TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

MAKALAH

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Mata Kuliah Bioteknologi

Oleh :Erlin Fujianti 122154042Wini Agustin122154052Neng Revi Rismayanti122154061

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGIFAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKANUNIVERSITAS SILIWANGITASIKMALAYA

2014

KATA PENGANTAR

Puji serta syukur penulis panjatkan kehadirat Allah swt. karena berkat rahmat-Nya yang telah memberi nikmat kesehatan dan kesempatan sehingga penulis mampu menyelesaikan makalah berjudul Teknologi DNA Rekombinan. Makalah ini disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Bioteknologi. Dengan berkembangnya ilmu pengetahuan diketahui bahwa setiap makhluk hidup menggunakan DNA dan RNA untuk menyimpan dan metransfer informasi genetiknya. Sehingga para ilmuwan berpikir mengenai bisa tidaknya materi gen ini dimanipulasi sehingga bisa didapatkan DNA dan RNA yang sifat genetiknya sesuai dengan yang diinginkan. Kemudian berkembang teknologi baru dalam perubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan teknologi DNA rekombinan atau disebut sebagai rekayasa genetik. Penulis menyadari bahwa selama penulisan makalah ini banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada :1. Egi Nuryadin, S.Pd., selaku dosen mata kuliah Bioteknologi yang telah membantu selama menyusun makalah ini;2. rekan-rekan kelas yang telah memotivasi penulis untuk menyelesaikan penyusunan makalah ini;3. semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu.Semoga Allah swt. memberikan balasan yang berlipat ganda. Makalah ini bukanlah karya yang sempurna karena masih memiliki banyak kekurangan, baik dalam hal isi maupun sistematika dan teknik penulisannya. Oleh sebab itu, penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun demi kesempurnaan makalah ini. Semoga makalah ini bisa membarikan manfaaat bagi penulis dan bagi pembaca. Amin.

Tasikmalaya, 20 September 2014Penulis

DAFTAR ISIKATA PENGANTAR iDAFTAR ISI iiBAB I PENDAHULUAN 1A. Latar Belakang 1B. Rumusan Masalah 2C. Tujuan Makalah 2D. Kegunaan Makalah 2E. Prosedur Makalah 3BAB II PEMABAHASAN 4A. Teknik Isolasi DNA 4B. Isolasi mRNA dan Pembuatan cDNA 6C. Pembuatan Gen Sintetik 6D. Amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR 7E. Pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi 12F. Penyambungan DNA (ligasi DNA) 14BAB III PENUTUP 17A. SIMPULAN 17B. SARAN 18

i

BAB IPENDAHULUAN

A. Latar Belakang MasalahSeiring berkembangnya ilmu pengetahuan banyak ditemukan penemuan-penemuan baru salah satunya tentang biologi molekular. Setelah banyak penelitian diketahui bahwa setiap makhluk hidup menggunakan DNA dan RNA untuk menyimpan dan metransfer informasi genetiknya. Sehingga para ilmuwan berpikir mengenai bisa tidaknya materi gen ini dimanipulasi sehingga bisa didapatkan DNA dan RNA yang sifat genetiknya sesuai dengan yang kita inginkan. Pada awal tahun tujuh puluhan, Paul Berg berhasil menyambungkan molekul DNA secara in vitro, maka kemudian berkembang teknologi baru dalam perubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan teknologi DNA rekombinan atau disebut sebagai rekayasa genetik. Teknologi ini pada dasarnya adalah teknik menyambungkan molekul-molekul DNA secara in vitro sehingga diperoleh molekul DNA rekombinan sesuai dengan yang diharapkan. Teknologi ini memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.Berdasarkan uraian latar belakang di atas, maka perlu diakukan penyusunan makalah terkait dengan teknologi DNA rekombinan untuk mengetahui lebih jelas mengenai teknologi DNA rekombinan tersebut serta manfaat yang diperoleh dari aplikasi teknologi tersebut bagi kehidupan manusia.

