Isolasi Dna

ISOLASI DNAKimia Makanan HalalKimia Makanan Halal

Daging merupakan hasil ternak yang tidak dapat dipisahkan darikehidupan manusia. Banyak produk makanan olahan yang

mengandung daging. Daging yang digunakan bisa berasal dari sapi,babi dan ayam.

Teknik deteksi dan identifikasi asal daging pada produk olahanmerupakan salah satu cara untuk menjamin keamanan dankehalalan pangan dalam upaya melindungi konsumen dari

pemalsuan informasi.

Sumber : ALMIRA PRIMASARIhttp://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/51386/2011apr.pdf?sequence=

1SENSITIVITAS GEN SITOKROM B (Cyt b) SEBAGAI MARKA SPESIFIK PADA

GENUS Rattus dan Mus UNTUKMENJAMIN KEAMANAN PANGAN

PRODUK ASAL DAGING

Adanya kandungan komponen bahan makanan yang mengandungbabi dalam bahan dan produk pangan dapat diidentifikasi melalui

lemak nya, protein nya, maupun DNAnya.

Adanya kandungan komponen bahan makanan yang mengandungbabi dalam bahan dan produk pangan dapat diidentifikasi melalui

lemak nya, protein nya, maupun DNAnya.

DNA lebih stabil dibandingkan dengan protein,terutama pada sampel yang telah mengalami proses pemanasan

dengan suhu tinggi.

DNA lebih stabil dibandingkan dengan protein,terutama pada sampel yang telah mengalami proses pemanasan

dengan suhu tinggi.

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik,dibangun oleh unit-unit dioksinukleotida. Asam nukleat

adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida.

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik,dibangun oleh unit-unit dioksinukleotida. Asam nukleat

adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida.

Con’t

Molekul DNA terdiri atas dua rantai polimer yang tersusun atas unit-unitmonomer nukleotida. Kedua rantai polinukleotidasusunan berpilin

(double helix) yang dihubungkan oleh ikt. hidrogen.

Masing-masing nukleotida tersusun atas tiga komponen yaitu gula(deoxyribosa), fosfat, basa nitrogen (Adenin dan Guanin basa purin,

Timin dan Cytosin basa pirimidin).

Antara nukleotida satu dengan yang lainnya dalam satu rantaipolinukleotida dihubungkan dengan ikatan fosfodiester melalui gugus

fosfat yang menghubungkan karbon ke tiga dari salah satu gugus guladengan karbon ke lima dari gula pada nukleotida lain.

DNA ditemui tersebar di seluruh inti sel (kecuali sel lemak) yaitu didalam kromosom. Selain itu DNA juga dijumpai dalam jumlah

sedikit di dalam plastid, mitokondria dan sentrosom.

Molekul DNA terdiri atas dua rantai polimer yang tersusun atas unit-unitmonomer nukleotida. Kedua rantai polinukleotidasusunan berpilin

(double helix) yang dihubungkan oleh ikt. hidrogen.

Masing-masing nukleotida tersusun atas tiga komponen yaitu gula(deoxyribosa), fosfat, basa nitrogen (Adenin dan Guanin basa purin,

Timin dan Cytosin basa pirimidin).

Antara nukleotida satu dengan yang lainnya dalam satu rantaipolinukleotida dihubungkan dengan ikatan fosfodiester melalui gugus

fosfat yang menghubungkan karbon ke tiga dari salah satu gugus guladengan karbon ke lima dari gula pada nukleotida lain.

DNA ditemui tersebar di seluruh inti sel (kecuali sel lemak) yaitu didalam kromosom. Selain itu DNA juga dijumpai dalam jumlah

sedikit di dalam plastid, mitokondria dan sentrosom.

Gen-gen yang paling sering digunakan sebagai penanda jenis hewanatau daging diantaranya adalah

sitokrom b (cyt b),12S dan 16S

subunit ribosom RNAdan daerah displacement loop (D-loop).

Gen-gen yang paling sering digunakan sebagai penanda jenis hewanatau daging diantaranya adalah

sitokrom b (cyt b),12S dan 16S

subunit ribosom RNAdan daerah displacement loop (D-loop).

Dalam melakukan deteksi untuk mengetahui halal tidak nya suatumakanan, maka Isolasi DNA merupakan prosedur pertama yang

akan ditempuh.

