МОСКОВСКИЙ ОРЛЕНА ЛЕНИНА И ТРУДОВОЮ КРАСНОЮ ЗНАМЕНИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ и м . М 3 . ЛОМОЮСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА ЦИТОЛОГИИ И ГИСТОЛОГИИ

ИММУЮГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК КУЛЬТУРЫ

КОСТНОГО МОЗГА И ОЧАГА АСЕПТИЧЕСКОГО1 ВОСПАЛЕНИЯ

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА студента 5-го курса

А Д З о тина

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

докт. био л . наук Н.ГДрув|овТ .В .Васильева

канд. биол. наук С.И.Поликарпова

Москва 1977

С О Д Е Р Ж А Н И Е

стр .

ьгШ Ь йИЕ . . . . . . I

ОБЗОР лкИ Ш Ш И ......................................................... 2-7

Г. м о д флуоресцирующих антител .................................................. 2-7

I . Методы выявления антигенов . . . « .................. . . . 2-4

. Методы выявления антител . « . . . .................. « « • 4-5

з« Контроле иммунологической специфичности флуоресценции 5-7

Л, Применение метода флуоресцирующих антител в иммунологии 7-ГГ

I* Обнаружение чужеродных антигенов, введенных в организм 7-8

2« Применение шшуиофдуоресцентвого метода для изучения

образования антител в организме ............................... • • 8-ТО

3 . Исследование мембранных антигенов клеток иммунной

системы ........................................................... «10-П

Ш. Применение метода флуоресцирующих антител в гистологии ГТ-23

Г. Изучение распределения собственных белковых антигенов

в организме животных «11-13

2* Исследование антигенной структуры тканей взрослого

организма . . • • • • • . * ...................... • • • • • «1Э-Т7

3 . Иммунофдуоресцентные исследования становления антиген#

вой структуры тканой организмов в ходе.зародышевого

развития • • • • • • • • • • • • • • • . « • • • • Г7-21

4« Применение метода флуоресцирующих антител для исследо­

вания гистогенеза тканей хивотньл в постнаталъном

онтогенезе . . . . , 2 Г-23

НАТЕРБАДЫ И feb'i’UiiN ................................................................. .. . .24—26

результаты и ыл оьсужде|ШЬ ........................................... .... «27-зх

Исследование клеток культуры костного мозга ..................27-29

Исследование клеток культуры очага асептическое

воспаление • • • • • • • • ........................... « .................. .29-31ьЫьиДЫ ................................................................................... « • • • • 3 1

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ У ..........................................................................; -4 2

ВВШШЁ

Для изучения гистогенеза клеток соединительной ткани широко

используются такие экспериментальные подели как культура клеток

различных органон и новообразование соединительной ткани в очаге

асептического воспаления. Эти методы дают возможность в короткий

срок подучить новообразование изучаемых клеток и провести анализ

путей дифференцирован этих клеток, используя тот или иной мето­

дический прием Црущов 1976). Наиболее перспективным в этом отно­

шении является применение иммунофлуоресцентного метода, обладаю­

щего рядом преимуществ перед другими используемыми методами (см.

Васильева Т977).

При исследовании этим методом культуры клеток костного мозга

ксеногенных (мышь - крыса) радиационных химер было показано, что

фибробдастоподобные клетки не взаимодействуют с видоспецифической

сывороткой против клеток костного мозга крысы (Поликарпова и д р .

1977). Логично было предположить, что зги клетки имеют рацияневтеку*

(мышиную) природу. Однако, наркологический анализ показал, что

практически все делящиеся клетки культуры костного мозга редиохимер

имеют кариотип донора. Оказалось, что фибробдастоподобные кдетки

культуры крысиного костного мозга также не связываются с антикост-

ниьшзговой сывороткой. Целью настоящей работы было иммуиогистохи-

мическое исследование этих клеток в культуре костного мозга крысы,

а также в очаге асептического воспаления*

ОЬЗОР АИТаРАТУ^Ы.

В настоящее время все большее распространение в гистогене-

тических исследованиях приобретает метод Флуоресцирующих антител»

Однако» применение этого метода для изучении гистогенеза имеет

определенные границы» Для того» чтобы иметь представление об этих

границах» необходимо знать возможности применения метода флуоресцир’

ющвх антител в гистологических исследованиях вообще* Описанию этих

возможностей и посвящен данный обзор»

Г. Метод iiiiUK)i)eomiP*Mum « и и м .

Сущность метода состоит а том» что к антителам иммунной сыво­

ротки химически присоединяется флуоресцирующее вещество» Если та­

кие меченые антитела привести в соприкосновение с соответствующи­

ми антигенами» то антитела специфически адсорбируются на поверх­

ности антигенов» При просмотре препаратов под люминесцентным ми­

кроскопом антигены будут обнаруживаться по яркой флуоресценции

адсорбированных антител»

Существует большое количество вариантов метода флуоресцирую­

щих антител» Все они могут быть разделены на две группы: методы

выявления антикеяов я методы выявления антител»

I . Методы выявления антигенов»*

Исторически первым был разработан прямой метод, который со­

стоит в том» что иммунная сыворотка» специфичная в отношении вы-, Coons

являемого антигена непосредственно метится >.;луорохроком (

e t &а&942). При обработке препаратов такой сывороткой к каж-

- 2 -

+ JATC

r J A T t -ф-

- 3 A T t y

~ Ж &

' W №

-ЗАТ С<>--ЗАТ П<> LЗАТ с<у

hi J 2 -ф- 3о

Рисунок I . Прямой метод фдуоресцируюпшх аетйтел для

выявления актигеновС по Лебедеву и Фуксу Т97

I* Детерминанты выявляемого антигена (АР).

2* Детерминанты антител (АТ) против выявляемого АР

3* Люминесцентная метка А*.

Т 'I—I

u

Vсо

f

U1

Ш Ш 1А А Л Л Л A A

<укХ )-'<Х и>ч>-

2ь>a*v

I 1 I I I----- 1-----)

+

U Li LLits.

. r i -r-n n Г jl

t/L

-JV

=

J^

Cli

vt-

14vL

~D

№

Рисунок 2 . Непрямой метод флуоресцирующих антител

для выявления антигенов./ по Лебедеву и Фуксу 1971/ .

I .Детерминанты выявляемого антигенэ/AIj/

2 . Детерминанты антител /ATj_ / против выявляемого антигена.

? . Детерминанты антител /АТ / против глобулинавида животного, на котором получены антитела

против АГ I •

А. Рлобулиновые детерминанты АТX •

5 .Люминесцентная метка антител,

а ,б - этапы окраски.

а /

+ ЩС

+ Ж

ZMTJT- 3 Alt- 3 All ~ЗАЦ- ] Alt- J A t t

l dai;c

В/

Al г З А р КЖ

ж >АТЯ< =Al _ ЗАХ ЭК ►> Д Т,<-^> ►> А 1 Х< -ф-

АТД<г> А l*<-£>-

А \ < ^

О* 3 ~7 5

Рисунок 3 . Непрямий метод флуоресцирующих антител

для выявления антигенов с использованием

комплемента. /По Лебедеву и фунсу/1971/,

1 . Детерминанты выявляемого антигена /АГ / .

2 . Детерминанты антител / АТ ./ претив выявляемого

антигена.

3 . Комплемент и его детерминанта.

4 . Глобуликевые детерминанты комплемента.

5 . Детерминанты антитела /АТ^/, полученного против

комплемента.6* Люминесцентная метка антител.

а ,б ,в - этапы окраски.

* /

-$■

+ 3A\L

1 AX j> - ] AT ЕФ-- Щ 0 -jAT^ " 3 AT, [ф -1 AT( &LW t®

] I h 2

■4~>ATa<

-& L -J

■ASM

> 3 ► ^

t

> АТд.<> 4T * < 4 -

►> ATj, <45-r > 4T* « 5 - *,> ЛУЯ< 4 - * > A T t < 4-

* * Л Т х

рисунок 4 . Непрямой метод флуоресцирующих

антител для выявления антигенов

в модификации Лебедева и соавторов

/по Лебедеву и Фуксу/.

I* Детерминанты антител /АТ / против выявляемого

антигена.

2 . Детерминанты выявляемого антигена /А Г^/.

3 . Детерминанты антител /АТ / против глобулина того вида животного на котором получены антитела

против АТ .Глооулиновые детерминанты антител /АТ / •

5 . Люминесцентная метка ан|Еител.

а , б - этапы окраски.

дой детерминанте антигена присоединяется одна молекула ант!

( р и с .1 ) . В результате по расчетам Лебедева и Фукса (1971),

молекула антигена оказывается связанной с 20-60 молекулами

хрома. Этого количества метки достаточно лишь для выявления

кой концентрации антигенов. Поэтому большинство исследовате

меняют более чувствительный непрямой метод в различных его

фикациях.

Непрямой метод впервые был описан Веллером и Кунсом ( м

с ons 1954). Они предложили обработать препарат намеченной]

ной сывороткой, содержащей антитела против выявляемого ант!

Образующийся при этом комплекс антиген-антитело выявляется

меченными антителами к У - глобулину сыворотки животных, от

была получена именная сыворотка против выявляемого антигена!

2 ) . В результате к одной молекуле антигена присоединяется i |

раз больше фдуорохрома, чем при прямом методе окраски Ш

Фукс, 1971).

Непрямое оррашивание дает возможность исследовать pa3J

антигены с помощью антисывороток, полученных от животных

вида, используя только одну меченую сыворотку. Кроме того 31

тод позволяет объективно сравнивать несколько антисыворс

следуемым антигенам ( Энгельгардт, I 968).

Еще более чувствительным является метод флуоресцентно!

иивания с использованием комплемента ( ooicwaeeer, sheparo

этот метод основан на том, что комплемент принимает участие

иодогическях реакциях, присоединяясь к комплексу антиген-анз

В качестве источника комплемента обычно используют сыворотк||

кой свинки. Реакция состоит в прибавлении (либо одновременно!

поэтапном (Лебедев,Фукс,1971) ) к препарату инактивированно!

антисыворотки против выявляемого антигена и комплеменз

- 3 -

ft

Сформировавшийся комплекс аитигем-вятвтедо-коипдемент выявляю*

флуоресцирующими антителами к комплементу морской свинки ( р и с А .

При этом к молекуле антигена присоединяется в 10-20 раз больше

молекул фдуорохрома, чем при прямом методе* Метод дает возможность

использовать одну и ту же флуоресцирующую сыворотку против компле­

мента морской свинки для работы с сыворотками любого происхождения*

Еще один вариант для непрямого метода для выявления антигенов

предложили Лебедев и соавторы (1 % 9 ). Они использовали две меченые

флуорохромом сыворотки: против выявляемого антигена и против У -

глобулина того вида животного, на котором были получены антитела

против выявляемого антигена (р и с Л ) . В этой реакции в одной моле­

куле антигена присоединяется в 20-40 раз больше молекул флуорохро­

ма. чем при прямом методе*

Как видно из изложенного, все варианты непрямого метода обла­

дают большей чувб^итедьностью по сравнению с прямым методом* Одна­

ко . при увеличении числа компонентов, участвующих в реакции, неиз­

бежно усиливается неспецифическое фоновое свечение, а также появля­

ется возможность взаимодействия меченой сыворотки с препаратом по

принципу прямого метода (Э нгельгардт.1968,Лебедев,Фукс,1971)*

Поэтому требуется высокая специфичность в высокая степень очистки

всех компонентов реакции*

2* Методы выявления антител.

Попытка выявить антитела прямым методом с помощью меченного !

флуорохромом антигена не удалась ( 'к* Beutaer 1961)* Это становит- j

ся понятным, если учесть, что антитела имеют всего две детерминан­

ты, к которым могут присоединиться меченые молекулы антигена, и,

по расчетам Лебедева и Фукса (1971), одна молекула антитела может

присоединить не более 10 молекул фдуорохрома, что недостаточно для

обнаружения данной метки.

] I h 2 . -$>■ 3

ЗИТС-Ф-- ] /I T !> ~]ATI> - i / m >

- э л т w -

-1 AT E- L ] AT Es

Рисунок 5 . Непрямой метод обнаружения антител.

/По Лебедеву и Фуксу/.

I . Детерминанты выявляемого антитела /А Т/.

2* Детерминанты антигена /АГД против которого

образовались выявляемые антитела.Р . Люминесцентная метка антител.

