REKAYASA GENETIKA DR. SYAZILI MUSTOFA, M. BIOMED

KEPALA LABORATORIUM BIOKIMIA, FISIOLOGI DAN BIOLOGI

MOLEKULER

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG

PENDAHULUAN

Rekayasa genetika adalah Kumpulan teknik-teknik

eksperimental yang memungkinkan untuk

mengisolasi, mengidentifikasi, dan melipatgandakan

suatu fragmen dari materi genetika dalam bentuk

murni

REKAYASA GENETIKA

• Dasar dari bioteknologi yang di dalamnya meliputi manipulasi gen, kloning gen, DNA

rekombinan, teknologi modifikasi genetik, dan genetika modern dengan menggunakan

prosedur identifikasi, replikasi, modifikasi dan transfer materi genetik dari sel, jaringan

maupun organ.

• Melibatkan penanda yang disebut sebagai Marker-Assisted Selection (MAS), bertujuan

meningkatkan efisiensi suatu organisme berdasarkan informasi fenotipenya.

REKAYASA GENETIKA

• Hewan yang sering menjadi uji coba adalah mamalia karena memiliki genom yang lebih

kompleks dari virus, bakteri, dan tanaman.

• Keunggulan: mampu memindahkan materi genetik dari sumber yang sangat beragam

dengan kecepatan tinggi dan terkontrol dalam waktu yang lebih singkat.

• Teknologi khusus yang digunakan: DNA rekombinan, pembentukan kombinasi materi

genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga

memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel yang

berperan sebagai sel inang.

REKAYASA GENETIKA

• Manfaat:

- Mengurangi biaya dan meningkatkan penyediaan sejumlah besar bahan yang sekarang

digunakan di dalam pengobatan, pertanian, dan industri.

- Mengembangkan tanaman-tanaman pertanian yang bersifat unggul.

- Menukar gen dari satu organisme kepada organisme lainnya sesuai dengan keinginan

manusia, menginduksi sel untuk membuat bahan-bahan yang sebelumnya tidak pernah

dibuat.

REKAYASA GENETIKA

• Teknik pelestarian dengan rekaya genetik ini sangat bermanfaat, dengan alasan:

- Induk dari spesies biasa dapat melahirkan anak dari spesies langka.

- Telur hewan langka yang sudah dibuahi dapat dibekukan, lalu disimpan bertahuntahun

meskipun induknya sudah mati.

- Telur yang sudah disimpan beku ini kemudian dapat ditransplantasi.

REKAYASA GENETIKA

• Contoh lain pemanfaatan rekayasa genetic pada hewan misalnya pemanfaatan Hormon bST

(bovinesomatotrophine hormone).

• Dengan rekayasa genetik dihasilkan hormon pertumbuhan hewan yaitu bST, melalui teknik:

- Plasmid bakteri E.Coli dipotong dengan enzim endonuklease.

- Gen somatotropin sapi diisolasi dari sel sapi.

- Gen somatotropin disisipkan ke plasmid bakteri.

- Bakteri yang menghasilkan bovine somatotrophine ditumbuhkan dalam tangki fermentasi.

- bovine somatotrophine diambil dari bakteri dan dimurnikan.

PRINSIP DAN TEKNIK DASAR

- Pengunaan vektor,

- Kloning,

- PCR (Polymerase Chain Reaction), dan

- Seleksi, screening, serta analisis rekombinan

LANGKAH REKOMBINASI GENETIK

- Identifikasi gen yang diharapkan

- Pengenalan kode DNA terhadap gen yang diharapkan

- Pengaturan ekpresi gen yang sudah direkayasa

- Pemantauan transmisi gen terhadap keturunannya

UNSUR-UNSUR KLONING DNA

1. Enzim retraksi (enzim pemotong DNA)

2. Kloning vektor (pembawa)

3. Enzim ligase yang berfungsi menyambung rantai DNA

PROSES DASAR KLONING DNA

1. Pemotongan DNA (DNA organisme yang diteliti dan DNA vektor)

2. Penyambungan potongan-potongan (fragmen) DNA organisme dengan DNA vektor

menggunakan enzim ligase

3. Transformasi rekombinan DNA (vektor + DNA sisipan) ke dalam sel bakteri Eschericia

coli.

4. Seleksi (screening) untuk mendapatkan klon DNA yang diinginkan.

GMO (GENETIC MODIFIED ORGANISM)

DEFINISI: Manipulasi gen untuk mendapatkan galur baru dengan cara menyisipkan bagian

gen ke tubuh organisme tertentu

SEJARAH:

Pemuliaan tanaman

(8000 SM) di Mesopotamia

Tanaman transgenic tahun 1977

PENGGUNAAN GMO DALAM INDUSTRY PANGAN

Keuntungan:

1. Sistem pertanian dapat ditingkatkan produktivitasnya dengan menggunakan pengolahan

konvensional termodifikasi

2. Pemupukan alami lebih ramah lingkungan

3. Potensi pertanian yang belum teroptimalkan, mereduksi penggunaan bahan kimia dalam

pestisida

4. Pengembangan bioteknologi mendukung ketahanan pangan di Indonesia

CONTOH GMO: TANAMAN TRANSGENIK

Identifikasi atau pencarian gen

Kloning gen Vektor cloning dimasukkan ke dalam bakteri

Gen diperbanyak

Transfer gen ke sel tumbuhan

Metode transformasi DNA yang diperantarai Agrobacterium tumefaciens

1. Metode senjata gen atau penembakan mikro-proyektil

2. Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens

3. Metode elektroporasi

PRODUK GMO PANGAN YANG DIKEMBANGKAN DI DUNIA

No. Jenis Tanaman Sasaran Modifikasi Genetik Hasil Modifikasi

1. Padi Mengandung provitamin A (beta-

karotena) dalam jumlah tinggi

Gen dari tumbuhan narisis, jagung, gan

bakteri Erwinia yang disisipkan pada

kromosom padi

2. Jagung, kapas, kentang Tahan (resisten) terhadap hama Gen toksin Bt (Crystal protoksin) dari

bakteri Bacillus thuringiensis ditransfer ke

dalam tanaman

3. Kedelai Mengandung asam oleat tinggi dan tahan

terhadap herbisida glifosat. Dengan

demikian, Ketika disemprot dengan

herbisida tersebut, hanya gulma di sekitar

kedelai tersebut yang akan mati

Gen resisten herbisida dari bakteri

Agrobacterium galur CP4 dimasukkan ke

kedelai dan juga digunakan teknologi

molecular untuk meningkatkan

pembentukan asam oleat

SAPI TRANSGENIK

• Ternak transgenik dihasilkan dengan injeksimikro gen ke dalam pronukleus sesaat setelah

fertilisasi dan sebelum terjadi pembelahan pertama zigot, selanjutnya ditanam di dalam

rahim induk pengganti.

• Ternak transgenik adalah seekor ternak yang DNA keturunannya telah ditingkatkan melalui

penambahan atau penggantian DNA dari sumber lain melalui rekombinan DNA.

SAPI TRANSGENIK

• Produksi sapi transgenik sangat tergantung pada kualitas embrio satu sel yang akan di

injeksi.

• Bila embrio diperoleh secara in vivo maka prosedur diawali dengan superovulasi ternak

donor (untuk mendapatkan banyak embrio), koleksi zigot (embrio satu sel), mikro injeksi

DNA pada embrio, kultur embrio sampai fase blastosis, ditransfer pada induk resipien dan

diperoleh sapi transgenik

SAPI TRANSGENIK

• Kemampuan untuk mengintroduksi gen-gen fungsional ke dalam hewan menjadi

terobosan berharga untuk memecahkan proses dan sistem biologi yang kompleks.

• Transgenik mengatasi kekurangan dari praktek pembiakan satwa secara klasik yang

membutuhkan waktu lama untuk modifikasinya, dan dapat pula digunakan untuk

menghilangkan barrier/ keterbatasan lintas taksonomik.