1

B. Rumusan MasalahBerdasarkan latar belakang masalah diatas, penulis merumuskan rumusan masalah sebgai berikut.1. Bagaimana teknik isolasi DNA ?2. Bagaimana isolasi mRNA dan pembuatan cDNA ?3. Bagaimana pembuatan gen sintetik ?4. Bagaimana amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR ?5. Bagaimana pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi ?6. Bagaimana penyambungan DNA (ligasi DNA) ?

C. Tujuan MakalahSejalan dengan rumusan masalah di atas, makalah ini disusun dengan tujuan untuk mengetahui :1. Teknik isolasi DNA;2. isolasi mRNA dan pembuatan cDNA;3. pembuatan gen sintetik;4. amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR;5. pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi; dan6. penyambungan DNA (ligasi DNA).

D. Kegunaan MakalahMakalah ini disusun dengan harapan memberikan kegunaan baik seara teoritis maupun secara praktis. Secara teoritis makalah ini berguna sebagai pengembangan konsep teknologi DNA rekombinan. Secara praktis makalah ini bermanfaat bagi :1. penulis, sebagai wahana penambah pengetahuan dan konsep teknologi DNA rekombinan;2. pembaca, sebagai media informasi tentang manfaat teknologi DNA rekombinan.

E. Prosedur MakalahMakalah ini disusun dengan menggunakan pendekatan kualitatif. Metode yang digunakan adalah metode deskriptif. Melalui metode ini penulis akan menguraikan permasalahan yang dibahas secara jelas dan konprehensif. Data teoritis dalam makalah ini dikumpulkan dengan menggunakan teknik studi pustaka, artinya penulis mengambil data melalui kegiatan membaca berbagai literatur yang relewan dengan tema makalh. Data tersebut diolah dengan teknik analisis isi melalui kegiatan mengeksposisikan data serta mengaplikasikan data tersebut dalam konteks tema makalah.

3

BAB IIPEMBAHASAN

Sejak keberhasilan penyambungan molekul DNA secara in vitro pertama kali oleh Paul berg pada awal tahun 70-an, maka kemudian berkembang teknologi baru dalam pengubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan Teknologi DNA rekombinan, atau secara umum disebut sebagai rekayasa genetik. Teknologi ini pada dasarnya adalah teknik untuk menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro sehingga diperoleh molekul DNA rekombinan sesuai yang diharapkan dalam pemuliaan jasa secara konvensional, sebenarnya terjadi proses rekombinasi genetik tetapi prosesnya tidak diatur secara khusus. Dalam pemuliaan tanaman secara konvensional, rekombinasi genetik berlangsung secara in vivo.Untuk melakukan rekombinasi DNA secara in vitro, maka perlu dilakukan beberapa tahapan dasar yaitu :a. Isolasi molekul DNA yang akan digabungkanb. Pemotongan DNA dengan enzim endoklease restriksic. Penyambungan molekul DNA dengan enzim ligase ke dalam molekul DNA vektord. Transformasi sel inang dengan DNA rekombinan hasil ligasie. Analisis dan konformasi keberadaan DNA rekombinan dalam sel inangf. Karakterisasi fungsional gen yang diklon.A. Teknik Isolasi DNAUntuk menyisipkan suatu gen tertentu ke dalam sel jasad target, maka terlebih dahulu harus dilalukan isolasi gen DNA yang mencangkupi gen yang dimaksud. Sumber gen yang akan disisipkan tersebut biasanya berasa dari DNA gemon jasad hidup yang bersangkutan. Untuk mengisolasi secara sepesifik DNA yang mencangkup gen tertentu , dapat dilakukan teknik, yaitu :1. Isolasi DNA gemon dan dilanjutkan dengan pemotongan DNA gemon menggunakan enzim endonuklease restriksi,

