amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh

Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk

mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa

jam.

Electroforesis adalah teknik laboratorium untuk memisahkan molekul

bermuatan. "Gel" merujuk pada matriks yang digunakan untuk memisahkan

molekulnya. Prinsip Dasar Electroforesis berhubungan dengan gaya gerak Iistrik

yang digunakan untuk mendorong atau menarik molekul melalui matriks gel.

Dari hasil praktikum Ekstraksi DNA, PCR dan Electrofresis didapat hasil

yaitu pada gel agarose tidak terbaca band/pitanya, hal tersebut dapat dikarenakan

kurangnya keaseptisan saat bekerja, kurang cermat dalam memberi reagen/enzim

serta dikarenakan perbedaan nyata antara pita dipengaruhi oleh persentase

agarose, waktu electroforesis, konsentrasi Etidium bromide, derajat superkoil dan

ukuran serta kompleksitas DNA.

5.2 Saran

1. Dalam melakukan teknik PCR harus dilakukan dengan sangat hati-hati dan

aseptis agar sampel yang akan di running akan tampak pada saat

electroforesis.

2. Sebaiknya dalam melalukan suatu pekerjaan Ekstraksi, PCR dan

Electroforesis dilakukan dengan serius agar hasil yang didapat

memuaskan.

3. Perlu dilakukan latihan berulang-ulang agar didapat hasil (terbacanya pita

DNA) pada gel agarosa.

DAFTAR PUSTAKA

Binur, Robbi. 2013. Penuntun Praktikum Biologi Molekular. Jurusan Biologi .

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Negeri

Papua. Manokwari.

Fatchiyah, dkk. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekular.

Jurusan Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Universitas Brawijaya. Malang.