PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN 2010.pdf

download PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN 2010.pdf

If you can't read please download the document

  • date post

    31-Dec-2016
  • Category

    Documents

  • view

    237
  • download

    10

Embed Size (px)

Transcript of PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN 2010.pdf

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11

    PRINSIP TEKNOLOGI PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINANDNA REKOMBINAN

    DEBBIE S. RETNONINGRUM

    SEKOLAH FARMASI

    INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22

    PUSTAKAPUSTAKA

    1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110

    2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, hal. 44-55

    3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 33

    TEKNOLOGI DNA REKOMBINANTEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

    Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda: fenomena umum di alam.

    Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap gejala difteri.

    Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam alam.

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 44

    TEKNOLOGI DNA REKOMBINANTEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

    Duplikasi fenomena alam di laboratorium Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi

    genetik ke dalam suatu organisme.

    Manipulasi genetik

    E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri) Saccharomyces cerevisiae (ragi)

    Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara tradisional.

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 55

    CONTOH PRODUK REKOMBINANCONTOH PRODUK REKOMBINAN

    ANTIBODI REKOMBINAN

    PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktornekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia

    VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria

    VAKSIN DNA

    TERAPI GEN

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 66

    CONTOH PRODUK REKOMBINANCONTOH PRODUK REKOMBINAN

    PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen

    PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 77

    TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

    PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)

    LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN)

    TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG& PERBANYAKAN DNA

    SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR REKOMBINAN

    DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)

    1972 Stanley Cohen danHerbert Boyer

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 88

    TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

    DNA kromosom

    Potong dengan enzim restriksiDNA plasmid

    ligasi

    DNA rekombinan

    transformasi sel

    transforman1 sel tumbuh jadi 1 koloni

    klon

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 99

    KloningKloning DNA DNA keke PlasmidPlasmid

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1010

    SUMBER DNA SISIPANSUMBER DNA SISIPAN

    TIGA PENDEKATAN: KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA

    GENOMIK

    PRODUK PCR

    mRNA cDNA (eukariot)

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1111

    Kepustakaan genomikKepustakaan genomik (genomic library)(genomic library)

    Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup semua gen dari suatu organisme

    Contoh ukuran genom: Bacillus anthracis: 5,1 5,2 Megabasa

    Escherichia coli: 4 Megabasa

    Pseudomonas putida: 6,0 6,1 Megabasa

    Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1212

    KROMOSOM KROMOSOM vsvs PLASMID PLASMID

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1313

    PLASMIDPLASMID

    DNA UNTAI GANDA BERBENTUK LINGKARAN BERSALINAN TINGGI BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI) DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN) ADA DUA GEN MARKER:

    UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1414

    VEKTOR (Plasmid)VEKTOR (Plasmid)

    VEKTOR KLONING

    HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA

    VEKTOR EKSPRESI

    UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahankomponen untuk mempermudah proses downstream/pemurnian)

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1515

    Beberapa contoh vektor kloningBeberapa contoh vektor kloning

    Nama Tipe Sel inang Keterangan

    pBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umum

    pUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umum

    pBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac.

    gt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNA

    YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1616

    PETA PLASMIDPETA PLASMID

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1717

    ENZIM RESTRIKSIENZIM RESTRIKSI

    MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI

    TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN

    MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE

    MENGENALI URUTAN PALINDROM

    5 GAATTC 3

    3 CTTAAG 5

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1818

    DNA (ligase)5- NNNGOH PAATTCNNN -3

    3- NNNCTTAAP OHGNNN -5

    ligase

    5- NNNGAATTCNNN -33- NNNCTTAAGNNN -5

    ENZIM RESTRIKSI & LIGASEENZIM RESTRIKSI & LIGASEDNA (enzim restriksi)

    5- NNNGAATTCNNN -33- NNNCTTAAGNNN -5

    EcoRI

    5- NNNGOH PAATTCNNN -3

    3- NNNCTTAA P OHGNNN -5

    Sisi pengenalan enzim restriksi

    Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawah

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1919

    CONTOH CONTOH ENZIM RESTRIKSIENZIM RESTRIKSI

    EcoRI (Escherichia coli galur R): GAATTC (ujung lancip)

    BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): GGATCC (ujung lancip)

    BglII (Bacillus globigii): AGATCT (ujung lancip)

    SalI (Streptomyces albus): GTCGAC (ujung lancip)

    PstI (Providencia stuartii 164): CTGCAG (ujung lancip) HindIII (Haemophilus influenzae): AAGCTT (ujung lancip)

    KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTACC (ujung lancip)

    XbaI (Xanthomonas bradii): TCTAGA (ujung lancip) HaeIII (Hemophilus aegyptius): GGCC (ujung tumpul)

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2020

    KloningKloning ProdukProduk PCRPCR

    PCR

    S. pyogenes M12 Gen ska

    Ligasi

    pGEMTrekombinan

    SDM

    Transformasi

    pGEMT/skaE. coli XL-Blue

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2121

    LIGASI PRODUK PCR KE LIGASI PRODUK PCR KE pGEMpGEM--TT

    Gen ska

    A A

    pGEM-T

    +

    pGEM-T REKOMBINAN

    ligasi Transformasi

    E. coli JM109

    E. coli pGEM-T REKKontrol +Kontrol

    LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTGLB/Amp

    Streptococcus pyogenes

  • Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Tek