76936791 Teknologi DNA Rekombinan

download 76936791 Teknologi DNA Rekombinan

of 20

  • date post

    11-Dec-2014
  • Category

    Documents

  • view

    16
  • download

    5

Embed Size (px)

Transcript of 76936791 Teknologi DNA Rekombinan

TEKNOLOGI DNA REKOMBINANKhrismawan PENDAHULUAN Informasi keturunan diletakkan dalam urutan basa dari molekul-molekul DNA. Fragmen-fragmen DNA yang informasinya diubah menjadi molekul-molekul yang fungsional, dikenal sebagai gen. Urutan dari salah satu rantai DNA akan diterjemahkan melalui suatu proses transkripsi menjadi suatu urutan RNA yang komplementer. Molekul RNA yang terbentuk, berfungsi sebagai matriks untuk sintesa protein (mRNA) atau menerima fungsi tersendiri (rRNA, tRNA atau snRNA). Pada eukariot, hanya fragmenfragmen gen tertentu yang yang mengandung sandi genetik. Fragmen-fragmen ini disebut ekson. Diantara fragmen-fragmen ini terdapat fragmen yang tidak mengandung sandi genetik, yaitu intron. Setelah transkripsi, intron akan dipisahkan dari hnRNA yang pertama-tama terbentuk. Hal ini terjadi selama proses pematangan RNA yang memodifikasi kedua ujung RNA. RNA yang matang akan meninggalkan inti sel dan di dalam sitoplasma terikat dengan ribosom. Ditempat ini urutan RNA akan diterjemahkan kedalam urutan asam amino (protein) yang sesuai melalui proses translasi. Pada proses ini berperan tRNA yang mengenali urutan RNA tertentu. Sebelumnya, tRNA diberi muatan asam amino yang sesuai melalui proses aktivasi asam amino.1, 2 Pada pembelahan sel, informasi genetik akan diteruskan ke sel-sel anak, yaitu dengan cara membuat salinan dari keseluruhan DNA melalui proses replikasi. Jadi sel-sel anak mengandung molekul DNA yang identik dengan sel induk.1, 2 KROMATIN Didalam inti sel eukariotik, DNA berhubungan dengan protein-protein dan molekul-molekul RNA. Kompleks nukleoprotein ini dikenal sebagai kromatin. Hanya selama mitosis, kromatin berkondensasi menjadi kromosom yang terlihat dibawah mikroskop cahaya. Selama interfase, kondensasi kromatin tersebut melonggar secara menyeluruh. Secara morfologik dapat dibedakan eukromatin yang terbungkus rapat dan

1

heterokromatin yang terbungkus kurang rapat. Heterokromatin adalah tempat proses transkripsi berlangsung sangat aktif. 1, 3 Protein kromatin terdiri atas protein histon dan bukan histon. Histon merupakan suatu kelompok protein kecil yang bersifat basa kuat. Urutan asam amino histon pada semua sel eukariotik adalah sangat serupa. Histon berhubungan langsung dengan DNA. Protein ini turut membantu organisasi struktural kromatin. Selain itu, asam amino histon yang bersifat asam dan memungkinkan pengemasan yang rapat dari DNA didalam inti sel. Jadi 46 molekul DNA genom manusia yang diploid dapat ditempatkan di dalam inti sel menjadi molekul dengan diameter hanya 10 m. 1, 3 Setiap dua molekul histon dengan tipe H2A, H2B, H3 dan H4 membentuk suatu kompleks oktamer yang dibalut oleh 146 pasangan basa DNA dalam kurang lebih 13/4 putaran. Partikel-parikel dengan diameter 7 nm semacam ini dikenal sebagai nukleosom. DNA yang tidak langsung berhubungan dengan oktamer histon disebut DNA penghubung. Pada DNA-linker berikatan suatu histon lain yaitu H1. Histon H1 mendukung pembentukan struktur yang berbentuk seperti serabut-serabut dengan diameter 30 nm, yang dikenal sebagai kumparan. Kumparan sekali lagi membentuk pita dengan panjang kira-kira 200 nm. Ujung akhir setiap pita semacam ini terikat pada suatu struktur kerangka protein yang dikenal sebagai kerangka inti.1 Protein bukan histon sangat heterogen.Yang termasuk kelompok ini adalah protein struktural, begitu juga enzim dan faktor transkripsi. 1 REPLIKASI A. Cara kerja dari Polimerase DNA Untuk meneruskan informasi genetika pada perbanyakan sel, sebelum pembelahan sel harus dibuat satu salinan dari genom. Replikasi DNA dikatalisis terutama oleh enzim polimerase DNA yang tergantung pada DNA . Enzim ini memerlukan satu DNA untai tunggal yang disebut sebagai untai cetakan (matrixstrand) dan mensintesis untuai kedua yang komplementer, sehingga kembali dihasilkan suatu DNA heliks ganda yang lengkap. Substrat dari polimerase DNA adalah keempat deoksinukleosida trifosfat yaitu dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP. Setiap basa pada untai cetakan akan berikatan dengan nukleotida yang komplementer