ISOLASI DNA

Isolasi DNA merupakan suatu proses untukmendapatkan DNA murni yang dapat digunakan

untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa.DNA dapat di isolasi dari berbagai sel yang

memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalaminti sel.

Isolasi DNA merupakan suatu proses untukmendapatkan DNA murni yang dapat digunakan

untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa.DNA dapat di isolasi dari berbagai sel yang

memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalaminti sel.

Bahan yang digunakan untuk Isolasi DNA

Binding buffer, yang terdiri dari berbagai macam komponen yaitu:

a) NaCl : untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, danmengendapkan DNA sewaktu di campur dengan etanol.b) EDTA : EDTA ini berfungsi sebagai perusak sel dengan caramengikat ion Mg (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritassel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease)c) SDS merupakan deterjen yang berfungsi merusak dinding ataumembran sel dan mendenaturasi proteind) Enzim protease : untuk denaturasi protein pada jaringane) Pemberian etanol berfungsi untuk memisahkan molekul-molekulnukleotida dari protein yang mungkin masih ada.

Sentrifugasi berfungsi pemecahan dinding sel dan membran intisecara fisik.

Binding buffer, yang terdiri dari berbagai macam komponen yaitu:

a) NaCl : untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, danmengendapkan DNA sewaktu di campur dengan etanol.b) EDTA : EDTA ini berfungsi sebagai perusak sel dengan caramengikat ion Mg (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritassel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease)c) SDS merupakan deterjen yang berfungsi merusak dinding ataumembran sel dan mendenaturasi proteind) Enzim protease : untuk denaturasi protein pada jaringane) Pemberian etanol berfungsi untuk memisahkan molekul-molekulnukleotida dari protein yang mungkin masih ada.

Sentrifugasi berfungsi pemecahan dinding sel dan membran intisecara fisik.

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yaknipenghancuran (lisis),

ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat sepertiselulosa dan protein,

serta pemurnian (purifikasi) DNA

Sumber : (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki(2000),

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yaknipenghancuran (lisis),

ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat sepertiselulosa dan protein,

serta pemurnian (purifikasi) DNA

Sumber : (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki(2000),

1.LISIS SEL

1.LISIS SEL

ENZIMATIKProteinase K

ENZIMATIKProteinase KFISIK/MEKA

NIK1. Menggerus sampel dengan

menggunakan mortar danpestle dalam nitrogen cair

2. Metode freezing-thawing3. Iradiasi ataupun Resonansi

(Giacomazzi et al., 2005)

FISIK/MEKANIK

1. Menggerus sampel denganmenggunakan mortar danpestle dalam nitrogen cair





KIMIAEDTA (ethyllenediamine

tetraacetic)Tris-Hcl

Sodium dodecyl sulphate (SDS)Cetyl trimethylammonium

bromide (CTAB)

KIMIAEDTA (ethyllenediamine

tetraacetic)Tris-Hcl

Sodium dodecyl sulphate (SDS)Cetyl trimethylammonium

bromide (CTAB)

FISIK/MEKANIK




FISIK/MEKANIK




2.PURIFIKASI DNA

2.PURIFIKASI DNA

Purifikasi DNA pada prinsipnyaadalah suatu cara ataumetoda untuk memisahkanDNA total dari komponen sellainnya.


Pada prinsipnya, metodepurifikasi pada semua jaringanhewan tidak jauh berbeda,yaitu terdiri atas tiga tahapanutama.

Tiga tahapan tersebut secaraberurutan adalahpenghancuran (lisis) membransel, pemisahan material DNAdari material organik sel lain,dan pemisahan DNA darilarutannya (presipitasi)





Kemurnian DNA tercermindalam rasio λ 260: λ 280dan harus antara 1,6 dan2,00. Penurunan rasio padaλ 260: λ 280 berarti masihada protein di dalamnya.

Kemurnian DNA tercermindalam rasio λ 260: λ 280dan harus antara 1,6 dan2,00. Penurunan rasio padaλ 260: λ 280 berarti masihada protein di dalamnya.





