PAPERDNA REKOMBINAN DAN BLUE WHITE SELECTION

Disusun untuk memenuhi tugas Mata Kuliah BioteknologiDosen Pengampu: Prof. Dr. rer nat Sajidan, M.Si

Disusun Oleh:Bryan Dion Pramana (S831408009)

Triana Atika Zulfa (S831408035)

PROGRAM STUDI MAGISTER PENDIDIKAN SAINSFAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU KEPENDIDIKANUNIVERSITAS SEBELAS MARETSURAKARTA2015DNA Rekombinan dan Blue White SelectionA. Sejarah Teknologi RekombinanPada tahun 1971-1973 telah dikembangkan metode oleh Herbert Boyer dan Stanly Cohen yang dinamakan teknologi DNA Rekombinan. Boyer dan Cohen berhasil mengekspresikan gen dari suatu bakteri Escherichia Coli (Sudjadi,2008).

B. Pengertian Teknologi DNA RekombinanTeknologi DNA rekombinan atau disebut juga rekayasa genetika merupakan sebuah upaya yang melibatkan perbanyakan gen tertentu di dalam sel yang bukan sel alaminya atau lebih sering dikatakan sebagai kloning gen (Sudjadi, 2011). Definisi untuk mendeskripsikan teknologi DNA rekombinan sangatlah banyak, namun yang mungkin repesentatif adalah DNA rekombinan merupakan teknologi yang digunakan untuk mengisolasi sekuen DNA tertentu dari suatu organisme atau sel untuk diperbanyak pada organisme yan berbeda dan menghasilkan sifat baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam vektor sehingga memungkinkan untuk terintegrasi. Kedua DNA yang berikatan (sekuens DNA target dan vektor) dinamakan DNA rekombinan (Andriyani, dkk, 2014: Rifai, 2010; Sudjadi, 2011; Rottenhoffen, 2010).Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik yang digunakan untuk merekombinasikan gen dalam tabung reaksi. Teknik itu antara lain: isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggabungkan DNA (ligasi) dan teknik untuk teknik memasukan DNA ke dalam sel hidup. DNA rekombinan yang telah terbentuk maka akan dilakukan proses transformasi kedalam host cell kemudian dilakukan proses inkubasi sel bakteri (Sri dkk, 2011). Setelah dilakukan inkubasi maka sel bakteri diuji kehadiran DNA rekombinannya yaitu dengan uji antibiotik, uji medium seleksi dan seleksi putih biru (blue white selection) (Rottenhoffen, 2010).Dari pengertian konsep DNA rekombinan tersebut dapat disimpulkan ada dua komponen penting yaitu vektor dan enzim-enzim untuk memotong DNA serta untuk menyambung potongan tersebut (Andriyani, dkk, 2014). Salah satu vektor yang lazim digunakan dalam proses manipulasi genetik adalah plasmid (Reddy, 2004; Sudjadi, 2011; Rottenhoffen, 2010). Ada dua macam enzim utama yang diperlukan yaitu enzim retriksi untuk memotong DNA dan enzim DNA ligase untuk menyambung DNA ke vektor.

C. Unsur-Unsur dalam DNA RekombinanDalam pembentukan DNA rekombinan diperlukan unsur-unsur yang penting, yaitu vector, enzim retriksi, DNA ligase.1. VectorVector dikatakan sebagai motor pada proses rekombinasi DNA yang membawa gen target untuk ditransfer dari satu organisme ke organisme yang lain (Padmanabhan et al, 2011). Syarat dapat digunakannya suatu vektor antara lain: mampu disisipi DNA asing, dapat diintroduksi ke dalam sel, dapat bereplikasi secara independent di dalam sel inang, dan memiliki penanda seleksi (Sudjadi, 2008). Vektor yang biasa digunakan dalam proses rekombinasi DNA adalah plasmid (Sudjadi, 2008; Reddy, 2004). Plasmid merupakan molekul double-stranded circular DNA berukuran kecil umumnya berasal dari bakteri, sering dianggap sebagai extra chromosomal (Rotenhoffen, 2010; Sudjadi, 2008). Plasmid berukuran 1 kb 200 kb dan membawa gen tertentu yang menguntungkan sel inang, misalnya gen resisten terhadap antibiotik, serta memiliki multiple cloning site (Sudjadi, 2008: Rotenhoffen; 2010). Multiple cloning site merupakan daerah target enzim retriksi endonuklease yang berperan saat proses pemotongan. Macam vektor yang lain yaitu: cosmid, bacteriophage, fagemids, artificial chromosome (Soedjadi, 2008: Padmanabhan et al, 2011)2. Enzim Retriksi EndonukleaseEnzim retriksi endonuklease merupakan protein yang digunakan untuk memotong DNA pada sekuens spesifik (Rotenhoffen, 2010). Panjang enzim retriksi sebesar 4 bp sampai 6 bp. Enzim restriksi dapat menghasilkan potongan DNA dengan bentuk sticky ends (ujung lancip) atau blunt ends sehingga mampu berpasangan dengan basa yang cocok/sesuai. Contoh dari enzim restriksi adalah enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer tahun1969 dari E.coli. Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A pada sekuens GAATTC.