2

melalui pemasangan basa yang spesifik. Kemudian gugus 3-OH dari nukleotida terakhir pada untai DNA yang sedang terbentuk bereaksi secara nukleofilik dengan residu -fosfat dari nukleotida baru ditambahkan. Reaksi ini menghasilkan suatu ikatan diester asam fosfat yang baru melalui pelepasan difosfat. Setelah enzim polimerase DNA bergeser ke basa berikutnya pada untai DNA cetakan, maka langkah-langkah tersebut akan terulang kembali. Mekanisme yang diterangkan ini mengungkapkan dengan sendirinya bahwa untai DNA cetakan dibaca dengan arah 3 5.1, 4 Sebagian besar sel mengandung lebih dari satu polimerase DNA. Selain enzim yang mengkatalisis replikasi sesungguhnya, terdapat polimerase yang berperan pada proses reparasi atau pada proses replikasi DNA mitokondria pada eukariot.1, 4 B. Replikasi pada E. Coli Saat ini telah diketahui gambaran yang tepat mengenai proses replikasi pada prokariot, sementara pada eukariot masih banyak rincian yang belum jelas. Akan tetapi sudah dapat dipastikan bahwa pada prinsipnya berlangsungnya proses replikasi pada sebagian besar sel adalah serupa. Disini ditunjukkan suatu skema yang disederhanakan untuk bakteri Escherichia coli. 1 Pada bakteri, replikasi dimulai pada suatu tempat tertentu dari DNA yang berbentuk cincin yaitu awal-mula replikasi dan dilanjutkan kedua arah. Hasilnya terbentuk garpu replikasi yang berjalan berpencaran. Pada garpu replikasi, kedua untaian direplikasikan secara bersamaan. DNA yang merupakan cetakan diberi warna biru sedangkan untai yang baru terbentuk berwarna merah atau jingga. 1 Setiap garpu mengandung sedikitnya dua molekul polimerase DNA III dan serangkaian enzim pembantu. Yang termask enzim pembantu adalah topoisomerase DNA yang mengendurkan jalinan untaian ganda DNA yang erat, helikase yang memisahkan untaian ganda DNA menjadi dua untaian tunggal dan protein-protein yang terikat pada untai tunggal. Karena untai cetakan selalu dibaca dengan arah 3 5 maka hanya satu dari kedua untaian tunggal tersebut yang dapat direplikasi secara tak terputus (biru tua/merah). Untuk untaian yang kedua (biru muda), arah pembacaan berlawanan dengan arah pergerakan garpu. Pada untai cetakan tersebut,

