Early-branching or fast-evolving eukaryotes? An answer based on slowly evolving positions

10
Early-branching or fast-evolving eukaryotes? An answer based on slowly evolving positions Herve¨ Philippe 1* , Philippe Lopez 1 , Henner Brinkmann 1 , Karine Budin 1 , Agne© s Germot 1 , Jacqueline Laurent 1 , David Moreira 1 , Miklo¨s Mu« ller 2 and Herve¨ Le Guyader 1 1 Phyloge¨ nie et Evolution Mole¨ culaires UPRES-A 8080) , Baª t. 444, Universite¨ Paris-Sud, 91405 Orsay, France 2 The Rockefeller University, New York, NY 10021, USA The current paradigm of eukaryotic evolution is based primarily on comparative analysis of ribosomal RNA sequences. It shows several early-emerging lineages, mostly amitochondriate, which might be living relics of a progressive assembly of the eukaryotic cell. However, the analysis of slow-evolving positions, carried out with the newly developed slow ^ fast method, reveals that these lineages are, in terms of nucleotide substitution, fast-evolving ones, misplaced at the base of the tree by a long branch attraction artefact. Since the fast-evolving groups are not always the same, depending on which macromolecule is used as a marker, this explains most of the observed incongruent phylogenies. The current paradigm of eukaryotic evolution thus has to be seriously re-examined as the eukaryotic phylogeny is presently best summarized by a multifurcation. This is consistent with the Big Bang hypothesis that all extant eukaryotic lineages are the result of multiple cladogeneses within a relatively brief period, although insu¤ciency of data is also a possible explanation for the lack of resolution. For further resolution, rare evolutionary events such as shared insertions and/or deletions or gene fusions might be helpful. Keywords: eukaryotes; molecular phylogeny; long branch attraction artefact; early-branching organisms; loss of function 1. INTRODUCTION Due to its ubiquity and great evolutionary conservation, ribosomal RNA rRNA) was amongst the ¢rst molecules used to infer the early evolution of life. The analysis of rRNA quickly led to recognition of the evolutionary distinctness of the Archaebacteria Woese & Fox 1977). This major achievement, together with the easy sequen- cing of rRNA, led to its extensive use in large-scale phylogenies. A phylogenetic framework of eukaryotic organisms emerged rapidly Sogin et al. 1989) and was strengthened by further sequencing of several hundred species Sogin & Silberman 1998). The biological valida- tion of the rRNA tree was its ability to recover mono- phyletic groups supported by numerous morphological characters e.g. red algae or ciliates), by only a few e.g. Euglenozoa) or by single ones e.g. stramenopiles or alveolates) at di¡erent taxonomic levels. Moreover, several taxonomically enigmatic protists have been classi- ¢ed through rRNA analysis, e.g. Pneumocystis as a fungus and Blastocystis as a stramenopile Sogin & Silberman 1998). All these data seem to con¢rm the reliability of rRNA as a phylogenetic marker in studies of the evolution of eukaryotes. Three amitochondriate lineages, diplomonads Giardia being the best-known representative), microsporidia and trichomonads, are the ¢rst o¡shoots in the rRNA tree, with an unresolved relative branching order Leipe et al. 1993). Several mitochondriate taxa Physarum, Dictyostelium, Euglenozoa such as Trypanosoma and Percolozoa such as Naegleria) and amitochondriate ones Entamoeba and Mastigamoeba) emerge stepwise after these three lineages and before a vast multifurcation. This multifurcation, named the crown Knoll 1992), is generally interpreted as evidence for a major evolutionary radiation during which fungi, animals, red and green algae, ciliates and many other groups of organisms appeared and rapidly diversi¢ed. This phylogenetic framework was viewed as re£ecting a step-by-step construction of the eukaryotic cell Cavalier-Smith 1987; Patterson & Sogin 1992), with some extant protists corresponding to lineages that derived from hypothetical intermediate forms. For example, diplomo- nads, microsporidia and trichomonads were considered relics of eukaryotes that never possessed mitochondria. This scenario attracted many adherents and has found its way into textbooks. However, the heterogeneity of the G + C content of rRNA 35^70%) brought the ¢rst criticisms because it can lead to tree reconstruction artefacts Hasegawa & Hashimoto 1993). For example, the early emergence of Dictyostelium was attributed to the low G+C content of its rRNA Loomis & Smith 1990).Yet, the overall picture of the rRNA tree remained unchanged when only species with similar G + C contents were included Leipe et al. 1993) or when methods of phylogenetic inference insensi- tive to this bias such as transversion parsimony Woese et al. 1991) or log-Det distance Lockhart et al. 1994) were applied. Indeed, such new methods seemed to con¢rm the earliest divergence of microsporidia Galtier & Gouy 1995). The phylogenetic position of this group turned out to be instructive. The tubulins, hsp70 and RNA polymerase phylogenies place microsporidia close to the fungi, in agreement with phenotypic characters such as the presence of chitin in the endospore wall and similarities of their cell cycles see Hirt et al. 1999) for a recent Proc. R. Soc. Lond. B 2000) 267 , 1213^1221 1213 & 2000 The Royal Society Received 18 January 2000 Accepted 6 March 2000 * Author for correspondence [email protected]).

