DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
-
Upload
hadianti-nurfitri -
Category
Documents
-
view
263 -
download
1
Transcript of DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
1/21
Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta
tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA
kromosom dan DNA vektor, pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi,
pembentukan molekul DNA rekombinan, dan transformasi sel inang oleh molekul
DNA rekombinan. Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasisa
diharapkan mampu menjelaskan!
1. pengertian teknologi DNA rekombinan,
2. dua segi manfaat teknologi DNA rekombinan,
3. tahapan-tahapan kloning gen,
4. pengertian dan cara kerja enzim restriksi, dan
5. garis besar cara seleksi transforman dan seleksi rekombinan.
"engetahuan aal yang diperlukan oleh mahasisa agar dapat mempelajari pokok
bahasan ini dengan lebih baik adalah struktur dan sifat-sifat asam nukleat seperti
yang telah dibahas pada #ab $$.
Pengertian Teknologi DNA Rekombinan
Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan
organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan
untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun %&'(-an
berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam
mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang
bertanggung jaab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk.
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
2/21
)eknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah
yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen
tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan
sebagai kloning gen. #anyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan
pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin
paling representatif, menyebutkan baha teknologi DNA rekombinan adalah
pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul
DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan
mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai
sel inang.
)eknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. "ertama, dengan
mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan
tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. *edua, teknologi ini memungkinkan
diperolehnya produk gen tertentu dalam aktu lebih cepat dan jumlah lebih besar
daripada produksi secara konvensional.
"ada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui
teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu +ambar &.%.
)ahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomikkromosom yang akan diklon,
pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran,
isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan
molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA
rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA
rekombinan.
Isolasi DNA
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
3/21
$solasi DNA diaali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang
dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-
leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. /angkah berikutnya
adalah lisis sel. #ahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang
lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton 0-%(( atau
dengan sodium dodesil sulfat +SDS. "ada eukariot langkah ini harus disertai
dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-
remukan sel harus dibuang. #iasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan
sentrifugasi. "rotein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut
organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara
enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan
sel masih tercampur dengan 1NA sehingga perlu ditambahkan 1NAse untuk
membersihkan DNA dari 1NA. 2olekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian
dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan
sentrifugasi kerapatan menggunakan 3s3l +lihat #ab $$.
Gambar 9.1. Skema tahapan kloning gen
)eknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun
DNA vektor, khususnya plasmid. 4ntuk memilih di antara kedua macam molekul
DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. "ertama, plasmid
pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan
mempunyai bentuk covalently closed circular+333, sedangkan DNA kromosom
jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat
tinggi. "erbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
4/21
denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. 5leh karena itu, aplikasi
kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
"endekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat
pearna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul
DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah
yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian,
perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA
kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat
dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.
Enzim Restriksi
)ahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik
maupun plasmid. "erkembangan teknik pemotongan DNA beraal dari saat
ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli,yang
berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda +l. 6irus l digunakan untuk
menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain * dan 3. 7ika l yang telah menginfeksi
strain 3 diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi
strain 3, maka akan diperoleh l progeni +keturunan yang lebih kurang sama
banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini,
dikatakan baha efficiency of plating+85" dari strain 3 ke strain 3 adalah %.
Namun, jika l yang diisolasi dari strain 3 digunakan untuk menginfeksi strain *,
maka nilai 85"-nya hanya %(-9. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak
%%(.((( kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain *
mempunyai nilai 85" sebesar %, baik ketika direinfeksikan pada strain * maupun
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
5/21
pada strain 3. :al ini terjadi karena adanya sistem restriksimodifikasi +rm pada
strain *.
"ada aktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain 3 diinfeksikan ke strain *, molekul
DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain *.
Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain *
juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa
pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan
(recognition sites)bagi enzim restriksi tersebut.
DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada
siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan
terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diariskan dan harus
dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang
diinfeksikan dari strain * ke strain 3 dan dikembalikan lagi ke strain * akan menjadi
rentan terhadap enzim restriksi.
2etilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA.
#erlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga
molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi.
8nzim restriksi dari strain * telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim
ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi
tipe I. #anyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies
bakteri lainnya.
"ada tahun %&'( ).7. *elly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan
ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. $a
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
6/21
mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzaestrain 1d, dan sejak
saat itu ditemukan lebih dari 9'; enzim restriksi tipe $$ dari berbagai spesies dan
strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam
tata kerja rekayasa genetika.
8nzim restriksi tipe $$ antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai
berikut!
%. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di
dalam molekul DNA
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
7/21
)empat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa
pasang basa. "emotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan
menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung ;> yang runcing karena masing-
masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan
ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung
runcing sering pula disebut sebagai !ng lengket (sticky end) atau !ng
kohesi".
:al itu berbeda dengan enzim restriksi seperti :ae $$$, yang mempunyai tempat
pemotongan DNA pada posisi yang sama. *edua fragmen hasil pemotongannya
akan mempunyai ujung ;> yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya
sama panjangnya. ?ragmen-fragmen DNA dengan !ng tmpl (blunt end)akan
sulit untuk disambungkan. #iasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk
menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul
linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk
menyintesis untai tunggal homopolimerik =>.
#igasi $olekl % molekl DNA
"emotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus
menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen
DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan +diligasi dengan DNA vektor
yang sudah berbentuk linier.
Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in
vitro. "ertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. *edua, ligasi
menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coliyang telah diinfeksi dengan bakteriofag
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
8/21
)9 atau lazim disebut sebagai enzim )9ligase. 7ika cara yang pertama hanya dapat
digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan
baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang
ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase
untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik =>. Dengan untai tunggal semacam
ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi
menggunakan DNA ligase.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya ='@3. Akan tetapi, pada suhu
ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan
menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan
tersebut. 5leh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 9 dan %;@3
dengan aktu inkubasi +reaksi yang diperpanjang +sering kali hingga semalam.
"ada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor,
khususnya plasmid, dapat terjadi peristia religasi atau ligasi sendiri sehingga
plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler
kembali. :al ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. 4ntuk meningkatkan efisiensi
ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan
konsentrasi tinggi +lebih dari %((gml, perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase
untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung ;> pada molekul DNA yang telah
terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik =>
seperti telah disebutkan di atas.
)ransformasi Sel $nang
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
9/21
)ahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA
genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut.
menggunakan teknik elektroforesis +lihat #ab 0. 7ika hasil elektroforesis
menunjukkan baha fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik
pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi
ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat.
Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA
rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak
terligasi satu sama lain. )ahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel
inang ini dinamakan trans"ormasikarena sel inang diharapkan akan mengalami
perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
)eknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun %&'( oleh 2. 2andel
dan A. :iga, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi
pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami
seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. *emampuan transformasi B. subtilis
pada aktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof +tidak
dapat tumbuh pada medium minimal menjadi prototrof +dapat tumbuh pada medium
minimal dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. #aru beberapa aktu
kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya
juga dikembangkan pada transformasi E.coli.
:al terpenting yang ditemukan oleh 2andel dan :iga adalah perlakuan kalsium
klorid +3a3l
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
10/21
?rekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di
dalam larutan 3a3l
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
11/21
berarti transformasi gagal, +
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
12/21
#ab ini akan membahas pengertian dan macam-macam vektor kloning, baik yang
digunakan pada sel inang prokariot maupun eukariot. Setelah mempelajari pokok
bahasan di dalam bab ini mahasisa diharapkan mampu menjelaskan!
1. pengertian vektor kloning,
2. ciri-ciri plasmid,
3. ciri-ciri kosmid,
4. ciri-ciri bakteriofag, dan
5. ciri-ciri vektor kloning pada khamir dan eukariot tingkat tinggi.
4ntuk dapat mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini dengan lebih baik
mahasisa disarankan telah memahami pokok bahasan tentang dasar-dasar
teknologi DNA rekombinan dan konstruksi perpustakaan gen, yang masing-masing
telah diberikan pada #ab $0 dan 0.
Pengertian &an $a*am+ma*am ,ektor -loning
"ada #ab $0 antara lain telah dibicarakan baha transformasi sel inang dilakukan
menggunakan perantara vektor. 7adi, vektor adalah molekul DNA yang berfungsi
sebagai ahana atau kendaraan yang akan membaa suatu fragmen DNA masuk
ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen
DNA asing tersebut. 6ektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot,
khususnya 8. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu,
vektor CA3s dan C8ps dapat digunakan pada khamir. "lasmid )i, baculovirus, S69(,
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
13/21
dan retrovirus merupakan vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot
tingkat tinggi.
Plasmi&
Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai ganda
di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. "lasmid tersebar luas di
antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar % kb hingga
lebih dari
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
14/21
pengenalan 8co1 $, salah satu enzim restriksi yang sangat umum digunakan,
terletak di luar marker. 5leh karena salah satu marker akan menjadi tempat
penyisipan fragmen DNA asing, maka 8co1 $ tidak dapat digunakan untuk
memotong p#1=
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
15/21
koloni yang hidup di tetrasiklin tetapi mati di ampisilin. Secara teknis pekerjaan ini
dilakukan menggunakan transfer koloni atau replica plating +lihat #ab 0.
"lasmid yang digunakan pada bakteri gram negatif seperti halnya p#1=
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
16/21
tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. 5leh
karena itu, DNA l tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning.
Akan tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA l yang memenuhi
syarat sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA
l, yaitu
vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing,
vektor substitusi, yang untuk membaa fragmen DNA asing harus membuang
sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan
menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.
Di antara kedua macam vektor l tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan
karena kemampuannya untuk membaa fragmen DNA asing hingga
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
17/21
ambar %%.
-
7/23/2019 DNA Rekombinan Dan Vektor Kloning
18/21
yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar %(( salinan. Salinan-
salinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke
permukaan sel inang. Dengan cara seperti ini DNA 2%= akan terselubungi oleh
membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa
menyebabkan lisis. 5leh karena fag 2%= terselubungi dengan cara pembentukan
kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang
dapat disisipkan kepadanya. $nilah salah satu keuntungan penggunaan 2%= sebagai
vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan l. *euntungan lainnya adalah
baha 2%= dapat digunakan untuk sekuensing +penentuan urutan basa DNA dan
mutagenesis tapak terarah +site directed mutagenesis karena untai tunggal DNA
2%= dapat dijadikan cetakan +templat di dalam kedua proses tersebut.
2eskipun demikian, 2%= hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada DNAnya
yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan restriksinya
pun sangat sedikit. Namun, sejumlah derivat 2%= telah dikonstruksi untuk mengatasi
masalah tersebut.
-osmi&
*osmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari DNA l
dengan plasmid. *emampuannya untuk membaa fragmen DNA sepanjang =