2. 4

3. Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil traskripsi gen yang dimaksud kemudian dilanjutkan dengan membuat turunan (complementary DNA/cDNA),4. Menyintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut (membuat gen sintetik) dengan teknik sintesis nkimiawi,5. Melakukan amplifikasi DNA dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reation).DNA gemin dapat diisolasi dengan berbagai macam teknik.pada prinsipnya, sel harus dipecah dahulu menggunakan beberapa agensia baik secara fisik maupun kimiawi, termasuk pengguanaan enzim tertentu. Pemecahan sel secara fisik dapat dilakukan misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu suatu alat yang menghasilkan suara dengan frekuensi yang ultra tinggi (ultra sound). ketika alat dihidupkan, maka akan dihasilkan suara dengan frekuensi ultra tinggi sehingga dapat memecah sel.Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel.senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA gemon adalah CTAB (Cetyl Treimethyl Ammonium Bromide). Setelah sel dipecah selanjutnya dilakukan iolasi dan pemurnian DNA. Beberapa diantaranya menggunakan kit yang terdiri atas mengikat molekul lainya yang ada didalam sel.Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA tertentu, DNA genom kemudian dipiotong dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi .Enzim endonuklease restriksi adalah enzim yang dapat memotong molekul DNA pada bagian tertentu. Hasil potongan dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujung-ujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong oleh enzim.Fragmen-fragmen DNA tersebut selanjutnya disambung dengan suatu DNA vektor sehingga menghasilkan molekul DNA rekombinan.

B. Isolasi mRNA dan Pembuatan cDNAGen yang mengkode suatu protein juga dapat diisolasi dengan cara mengisolasi mRNA hasil traskripsi gen tersebut,selanjutnya mRNA diubah menjadi turunan DNA (cDNA).Pembuatan cDNA memungkinkan dilakukianya kloning dengan ekspensi gen eukaryot yang memiliki intron yang tidak akan diekspresikan dalam bentuk ututan asam-asam amino suatu protein. Dalam proses traskrpsi dihasilkan molekul mRNA matang yang akan ditranslasi.Hal ini menyebabkan perubahan pada hasil traslasi karena sekuen intron masih terikut pada mRNA sehingga ikut ditraslasi. Hasilnya adalah suatu protein yang mengandung urutan asam amino yang beberapa protein alami yang dihasilkan oleh sel eukariyot. Dengan mengisolasi mRNA yang suadah matang dari sel eukariyot, maka sekuen intron sudah dihilangkan dalam proses traskripsi. Setelah mRNA diisolasi, selanjutnya diubah menjadi cDNA dengan buatan enzim traskriptase balik.

C. Pembuatan Gen SintetikSuatu gen yang tersusun atas rangkaian nukleotida juga dapat diperoleh denga melakukan sintesis kimia sehingga diperoleh gen sintetik. Sekarang telah banyak metode sintesis nukleotida, baik secara otomatis maupun semi-otomatis. Meskipun demikian, gen-gen dengan ukuran besar tidak selalu mudah disintesis sehingga seringkali harus dilakukan sintesis secara bertahap. Hasil sintesis gen tersebut selanjutnya harus dicek kembali urutan nukleotidanya dengan teknik penentuan urutan DNA (DNA sequencing). Dengan metode sintesis kimiawi maka dimungkinkan untuk membuat suatu gen yang sama sekali baru yang tidak pernah ada di alam. Meskipun demikian, belum tentu gen baru tersebut dapat diekspresikan menjadi suatu rangkaian asam amino suatu protein yang fungsional.Sintesis gen buatan merupakan suatu metode dalam biologi sintetis yang digunakan untuk membuat gen buatan di laboratorium. Saat ini berdasarkan sintesis DNA fase padat, berbeda dari molekul kloning dan polymerase chain reaction (PCR) dalam bahwa pengguna tidak harus dimulai dengan urutan DNA yang sudah ada sebelumnya. Oleh karena itu, adalah mungkin untuk membuat molekul DNA beruntai ganda benar-benar sintetis tanpa batas jelas di kedua urutan nukleotida atau ukuran. Metode ini telah digunakan untuk menghasilkan kromosom bakteri fungsional yang mengandung sekitar satu juta pasangan basa. Sintesis gen telah menjadi alat penting dalam berbagai bidang teknologi DNA rekombinan termasuk ekspresi heterolog gen, pengembangan vaksin, terapi gen dan rekayasa molekuler. Sintesis sekuens asam nukleat sering lebih ekonomis daripada kloning dan mutagenesis prosedur klasik.Membuat Humulin dengan memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli,.Proses membuat vaksin dengan Bioteknologi dimulai dengan mengisolasi virus penyakitnya terlebih dahulu. Proses berlanjut sequence dan kemudian menghasilkan bibit vaksin.Terapi gen adalah proses DNA rekombinan di mana sel-sel yang diambil dari pasien, diubah dengan menambahkan gen, dan diganti pada pasien. Gen-gen kemudian memberikan kode genetik untuk protein pasien kurang. Sel nonreproductive digunakan dalam terapi gen, sehingga tidak ada sisa-sisa gen disisipkan ke generasi berikutnya.