Transcript of Early-branching or fast-evolving eukaryotes? An answer based on slowly evolving positions

������������� � ������� ����� ������ ������ ������ ����� � �� ��� �� ����� � ���� �������� �������� ����� � ���� ������ ����������� ������ ������������ � ���� ��� ��������� ��������� ���� ! ������� !�� � � !�" ���

��� ������ �� ��#�����

��������� � �� � ����� ����� ������� �������� ������ ��� �� ���� � ������ ������� � !"��# $����� %�����&�� ���'�(����� � ������ )�*+��'� )+ "��,"� ���

��� ���� �������� �� ������ � ���� ��� �� ����� ��������� �� ������ ��� �������� �� ������������ ������� ! ���"� ������� �����#�������� ��������$ ��� �� ��� �������� �$ "��� ���� �� ����������� �� � ����������� �������� �� �� ������ � ��� %�"����$ �� �������� �� ���"#�������� ���� ����$������ � "� � �� ��"�� ��������� ���"&��� �� ���$ ������� �� ���� �������� ���$ �� ���� ������ ��� ��� � ���$ ��� #�������� ����$ �������� � �� ���� �� �� ��� �� � ���� ����� � �� ����� ��� '��� �� ��� #�������� ����� ��� �� ��"��� �� ����$ ��������� �� "��� ���������� ����� �� � ������$ ��� �(������ ��� �� �� �������� �������� ����������� ��� ���� �������� �������� � ���� ��� �� ��� � �� �������� ��#�(������ �� �� ������ � ��������� �� ������ �� ��� ������)�� �� � �� ���� ��� ���� �� ����� �� "� � �� *�� *��� ���� ����� �� ��� �( �� ������ ��������� ��� �� ���� �� �� ���� ����������� "� ��� � ���� ����� ����� ������$ �� ���� ���+���� ���� � �� ���� � �������� �(����� ��� ��� �� ��� �� ����� ��� ,�� �� ��� ����� ���$ ���� ���� ���������� � �� �� ������ ����� ���� ���-�� ���� ���� �� ���� ������ ���� �� ������

�������� ������ ��. ������� ���������. ���� ����� � �� ��� �� ��� .�����#�������� ���������. ���� �� �� ���

�� ����������

/� � � � ���� � ��� ���� ���� ������ ������� ���$��������� ��� ������ "�� ������ �� 0�� ���������� � ����� �� ����� ���� ��� �� ���� ��� �������� ������ ����� ��� � ������ ��� �� �� ���� ��������� �� ���� �� �� ������� ���� �1���� 2 ,�( �344� ���� ��5�� ��������� $ ��� ��� "� � �� ���� �����#��� �� ����$ ��� � � � �( ������ �� �� �����#��������������� � ��������� � �����"��� �� ������ ���������� ������� ������� �'���� �� �� �363� ��� "��� ���� ����� �� �� ��� �������� �� ������� ������������ �'���� 2 '�������� �336� ��� ��������� ������# ��� �� �� ���� ��� "�� � � ����� � � ������ ����#����� � ����� ����� �� �� ������ ���������������� ��� �� � ��� ����� �� ���� ���$ �� ���� � ��" �� � 7�����)��� �� �� ������ ���� �� � � ����������� ��������� ��� � ��8���� �(����� ������ 9�������$������� �(��������� ������ � ��� �� � ���� ���� �����#0�� ����� ���� ��������$ � � ���-������ �� � ������� ����������� �� � � ���������� �'���� 2 '���������336� ��� ���� �� � ���� � ��0�� �� ��������� � ������ �� � ��������� � ������ �� � ���� �� �� ���� ����� ������ ��

����� ��� �������� � ��������$ ����������� �.�� ������ �� ��� #���"� �������� � ����$ ������������ ��� ����������$ ��� �� 0�� �8���� � �� �� ���� ���$"� � �� ��������� ���� ��� �������� ����� �:���� �� �� �33;� '������ �� �������� � �(� ��������-$ /���������-$7�����)�� �� �� &��0����-� ��� <�����)�� �� ��)�������� ��� ��� �������� � ���� ����-��1� ���������-��1�� ������ � ��"��� �� �� ���� ���� ��������

��� ������ � ��� �� ���� ��� ���� �� ���� ���$����� �� ��"� �=���� �33��$ �� ��������� �� ����� �� ��������� ��� � ��5�� ���� ������ ����� ��� ����� "�������$ �������$ ��� ��� ����� �����$ ���� �� ��� ����� ��� ����� �� ��������� �������� ��� ��������������0�� ���� ��������� � �����"��� "�� ���"�� ����>� ��� � � ��#��#� �� ��� � ��� �� �� ������ � ����?�������#'�� � �364. <� ����� 2 '���� �33��$ "� � �����( �� ��� �� � ������������ � �������� �� ������� �������� �� ��� �� ������� � ����� ,�� �(�����$ �������#����$ ������������ ��� ���������� "��� �������������� �� ������ �� �� ����� ��������� �� �������� ���� ������� � �� �� ���� ������� � ��� ��� ���� � �"�� �� � �( �����

%�"����$ �� �� �������� � �� �� @ A ? �� �� ������ �;B&4CD� ����� �� 0�� �� ����� ����� � �� ���� � ��� ����� � ��� �� ��� � �%�����"� 2%������ � �33;� ,�� �(�����$ �� ����� �������� ��/���������- "�� � ��� �� � �� ��" @ A ? �� �� �� � ����� �:����� 2 '�� � �33C� E� $ �� ������� �� �� �� �� ���� ��� �������� ������� "��� ���� ������"� � ������� @ A ? �� �� � "��� ������ �:���� �� �� �33;� �� "��� �� ���� �� ��������� � �������� �������# ��� � ��� ���� �� �� ����������� ��������� �1���� ���� �33�� �� ���#/� ��� ��� �:����� �� �� �33F� "���������� !�����$ �� ��" �� ���� ������ � ��0�� �� ������� ��������� �� ������������ �@�� ��� 2 @���33B�

��� ��������� � ���� ��� �� ��� ���� ���� � ��� ��� � ��� ��� �����$ ���4C ��� ��� ��������������������� ���� ������������ ���� � �� ����$ ���������� "� � ����� ��� ���� ��� �� �� ��������� �� �� �� �� �� ��������� "��� ��� �������� ����� ���� ��� ���� ���� %�� �� �� ��333� ��� � ����

����� �� ���� 2� � * ��CCC� ��$ ���;&���� ���; � �CCC ��� ����� '��� ����� � �6 G����� �CCC ����0�� H 9��� �CCC

�� ��� ��� ������������ ������ ��������I�F #��� ���

��������� 9�������$ ������������ ��� ��" �������� ����� ��� �� ����� �� ��������$ ���� ��� ���������� 0�� �� ��������� ����� �� ���� ���� '������0������ "��� ���� ���� �� ����������� ��� ������#����$ "���� ��� �� �� �������� ��� ���� � ��� �� ��������� ���� �� ��������� � �������������$ �����# ����� �@��� �� �� �333�$ ���� �� ����� ��� �� �� �������� ������� ���� �� ���� ���� � �'���� �334� '�0������ ���� ��������� �� ���" �� ����� ����� ��� �#������� � ������ �� ���� �(�� ��$ ������� ��� � �� � �� �������� ����� � �� ���� �� �� ������ � ����7����� 2 %�� �336. <������� 2 ��� � �336. ' ����� 2%��� �333� %��� "� �(����� �� ��������� � ������ ����� �� ����� ���� �''J� ����$ � ��$ ������ ����� �� 7,#�� ��� �# ����$ "��� ��� ������� ��� ������ �� �������� ����� �� ������ ��

�� � ���� � �� �������

�� ������������ ''J ����$ 7,#��$ �# ���� ��� � �� �������

��� ������ ���� @��*���� "��� ������� ������� ���� 9J'��<������� �33;� K��� ���������� ������� ���� ���� �64B$;66$ ;B3 ��� ;36$ ����� ������ "��� �� ����� ��������$ "������� �������� � ��� �� ��� ������ � ����� "��� ���� ����� ��������� �� �� ����$ � �� ��� ���� ����$ ������� �;B$ ;� ��� ;� �(�$ ����� ����� ,�� �� ���"&��� �'&,���������$ �(����� ����� "� � � ���� ��� � 0�� �������"��� ���� �� �"��� ���� "��� ���������$ ������� ��� ������������ ���� "��� ���������$ ������ 3B$ ;�$ ;3 ��� ;6 �(�$����� ����� 1� � ������ � ����$ ���� ������������ "������������ ����� ��� ��� ���� ����� ��� � �� ���� �� ������� � �� ��������� @ A ? �� �� �1���� �� �� �33��$ �� ���� �� ���� � "��� ������� "��� �� � ����� ���� ��� ������������"��� ��� ��� � �� ���"��

�� ���������� ����� �����9�(���#���������� �9:� �������� "��� �� "� � ��

<�K�9: ��� �J?9: � � ; �������� ������ 2 %�����"��33H� 9�(���#��������� �9<� �������� "��� �� "� �<�J< ; � � ��� "��� �'"�8��� �33;� ��� '&, �� ����*�������� 2 <������� �333� "�� ������� ������� � �������"��� ��� ��� ��� �� � �� "�� ���� �� � ��������� ������ �� �������� ��)� �� 9< �������� "�� ������� � ��� �(����� ���� ���� � 0�� �(�� ��� �� ����� �� ��� � # ���� �������� ��� ��� ���� ��� ���� ����� "�� ��� ��������� ��� �� ����� �� �� �� � �� $ ������ �� �� ��� � �� ����������� � �� ��� ���� ��� <��� ���� "��� ��� ���� ��������� � ��� �� ��� �� ��������� � ,�� � �������� �� $ ������ ���� ���� �� ��� �� � �� � �� � �� � ���"$ �� �� ��� � ���� � �� ��"�� ��� ������� �� �� � �� % �� � ��� $ �� �� ��� ����� �� ��� ������� ���� �� ��� ���� �� ���#5��� ������ �������� �� "��� �� �(����� ����� ��� ������ �������� � �� ������� ������� "���� ��� �,����� �3H3�

�� �������� ����� � ��� ��������� ������� �����

� ��� �� ���� ��� ��� �� ����� �� ����� ���� "���$ ������ ����$ �� "� ������� ������� ���� ��� ���� �� ��� ������ ����� �� ������ !� �� ��� $ � ��� �� ����� �� ������# ���� ������ � ������� "���$ � ��� ����$ ��� ����� �� ����� ������ ������ ��� �� � ��� ��� �� ��������� ������ �%�����33�� ��� ����� �� "�� �� ��� �� "� � � ��" ����( �� ���� ���� ��� �� ���� ��� ���� �� �� ����� ������ ��� �� ������ � � �L--��� �F #��� ��-�������-���� � �� �������� ������ �� �� �� ����� ��" ��� "�� �� ��� �� ����<�9< ���� �� <�9: ������ �E��� �334�

��� �������� �� �� �� � �����#�� �� ����� "�� �� ��������� � �� �� ��� �� :���) �� �� ��333� 1��� �����#����� �� ��� ���� ����� �� �� ��� � ��� �� � �� � ��������� ��� �� ��� �� ������ ���$ � � ��5� ��� ����� �� �

���F % <������� ��� � ���� ������1����� �� (����� �� � ��'�������3

����� �� ���� 2� � * ��CCC�

SSU rNA actin

MYC

BIL

FUN

RHO

API

STR

RHO

CIL

CEN

TRIEUG

DIP

PER

MICCIL

-tubulinα

-TUBβ

FUN

BIL

STR

CILCILAPI

CHL

CHL

MYC

EUGPER

DIP

TRI

MYCMYC

MIC

FUNgiMYCetozoa

BILateria

CHLorobionta

RHOdobiontaSTRamenopiles

APIcomplexa

CILiophora

MYCetozoaMYCetozoa

PERcolozoa

EUGlenozoa

DIPlomonadida

MICrosporidia

TRIchomonadida

ARChaebacteria5% 5% 5%

,���� � !���������� �� "��� ������ � ����������� ��� ���� "��� �� ����� �� �� 9: �� ��� �� ����������������� ���� ���� �64B ���� ���� ��� ''J ����$ ;B3 ����� ���� ��� � �� ��� ;36 ����� ���� ��� �# ����� ��� ��� �� ��������� ����$ �� �� �� �?7�� ��� �# ���� ��#�J*�$ ����� ����� !� ����� � �������� ����������� �� "��� ���������$ �����#�������� �(� �� �� ���� ��� ��� �� � ���� ��� ������ "� � � ����� ����� �� ��� ���� ��(� ���� �� ��"���� ������ "� � �� ���� ������� ��� ���� ��� ���������� � � ��� � ��� �� � �� BD ��� �� �

������� ����� �������� �� �� � �� �� !� � ������� �����$ �� ���� ���� ��� ����"�� � �"� � �� "��� �������� ��� ������#���� � � �� �,� � 2 9����"� ) �34C. �M�� 2 ' ��� �336�$"��� �� �� ����"� �� ��� � ��� �� � �� � ����� ���� ��� ����� ������ ��� 7�� ��������� ���� ��� "�� �� �� ��"��� �� �� ����� � �� � ��

��� ������� �������� �$ ��� ��������� � ���� ��� �����#��� ��� ������� ��� ��� ��������� ���� � �L--��� �F #��� ��-�������-���� � �

�� ������ �� ��������

�� ������������ ������ ���������9��� ������� ������� ��� ��" ��������� ��� ���

����� ����� ������� ����� � ��$ �# ��� �# �����$���4C$ 7,#��$ ��HC$ ����� ��� ��� ���������� !! E� ���� �������� ��� �� �������� � ������� �� �� �� ������������ ����������� ��� �� ������ "� � �� ���� ��� �� "� � ��� � ��� ���� �����"�$ ��� 7����� 2 %�� �336. <������� 2 ��� � �336� ���� �� �� ������ ����"��� �� ���� ��������� �� ������� "� � ���� ��� �� ��� �# ���� �0��� �� @���� �������� 0�� �� �� ���� ��� �� �� ���������� ������ 0�� ��� � ����� ����$ �� � �������� �(�����0�� �� �� �� ��������� �� ����������$ ������������ ��� �����#������ �� �� �# ���� ��� ?���������$ �� ����������� ��� � �� ����� �� ��� ��� ������ ��� �# �����9�� �)��� ��� �� ����� ��� ����

!� ���� �����$ ����� � ���� ������ ��>� �$ �� ������������� �� �� ���� ��������� ��� ������� "� � � ��������� ������� � �� � ����$ �� ������ ���� ������� � ����� ���� �� ���� ��(�� �� �������� � ���))���� 1� ���� ��������� �������� � ����� �<�������2 ��� � �336� �� "��� �� ���� ����� � �� ����:*�� �� ��� �,������ ��� �346� ������ �� �� ������# ���� ���� �� "��� �� �������� ����� �� �� ���������� ������ �� "� � ���� ���� ������ �� �� �0��� �� ��������� �(������ "�� ������� ��� ������ � �������������� ����������� ��� �� ����� "� � ��8���� ������� �0��� �� ?��� �� ����� ���� �% <�������$��������� �� �� ���� ���"� �� �� �� �� ��� �������� ���� ���� �� �������� ���� � ������ �� ����$������� ����������� ��������� ��8������ �� ����# ������ �� �� �0��# � �C#����� ������ �334. <�"��"����� �� �334. <������� �334�

�� ��� ��� ����� "� � �� ��+� � �� 0����� ����������� � ����� �� ������ ���� ��� �E��� �33H.'������ 2 '"�8��� �334. @������ �� �� �336. � $ ���<������� 2 @���� �CCC�$ �� �������� �� �� ������ ���������� "�� ��� �� �� � �� ��� �������� ���� ����$"��� ��� ���� ������ � �� ��� � �������� ��������� ������� !� �� ����� �������� �� 0��� � �� ��$ �� ������ ��� ����������� ��� ����� � ��� �� ��� � ��� ����� #�������� ���� ����$ "��� ���� � ���� ���� �� ������� � ������ �� ���� ��� � ���� �� � ������� �� ���� 1� �������� ��� �� '&, �� ����*�������� 2 <������� �333�$ "��� �������� �� ������# �#����� �� �� ��� �� ����� ������� �� ���� ����� �� ������� ������� ' �� ��� ���� �� ����� � �� � �� $ �� �� ��� ������������� ������� �� �������� ���� ����$���� ���� ������� � � ����� �� ��($ "��� �� ���� ����� ���"�� �������� ���� ���� ��� "��� �� :*� �� ��� "��� �� ����� �0��� ;� !� �� ����� �� ����� ������� �� ������� ���� ��� ��� ���� �� ��� ��$ ���� �����"#�������� ���� ���� "��� ���� �������� �� ����� ��������� � ������ ���� ����� � ���� ��� ��� ������������� "���� �� ��� #�������� ���� ���� ����� ����"����� �� ������ !� �� ��� $ �� �� ����� �� 0��� � ������ $ �� �������� �����#�������� �(� ����������� �� �� �� �� ��� #�������� ���� ���� ��� �������$��� ������� �� ��� ����� ���� ���� ������� ���� �#���� ���� 0��� ; ��� � ��������� �� �� "� ���������

