DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.

Teknologi dna rekombinan (GENETIC ENGINEERING)

Teknik Rekombinan meliputi:

-Teknik untuk mengisolasi DNA-Teknik untuk memotong DNA.-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan

Organisme transgenik: organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya.

Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika

Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA Rekombinan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan.

Perubahan genetik suatu organisme, atau keturunan, teknik untuk menghilangkan karakteristik bahan yang tidak diinginkan atau untuk menghasilkan bahan yang baru yang diinginkan.

Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang diinginkan

Definisi:

Apa Rekayasa Genetika?

Isolasi dan pemurnian DNA• Isolasi DNA bakteri• Isolasi DNA plasmid• Pemurnian secara kimiawi dan enzimatis

Berbagai jenis dan karakterisasi vektor• vektor plasmid• vektor yeast• vektor bakteriofag

Enzim restriksi dan ligase• Jenis enzim restriksi• Faktor yang berpengaruh terhadap enzim restriksi• Faktor yang berpengaruh terhadap enzim ligase

Teknik Elektroforesis dan PCR• Faktor yang berpengaruh dalam elektroforesis• Faktor yang berpengaruh terhadap PCR

DNA sekuensing dan hibridisasi• southern blot• northern blot• western blot

DNA rekombinan dan Transformasi• Isolasi• Restriksi• Sel kompeten• Transformasi

Rekayasa genetik pada :• Rekayasa genetik pada hewan• Rekayasa genetik pada tumbuhan• Rekayasa genetika pada manusia

Produk transgenik, keamanan dan bioetika• Biosafety• bioetika• GMO dan genetically modofied foods

Rekayasa genetika, juga dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, berarti mengubah gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan Genetically Modified Organism (GMO) dengan genotipe baru

Berbagai jenis modifikasi genetik yang mungkin: memasukkan gen asing dari satu spesies menjadi

- spesies lain, - membentuk organisme transgenik; - mengubah gen yang ada sehingga produknya

berubah, - mengubah ekspresi gen sehingga ditranslasikan lebih sering atau tidak sama sekali

Awalnya manipulasi genetik secara tradisional seperti : pemuliaan selektif untuk meningkatkan nilai gizi tanaman → terlalu lambat

Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)

• Kloning gen untuk menentukan fungsinya • Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat

yang diinginkan

Rekayasa genetika dengan teknik molekuler • Memungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar

pada kecepatan yang jauh lebih cepat• Produksi bahan farmasi dalam jumlah besar

MENGAPA ILMUWAN MENGEMBANGKAN REKAYASA GENETIKA..?

Teknik Dasar Rekayasa Genetika

Selective BreedingTanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut

Hybridization (Crossbreeding)Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan karakteristik terbaik dari keduanya.(burung dara + perkutut = sinom)

Recombinant DNA TechnologiesTransformasi

Basic steps in genetic engineering

1. Isolasi gen2. Insersi ke dalam host menggunakan vector3. Perbanyak copy DNA sebanyak mungkin4. Pemisahan produk gen yang dihasilkan5. Ekstraksi produk gen yang diinginkan

Fluorescent proteins are a useful tool in biotechnology

Menjadi petanda adanya ekspresi gen dan protein target dalam sel-sel hidup suatu organisme

Paling banyak digunakan adalah green fluorescent protein (GFP) pertama kali diisolasi dari Victoria aequorea (ubur-ubur), dapat dilekatkan ke hampir semua protein dan yang menarik dan masih dapat menjadi fluorescent molecule.

Dapat digunakan untuk melokalisasi protein yang sebelumnya belum di-karakterisasi untuk memvisualisasikan dan melacak protein untuk lebih memahami peristiwa selular.

Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan

Hewan Transgenik

Tikus transgenik dapat digunakan untuk mempelajari sistem kekebalan tubuh dan penyakit genetik

Babi : Faktor VIII pada pembekuan darah, organ-organ untuk transplantasi

Hewan lain : hormon pertumbuhan IL-2 (kanker), albumin

Organisme rekombinan

Tanaman tahan hama jagung (gen toksin dari Bacillus

thuringiensis yang dapat membunuh serangga)

Tanaman tomat Golden rice (beta-carotene) Plant-based vaccines

Genetically Modified Organisms

Tanaman tahan hama Jagung Bt (mengandung gen toksin dari

Bacillus thuringiensis yang membunuh hama)

Golden rice (mengandung beta-carotene) Tanaman sebagai vaksin

Genetic engineering of Bt-resistant corn (Bt-corn)

Bt-transgenic plants are resistant to insects, no need for spraying

insecticide

Clone Bt toxin gene from bacteria and express in plants

Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida, serangga/ulat akan mati bila memakan jagung

Contoh penerapan rekayasa genetika pada tanaman“Golden Rice” mengandung gen untuk menghasilkan vitamin

A

Biji beras (endosperm) kekurangan senyawa essential seperti vitamin A dan precursornya (β-carotene). Defisiensi Vitamin A dapat meyebabkan kebutaan dan penurunan sistem imun tubuh.

HUMAN GENETIC ENGINEERING HUMAN GENETIC ENGINEERING Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen

dalam sel manusia yang hidupdalam sel manusia yang hidup

Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang disebabkan oleh gen yang cacat dalam sel paru-paru. disebabkan oleh gen yang cacat dalam sel paru-paru. Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan akan sembuhakan sembuh . .

Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan gen baru yang diinginkan ke virus yang diperbolehkan gen baru yang diinginkan ke virus yang diperbolehkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang memasukkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang memasukkan gen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnyagen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnya

HUMAN GENETIC HUMAN GENETIC ENGINEERING ENGINEERING

"Somatic" genetic engineeringRekayasa genetika yang menargetkan gen di organ Rekayasa genetika yang menargetkan gen di organ

tertentu dan jaringan tubuh orang yang ada tanpa tertentu dan jaringan tubuh orang yang ada tanpa mempengaruhi gen dalam telur atau sperma.mempengaruhi gen dalam telur atau sperma.

Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani uji klinis, dengan hasil yang beragam sampai saat uji klinis, dengan hasil yang beragam sampai saat ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat digunakan ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat digunakan dengan efektifdengan efektif

"Germ line" genetic "Germ line" genetic engineeringengineering

RRekayasa genetika yang menargetkan gen dalam ekayasa genetika yang menargetkan gen dalam

telur, sperma, atau embrio sangat awaltelur, sperma, atau embrio sangat awal Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam

tubuh individu yang dihasilkan, dan diwariskan tubuh individu yang dihasilkan, dan diwariskan kepada semua generasi berikutnyakepada semua generasi berikutnya

[note: The term "somatic" comes from the Greek "soma" for "body."The term "germline" refers to the "germ" or "germinal" cells, the eggs and sperm.

• Insulin (diabetics)• Factor VIII (males w/hemophilia A)• Factor IX (hemophilia B)• Human growth hormone• Erythropoietin (anemia)• Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs)• leptin

Produk DNA Recombinant untuk terapi pada manusia

DESIGNER BABY

Kesulitan pada Rekayasa Genetika Manusia

Inserting gene in correct cellsInserting gene so it is expressed correctly

– Orientation– Regulation

Controlling virus vectorEthical issues

KLONING GEN

Kloning - definisiDari Bahasa Yunani - klon, rantingKumpulan turunan suatu individu

yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)

Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya

Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Kloning DNA

Metoda untuk memurnikan atau

mengidentifikasi dan memperbanyak

suatu potongan DNA tertentu (klon) yang

dikehendaki dari campuran potongan-

potongan DNA yang kompleks.