900 μl larutanpelisis + 300 μl

darah

- Masukkan ke dalam tabung mikro 1,5ml- Balik2an- Inkubasi 10 menit pd suhu ruang- Balik2an tabung 5x setiap 2’- Sentrifugasi 13.000-16.000X g selama 20 ‘’

supernatanResidu : butiran endapan seldarah putih dan 10-20 μlsisa cairan

- Vortexbuang

- Vortex

+ 300 μl larutanpelisis

- Pipetkan naik turun u/melisiskan sel

Inkubasi pd suhu37°C sampai homogen

Jika mshmenggumpal

Bisa disimpan±18 bulan

+ 1,5 μl larutanRNAse A ke dlm

lisat sel

Campurkan dg membalik2an tabungsebanyak 25x

Inkubasi pd suhu37°C selama 15’

sample

Dinginkan pdsuhu ruang

+ 100μl larutanpengendapprotein• Vortex selama 20’’

• Sentrifugasi 13.000-16.000 X g selama3’

↓ protein dgbutiran voklat

tua padat

Supernatan DNA

Buang ↓protein

Balik2an tabung50x secaraperlahan

3000μlisopropanol100%

Keringkan tabung

+ 300 μletOH 70%

Sentrifugasi13.000-16.000X g selama 3’

Tuangetanol

Keringkan diudara selama15’

Balik2an tabung50x secaraperlahan

Terbentukgumpalan yg

dpt terlihat

Sentrifugasi13.000-16.000 X gselama 3’

DNA akan tampaksbg butiran putih

kecil

supernatan

buang

Keringkan tabung

Butiran DNA + larutan penghidrasi DNA

• Biarkan semalam pd suhu ruang, atau• panaskan pd suhu 650C selama 1jam

Ketuk2 tabung secara periodikutk menyebarkan DNA

Simpan pd suhu 2-80C

1-5μl larutanDNA

aquadest

1-5μl larutanDNA

aquadest

Kocok perlahan

Ukur pd λ260nm

• Ukur pd λ 280nm• Tentukan index kemurnian :

A260 : A280

Penumbuhan selPanen sel dan lisis

Purifikasi DNA

Sistematika ekstraksi dan purifikasi DNA

Pemekatan DNA

Penumbuhan selPanen sel dan lisis

Purifikasi DNA

Sistematika ekstraksi dan purifikasi DNA

Pemekatan DNA

JURNAL-JURNAL

Jurnal 1: Isolation of high quality DNA: aprotocol combining “rennet” and glass

milk

Reagen yang digunakan: Enzyme chymosin, (yang sering digunakan untuk

produksi keju, mudah ditemukan di pasaran. Rennet DNA extraction protocol

Jurnal ini menunjukkan bahwa reagen rennet chymosinmemiliki aktivitas yang paling baik sebagai agen proteolitikuntuk isolasi DNA.

Reagen yang digunakan: Enzyme chymosin, (yang sering digunakan untuk

produksi keju, mudah ditemukan di pasaran. Rennet DNA extraction protocol

Jurnal ini menunjukkan bahwa reagen rennet chymosinmemiliki aktivitas yang paling baik sebagai agen proteolitikuntuk isolasi DNA.

Pengambilan Sampel Dari Daging Kambing Daging kambing dipotong-potong hingga menjadi kecil, lalu

dihancurkan dalam mortir dengan stamper. Sampel daging diambil dan ditimbang seberat 0,025 dan 0,050

gram lalu dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 1,5 ml. Tiap tabung ditambahkan lysis buffer yang mengandung NaCl

5M, EDTA 0,2M, Tris-Cl 2M, Urea 4M, dan air distilisasi.Sampel daging diberi kode VD25 untuk variasi berat 0,025 gramdan VD50 untuk variasi berat 0,050 gram.

Penelitian 3: Ekstraksi DNA dariDaging dan Tulang Kambing

Daging kambing dipotong-potong hingga menjadi kecil, laludihancurkan dalam mortir dengan stamper.

Sampel daging diambil dan ditimbang seberat 0,025 dan 0,050gram lalu dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 1,5 ml.

Tiap tabung ditambahkan lysis buffer yang mengandung NaCl5M, EDTA 0,2M, Tris-Cl 2M, Urea 4M, dan air distilisasi.Sampel daging diberi kode VD25 untuk variasi berat 0,025 gramdan VD50 untuk variasi berat 0,050 gram.

Pengambilan Sampel Dari Tulang Kambing

Tulang kambing yang berukuran 2-3 cm dihancurkan denganbantuan alat mortir dan stamper hingga menjadi bubuk.

Bubuk tulang diambil dan ditimbang seberat 0,025 dan 0,050 gramkemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan diisidengan lysis buffer yang mengandung NaCl 5M, EDTA 0,2M, Tris-Cl 2M, Urea 4M, dan air distilisasi.