KEAMANAN DAN PERATURAN (PP) DALAM PENGGUNAAN GMO

• PP No. 28 tahun 2004 , Pangan hasil rekayasa genetika adalah pangan atau produk pangan yang diturunkan

dari tanaman atau hewan yang dihasilkan melalui proses rekayasa genetika.

• Kesimpulan isi: setiap orang yang memproduksi pangan, bahan baku, bahan tambahan pangan, atau bahan

bantu lainnya yang merupakan GMO harus memeriksakan bahan-bahan tersebut ke komisi yang menangani

keamanan pangan produk rekayasa genetika.

• Pasal 35 PP No. 69 tahun 1999: pada label untuk pangan hasil rekayasa genetika wajib dicantukan tulisan

PANGAN HASIL REKAYASA GENETIKA

• Tahap uji produk GMO: Pengujian Fasilitas Uji Terbatas (FUT) dan Lapangan Uji Terbatas (LUT)

REKAYASA GENETIKA DNA REKOMBINAN

• Teknik DNA Rekombinan: Rekayasa genetika untuk

menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan

gen tertentu dengan DNA genom.

• Rantai DNA: polimer panjang, tak bercabang, tersusun

dari empat macam subunit, yaitu: adenine (A), sitonin

(C), guanin (G), dan timin (T).

• Nukleotida dirangkai dengan ikatan fosfodiester pada

sebuah gugus deoksikarboribosa

DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Mekanisme seksual (berasal dari dua sel berbeda)

PERANGKAT TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Transposon: alat untuk melakukan mutagenesis dan menyisipkan penanda

Pustaka genom: menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan

Enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA

Pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan dan atau mendeteksi kol yang benar

ENZIM RESTRIKSI

• Digunakan untuk memotong DNA

pada sekuens spesifik yang

panjangnya empat sampai enam

panjang basa.

TIPE PEMOTONGAN ENZIM RESTRIKSI

ENZIM SELULER

Enzim endonuklease

• Mengenali batas-batas sekuen nukleotida spesifik dan berfungsi dalam restriction atau peotongan bahan-bahan genetik

DNA polimerisasi • Enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA

Enzim RNA Polimerisasi

• Berfungsi untuk membaca sekuen DNA dan menyintesis molekul RNA komplementer

Enzim DNA Ligase

• Berfungsi untuk mwnyambungkan suatu bahan genetic dengan bahan genetic lainnya

VEKTOR KLONING

• Vektor adalah molekul DNA yang digunakan sebagai pembawa gen asing ke dalam sel

inang.

• Contoh: plasmid.

• Plasmid: molekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat melakukan

replikasi sendiri.

• Plasmid tersebar luas di antara mikroorganisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi

dari sekitar 1 kb hingga lebih dari 250 kb.

Syarat plasmid sebagai vector cloning:

a. Mempunyai ukuran relative kecil bila dibandingkan

dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan

mudah melintasinya

b. Mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker

yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke

dalam sel inang

c. Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-

kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat

digunakan sebagai tempat penyusunan fragmen

DNA

d. Mempunyai titik awal replikasi sehingga dapat

melakukan replikasi di dalam sel inang.

BAKTERIOFAG

• Definisi: virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidup yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag sebagai vector cloning pada

sel inang

• Jenis-Jenis Bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vector cloning:

a. Bakteriofag I

b. Bakteriofag M13

c. Kosmid

d. Fosmid

e. Vektor YACs

f. Vektor YEPs

g. Plasmid Ti Agrobcterium tumefaciens

h. Baculovirus

BAKTERIOFAG 1

• Virus kompleks yang menginfeksi bakteri E. Coli.

• Dua macam vector cloning yang berasal dari DNA 1:

• A. vector insersional: dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing

• B. vector substitusi: untuk membawa fragmen DNA asing harus membuang sebagian atau

seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah non essensial dan menggantinya dengan

urutan basa fragmen DNA Asing tersebut.