Gambar 1. Hasil potongan DNA dengan enzim EcoR1

Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuclease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan.

Gambar 2. Macam-macam enzim retriksi endonuklease

Gambar 3. Perbandingan Hasil pemotongan DNA dengan sticky ends dan blunt ends

Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang double-stranded, sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan ujung 5 atau ujung 3 yang menggantung. Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dapat ditentukan berapa besar ukurannya dengan menggunakan teknik gel elektroforesis (Rotenhoffen, 2010).3. Enzim DNA LigaseEnzim DNA ligase adalah enzim yang dapat mengkatalis pembentukan ikatan fosfodiester ujung 5-fosfat dan 3-hidroksil yang digunakan saat proses ligasi pada DNA yang mengalami pemotongan dengan enzim retriksi sebelumnya (Rotenhoffen, 2010; Sudjadi, 2008). DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA.

D. Teknologi DNA RekombinanTeknologi DNA rekombinan merupakan kumpulan dari teknik yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi:1. Isolasi DNAIsolasi DNA diawali dengan perusakan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi didalam medium buffer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CaCl. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid.2. Retriksi DNATahap kedua dalam DNA rekombinan adalah pemotongan (retriksi) molekul DNA (RifaiI, 2010). Molekul DNA data dipotong pada suatu urutan nukleoptida tertentu dengan menggunakan enzim endonuclease retriksi atau secara singkat disebut enzim restriksi. Telah dijelaskan diatas, bahwa teknologi DNA rekombinan, enzim restriksi yang paling sering digunakan adalah tipe II karena urutan nukleotida yang dikenali dan dipotong oleh enzim tersebut adalah sama sehingga memudahkan strategi kloningnya. Di antara enzim restriksi tipe II, pola pemotongannya berbeda. Banyak enzim restriksi yang menghasilkan ujung DNA kohesif (sticky end), tetapi ada juga yang menghasilkan ujung tumpul (blunt ends). Contoh enzim yang menghasilkan ujung kohesif adalah EcoRI yang mengenali dan memotong urutan nukleotida 5-GAATTC-3 yang bersifat polindromik. Ujung kohesif artinya ujung-ujung yang akan dengan mudah membentuk ikatan komplementer lagi seperti semula jika kedua potongan DNA tersebut disambung lagi dengan menggunakan enzim DNA ligase. DNA ligase merupakan enzim yang dapat menyambung potongan DNA. Ada juga enzim rektriksi yang hasil potongannya membentuk ujung tumpul (blunt end), misalnya enzim PvuII. Enzim ini mengenali dan memotong DNA pada urutan CAGCTG dengan hasil sebagai berikut :5-CAGCTG-3 5-CAG-3 5-CTG-33-GTCGAC-5 3-GTC-5 3-GAC-5Ujung-ujung tumpul semacam ini lebih sukar disambung lagi oleh enzim DNA ligase, jika dibandingkan dengan penyambungan ujung-ujung kohesif Jika dua macam DNA yang berbeda asalnya tetapi mempunyai daerah pengenalan oleh enzim yang sama dan kemudian dipotong dengan enzim rektrisi yang sama, maka kedua molekul DNA tersebut akan mempunyai ujung-ujung yang komplementer. Dengan menggunakan enzim DNA ligase kedua potonngan DNA yang komplementer tersebut dapat disambung membentuk molekul DNA rekombinan.3. Ligasi DNAMolekul DNA yang mempunyai ujung hasil pemotongan oleh enzim restriksi yang sama dengan mudah disambung (diligasi) dengan menggunakan enzim DNA ligase. DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5-fosfat dan 3- hidroksil. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi meggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau biasa disebut enzim T4 ligase. Jika cara pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung yang lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara, cara ketiga telah disinggung yaitu dengan pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3. Enzim yang sering digunakan untuk menyambung DNA adalah enzim yang gennya berasal dari genom virus (bakteriofag) T4, sehingga disebut T4 DNA ligase. Enzim T4 DNA ligase mampu menyambung DNA dengan ujung sticky dan blunk end. Penyambungan ujung tumpul (blunk end) memerlukan lebih banyak molekul DNA dan enzim ligase dibnding dengan penyambungan ujung kohesif (sticky end). Menurut Brown (2011) dalam Sri, dkk (2011), ligasi sticky ends lebih efisien daripada blunt ends karena ujung sticky ends dapat saling berpasangan basa melalui pembentukan ikatan hydrogen dan emmbentuk struktur yang relative stabil. Dampaknya dapat mempercepat pembentukan ikatan fosfodiester yang menyambung kedua molekul DNA tersebut. Ligase DNA dilakukan dengan mencampur dua macam molekul DNA yang akan disambungkan dengan enzim DNA ligase, kemudian diinkubasi pada suhu 12-15oC selama semalam. 4. Transformasi DNATransformasi adalah pemindahan produk (campuran DNA target dan vektor) pada proses ligasi ke dalam bakteri (Padmanabhan et al, 2011; Rotenhoffen, 2010). Transformasi bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan metode kimia (metode tradisional) atau dengan metode electroporation (Padmanabhan et al, 2011).Transformasi dengan metode kimia dilakukan dengan cara menginkubasi sel di dalam CaCl2 yang menyebabkan perubahan struktur dinding sel dan emningkatkan pengikatan DNA pada bagian luar sel. Selanjutnya mencampur DNA dengan sel kompeten di dalam es yang diikuti dengan perlakuan heat shock pada suhu 420C selama kurang lebih 4 detik, kemudian sel diinkubasi di medium selama 30-60 menit (Padmanabhan et al, 2011).Transformasi cara electroporation dilakukan menggunakan arus listrik dengan bantuan alat electroporator. Sel yang ditumbuhkan, dicuci dengan air untuk menghilangkan semua garam dari medium pertumbuhan dan penembahan gliserol dengan konsentrasi final 10% sehingga sel dapat disimpan dalam pendingin dan disimpan untuk penelitian selanjutnya (Padmanabhan et al, 2011).