Sampel tulang diberi kode VT25 untuk variasi berat 0,025 gram danVT50 untuk variasi berat 0,050 gram

Tulang kambing yang berukuran 2-3 cm dihancurkan denganbantuan alat mortir dan stamper hingga menjadi bubuk.

Bubuk tulang diambil dan ditimbang seberat 0,025 dan 0,050 gramkemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi dan diisidengan lysis buffer yang mengandung NaCl 5M, EDTA 0,2M, Tris-Cl 2M, Urea 4M, dan air distilisasi.

Sampel tulang diberi kode VT25 untuk variasi berat 0,025 gram danVT50 untuk variasi berat 0,050 gram

Sample : sate kambing

Potong dan hancurkan dgstamper

Timbang 0,025g dan0,050g

Tulang (ukuran : 2-3 cm)

hancurkan dgstamper

Bubuk tulang

Timbang (0,025g &0050g)

Masukkan ke dlmtabung sentrifugasi

+ lysis buffer pd tiaptabung

Lysis bufffer :NaCL 5M, EDTA 0,2M,Tris-Cl 2M, Urea 4M, &air destilasi

Beri kode pd masing2sample : VD25 danVD50

Timbang (0,025g &0050g)

Masukkan ke dlmtabung sentrifugasi

+ lysis buffer pd tiaptabung

Beri kode pd masing2sample : VT25 danVT50

Jurnal 2: Deteksi Kandungan Daging Babi pada Bakso yang Dijajakandi Pusat Kota Salatiga Menggunakan Teknik Polymerase

Chain Reaction

Populasi bakso dari 25 warung bakso kecil, menengah,dan besar yang tersebar di kota Salatiga.

Jurnal 3: Isolasi DNA Ikan Mas yang Terinfeksi KHV

Metode dengan menggunakan kit ekstraksi DNA (Wizard Genomic DNA Purification,Promega). Metode ini merupakan metode yang dikeluarkan oleh PromegaCorporation dan telah teruji hasilnya, namun disisi lain biaya yang dibutuhkan cukupbesar.

Metode CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide) dengan Phenol(Suharsono 2000 dalam Yustiati 2006). Metode ini memiliki waktu pengerjaan cukupsingkat dimana pada proses presipitasinya digunakanpenambahan P : C : I untukmemisahkan DNA dengan materi ikutan lainnya.

Metode modifikasi CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide)(Rogers dkk. 1997 dalam Mulyani 2003). Metode ini memaksimalkan presipitasi DNAdengan menggunakan C : IAA secara berulang yakni dua kali untuk mendapatkanDNA yang bebas dari pengotor. Nilai konsentrasi DNA yang didapat relatif tingginamun di dalam pengerjaannya dibutuhkan waktu yang relatif lebih lama.

Metode ekstraksi DNA dengan thermal lysis (Buwono dan Rosidah 2010). Metode inimemiliki waktu pengerjaan yang sangat singkat. Namun dalam pengerjaannya tidakmelibatkan proses presipitasi dan pencucian DNA melainkan hanya melakukanproses ekstraksi DNA saja.

Metode dengan menggunakan kit ekstraksi DNA (Wizard Genomic DNA Purification,Promega). Metode ini merupakan metode yang dikeluarkan oleh PromegaCorporation dan telah teruji hasilnya, namun disisi lain biaya yang dibutuhkan cukupbesar.

Metode CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide) dengan Phenol(Suharsono 2000 dalam Yustiati 2006). Metode ini memiliki waktu pengerjaan cukupsingkat dimana pada proses presipitasinya digunakanpenambahan P : C : I untukmemisahkan DNA dengan materi ikutan lainnya.

Metode modifikasi CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide)(Rogers dkk. 1997 dalam Mulyani 2003). Metode ini memaksimalkan presipitasi DNAdengan menggunakan C : IAA secara berulang yakni dua kali untuk mendapatkanDNA yang bebas dari pengotor. Nilai konsentrasi DNA yang didapat relatif tingginamun di dalam pengerjaannya dibutuhkan waktu yang relatif lebih lama.

Metode ekstraksi DNA dengan thermal lysis (Buwono dan Rosidah 2010). Metode inimemiliki waktu pengerjaan yang sangat singkat. Namun dalam pengerjaannya tidakmelibatkan proses presipitasi dan pencucian DNA melainkan hanya melakukanproses ekstraksi DNA saja.

