Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

32
Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - - FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1 1 PRINSIP TEKNOLOGI PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DNA REKOMBINAN DEBBIE S. RETNONINGRUM SEKOLAH FARMASI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

Transcript of Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Page 1: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11

PRINSIP TEKNOLOGI PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINANDNA REKOMBINAN

DEBBIE S. RETNONINGRUM

SEKOLAH FARMASI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

Page 2: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22

PUSTAKAPUSTAKA

1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110

2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, hal. 44-55

3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97

Page 3: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 33

TEKNOLOGI DNA REKOMBINANTEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

• Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda: fenomena umum di alam.

• Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus βmenghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap gejala difteri.

• Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam alam.

Page 4: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 44

TEKNOLOGI DNA REKOMBINANTEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

• Duplikasi fenomena alam di laboratorium• Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi

genetik ke dalam suatu organisme.

• Manipulasi genetik

E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri) Saccharomyces cerevisiae (ragi)

• Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara tradisional.

Page 5: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 55

CONTOH PRODUK REKOMBINANCONTOH PRODUK REKOMBINAN

– ANTIBODI REKOMBINAN

– PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktornekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia

– VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria

– VAKSIN DNA

– TERAPI GEN

Page 6: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 66

CONTOH PRODUK REKOMBINANCONTOH PRODUK REKOMBINAN

– PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen

– PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida

Page 7: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 77

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

• PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)

• LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN)

• TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG& PERBANYAKAN DNA

• SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR REKOMBINAN

• DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)

1972 Stanley Cohen danHerbert Boyer

Page 8: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 88

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

DNA kromosom

Potong dengan enzim restriksiDNA plasmid

ligasi

DNA rekombinan

transformasi sel

transforman1 sel tumbuh jadi 1 koloni

klon

Page 9: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 99

KloningKloning DNA DNA keke PlasmidPlasmid

Page 10: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1010

SUMBER DNA SISIPANSUMBER DNA SISIPAN

• TIGA PENDEKATAN:– KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA

GENOMIK

– PRODUK PCR

– mRNA cDNA (eukariot)

Page 11: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1111

Kepustakaan genomikKepustakaan genomik (genomic library)(genomic library)

• Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup semua gen dari suatu organisme

• Contoh ukuran genom:– Bacillus anthracis: 5,1 – 5,2 Megabasa

– Escherichia coli: 4 Megabasa

– Pseudomonas putida: 6,0 – 6,1 Megabasa

– Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa

Page 12: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1212

KROMOSOM KROMOSOM vsvs PLASMID PLASMID

Page 13: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1313

PLASMIDPLASMID

• DNA UNTAI GANDA• BERBENTUK LINGKARAN• BERSALINAN TINGGI• BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI)• DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL• DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN)• ADA DUA GEN MARKER:

– UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR– UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN

Page 14: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1414

VEKTOR (Plasmid)VEKTOR (Plasmid)

• VEKTOR KLONING

HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA

• VEKTOR EKSPRESI

UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahankomponen untuk mempermudah proses “downstream”/pemurnian)

Page 15: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1515

Beberapa contoh vektor kloningBeberapa contoh vektor kloning

Nama Tipe Sel inang Keterangan

pBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umum

pUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umum

pBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac.

λgt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNA

YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle

Page 16: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1616

PETA PLASMIDPETA PLASMID

Page 17: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1717

ENZIM RESTRIKSIENZIM RESTRIKSI

• MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI

• TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN

• MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE

• MENGENALI URUTAN PALINDROM

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

Page 18: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1818

DNA (ligase)

5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’

3’- NNNCTTAAP OHGNNN -5’

ligase

5’- NNNGAATTCNNN -3’3’- NNNCTTAAGNNN -5’

ENZIM RESTRIKSI & LIGASEENZIM RESTRIKSI & LIGASEDNA (enzim restriksi)

5’- NNNGAATTCNNN -3’3’- NNNCTTAAGNNN -5’

EcoRI

5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’

3’- NNNCTTAA P OHGNNN -5’