• Mempunyai dua fase daur hidup: fase litik dan fase lisogenik.

BAKTERIOFAG M13

• Mempunyai struktur berupa filamen

• Ketika berada dalam sel inang genom M13 berubah menjadi untai ganda sirkuler yang

dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100 Salinan

• Salinan-Salinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke

permukaan sel inang.

• Dengan cara seperti ini DNA M13 akan terselubungi oleh membrane dan keluar dari sel

inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa menyebabkan lisis

KOSMID

• Vektor yang diturunkan dari plasmid yang mengandung ujung kohesif dari fage lamda.

• Vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari DNA 1dengan plasmid

• Kemampuan untuk membawa fragmen sisipan DNA yang lebih besar yaitu berkisar antara

sepanjang 32 hingga 47 kb

FOSMID

• Gabungan antara plasmid

dan fag 1

• Membawa segmen DNA 1

yang berisi tempat att.

• Tempat att digunakan oleh

DNA 1untuk berintegrasi

dengan kromosom sel

inang pada fase lisogenik

VEKTOR YACS

• Menggabungkan antara DNA plasmid dan segmen tertentu DNA kromosom khamir

• Segmen kromosom khamir yang digunakan terdiri atas sekuens telomir, sentromir, dan titik

awal replikai

• VEKTOR YEPS

• Dikenal dengan nama plasmid 2 mikron.

• Plasmid ini memiliki sekuens DNA sepanjang 6 kb, yang mencakup titik awal replikasi dan dua

gen yang berfungsi sebagai penanda seleksi, misalnya gen LEU2 yang terlibat dalam biosintesis

leusin.

PLASMID TI AGROBACTERIUM TUMIFACIENS

• Ketika infeksi berlangsung, T-DNA akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman

mengakibatkan terjadinya pertumbuhan sel-sel tanaman yang tidak terkendali. Akibatnya

akan terbentuk tumor atau crown gall.

• Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA dapat

mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman.

• Gen target selanjutnya akan diekspresikan menggunakan system DNA tanaman

BACULOVIRUS

• Virus yang menginfeksi serangga.

• Polihedrin akan terakumulasi dalam jumlah sangat besar di dalam nuclei sel-sel serangga

yang diinfeksi karena gen tersebut mempunya promoter yang sangat aktif

• VEKTOR KLONING PADA MAMALIA

• SV40, panjang hanya 5,2 kb. Genom ini mengalami kesulitan dalam pengepakan (packaging)

sehingga pemanfaatan SV40 untuk mentransfer fragmen-fragmen berukuran besar menjadi

terbatas.

BAKTERI REPLIKASI

• Bakteri berperan sebagai vector, yaitu beberapa mikroba yang membawa gen yang

diinginkan ke genom target

• Sebagai alat yang digunakan dalam modifikasi genetic

• Objek rekayasa, secara genetic lebih mudah dipelajari dan pertumbuhannya lebih cepat

sehingga dijadikan agen perantara dalam transfer genetic dalam bentuk vector

rekombinan

PERTUKARAN MATERI GENETIC PADA BAKTERI

• 1. Transfer Gen:

• A. Transduksi

• B. Transformasi

• C. Konjugasi

KODE GENETIK

• Kode genetic bersifat tidak saling tumpeng tindih, kecuali pada kasus tertentu, misalnya

bakteriofag X174 yang mempunyai kodon tumpang tindih

• Tidak ada sela (gap) di antara kodon yang satu dengan kodon yang lainnya

• Tidak ada koma di antara kodon

• Kodon bersifat degenerate artinya ada beberapa asam amino yang mempunyai lebih dari

satu kodon

• Kodon bersifat hampir universal karena pada beberapa organel berbeda dari kodon yang

digunakan pada sitoplasma

RESPON BAKTERI TERHADAP KERUSAKAN DNA

Missense mutation

Nonsense mutation

Insertion

Deletion Duplication

Frameshift mutation

Repeat expansion

TERIMA KASIH