D. Amplifikasi DNA dan teknik teknik PCRMetode ini ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1985. Metode PCR ini pada awalnya hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, akan tetapi dalam perkembangannya dapat digunakan untuk melipatgandakan molekul mRNA. Kemajuan teknologi telah memungkinkan para ilmuan untuk meniru urutan nukleotida suatu gen dengan cara melakukan amplifikasi DNA dengan teknis reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, atau PCR). Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro (di dalam tabung) dengan menggunakan :

1. Enzim DNA polimerase,2. dNTP (dinukleatida triphosphat),3. oligonukleatida primer,4. Molekul DNA cetakan (DNA template)Enzime DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA. Dalam teknik PCR, biasanya digunakan enzim DNA polimerase yang berasal dari bakteri termotoleran yang berasal dari laut, yaitu Thermus aquaticus, sehingga enzimnya disebut Taq DNA polymerase. Enzim ini mempunyai kelebihan dibanding dengan enzim Dna polimerase yang lain karena ketahanannya terhadap suhu sangat tinggi mencapai suhu 95 - 100C. Selain itu enzim DNA polimerase yang termostabil lainnya diisolasi dari bakteri yang hidup pada turbin kapal selam yang disebut dengan Vent DNA polymerase. Suhu setinggi ini diperlukan sebab untuk dapat menyalin urutan basa DNA cetakan dalam metode PCR, maka DNA cetakan harus didenaturasi (dipisahkan ikatan antar untaiannya) dengan perlakuan panas. Sekarang telah banyak enzim DNA polimerase termotoleran lain yang dikembangkan untuk PCR, misalnya Tth DNA polymerase, dan Pwo DNA polymerase. Aktifitas enzim DNA polimerase ini mengkatalisis polimerase DNA berlangsung dari ujung 5 ke ujung 3.Molekul dNTP (yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP) diperlukan untuk teknik PCR sebagai bahan dasar untuk membuat untaian DNA karena molekul DNA disusun oleh keempat nukleotida tersebut. Biasanya konsentrasi masing-masing-masing dNTP adalah 200 M, pada pH 7,0. Bila konsentrasi terlalu tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan DNA polimerase. Sedangkan bila konsentrasi terlalu rendah dapat mempengaruhi ketepatan dan ketelitian hasil amplifikasi DNA. Oligonukleotida primer adalah molekul nukleotida berukuran pendek (sekitar 10 30 basa nukleotida) yang diperlukan dalam mengawali proses sintesis DNA. Perlu diketahui bahwa proses sintesis DNA, baik secara in vivo (di dalam sel) maupun secara in vitro (di luar sel) memerlukan molekul primer. Urutan basa nukleotida pada primer ditentukan agar menempel (komplementer) pada bagian molekul DNA cetakan yang akan disalin atau diamplifikasi. Molekul primer dapat dibuat dengan cara sintesis kimiawi.Beberapa hal penting yang harus diperhatikan pada perancangan primer oligonukleotida antara lain adalah : 1. Harus dihindari susunan tiga basa berturut-turut terdiri dari G atau C pada ujung primer, misalnya CCG, CCC, GCG, GGG, dan GCC2. Urutan basa sepasang primer tidak boleh saling komplementer, sehingga dapat membentuk dimer, atau membentuk ikatan seperti jepitan rambut (hairpins) dan hindari rancangan suatu primer pada daerah repetitif.Molekul DNA cetakan adalah molekul DNA yang urutan nukleotidanya akan disalin. DNA cetakan diisolasi dari sel dan selanjutnya digunakan sebagai cetakan yang akan dibaca oleh enzim DNA polimerase untuk membuat salinan urutan nukleotida.Pemilihan sekuen DNA target perlu diperhatikan kestabilannya genetik, terutama untuk tujuan identifikasi. Sebagai contoh, misalnya gen virulensi suatu bakteri biasanya merupakan elemen genetik yang tidak stabil, sehingga biasanya akan hilang pada saat isolasi dan pemindahan kultur bakteri secara serial. Oleh sebab itu, untuk mengamplifikasi gen semacam ini harus dilakukan segera setelah proses isolasi DNA.PCR dilakukan dengan mencampurkan empat komponen tersebut dalam tabung Eppendorf kemudian dimasukan ke dalam alat thermocycler. Volume total campuran reaksi diperlukan biasanya berkisar antara 25 100 l. Thermocycler adalah alat yang dapat diatur untuk membuat suatu siklus perubahan suhu yang diperlukan dalam proses amplifikasi DNA. Mesin PCR dilengkapi dengan program komputer yang mengatur secara otomatis pada setiap siklus.

Thermocycler

Tabung

Pertama kali suatu alat diatur sehingga mencapai 95 - 100C selama beberapa menit (biasanya sekitar 5 menit). Pada saat ini, molekul DNA cetakan mengalami denaturasi sehingga dua untaiannya terpisah. Pemisahan untaian ini diperlukan agar oligonukleat primer dapat menempel, karena primer tidak akan dapat menempel pada DNA cetakan yang masih dalam bentuk untaian ganda (double stranded).Setelah beberapa menit pada suhu denaturasi, suhu alat diturunkan sehingga mencapai suhu yang sesuai untuk penempelan primer (primer annealing) pada DNA cetakan. Biasanya suhu diperlukan sekitar 50 - 60C, tetapi suhu yang tetap harus ditentukan secara empiris tergantung pada basa nukleotida primer yang digunakan. Pada suhu yang tepat, molekul primer akan menempel pada daerah DNA yang komplementer. Sebagai contoh, jika urutan nukleotida primer adalah GATCTTCG, maka primer tersebut akan menempel pada daerah DNA cetakan yang mempunyai urutan CTAGAAGC. Molekul primer yang menempel tersebut berfungsi sebagai molekul awal dalam proses polimerisasi DNA. Nukleotida-nukleotida baru akan ditempelkan di ujung primer tersebut sesuai dengan urutan nukleotida pada DNA cetakan.Proses penempelan primer biasanya memerlukan waktu beberapa menit (sekitar 2-3 menit), selanjutnya suhu alat dinaikan ke suhu yang optimum untuk aktivitas polimerisasi DNA oleh DNA polimerase. Jika digunakan Taq DNA polymerase, maka biasanya suhu dinaikan menjadi 72C. Pada suhu inilah terjadi proses polimerisasi (sintesis) DNA baru dengan adanya aktivitas DNA polimerase, dNTP, primer, dan DNA cetakan. Proses polimerisasi biasanya berlangsung selama 2-5 menit.Setelah proses polimerisasi, kemudian dilakukan lagi siklus seperti semula, yaitu dengan menaikan suhu menjadi 95-100C (denaturasi), kemudian diturunkan menjadi 50-60C (penempelan primer), dan kemudian dinaikan lagi menjadi 72C (polimerisasi). Siklus perubahan suhu semacam ini dilakukan berulang-ulang sekitar 25-35 kali. Dengan demikian dalam proses PCR terjadi sintesis DNA secara berulang-ulang sehingga diperoleh molekul DNA baru dengan jumlah yang jauh berlipat ganda dibanding dengan molekul DNA cetakannya. Inilah yang disebut sebagai proses reaksi berantai polimerase atau PCR. Dengan teknik ini dimungkinkan mengamplifikasi suatu fragmen DNA dengan cepat dan dalam jumlah banyak. Selain itu, amplifikasi juga dapat diarahkan hanya pada bagian-bagian tertentu suatu gen sehingga dapat dikembangkan untuk tujuan rakayasa struktur suatu gen atau suatu protein. Skema dasar proses PCR.