• Sisi pengenalan enzim restriksi

• Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawah

Page 19: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1919

CONTOH CONTOH ENZIM RESTRIKSIENZIM RESTRIKSI

• EcoRI (Escherichia coli galur R): G↓AATTC (ujung lancip)

• BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): G↓GATCC (ujung lancip)

• BglII (Bacillus globigii): A↓GATCT (ujung lancip)

• SalI (Streptomyces albus): G↓TCGAC (ujung lancip)

• PstI (Providencia stuartii 164): CTGCA↓G (ujung lancip)

• HindIII (Haemophilus influenzae): A↓AGCTT (ujung lancip)

• KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTAC↓C (ujung lancip)

• XbaI (Xanthomonas bradii): T↓CTAGA (ujung lancip)

• HaeIII (Hemophilus aegyptius): GG↓CC (ujung tumpul)

Page 20: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2020

KloningKloning ProdukProduk PCRPCR

PCR

S. pyogenes M12 Gen ska

Ligasi

pGEMTrekombinan

SDM

Transformasi

pGEMT/skaE. coli XL-Blue

Page 21: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2121

LIGASI PRODUK PCR KE LIGASI PRODUK PCR KE pGEMpGEM--TT

Gen ska

A A

pGEM-T

+

pGEM-T REKOMBINAN

ligasi Transformasi

E. coli JM109

E. coli pGEM-T REKKontrol +Kontrol –

LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTGLB/Amp

Streptococcus pyogenes

Page 22: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2222

Page 23: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2323

TransformasiTransformasi

• info genetik ditransfer ke sel inang denganmetode transformasi

• Sel inang dibuat kompeten (siap menerima“DNA asing”) → modifikasi struktur dinding sel

• Metode transformasi : heat shock/elektroporasi

Page 24: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2424

Transformasi

Sel kompeten

Seleksi Biru-Putih

SeleksiSeleksi TransformanTransforman

Page 25: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2525

SELEKSI BIRU PUTIHSELEKSI BIRU PUTIH

• MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA?

• PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE GALAKTOSIDASE)

• X-GAL → BIRU

• DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ →GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI →

X-GAL TIDAK DIURAIKAN → PUTIH

Page 26: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2626

DeteksiDeteksi keberadaankeberadaan DNA DNA sisipansisipan

• Analisis migrasi

• Analisis restriksi Elektroforesis gel

• PCR

• Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)

Page 27: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2727

ELEKTROFORESIS ELEKTROFORESIS GELGEL

• Gel agarosa atau poliakrilamid

• DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat): bergerak dari kutub negatif ke kutub positif

• DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya: migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar

• Visualisasi: – etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi

dengan pemaparan UV)

Page 28: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2828

Elektroforesis Elektroforesis GGelel AgarosaAgarosa

Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA

Page 29: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2929

KONFIRMASIKONFIRMASI pGEMpGEM--T REKOMBINANT REKOMBINAN

Isolasi pGEM-T/ska

(kit Qiaprep, Qiagene)

1 = pGEM-T rekombinan2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan

1 2

Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan <ukuran plasmid dengan DNA sisipan

Page 30: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3030

1419 pb

517 pb

Isolasi Plasmid Rekombinan

1 2 3

Koloni PutihKoloni Biru

Elektrogram hasil isolasi plasmid koloni biru dan putih :1. Koloni biru2. Koloni putih3. Koloni biru

KoloniBiru

pGEM-T (3000 bp)

881 pbDNA sisipan

1 2

Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI1. Marka pUC19/HinfI2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI

Analisis Restriksi pGEM-T rekombinan

KONFIRMASIKONFIRMASI pGEMpGEM--T REKOMBINANT REKOMBINAN

Page 31: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3131

HASIL HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA DNA SISIPANDNA SISIPAN (DNA Sequencing)(DNA Sequencing)

Page 32: Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3232

HASIL SEKUENSINGHASIL SEKUENSING

Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal

(Analisis homologi/kesamaan – program BLAST dari NCBI)