�� ������������� � ���� ���������� '&, �� ��� "�� ������� � � ����� �� �� ����

������� �� ���"� �� 0��� F$ �� ��� �������� ����# ���� ��� ���� �C ��� ��. )��� �� ��� ������ ��� � ������ �� �3 ������ ������ ������ �� � �� ��� �� � #���� �������� ����� �� ���� ��� �� �� ���� ��$ ���� ������� �������� �� �����������$ ������������ ��� ���������� �� �� ����� �� � ���$ ��� ����� ���� ��������� ������ �� ��� �� ��� ��� � ��� ������ �� ' �� ��� ���� �� �� ���� ���$ ��� �� ��( �� �����#������ ��� ������������ ���� �(�������� �� �C ��� �# ���� ��� ���������� �� ��$ "������ � ��� ������ ������ �� �� ���� ��$ ����$ ��� ����� ��� � ��������������� �������� ���� )��� �� ��� ��� � ��� 1��� ������������ ���� ��� ��� ����� ��� ���� ��&�F�$ ���� ��� ������� ���� ���$ � �� ���������� ��"������ ����� � �� �� ���� ���$ �������� �� 0��

������1����� �� (����� �� � ��'�������3 % <������� ��� � ���� ���B

����� �� ���� 2� � * ��CCC�

inferred treegene 1

inferred treegene 2

true tree

ACDFHIEBG

A

CD

F

HI

E

B

GA

CD

F

H

I

E

B

G

,���� � 7(�������� �� ����������� �� �� :*� �� ��� 1��� � ��� �� �� ���� �� � ���� �� ���$ ��� #�������� ����������� � �� �� �� �� ���� ����� �� �� � ���� ������ ��� �� �� ��� �� ������ ���� ���� ��� ����� �� �������� "��� �������� �� "� � �� ���� ������ �� �� !� �� ��� #�������� �������� ��� ��8���� ��� "� ������� ������ �� �� ����� ��� ������������$ �� �������� ���� "��� �� �������� �������� �� � �� ��� #�������� ������ "��� �� ���������� ������� � ���� ������� �� �������� ��� �<������� 2 :���� �336� ��������� �� �� � ��� �� �� �� ��� � ��+�

������� � ��� �� :*� �� ������ ���� ���� ���������� �� ����������$ ������������ ��� ������)������������ "��� ���� ���� �(���� ��� 0�� ������ ��� ����� ��� ��� ������ ���� ���� �� �������� ���� "��� ������� ���� ��� ��������� ��� A �� �� 0��� F�

��� �������� �� �� ���"#�������� ���� ���� �� ���� �� �� ���� ������ "� � ������� � �� 0��� ; !������# ��� �� ���� �� ���� ���$ ��� #�������� �������� ������ � �� ���� �� �� ��� �� � ���� �� �� :*� �� ��� $ "��� ������ �� �� ��� #�������� ���� ���� �� ��� �� �����#���� � ������ ,�� #�������� ���� ���� ����� ��� ������� � ����� ��� ��� �� �� �� 3CD �� �� � ������� �� � ���$ "��� ����� �� ��� � � ����"��������� � ���$ ��������$ �� ����� � ��� �� ����� � �� �#�� � 1���� ���"#�������� ���� ���� ���� �� � ����� ��� ����� �� ��������� � ����� �� � ������ ���$ ����� �� ����� �� ����� �������� �� ��� ���� ,���(�����$ �������� �� ��������� �� ���� ��� ��������#���� ������� B� �( �� � ��� "��� ��� ���� ���� "��� �����#����$ � ���� "��� ���� ���� ���� "� � ���� ��� "�

��� � ���� "��� �������� !� �������$ �� ��������� �� �� �� � ���� �� � "��� ����� �� ���� ������ �� ��������� "� � � ��� �� ����� ��� �� �� ������� ���� ���#����� ���� �� ��� �� ���� ���� �� 0��� F�

�� ������������� � ������ ������������ ����� ���"� �� 0��� � �(������ �� ������#

���� ���� �� �� ���� ��������� ��� ����� �����(����� ���� �� �� ����������� ����� �� ��� ���� �� ��7,#��$ �# ����$ ��� ���������� !! �� � �� ��� '&,�� ��� ������ ���� �� �(�� �� ���� � "��� ������� � �� 7,#�� ��� �# ���� ������� �0��� F� �������� �� �� ���"#�������� ���� ���� ������ ������� �� ���� ����# ������ �� � �� ���� �������� ������������$ ������)������� ���� �� ��� 7,#�� ��� ���-��1�$ /���������-$ �����#������ ��� ������������ ��� �# ����� 1� � �� ��� #�������� ���� ���� ������$ ���� ����� ������� � ������ �� �� ��� �� � �������� �� :*� �� ��� ��������$ ��� �(�����$ � �� �� ��� �� ��������� �� ���#� �� �� �� 7,#�� ��� �0��� F�

���H % <������� ��� � ���� ������1����� �� (����� �� � ��'�������3

����� �� ���� 2� � * ��CCC�

......

......