Metode SampelPanjang gelombang Konsentrasi C

(μg/ml) Rasio Absorbansi( R )

A260 A280 A320

Kit ekstraksi omega(promega)

Sirip ikan Jatinengah 0,479 0,277 0,060 23,95 1.93

Sirip ikan Ciputri 0,520 0,301 0,063 26,00 1,92

Insang ikan Jatinengah 1,073 0,557 0,037 53,65 1,99

Insang ikan Ciputri 0,920 0,481 0,025 46,00 1,96

Sirip ikan Jatinengah 0,591 0,294 0,031 29,55 2,10


Tabel 4. Nilai kuantitas DNA genom

CTAB dengan phenolSirip ikan Ciputri 0,605 0,317 0,027 30,25 1,99



Modifikasi CTAB





Ekstraksi DNA denganthermal lysis





Metode

Efektivitas mendeteksi KHV

Efisiensi waktu Konsentrasi DNA Kemurnian DNA AmplifikasiBiay

a

Kit ekstraksiomega (promega)

++ ++ +++ ++ +

Tabel 5. Perbandingan Efektifitas dan Sensitifitas Isolasi DNA

CTAB denganphenol

++ ++ ++ ++ ++

Modifikasi CTAB + +++ +++ ++ ++

Ekstraksi DNAdengan thermal

lysis+++ + + ++ +++

Keterangan :+ : Kurang baik++ : Baik+++ : Sangat baik

Untuk isolasi DNA pada ikan tersebut,metode purifikasi yang cocok adalah???

Metode yang sensitif dalam mengisolasiDNA genom ikan mas adalah metodemodifikasi CTAB karena metode ini mampumenghasilkan nilai kemurnian dankonsentrasi DNA tertinggi.

supernatan

Supernatan dlm tabung

+ 50 μl 5M NaCl+ 1 ml etOH absolut

- Kocok dg tangan- Inkubasi selama 1 jm- Sentrifugasi 8000 rpm

selama 5 menit

Residu

+ 200 μl air destilasisteril+ 200 μl fenol+ 200 μl kloroform

- Homogenisasi dgtangan

- Sentrifugasi 8000rpmselama 10 menit

Supernatan, dimasukkandalam tabung

+ 1 ml etOH 70%

- Sentrifugasi 8000 rpmselama 5 menit

Sisa etOH

+ 50 μl TE

- Keringkan 30-60 menit

- Simpan pd suhu 4C sampaidigunakan

50 μl Hasil isolasi DNA

- Masukkan ke dlmtabung

+ 5 μl RNAase(10mg/ml)

- Vortex- Inkubasi pd suhu 37C

selama 3 jam

+ 200 μl air destilasisteril+ 200 μl fenol+ 200 μl kloroform

Supernatan + 25 μl 5M NaCl+ 500 μl etanol absolut dingin

- Inkubasi pada suhu -20ºC selama 1 jam

- Sentrifugasi 8000rpmselama 10 menit

Residu (DNA )

- Simpan pd suhu ruangsampai digunakan

- Jk di pake pd hariberikutnya disimpan pdsuhu 4ºC

+ TE

- Simpan pd suhu ruangsampai digunakan

- Jk di pake pd hariberikutnya disimpan pdsuhu 4ºC

DNA genom diuji dg tehnikelektroforesis gel agarose 0,8%dg voltase 70 volt selama 30 menit

Jurnal 4: Isolasi DNA menggunakanmesin purifikasi DNA

Contoh mesin purifikasi DNA : [Maxwell]®16].

Sebanyak 50 mg daging babi segar, daging sapisegar, dan sosis sapi (sebagai sampel) dipotong-potong kemudian dimasukkan kedalam well 1 yangtersedia pada cartridge.

Setiap sampel ditaruh pada cartridgeyang berbeda(cartridge1 = daging sapi segar; cartridge 2 = dagingbabi segar; cartridge 3–13 = masing-masing samplesosis sapi berbagai merek).

Contoh mesin purifikasi DNA : [Maxwell]®16].

Sebanyak 50 mg daging babi segar, daging sapisegar, dan sosis sapi (sebagai sampel) dipotong-potong kemudian dimasukkan kedalam well 1 yangtersedia pada cartridge.

Setiap sampel ditaruh pada cartridgeyang berbeda(cartridge1 = daging sapi segar; cartridge 2 = dagingbabi segar; cartridge 3–13 = masing-masing samplesosis sapi berbagai merek).

