Laporan Praktikum ke-5 dan 6 Hari/Tanggal :Selasa/30 September 2014m.k Penyakit Organisme Akuatik Kelompok : 11

Asisten : Adel Christian Iqbal Wijaya

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PATOGEN

Disusun oleh:Rinda Ulfah Likandi

C14120011

DEPARTEMEN BUDIDAYA PERAIRANFAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR2014

I. PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Penyakit adalah salah satu faktor penghambat dalam

kegiatan budidaya perikanan karena dapat mengurangi

atau bahkan meniadakan keuntungan yang memang menjadi

tujuan kegiatan akuakultur. Penyakit pada dasarnya

adalah segala sesuatu yang mengganggu aktivitas

fisiologis ikan baik secara langsung ataupun tidak

langsung (Sachlan 1972 dalam Afrianto dan Liviawaty

1992). Penyakit pada ikan hanya akan terjadi apabila

terdapat reaksi antara agen patogen, lingkungan yang

tidak sesuai, dan inang. Apabila terdapat salah satu

faktor di antara ketiga hal di atas yang tidak sesuai

bagi kehidupan ikan, maka kemungkinan ikan terjangkit

penyakit semakin besar.

Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk

mengurangi kemungkinan ikan terjangkit penyakit yaitu

mengatur lingkungan yang sesuai dengan ikan yang

dibudidayakan. Faktor inang dan adanya patogen sulit

dihindari karena hal itu bersifat alami, sementara

lingkungan ikan budidaya adalah sesuatu yang dapat

direkayasa sehingga dapat dikontrol. Hal itu juga

didukung oleh pendapat Suparjo (2008) yang mengatakan

bahwa lingkungan adalah faktor pembatas pada kegiatan

budidaya karena ketidaksesuaian lingkungan akan

mengakibatkan kematian ikan lebih cepat daripada

faktor patogen atau inang ikan sendiri. Oleh karena

itu, faktor lingkungan harus dikelola dan dikontrol

dalam jangka waktu tertentu untuk menghindari penyakit

yang berpotensi menyebabkan kematian pada ikan.

Tidak jarang apabila penyakit telah menjangkit

ikan, petani sulit menentukan jenis penyakit yang

menyerang ikan mereka sehingga petani pun kesulitan

menentukan langkah yang harus diambil dalam

menanggulangi penyakit itu. Terlebih lagi, banyak

penyakit pada ikan yang memiliki gejala klinis yang

mirip antar satu penyakit dengan penyakit lain

sehingga metode laboratorium sering menjadi alternatif

untuk mendiagnosa penyakit yang menyerang. Salah

satunya yaitu metode isolasi dan karakterisasi bakteri

patogen. Metode ini dinilai tepat untuk mengetahui

jenis penyakit dan langkah penanggulangan dan kelak

juga menentukan langkah pencegahan pada jenis patogen

tersebut.

I.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar

mahasiswa mengetahui jenis-jenis bakteri akuatik

penyebab penyakit pada ikan beserta ciri-cirinya, serta

mengetahui cara penanganan bakteri dari tahap isolasi

hingga tahap identifikasi sehingga memudahkan

dilakukannya diagnosa, penentuan penyebab penyakit, dan

penentuan langkah pengendalian penyakit.

II. METODOLOGI

II.1 Waktu dan Tempat

Praktikum dilaksanakan pada hari Selasa, 30 Oktober

2014 pada pukul 13.00 sampai 15.00 untuk praktikum

isolasi bakteri pada organ ikan, sementara isolasi dan

karakterisasi bakteri dilakukan pada hari Selasa, 7

Oktober 2014 pada waktu yang sama di Laboratorium

Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Pengamatan hasil karakterisasi bakteri dilakukan pada

hari Rabu, 8 Oktober 2014 di Laboratorium Kesehatan

Ikan, Departemen Budidaya Perairan, IPB.

II.2 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah alat bedah,

mikroskop, pipet tetes, kaca preparat, cover glass,

mikropipet, mikrotip, cawan petri, batang ose, wrapped

plastic, bunsen, tisu, baki, oven, label, dan alat tulis.

Bahan-bahan yang digunakan adalah ikan lele (Clarias

sp.), ikan nila (Orechromis niloticus), alkohol 70 %,

pewarna Kristal violet, pewarna safranin, akuades,

lugol, alkohol absolut, media TSA, KIT API 20 E, dan

KIT API STREP.

