Laporan Praktikum Hari, Tanggal : Rabu, 5 November 2014Teknologi Asam Nukleat dan Protein Waktu :

13.00-16.00PJP : Puspa J Puspita, MSc

Asisten : Lidya Agustin M. Maftuchin Sholeh

Eva Selenia Salmi

ISOLASI DNA PLASMID, PEMBUATAN SEL KOMPETEN DAN TRANSFORMASI

Kelompok 06

Ayu Syafitri S G84110002Widadi Tri Rizeky G84110017Hasbi Narantika G84110035Dezika Geniya G84110065

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR2014

PENDAHULUANPlasmid adalah salah satu vektor dalam proses

pengklonan gen berupa molekul DNA utas ganda sirkuler yang

berukuran kecil, terdapat di dalam sitoplasma, dan dapat

melakukan replikasi secara autonom (Suharsono 2006).

Plasmid merupakan material genetik diluar kromosom

dengan ukuran dan berat sekitar 1-300 kb (Snustad dan

Simmons 2003). Vektor ini berbentuk sirkular yang

memungkinkan terjadinya replikasi karena adanya suatu

urutan DNA sebagai asal replikasi. Plasmid memiliki gen

penanda seleksi dominan, yaitu gen resisten antibiotik

(Twyman 1998).

Keberhasilan tahapan isolasi bergantung pada

sumber bahan, konsentrasi bahan, stabilitas, dan kadar

kemurnian produk akhir. Isolasi plasmid terdiri dari

tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan

pemanenan atau harvesting, tahap lisis dan tahap

pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu proses reproduksi

bakteri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid

dalam jumlah yang banyak. Perusakan (lisis) dinding sel

bakteri dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti

sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara

kimiawi menggunakan larutan lisis. Plasmid yang

diperoleh dimurnikan dari berbagai kontaminan dengan

penambahan fenol (Brown 2003).

Rekayasa genetika merupakan teknik

memanipulasikan gen untuk menghasilkan makhluk hidup

baru dengan sifat yang diinginkan. Tahapan rekayasa

genetika yaitu isolasi dan pemurnian plasmid DNA,

pemotongan DNA plasmid, pembuatan sel kompeten dan

transformasi, dan elektroforesis. Komponen yang

dibutuhkan dalam proses rekayasa ini berupa sel inang,

vektor, dan DNA insert. Menurut Brown (2003) bahwa

keberhasilan proses tersebut bergantung pada

keefektifan penyisipan DNA insert ke dalam plasmid sel

inang.

Transformasi adalah proses introduksi DNA

rekombinan (asing) ke dalam sel inang baik itu bakteri,

fungi, tanaman, maupun sel hewan. Sel inang yang

digunakan dalam praktikum adalah bakteri Escherichia coli

karena dapat membelah secara cepat serta memiliki

kandungan plasmid dalam jumlah banyak. Bakteri yang

digunakan dalam proses transformasi adalah bakteri yang

dibuat kompeten dengan perlakuan fisik agar mampu

mengambil DNA yang akan disisipkan pada sel bakteri.

Perlakuan fisik yang diberikan adalah melalui perlakuan

dengan garam CaCl2 atau RbCl (Suharsono 2006). DNA

yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa

potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel

bakteri yang lain atau organisme yang lain.

Penapisan atau screening merupakan tahapan untuk

menyeleksi vektor rekombinan hasil kloning. Penapisan

ini dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain

dengan menguji sensitivitas dan resistensi terhadap

antibiotik, menumbuhkan sel transforman pada medium

selektif nutrien, seleksi biru putih atau α-

komplementasi, analisis restriksi dari DNA plasmid dan

hibridisasi asam nukleat. Uji sensitifitas dan

resistensi antibiotik dapat dilakukan apabila vektor

pengklonan membawa sedikitnya satu gen penyebab

resistensi terhadap antibiotik pada sel inang, misalnya

ampisilin (ampR).

Tujuan dari praktikum kali ini menunjukkan sifat

dan struktur DNA plasmid melalui proses isolasi

terhadap DNA plasmid, menganalisis DNA plasmid yang

mengalami pemotongan dengan enzim restriksi, membuat

sel E. coli kompeten dan melakukan transformasi sel E. coli

dengan DNA plasmid.

METODE PERCOBAAN

Tempat dan Waktu

Praktikum dilakukan di Laboratorium Biokimia,

Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Waktu

pelaksanaannya yaitu Rabu, 5 November 2014 pukul 13.00-

16.00 WIB.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah gelas piala,

neraca analitik, sudip, bunsen, ose, vortex, tabung

reaksi, sentrifus, pH meter, tabung sentrifus, mortar,

penangas es, vial, inkubator, autoklaf, pipet mikro

10µl, 100 µl, 1000 µl, tip pipet mikro, gelas piala,

aluminium foil, cawan petri, penangas, erlenmeyer,

sentrifus, tabung sentrifus, laminar air flow, alat-alat

gelas, dan inkubator.

Bahan-bahan yang digunakan adalah Tris-HCl, EDTA,

sukrosa, NaOH, natrium asetat, fenol, akuades, kultur

bakteri E. coli, medium LB, tripton, NaCl, ampisilin,

kloroform, etanol 70%, etanol absolut, dH2O DNA

plasmid, buffer restriksi, enzim restriksi, media LB

cair dan padat, ampisilin, biakan sel E. coli, CaCl2 75

mM, MgCl2 100 mM, es, DNA plasmid, bufer ekstraksi

(akuades steril, Tris-HCl 1 M pH 8.0, edta 0.5 M pH

8.0, NaCl 5 M dan CTAB 10%), daun kunyit, Na Asetat 3 M

pH 5.2, etanol absolut dingin, kloroformisoamil alkohol

(24:1), PVP, es, dan RNAse dan dH2O steril.

Prosedur Percobaan

Isolasi dan pemurnian plasmid DNA. Pertama,

disiapkan larutan satu, dua, dan tiga. Larutan satu

dibuat dari campuran tris-HCl 25 mM pH 7.5, EDTA 10 mM,

dan sukrosa 15%. Larutan kedua dibuat dari campuran

NaOH 0.2 M dan SDS 1%. Larutan NaOH 0.2 M dibuat dengan

dilarutkannya 0.4 gram kristal NaOH dalam 1000 mL

akuades. Sedangkan larutan SDS 1% dibuat sebanyak 50 mL

dengan cara 0.5 gram SDS ditimbang dan dilarutkan dalam

50 mL akuades. Larutan tiga dibuat dari Na-asetat 3 M

pH 4.6. Langkah kedua yaitu bakteri dibiakkan dalam

medium LB. Medium LB ini dibuat dari campuran 0.5 gram

yeast extract, 1 gram tripton, 0.5 gram NaCl, dan

ampicilin sebagai antibiotik. Konsentrasi akhir medium

LB dijadikan 50 µg/mL.

Langkah selanjutnya, biakan bakteri yang telah

disiapkan diambil dan dipindahkan ke dua tabung

Eppendorf, masing-masing sebanyak 1.5 mL. Tabung

kemudian disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama

tiga menit. Supernatan yang terbentuk kemudian dibuang

dan ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 100 µL

larutan satu. Tabung kemudian divorteks lalu disimpan

dalam es selama lima menit. Berikutnya 200 µL larutan

dua ditambahkan pada masing-masing tabung dan tabung

dicampur dengan cara dibolak-balik. Tabung kembali

disimpan dalam es selama lima menit. Selanjutnya,

ditambahkan 150 µL larutan tiga ke dalam masing-masing

tabung dan disimpan lagi dalam es selama lima menit.

Langkah berikutnya adalah sentrifugasi tabung dengan

kecepatan 8000 rpm selama 10 menit pada suhu 40C.

Setelah terpisah antara supernatan dan pelet,

supernatan dipindahkan ke tabung baru.

Larutan fenol/kloroform sebanyak 300 µL dimasukkan

ke tabung baru tadi dan divorteks kemudian dilanjutkan

dengan sentrifugasi selama lima menit.. Supernatan

diambil dan dipindahkan ke kuvet baru kemudian ditambah

dengan 1 mL etanol absolut. Kuvet selanjutnya divorteks

dan didiamkan dalam suhu ruang selama 5 menit.

Selanjutnya kuvet kembali divorteks dan supernatannya

dibuang. Ke dalam pelet ditambahkan 1 mL etanol 70% dan

divorteks lagi selama 1 menit dan disentrifus.

Terakhir, pelet dikeringkan dan ditambah 30 µL dH2O

lalu disimpan dalam lemari es.

Pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi.

Sebanyak 5-10 mg DNA plasmid, 5 mL buffer enzim (10x),

1 mL enzim restriksi dan dH2O steril dimasukkan ke

dalam erlenmeyer 50 mL hingga volume larutan mencapai

50 m lalu dimasukkan ke dalam es. Campuran tersebut

diinkubasi pada suhu 370 C selama 1 jam. Aktivitas

enzim dihentikan dengan memanaskan pada suhu 650-700 C.

Pembuatan sel kompeten dan transformasi. Media LB

sejumlah 150 mL dibuat dari campuran tripton, NaCl, dan

yeast extract. Bakteri dibiakkan di dalam 100 mL media LB.

Dua buah tabung reaksi bersih disiapkan dan diisi

dengan masing-masing 10 mL media LB. Ke dalam 10 mL

media LB dimasukkan bakteri yang telah dibiakkan selama

satu hari. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 37°C

selama 90 menit. Selanjutnya tabung disentrifus pada

kecepatan 8000 RPM, suhu 40C, selama dua menit.

Sebelumnya tabung sentrifus ditimbang dan digunakan

tabung berisi air sebagai penyeimbang saat

sentrifugasi. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan

ke dalam pelet ditambahkan 5 mL CaCl2. Tabung kembali

disentrifugasi. Supernatan kembali dibuang dan

ditambahkan 5 mL CaCl2 75 mM. Tabung disimpan dalam es

selama 30 menit. Selanjutnya tabung disentrifus,

supernatan dibuang dan ditambahkan 1 mL CaCl2 75 mM.

Terakhir, diambil 100 µL dan disimpan di lemari

pendingin untuk transformasi.

DNA plasmid dengan konsentrasi 0.4 µg sebanyak 2

µL dimasukkan ke dalam dua tabung yang berisi masing-

masing 100 µL. Sel kompeten Tabung disimpan dalam es

selama 30 menit. Langkah berikutnya, diberi perlakuan

kejut panas 420C selama 45 detik. Isi tabung lalu

dicampur ke dalam Erlenmeyer yang berisi 400 µL agar LB

dan diinkubasi selama 30 menit. Agar LB diambil 150 µL

dan dituang dalam cawan petri. Cawan kemudian

diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37°C. Pengamatan

dilakukan dengan penghitungan jumlah koloni yang

terbentuk.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus

dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke

proses selanjutnya. DNA yang biasa diisolasi dan

dimurnikan dalam rekayasa genetika, yaitu DNA total

sel, DNA plasmid, dan DNA faga. Prinsip dasar isolasi

DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan

mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk

ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA

total dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi

sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA

total (Artama 1991). Namun, pada isolasi DNA plasmid

terdapat proses yang akan memisahkan antara DNA total

dan DNA plasmid.

Langkah pertama dalam proses isolasi DNA adalah

perusakan dan atau pembuangan dinding sel bakteri yang

dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi,

tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara kimiawi

menggunakan larutan lisis (Brown 2003). Pada praktikum

ini, perusakan dinding sel dilakukan dengan pemberian

larutan lisis dan SDS pada kultur bakteri. Larutan

lisis yang digunakan mengandung EDTA 10 mM, Tris HCl 25

mM, dan sukrosa 15%. EDTA 10 mM yang berfungsi sebagai

perusak sel dengan cara mengkelat ion magnesium. Tris-

HCL berperan sebagai buffer untuk menjaga pH DNA berada

dalam keadaan optimum. Sedangkan sukrosa 15% berfungsi

memecah dingding sel bakteri (Ausubel et al. 1994).

Setelah optimalisasi reaksi pada suhu dingin, maka

ditambahkan larutan untuk mengendapkan dinding sel.

Larutan tersebut adalah NaOH dan sodium dodesil sulfate

(SDS). Penambahan NaOH akan menyebabkan pH menjadi 12.0

- 12.5 sehingga ikatan hidrogen pada molekul DNA tidak

berlilitan akan pecah dan menyebabkan heliks ganda

terurai dan rantai polinukleotida memisah. Penambahan

Na-asetat yang bersifat asam menyebabkan DNA bakteri

yang terdenaturasi akan mengelompok kembali menjadi

benang kusut sehingga dengan proses sentrifugasi dapat

terpisah (Brown 2003).

Plasmid yang diperoleh masih belum murni sehingga

perlu dilakukan pemurnian dari berbagai kontaminan.

Setelah penambahan fenol, kecepatan sentrifugasi

ditingkatkan agar kontaminan protein yang terdapat

dalam ampel dapat dihilangkan. Kecepatan yang semakin

tinggi diperlukan untuk mengendapkan asam nukleat

karena densitas DNA yang lebih tinggi yakni sekitar 1.7

g cm-3 dibanding protein dan molekul lain yang

densitasnya berkisar kurang dari 1 g cm-3 (Albert et al.

2004). Saat sentrifugasi, dilakukan penmbahan etanol

absolut agar proses presisipitasi DNA menjadi lebih

sempurna. Berbagai penambahan pelarut dilakukan sebagai

upaya dalam pemurnian plasmid. Menurut Ausubel et al.

(1994) bahwa penambahan etanol 70% akan menghilangkan

berbagai pelarut yang telah ditambahkan selama tahapan

pemurnian sehingga diharapkan yang tersisa hanyalah DNA

plasmid (Ausubel et al. 1994).

Pembuatan DNA rekombinan diawali dengan pemotongan

DNA plasmid dan DNA insert menggunakan enzim restriksi

sejenis. Enzim restriksi yang digunakan dalam praktikum

adalah BamH1. Enzim ini akan menghasilkan ujung

lengket yang sama yakni GATC. Sifat ini dikenal dengan

isochizomer yakni enzim yang memiliki situs pengenalan

sama dan hasil pemotongan bisa sama atau tidak. Fragmen

DNA hasil pemotongan oleh salah satu enzim tersebut

dapat disambung karena tiap fragmen memiliki ujung

lengket yang komplementer. Akan tetapi hasil ligasi

tersebut tidak dapat dipotong lagi dengan enzim yang

sama karena telah dimasukkan dalam vektor sehingga

ukurannya menjadi lebih besar.

Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi

menggunakan beberapa perlakuan. Penyimpanan sampel di

es bertujuan untuk menjaga aktivitas enzim. Proses

inkubasi suhu 370 C selama 1 jam bertujuan untuk

meningkatkan aktivitas enzim. Pemanasan pada suhu 650-

700 C bertujuan untuk menghentikan aktivitas enzim.

Penambahan bromfenolbiru berfungsi sebagai penanda

migrasi pada proses elektroforesis. Proses

elektroforesis bertujuan untuk mengetahui bobot molekul

DNA plasmid nyang dipotong oleh enzim restriksi dan DNA

plasmid yang utuh. Selanjutnya, DNA plasmid yang telah

dipotong disambungkan dengan DNA insert menggunakan

enzim ligase untuk membentuk DNA rekombinan. Pada

praktikum ini tidak digunakan DNA insert, sehingga

setelah pemotongan terjadi DNA plasmid disatukan

kembali oleh ligase.

Plasmid yang diperoleh dari proses isolasi ialah

plasmid pUC19 (Gambar 1). Plasmid ini banyak digunakan

sebagai vektor kloning karena memiliki ukuran kurang

dari 10 kb sehingga dapat menghindari kerusakan DNA

saat pemurnian. Ukuran plasmid ini sebesar 2686 bp,

menunjukkan bahwa pemurnian dapat dilakukan dengan

mudah. Vektor

ini membawa

dua gen

resisten antibotika yakni ampisilin dan tetrasiklin.

Antibiotika tersebut dapat digunakan sebagai penanda

seleksi dan tiap gen penanda mengandung tempat

restriksi yang khas untuk kloning. Selain itu, plasmid

ini memiliki banyak kopi, sekitar 15 molekul dalam sel

E.coli dan jumlahnya dapat ditingkatkan hingga 3000 kopi

dengan cara amplifikasi plasmid (Brown 2003).

Gambar 1 Plasmid pUC19

Tahap selanjutnya ialah penyisipan DNA rekombinan

dalam sel inang (transformasi). Secara alami, beberapa

jenis bakteri mempunyai kemampuan untuk menyerap (up

take) untaian DNA yang diatur oleh serangkat gen (gen-

gen kompeten). Proses transformasi ke sel bakteri pada

umumnya menggunakan metode heat shock. Secara artificial,

bakteri dapat dibuat kompeten dengan larutan kalsium

klorida (CaCl2) dingin. Ion kalsium akan menetralisir

aksi tolak-menolak antara muatan negatif dan bagian

kepala fosfolipid dengan muatan negatif gugus fosfat

DNA. Selain itu, CaCl2 dingin menyebabkan terganggunya

struktur membran sel sehingga membentuk pori dan

bersifat permeabel. Bakteri kemudian diperlakukan

dengan suhu 42oC (heat shock) selama 45 detik.

Pemanasan menimbulkan gradien panas yang menyebabkan

aliran yang mengalir ke dalam sel yang memungkinkan DNA

masuk ke dalam sel (Brown 2003).

Proses transformasi menggunakan kontrol positif

dan kontrol negatif (Gambar pada Tabel 1). Kontrol

positif dari sel kompeten E. coli tumbuh karena sel

tersebut mengandung plasmid pUC19 yang telah

ditransformasikan sehingga mengandung gen resistem

ampisilin. Penggunaan kontrol positif dan negatif

bertujuan untuk mengetahui keberhasilan proses

transformasi tanpa adanya kontaminasi serta untuk

memastikan kualitas sel kompeten yang telah dibuat

sebelumnya (Sambrook dan Russell 2011). Selain dengan

screening, untuk menyeleksi transforman dapat dilakukan

dengan deteksi menggunakan XGal (5-bromo kloro-indolil-

β-D-galaktosida), transposon, dan menggunakan pelacak

(probe).

Tabel 1 Hasil seleksi bakteri transformanCawan Gambar

Kontrol positif (ampisislin)

Kontrol negatif

Plasmid rekombinan

Berdasarkan hasil yang diperoleh, sel E. coli

berhasil ditransformasikan yang diperoleh dari cawan

hasil inkubasi. Pada cawan yang berisi bakteri hasil

transformasi, terdapat koloni bakteri yang tumbuh yang

menunjukkan bahwa proses transformasi telah terjadi.

Terdapat berbagai faktor yang mempengaruhi keberhasilan

proses transformasi. Salah satunya adalah keberhasilan

pembuatan sel kompeten. Sel kompeten yang masih baru

akan memiliki kemampuan menerima plasmid lebih baik

dibandingkan sel kompeten yang telah disimpan lama.

Selain itu, enzim restriksi dan pengaruh pemanasan saat

heat shock juga sangat mempengaruhi hasil.

SIMPULAN

DNA plasmid dapat digunakan sebagai vektor cloning

karena mampu bereplikasi secara autonomous. Plasmid

berhasil diisolasi dengan penumbuhan kultur E.coli,

pemanenan sel E.coli, dan pemurnian dari kontaminan lain

melalui metode lisis alkali. Pemotongan plasmid

dilakukan dengan enzim restriksi oleh BamH1 akan

menghasilkan ujung lengket yang sama yakni GATC.

Plasmid yang dipotong oleh BamH1 akan mudah disisipi

gen target dari pada plasmid pada umumnya. Pemotongan

ini merupakan salah satu langkah dari proses rekayasa

genetika. Plasmid pUC19 telah berhasil ditransformasi

ke sel E.coli yang terlihat dari adanya koloni putih

pembawa resistensi antibiotik ampisilin.

DAFTAR PUSTAKA

Alberts B et al. 2004. Essential Cell Biology. 2nd edition. NewYork (UK): Garland Science.

Artama WT. 1991. Rekayasa Genetika. Yogyakarta (ID): UGMPress.

Ausubel FM et al. 1990. Current Protocols in Molecular Biology.Kanada (US): John Willey & Sons.

Brown TA. 2003. Pengantar Kloning Gen. Muhammad SA,penerjemah. Terjemahan dari: Gene Cloning anIntroduction. Yogyakarta (ID): Yayasan EssentiaMedika

Sambrook J & DW Russell. 2001. Molecular Clonning: ALaboratory Manual. New York (US): Coldspring HarborLaboratory Pres.

Snustad DP & MJ Simmons. 2003. Principles of Genetic. Hoboken(US): Wiley & Sons Inc.

Suharsono WU. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan TeknikPengklonan Gen. Bogor (ID): Pusat Penelitian SumberDaya Hayati dan Bioteknologi IPB.

Twyman RM. 1998. Advanced Molecu;ar Biology. New York (US):BIOS Scientific Publisher.