Skema PCRSejak ditemukannya metode PCR, perkembangan dunia biologi molekular dan bioteknologi semakin pesat. Beberapa contoh penerapan PCR antara lain: analisis tindakan kriminal dengan sedikit sampel darah, sperma, sidik jari atau jaringan deteksi DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV pengujian kualitas air minum identifikasi jenis kelamin

E. Pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksiMolekul DNA dapat dipotong pada suat urutan nukleoptida tertentu dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi atau secara singkat disebut enzim restriksi. Saat ini telah berhasil diisolasi ratusan macam endonuklease restriksi, terutama dari sel jasad prokariyot. Enzim-enzim tersebut dikarakterisasi titik pengenalan (recognition site) dan titik potongnya (restriction site) pada molekul DNA. Enzim restriksi dikelompokan menjadi 3 (tiga) tipe, TipeKonfaktorUnrutan DNA yang dikenaliUrutan DNA yang dipotongContoh

IATP, Mg++, S-adenosil metionim13-15 pasangan basa yang mengandung urutan neopleotida tidak spesifik sepanjang 6-8 pasangan basa Tidak spesifik, tidak sama urutan DNA yang dikenaliEcoK

IIMg++4-8 pasangan basa, biasanya dengan susunan simetris Sangat spesifik, pemotongan pada urutan nukleotida yang dikenaliEcoRI

IIATP, Mg++, (S-adenosil metionim dapat menstimulasi aktivitas)5-6 pasangan basa, tidak tersusun secara simetrisSangat spesifik, tetapi pemotongan terjadi pada daerah yang bukan tempat pengenalan yaitu ke arah ujung 3 dan titik pengenalanEcoPI

Dalam teknologi DNA rekombinan, enzim restriksi yang paling sesering digunakan tipe II karena urutan nukleotida yang dikenali dan dipotong oleh enzim tersebut adalah sama sehingga memudahkan strategi kloningnya. Di antara enzim rektriksi tipe II tersebut, pola pemotonganya pun berbeda. Banyak enzim rektriksi yang menghasilkan ujung DNA kohesif (ujung lekat/ sticky end, atau ujung runcing), tetapi ada juga yang menghasilkan ujung tumpul. Sebagai contoh, enzim EcoRI mengenali dan memotong urutan nukeleotida 5-GAATTC-3 yang besifat palindromik, artinya kalau urutan tadi dibaca dari urutan untaian komplementernya maka hasilnya tetap sama (pembacaan searah dengan anak panah).