II.3 Prosedur

2.3.1 Isolasi Bakteri dari Ginjal dan Luka/Otak Ikan

Lele (Clarias sp.) dan Ikan Nila (Oreochromis niloticus)

2.3.1.1 Cara Isolasi Bakteri

Hal pertama yang harus dilakukan yaitu melakukan

pengamatan visual pada ikan lele dan ikan nila, apabila

terdapat gejala klinis pada morfologi ikan. Jika tidak

didapat gejala di bagian luar tubuh ikan, dilakukan

pembedahan pada ikan lele dan ikan nila. Organ tubuh

ikan yang diambil yaitu ginjal dan otak pada masing-

masing ikan. Sebelum dilakukan isolasi, dilakukan

sterilisasi tangan dan meja kerja dahulu dengan alkohol

70 %, lalu dikeringkan dengan tisu, kemudian dinyalakan

bunsen.

Ujung batang ose dipanaskan dahulu, didinginkan

sejenak, lalu digunakan untuk dioleskan pada organ yang

dimaksud untuk mengambil bakteri patogen. Setelah itu

dioleskan pada cawan petri yang berisi media TSA yang

pinggirannya telah didekatkan kea pi untuk menghindari

kontaminan. Setelah penggoresan dilakukan, pinggiran

cawan dibungkus dengan wrapped plastic dan diberi label

agar tidak tertukar.

2.3.2 Karakterisasi Bakteri Patogen,

2.3.2.1 Pewarnaan Gram

Bakteri yang akan dilakukan pewarnaan gram berasal

dari bakteri hasil kultur pada media agar miring yang

telah disiapkan sebelumnya. Setelah itu, meja kerja dan

tangan disterilisari dengan alkohol 70 %, lalu

dikeringkan dengan tisu. Ujung batang ose dipanaskan

terlebih dahulu lalu didinginkan sesaat, kemudian

digunakan untuk mengambil koloni bakteri pada media

agar miring untuk dioleskan pada kaca preparat.

Sebaiknya tidak terlalu tebal agar memudahkan dalam

pengamatan. Setelah itu, preparat ditetesi akuades

sedikit, lalu dipanaskan di atas api dengan jarak yang

tidak terlalu dekat dengan tujuan fiksasi. Setelah

fiksasi, preparat ditetesi oleh kristal violet dan

ditunggu selama satu menit.

Setelah satu menit, dibilas dengan akuades.

Selanjutnya, preparat ditetesi dengan lugol/Kalium

Iodida sebanyak satu tetes dan ditunggu ssatu menit.

Kemudian, dibilas kembali dengan akuades. Setelah itu,

ditetesi dengan alkohol absolut, lalu ditunggu selama

30 detik, kemudian dibilas kembali dengan akuades.

Teakhir, ditetesi dengan pewarna safranin, lalu

ditunggu selama 30 detik, setelah itu dibilas kembali

dengan akuades. Setelah semua prosedur selesai,

dilakukan pengamatan di bawah mikroskop untuk mengamati

bentuk dan warna bakteri serta jenis bakteri.

2.3.2.2 Karakterisasi dengan KIT API 20 E

Isolat bakteri dicampur ke dalam PSB 5 ml. Setelah

itu, campuran tadi dimasukkan ke dalam larutan PBS 5 ml

di dalam appendorf. Kemudian, larutan tadi dimasukkan

ke dalam wadah sumur-sumur lalu diinkubasi selama 24

jam pada suhu 37oC. Jumlah yang dimasukkan ke dalam

strip plastik tersebut tergantung pada penanda di bawah

tiap-tiap strip, VP untuk pengisian penuh, ADH untuk

pengisian ½ bagian ditambah oil, dan ONPG untuk

pengisian ½ bagian tanpa penambahan apapun. Setelah

diinkubasi, dimasukkan reagen-reagen tertentu agar

diketahui hasil akhirnya. Terakhir, dibaca hasil yang

muncul menggunakan software API WEB untuk mengetahui

identitas kemiripannya.

2.3.2.3 Karakterisasi dengan KIT API STREP

Bakteri yang telah digores di media kemudian

dimasukkan ke dalam appendorf dan ditambah dengan

akuades sebanyak 2 ml. Setelah itu, pada strip plastik

yang kecil diisi sebanyak ½ bagian menggunakan

mikropipet, sementara bagian strip plastik besar diisi

sebanyak ½ bagian ditambah dengan oil. Keduanya

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Kemudian, pada

strip plastik kecil ditambah reagen-reagen tertentu

sementara pada strip plastik yang besar langsung dibaca

hasil yang terlihat dan dimasukkan dalam software API

WEB.

III.HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

Berikut ini merupakan hasil isolasi bakteri patogen

pada Ikan Lele (Clarias sp.)

Kel.

