Makalah Teknologi DNA Rekombinan (TDR)

of 32

  • date post

    07-Mar-2016
  • Category

    Documents

  • view

    1.254
  • download

    211

Embed Size (px)

description

Perkembangan bioteknologi sekarang ini sudah semakin pesat terutama di negara-negara maju. Penerapan bioteknologi di bidang pangan dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan (TDR) menghasilkan tanaman dan produk unggul karena mengandung zat gizi yang berkualitas tinggi dibandingkan tanaman biasa, serta lebih tahan terhadap hama penyakit dan tekanan lingkungan. Teknologi DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom.

Transcript of Makalah Teknologi DNA Rekombinan (TDR)

  • TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

    Disusun Guna Memenuhi Tugas Mata Kuliah Bioteknologi

    Dosen Pengampu

    Dr. drh. Heru Nurcahyo, M.Kes

    Disusun Oleh Kelompok 1

    Andy Maryam (12708251011)

    Nurul Imtihan (12708251026)

    HBA Jayawardana (12708251036)

    PRODI PENDIDIKAN SAINS

    PROGRAM PASCA SARJANA

    UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA

    2013

  • 1

    BAB I

    PENDAHULUAN

    Perkembangan bioteknologi sekarang ini sudah semakin pesat terutama di

    negara-negara maju. Penerapan bioteknologi di bidang pangan dengan menggunakan

    teknologi DNA rekombinan menghasilkan tanaman dan produk unggul karena

    mengandung zat gizi yang berkualitas tinggi dibandingkan tanaman biasa, serta lebih

    tahan terhadap hama penyakit dan tekanan lingkungan. Teknologi DNA rekombinan

    adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat baru dengan cara

    merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom.

    Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua manfaat yaitu pertama, dengan

    mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan

    tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan

    diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar

    daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan

    suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan

    beberapa tahapan tertentu.

    Tahapan-tahapan tersebut adalah isoasi DNA genomik yang akan diklon,

    pemotongan molekul DNA menjdi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran,

    isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan

    DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan,

    reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.

    Pada makalah ini secara khusus akan membahas mengenai prinsip dasar dalam

    teknologi DNA rekombinan, proses pemotongan dan penyisipan gen.

  • 2

    BAB II

    TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

    A. Prinsip Dasar Teknologi DNA Rekombinan Teknik dalam manipulasi gen sangat kompleks dan beragam. Namun

    prinsip-prinsip dasar dalam teknologi DNA rekombinan cukup sederhana yang

    meliputi tahapan sebagai berikut (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).

    1. Generasi fragmen DNA dan pemilihan bagian yang diinginkan dari DNA

    (misalnya gen manusia).

    2. Memasukkan atau menyisipkan DNA yang terpilih ke dalam kloning vektor

    untuk membuat DNA rekombinan.

    3. Pengenalan vektor rekombinan ke sel inang (misalnya bakteri).

    4. Perbanyakan dan seleksi klon yang mengandung molekul rekombinan.

    5. Ekspresi gen untuk menghasilkan produk yang diinginkan.

    Gambar 1. Prinsip dasar teknologi DNA rekombinan

    B. Aspek-aspek dalam Teknologi DNA Rekombinan Teknologi DNA rekombinan secara khusus mengacu pada aspek-aspek

    diantaranya bahan molekuler rekayasa genetika, sel inang, vektor, metode

    transfer gen, dan strategi dalam kloning gen (Chakrapani dan Satyanarayana,

    2007).

  • 3

    1. Bahan Molekuler dalam Rekayasa Genetika Perangkat rekayasa genetika atau bahan molekuler yang umum

    digunakan dalam penelitian teknologi DNA rekombinan adalah enzim. Enzim

    yang berperan penting dalam teknologi DNA rekombinan adalah enzim

    restriksi dan enzim DNA ligase. Enzim restriksi merupakan suatu

    endonuklease yang memiliki kemampuan mengenal dan memotong urutan

    nukleotida pada basa-basa secara spesifik (DNA sekuens spesifik yang

    panjangnya empat sampai dengan enam pasang basa), sehingga

    pemotongannya bersifat terarah (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).

    Enzim restriksi juga dikenal dengan nama enzim endonuklease restriksi

    yang ditemukan oleh Werner Arber dan Hamilton Smith tahun 1960 dari

    mikroba yang memotong DNA untai ganda. Enzim restriksi memotong DNA

    pada tempat yang tepat (bukan sembarang tempat). Bagian yang dipotong oleh

    enzim ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan

    nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai

    tempat atau bagian yang akan dipotongnya (Tjahjoleksono, 2010). Berikut ini

    beberapa enzim restriksi, sekuens pengenal dan produk.

    Sumber Sekuens Pengenal Produk EcoRI (Escherichia coli)

    5....G-A-A-T-T-C...3 3....C-T-T-A-A-G....5

    A-A-T-T-C... G... ....G C-T-T-A-A

    BamHI (Bacillus amyloliquefaciens)

    5....G-G-A-T-C-C....3 3....C-C-T-A-G-G....5

    G-A-T-C-C... G... ....G ....C-C-T-A-G

    HaeIII (Haemophilus aegyptius)

    5....G-G-C-C....3 3....C-C-G-G....5

    *C-C... G-G... ....*G-G .... C-C

    HindIII (Haemophilus influenza)

    5....A-A-G-C-T-T....3 3....T-T-C-G-A-A....5

    A-G-C-T-T... A... ...A ....T-T-C-G-A

  • 4

    Noti (Nocardia otitidis)

    5....G-C-G-G-C-C-G-C....3 3....C-G-C-C-G-G-C-G....5

    G-G-C-C-G-C... C-G... ...G-C ...C-G-C-C-G-G...