5-GAATTC-33-CTTAAG-5Jika urutan semacam ini dipotomg oleh enzim EcoRI maka hasilnya adalah sebagai berikut :5-GAATTC-33-CTTAAG-5

Anak panah menggambarkan letak pemotongan oleh enzim EcoRI sehingga dihasilkan potongan dengan ujung kohesif:

5-G5-AATTC-33-CTTAA-5 G-5Ujung kohesif artinya ujung-ujung yang akan dengan mudah membentuk ikatan komplementer lagi seperti semula jika kedua potongan DNA tersebut disambung lagi dengan menggunakan enzim DNA ligase. DNA ligase merupakan enzim yang dapat menyambung potongan DNA. Ada juga enzim rektriksi yang hasil potongannya membentuk ujung tumpul (blunt end), misalnya enzim PvuII. Enzim ini mengenali dan memotong DNA pada urutan CAGCTG dengan hasil sebagai berikut :5-CAGCTG-3 5-CAG-35-CTG-33-GTCGAC-53-GTC-53-GAC-5Ujung-ujung tumpul semacam ini lebih sukar disambung lagi oleh enzim DNA ligase, jika dibandingkan dengan penyambungan ujung-ujung kohesifJika dua macam DNA yang berbeda asalnya tetapi mempunyai daerah pengenalan oleh enzim yang sama dan kemudian dipotong dengan enzim rektrisi yang sama, maka kedua molekul DNA tersebut akan mempunyai ujung-ujung yang komplementer. Dengan menggunakan enzim DNA ligase kedua potonngan DNA yang komplementer tersebut dapat disambung membentuk molekul DNA rekombinan.

F. Penyambungan DNA (ligasi DNA)Molekul-molekul DNA yang mempunyai ujung hasil pemotongan oleh enzim restriksi yang sama dengan mudah disambung (diligasi) dengan menggunakan enzim DNA ligase. Enzim yang sering digunakan untuk menyambung DNA adalah enzim yang sering digunakan untuk menyambung DNA adalah enzim yang gennya berasal dari genom virus (bakteriofag) T4 sehingga disebut T4 DNA ligase. Enzim T4 DNA ligase mampu menyambung DNA dengan ujung kohesif maupun tumpul. Hal in berbeda dari enzim DNA ligase yang gennya merupakan bagian genom bakteri Escherchia coli karena enzim karena enzim ligase E. Coli tersebut hanya mampu menyambung ujung DNA yang kohesif. Selain itu, T4 DNA ligase juga mampu menyambung molekul RNA dengan DNA, sedangkan enzim dari E.coli tidak mampu melakukan hal semacam ini. Oleh karena itu enzim T4 ligase sering digunakan dalam kloning DNADibandingkan dengan penyambungan ujung-ujung kohesif, penyambungan ujung-ujung DNA yang tumpul memerlukan lebih banyak molekul DNA dan enzim DNA ligase. Ligasi DNA dilakukan dengan mencampur dua macam molekul DNA yang akan disambung dengan enzim DNA ligase, kemudian diinkubasikan pada suhu 12-15oC selama semalam. Akan tetapi sekarang telah banyak kit yang dikembangkan untuk ligasi DNA secara cepat, bahkan dengan jangka waktu hanya beberapa menit. Kit ligasi DNA tertentu bahkan dapat digunakan untuk ligasi DNA pada suhu kamarDalam keadaan tertentu molekul DNA yang akan diligasi mempunyai ujung-ujung yang tidak sama karena merupakan hasil pemotongan oleh enzim rektriksi yang berbeda. Untuk menyambung molekul-molekul yang berbeda ujungnya tersebut dapat dikerjakan dengan melakukan beberapa macam modifikasi, yaitu 1. Penambahan adaptor atau penyambungan (linier)2. Pembentukan ekor homopolimer pada ujung DNA3. Pengisian ujung-ujung DNA kohesif 4. Penghilangan ujung DNA kohesifAdaptor ialah suatu molekul oligonlukleotida sintetik yang urutan nukleotidanya dirancang sedemikian rupa sehingga masing-masing ujung DNA yang akan disambung, Sebagai contoh, adasuatu adaptor yang dapat digunakan untuk menyambung ujung-ujung DNA yang dipotong oleh enzim EcoRI dan BamHI. Linker adalah molekul oligonukleotida suntetik yang dapat mengalami penyambungan sendiri (self-ligation) membentuk molekul untai ganda berujung tumpul tetapi mempunyai urutan nukleoptida yang dikenal oleh enzim rektriksi tertentu. Linker tersebut kemudian diphosphorilasi dengan enzim polinukleotida kinase. Selanjutnya linier tersebut disambung dengan DNA berujung tumpul dengan metode penyambungan ujung tumpul (blunt end ligation) skema adaptor dan linier.Ekor homopolimer adalah molekul deoksitibonukleotida yang terdiri atas satu macam nukleotida dan ditambahkan pada ujung 3 suatu molekul DNA untai tunggal atau ganda sehingga DNA tersebut dapat membentuk rekombinan dengan DNA lain yang mempunyai ekor homoplimer yang komplementer. Enzim ini dapat menambahkan ekor homopolimer sepanjang 50 sampai 150 nukleotida da atau dT, dan sekitar 20 dG atau dC. Skema penambahan ekor homopolimerPengisian ujung kohesif dilakukan dengan menggunakan aktivitas enzim DNA polimerase untuk mengisi ujung 3 DNA hasil pemotongan oleh enzim restriksi. Enzim yang sering digunakan untuk keperluan ini adalah DNA polimerase I dari E.coli yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease 5 3 sehingga hanya mempunyai aktivitas polimerase 5 3 dan endonuklease 3 5. Fragmen DNA polimerase I semacam ini disebut fragmen klenow yang dapat diperoleh dengan memotong DNA polimerase I yang lengkap dengan enzim subtilisin. Dengan adanya dNTP dan ion Mg++ , enzim Klenow akan menyintesis untaian DNA yang komplementer dengan ujung 5 yang menonjol dengan menggunakan ujung 3 sebagai primer. Selain dengan cara semacam ini, ujung 5 atau 3 yang menonjol dapat dihilangkan dengan menggunakan aktivitas eksonukleolitik 3 5 fragmen Klenow, atau dengan menggunakan enzim T4 DNA polimerase.Jika ujung-ujung DNA yang akan diligasi sudah dimodifikasi dengan salah satu cara diatas maka selanjutnya dapat dilakukan ligasi, baik dengan menggunakan teknik ligasi DNA tumpul atau dengan memotong terlebih dahulu menggunakan enzim rektriksi, jika modifikasinya berupa penambahan adaptor atau linker.16

BAB IIIPENUTUP

A. SimpulanTeknik DNA rekombinan merupakan pengubahan sifat-sifat genetik suatu jasad, dengan tahapan 1. Isolasi molekul DNA yang akan digabungkan2. Pemotongan DNA dengan enzim endoklease restriksi3. Penyambungan molekul DNA dengan enzim ligase ke dalam molekul DNA vektor4. Transformasi sel inang dengan DNA rekombinan hasil ligasi5. Analisis dan konformasi keberadaan DNA rekombinan dalam sel inang6. Karakterisasi fungsional gen yang diklon.Sintesis gen buatan merupakan suatu metode dalam biologi sintetis yang digunakan untuk membuat gen buatan di laboratorium.PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah perbanyakan (amplifikasi) DNA dilakukan secara in vitro (di dalam tabung) dengan menggunakan Enzim DNA polimerase, dNTP (dinukleatida triphosphat), oligonukleatida primer, Molekul DNA cetakan (DNA template). B. SaranTeknologi DNA rekombinan digunakan secara bijaksana dan bermanfaat. Kita selaku mahasiswa biologi harus mengetahui mengenai bioteknologi terbaru sebagai penyesuaian terhadap perkembangan zaman. Karena ilmu pengetahuan akan senantiasa berkembang.

DAFTAR PUSTAKA

Radji, Maksum. (2011). Rekayasa Genetika. Jakarta : Sagung Seto.Yuwono, Triwibowo. (2012). Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.18