3

pertama-tama dibentuk untai yang baru dalam bentuk potongan DNA yang terpisah, yang kemudian disebut berdasarkan nama dari penemunya yaitu fragmen Okazaki (hijau/jingga). Setiap fragmen mulai dengan suatu urutan awal yang pendek ( primer) dari RNA (hijau) yang diperlukan agar polimerase DNA dapat berfungsi. Primer RNA disintesis oleh suatu suatu polimerase RNA yang khusus (primase). Kemudian primer tersebut akan diperpanjang sekitar 1000 2000 komponen deoksinukleotida oleh enzim polimerase DNA III (jingga). Selanjutnya sntesis fragen Okazaki berhenti dan akan dimulai sntesis statu fragen Okazaki baru pada statu primer RNA lanilla yang sementara itu telah dibentuk tidak saling berhubungan satu dengan lainnya dan masih mengandung RNA pada ujung 5. Setelah garpu replikasi berjalan dengan jarak tertentu, baru dimulai kerja enzim polimerase DNA I yaitu menggantikan primer RNA dengan DNA. Akhirnya celah yang tertinggal di antara dua fragmen Okazaki ditutup oleh suatu enzim ligase DNA. Pada statu heliks ganda DNA yang terbentuk dengan cara tersebut, hanya satu untaian DNA yang disintesis baru, artinya replikasi bersifat semikonservatif.1 TRANSKRIPSI Agar informasi genetik yang disimpan di dalam DNA dapat digunakan, maka harus disalin ulang dalam bentuk RNA (ditranskripsikan). Dalam hal ini DNA hanya berfungsi sebagai pola, artinya DNA tidak akan mengalami perubahan melalui proses transkripsi. Fragmen DNA yang dapat ditranskripsikan ialah yang mengandung sandi genetik untuk suatu produk tertentu. Fragmen DNA tersebut dinamai gen. Diduga, genom mamalia mengandung 20.000 hingga 50.000 gen, yang keseluruhannya kurang dari 10% DNA pada mamalia. Kegunaan fragmen DNA yang bukan gen masih belum jelas.1, 2 A. Transkripsi dan pematangan RNA Transkripsi dikatalisis oleh enzim polimerase RNA yang tergantung pada DNA. Enzim ini bekerja serupa dengan polimerase DNA, akan tetapi yang ditambahkan kedalam untaian yang baru disintesis adalah ribonukleotida bukan deoksiribonukeotida. Sel eukariotik sekurang-kurangnya mengandung tiga polimerase RNA. Polimerase RNA I mensintesis suatu RNA dengan koefisien sedimentasi

4

sebesar 45 S, yang berfungsi sebagai prekursor untuk tiga RNA ribosom. Produk polimerase RNA II adalah hnRNA yang kemudian menjadi mRNA, dan juga prekursor snRNA. Yang terakhir adalah polimerase RNA III, mentranskripsi gen yang mengandung sandi genetik untuk tRNA, 5S-rRNA dan snRNA tertentu. Dari prekursor-prekursor ini kemudian melalui proses pematangan RNA terbentuk molekul RNA yang dapat berfungsi. Polimerase II dan III dapat dihambat oleh -Amanitin, suatu racun jamur. 1

Gambar 1. Mekanisme transkripsi Dikutip dari Kopp2 B. Organisasi gen -Globin Organisasi gen eukariotik diterangkan dengan contoh gen yang mengandung sandi genetik untuk rantai hemoglobin (146 asam amino). Gen tersebut mencakup hampir 2000 pasangan basa (pb), akan tetapi hanya sekitar 450 pb yang membawa informasi untuk urutan protein. Tiga daerah yang mengandung sandi genetik atau ekson (E1-E3, biru tua) dipisahkan satu sama lainnya oleh dua segmen yang tidak mengandung sandi genetik (intron). Pada ujung 5 gen terdapat daerah promotor 5

(merah muda) yaitu suatu fragmen sebesar Kira-kira 200 pb dan berfungsi dalam regulasi transkripsi. Transkripsi mulai pada ujung 3 daerah promotor dan dilanjutkan hingga melampaui urutan poliadenilat. Pada gen -globin transkrip primer yang terbentuk mempunyai panjang sekitar 1600 basa. Selama proses pematangan RNA, urutan-urutan intron yang tidak mengandung sandi genetik yang sesuai dilepaskan. Selain itu, kedua ujung hnRNA dimodifikasi. mRNA dari -globin masih mengandung sekitar 40% hnRNA dan sebagai tambahan juga mengandung urutan pada