а ,б - этапы окраски

W W v W

-rH

l!j uii lIjlLi l! il! i ljIis> 23s>. !Гг~>r _£isri ^4 sr~i i ^ 4 -rH -rH

I— i n r —i Г П I— 1 П П

W

- H

i i i i i f

Рисунок 6 . Непрямой метод для обнаружения антител в модификация*

Ганиной и соавторов. /По Лебедеву и Фуксу 1971/. 1

I* Детерминанты выявляемого антитела /АТ^/.

2 . Детерминанты антигена /А1*1/, против которого образовались

выявляемые антитела»3 . ГЛобулияовые детерминанты выявляемых антител.

4 . Детерминанты антител /к Т ^ / против глобулинов того вида яи

на которых были получек^ АТ^.

5 . Люминесцентная метка антител,

а , б> в - этапы окраски.

I

A r> A r*

,-#■> A h < 2 ^ /# > atx< 7% > ATI ■£

-Ф- >ЛТг <\^ф->ATz<*

- & > A T ^ '

# |$ |$ н г4 % щ

и I h 2 ► з ~g- >5

Рисунок 7 , Одновременное выявление специфических антител и неспецифических глобулинов . /По Лебедеву и

Фуксу 1971/.1 . Детерминанты выявляемых антитал /АТ / .2 . Детерминанты антигена /АР / , против которого обра­

зовались АТ .I

В . Глобулиновые детерминанты АТ и неспецифических

глобулинов /НГ/*

4 . Люминесцентная метка антител. /Ф- флуоресцеин,

Р-роданин/

5 . Детерминанты антител АТ против глобулина изучаемого2

вида животных.

а , б , в -этапы окраски

- 5 -

Непрямое метод для обнаружения антител впервые применили

Кунс и соавторы ( Соо,Л e t a l *1955). В соответствии с этим мето­

дом* на препарат» где выявляется антитела» последовательно наносят

антиген и антитела данной специфичности* мечхенные фауорохромом

(р и с .5 ) . В дальнейшем (Лебещав»#укс,1971) была предложена модифика*

цня метода с добавочным наложением после антигена и антител против

У «глобулина того же животного* на котором получены антитела изуч!

емойспецифичноети (р и с .6 ) . Последний метод чувсвнтельиее метода

Кувса.

Для одновременной окраски антител н ■неспецмфнческвж* иммуно­

глобулинов была предложена следующая методика (Лебедев«Скрябин»

Р ан и т* 1968) . Препарат сначала окрашивали на специфические антите­

ла с использованием в качестве фдуорохрома родамина ( красное све­

чение). Далее препарат обрабатывали раствором антител» меченных

флуоресцемвом (зеленое свечение)» против иммуноглобулинов исследу­

емого вида животного (р и с .7 ) . При данной окраске антитела имеет

смешанное красно-зеленое свечение с преобладанием красного* а

"веслецвфяческвб” иммуноглобулины окрашивается в чисто зеленый

цвет.

3. ^н трш ш .й М йуррдоги дккой ^

Все описанные методы необходимо сопровождать серией контр®-

л ей . Только при отсутствии свечения в контрольных препаратах можно

считать специфическим свечение в опытных препаратах. Больоннетво

авторов ( с опв»КаР1ап» 1950, Михайлов, Дьяков* 1961, ********

1961* Лежнева, 1968, Энгельгардт *1968) считают необходимым поста­

новку следующих контролем:

I . Замена иммунной сыворотки к выявляемому антигену тр и ал ь­

ной или гетерологичной сывороткой.

2 , Окраска препаратов, заведомо не содержащих исследуемый

антиген,

3 , Нейтрализация иммунной сыворотка исследуемый антигеном с

последующим использованием згой сыворотки для окраски препарата,

4 , Подавление тканевого антигена нефяу оресцирующей иммунной

сывороткой (для прямого метода),

5 , Окраска только флуоресцирующей сывороткой ( для непрямого

метода ) •

6 , Последовательная обработка препарата соответствующей специ­

фической сывороткой, аефдуоресцнрующей антиглобулиновой гомологич­

ной сывороткой и флуоресцирующей антиглобулиновой сывороткой (для

непрямого метода),

7 , Реакция на присутствие антигена ( для методов обнаружения

антител)•

Кроме того некоторые авторы считают нужным исследовать нео­

крашенные препараты на аутофауоресценцаю ( 1 ; u s* i ixon Г93b),

Следует отметить, что на всех типах контрольных препаратов

выявляется небольшой процент клеток с типичным специфическим све­

чением, Причины этого свечения подробно разбираются Дежневой (1968)

Для оценки активности иммунной сыворотки было предложено использо­

вать индекс флуоресценции (Дежнева, 1968),

где и -количество весветящихся клеток в контроле Г, ^ -коли­

чество несветящихся клеток в опыте. Антисыворотки с индексом флу^

оресценции больше 0 ,2 считаются активными. Индекс флуоресценции

не является строго количественным показателем реакция, так как в

некоторых случаях при частичной нейтрализация антисыворотки ваблю-

дается резкое снижение интенсивности флуоресценции клеток без

существенного изменения индекса флуоресценции (Дежнева, 1 % з).

П. Примените метода [Ыигореснируваих автител в ищ уиодопм.

I . О бваряею ю чужеродных антигенов, дведевных в организм.

Метод флуоресцирующих антител был первоначально использован

для изучения судьбы различных чужеродных антигенов, введенных в

организм животных. Так было исследовано распределение полисахарид!

капсула пнемококков типа П, И и бациллы Фридлендера, введенных

в организм мыши. Полисахариды обнаруживали в течение длительного

времени ( 3 -6 месяцев ) в клетках ретикудо-эддотелиадьной систе­

мы и в фибробластах большинства исследованных органов, а также в

моноцитах И лимфоцитах крови ( Coons e t a l , 1942, Coons ,

K ap lan , Г950, H i l l e t a l , 1950, Coons, 1958), Белковые антигены

(яичный альбумин, альбумин бычьей сыворотки, У'-глобулин челове­

ка) после их введения в организм мыши быстро и в большом количе­

стве появлялись в клетках соединительной ткани, эндотелии сосудов

димфацитах селезенки и лимфатических у злея , эпителии почечных ка­

нальцев, купферовских клетках печени, В отличие от бактериальных

полисахаридов белки обнаруживались в организме мыши лишь в тече­

ние нескольких дней. Причем было показано, что скорость их исчез­

новения из клеток находится в обратной зависимости от их молеку­лярного веса ( coons et a i . 1951, Coons 1953). Аналогичные

результаты были получеа* и другими авторами ( S c h i l l e r e t s i e

1953,:убжицкий, 1964). Однако, Гауровитц (1969) наблюдал белковые

антигены в крови в течение 2-3 недель, а в тканях внутренних орга

нов - от нескольких месяцев до нескольких л ет .

При изучении судьбы яичного альбумина и бычьего ^-глобули­

на, введенных внутрикожно нормальным и сенсибилизированным кроли-

- 7 -

кая , антигены были найдены в области их введения между клетками, а 1

также в гистиоцитах и лимфоцитах регионарных лимфатических узлов.

У сенсибилизированных животных отмечалось замедленное исчезновение

антигенов как из кожи, так и из лимфатических узлов ( waksman ,

Вок±пе , 1953). Также было показаво, что иммунный кроличий глобу­

лин и агрегированный V-глобулин человека исчезают иг организма

мыши быстрее,чем нормальный ) -глобулин ( Зубжицкий, 1964).

флуоресцентного2. Применение иммуномог ичеокоро метода для изучения

образования антител в организме.

При изучении методом Кунса тканей кролика, многократно имму­

низированного человеческим Л -глобулином и куриным яичным альбу­

мином, было найдено, что антитела присутствуют в группах плазмати­

ческих клеток в красной пульпе селезенки, в мозговом веществе лим­

фатических узлов, в подслизистой тонкого кишечника и в перипортадь-

вой соединительвой ткани ( Coons e t »i ,1 9 5 5 ). Изредка антите­

ла в небольших количествах обнаруживались в клетках лимфоидных

фолликулов селезенки и лимфатических узлов. В лимфацитах активное»

никогда не наблюдалась.

Обнаружение синтеза антител в цитоплазме плазматических кле­

ток подтвердили также другие авторы. Так, скопление плазиоцитов,

содержащих антитела, отмечалось в очагах воспалеиия вокруг анти­

генов, введенных в переднюю камеру глаза кролика ( u t» « r ,1 9 5 5 ).

Кроме того , была обнаружена корреляция между числом плазмоцитов,

содержащих антитела, и количеством антител против яичного альбу­

мина, ПрОДуЦИруеМЫХ i n v i t r o раЗЛМЧНЫЫИ ТВаНЯМИ ( A skonas f

«b ite , 1 9 5 6 ).

Исследование внутриклеточной локализации антител показали их 1

- 8 -

наличие в тельцах Русселя ( white 9 1934) и в ядрышке ( ,

1939) плазматических клеток*

Косвенное доказательство синтеза антител плазматическими

клетками было получено в исследованиях по локализации У-глобули-ft

на^димфоидной ткани прямым методом Кунса ( orteea.MeHiore ♦

1937)* \ -глобулин обнаруживался в цитоплазме плазматических

клеток и некоторых клеток зародышевых цеатров лимфатических узлов

Таким образом• с помощью метода иммунофлуоресценции была

окончательно подтверждена гипотеза плазмоцитарвого происхождения

антител*

Исследование тканей после однократной и двухкратной иммуниза­

ции показало,что антитела могут синтезироваться не только в плаз-

моцитах, но и в их предшественниках * Было отмечено, что после пер­

вичного антигенного раздражения антитела обнаруживаются в больших

незрелых клетках мозговых оболочек лимфатических узлов* Вторичная

реакция была связана с развитием ( предположительно из незрелых

клеток) гнезд плазмоцнтов, содержащих антитела ( x*dae e t &i

1955).

Дальнейшие исследования диффереяцировки антителопродуцирующих

клеток яммунофдуоресцентньш методом показали, что после повторной

иммунизации морских свинок большими дозами дифтерийного анатокси­

на дифференцнровка антителообразующих клеток идет синхронно и

через определенные интервалы времени* Уменьшение количества вводимс

го антигена, рентгеновское облучение или добавочное повторное вве­

дение антигена нарушают время выхода клеток в дифференцировку*

Введение иммунизированным животным антител снижает число образую­

щихся клеток, но не изменяет времени начала их дяфференцировки

(Лебедев,Скрябин,Ганина,1971). В культуре лимфоидной ткани вабдю-

далось удлинение времени жизни популяции антителообразующих клето!

- 9 -

10

что* по мнению авторов* связано с более длительный поддержание**

пула юных, актив^влшцихся Форм в условиях культивирования ( Ле­

бедев ,Ванько,1% 9 ) .

32, Исследование мембранных антигенов клеток

июунной системы,

В последнее время метод мммунофдуоресценции стад широко при­

меняться для изучения поверхностных рецепторов клеток, В основном*

эти исследования касаются клеток иммунной системы.

3 большом количестве работ показано*что В-димфоциты содержат

на своей поверхности детерминанты к х** * а также к *еи % фраг­

ментам иммуноглобулинов* в то время как Т-димфоциты не содержат

на поверхности этих детерминант ( Вжгпвр *1974* МсСо 11061 **19% . И«Сопм1 # Lmchm** ,1 9 7 6 ),

Однако, Хаммеринг и соавторы ( s«m «rine e t a i Х97б) описали

Т-лимфоциты, реагирующие с сыворотками против *** в непрямом

иммунофлуоресцентвом методе. Адсорбция сывороток тимоцитами н

Т-клетками опухолей полностью снимала их активность к t -клеткам

* но сохраняла способность окрашивать В-клетки, Адсорбция В-кдет-

ками удаляла активность и к t - и к В- клеткам. Авторы предполага­

ют* что t -клетки несут ва своей поверхности иммуногдобудиноподобвде

молекулы, которым присущи некоторые антигенные детерминанты

в-клетон.

da поверхности T-лимфоцитов мышей обнаруживается так называ­

емый 6-антиген { антиген общий для мозга и тимуса i Reif *

Allen , 1964), Этот антиген был выявлен также на поверхности

эпителиальных клеток и фибробластов мыши* а также в клетках раз­

личных тканей крыс ( ВалЬтлл , Turk , 1976).

II *

Большая часть В-клехок не имеет на своей поверхности $ -ан­

тигена. Однако, было обнаружено, что суммарное количество клеток

с иммунноглобулиновыми рецепторами и клеток с £ -антигеном превы­

шает 100% ( Lcor.Kindrod ,1973, Tiixk а- Тч73) - йммунофдуо*ресцентные исследования с использованием двойной метки показали,

что около 10% клеток лимфатических узлов содержали, как иммуногло­

булиновые детерминанты, так и 9 -антиген ( Loor,Kindred, ,1973,

Santana , Turk, ,1 9 7 6 ). РоЙЛвНТС И соавторы ( Boelante e t a l#i 975)

описали 5 типов лимфоцитов в зависимости от соотношения 9 - и

иммуноглобулиновых антигенов на их поверхности.

Также, с помощью метода флуоресцирующих антител было проведе­

но исследование распределения ig s в коже человека (лпап , 1976).

Клетки,содержащие ig£ , находились я поверхностных и средних(■(Ч

слоях дермы и после окраски толуидинов^синим были идентифицированы

как мастоциты.

Ш. Применение метода Флуоресцирующих антител в гистологии.

I . Изучение распределения собственных белковых антигенов

в организме животных

Впервые метод флуоресцирующих антител для установления лока­

лизации собственных антигенов организма использовал Марвелл

( Marshall *1951). Он изучал реакции сыворотки против адренокорти

котропного гормона свиньи в гипофизе нескольких видов животных.

Флуоресценция была обнаружена в цитоплазме - клеток передней дс

ли гипофиза свиньи и отсутствовала в клетках гипофиза овцы и ворс

вы. Однако, оказалось, что антисыворотки против гонадотропного гс

мона перекрестно реагирует с антисывороткой против адренокортико-

12 -

ipofiHOPG рораоиа ( Crttlokshank> Carrla 1958). Hoatoiij изучение

локализации этих гормонов требует специфических контролей.

Недавне было проведено исследование по локализации нескольких

гормонов гипофиза у лисиц ( Bugaon e t a i . ,Т974в). Непрямой имму-

нофлуоресцентный метод использовали в сочетании с электронно-микро­

скопическими исследованиями. Было установлено, что антилролактино-

вая сыворотка выявляет в гипофизе лисицы клетки с в р ш р Ш ^ильноЙ

зернистостью, которой на электронно-микроскопическом уровне соот­

ветствует секреторные гранулы размерами 200-300 нмя. (При лактации

эти клетки дегранулированы, аппарат Гольджи и структуры эндоплазма­

тического ретикулума гипертрофированы). Сыворотка против гонадотроп

ного гормона выявляла клетки с крупными зернами, окрашивающимися

альциановым синим. Под электронным микроскопом этим зернам соотве­

тствует слившиеся между собой скопления гранул 200-300 кмк, раз­

деленные структурами гранулярного и агранулярного эндоплазматичес­

кого ретикулума. Антикортикоеропная сыворотка взаиммшодействовада

с несколькими типами клетжок, расположенными в промежуточной или

в передней доле гипофиза. ^ i

в другом исследовании эти авторы ( Bugnon et &i. I » )

методом флуоресцирующих антител изучали иаменемие количества про­

дан тиковых и гонадотропных клеток гипофиза самцов лисицы в течение

годового полового цикла. Было показано, чхо в период регрессии

семенников происходит значительное развитие пролактиновых клеток,

одновременно с инволюцией гонадотропных. После возобновления

сперматогенеза пролактиновые клетки заметно регрессируют, в то

время как активность гонадотропных клеток увеличивается. Эти изме­

нения, по мнению авторов, свидетельствуют об участии пролактина в

эндокринной регуляции годичного цикла семенников у лисиц.

При изучении реакций антисывороток к препаратам бычьего и

- 13 -

свиного инсулина пряным тмувофлуореецентным методой свечение

было локализовано в островковых клетках бычьей, кошачьей и выши­

ной поджелудочной железы. Островковые клетки морской свинки, кро

лика и человека не давали положительной реакции ( ,

1957). Адсорбции меченых антител свиным инсулином устраняла све­

чение.

Химотридсиноген и прокарбоксилептидаза были выявлены в гра-, M arshall,

нудах знмогена поджелудочной железы быка ( , 1954}*

Метод флуоресцирующих антител использовался также для выявле­

ния протеина НС (гдикопротеина, формирующего комплексы е гетеро­

генным зарядом) на поверхности человеческих лимфоцитов ( TeJler

e t a i ш 1976). этот глмкопротеим присутствует в плазме крови чело-

века,моче, спиномозговой жидкости. Флуоресценция была выявлена

на мембранах 73-86% клеток очищенной популяции лимфоцитов перифе­

рической крови человека. Удаление гдикопротеина с поверхности

клеток путем триосинизации в появление его при дальнейшем кудьт<<1ч

ровании клеток свидетельствует, по мнению авторов, о синтезе НС

протеина лимфоцитами.

2 . Исследование антигенной структуры,тканей

в зро с л о го организма.

Большое количество подобных исследований посвящено изучения?

антигенной структуры тканей^^Аверкина, 1973).

Специфические антигены почки были локализованы в щеточной

каемке проксимальных извитых канальцев ( * ,1962,она da f x% 3 , under t i% 9 , Аверкина, 1972). Сказалось, что

эти антигены имеют сходство у различных видов млекопитающих, а

14

также птиц. Ткани почки амфибий и рептилий ее реагировали с анти­

сывороткой к специфическим почечный антигена» человека и хомяка

( N airn,(Шэе | 1962}.

В цитоплазме клеток почечных канальцев ( проксимальных» изви*

тых и петли Гешхе ) методом флуоресцирующих антител был выявлен

также антиген идентичный антигенам некоторых других органов Спечо

ни» семенника, слизистой тонкого кишечника, эпидермиса (okada »

1968, Linder »1969 ,Аверкина,1972)•

Еще один межорганный антиген был выявлен в эпителиальных

клетках клубочков почки* Этот антиген выявлялся сывороткой против

синовиальной ободочки. Адсорбция противокдубочковой сыворотки

тканью легкого удаляла свечение эпителиальных клеток. Адсорбция

той же сыворотки селезенкой не влияла на свечение эпителия клубов

КОВ ( Linder ,1 9 6 9 ).

С помощью иимуннофдуоресцентного метода исследовались также

антигены соединительной ткани почки и других органов. Так, при из:

чении антигенов базальной мембраны почкн было показано, что они

могут быть выявлены как с помощью меченых сывороток к корковому

веществу почки, так и о помощью антиколлагеновых сывороток. Однакс

адсорбция каждой из сывороток г«тарологичным антигеном не подавдя-

ла свечения. Кроме того , обработка препаратов почки колдагеназой

предотвращала флуоресценцию базальных мембран после обработки их

мечеными сыворотками к коллагену и не влияла на флуоресценцию,

вызванную антителами сыворотки против коркового вещества почки( Roth bard # Watson eI % I eI% 9 ) . АнТЙТвДа СЫВОрОТКИ К КОрКОВОМу

веществу почки, взаимодействующие с базальной мембраной, вызывали

вефротоксический нефрит прн введении их животным. Антиколлагенова|

сыворотка такой активностью не обладала ( Rot^bard # wnteon #Х961,Т

15—

1969). Антигены базальной мембраны почке, ответственные за феном<

кефротоксичеекого нефрита обнаружили также другие авторы ( 8111 , CraickeL.tt.ok #IS5Sf Mairn , Gbos #I% 2)*

Помимо этик двух антигенов, в базальной мембране почки был

найден антиген сходный с ретикулином ( K ili , Gl‘ulckafaank ,1953),

который обнаруживался в эндотелии капилляров почки и других орга­

нов ( Gruicksb&ak ь H ill % 1953, S«o tt , 1957, e t a l ,1962

U n d er , х % 9 ). Бее изученные антигены базальной мембраны почка

обнаруживались и в других органах ( селезенке, печени, сердце,лег КОМ И д р . ( 8111 , Crutckehank #I 953,Ofcada t I% 3 f Bethbard f I 962

При исследовании методом Кунса распределения форсмавовского

антигена с помощью сывороток против почечной ткани лооади реакцииj

наблюдалась в эндотелии и в соединительной ткани сосудов морских

свинок,кошек, собак, мышей и цыплят. В тканях свиней, быков, кроли­

ков, крыс, гусей , голубей и лягушек Форсмановский антиген отсутстьо

вал ( Таааса , Lcfi113 ,1 9 5 6 ).

Изучение соединительной ткани сердца проводилось Даниловой и

сотрудниками. Методом иммунофлуоресценции было показано,что клетки j

соединительной ткани сердца и других органов быка реагируют с сыво­

роткой людей больных ревматизмом ( Данилова, Федорова,1974). Исполь­

зование соединительной ткана в качестве иммуносорбента, позволило

выделить из сыворотки людей больных ревматизмом антитела к ней.

Оказалось, что антитела выделенные на перикарде быка интенсивно

реагировали с элементами интерстициальной соединительной ткани

сердца, скелетных мышц, почки быка, соединительнотканной стромой

тимуса и лимфоузлов, а также купферовскими клетками печени. В то II

же время в соединительной ткани клапанов сердца быка свечение отс.уг

ствовало (Данилова,Федорова, 1976). Использование в качестве ииму-

16

носорбента тканей клапанов сердца человека* позволило наделить анти

тела* реагирующие с фибробластами плотвой и рыхлой соединительной

ткани клапанов сердца человека и быка* но не с фибробластами интер-;

стадиальной соединительной ткани сердца, выделенные антитела, кроме

фибробластов клапанов, взаимодействовали о фибробластами соединитель

ной ткани сустава* оотеоцитами и ховдроцитами ( Данилова и др .

1977).

При исследовании тканей глава мышей с помощью сыворотки в бед

кам хрусталика мыши меченной бензальдегид - 6 - нитро - 2 - натрий

диазотатом ( красная флуоресценция)* и сыворотки против мышечной

ткани мыши* меченной изоционат - 4 - флуоресценном (зеленая флуорес*

ценция) наблюдалась следующая картина: хрусталик был ярко-красного

цвета* ресничный отросток* ретина и эпителий роговида - бледно

розового* мышцы глаза - зеленого, а сосудистая оболочка - бледно

зеленого цвета (Clayton ,1 9 5 4 ).

Довольно большое количество мехорганных антигенов найдено в

тимусе. Так» антитела в дискам мышечных волоков миокарде и скддет-

ных мышц» выделенные из сывороток больных ревматизмом, специфически

реагировали с цитоплазмой крупных эпителиальных клеток, расположен*

ных в медулярвом слое дольки тимуса ( так называемые , миоидные

клетки) (Белецкая и д р .,1 9 7 2 ) . Причем свечение цитоплазмы"зрелых"

форм миоидных клеток имело характер поперечной исчерченности,

сходной с исчерчеиностью миофибрилл мышечных волокон (Ь'елецквн,

Гкездмцкая, Iу ? 4 а ,I977).

Антигены, сходные с антигенами межклеточной субстанции и бле­

стящего слоя эпидермиса кожи, были выявлены в тельцах Гассаля

( Белецкая,Гнездицкая,1974а,б, 1‘неэдяцкая*Белецкая*19746). Антитела

к клеткам базального и шиповатого слоев взаимодействовали с пери­

ферическими ( молодыми) элементами тимических телец (Белецкая,Гнез-

дицкая, 1974а). Кроме того» в тимусе выявлен органосяецифаческий

антиген» локалжзованнйй в цитоплазме части клеток» расположенных

по периферии долек оргааа» и внеклеточно, по всей внутренней поверх

вости капсулы долек ( Гнездицкая.Белецкая, I974а).

Б печена с помощью метода флуоресцирующих антител удалось ло­

кализовать два оргавоспецифических антигена ( Энгельгардт,1964).

Первый из них находился в ядре и цитоплазме» а второй-только в

цитоплазматических гранулах клеток паренхимы печени*

Использование сыворотки к экстрактам сетчатка глаза человека

позволило выявить органоспецифический антиген сетчатки в области

внутренних члеников кодбочновых фоторецепторных клеток (Кулагин

н др .,1974 )*

Интересное исследование проведено Иевлевой и соавторами (1974]

Они обнаружили у мышей с вирусной лейкемией Раувера антиген» присут

ствующий в сыворотке и селезенке нормальных мышей разных линий*

Этот антиген закономерно выявлялся на поверхности эритробластов

и отсутствовал в эритроцитах» клетках миелоидного ряда и лимфоци­

тах тимуса и селезенки*

- 17 -

з . з йм м уаоФдуоресцентвис исследования становления

у щ ц г е а т , & m n m . , m s s Lразвития*

Впервые исследование эмбриональных антягемов методом фвуорж

цируюцих антител были проведены Клейтон ( e u *toB ,1954)* Она

установила» что на раяяях стадиях развитая мыямйых зародышей

ищуиная выворотка против хрусталика взрослой мыши дает слабую

реакцию с мозгом и несколько сильнее с глазной чашей и хрусталике-

- 16 -

вым пузырьком. Наиболее интенсивное свечение наблюдалось вокруг

полости хрусталикового пузырька. Однако, в дальнейших исследовани­

ях , проведенных на зародышах курицы, специфические антигены хруста­

лика выявлялись только в хрусталиковом пузыре, но не в других ткавDaoreoaalen _ _ . ч

НЯХ ( ,1 9 6 6 ).

Применение противохрусталияовой сыворотки узкой специфичности

позволило провести иммунофдуоресцентвые исследования сроков появле-

няя и локализации отдельных антигенов хрусталика кур ( ,

Ikeda ,1% в) ( -p e e s # . Альфа-крисаллшш появляются у куриных заро­

дышей на третьи сутки инкубация в первичных хрусталиковых волокнах,

Позднее эти белки начинают синтезировался также в эпителии хру­

сталика, и к концу зародышевого развития овн выявляются почтя ис­

ключительно в этой зоне хрусталика. Бета-кристалдины появляются в

период формирования хрусталикового пузырька у 56- часовых зароды­

шей. В ходе дальнейшего развития интенсивная реакция с сыворотками

против бета-кристаллиняя наблюдается в дентальной части хрусталика.;

Однако, к концу зародышевого развития их локализация оказывается

сходной с альфа-кристаллинами.

Делма-крнсталдины появляются в базальных клетках инвагинирую-

щей хрусталиковой плакоды зародышей 50- часов инкубации. В дальней*

шем они концентрируется в центральной части хрусталика*

Исследования гамма-кристалдинов хрусталика лягушки показала,

что эти белки появляются в период формирования первичных хруста-. KcStTltt

диковых волокон и локализуются в зоне ядра хрусталика (

e t S l .1969 ).

Интересно,что Формирование антигенного спектра в ходе реген е-ij

рации хрусталика из радужины тритона ( Вольфовская регенерация) 1

и в процессе нормального развития идет сходным образом (Барабанов,

1973) .

- 19 -

Довольно хорошо изучено формирование антигенной структуры

почки* Антигены соединительной ткани обнаруживаются в зачатке мезо­

нефроса у трехдневных куриных зародышей вокруг скопления клеток

нефрогенной мезенхимы (okada ,1965), и вокруг почечных пузырьков и |

всего зачатка у пятинедельных зародышей человека ( Linder ,1969).

Форсмановский антиген найден в мезонефросе четырехдневных ;

зародышей кур на поверхности эпителиальных клеток главного протока i

и его собирательных трубочек ( ssuiaan ,1975).

Появление антигенов эндотелия и эпителия клубочков совпадает |

Образованием примитивного сосудистого клубочка на 6 неделе развил ;

тин зародыша человека (L inder ,1969 ).

Межорганный антиген цитоплазмы клеток проксимальных почечных

канальцев начинает обнаруживаться на стадии образования в -образ­

ного канальца ( 8 недель развития ) ( Linder ,1968 ). Позже всех

появляется специфический почечный антиген. Он выявляется в щеточ­

ной каемке клеток проксимальных извитых канальцев у 12-недельного |

эмбриона человека ( Аверкина,1972), I

Кроме того у зародыша человека 2,5-12см длины было описано J 2 стадио-специфических антигена. Один из них локализуется в недиф- 1

ференцироваяяой нефрогенной мезенхиме и не является почечноспеци­

фическим, так как адсорбируется сывороткой крови плода. Второй, 1

ПО-ВИДИМОМУ, С п ец и ф и ч ен ДЛЯ ПОЧКИ ( L in d e r , i э ь э )щ |

G помощью метода флуоресцирующих антител подробно изучено а

распространение эмбрионального сывороточного бедка Х-фетопротеи- ||

на в организме крысы. Этот белок содержится в эктодерме и мезев- Jхиме желточного мешка, а также в цитоплазме части эритробластов 1

12-дневного зародыша крысы.

В самом эмбрионе ' -фетслротеин был выявдеи б клетках мезенхимы,

б эндотелии кровеносных сосудов, клетках периферической крови и

зачатке печени (Шилова* Гусев, 1976)* В 13-дневном зародыше интене

сивно флуоресцирует клетки крови эритроидного ряда и эндотелий cocj

дов* Начиная с этой стадии развития, в печени выявляется два типа

гепатоцитов: содержащих л -фетопротеин и не содержащих его* Причем;1,

большая часть гепатоцитов, в цитоплазме которых выявляется -фето-

протеин, локализуется вокруг крупных кровеносных сосудов. В даль­

нейшем количество содержащих ■ -фетолротеин гепатоцитов увеличивав? |'! I

ся и достигает максимума к 19-20 суткам развития* Однако, даже на |

этой стадии часть гепатоцитов не содержит * -фетопротеина (Шилова, |

Гусев, 1976)* После рождения количество -фетопротеннаоложитель- j,

ных гепатоцитов уменьшается и к 17 дню достигает 1,5%. При этом ‘j

наиболее ярко светятся клетки, расположенные у центральных вен* i■!

У взрослых крыс < -фетопротеин не обнаруживается (Шипова«Гусев,

1976, ЯеУ®* ®t a l *X974).

Аналогичные результаты были получены при исследовании печени |

зародышей человека и новорожденных мышей ( Энгельгардт и др .,1969 , Engel gar d t e t a l ,1971, ШйЛОВа ИДр.,197^)* S

В опытах с регенерацией печени после отравления с С1 было ’

показано, что в печени взрослых мышей сохраняются клетки, способ­

ные в определенных условиях к синтезу -фетопротеина (Гдейбермав

1976*Ннгельгардт и д р .,1 9 7 7 ) . |

Имиунофлуоресцентный метод использовался также для изучения J синтеза белкового компонента тиреоглобудина в щитовидных железах J

зародышей крыс, морских свинок, кур и крупного рогатого скота

(Григорьева, 1973,1974). На предфолдикулярной стадии дифференциров» \

ки щитовидной железы наблюдалось диффузное свечение цитоплазмы

эпителиальных клеток* По мнению автора, это свечение дают низко­

- 20 -

21

молекулярны е предш ественники хи рео гд обули н а . На с та д и и об р азо ва ­

ния ф олликулов тиреоглобулинж вы является на апикальны х полюсах

кл е то к* На более поздних с т а д и я х , к о гд а щ итовидная ж елеза уже

имеет ф олликулярное с тр о е н и е , специф ическое свечение обнаруж ивает­

ся на гр анице клетж ка -кил лоид и в коллоидных п ол остях*

4 . Применение м етода Флуоресцирующих ан ти тел для исследования

г и с т о г е н е з а тканей животных в п о стна тад ьн ом о н то ге н е зе ,

Иммунофлуоресцентный метод сравнои тельно редко и сп о л ьзуе тся

в ги с т о ге н е ти ч е с к и х и сследованиях и з - з а р яда те хн и ч е ски х тр у д н о -1

с т е й . Яреаде в с е го э ти тр уд н о сти связаны с получением специф ичес-)иям '

ки х сы воро ток Ж кл е тм с определенной линии диф ф еренцировки. Кроме

т о г о , по наличию или о тсутсви ю а н ти ге н н о го с х о д с т в а различных

клеточны х типов очень трудно д е л а ть выводы о степ ен и их р о д ст в а ,

п о с к о л ь к у , в о -п е р в ы х , в проц ессе дифференцировки может происходить

изменение ан ти ген н ой с тр ук тур ы кл е то к и , в о -в то р ы х , кл е тки р а з ­

личных линей дифференцировки м о гут иметь сходные ан ти ген ы . Однако,

в некоторы х сл уч ая х можно в к а к о й -т о степени с уд и т ь о происхожде­

нии т е х или иных тканевы х эл е м е н то в . Т а к , Хамфрей ( Humphrey # J

Т955) и сп о л ьзуя меченные а н ти тел а к тромбоцитам морской сви н ки , !

продем онстрировал их м е гакариоц и таряое происхож дение .

С д р у го й стороны , метод К ун са может быть и спользован для

обнаруж ения ан ти генны х различий морф ологически сходных типов кле ­

т о к . Примером тому может служ ить описанное .Даниловой и соавторами

(Д анилова , Ф едорова , 1976 , Д анилова и д р * , 1977) различия в

ан ти генном со с т а в е ф ибробластов клапанов и интерстициальной си е д и - IIнитедьной ткани сердца ( с м . вы ш е).

Наибольший у сп е х в и зучении ги с т о ге н е з а методом ф луоресциру­

ющих ан ти тел был д о с т и г н у т при е го и спользовании совм естно с

методой радиационны х алло* иди ксеногенны х мышиных химер иди мето­

дом ге теро троп п ы х т р а н сп л а н та то в . й этом сл уч ае д о с та то ч н о иметь

видоспециф ическую или линейноспециф ическую сы во р о тку , реагирующую

со всем и клеткам и д о н о р а .

С помощью подобных и сследований и зучали в основном ги с то ге н е ­

зы кроветворной и соединительной т к а н е й . Т а к , было п о к а за н о , что

лимфоциты иммунизированных ж ивотны х, помещенные в иммунологически

инертные реципиенты , трансф ормирую тся в п ла зм ати че ски е клетки

( D ixon, e t a l . , 1957, H ell, Dixon, 1959).

Васильевой с соавторам и {1 9 7 7 ,б ) подробно и зуч ен а к и н е т ю а

репопуляции кроветворны х и лимфоидных ор ган ов л е тал ьн о облученных

мышей по сле введения им к л е то к к о с тн о го м о з га крысы . Клетки доноре -!

кой природы раньше в с е го вы являлись в се л е зе н ке и в ко стном м о з ге .

Позднее они п оявляли сь в лимф атических у зл а х и лишь через месаи

после тран сп лан тац и и - в т и м у с е . При этом больш инство крысиных

к л е т о к , репопулирующих лимф атические узлы и т и м у с , имели морфологию

больших лимф оцитов . ;*алые лимфоциты во в се х и с с л е д о в а н и и ор ганах

о т с у т с т в о в а л и . При и сследовании печени было у с т а н о в л е н о , что к у п - i

Ф еровские к л е т к и , а также кл е тки экстрамедуллярны х о ч а го в кроветво ­

рения имеют донорскую (к о стн о м о згов ую ) природу .

И сследование происхож дения макроф агов различны х о р га н о в , про­

веденное на к сено генны х радиохимерах с помощью м етода К у н са , пока­

зало , что их предш ественники локали зую тся в костном м озге я ее

обнаруж иваю тся среди лимфоцитов гр уд н о го протока ( в * п , яь«п4,

1 9 7 1 ,1 9 7 2 ) . В опы тах по выделению макроф агов из суспен зии клеток

к о с тн о го м о з га было обнаруж ено , ч то их предш ественники не обладают i

двум я основными свой ствам и м акроф агов: сп о со б н о сть» к ф агоцитозу

И способностью К а д ге зи и ( shand, B e l l , Г9 7 2 ) .

Дальнейшие иммунофдуоресцентные и сследования происхождения

клеток соединительной ткани показали, что предшественники макрофа­

гов подкожной соединительной ткани и очага асептического воспале­

ния также находятся в костной иозге ( Васильева и д р . , 1977а,

Васильева,1976). Кроме того было продемонстрировано костномозговое

происхождение фибробластов нормальной подкожной соединительной тка­

ни и очага асептического воспаления, а также гигантских клеток

инородных тел (Васильева,1976,1977, Васильева и д р .,1 9 7 7 а ).

Учитывая исследования, проведенные с помощью других методов

( Хрущов,197б), можно полагать, что предшественники микрофагов,

а также фибробластов нормальной подкожной соединительной ткани

идентичны стволовым кроветворным клеткам.

С другой стороны, из опытов Поликарповой и сотрудников (1977)

с культурой костного мозга ксеногенных и Иванова-Смоленского с

соавторами (1976) с культурой костного мозга аллогенных мышиных

радиохиыер следует, что, по-видимому, предшественники фибробласто­

подобных клеток, образующих колонии в культуре костного мозга,

отличны от стволовой кроветворной клетки.

- 23 -

- ш4

Ш ’м'ИАлЫ К М ЛиДН

а у л ы и в и о о в зн и е к л е то к к о с тн о го м о з га .

У крыс ^инии Вистар выделяли бедренный и большие берцовые

к о с т и , обрезали эпифизы и вымывш и кл е тки к о с тн и го м о з г а . Культи­

вирование проводили на предметных с те к л а х и в 5 -литровы х матрасах

в лидкой кул ьтура л ьн ой среде (с р е д а И гла - 8 0 3 , сы воротка крупного

р о га т о го с к о т а - 2 0 ? , ан тибиоти ки - 50 е д . / м л ) , при начальной плот

н о сти 4 -6 ьин к л е то к в мл*

П остан овка ц и то то к си ч е ско й реакции .

Ц и то ток си че ская реакции приводилась на к л е тк а х 21 -дневной

мопослойной культуры к о с тн о го м и зга кры сы . С текла с клеткам и куль ­

туры п ослед ова тел ьн о инкубировали 30 мип . с кроличьей сывороткой

против к л е то к к о с тн о го м о зга крысы и 60 м ин . при И7 °С с комплемев-

том (сы в о р о тка морской сви н ки ) (м е то ди ку получения иммунной сыво­

р о тки с м . В асильева 1 9 7 6 ) . Затем препараты окрашивали 1% р а с т в о -,Tq г* *1

ром н и гро зи н а на 0,85% р а ств о р е в течение 20 м ин , и заключали

в забуференный глицерин ( р Н " 7 ,2 ) . Для окраш ивания контрольных пре­

паратов вм есто иммунной сы воротки и спользовали нормальную кроличьи

сы в о р о т к у . На опытных и контрольны х препаратах подсчитывали со о т ­

ношение окрашенных и неокрашенных к л е т о к . Для количественной оцен­

ки ц и то то к си ч е ско й * реакции и сп о льзовал ся ц и то токсический индекс

( с м . Ьр сндз 1% 4) равный гд е в - коли чество неокрашенных

кл е то к в к о н тр о л е , а - кол и ч ество неокрашенных клеток в опы те.

При ц и то ток си ч еско м индексе больше и , 15 реакция с ч и та л а сь положи­

т е л ь н о й .

- 25 -

Обличение к р ы с ,

для обличения и спользовали сан ок крыс линии В и с та р . Обличе­

ние проводили на у с т а н о в к е РУМ -13 в следующем режиме: напряжение <

180 в* си л а т о к а - 15 ма, д о з а облучения - 1000 р , время о б л уч е -А1 Си

ния - ТО мин* При обличении и сп о л ьзо в ал и сь фильтры - 1 , и и —0,5"

Иммунизация к р о л и к о в .

Для иммунизации брали кроликов весом около д в у х к г , в кач е ст ­

ве а н т и ге н а и сп о льзовали суспензию к л е то к к о с тн о го м о з га облучен­

ных крыс на 4 д ен ь после облучения или го м о ген а т кл е то к 30-дневной

к ул ьтуры к о с т н о го м о з га кры с . Общий объем т к а н и , вводимой кролику

с о с т а в л я л 0 , 6 м л . Животных иммунизировали по следующей схем е :

вводили 0 ,4 мд см е си с у сп ен зи и к л е то к и р авн о го объема полного

адъю ванта Фрейнда в подколенные лимфоузлы и 0 ,6 мл сусп ен зи и -

внутримыш ечно. Через 30 дней проводили повторную иммунизацию жи­

вотны х (внутримыш ечно) ( и з - з а т е хн и ч е ск и х тр уд н о стей реиммуниза­

цию к р о л и к а , имм унизированного го м о ген атом к л е то к культуры ко стн о го

м о з га , проводили клеткам и обл ученно го к о с тн о го м озга кры сы ). Сыво­

ротку получали на 8 -1 0 д ень после реим м унизации . У к р о л и ка , имму­

ни зированно го клеткам и культуры к о с тн о го м о з га , сы воротку брали

такж е на 28 д ень после первой им м унизации . Сыворотки проверяли с

помощью реакции преципитации в а га р е по методу Охтерлони в м икро -

модификации Гусева ( Г у с е в , Ц ветков 1 9 6 1 ) , и с помощью метода Кунса ,i

на с р е з а х регенерирую щ его к о с тн и го мозга крысы и тран сп лан та то в j

кры синого к о с тн о го м о з га под к ап сул у пищки мыши, приготовленны х

Т .В .В а с и л ь е в о й и Т .В .М и ч ур и н о й , а также на к л е тк а х культуры к о с тн о й

м о з га и и с к у с с т в е н н о го монослоя к о с тн о го м озга кры с .

Непрямой метод К у к с а .

На фиксированный Ш > формалином препарат н ан о си лась иммунная

- 26 -

сы воротка на 3 0 -4 0 м ин . Сы воротка отм ы валась в тре х сменах среды

199 по одной минуте е к а а д о й . Затем препарат инкубировался в тече ­

ние 30 мин. с ослиной сы вороткой против ^ -глобул ина кро л и ка , мечен­

ной и.чотиоцианатом ф луоресцеина , заклю чался в забуференный глице­

рин (p rtF 7 ,2 ) и р ассм атривало» под люминесцентным м икроскопом . Для

идентификации наблюдаемых кл е то к и сп о л ьзовал ся метод Ф азового кон­

т р а с т а . Все реактивы были охлаждены до 4 ° С . Меченная сы воротка

была получена в И н сти ту те Эпидемиологии и М икробиологии имени

Н .Ф .Ганадеи АМН СССР . Перед и спользованием ее истощали печеночным к порошком мыши, д обавляя к I мл ан ти сы воротки ТОО м г порош ка.

И зучение культуры к л е то к о ч а га а с е п ти ч е ск о го воспаления.

Крысам линии Вистар под кожу спины стерильно вводились с т е к ­

лянные п л а с ти н к и . Через 6 дней пластинки с наросшими на них кл е т ­

ками п ереносились в жидкую культуральную среду Сс р е д а 199 - 80%,

сы воротка кр уп н о го р о га т о го с к о т а - 20%, ан тибиотики - 50 е д . / м л ) .

Фиксация прои зводилась с р а зу же по сле эксплан тац ии и на 3 , 5 , 8 ,

14 , 16 с у т к и к ул ь ти в и р о в а н и я . Препараты и зуч ал и сь непрямым мето­

дом Кунса с и спользованием сы воротки против к о с тн о го м о зга кры с.

Pti-'JUMATH И ifiA uBCyiUbaiiL

- 27 -

Исследование клеток культуры кист ни г и мозга,

Ва 21 день риста в культуре костного мозга крысы присут­

ствуют два тика клеток. Клетки первого типа идентифицируются как

макрофаги и представляют собой округлые, полигональные или верете­

новидные элементы, ь цитоплазме этил клеток выявляются многочис­

ленные гранулы и вакуоли. Макрофаги, как правило, располагаются

изолированно• второй тип клеток составляют так называемые фибро­

бластоподобные клетки - выткнутые или распластанные элементы с

крупным овальным ядром, содержащим несколько ядрышек, и светлой

отросчатой цитоплазмой, Эти клетки склонны к образованию колоний,

хотя встречаются и изолированные фиброблаетоподобкые клетки.

Сыворотка против костного мозга крысы оказывает цитотокси­

ческое действие на подавляющее большинство макрофагов, в то время

как практически все фиброблаетоподобкые клетки остаются живыми

(см , табл, I ) , Это говорит о том, что фиброблаетоподобкые клетки

культуры костного мозга и макрофаги имеют различную антигенную

структуру.

Таблица I . результаты цитотоксической реакции.

Типклеток

------ i

Количество живых клеток : Цитотоксический (в % от общего числа клеток: индекс

1Ш 1 -----------------------1 *=*контроль : вт щ ш .

__ill + шп г -S-Макрофаги

Фибробластолодиб- ные клетки• •JJL

11,46*2,97 : 77,28*113,0:: :• *

9 1 ,3 8 * 5 ,7 2 : 9 1 ,3 0 * 5 ,0 0 :--------------------- 1_____________L

0,85

О:#

1Таким образом, результаты цитотоксической реакции подтверждают

данные П одикарпивой и со а в то р о в ( 1 9 7 7 ) , подученные с помощью в е т о -

д а К у н с а . Сходные р е зул ь та ты получены в ва д р у ги х о б ъ е к т а х . Т а к ,

было п о ка за н о ан ти ген н о е различие макроф агов и Фибробластоподобных

к л е то к к ул ьтуры к о с т н о го м о з га к сено генны х (П оликарпова и д р . 1977)

н аллогенны х (И ванон-Сы иленский и д р .1 9 7 о ) радиационных мышиных

х и м е р . По мнение риденш тейна (Ч е р т к о в , Фриденштейн 1 9 7 7 ) , фибро-

бластоподобны е кл е тки культуры к о с т н о го м о з га п р ед ставл яе т собой

v/ независимую о т кроветворной клеточниа линию и являю тся потомками

стромальны х к л е то к к о с т н о го м о з га . Полученные резул ьтаты косвенным

образом подтверж дает э т у г и п о т е з у .

для т о го , чтобы оолие полно о х а р а к те р и зо в а ть Сибробластоподоб-

нне к л е тк и культуры к о с т н о го м о з га была предпринята попы тка получить

с д е ц и и ч е с я и е ан ти сы воротки к нн и . В к а ч е с т в е а н ти ге н а д л я иммуниза­

ции и сп о л ь зо в а л и сь либо н епосред ственно кл е тки 30 -дн свной Культуры

к о с т н о го м о з га , к о гд а ф ибрлобастаподобные клетки с т а н о в я т с я преобла­

дающими, либо стром альны е кл е тки к о с тн о го м о з г а . В интактном костной

ш з г е и тн и св те л ьн о е содерж ание стромальны х кл е ти к недо ста точно для

получения а н ти те л к ним . П оэтому для иммунизации и спользовал ся к о с т ­

ный ,*.’о з г л е тал ьн о об^ уч сш ы х крыс на Д с у т к и по сле облучен» я . К

этом у с р о к у к о л и ч е ство кроветворны х к л е то к зн ачи тельно сниж ается ,

а ко л и ч е ство с тр о га л ьн ы х элем ентов даже н е скол ько в о зр а с т а е т ( с м .

кл ем ед со н , Нельсон Г 9 6 2 ) .

ь р е з у л ь т а т е получено 8 вида сы воро ток :культуры ;

1 . Кроличья сы воро тка против к л о ю к 'ъ о с г н и г о м о з га кры сы . |

2 . Сы воротка к р о ш к а , иммунизированного клеткам и культуры ко стн о го .

}»озга и р еииауни зированно го клеткам и облученно го к о с тн о го м о з га .

:•’* Кроличья сы воротка против к л е то к к о с тн о го м о зга облученных кры с.

;*ти сы воротки дают четкую полосу преципитации с тем ан ти ген ом ,

который был и сп о л ьзован для иммунизации (ф ото I а , б ) .

- 28 -

29

При исследовании непрямым ыетидом Кунса все виды сывороток

реагируют с тканями сходным образом, макрофаги культуры костного

мозга я кроветворные клетки дают специфическую флуоресценцию ( фото

2 -4 ; . Фиброблаетоподобные клетки культуры костного мозга гетерогенны

по отношению к подученным сывороткам: часть клеток, имеющих в основ­

ном ящирюишд удлиненную форму, специфически окрашивается, в то

время как крупные распластанные клетки остаются неокрашенными (фото

4 -7 ) . На срезах регенерирующего костного мозга и трансплантатов

крысиного костного мозга под капсулу почки облученных мышей кроме

кроветворных клеток специфически светится часть стромальных элемент!

ювСфото 8-ГО). Костные балки не окрашиваются.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о гетеро

генаости популяции фибробластопедобных клеток культуры костногоI

мозга. Кроме того, можно полагать, что среди клеток, формирующих

культуру костного мозга, имеются элементы сходные по антигенному

составу с клетками стромы. Однако, для более детальных исследований

необходима дальнейшая обработка полученных сывороток.

Исследование клеток к./льтуцы очага асептического

воспаления.

На 6 день после начала воспаления на стеклянных пластинках г*обнаруживается несколько клеточных типов. Наиболее многочисленны*^

них представлены макрофагами, морфологически сходными с описанными

выше макроаагами культуры костного м озга. Фибробласты очага воспа­ления представляют собой вытянутые или веретеновидвые клетки со о^г- лой цитоплазмой и крупным овальным ядром, содержащим несколько

ядрышек, Кроме того , в очаге асептического воспаления можно найти

эпитедиоидкые клетки и многоядерные гигантские клетки, тивячяр»

для воспалительных гранулем.

- 30 -

М акроф аги , фибробласты к ги г а ь т с к и е кл е тки ииородных тел

наблюдаются на в с е х исследованны х сро ка х культуры о ч а га во спа ­

л е н и я . Эпитедиоидные к л е тк и п р ак ти ч е ски исчезаю т к 5 дню к у л ь т и -

в кр ован и н .

При иммуноф дуоресцентном окрашивании с помощью сы воротки про­

тив к о с т н о го м о з га крысы в с е описанные типы к л е то к дают с п е ц и ф и - ,

ческую ф луорееценцию (ф ото11 -13 , 1 5 ,1 6 ) .

На 8 д ень кул ьтивирования обнаруж иваю тся нефлуореспирующие

ф ибробластоподобные к л е т к и . Эти к л е тк и имеют тенденцию к кол о ни е -

образовавии и морф ологически сходны с фнбробластоподобвыми клет ­

ками кул ьтуры к о с тн о го ыозгаСф ото 14 , Г5 , 1 7 ) .

На 14 и Гб д ень число в размеры кол о ни й , состоящ их из неф лу-

оресцируюадах ф ибробластоподобных к л е то к , в о з р а с т а е т .

Для решения в о п р о са о происхож дении ф ибробластолодобных

к л е т о к , вырастающих в к у л ь т у р е о ч а га а с е п ти ч е ск о го во сп ал ен и я ,

необходимы дальнейш ие и ссл е д о в а н и я . П редварительно можно с к а з а т ь ,

что ско рее в с е го э ти к л е тк и родственны фибробдастолидобным клеткам

культуры к о с т н о го м о з г а , п о ско л ьк у они обнаруживают с хо д ств о по

ряду при зн ако в (с п о с о б н о с т ь к образованию колоний , морфологичес­

кое с х о д с т в о , о тр и ц ател ьн ая реакция с сы вороткой против к о с тн о го

м о з г а ) . С ледует о т м е т и т ь , что к л е тк и подобной морфологии появля­

ются и в к у л ь т у р е д р у ги х о р га н о в ( с е л е з е н к и , лимф атических у зл о в ,

т и м у са , п ери тон еальн о го э к с с у д а т а и д р . ) (Д урвя 1 9 7 2 ) .

И сходя из полученны х данных можно п о л а га т ь , что ф ибробласты ,

участвующ ие в во сп али тел ьно й р е а кц и и , в отличие о т ф ибробласто -

подобкых к л е т о к , образующих колонии в к ул ь ту р е о ч а га а сеп ти ч е ско го

во сп ал ен и я , имеют а н ти ге н ы , сходны е с анти генам и кл е то к к р о в е т в ^ 1

го ряда диф ф еренцировкк. Аналогичные р е зул ьта ты были получены Ва­

сильевой при и сследовании к л е то к о ч а га а с е п ти ч е ск о го воспаления

у к сен о ген н ы х (мышь — кры са) радиационных хи м ер (В аси л ьева 1976 ,

ьа си л ьева к др* 1 9 7 7 а ) . Таким о б р а зо к ко свенно подтверждаемся

ги п о те з а о наличии общих яредлественнккоЕ у ф ибробластов оч а га

воспаления и кроветворны х к л е то к и р у щ о в Г 9 7 ь ) .

ВЫаидЫ.

Иммуникор^о-Аогич-Ское и сследование к л е то к культуры к о с т -

и го ш а г а и о ч а г а а с е п ти ч е с к о го воспаления п о к р а л о сл ед уодев !

1 . оиороолаетопидобны е к л е тк е к ул ьтуры к о с тн о го м озга

о т д а ч а т ся по ан ти генной с т р у к т у р е о т макроф агов к кроветвор ­

ных к л е т о к .

2 . Все к л е т к и , участвую щ ие в воспалительном р еакц и и ,

имеют ан ти ген ы , сходны е с анти генам и кл е ти к к р о ве тв о р н о го

ря.еа диф ф еренцировки .

'5. При кул ьти ви р ован и и к л е то к о ч а га а с е п ти ч е ск о го в о с ­

паления примерки на 6 с у т к и появляю тся фибробластоподобные

к л е т к и , не вааимадействлощ ие с сы вороткой против к о с тн о го

ш з г а . Ьти к л е тк и сходны с 4и б р об л аето пи д о б и ш и клеткам и

культуры к о с т н о го м о з га и некоторы х д р у ги х о р га н о в .

Автор выражает глубокую п р и зн а те л ьн о сть Г .й .б а тд ы к о в о й и

прос?occupy Г .М .А б ел еву з а помощь, оказанную в р а б о т е .

32 -

СПИСОК ЛИТШШРЫ

1. Аверкина Р .Ф ., Локализация некоторых антигенов в почке эмбрио­

нов и взрослого человека. Онтогенез, 1972, 3* *1, 47-52.

2 . Аверкина Р .Ф ., Становление антигенов тканей почки животных и

человека в ходе эмбриогенеза. В кн. Основы иммуноэмбриологии.

М.,"Медицина", 1973, 83-137.

/ 3. Барабанов В.М., Становление антигенной структуры тканей глаза в

ходе эмбриогенеза. & кн. Основы шшуноэмбриологии. М.."Медицина",

1973, 38-73.

4 . Белецкая Л .В ., Гнездицкая Э .В ., Изучение ткани тимуса методом

иммунофлуоресценции. (Гетероорравные антигены тимуса). В сб .•.

Вопросы иммунологии. М., 1974а, М?в, 124-ГЬО.

5. Белецкая Л .В ., Гнездицкая 3 .6 . , Реакция сывороток больных вуль-

гарной пузырчаткой с антигенами склеивающей субстанции эпителия

телец Гассаля тимуса человека и животных. Балл, экспер. биол.,

19746, 77, 1»6, 87-90 .

6 . Белецкая Л .В .# Гнездицкая З .В ., Изучение миоидных клеток тимуса

методом иммунофауоресценции. Арх. ан ат ., гистол. и эмбриол., 1974

72, Ш 9 5 -10 .

7. Белецкая Л .В ., Данилова Т .А ., Шагал Л ,И ., Реакция сывороток боль­

ных ревматизмом с эпителиальными клетками тимуса. Волл, экспер.

биол., Г972, 73, $2 , 73-76. 1

8 . Брондз Б .Д ., Изучение in v ltrtto in Tlvo цитотоксического эффекта |г

" "клеточных" и гуморальных изоантител. Сообщение I . Цитотоксичес­

кое действие гуморальных изоантител на клетки "резистентной"

саркомы мышей. Волр. онкол., 19ь4, 10, $3, 9 -16 .

9. Васильева Т .В ., Использование метода флуоресцирующих антител

для идевтификацни природы клеток у ксеногенных радиационных

33

химер.,Онтогенез,197b, 7, $6, 643-645.

10. Васильева Т .В ., Исследование природы клеток очага асептического I

воспаления у ксеногенш? радиохимер методом флуоресцирующих

антител. В об* Материал!* Ш научной конференции молодых ученых 1

морфологов Москвы. Д еп.,1977, 3 -4 .

11. Васильева Т .В ., Мичурина Т .В ., Хрущев в .Г . , йыаунофдуоресцеят-

нов исследование происхождения клеток соединительной ткани у

ксеногенных радиационных химер ж норме и при асептическом вос­

палении. Онтогенез, 1977а.

12. Васильева Т .В ., Цховребова А.З.,Мичурина T .S ., Хрущов В .Г .,

йммунофлуоресцентное исследование кроветворных органов ксено­

генных мышиных радиационных химер. Онтогенез,19776, 3, $3.

13. Гауровитц Ф. Иммунохимии и биосинтез антител. м . ,0Мяр",1%9. I14. Глейберман А.С* Приготовление парафиновых срезов для иммунофлуо;!

ресцентного анализа антигенов различной химической природы.

Бюлд.Якспер.биол..1976, 82, ЯЙ, IQI8-I02G.

15. Гнездицкая 3 ,в.,Белецкая Л .В ., Изучение методом иммунофдуорес-

ценции антигена коркового эпителия тимуса человека, в сб .

Вопросы иммунологии, 1974, $6, I3 I - I3 7 .

16. Гнездицкая я .в .,Б елец кая л«В., Изучение методом иммунофдуоресце.

цеиции кепатияа телец Гассаля и эпидермиса кожи человека.

Бюлл.Зкспер.биол*,19746, 77, й»4, 89-92. |

17. Григорьева Н.Ф., Применение иммунофлуоресцентвого метода для

исследования тиреогдобулииа в щитовидных железах зародышей*

Онтогенез, 1973, 4 , *f*4, 427-431.

18. Григорьева Н.Ф., йммумофдуоресцеатное исследование тиреогдобу-

лина в период становления функция зародышевых щитовидных желез.

Онтогенез, 1974, 5 , *2, 172-179.

34

19 . Г у с е в А .И . , Ц ветков В .С . , Т ехника ыикропрецвш аш ш в а г а р е .

1 а б о р . д е л о , Г96Т , ш , 4 3 - 4 5 .

20» Данилова Т . А . , Ф едорова Н .М .* А н ти тела к элементам ге т е р о л о п

че ской соедини тельной ткани при р ев м а ти зм е . ,Ь ю л л .э к с п е р . бш

1974 , 7 7 , $>6 , 7 6 -7 9 .

2 1 . Д анилова Т .А » , з д о р о в а Ц .М ., И зучение а н ти те л к ге те р о л о ги ч

кой соедини тельной т к а н и , выделенных из сы вороток больных

р евм ати зм ом . « Б а ш х .з к сп е р .б и о д .* м ед .* Г970 , 8 1 , 3?4,4 6 2 -4 6 4 .

2 2 . Данилова Т . А . , Ф едорова Н .М ., Р а с со х и н а И .Й . , А н ти тела к Фибр

бла стам клапанов сердца в сы воротках б о л ы ш х ревм ати зм ом . Бюл

э к с п е и .б и о л . ,1 9 7 7 , 8 3 , И»Я, 3X5 -817»

2 3 . Зубжицкий Ю.н»,Метод льм иаи сцен твой микроскопии в микробиоло­

г и й , в и р у со л о ги и и и м м ун о л о ги и ., А . , "М е д и ц и н а " ,1964.

2 4 . И ванов-Смоленский А .А .« Г о р с к а я б .Ф .,К у р а л е с о в а А .М .,Д ац и н и к

й»в » ,Происхождение стром альны х м ахавоцитов в к ул ь т у р а х kocthoi j

м о з г а . Б ю л л .э к с п е р .б к о л . ,Т 9 7 6 , 8 2 , ^ 10, T 2 7 G -I2 7 Г .

2 5 . Иевлева Е .С .« Э н ге л ь га р д т И .В .« А б ел ев Г. К . , А нти ген эритроблас-

то в при вирусны х лейкем иях мышей. Б ю д д .э к с п е р .б и о л .,Т 9 7 7 , $>6,

8 2 -8 7 .

26. Клемедсон « В ельсов « Общая р ад и о б и о л о ги я . Биологичео

кое д е й ств и е и злучения на взрослы й организм » Ь к н . Механизмы

р ад и о б и о л о ги ч е ско го эф ф екта .

2 7 . К улагин П .П . , Бекчанов А .Н .« Редькина М .А . , Калашников В .В » ,

Иимунохиничеекая идентиф икация и х а р а к те р и с ти к а специф ического

а н ти ге н а с е т ч а т к и г л а з а ч е л о в е к а . ,й в л л .э к с л е р .б и о д .*197#, 77 ,

М , 8 6 -8 9 .

£ 8 . Лебедев К .А . ,В а н ь к о Л .В .« О со б ен н о сти дифферевцировки имм^ноком#

петентны х к л е то к в у сл о в и я х кул ьтивирования лимфоидной ткани

in v it r o в ь ю л л .э к с п е р .б и о л . ,1 % 9 , 68,%Ю» 9 С—9 4 .

35

2 9 . Лебедев А . А . , Скрябин А . С . , Ганина Б .Я . , Новый люминесцентный .

к о !о д одноврем енного выявления клеток» синтезирующ их специфи­

ч е ски е а н ти те л а к данному ан ти ге н у и иммуноглобулины иной сп е ­

циф ичности . S . м и кр о б н а я .,эп и д е м и о л . и и * ш у н о л .,Т % 8 , 45» $ 1 , j

66—6 9 .

30 . Лебедев К . А . , Скрябин А . С . , Ганина В . Я . , И зучение ц и кл и ч е ско го |

выхода в диффереацировку иммунокомлетентных к л е т о к . О нтогенез»

1971 , 2 , & 6 , 5 7 2 -5 6 0 .

3 1 . Лебедев К .А . ,Ф у к с Б . Ь . , Иммуноцитохимический анализ» в к н .

Принципы и методы ги с т о -ц и то х и м и ч е с к о го а н а л и за в п а то л о ги и .

Л .» М е д и ц и н а 1*, 1971» 2 3 8 -2 9 7 .

82 . Лебедев К .А .» Ч ахава О .В .,Ц а ц е н к и н а Т .Й . , йммунокомпетентеаа

лимфоидная т ка н ь безмикробны х м орских с в и н о к . М .микробиол .»

эпидем иол . и им м унолог. ,1 % 9 , 46* $ 7 , Г 2 2 -Т 2 7 . I

33. Лежнева О .М ., Выявление поверхностны х ан ти ген о в на живых кл е т ­

ка х методом флюоресцирующие а н т и т е л . В к н . Иммунохимический j

а н а л и з , М .,"М е д и ц и н а " ,1 % 8 , 189 -201* |

34. Дурня Е .А . ,К р о в е т в о р н а я и лимфоидная т к а н ь в к у л ь т у р а х . М .,"М е» !

д и ц и н а " ,1 9 ?2 *

35 . Михайлов И .Ф .,Д ь я к о в С .й .» Дюминисцентная м и кр о ско п и я . М едгиз,

М .,1961.

36 . Пом-^карпова С .И * ,М ичурина Т .В . ,В а с и л ь е в а Т .В . , / р у щ о в H . F . ,

Костный м о з г к сено генны х мышиных радиационных химер в к ул ь ту р е

т к а н и . Б ю л л .э к с п е р .б м о л .,м е д .»

37 . Чертков И*л* Фрвденштейн А . Я . , Клеточные основы кро ве твор ен и и .

(Кроветворны е к л е тк и п р ед ш ественн и ки ). М .,"М е д и ц и н а " ,1977 .

38 . Шипова Л . Я . , Г у с е в А .Й .,А л ьф а -ф е то п р о теи н в печени эмбрионов

и новорожденных ки ы с . О н т о ге н е з ,1976 , 7 , $ 4 , 3 9 2 -8 9 6 .

36> Хрущов Н .Г . Г и с т о г е н е з соедини тельной т к а н и . М . , " Н а у к а " , 1976*

8 9 . Шилова Л .Я * , Г у с е в А .й . ,Э н г е л ь г а р д т Н .В .,И м м ун о ги сто хи м и ч е ско е 'н

и зучений ^ -ф е то п р о те и н а и сы вороточно го альбумина в ранней

п о стнатальвы й период у мышей* О н то ге н е з ,Г 9 7 4 , 5 , £ 1 ,5 8 - 6 0 .

4 0 . Э н ге л ь га р д т И . В . , Применение ан ти тел против ^ -гл о б у л и н а в н и

не прямой м етоде флуоресцирующих а н т и т е л . Ь ю л л .эк сл ер *би ол . и

м е д . ,1 9 6 4 $ ,2 9 , 5 7 ,£ 1 , 6 7 -7 0 .

4 1 . Э н ге л ь га р д т К .В . ,М е т о д флуоресцирующих ан ти тел и е го примене­

ние для обнаруж ения тканевы х а н ти ген о в на с р е з а х . В кн .И ы ы уио-

хим ическлй а н а л и з . , М .,"М е д и ц и н а " ,1 9 6 8 , 1 6 5 -1 8 8 .

4 2 . Э н ге л ь га р д т а .В . ,У р ы в а е в а Й .8 . ,Л а з а р е в а М .Н .,Ф а к то р В .М . ,

П олторанина В .С . ,Б р о д с к и й В.Я*,Абелев Г.М .,Л окализация -ф е т о -

п р о теиаа в регенерирующ ей печени мышей. С вязь с син тезом ЛИК.

В е стн ик А1Ш С С С Р ,1977 , £ 8 , 8 - 6 .

4 8 . Э н ге л ь га р д т Н .8 .,Ш и п о в а Л .И . ,Г у с е в А .И „ ,Я з о в 8 А .К . ,Т е р -Г р и г о р о -

в а Б . Н . , Обнаружение у - гл о б у л и н а на с р е за х печени эмбриона

человека и новорожденных мышей с помошфо флуоресцирующих анти­

т е л . Ь ю л л .э к сп е р . б и о л . и м е д . , 1 9 6 9 ,6 8 , £ 1 2 , 6 2 -6 4 .

bit. Ап.:л з . C e llu le e poxv^tettsee d$mmunoglcbalines au niveau de la peau.

Liudes en 1шяипоflu o r esce n c e dans l e s le s io n s a top iq u e. R ev.franc.

a l le r g o l . ,1 9 7 6 , 16 , H£, 6 5 -7 1 .

Д5. Askoncs B .A ., S h ite R. G. B ite s o f antibody production In the guinea^»

pip. The relation fcetwtо : in vivo a y n tcea ie o f anti-ovalbum in and

g lo b u lin and d is tr ib u t io n o f antibody co n ta in in g plasma c e l l s . B r it .

E xp.Pathol. ,1956 , 37 , Ы -7 7 *

Д6 . B e ll Б.В., Shand F.L* A search fo r macrophages derived from ra t

th o r a c ic duct llmpho c y te s during xen ogen esls g r a ft-v e re u s-h o st

rea ctio n * in n . In st* F asteu r, 1971, 120* **3, 356-364 .

Д7. B e ll E .B ., Shand F .L . A search fo r lia p h o c y te -d er iv e d macrophages

I

37d arin g xenogeneic g r a ft-v e r sa t^ h o st r e a c tio n s Induced by r e t th oracic dm

c e l l s . Immunology, 1972, 22 , N4, 537-547*

48* Beatner £*H« Irneunofluorescent s ta in in g : the f lu o r e sc e n t antibody ■«

aeth od . B a c t.R ev .,1 9 6 1 , 2 5 , HI, 49-76*

49* Bugnon C .,Lenya D .,H erlan t M ., Dessy C ., I d e n t if ic a t io n par Immuneflu

reecen ce de t r o l s ty p es de c e l lu l e s dans lAdenohypophyse du renard e t

su p e rp o sitio n dee r e a u lta t s obtenus sur coupes s o e l - f ln e s a 1 Analyse «

u ltr a s tr u e tu r a le d es coupes f in e s T o lsln ee* C .r . S o c .b lo l . ,1 9 7 4 a ,168,

Н4-5» 456-460 .

50* Bugnon Claude, Lenys D a n ie le , S o ffr e M ich el, F elln an D oaln lque., Etude

cytolm aunologlque dee u a r ia t io e dee c e l l u l e s a p r o la c t in e e t dee

c e l lu l e s gonadotropee au cours du c y c le se c u e l annuel dans lltdenohypo*

physe du renard m ale. C .r . Acad, e e l . , 1974 b , 0279» N3, 289-292 .

5 1 . C layton H. M. L o c a lisa t io n o f ea b r lo n lc a n tig e n s by a n tise r a la b e lle d

w ith f lu o r e c e n t b y e s . Mature, 1954» 174» N1 40 , 1059*

$ 2 . Coons A.X. The lo c a l i s a t io n o f an tigen In t i s s u e c e l l s by neans o f

f lu o r e s c e ln - la b e lle d a n t lb o d y . The nature and s ig n if ic a n c e o f antibody

resp o n se . Sympos*of th e s e c t io n o f a lcr o b io lo g y N .J• Acad.Med., 1953»

N5, 200- 206 .

53 . Coons A.B. The c y to lo g y o f antibody form ation . , J . C e llu la r Coap.

P h y s io l, ( s u p p l) , 1959* 52 , HI, 55-67*

5 4 . Coons А.И.* Creech B .J . , Jones R .N ., B er lin er E.,Th© denon stratlon o f

pnevnococcal a n tig e n s in t i s s u e s by th e u se o f f lu o r e sc e n t an tib ody. ,

J .I s n u n o l . , 19 4 2» 4 5 . H3. 157-170 .5 5 . Coons A .B ., Kaplan M .B .,L o c a lisa t io n o f an tigen # In t i s s u e c e l ls * ,,

I I Improvements In a method o f th e d e te c t io n o f an tigen by sea n s o f

f lu o r e sc e n t a n tib o d y . J .sx p .m ed .,1 9 5 0 , 91* 1,1 * '

5 6 . Coons А .Й ., Leduc S.H .* C onnolly J .M ., S ta d ie s on a n tib o d y p ro d u c tio n .

I A method fo r the h is to sh em lca l dem onstration o f s p e c i f ic antibody

and i t s a p p lic a t io n to a study o f th e hyperimmune r a b b it . J.Exp.M ed.,

1955* 102» HI, 4 9 -6 0 .

57* Coona A.H., Leduc E.H., Kaplan M.M., Locallnation of antigen la tisane

c e l l s th e noose* J*Exp.Med*, 1 9 5 1 , 93* М2 * 17 3 - 188 .

58* Crulckahank B ., C urrie A.R. * L o c a lisa t io n o f t i s s u e a n tig e n s w ith the

f lu o r e s c e n t antibody technique a p p lic a t io n to human a n te r io r p itu ita r y

hormones. Immunology, 1958*8, Ml, 1>-26*

59 . Crulckahank B ., R i l l A .G .S ., The h isto ch em ica l id e n t i f ic a t io n o f а сохшее

t l v e - t l s s u e a n tigen in th e r a t . J . P a t h o l .B a c t e r io l . ,1955, 66* М2* 283-28$

80• Dixon F *J .,W elg le W .O.,Roberta J • C ., Comparison o f antibody responses

a sso c ia te d with the tr a n sfe r o f ra b b it limph node, p e r ito n ea l exudate

and thymus c e l l s . «J• Immunol• , 1957» HI, 78* 56-62*

6 1 . Doorenmaalen W.J. v a n ., Im m unohistological dem onstration o f ad u lt la n e

a n tig e n s in the embrlonie ch ick le n s . I I . E x p tl .E y e .R e s .,1966* 5 , М2,151,

6 2 . Engelhardt M.V., Gussev A * I . ,Shipova L .? .,A b e le v G .Y.,Im m unofluorescent

stady o f a lp h a -fe to p r o te in (a fp ) in l iv e r and l iv e r tumors. I . Technique ,

o f a fp lo c a l i s a t io n in t i s s u e s e c t io n s . In tern a t.J .C a n cer , 197t, 7 ,1 9 8 -

—206.

63* Ooldwasser R .A .,Shepard C .C .,S te in ln g o f complement and m o d ifica tio n s

o f f lu o r e s c e n t antibody procedures. J .Im m u nol.,1958, 80 , М2, 122-131. jj

64* Hammering U.,Hack C ., P lc k e l H.G*,Immunofluorescence a n a l ia is o f Ig

determ inant o f mouse thym ocytes and T c e l l s . Immunochemistry, 1976,

13, M6* 525-531 .

65* B i l l A*G*S*, Crulckahank B ., A study o f a n tig e n ic components o f kidney 4

t i s s u e . B r i t . f j »Exp. P a th o l* ,1953 * 34* Ml, 27-34*

66 . B i l l А !в . S . , Deane B*W., Coons A .H ., L o c a lisa t io n o f an tigen in t l s s m

c e l l s . V. Capsular polysacch arid e o f F r le lg n d er b a c i l lu s ,ty p e B, in

th e mouse. J .E xp . M ed., 1950, 9 2 , Ml* 35-44*

67* Humphrey J .H .,O r ig in o f blood p l a t e l e t s . Nature* 1955* 176,N4470*38.

68 . Lacy P .E ., D u ties J . * Prelim enary s tu d ie s on th e demonstra t io n o f

in s u l in e in th e i s l e t s by th e f lu o r e sc e n t antibody te c h n ic . D iab ets,

] 957 , 6 , 354 -357 .

-3 9 -

69* Leduc E .H ., Coons A.H*, Connolly J . H .,S tu d ie s on antibody production*

II .T h e primary and secondary resp on ses in the p o p lite a l lymph node

o f the r a b b it . J . Exp. M ed.,1955, 102, HI, 61-72*

70* Linder E .,D if f e r e n t ia t io n p f kidney a n tig en s in the human fo e tu s . J .

E m b rio l.exp .aorp h ., 1969» 21 , H6, 517*

71* Loor F . , Kindred B*, D if fe r e n t ia t io n o f T—c e l l precursors in nude B ice s

denonstrated by im m unofluorescence o f T -c e l l membrane markers. J.Exp.

Med., 1973* 138, H6, 1066-1067*

7 2 . McConnell I . Hurd C.M., L iaphocyte r e c e p to r s . I . Receptors fo r FCo f IgG and complement (csb ) on im m u n oglob u lin -bearin g ,antigen -b ild ing

and a n tib o d y -se c r e tin g c e l l s * Immunology, 1976, 30 , N6, 825-833.

73* McConnell X ., L&chmann P .J . , G ivol D ., V ariable reg ion (FT) determ inants

on mouse lym p h ocytes., Immunology, 1976, 3 0 , N6, 861-850.

76* M cD evitt D .S ., Mesa I . , Jamada T ., Im m unofluorescence lo c a l i s a t i o n o f

th e c r y s t a l l i n e i n am phibian le n s developm ent w ith s p e c ia l re fe re n c e to

th e y - c r y s t a l l i n e . D e v e lo p .B io l., 1969* 19, N5, 581.

7 5 . M arshall I .K ., L o c a lisa t io n o f adreno c o r t ic o tr o p ic hormone by h i s t о

chem ical and immonocheoicac m ethods., J .E xp . Med., 1951, 9k» HI, 21 -29 .

7 6 . M arshall J .M ., D is tr ib u tio n s o f chim otrypslnogen, procarboxypeptidase, d

deaoxyribonuclee.se and r ib o n u clea se in bovine pancreas. E xp .C ell. R es .,

1956, 6 , HI, 260-262 .

77* Nairn R .S ., Ghose T ., F o th e r g ll l J .E . , M c&tegard M.G., Kidney s p e c i f ic

a n tig en and i t s s p e c ie s d is tr ib u t io n . H atore, 1962, 196, N 6852,385-387.

7 8 . Nayak N .C ., M ita l I . , M itta l A ., Comparative o n to g sa ic dynamic o f alpha-

- f e to p r o te in and albumin s y n th e s is by the l iv e r c e l l . A study in the

human and r a t by iramunohistochemical and immunofluorescence tech n iq u es.

АлвАпйу. ia x In: A lp h a-F eto -P ro te in . P ro c .o f the X nternat. Conf. France,

R. M asseyeff, E d .,1976, 323-332 .

79* N e ll A .L ., Dixon F .J . , I ташипоЫе to chem ical d e te c t io n o f anlbody in

c e l l - tr a n s fe r stu d ies* A.M.A.Arch. P a th o l., 1959* 6 7 , 643-649*

8 0 . Okada T .S . , C e llu la r d is tr ib u t io n o f some microsomal a n tig en s in

ea b r io n ic ch icken k id n e y s . E x p .C e ll .R e s .,1963* 3 2 , М3* 584*

8 2 . Okada T .S . Development o f k id n ey- s p e c i f ic a n tig en s: an immunohistolo-

g ic a l stu d y . J . B n b rio l. exp. Morpb.g 1965, 13, N2, 285*

8 2 . O rtega L .G ., M ellors R .C .,C e llu la r s i t e s o f form ation o f gamma globu­

l i n . J .E xp . Med., 1957, Ю6, N5, 627-640 .

83 . K eif A. E . , A llen J .M .V ., The АКБ thitnlc an tigen and I t s d i s t r i b a t io n

lenkaem ias and n erv o u s t i s s u e s . J . Exp. M ed., 1964* 120* 413-420*

84* R oelante G .E ., F o rn i L ., P e m is B ., B lock ing and r e d i s t r i b u t i o n

( "capping**) o f a n tig en r ec ep to r s in T and В lim phocytes by anti-immono

g lo b u lin an tib od y . J .E x p ^ e d .,1 9 7 3 , 137, N7, IO6O-TO65 .

85* R oelante G .E ., Loor F** Bo sh eer H ., Sprent J . e HSgg L.B. , Mayor K.S*... - ,■■■+’ . f

Ryden A*, F iv e ty p e s o f lynphoeytea ( I g - t * Ig - weak, Ig - 6 !

s tr o n g , Zg ' , Ig )ch aracter ised b y etwble double iammnofluores­

cen ce and e le c tr o p h lo ro g en etic m o b ility , organ d is tr ib u t io n in normal

and nude m ice . Europ. J* Immunol., 1975* 5 , N1, 127-130.

86* Rothbard 2 . , Watson R .F ., A n tig en ec ity o f r a t c o lla g e n . Demonstration

o f antibody to r a t co lla g en in th e ren a l g lom eruli o f r a te by f lu o r es­

cence m icroscopy. J . Exp.Med., 113* Мб, 1041-Ю43*

8 7 . Bothard S*,Watson R .F .,A n t ig e n ic ity o f r a t c o l la g e s . D is tr ib u tio n o f

antibody to r a t c o lla g e n in je c te d in to r a te . J . Exp .M ed., 1962* 116,

N2, 337 -342 .

8 8 . Rothbard S . , Watson R .F ., Comparieon o f r e a c tio n s o f a n tib o d ies to

r a t c o lla g e n and to r a t kidney in th e basement membranes o f r a t renal

g lo m e ru li . J .E x p .M e d ., 19 6 9 , 129, H6, 1145-1149*

89* Santana Turk J .L .,B in d u n g o f h e to ro lo g o u e a n t i - b r a i n a n tib o d ie s

41

to so u se В s e l l s * Imnunology, 1976» 30» >6» 859-864 ,

90* S c o tt D.CL, A stu dy o f tiie a n t ig e n ic ity o f beeeneat aeebrane end retl<

11a* B r lt« 2 ,E x p ,P a th ,, 1937» 3d» Х2» »?8*

91* S c h i l l e r 4 ,1 * , Schayar B*«*»Bese K .L ., F ln oreecen t-eon ju gated bovine

a lb u a ln . P h y sica l and b lo lo g io a l p r o p e r t ie s , J .G e n .i t iy e io l , , l9 5 3 , 3 6 ,

И4. 4 8 9 -5 0 6 .

92* Stand F*L*, B e ll E .B ., S tu d ie s on th e d ia tr ib e t lo n o f macrofagae dari

fro a r a t bone narrow e e l l e l a xen ogen etic r a d ia t io n chlnaeras* Хамою!

1972, 2 2 , *4» 549-556 .

93» Saalnan Aron £* , E xp ertsen ta l in v it r o organogeneale and I t s e o d lf lc a .

t lo n by antibody d ir e c te d to a c e l l su r fa c e a n t ig e n . D e v e lo p ,M o l,,

1975, 4 3 , B1, 101-108 ,

94* Tanaka A ,, Leduc E*H«, A etady o f the c e l lu la r d is tr ib u t io n o f Рогами

a n tig en In c a r to n s s p e c ie s , J .I n e u a o l . ,1 9 5 6 , 77» >3» 198-212 ,

9 5 , T e lle r L ars, Srubb Anders 0 , , Tnreaeon sugenar, Xananofluoreaceat den

t r a t io n o f th e presence o f p ro te in BC on th e su r fa c e o f huaan lynphoey

Acta a e d , a ca n d .,1 9 7 6 , 199» * 5 , 425-427*

9 6 , Vasques J . J . , M aon F * J ,, S tu d ie s on th e I t— noh le to chem ical con posit:

o f la f le a a to r y and d ageneratlva v i s io n s , Aaer« 2 ,P a th o l , , 1956, 32,13»

613-616*

9 7 , Vaknaan B*B,, Booking D*, Study w ith f lu o r e sc e n t antibody o f fa ta

In tr a d a r n e lly In je c te d p r o te in s In r a b b its* P roc .S oc , Exp,M ol,M ed,,

1953» 8 2 , B4, 738-742*

98* Varner R*B*, Haabrane la a n n o ta g lo b u lin and a n tig en r ec ep to r s on В and

T llap h ocytea* Advene,Inoranol., 1974» 19» >1» 67-70»

9 9 , B a iler» T«H«, Coons A*B*, F lu oraecent antibody s tu d ie s w ith agenta o f

v a r ic e l la and herpes a o sta r propagated In v itro * Pros* Soc. Exp. M ol*

Med. (B-B)» 1954» 8 6 , 1 4 . 789-794*

100* White O bservations on th e form ation and nature o f R ussel bodies.

Exp. P a th o l . , 1954 , 3 5 , 1 5 , 365-370»

101* Ш м г K*B* , Antibody form ation 1» ra b b it eye stu d ied w ith fluoreaeatu

e ce ia » la b e le d an tib od y . A .M .A .A nh. C p fcta ln o l.,1955*53» > 6 , 8 t w 8 l6 .

102* Zvaaa J . t Iked» A*, Haeroao 1 e c a la r e v en ts daring the d i f f e r e n t ia t io n

o f tb e ch ick en l a t e . Exp* Eye B aa ., 1968, ? , * 4 , 301*

П Р И Л О Ж Е Н И Е

а) б)

сото I* Реакция преципитации в геле.

а) В центральной лунке - сыворотка против костного мозга облу­

ченных крыс. 1-6 - последовательные разведения гомогената

клеток облученного костного мозга крыс.

б) В центральной лунке - сыворотка против клеток культуры костш

го мозга крыс. 1-6 - последовательные разведения гомогената

клеток культуры костного мозга крыс.

Фожо 2 . Ии.чослой костного визга крысы. Реакций гСувса с

йсйааьэовавиев сыворотки против облученного кост­ного к о з г а . (В в е р ху - ф луоресценция , в в г з у - Чазовы!

контраст) Об. 90 ок.Т#

Фото н . Монослой костного мозга крысы. Реакция Кунса с

использованием сыворотки против культуры костного

мозга.(Вверху - флуоресценция, внизу - фазовый

контраст). 06.90х , ок. 10х

VOTO Ч. Реакция Kjraoa на а д л ь а д е к л е то к к о с тн о го м о зга

с и спользованием сы воротки против «облученного

к о с тн о го и о а г а . Макрофаг (в в ер ху} и а и б р о б л а с то -

подобнан к л е тк а ( в н и з у ) . Ш . 9и\ о к . Г0Х ,

Фото 5 . Реакция Кувса нь к ул ь ту р е кл е то к к о с т в о го м о з га

о использованием сы воротки против облученного

к о с тн о го м о з га . Не^луоресцирующая бибробластонидоб

ная к л е т к а , иб. 90х , ок . 10х .

wuto 6* Реакций Кунса на syHbtypc клеток жеоттого мозгас использованием сыворотки против них. 06.90х , ок. lux.

„ . . клетокФото 7* Реакция Ну ноа на культуре костного мозга с

с использованном сыворотки против них.

^флуоресцирующая фибробластоподобная клетка.

Об* 9°х , ок ПР;.

‘jto Реакций Ityuca ва срезе регенерирующего коетаогошзга о исиользойакиеа сиворотка против облv чек- вору коатвого мозга. Об, ш1 о^ЛиА*

Ф0*О 9 . Реакция Куаеа на срезе регенерирую ,е го к о с тн о го м озга

с использованием сыворотки против культуры костного

мозга. Об. 90х , OK.t0x .

0‘iu l u . Реакция К укса на ср е зе тр а н сп л а н та та кры синого

к о с тн о го м озга под к ап сул у почки облученных мышей

с и спользованием сы воротки против к л е то к культуры

к о с тн о го ?£0 з г а # иЬ . .лл , о к • Ги •

фV *

ото I t . уиброоласт очага асептического воспалений.Реакции Кумса с использованием сыворотки против клеток костного мозга. uo.^oxt ок. 10х*

фото 12. Уакрофар очага асептического воспаления.Реакций й./кса с использованием сыворотки против клеток костного мозга. 06.90х» ок. 10х.

Фито 13» Реакция JO аса яа клетках 5-дневйой культу ры очага воспадшшк с йспйльзоЕ&ниеи сыворотки против клеток костного шага* Об. 90х, ок. 10х.

Фото 14 . Колония нефлуоресцируюдих .ибрибластоподобны х

к л е то к в 16 дневной к ул ь ту р е о ч а га в о сп а л ен и я .

Реакция К ун са с и спользованием сы воротки против

кл е то к к о с тн о го и о з г а . Об. | 4 г , о к . Ш л .

Фото 15 . Реакция К ун са на к л е тк а х 16-дневной культуры очага

воспаления (сп р а в а - нефдуореецярукщ ая ф ибробласто­

подобная к л е т к а ) . Об. 90х , о к . 10х . 4 “

Фото 1 6 . Реакция Kjtaea ка щ гатиях „«а «летках Гб-дневной культуры 0.,ага

во сп а л е н и я . Об. 90х ,о к .1 0 х .

Ф**о I? . Реакция Кунса на клетках 16-дневной культуры очага воспаления. (Внизу - «©флуоресцирующая фибробласте- подобная клетка). иб.х90 , ок. 10х*