Kloning Gen

Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut

Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

Tujuan mengklon GenMenentukan urutan basa nukleotida

penyusun gen tersebutMenganalisis atau mengidentifikasi

urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut

Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut

Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan

Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Sumber DNA untuk diklon DNA kromosom cDNA (complementary DNA) yang

disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)

DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR

Bahan / Alat untuk Mengklon

Enzim endonuklease restriksi Enzim ligaseVektorsInang (Host)Metoda untuk memasukkan DNA ke

dalam sel inang

Memotong DNAMenggunakan enzim

endonuklease restriksiUjung “lengket” (sticky

ends)Ujung “tumpul” (blunt

ends)

Penamaan enzimEcoRIE = genus (Escherichia)co = species (coli)R = strainI = # of enzyme

Penyambungan (pasting) DNA

Pembentukan ikatan-H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)

Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA

Vektor untuk Mengklon

Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut

Plasmid

DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad

Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

Vektor untuk MengklonPlasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki:

Replikator (origin of replication) Penanda (Marker) yang mudah diseleksi

(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)

Situs untuk mengklon (potongan DNA yang memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau penanda

Plasmid yang Dimiliki oleh Escherichia coli

Berasal dari plasmid alami E. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)

Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain

Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan

Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"

Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

Kloning Terorientasi

Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu

Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda

Vektor untuk Mengklon

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga

3 Cosmid

4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome) & YAC (Yeast Artificial Chromosome)

1. Memiliki origin of replication dari inang yang dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara independen terhadap genom inang.

2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asingketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putih

3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple cloning sites, MCS)

4. Mudah diisolasi dari sel inang.

Vektor berupa Plasmid

Multiple Cloning Site (MCS)

Vektor berupa Plasmid

Vektor berupa Plasmid

Keunggulan:Kecil, mudah pengerjaannyaStrategi seleksi mudahBerguna untuk mengklon potongan DNA ukuran kecil (< 10kbp)

Kelemahan:Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)

Bakteriofaga (phage)

Vektor berupa bakteriofaga (vectors)

Lengan kiri:Protein penyusun

kepala & ekorLengan kanan:

Sintesis DNAPengendalianLisis inang

Daerah yang dihilangkan:integrasi & eksisiPengendalian

Vektor berupa bakteriofaga (vectors)

Vektor berupa Bakteriofaga

Keunggulan:Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)

Seleksi berdasar ukuranKelemahan:

Lebih sulit pengerjaannya

Vektor Cosmid

Keunggulan:Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)

Seleksi berdasar ukuranPengerjaan seperti plasmid

Kelemahan:Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)

Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs cos (dihilangkan pada vektor )

Vektor Cosmid

Vektor BACReplikasi dimediasi oriS dan oriE

parA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel

Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR

Vecktor YAC

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

telomere telomerecentromere

URA3ARS HIS3

replicationorigin

markers

largeinserts

BACs dan YACs

Keunggulan:Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA

dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)Penting digunakan dalam proyek penetapan

urutan basa nukleotida total genomKelemahan:

Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat besar

BACs : Bacterial Artificial Chromosomes

YACs : Yeast Artificial Chromosomes

Shuttle VectorVektor yang dapat digunakan untuk dua macam

inang (memiliki origin of replication dari masing-masing inang)

Memilih Vektor

Ukuran DNA yang disisipkan

Ukuran vektor Situs enzim

restriksi yang tersedia

Jumlah salinan (copy number)

Efisiensi kloningKemampuan

untuk menapis DNA sisipan

Rencana penelitian selanjutnya

Cara Mengklon DNA (1)Isolasi vektor kloning

(plasmid bacterial) & DNA sumber gen

Pemotongan DNA sumber gen & vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama

Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase

Cara Mengklon DNA (2)Vektor kloning yang

telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang)

Penapisan sel pengklon (dan gen yang dimasukkan)

Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

Transformasi Sel InangMemasukkan plasmid (yang merupakan vektor yang telah disisipi gen) ke dalam sel inang

Transformasi PRA-INKUBASI

Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .

Transformasi INKUBASI

Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E. coli kompeten.

Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.

Transformasi KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)

Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel.

Transformasi PENYEMBUHAN (RECOVERY)

Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah mengalami cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45 menit)

Transformasi PENAPISAN (SCREENING)

Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan ditapis pada medium padat yang mengandung senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa oleh plasmid.

Koloni E. coli yang membawa plasmid dengan penanda gen pendar fluor (pGLO)

E. coli yang Membawa Plasmid pGlo

Penapisan KlonMedium pertumbuhan

diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin

Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya

Manfaat

Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu pengetahuan maupun dibidang terapan.

Contoh: Bidang Kesehatan:

Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetis. Merekdagang: HumulinR

Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).

Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri