Ricerca di sostanze psicotrope in campioni urinari di poliassuntori:confronto di metodiche immunochimiche e di spettrometria di massa(I e II livello)Denise Caneparo1, Alberto Salomone1,2, Elsa Basili3, Marco Vincenti21Consorzio Piemontese per la prevenzione e la repressone del doping e di altri usi illeciti dei farmaci, Orbassano (TO)2Dipartimento di Chimica Analitica, Università degli Studi, Torino3Stuttura Semplice di Tossicologia ed Istopatologia Medico Legale, ASL 8, Moncalieri (TO)

INTRODUZIONE

Negli ultimi anni l’uso/abuso delle droghe di sintesi(designer drugs), costituite principalmente da sostanze ditipo amfetaminico quali, ad esempio, amfetamina (AMP),metamfetamina (MA), metilendiossimetamfetamina(MDMA, ecstasy), metilendiossiamfetamina (MDA, lovedrug), metilendiossietilamfetamina (MDEA, eve), ecc. èsensibilmente aumentato, soprattutto nella popolazionegiovanile (adolescenti e giovani adulti), con particolare rife-rimento a certi contesti ricreazionali come discoteche, "raveparties", "techno parties", ecc.1. Queste sostanze hannoimportanti e ben dimostrati effetti neurotossici a livello del

sistema dopaminergico e serotoninergico2-4; rilevanti, eanch’essi ben documentati, sono inoltre gli effetti tossici alivello epatico5,6, cardiovascolare7,8, renale9,10, immunita-rio11 ormonale12,13 e fetale14,15, così come i casi letali16-18.Particolare attenzione va posta, inoltre, all’incidentalità stra-dale (le cosiddette "stragi del sabato sera") legata anche alconsumo di amfetaminici (spesso associato a quello di altresostanze psicotrope), consumo in grado di condizionarepesantemente l’abilità alla guida19-21. A tale proposito, siricorda che gli incidenti stradali causano il 40% dei decessiche si verificano annualmente in Italia tra i 15 e i 24 anni,costituendo in assoluto la prima causa di morte in questafascia di età. Questi eventi rappresentano inoltre un impor-

Altri contributi

Detection of psychotropic substances in urine samples from poliabuser: comparison of immu-nochemical and mass spectrometry methods (I and II level). The abuse of synthetic drugs has

considerably increased in recent years. The fallen back of the phenomenon suggested us to revise two immunochemicaltests commonly used, comparing results with those obtained from surveyings in gascromatography (GC) mass spectro-metry (MS). For this study 33 urine samples from polyabusers were draft and subsequently analyzed in screeningprocedure with the method hOmogeneous Method Enzymatic Complex (OMEC) and, for the class of amphetamines, alsowith the method Fluorescences Polarization Immuno Assay (FPIA). Samples for GC-MS analysis were prepared usingtwo different analytical methods: AZOLIQ and TOXISPE. At amphetamines cut-off values (1000 ng/mL for screening and500 ng/mL for confirmation) 2 samples resulted positives and 20 negatives. 10 samples were positives in GC-MS (usingeither the cut-off value, n = 6 cases, or the LOD at 5 ppb, n = 4 cases) but negatives in screening, while 1 sample wasnegative in GC-MS but positive in OMEC. The GC-MS analysis allowed us to obtain the whole spectrum of other classesof abuse drugs, including metabolites of great interest. In conclusion, it is necessary to know the limits of the tests usedand adopt cut-off values appropriate to the analysis purposes, since the negative samples in the screening procedureare generally excluded from successive confirmations.

Key words: Psychotropic substances, Amphetamine, Screening, Gascromatography-mass spectrometry, Cut-off

L’abuso delle droghe di sintesi è sensibilmente aumentato in questi ultimi anni. Le ricadute del fenomenoci hanno indotti all’analisi di due test immunochimici, comunemente utilizzati nella ricerca delle principali

classi di sostanze psicotrope, confrontandone i risultati con quelli ottenuti da indagini in gascromatografia (GC) abbinataalla spettrometria di massa (MS). Per lo studio sono stati selezionati 33 campioni urinari di soggetti poliassuntorisuccessivamente processati in screening con il metodo hOmogeneous Method Enzymatic Complex (OMEC) e, per laclasse delle amfetamine, anche con il metodo Fluorescenze Polarization Immuno Assay (FPIA). Le analisi in GC-MSsono state condotte con due metodiche analitiche: AZOLIQ e TOXISPE. Per la classe delle sostanze amfetaminiche, aivalori di cut-off utilizzati nei test di I e II livello (rispettivamente 1000 ng/mL e 500 ng/mL), sono risultati concordanti 2 casipositivi e 20 negativi. Degli 11 campioni rimanenti, 10 sono risultati positivi in GC-MS (con valutazione del dato al cut-off,n = 6 casi, o al LOD di 5 ppb, n = 4 casi), ma negativi in screening, mentre 1 campione è risultato negativo in GC-MS mapositivo in OMEC. Relativamente alle altre classi di sostanze d’abuso, le indagini in GC-MS hanno permesso di cogliereuno spettro quasi completo delle specie assunte (metaboliti compresi); particolarmente interessante è stata l’identifica-zione di una serie di sostanze non rilevabili con i test di screening. Infine, poiché i campioni negativi allo screening vengonogeneralmente esclusi da successive conferme, è opportuno conoscere bene i limiti dei metodi utilizzati, riflettendosull’opportunità di adottare valori di cut-off maggiormente appropriati alle finalità delle indagini.

Parole chiave: Sostanze psicotrope, Amfetamine, Screening, Gascromatografia-spettrometria di massa, Cut-off

ABSTRACT

RIASSUNTO

LigandAssay 10 (4) 2005 293

tante motivo di ricovero e di accesso alle prestazioni sani-tarie, nonché la causa determinante di gravi invalidità trau-matiche (20.000-25.000 casi/anno) quali paraplegia, tetra-plegia e traumatismi cranici22.

Gli utilizzatori di sostanze di tipo amfetaminico sono con-siderati "recreational drug user", espressione che definisce lepersone che assumono sostanze in relazione a precisi tipi didivertimento. In questi casi è pressoché abituale l’utilizzo di piùsostanze per ricercare effetti differenti nel corso della stessaserata, e le associazioni di più frequente riscontro sono quellecon alcol, cocaina e cannabis (quest’ultima utilizzata in generea supporto della fase decrescente di benessere)23. In generalela poliassunzione di sostanze psicotrope può essere conside-rata secondo due diversi parametri: il tempo (uso simultaneoo concorrente) e la funzione o le modalità (affiancamento,sostituzione o compresenza). Le ragioni del diffondersidell’abuso multiplo di sostanze psicoattive potrebbero ricon-dursi ad una serie di fattori: alto costo della droga primaria,necessità di sostituzione della droga abituale non disponibilesul mercato illecito, sperimentazione di nuove droghe, possi-bilità di modulare l’azione della droga primaria, ecc.; comuni efrequenti associazioni sono ad esempio quelle di cocaina ederoina (speed ball)/alcol/metadone, eroina e cocaina/canna-bis/benzodiazepine, ecc.24,25. La necessità di rilevare, attraver-so esami sulle urine, il consumo delle sostanze di tipo amfeta-minico, così come quello di svariate altre classi di composti(oppiacei, cocaina, cannabinoidi, metadone, benzodiazepine)in relazione all’elevata incidenza di poliassunzione riscontratanella pratica quotidiana, ci ha indotti ad una revisione critica dialcuni dei test immunochimici, comunemente utilizzati, attra-verso la conferma con indagini in gascromatografia (GC)abbinata alla spettrometria di massa (MS).

L’elemento di novità di questo studio è rappresentatodall’approccio culturale e metodologico, strutturato attraver-so una fattiva collaborazione tra professionalità e compe-tenze diverse, concretizzatosi: (1) nella messa a punto didue metodi di conferma in GC-MS (applicabilità su matriciurinarie, rapidità di esecuzione, ampio spettro di sostanzee metaboliti rilevabili, limiti di rivelabilità al di sotto dei valorisoglia indicati dagli enti di controllo); (2) in un processo diinterscambio tra le informazioni chimico-tossicologiche equelle cliniche-medico legali.

MATERIALI E METODI

Casistica

Lo studio è stato condotto su 33 campioni urinari, sele-zionati in base a criteri anamnestico-clinici, proventi da 26soggetti tossicodipendenti (24 maschi e 2 femmine, etàcompresa tra 17 e 46 anni, tutti codificati in anonimato) constoria di poliassunzione ed in trattamento riabilitativo pressoil Dipartimento di Patologia delle Dipendenze dell’AziendaSanitaria Locale n. 8 di Chieri (TO). I campioni di urina diquesta casistica sono stati analizzati con test di screeninge successive indagini di conferma.

I campioni verranno indicati, nel testo e nelle tabelle, conuna numerazione da 1 a 33.

Indagini di screening

Le indagini di screening sono state condotte con i metodi

immunochimici Fluorescence Polarization Immuno Assay(FPIA) per la classe delle sostanze amfetaminiche, su stru-mento TDx (Abbott Diagnostics, Illinois, USA), mentre, perle altre classi di sostanze (oppiacei, cocaina, cannabinoidi,metadone e benzodiazepine), amfetamine comprese, conil metodo Homogeneous Method Enzymatic Complex(OMEC) su strumento AEROSET (Abbott Diagnostics, Illi-nois, USA).

I valori di cut-off utilizzati nelle analisi di screening sonoquelli suggeriti a livello scientifico internazionale26 e riportatiin Tabella 1.

Indagini di conferma

Le analisi di conferma sono state eseguite per tutti icampioni, indipendentemente dai risultati semiquantitatividei test di screening. Per queste indagini, eseguite in ga-scromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS), si sono seguite due procedure di estrazione e purifi-cazione del campione da noi messe a punto e denominateAZOLIQ e TOXISPE.

Metodi di estrazione e purificazione delcampione

Nel metodo AZOLIQ, 3 mL di campione urinario vengo-no trasferiti in una provetta e addizionati dello standardinterno (eptilamina) in quantità tale da ottenerne una con-centrazione finale pari a 100 ng/mL; si corregge il pH conalcune gocce di idrossido di sodio 1M fino a portarlo ad unvalore di 8-9 e si addiziona una punta di spatola di solfatodi sodio. Si procede quindi ad un’estrazione liquido-liquidocon dietiletere (1 mL per due volte) agitando per circa 1minuto, centrifugando per 5 minuti a 5000 rpm e raccoglien-do la fase organica. Questa viene portata a secco sottoflusso di azoto, avendo cura di non scaldare per evitare laperdita delle molecole più volatili, quali ad esempio le am-fetamine. Successivamente, si aggiunge anidride trifluoroa-cetica come agente derivatizzante e si lascia in incubazionein stufa a 60°C per 15 minuti. Si porta nuovamente a seccoe si riprende l’estratto con 100 µL di diclorometano.

Nel metodo TOXISPE, 3 mL di campione urinario ven-gono trasferiti in una provetta ed il pH corretto a 5,5 contampone acetato 1,1M; si aggiungono 50µL di enzima glu-curonidasi e si pone in stufa a 55°C per 2 ore. Dopo averlasciato raffreddare, si centrifuga per 5 minuti a 5000 rpm.Il campione viene poi caricato, per l’estrazione in fasesolida, su colonne Bond Elut Certify con capacità 10 mL(Varian, Milano) a fase stazionaria mista, apolare e a scam-bio cationico (C18 e SCX), precedentemente condizionate

Altri contributi

Sostanze Cut-off (ng/mL)

Amfetamine 1000Cocaina 300Oppiacei 300Cannabinoidi 50Metadone 300Benzodiazepine 200

Tabella 1Valori di cut-off utilizzati nelle analisi di screening

294 LigandAssay 10 (4) 2005

con 2 mL di metanolo e con 2 mL di tampone fosfato 0,1M.Dopo il passaggio del campione, si lava con 2 mL di acquadeionizzata, 0,5 mL di acido acetico 0,01M a pH 3,3 e 1 mLdi esano, avendo cura di mandare bene a secco dopo ognilavaggio. Infine, si eluisce con 2 mL di miscela clorofor-mio/2-propanolo 80% con 2% di idrossido di ammonio al30%. Si porta a secco con flusso di azoto e si derivatizzacon 100 µL di anidride pentafluoropropionica e 75 µL dipentafluoropropanolo, incubando a 65°C per 30 minuti;dopo aver evaporato il derivatizzante con flusso di azoto, siriprende l’estratto con 100 µL di diclorometano.

Analisi in GC-MS

Per l’analisi in GC-MS è stato utilizzato un gas-croma-tografo Trace GC Ultra (Thermo Electron Corporation, Mi-lano), con una colonna cromatografica RTX- 5 MS di lun-ghezza 30 m, avente diametro interno di 0,25 mm, spessoredel film di 0,25 µm e fase stazionaria polimetilsilossanicacon 5% di derivati fenilici; l’elio è stato utilizzato come gasdi trasporto ad un flusso di 1,0 mL/min. Si è iniettato 1,0µLdi estratto urinario in condizioni di splitless per 1 minuto, allatemperatura di 250°C. Come analizzatore di massa si èusato la trappola ionica PolarisQ della Thermo ElectronCorporation; la ionizzazione delle molecole eluite si è otte-nuta per impatto elettronico a -70 eV.

Nell’analisi gascromatografica si sono impiegati gra-dienti di temperatura differenti a seconda del tipo di estra-zione e purificazione del campione eseguite in precedenza,cioè, a seconda delle sostanze ricercate. Dopo estrazioneAZOLIQ l’analisi è stata condotta mantenendo il GC allatemperatura di 40°C per 1 minuto ed incrementandola,successivamente, di 15°C/min fino a 300°C con isotermafinale di 3 minuti. La transfer-line è stata mantenuta allatemperatura di 250°C. A seguito dell’estrazione con metodoTOXISPE la temperatura del GC è stata inizialmente rego-lata a 100°C per 1 minuto, incrementata di 30°C/min fino a220°C, con isoterma di 1 minuto, e nuovamente aumentatafino a 300°C con un gradiente di 15°C/min e isoterma finaledi 3 minuti. La transfer-line è stata mantenuta alla tempera-tura di 280°C.

L’analisi in spettrometria di massa la si è condotta siaattraverso la contemporanea acquisizione di tutti gli ioni(analsi in full scan), sia mediante la selezione di alcuni diessi (ione precursore) e la loro ulteriore frammentazione conla produzione di ioni prodotto (analisi in tandem-mass spec-

trometry). Gli ioni monitorati e i percorsi di frammentazioneprincipali sono indicati in Tabella 2.

Tutti i prodotti utilizzati sono stati acquistati presso laditta Sigma-Aldrich (Milano), ad eccezione degli standard dicalibrazione per le amfetamine (MDMA esclusa che è statafornita sempre dalla ditta Sigma-Aldrich) ed i controlli diqualità per benzoilecgonina, morfina, metadone e acido11-nor-∆9-tetraidrocannabinolo-9-carbossilico (THC-COOH, metabolita del tetraidrocannabinolo) che sono statiforniti da Abbott Diagnostic Division (Wiesbaden, WG).

RISULTATI

La Tabella 3 mostra i risultati complessivi dei campionianalizzati in screening (I livello) ed in conferma (II livello),mentre la Tabella 4 evidenzia quelli relativi alla classe dellesostanze amfetaminiche. Su tutti i campioni, al fine di valu-tarne l’idoneità, è stata determinata la creatininuria (CREU,concentrazione media: 189 mg/dL; min:24, max: 525) utiliz-zando il valore di 20 mg/dL come cut-off26.

I risultati e la relativa interpretazione delle analisi diconferma per le sostanze di tipo amfetaminico cercate(amfetamina, metamfetamina, MDMA e MDA) sono di tipoquantitativo (Tab. 4), mentre sono puramente qualitativi perle altre classi di sostanze (Tab. 3). In alcuni casi, è statopossibile evidenziare con un unico metodo, e quindi in ununico cromatogramma, la presenza di più droghe parentie/o metaboliti, come ad esempio cocaina, morfina e 6-mo-noacetilmorfina (6-MAM, metabolita dell’eroina), secondoquanto mostrato in Figura 1.

Nell’analisi in GC-MS, i dati sono stati acquisiti secondodue tipi diversi di esperimento: nel primo, altamente speci-fico, si sono monitorate le transizioni MS-MS tra ioni precur-sori e ioni prodotto, diagnostiche delle classi di sostanzericercate, così come definite nella fase di messa a punto delmetodo (Tab. 2); nel secondo esperimento, ad alto conte-nuto informativo, si è acquisito l’intero spettro di massa ditutte le sostanze contenute nell’estratto urinario ed eluite dalgascromatografo. Mentre il primo esperimento ci ha garan-tito il riconoscimento certo delle droghe assunte, responsa-bili della positività in screening alla classe (Tab. 3), il secon-do ci ha permesso l’identificazione di altre sostanze xeno-biotiche escrete e non specificatamente ricercate, con ap-profondimento del quadro anamnestico-clinico (Tab. 5).Abbiamo inoltre esaminato più nel dettaglio i risultati relativialla classe delle amfetamine ed, acquisendo gli spettri dimassa completi delle sostanze eluite, è stato possibile

Altri contributi

Sostanza Ioni estratti (FS) Ione precursonre (MS-MS) Ione prodotto (MS-MS)

Amfetamina 231, 118, 140 140 118Metamfetamina 245, 110, 154 154 110MDMA 154, 162, 289 154 110Benzoilecgonina 421, 300, 82 300 82Cocaina 303, 182, 82 303 82Morfina 577, 414 414 250Metadone 72, 223, 294 - -THC-COOH 622, 607, 445, 459 607 429

THC-COOH = acido 11-nor-∆9-tetraidrocannabinolo-9-carbossilico, metabolita del tetraidrocannabinolo

Tabella 2 Ioni monitorati in Full scan (FS) ed in Tandem-mass spectronetry (MS-MS)

LigandAssay 10 (4) 2005 295

distinguere le diverse amfetamine assunte o presenti comerisultato di vie metaboliche, differenziando così le variepositività (Tab. 4). Per la valutazione quantitativa delleprincipali sostanze appartenenti a questa classe è statacostruita una retta di calibrazione nell’intervallo di concen-trazione 250-8000 ng/mL. I campioni sono stati valutati siain base ai valori di cut-off comunemente utilizzati26 nelleanalisi di conferma (500 ng/mL), sia in base al limite dirilevabilità (Limit Of Detection - LOD) calcolato (5 ng/mL).Si sottolineano, in particolare, dieci casi (Tab. 4) con risultatidiscordanti nella valutazione di uno o entrambi i metodiimmunochimici rispetto all’analisi in GC-MS positiva al cut-off (casi 3, 22, 29, 31, 32, 33) o al LOD (casi 5, 7, 15, 17).

I parametri (sensibilità, specificità, predittività positiva enegativa) dei metodi immunochimici utilizzati nel presentestudio (OMEC e FPIA) e valutati in base alle analisi condottein GC-MS, sono riportati in Tabella 6.

DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

Il sensibile aumento del poliabuso di sostanze psicotro-

pe (specialmente di tipo amfetaminico) avvenuto negli ultimianni, e gli importanti e ben dimostrati effetti tossici che sihanno in vari distretti corporei in seguito all’assunzione, cihanno indotti all’analisi critica di due test immunochimici(OMEC ed FPIA) comunemente impiegati nella ricerca delleprincipali droghe d’abuso, e alla messa a punto di duemetodi di conferma in GC-MS (TOXISPE ed AZOLIQ).

Lo studio è stato condotto su 33 campioni urinari disoggetti poliassuntori in trattamento riabilitativo pressol’ASL 8 di Chieri (TO); la selezione dei campioni è stata fattain base a criteri anamnestico-clinici.

I campioni sono stati inizialmente processati in scree-ning con il metodo OMEC e, per la classe delle amfetamine,anche con il metodo FPIA, e successivamente analizzati inGC-MS con i metodi TOXISPE ed AZOLIQ.

Dalla valutazione globale dei dati (Tab. 3) risultanonegativi alle principali droghe d’abuso quattro campioni (12%), per i quali si ha una concordanza dei risultati ottenuti inscreening ed in conferma (casi 6, 12, 16, 18), mentre in ottocasi (24 %) le analisi di conferma hanno smentito la positi-vità (caso 8) e le negatività (casi 3, 5, 8, 14, 15, 17 e 22)

Altri contributi

n I livello II livello

1 Oppiacei Morfina2* Cocaina, Benzodiazepine Cocaina, BZE, Cocaetilene, Flurazepam, Efedrina3* Oppiacei, Cocaina Morfina, BZE, MA4 Cannabionoidi THC-COOH5* Oppiacei, Cocaina Morfina, BZE, AMP6 Negativo Negativo7* Cannabinoidi, AMP THC-COOH, AMP8 AMP Clorpromazina9 Cannabinoidi THC-COOH10 Metadone Metadone11 Metadone Metadone12 Negativo Negativo13* Oppiacei, Cannabinoidi Codeina, THC-COOH14* Cannabinoidi, Metadone THC-COOH, Metadone, Mirtazapina15 Negativo MA16 Negativo Negativo17* Oppiacei, Cocaina Morfina, Cocaina, BZE, MA18 Negativo Negativo19* Oppiacei, Cocaina Morfina, 6-MAM, Cocaina, BZE20 Metadone Metadone21* Metadone, Benzodiazepine Metadone, Clonazepam22* Oppiacei, Cocaina Morfina, BZE, MA23 Metadone Metadone24* Cocaina, AMP BZE, MDA25 Oppiacei Morfina26* Oppiacei, Cocaina, Metadone Morfina, BZE, Metadone27* Oppiacei, Cocaina Morfina, BZE28* Oppiacei, Cocaina Morfina, BZE29* Oppiacei, Cocaina, AMP Morfina, BZE, MA, MDMA30* Oppiacei, AMP Morfina, MDA, MDMA31* Cocaina, Cannabinoidi,AMP Cocaina, THC-COOH, MDA, MDMA32* Metadone, AMP Metadone, MDMA, MDA, MA33* Cannabinoidi, AMP THC-COOH, MDA, MDMA, AMP

6-MAM=6-monoacetilmorfina (metabolita dell’eroina)BZE = benzoilecgonina (principale metabolita della cocaina)*)Campioni positivi a più di una classe di sostanze

Tabella 3Risultati delle analisi di I e II livello

296 LigandAssay 10 (4) 2005

ottenute in screening. I risultati ottenuti in GC-MS hannoconfermato in tutti gli altri casi (64 %) le positività riscontratein screening, permettendo la rivelazione delle singole so-stanze assunte e/o loro metaboliti, nonché l’identificazionedi quelle sostanze che non sono state e non sarebbepossibile evidenziare con i test di screening comunementeutilizzati (cocaetilene ed efedrina, caso 2; clorpromazina,caso 8 e mirtazapina, caso 14).

Si evince inoltre che 28 campioni presentano positivitàper:

• 1 sostanza: 9 casi (27 %)• 2 sostanze: 9 casi (27 %)• 3 sostanze: 8 casi (24 %)• 4 sostanze: 2 casi (6 %)a conferma dell’elevata prevalenza della poliassunzio-

ne.Integrando i dati ottenuti dalle indagini chimico-tossico-

logiche di I e II livello con i dati anamnestico-clinici disponi-bili, è stato possibile ottenere preziose informazioni, inparticolare, nella valutazione di situazioni più complesse incui la dipendenza da sostanze psicotrope è associata adisturbi psichiatrici. Si citano come esempi il caso 8, relativoad un soggetto in trattamento con clorpromazina (Largactil),sostanza identificata in GC-MS (vedi Fig. 2 in cui è riportatolo spettro di massa e le rispettive strutture degli ioni princi-pali) e segnalata nel manuale di istruzione del metodoOMEC come possibile causa di risultati falsi positivi per laclasse delle amfetamine, ed il caso 14, appartenente ad unsoggetto depresso, etilista, con storia di poliabuso e intrattamento con metadone e Remeron (mirtazapina, identi-ficata nelle analisi di conferma). Si segnalano inoltre i cam-pioni 2 e 5 relativi ad un paziente in fase di grave scompensoe deceduto per overdose (suicidiaria? accidentale?); nelleFigure 3 e 4 sono riportati gli spettri di massa e le strutture

Altri contributi

Indagini di conferma(GC-MS)

Indagini di screening(Immunochimiche)

n CREUmg/dL

Ang/mL

MAng/mL

MDMAng/mL

MDAng/mL

OMECng/mL

FPIAng/mL

1 113 - - - - 325 <1502 327 - - - - 367 <1503 127 - 519 - - 533 2654 250 - - - - 662 4865 288 310 - - - 550 2326 121 - - - - 535 <1507 175 292 - - - 1587 1568 163 - - - - >2000 1619 38 - - - - 665 <15010 310 - - - - 432 34111 24 - - - - 893 <15012 311 - - - - 502 28313 224 - - - - 518 19014 129 - - - - 587 16015 93 - 251 - - 400 <15016 255 - - - - 327 <15017 295 - 412 - - 505 18218 103 - - - - 445 16919 305 - - - - 526 32220 92 - - - - 502 37021 216 - - - - 635 41922 176 - 562 - - 460 27623 159 - - - - 448 <15024 157 - - - POS >2000 434625 84 - - - - 460 <15026 217 - - - - 524 30427 151 - - - - 306 <15028 525 - - - - 546 43729 268 - 133 1804 - 923 754230 223 - - >8000 POS >2000 >800031 107 - - >8000 POS 792 428532 375 - 998 50 POS 548 116233 151 2500 - >8000 POS 852 5820

-) Dato inferiore al LOD (5ng/mL)

Tabella 4Risultati delle indagini di conferma (valori quantitativi) e delle indagini di screening (valori semiquantitativi) per le principali sostanzeamfetaminiche

LigandAssay 10 (4) 2005 297

Figura 1Identificazione simultanea di più sostanze psicotrope con un unico metodo analitico

Figura 2Spettro di massa della clorpromazina e struttura dei relativi ioni principali

Altri contributi

298 LigandAssay 10 (4) 2005

proposte dei relativi ioni principali del cocaetilene (prodottodell’assunzione elevata e concomitante di etanolo e cocai-na) e dell’efedrina (entrambe ritrovate nel campione 2).Relativamente a questo caso è doveroso ricordare che il

rischio di suicidio può essere particolarmente alto durantel’uso di droghe che influiscono pesantemente sul tonodell’umore e sulla sfera psichica affettiva, come la cocainae le sostanze di tipo amfetaminico; di ciò bisogna tenerconto sopratutto quando il paziente appare depresso o siha la sensazione che la tossicodipendenza rappresenti untentativo di auto-terapia per una patologia psichiatrica pri-maria27.

Data la facilità di sintesi e la conseguente diffusione edabuso delle sostanze amfetaminiche, si è proceduto, per le

principali sostanze appartenenti alla classe, ad un’indaginepiù approfondita mediante l’impiego di un secondo metododi screening (FPIA) ed una loro quantificazione in GC-MS;in Tabella 4 sono riportati i risultati ottenuti. I dieci casi con

n Classi positive in screening Sostanze identificate in conferma Dati anamnestico-clinici

2 CocainaBenzodiazepine

Cocaina, BZECoacetilene, Flurazepam, Efedrina

Soggetto benestante, etilista con storia pluriennale di poliabuso; varitentativi fallimentari di "autoterapia"; situazione clinica di importantescompenso con exitus per overdose a fine giugno 2004

8 AMP/MA (OMEC) Clorpromazina Poliabuso in disturbo bipolare (DSM IV); alcuni mesi primatrattamento sanitario obbligatorio (TSO); in terapia conclorpromazina (Largactil)

13 OppiaceiCannabinoidi

CodeinaTHC-COOH

Nuovo ingresso su invio dei servizi sociali; abuso prevalente dieroina e cannabis in soggetto con forte disagio psichico e famigliare;possibile assunzione di codeina

14 CannabinoidiMetadone

THC-COOHMetadone, Mirtazapina

Storia di poliabuso in etilista; stato depressivo; grave epatopatia inevoluzione cirrotica; terapia con Remeron (mirtazapina) e metadone(dosi elevate, 120 mg/die)

Tabella 5Sostanze xenobiotiche non specificatamente ricercate ed identificate in GC-MS

Parametro OMEC FPIA

Sensibilità 14% 71%Specificità 92% 100%Predittività positiva 33% 100%Predittività negativa 79% 93%

Tabella 6Parametri dei metodi immunochimici OMEC e FPIA rispetto allaGC-MS

Figura 3Spettro di massa del cocaetilene e struttura dei relativi ioni principali

Altri contributi

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risultati discordanti nella valutazione di uno o entrambi imetodi immunochimici rispetto all’analisi in GC-MS positivaal cut-off o al LOD, in funzione dell’interpretazione del datochimico-tossicologico con tutte le sue ricadute in ambitoclinico e/o medico-legale, dovrebbero far riflettere sull’op-portunità di adottare, almeno in casi particolari, proceduredi screening non immunochimiche, così come già eviden-ziato in letteratura internazionale28,29.

I risultati ottenuti dall’analisi delle sostanze amfetamini-che hanno permesso una stima della specificità, sensibilità,valore predittivo positivo e negativo dei due metodi di scree-ning impiegati (per confronto dei risultati di screening conquelli di conferma). Dalla Tabella 6 si può evidenziare unaspecificità simile per i test di screening considerati, associa-ta ad una bassa sensibilità per OMEC (14%) e discreta perFPIA (71%). Vale però la pena rilevare che il fattore disensibilità risente fortemente del valore di cut-off adottato:infatti, se si fosse scelto un valore di cut-off pari a 750 ng/mL,anziché di 1000 ng/mL (come potrebbe risultare ragionevo-le su base statistica), il fattore di sensibilità del metodoOMEC sarebbe salito al 57%. Da ciò si desume il ruolocruciale giocato da una corretta impostazione del valore dicut-off sull’interpretazione delle risultanze analitiche. Stes-so discorso vale per il valore predittivo negativo, non moltodissimile tra i due metodi, mentre il valore predittivo positivoè del 100% per FPIA e del 33% per OMEC. Va comunqueconsiderato che i valori predittivi, dipendendo dalla preva-lenza, devono essere calcolati da ogni laboratorio sullabase dell’epidemiologia relativa alla composizione dei cam-pioni ad esso afferenti30.

La Tabella 4 mostra quindi con chiarezza l’ampia varia-

bilità di risposta dei due metodi di screening considerati,variabilità che può essere dovuta a tutta una serie di fattorilegati alle caratteristiche intrinseche del metodo (anticorpo,segnale, ecc.), al tipo di strumentazione utilizzata ma, so-prattutto, alla diversa specificità. Infatti, per una correttalettura del risultato, quando siano rilevate classi di sostanze,si devono tenere ben presenti le caratteristiche di specificitàdei test che presentano differenti reazioni crociate nei con-fronti delle sostanze amfetaminiche più comuni e dellesostanze con struttura chimica simile che possono trovarsinelle urine umane e che, in definite concentrazioni, possonointerferire con la risposta analitica.

La reattività crociata, propria delle tecniche immunochi-miche, potrebbe quindi essere un fattore limitante che,tuttavia, se opportunamente conosciuta e gestita, non im-pedisce affatto l’utilizzo di questi saggi che devono essereimpiegati per il rilievo di sostanze e non per la loro identifi-cazione31. E’ evidente, però, come la bassa specificitàcomporti una riflessione sui valori di cut-off (1000 ng/mL)comunemente utilizzati nella pratica quotidiana26.