    Catatan:tanda(-) merupakan daerah yang dipotong. Tanda (*) adalah produk dengan ujung tumpul sedangkan yang lainnya adalah produk dengan ujung lancip/lengket

    Tabel 1. Beberapa enzim restriksi, sekuens pengenal dan produk

    Salah satu enzim restriksi ini adalah enzim EcoRI yang telah diisolasi

    pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli

    (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007). Enzim EcoRI memotong DNA pada

    bagian yang urutan basanya GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI). Pada

    DNA untai ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens

    yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap untai

    dari untai ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Potongan-potongan atau

    fragmen-fragmen DNA untai ganda yang dihasilkan akibat pemotongan di

    setiap untainya akan memiliki ujung beruntai tunggal. Ujung ini dikenal

    dengan istilah sticky ends atau cohesive ends (ujung kohesif) dan blunt ends

    (ujung tumpul) (Tjahjoleksono, 2010). Fragmen DNA dengan sticky ends

    adalah partikel yang digunakan untuk eksperimen DNA rekombinan. Hal ini

    karena ujung untai tunggal DNA-nya mudah berpasangan dengan fragmen

    DNA komplementer lain yang memiliki sticky ends (Chakrapani dan

    Satyanarayana, 2007).

    Tatanama enzim restriksi mengikuti standar prosedur berdasarkan

    sumber bakteri yang diisolasi. Huruf pertama pada enzim yang ditulis miring

    menunjukkan nama genus, diikuti dua huruf berikutnya juga ditulis miring

    menunjukkan spesies, selanjutnya adalah strain organisme dan terakhir angka

    Romawi yang menunjukkan urutan penemuan. Beberapa contoh penamaan

    enzim seperti berikut ini. EcoRI adalah enzim yang berasal dari Escherichia

    (E) coli (co), strain Ry13 (R), dan merupakan endonuklease pertama (I) yang

    ditemukan. HindIII adalah Haemophilus (H) influenzae (in), strain Rd (d), dan

    merupakan endonukleus ketiga (III)yang ditemukan.

  • 5

    Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung atau menyisipkan

    DNA. Pada tahun 1972, David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg berhasil

    membuat molekul DNA rekombinan. Mereka menggabungkan fragmen-

    fragmen DNA dengan cara memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari satu

    fragmen dengan ujung sticky ends fragmen lainnya, kemudian

    menyambungkan kedua ujung fragmen tersebut secara kovalen dengan

    menggunakan enzim DNA ligase (Tjahjoleksono, 2010).

    Keberadaan enzim DNA ligase sangat diperlukan untuk menangkap

    potongan DNA asing. Selain kedua enzim tersebut enzim (restriksi dan enzim

    DNA ligase), terdapat beberapa enzim yang ikut berperan dalam teknologi

    DNA rekombinan seperti dalam tabel berikut.

    Enzim Kegunaan/Reaksi Alkalin posfatase Menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5 pada untai

    ganda/tunggal DNA (atau RNA) Bal 31 nuklease For the progressive shortening of DNA DNA ligase Menyambungkan dua mulekul/fragmen DNA DNA polymerase I Mengisi kekosongan dalam dupleks dngan penambahan

    nukleotida pada ujung 3 Dnase I Memproduksi single-standed nicks dalam DNA Endonuklease III Menghilangkan residu nukleotida dari ujung 3 untai

    DNA eksonuklease Menghilangkan residu nukleotida dari ujung 5 suatu

    dupleks untuk membuka ujung 3 untai tunggal Polynukleotida kinase Menambah fosfat pada ujung 5-OH polinukleotida untuk

    melabel atau melangsungkan terjadinya ligasi Enzim restriksi Memotong untai ganda DNA pada urutan basa yang

    spesifik Transkriptase balik Membuat salinan DNA dari molekul RNA Rnase A Memotong dan mencerna RNA (tidak termasuk DNA) Rnase H Memotong dan mencerna untai RNA pada RNA-DNA

    heterodupleks Taq DNA polymerase Digunakan dalam PCR (Polymerase Chain Reaction) SI nuclease Mendegradasi untai tunggal DNA dan RNA Terminal transferase Menambahkan ekor homopolimer pada ujung 3-OH

    dupleks linier

    Tabel 2. Beberapa enzim yang biasa digunakan dalam teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).

  • 6

    2. Sel Inang Sel inang merupakan sistem kehidupan atau sel yang membawa

    molekul DNA rekombinan. Jenis sel inang pada prokariotik (bakteri) berbeda

    dengan sel inang pada eukariotik (jamur, hewan dan tumbuhan). Beberapa

    contoh sel inang yang digunakan dalam rekayasa genetika dapat dilihat pada

    tabel sebagai berikut.

    Kelompok Contoh Prokariotik

    Bakteri Escherichia coli Bacillus subtilis Streptomyces sp

    Eukariotik Fungi Hewan Tumbuhan

    Saccharomyces cerevisiae Aspergi