Tumbuh/ Tidak

Warna Tepian Elevasi FotoNila Lele

Otak Ginjal

Otak

Ginjal

1 V V V V Putih Halus Cembung

2 V V V V Putih Halus Cembung

3 V V V V Putih Halus Cembung

4 V V V V Putih Halus Cembung

5 V V - V Putih Halus Cembung

6 V V V V Kuning

Halus Cembung

7 V V V V Putih Halus Cembung

8 V V V - Putih Halus Cembung

9 V - - - Putih Halus Cembung

10 V V V V Putih Halus Cembung

11 V V V - Putih Halus Cembung

12 V - V V Putih Halus Cembung

Tabel 1 Hasil Isolasi Bakteri Patogen pada Ikan Lele

(Clarias sp.)

Berdasarkan hasil yang didapat pada tabel di atas,

diketahui bahwa bakteri patogen pada otak dan ginjal

ikan nila dan ikan lele kelompok 1, 2, 3, 4, 6, 7, dan

10 tumbuh dengan tepian halus, warna putih agak

kekuningan, dan elevasinya cembung, sedangkan kelompok

5 bakteri pada otak ikan lele tidak terdapat

pertumbuhan bakteri, pada kelompok 8, juga tidak

terdapat pertumbuhan bakteri pada ginjal, kelompok 9

hanya bakteri pada otak ikan nila yang terlihat ada

pertumbuhan bakteri, serta kelompok 11 dan 12 bakteri

pada ginjal ikan lele dan ginjal ikan nila tidak

terdapat pertumbuhan bakteri.

Tabel 2 Hasil pewarnaan gram (Shift 1 atas)

Kelompok

Isolat

Gram Penampang/Bentuk Foto

7 A/B +/- Cocus/ Basil8 B - Basil (Bacillus sp.)9 A - Basil (Bacillus sp.)

10 B - Basil (Bacillus sp.)

11 A + Coccus (Streptococcussp.)

12 B - Basil (Bacillus sp.)

Berdasarkan hasil pada tabel di atas, diketahui

bahwa jenis isolat B setelah dilakukan pewarnaan gram

yaitu berbentuk basil dengan genus Bacillus sp. yang

termasuk gram negatif. Namun, pada kelompok 9 didapat

isolat A yang juga merupakan bakteri Bacillus sp. Isolat A

setelah dilakukan pewarnaan gram termasuk gram positif

dengan genus Streptococcus sp.

Tabel 3. Hasil Karakterisasi Bakteri Patogen dengan KITAPI 20 E dan API 20 STREP.

Shift 1(sampel) Uji Kit Hasil % ID

1 (A) API 20 Strep Aerococcus urinae 952 (B) API 20 E Aeromonas hydrophila 74,2Shift 2(sampel)1 (A) API 20 Strep Streptococcus agalactiae 81,22 (B) API 20 e Aeromonas hydrophila 89,8

Berdasarkan tabel di atas, hasil uji karakterisasi

patogen dengan kit API 20 E pada sampel B yaitu didapat

bakteri Aeromonas hydrophilla dengan persentase kemiripan

pada shift 1 yaitu 74.2 % dan 89.8 % pada sampel shift

2. Sementara pada KIT API 20 STREP didapat bakteri

Aerococcus urinae pada sampel shift 1 dengan kemiripan 95 %

dan Streptococcus agalactiae pada sampel shift 2 dengan

kemiripan 81.2 %.

3.2 Pembahasan

Hasil isolasi bakteri pada ginjal ikan lele

sebagian besar didapat isolat koloni bakteri berwarna

putih kekuningan dengan elevasi cembung. Hal ini sesuai

dengan Wijayanti et al (2013) yang mendapatkan koloni

putih, memiliki elevasi cembung dan pipih. Hasil

isolasi bakteri pada otak ikan lele didapat koloni

berwarna putih dengan tepian halus dan elevasi cembung.

Hasil ini sesuai dengan hasil yang diperoleh Wijayanti

et al (2013) yang juga menunjukkan hasil isolasi bakteri

pada otak lele membentuk koloni putih keruh dengan

elevasi cembung. Hasil isolasi bakteri dari otak dan

ginjal ikan nila menunjukkan hasil berupa koloni

bakteri dengan warna putih kekuningan yang agak

transparan. Hal ini sesuai dengan penemuan yang

dilakukan Gardenia et al (2011) yang menemukan hasil

isolasi bakteri dengan sumber organ ginjal dan otak

ikan nila berupa koloni putih dengan elevasi cembung.