In generale, a proposito dei cut-off analitici, è opportunoconsiderare che:

a) il cut-off è una misura amministrativa non legata allesole prestazioni delle tecniche analitiche impiegate32;

b) il cut-off viene stabilito anche in funzione della speci-fica realtà, delle finalità e degli obiettivi diagnostici33,34: aquesto proposito, le "Mandatory guidelines for federalworkplace drug testing programs" che rappresentano ildocumento di riferimento anche in Italia (dove, peraltro,manca una specifica normativa per questo tipo di program-ma) hanno finalità ed obiettivi assai diversi rispetto a quelli

Figura 4Spettro di massa dell’efedrina e struttura dei relativi ioni principali

Altri contributi

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propri dei Dipartimenti di Patologia delle Dipendenze (atti-vità di prevenzione, diagnosi, cura e riabilitazione);

c) con le tecniche in GC-MS si ha una sensibilità anali-tica nettamente superiore a quella dei metodi immunochi-mici, ottenendo risultati quantitativi per ogni singola sostan-za (anziché un dato semiquantitativo/qualitativo per classedi sostanza).

Poiché i campioni cosiddetti "negativi" allo screeningsono campioni che vengono generalmente esclusi dallesuccessive indagini di conferma, con la possibilità cheinformazioni utili sul piano clinico e/o medico legale venga-no irrimediabilmente perse (con tutte le possibili conse-guenze sociali, amministrative e giudiziarie), è opportunoconoscere bene i limiti dei metodi utilizzati. L’uso sistema-tico di cut-off troppo bassi, d’altra parte, potrebbe accresce-re il numero di falsi positivi con allungamento dei tempi direfertazione e un’amplificazione dei costi economici, in ter-mini di risorse umane e strumentali, non dimenticando irisvolti etici. L’individuazione di appropriati valori di cut-off,ottenuti secondo un’impostazione statistica rigorosa, po-trebbe quindi meritare in futuro uno studio a sé stante.

Elementi di novità dell’approccio presentato sono rap-presentati sia dalla possibilità di identificare le singole so-stanze (con i relativi metaboliti) assunte dal tossicodipen-dente, sia di migliorare la valutazione delle poliassunzioni,integrando quindi le informazioni ottenute sul piano chimi-co-tossicologico con quelle cliniche e medico legali, al finedi ottimizzare la gestione del singolo caso35. Va infatti tenutoben presente che, nell’area delle dipendenze, allo statoattuale, il fenomeno della poliassunzione è di riscontroabituale e comune nella pratica clinica e medico legale,anche se relativamente poco studiato nei vari ambiti diinteresse. Questa metodologia di intervento operativo nonpuò essere legata alla semplice applicazione dei test immu-nochimici di analisi (OMEC e FPIA), i quali, per quantoefficaci nello screening, rispondono uniformemente a interefamiglie di sostanze psicotrope, sono proni a interferenzepositive e negative e non rilevano adeguatamente le polias-sunzioni e le conseguenti dinamiche metaboliche.

Al contrario, le indagini di conferma secondo protocollidi GC-MS e GC-MS-MS sulla casistica studiata hannoconsentito di cogliere appieno lo spettro delle sostanzeassunte, di confermare o di smentire le dichiarazioni anam-nestiche, di valutare le conseguenze metaboliche e tossi-cologiche delle poliassunzioni, eventualmente anche in re-lazione a finalità medico-legali e tossicologico-forensi, edinfine di impostare correttamente un adeguato programmariabilitativo.

Un’ultima considerazione di particolare apprezzamentodeve essere indirizzata all’approccio interdisciplinare cheha caratterizzato il presente lavoro. Esso ha dimostrato unavolta di più che una corretta impostazione riabilitativa delletossicodipendenze, sotto il profilo medico e psicologico, nonpuò prescindere dalla disponibilità di ampie informazionianalitico-cliniche e che, d’altra parte, l’utilizzo dei più sofisti-cati protocolli chimico-analitici risulta inutile ed economica-mente dispendioso se non è correttamente indirizzato da unadeguato inquadramento anamnestico-clinico. Tutto ciòsottolinea l’importanza di una costante ricerca di sinergie tradiverse professionalità e competenze, al fine di ottimizzaregli interventi nell’area delle dipendenze.

RINGRAZIAMENTI

Si ringraziano per la competente collaborazione tutticoloro che hanno contribuito alla realizzazione di questolavoro, in particolare: la Sig.ra Paola Bellati della AbbottDiagnostics;il Dr. Paolo Barcucci ed i medici dei Ser.T. delDipartimento di Patologia delle Dipendenze dell’ASL 8 diChieri (TO); i Tecnici di Laboratorio Serena Bufano e Jessi-ca Patuto e la Thermo Electron Corporation di Milano per ladisponibilità strumentale.

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Per corrispondenza:

Dott.ssa Denise CaneparoASO San Luigi di OrbassanoRegione Gonzole, 1010043 Orbassano (TO)Tel.: 011-90224232e-mail: denise.caneparo@unito.it

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