Con’t

Cartridge yang telah siap diletakkan pada cartidge holder yang tersediapada instrument dan seal yang ada pada cartridge dibuka, posisi yangbergerigi menghadap ke arah depan (yang paling dekat dengan pintu).

Lalu plunger diletakkan pada well 7 dan blue elution tube pada elutiontube slots.

Kemudian elution buffer dimasukkan sebanyak 300 µL pada masing-masing blue elution tube.

Protocol dan tipe sampel dipilih pada Instrument dengan sample type:DNA dan protocol: cells lalu tekan “OK”.

Setelah proses running selesai, elution tube dipindahkan ke magneticelution tube rack dan elution DNA sampel dipipet ke tube 1,5 mL.Cartridge sisa pakai dibuang beserta elution tube dan plungers.

Cartridge yang telah siap diletakkan pada cartidge holder yang tersediapada instrument dan seal yang ada pada cartridge dibuka, posisi yangbergerigi menghadap ke arah depan (yang paling dekat dengan pintu).

Lalu plunger diletakkan pada well 7 dan blue elution tube pada elutiontube slots.

Kemudian elution buffer dimasukkan sebanyak 300 µL pada masing-masing blue elution tube.

Protocol dan tipe sampel dipilih pada Instrument dengan sample type:DNA dan protocol: cells lalu tekan “OK”.

Setelah proses running selesai, elution tube dipindahkan ke magneticelution tube rack dan elution DNA sampel dipipet ke tube 1,5 mL.Cartridge sisa pakai dibuang beserta elution tube dan plungers.

Tahap 1: Preparasi sampelAbon digiling di mortar

Tahap 2: Degradasi proteinSampel ditambah 150 ul air, 200 ul 1x sodium trisEDTA, 40 ul SDS 10%, 20 ul proteinase K 10 mg/ml.

Homogenkan.

Inkubasi pada suhu 55oC selama 2 jam.

Jurnal 5: Analisis daging tikus pada abon sapi

Tahap 1: Preparasi sampelAbon digiling di mortar

Tahap 2: Degradasi proteinSampel ditambah 150 ul air, 200 ul 1x sodium trisEDTA, 40 ul SDS 10%, 20 ul proteinase K 10 mg/ml.

Homogenkan.

Inkubasi pada suhu 55oC selama 2 jam.

Tahap 3: Degradasi bahan organikSampel ditambah 400 ul fenol, 400 ul Ciaa, 40 ulNaCl 5M.

Aduk rata selama satu menit.

Inkubasi selama 15 menit di suhu ruangan sambilterus di bolak-balik.


Tahap 3: Degradasi bahan organikSampel ditambah 400 ul fenol, 400 ul Ciaa, 40 ulNaCl 5M.

Aduk rata selama satu menit.

Inkubasi selama 15 menit di suhu ruangan sambilterus di bolak-balik.

Tahap 4: Presipitasi DNADisentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit disuhu 20oC.

Lakukan tahap 2-4 hingga 3 kali pada tiap tiap bagianDNA dari hasil pemisahan.

Diamkan di suhu ruangan hingga dirasa alkoholsudah menguap semua, lalu ditambahkan 100 ul TrisEDTA.

Simpan di suhu -20oC. DNA siap di analisa


Tahap 4: Presipitasi DNADisentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit disuhu 20oC.

Lakukan tahap 2-4 hingga 3 kali pada tiap tiap bagianDNA dari hasil pemisahan.

Diamkan di suhu ruangan hingga dirasa alkoholsudah menguap semua, lalu ditambahkan 100 ul TrisEDTA.

Simpan di suhu -20oC. DNA siap di analisa

pertanyaan

Delvina: Purifikasi itu bagian dari ekstraksi ataubukan? Karna di slide dijelaskan kalau purifikasi itutermasuk bagian isolasi, tapi di slide yg lain padaPPT ini dijelaskan sebagai satu kesatuan sendiri.

Jawab: sudah diperjelas dan penyusunan slidediperbaiki.

Delvina: Purifikasi itu bagian dari ekstraksi ataubukan? Karna di slide dijelaskan kalau purifikasi itutermasuk bagian isolasi, tapi di slide yg lain padaPPT ini dijelaskan sebagai satu kesatuan sendiri.

Jawab: sudah diperjelas dan penyusunan slidediperbaiki.

Isolasi Dna

Documents

Transcript of Isolasi Dna