E. Blue-White SelectionUntuk mengidentifikasi apakah proses transformasi berhasil atau tidak, dilakukan proses seleksi. Melalui proses seleksi, koloni transforman yang membawa DNA rekombinan target dapat dibedakan dari koloni transforman yang tidak membawa DNA target. Metode yang umum digunakan adalah metode seleksi antibiotic dan -komplementasi atau biasa dikenal dengan metode blue-white selection. Untuk proses seleksi ini menggunakan antibiotic yang disesuaikan dengan ketahanan antibiotic yang terdapat pada plasmid yang digunakan. Plasmid pUC18 misalnya, merupakan vektor yang memiliki penanda resisten untuk antibiotic ampisilin. Gen penanda seleksi antibiotic ampisilin (bla) yang dibawa oleh vektor plasmid akan mengekspresikan sifat resistensi ampisilin kepada sel inang setelah ditransformasi dengan mengkode -laktamase yang mampu memisahkan ikatan 4 cincin (-lactam ring) di molekul ampisilin. Koloni bakteri yang ditumbuhkan di medium yang berisi antibiotic ampisilin ditambahkan dengan senyawa pewarna kromogenik yang dinamakan X-gal. X-gal merupakan suatu galaktosa dan prechromophore 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--d-galactoside.Plasmid memiliki multiple cloning site yang berada di pertengahan gen lac-Z (-galactoside) dan komplemen dengan -komplementasi. Apabila gen insert berhasil masuk ke vektor (dalam hal ini plasmid), maka fragmen amino-terminal -galactoside akan nonaktif menghilangkan -komplementasi, sehingga sel yang menghasilkan plasmid rekombinan akan tampak berwarna putih dan dapat dibedakan dengan plasmid yang tidak mengandung gen insert yang nampak berwarna biru sebagai akibat dari katalisis -galactoside (Reddy, 2004).

Referensi:Andriyani, P., Sajidan, Artini, P. 2014. Isolasi dan Kloning Gen Penyandi Fitase Bacillus sp EN 6. EL-VIVO. Vol. 2 (1) 1-9Padmanabhan, Sriram, Banerjee, Sampali, and Mandi, Naganath. 2011. Screening of Bacterial Recombinants: Strategies and Preventing False Positives. Molecular Cloning Selected Applications in Medicine and Biology ISSBN 978-953-307-398-9Reddy, Manjula. 2004. Positive Selection System For Identification of Recombinants Using -complementation Plasmids. Biotechniques. Vol. 37(6) 948-952Rifai, M. 2010. Genetika Rekombinan dan Populasi. Malang. Galaxy ScienceRotenhoffen, Erik. 2010. Cloning DNA Through The Use Of Recombinant DNA Technology. School of Doctoral Studies (European Union) Journal. Hlm. 128 137Sri Sumarsih, Ni Nyoman TP, Ami Soewandi JS. 2011. Rekombinasi Gen Penyandi -xilosidase asal Geobacillus Thermoleovorans IT-08 dalam Plasmid Phis 1525. JBP. Vol. 13(3) 150-154Soedjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius

4