TUGAS KELOMPOK BIOTEKNOLOGI

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

KELOMPOK

1. Devianti (10060308082)

2. Sri Eli (10060308083)

3. Iin Indrayani (10060308085)

4. Vina Nur Syaidah (10060308110)

5. Dani Febrian (10060308106)

6. Sendi (10060308105)

DOSEN : Dina Mulyanti,S.Si., Apt.

LABORATORIUM ANATOMI FISIOLOGI MANUSIA

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG

2010

Penyebaran penyakit yang disebabkan oleh bakteri Streptococcus pyogenes

dapat dicegah dengan mengadakan/membuat suatu vaksin yang menghalau infeksi oleh

bakteri tersebut. Vaksin untuk pencegahan terhadap infeksi S. Pyogenes diperoleh dari

memproduksi protein Lmb yang dimiliki oleh bakteri tersebut dengan menggunakan

Teknologi DNA rekombinan.

Teknologi DNA rekombinan yang dilakukan adalah jenis kloning gen. Pada

tahap awal yang dilakukan adalah dengan menyiapkan dua jenis DNA yaitu DNA

sisipan (yang dapat berasal dari kromosom) dimana dalam hal ini berasal dari

S.pyogenes dan plasmid ( yang berfungsi sebagai kendaraan, vehicle, vektor) yang

membawa DNA sisipan dimana dalam hal ini adalah vektor pGEM-T Easy. Kemudian

DNA kromosom dari S.pyogenes dipotong oleh suatu enzim restriksi, yaitu suatu enzim

endonuklease yang mengenali urutan spesifik pada DNA. DNA plasmid (vektor pGEM-

T Easy) dipotong dengan enzim restriksi yang sama sehingga plasmid yang asalnya

berbentuk sirkuler menjadi linier. Hasil pemotongan DNA kromosom diligasi oleh

DNA ligase (merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester

dari hasil pemotongan oleh enzim restriksi) terhadap DNA plasmid linier untuk

membentuk DNA sirkuler yang mengandung DNA sisipan. DNA yang telah

mengandung DNA sisipan ini disebut DNA rekombinan.

Untuk melakukan teknologi DNA rekombinan diperlukan peta plasmid. Pada

gambar adalah peta salah satu plasmid pGEM-T. Plasmid ini adalah plasmid linier yang

mempunyai basa T pada ujung 3’nya. Dari peta plasmid ini dapat diketahui bahwa

pGEM-T mempunyai ori (untuk replikasi), gen pengkode resistensi ampisilin (gen b-

lactamase, gen bla) dan gen lacZ. Gen pengkode resistensi berfungsi sebagai marka

seleksi untuk mengetahui apakah sel inang telah mengandung plasmid rekombinan. Gen

lacZ adalah marker untuk mengetahui apakah plasmid telah mengandung DNA sisipan.

Selain itu, plasmid pGEM-T mengandung multiple cloning site (MCS) yang digunakan

untuk menyisipkan DNA sisipan. MCS mengandung beberapa situs yang dikenali oleh

enzim restriksi. Produk PCR yang dihasilkan menggunakan enzim Taq mempunyai 1

basa A pada ujung 3’nya. Basa T ekstra pada ujung 3’ di pGEM-T digunakan untuk 2

tujuan, yaitu agar dapat disisipi produk PCR yang mempunyai 1 basa A pada ujung

3’nya dan untuk menghindari terjadinya self ligation (ligasi plasmid tanda DNA

sisipan).

Gambar 1. Plasmid pGEM-T Easy

Hasil ligasi (merupakan DNA rekombinan) kemudian ditransformasi dengan

proses heat shock atau elektroporasi ke dalam Escherichia coli (sel inang) dimana satu

sel inang hanya akan menerima satu molekul DNA rekombinan. Transforman (bakteri

berisi DNA rekombinan) ini akan membelah dan ketika pembelahan sel terjadi plasmid

ikut mereplikasi. Karena populasi tersebut berasal dari 1 sel yang mengandung DNA

rekombinan tertentu maka akan dihasilkan klon. Transforman kemudian diseleksi

menggunakan metode seleksi Biru Putih untuk mengetahui apakah DNA sisipan

berhasil diligasi ke dalam vektor atau tidak. Gen lacZ pada MCS yang mengkode

galaktosidase dapat menguraikan X-Gal menjadi berwarna biru. Jika terdapat koloni

biru, maka DNA sisipan tidak terligasi. Sedangkan jika terdapat koloni putih, maka

DNA sisipan terligasi akibat gen lacZ rusak, galaktosidase tidak diproduksi sehingga X-

Gal tidak diuraikan.

Konfirmasi pGEM-T rekombinan dilakukan setelah memperoleh koloni biru

(tidak mengandung DNA sisipan) dan koloni putih (mengandung DNA sisipan),

plasmid masing-masing diisolasi dari kedua koloni tersebut. Plasmid kemudian

dielektroforesis dengan agarosa. Hasil elektroforesis plasmid hanya memberikan

informasi bahwa ukuran plasmid rekombinan > dari plasmid tanpa DNA sisipan.

Ukuran DNA sisipan hanya dapat diperoleh dari pemotongan menggunakan enzim

restriksi. Untuk mengetahui ukuran DNA sisipan, plasmid rekombinan dipotong dengan

dua enzim restriksi yang mengapitnya sehingga DNA sisipan dapat dipisahkan dari

vektornya. Hasil pemotongan menggunakan dua enzim restriksi yaitu EcoRI dan NdeI

memberikan dua pita yaitu pita pGEM-T Easy (bermigrasi lebih lambat karena

ukurannya 3015 pb) dan DNA sisipan (bermigrasi lebih cepat karena ukurannya lebih

kecil 921 pb). Hasil pemotongan dengan enzim restriksi hanya memberikan informasi

bahwa ukuran DNA sisipan yang kita inginkan adalah benar. Adapun DNA sisipan

mengandung DNA yang kita inginkan dalam hal ini adalah gen Lmb maka harus

dilakukan penentuan urutan nukleotida melalui sekuensing.