Hasil pewarnaan gram menunjukkan bahwa terdapat

dua isolat berbeda yaitu isolat A yang merupakan

bakteri Streptococcus sp. dan isolat B yang merupakan

Bacillus sp. Kedua bakteri ini termasuk gram positif

karena saat dilakukan pewarnaan, terlihat warna ungu

pada hasil pengamatan. Warna ini diperoleh dari

pewarnaan menggunakan Kristal ungu. Warna ungu ini

diserap oleh peptidoglikan yang terdapat dalam membran

sel bakteri dan terikat sempurna serta tidak luruh

ketika dibilas oleh alkohol absolut sehingga warna ungu

tetap bertahan sampai akhir (Sabir 2005). Hasil yang

diperoleh pada Tabel 2 tidak sesuai dengan literatur

karena warna yang terlihat saat pengamatan Bacillus sp.

terlihat agak kemerahan yang diakibatkan pewarna

safranin sehingga terlihat seperti bakteri gram

negatif.

Streptococcus sp. adalah bakteri gram positif dan

nonmotil yang merupakan anaerob fakultatif (Sabir

2005). Bakteri ini memiliki bentuk bulat, tersusun

seperti rantai dan tidak membentuk spora. Bakteri ini

tumbuh secara optimal pada suhu sekitar 180C – 400C.

bakteri ini dapat menyebabkan karies gigi pada manusia,

selain itu dapat menjadi agen patogen pada ikan,

terutama pada spesies tilapia. Bacillus sp. juga merupakan

bakteri gram positif, tetapi memiliki bentuk basil atau

menyerupai batang. Bakteri ini termasuk aerob sehingga

tidak dapat hidup tanpa adanya oksigen, selain itu

bakteri ini bersifar saprofor dan dapat di hidup di

berbagai tempat.

Aeromonas hydrophilla termasuk bakteri gram negatif

dan bersifat positif oksidatif. Aeromonas

hydrophila berbentuk batang lurus dengan ujung membulat,

biasanya m otil dengan flagel tunggal. Kadang-

kadang flagel bersifat peritrik dalam medium cair saat

kultur muda. Bakteri ini bersifat anaerobik fakultatif

dan kemoorganotropik karena melakukan respirasi dan

fermentasi (Ko et al 2003).

Bakteri adalah organisme mikroskopis bersel

tunggal yang hidup bebas dan mampu bereproduksi sendiri

walaupun kadang memerlukan inang (Corwin 2009). Bakteri

tidak memiliki inti sel. Tubuh bakteri terdiri atas

sitoplama yang dikelilingi oleh dinding sel yang

mengandung zat tertentu yang biasa disebut

peptidoglikan. Sitoplasma merupakan tempat bagi materi

genetik, baik DNA atau RNA dan segala zat yang

dibutuhkan untuk metabolisme sel (Corwin 2009). Bakteri

bereproduksi dengan cara yang sederhana yaitu

reproduksi aseksual sederhana dan pembelahan diri.

Sebagian bakteri memiliki pertahanan tubuh dari zat-zat

atau lingkungan yang tidak sesuai bagi diri mereka.

Biasanya bakteri digolongkan dalam dua kelompok

besar yaitu bakteri gram negatif dan bakteri gram

positif. Bakteri gram negatif yaitu bakteri yang

mayoritas dari jenisnya adalah bakteri patogen. Bakteri

ini memiliki dinding sel yang terdiri dari

lipopolisakarida. Lipopolisakarida berfungsi untuk

pertahanan bakteri terhadap imunitas inangnya sehingga

dinding sel bakteri gram negatif sulit ditembus oleh

antibiotik (Campbell dan Reece 2003). Contoh bakteri

gram negatif yaitu Salmonella typhosa dan Azotobacter.

Bakteri gram positif yaitu bakteri yang dinding selnya

banyak mengandung peptidoglikan daripada lipid sehingga

akan berwarna keunguan apabila dilakukan pewarnaan gram

(Campbell dan Reece 2003). Bakteri gram negatif lebih

rentan terhadap antibiotik, tetapi sulit ditumbuhkan di

media karena memiliki kebutuhan nutrisi yang kompleks

(Grossman et al 1988).

Standar isolasi dan identifikasi bakteri yaitu

didasarkan pada standar nasional atau internasional

yang telah berlaku. Indonesia memiliki standar sendiri

untuk isolasi dan identifikasi bakteri yaitu SNI ISO

No. 6887-3 Tahun 2012 mengenai standar uji mikrobiologi

pada bidang perikanan (Badan Standarisasi Nasional

2013). Isi dari standar yang tercantum yaitu

standarisasi mikrobiologi bahan pangan dan pakan berupa

penyiapan contoh uji, suspensi awal dan pengenceran

desimal untuk pengujian mikrobiologi, serta aturan

khusus untuk penyiapan ikan dan produk perikanan (Badan

Standarisasi Nasional 2013).

Isolasi dan identifikasi bakteri pada saat ini

tidak hanya dilakukan dengan cara konvensional, tetapi

telah digunakan metode yang lebih modern yaitu dengan

KIT. Kit yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah

KIT API 20E dan KIT API 20 STREP. Kit API 20E adalah

kit komersial yang biasa digunakan untuk

mengidentifikasi bakteri Enterobacteriaceae dan

beberapa spesies bakteri gram negatif lainnya.

Penggunaan KIT dalam karakterisasi bakteri dinilai

lebih cepat disbanding metode konvensional karena dalam

KIT telah tersedia reagen-reagen yang dapat digunakan

langsung dalam karakterisasi, sementara hal itu tidak

didapat pada metode konvensional. Hasil yang didapat

pun relatif lebih akurat daripada metode konvensional.

Namun, karena kelengkapannyalah harga KIT di pasaran

masih relatif mahal disbanding metode konvensional

(Astuti 2009)

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

IV.1 Kesimpulan

Menurut jenis gram, bakteri terdiri atas gram

negatif dan gram positif. Bakteri gram positif akan

menunjukkan warna ungu pada akhir pewarnaan gram

sementara bakteri gram negatif akan terlihat warna

kemerahan pada akhir pewarnaan gram. Isolasi dan

identifikasi bakteri baik dengan kit maupun manual

dapat berfungsi sebagai langkah deteksi bakteri patogen

yang meyerang ikan sehingga dapat dilakukan penanganan

yang tepat dan cepat apabila terlihat gejala klinis

pada ikan.

IV.2 Saran

Praktikum selanjutnya diharapkan setiap kelompok

mendapat kesempatan untuk menggunakan KIT API untuk

identifikasi bakteri agar lebih dapat memahami prosedur

identifikasi bakteri dengan kit.

DAFTAR PUSTAKA

Afrianto E dan Liviawaty E. 1992. Penyakit dan Hama Ikan.Yogyakarta (ID): Kanisius

Astuti DD. 2009. Karakterisasi Fisiologi danIdentifikasi Molekuler Isolat-Isolat BakteriMetanotrof Asal Sawah Wilayah Bogor dan Sukabumi.Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu PengetahuanAlam, Institut Pertanian Bogor

[BSN ] Badan Standarisasi Nasional. 2013. BuletinInformasi SNI Terbaru. [Internet]. [Diacu tanggal10 Oktober 2014]. [Terdapat padahttp://bsn.go.id/uploads/download/buletin_SNI_final_Cetak_reduced1.pdf]

Campbell NA dan Reece JB. 2003. Biologi Edisi ke-5 Jilid ke-2.Jakarta (ID): Erlangga.

Corwin EJ. 2009. Buku Saku Patofisiologi Ed. 3. Jakarta (ID):Penerbit Buku Kedokteran EGC

Gardenia L, Koesharyati I, dan Aryati Y. 2011. KasusInfeksi Alami: Diagnosa Streptococcus agalactiae dariJaringan Ikan Nila Menggunakan PCR. Journal of FisheriesScience XIII (1): 22-26

Grossman LI, Oliet S, dan Del Rio CE.1988. IlmuEndodontik dalam Praktik. Jakarta (ID): Penerbit BukuKedokteran EGC

Ko, CW, Chiang SR, Lee HC, Tang HJ, Wang YY, dan ChuangYC. 2003. In vitro and In Vivo Activities ofFluoroquinolones Againts Aeromonashydrophila. Antimicrob. Agents and Chemother. 47 (7) :2217-2222.

Sabir A. 2005. Aktivitas Antibakteri Flavonoid PropolisTrigona sp, terhadap Bakteri Streptococcus mutans (invitro). Dental Journal. Vol. 38 No.3: 135-141

Suparjo MN. 2008. Daya Dukung Lingkungan PerairanTambak Desa Murorejo Kabupaten Kendal. Jurnal Saintek.Vol. 4 No.1: 50-55.

Wijayanti A, Sarjito, Prayitno SB. 2013. Identifikasidan Uji Postulat Koch Agensia Penyebab PenyakitBakteri pada Ikan Lele yang Berasal dari Demak.Journal of Aquacuture Management and Technology. Vol. 2 No.2: 10-19.

LAMPIRAN

Sjdn

Hasil isolasipada organ

Hasil isolasipada organ

Hasil

pewarnaan gramSebelum

Setelahdiinkubasi 24