......

completedata set

no. of steps = 0 2 3 1 4 2 0 1 0 3 1 1 0 3 2 4 0 1 0 3 1 2 0 3

true phylogeny

scenario 1 scenario 2

Si

S0

,���� ; :*� ��� �� '&, �� ��� ��� ��������� � �� ��� ���� ��� �� �� �� � �� �� �� �� ��� �� �� �� �� ��� ���������� *�������� 2 <������� ��333� ����$ ���� ���� �� ���� � ��"�� ��������� � ��� � ����� �������� ��� ��� �� �� ��( � 1��� ���������� �� ������� �������� ��� �� � �� �� � �� $ �� '&, �� ��� ����"� ��� �� ��� �� "��� "� ����������������L ��� �� � �� ����� �������� �� �� ���� �(� ���� �����$ �� ���� �� �� ��� �� ����� �������� �� �� ���� �(�$"��� ��� � �� �� �"���� �� � ���� �� � :*� �� ��� ����� ����� !� ������� � �� ��$ �� ���"�� �� ���� ���������� ��������� ���� ���� �������� �� �� ��� ����L �� ���� �(� ����� � ��� ������ �����$ ���� "� � ���� �� ������� K� ���� ����$ ������� � "��� ���� �� ���� �(� �������� �� �� ��� ���������� ���� ������� ��� ���" �� ���� ���� �C ��� ��� ����������� ��� �� ������� �� ��� #�������� ���� ���� ��� �����

������1����� �� (����� �� � ��'�������3 % <������� ��� � ���� ���4

����� �� ���� 2� � * ��CCC�

-tubulinEF-1SSU rRNA

Ts+Tv C C

10

10

S5

10

S3

1

S1

1

S1

1

S1

1

S0

1

S0

1

S0

10

S3

10

S3

10

S5

10

S5

10 10

BIL

CHL CIL

API

CHLMYC

EUG

MYCMIC

FUN

BIL

DIPMYC

-TUBβ

MYC

FUN

BIL

EUG

CIL

DIP

ARC

EUGPER

DIPMIC

TRIARC

BIL

BIL

BIL

EUG

EUGPER

EUG

PER

MYC

MYC

MYC

MYC

CHL

FUN

BIL

EUG

CIL

DIP

ARC

MYC

CHL

FUN

BIL

EUG

CIL

DIP

ARC

MYC

CHL

FUN

BIL

EUG

CIL

DIP

ARC

MICTRI

TRI

ARC

ARC

DIP

MICDIP

BILEUG

PER

MYC

TRI

ARC

MICDIP

DIP

MYC

MYC

FUN

FUN

MIC

BIL

DIP

MYC

-TUBβ

FUN

MIC

BIL

DIP

FUN

MIC

BIL

DIP

MYC

MYC

-TUBβ

-TUBβ

API

CHLBIL

CIL

CIL

MYC

API

CHL

EUG

CIL

API

CHL

EUG

CIL

FUN

MIC

BIL

DIP

MYC

-TUBβ

API

CHL

EUG

CIL

CHL

EUG

CIL

DIP

ARC

MYCPER

MICTRI

ARC

MYC

αα

,���� F !��� �� ��� #�������� ���� ���� �� �� �������� ���� ��� ���� "��� ����� � �� ���� �� 9< �� ��� �������� � �� � �� � �� ��� 3B$ ;� ��� ;3 ������� ��� 64B$ ;66 ��� F�� ���� ���� ��� ����$ 7,#�� ��� �# ����$ ����� �����$��� ��� ����� �� �� �� A �� ��� � ����� ���� ��� ������������� ��� ���� ��� �� ? ��� ��� ���� ����� � "��� �� ����� ����"� � ���� ���� ��������� ���� ��� ������ "� ��� �� �����0��� ����� ���� *�������� 2 <������� ��333� ��� � ������ ��� �� �� '&, �� ���� ����� ���� ��� � �� ������� ���� �� �� �� �� ������$ ��� ����������� ���� �������� ���� ��� �� ��0��� � ��� ���� ���� ����� � �� ����� �� ��� � ���� ,�� ����$ ���� �� ��� �F ��� ��� ���� ���� ��� � ��� �; ���� ������� ��������� � � �L--��� �F #��� ��-�������-���� � �� ��(� �� ������ ����� �� �� ������� �������� �� �� ����� ��� � �� ��� ����� �� �� ����

%�"����$ "� � �� �(�� ��� �� ���� ��� �)����$ ���# ���� �� � �� �(���� �� �� ������� ��8������ ��� � ���� ������ �� �� ��� �� ���� ��� !� �������"� � �� �����$ �� ������ ���� ���� "�� ���� ������������ !� ���� �����$ ����$ ������������ ���������� ��"��� ������ ��� ��� �(�� �� �� �� ���#� ��� �� ����� "� � �� ��� ���"�� �������� ���� ������C� %�"����$ �� � � �� ��� ����� ��� ��� ���� ��"����������� ��" �# ����$ �� ���� � ���� ������ �� ���� �� �� ����� ����� ���� �� � � ���� ������ �� �$ �� ������ �� �� ����� � �� ���� ��" ������� ��� ���� ���� !�����$ � ������ �� ���� "��� � �������� � ���� ����� �� ������� ��� ���� ���� ��� ������� �� �� ���������� ���� � ������� ��� !� ��� ����� $ ����$"� � ������ ������� ��� ���� ����$ �� � ������� �����#���� � ������$ �� ���� � � ����� �� � ����� ���$ "�������� �� � ������� ��� ��������$ ����� � ������������ ��� ��� �� ��� �� �������� ������ ���� ����������� ��� ��� ��� ���"#�������� ������ ��� �� ��������� �� ��"� �� �� ���� ��� �� � ��� �� ��������� �������� ��� ������ � ���������

�� ���������� � �������� ���������� 0�� ����� � ��� ������ ������� �� ��������

���� �� �� �������� ����������� ��� �� �� � ��� %�"����$ ��������� � �������� �� � ��+� ���$ ������� ���� ���� ����� �� �� ������� ������� 2 *��"��336� �� ������� �<������� �334� ��� ��+� � ����������� ������ � ��������� ����� �� �(�� ������������ �� ���� ���#���� ��������$ ��� �� ���� ���� �� � ���� �� ����� ���� ��� �� �0��� F� ,���(�����$ �� �� � �� � �� ������ ���� ���� "� � � ��������� � ��� ����$ �� ������ �� ��� � ���� �� ������� ������� � �� � ���� "��� �� ���� �� ;C �7,#���$ FC ������ �� HB ��# �����$ "������ ���� "��� ����� � ���� ��� ��" ��� ����� �� �� �� �� ������������ �� ������ ������ � ������ � ����� /� � ���� ��� ��� ����$ �� � ����� ������ ���� ����� ������ ������� ��� ���� �� �� �������� ����� "� ���)���� �1������ �33C� ��� ���������� �� ��� �������"� � �� ������ �� ���� ������ �� � �� � �� �(�� ���� � �� :*� ���������� ���� �� ��� �� ����+� � �� � $ ����� ��� #�������� �������� �� �� ��"��� ������� ���� ���� ������� "��� ����� � �� ��� � ��� ��� �0��� F� !� �� $ ��� � � ������� �� �� ���������$ ��� # ��� ���"#�������� ������ "��� �(���� ������� ��� ���� � �� � ����$ ��� � ��� � ���#������������ �<������� 2 :���� �336� K��� ���"#�������� ���� ���� �� ��� �� �� �� �� ����" ������ �0� ��� �� ��� #�������� ������ "��� �� � ������ ��� �� �0��� F�

,�� ���� �������$ �� �� ���4C$ �� � ���� �� ������*��� 2 <������� �336� �� �(�� ��$ �� ������ �������� ����� �� �� �� ����� �� 0��� � �� ����� ��� �� ����� �� �� �������� ������ � ��������� �� ��������� ���� �@���� 2 <������� �333� %�"����$ ����"� � � ���� � ����$ �� �������� �� �� ������ �� ��:*� �� ��� $ �� ���� ��� �� ��������� ���� ��� "������� �������� �(���� ���������� ������ ���� �������� #�������� ������ ��� � �� �� ���� �� ��� � ��� ��� �� �� � ���� ���$ ��$ ��� ������ ��� ����<������� 2 :���� �336� �� � ����������� "�� �@����� �� �333�

��� ���� � �� ������� ��������� �� ��������� �������� �������� ��� ������ �� � ��� �� �(�� ��� �� ��5����8������ �� �� ���� ������ �� �� ������� :*��� ��� �$ ��� ���� �� ��� �� �� ����� � ����� �������� ���� ��� �<������� 2 :���� �336� �� �������� �����( ������ ���� ���� �������� �� �E��� �33H.'������ 2 '"�8��� �334. @������ �� �� �336�$ ��� �������� �� �� ���� ������ �� � �� � ����� ���� ���$ ���� ������� �� "��� ���� ����$ ������� �� ��������� �� �������� ��� �� �����#�� �� ������ �� �� ����# ��� ����� � � �� �� ���� � ��� ��� �� �� ���� ���� � ���� �� ��������� �� ���� � ���� � � ����� ��� ��� ������ ��� �� ����� ����� ��� �,� � 2 9����"� )�34C�$ ��������� �� ���� ������ �� � �� � ���� ��� ����#���� ���� ��� �� ���"� ��� � ��� ������� �9����� � 2,� � �33B. :����� �� �� �336. :���) �� �� �333�$ ��������� ����� �������� �� ���� ��� �� ����������� �� �� ��� �� � �����#�� �� ������ J���� ���� ��� �� :���) �� �� ��333�$ �BD �� �� ������� ������� ���� �� �� ���� ���� � �����0�� �� �� ������������� ������ �� � ��� �� �� � �����#�� � ����� �� ����5� �� � �� �� ��0���� ����� ��� �� ����� ����� �� � �� ��� 9: �� ��� "�� ��� �� �� ���� ��������)��� �� �8� � �� ����� ����� ���� ����� � ����������� �� ��� ���� �%�����"� 2 ,5�"��� �33;� E� $ �� ���� �� 0��� � ��� � ��� ������ "� � :*� ����9: �� ������ �� �� ��5�� ����� ��� �� � � ����� �����:����� �� �� �33H. ?�� �� �� �336. <������� 2 @���� �CCC� ,�� �(�����$ ����� �� � ��� �����#�� � �� ������ ��� ����"�� ��� ��� ������������ �� � �� ��"�� ���� �� � ��� �� ���� � �� ������� �� ��� ��� �������$ � ��� ����������� ��� �� ��������� � ������ �<���� ������� �� �� �336� �� �� ������� ����� ����� ��� �� ���� �������� �� �� ��� 9: ��� "���$ ��'&, �� ���$ �� ���� ���� ������ �� ��$ �� ������������ �������� ����� � �������� �� ��� �������� ����# ���� ���� !�����$ ���� �������� ���� ���"#���������� ���� ��� �� �8� �� �� :*� �� ��� � �0��� F�

��� ������� ����� ������� �(������ "� �))����������� ���� ,��� $ �� "� ���� �� ������� ����� ��� �� �� ���� ������ �� �� �� �� ���� ���� ��� ��� ��#� �� ������� � � ����� ��"$ �� ����� ������ �������� ���� C CC; � 33 ��� � �� ���"�� ��������� �� �� �(����� ����� '����$ �� ����� �� �(���� ���� �������� �� �� ��� �� �� ��� �������$ � ��� ����� �� �������� ���� ,�� �(�����$ ������������ �������������� ������ ���� �������� ���� ���� ��� �� �(��������� ������� ����� �� ���� �� � �������������������� ��� ������� ��� �� ��������� � � �L--��� �F #��� ��-�������-���� � �� 7��� ������ �� ���� ������� ����� �� ����� � ��� �� �� ��� � ����� � �� �� �������� ���� ���� �� ��������� ���� $ � ���� ����� �� ������� �� �� ����� �� �������� ����# ���� �� ������ �� �� ��� ���4C �� .�� � ���&����-����@���� 2 <������� �333� ���� ���� �������� �����0�� �� :*� �� ��� ��� ��� �(����� �� ������ �������#��� � �� ����� �� �� ���� ���������

�� ������ � �������� � ��� ��������� ���������� ������ � ����������� �������� "� � �������

������� ��� ��� �� �������� $ "��� �� �� �(������� � � ���� �( �� �� :*� �� ��� � !� ���� �����$ �� ��������� ��� �� �� ��� �� ������� �� ���� ������ � �������

���6 % <������� ��� � ���� ������1����� �� (����� �� � ��'�������3

����� �� ���� 2� � * ��CCC�

�� ���� �������� �� "��� �� ������ � ����� �*��� 2<������� �336� '� � 0����� ����� �� �� ��(�� �� 78�� � � ������� � �� ��� ��� �� �� �������������� �� ���� ���� ���� ������� ���� ��+� ��� 1���� �� ��������� ����� �� ���������� �������� �������� ���� �0�� ��� ������ ������ �� ���� ��� � ��� �� �� ����� �� � ��� � ��� ������� ���$ ��� � ��� � ��� ������ ���� ������#����� ���� �������� ���� ����������� �� ������������ �������������� "��� ����#��)�� �� ���� ��� ��������� �������� �<� ����� 2 '�����33�� ��� ��� ������ �� ������ � ��������� �� �����" � ��� ���� ��� ������� �� ��5�� ����� 1� ������������ �� *�� *��� ���� �����$ � � � ����� ��� ���� $ � ��� ��� �(�������� �� ��� �� ����� ��� �� �� ������������� ��� ������� �� � �<������� 2 ��� ��336� *���������� ��������$ ��� ���� ����� ������ �� �� ����� ��� ���� � �� ���� ��� � � �� ���������� �� � ���� ������ �� ���$ � N���� O ��� � ������0�� � ����� ����� ����� � ��� ��� ��������� ��"���� � ��������� � ������ ������ ������� �� �� ������� ��������������$ "��� �� ���� ������ ������ ����� � �� ��� ������� �� "��� �� ����� ��� �� ���� ��� � �� ���� ��� �� 0�� ����� ��� ���� "� ��� �� ���� '��� �� ��������� ��"�� �� ������� ��������� ���� ��� ���� �� �<������� �� �� �33F�$ "� ����� �� ����� ��� �� �� ������ � ����� ��� ��� �� ���� ��� ��������� ����� �9��� � � �CC 9��$ �� ���� ���� ������ � ��� ������� � ������ ��� ����

K�� "�� �� ��������� �� ��������� ��"�� �� � ��������� ����� ���� ������� ,�� �(�����$ �� �������� ��� ����� �� �; ����� ������� �B�4� ����� ����������� � ���� ����� ��� �� ��� ��#���� ���� ��������� ��� ����� ��� ����� ���� �$ � ��� ��� �� ����������������� "��� ������ ����� "��� ��� �9������ �� �� �CCC� ��� ����� ���� ��� �� ������ �� � ��������� ����" �� �������� ��� ��� ��� ���� ������ ������ E� $ ��� �� �� ���������� �� �� �� ���� �� �������� � ��� ��� ��� ������� �� $ ��� ������ ��������� ���� �� ������ �������� "��� �� ���

�� ��� ��� "�� �� ������ ��� ��� ���� �� �����������"��$ "� ����� �� �� �� ���� ���� � �� �� ����������� ���� ���-�� ���� ���� �� ���� ������ '���������� ���� ������� ������ ����$ ��� ��� ��� ������� ��� �� �� �� ����� ���� �� �� 7,#�� ������ ������ ��� ������� �*����� 2 <����� �33;� ��� ���� �������������� �=������� �� �� �33H� ��� ����� �� ���� ��������� ������ �� �(#� ��� �(#�$ "��� ������� ���� �������� �� ������-��1� ��� /���������-�@��� �� �� �333�$ ��� � �� � ������������ ��� ��9�� �)��$ "��� ��� �� ��� ���� ���� ����� �� ������������� ����� �� 7,#�� �*����� 2 /���� �� �334���� � �� �<������� 2 ��� � �336� 9��� �� ���� �����$ �� ���� ����������� � ��� ��� ��� �������� ���� ���� ����� �� ������� ��$ ���� � ��� 7�����)������� �� �� ���� � A �������������-������� ������� �� ����� �� 0�� �������� �������� �� �� �����#� � ���������$ ����� ���� ����� ��� ���� ���������� �� �������� ��

!������� �� ���� ������ �� �� ���� ���� ���"� ������ �� ��������� � ������ "��� ��� �� �� �� ���������� �� � ���� �0��� F�$ � ��� �� ���������� � "��� ��� �� �� "��� ���� �������� ����������0� ��� !� �� � ���$ ���� �������������� ��

���� � ��� �� �� ����� ����� "��� �� ������$ ���� �� �� ��� ������� �� �� ��� ���� ���� �(������ �� � ��������� ��� �� ���� � A �������������-������� ������������ "� � �# ���� ��� �� "� � � ��� ��������0��� F� '��������$ *��� ���� ������� � ���� ����� ��������� �� �� ���� ��� �0��� F�$ ��� ������ "���������� "� � ��������� � ���� ������ ��� ���������(������ "�� ����� ���� �����������$ "��� ��� ��"��������� ��� ���� �+��� ����� � ��� �� ���� ����� ������ �� ��������� �� ������� �,���� �� �� �366� /� � ��� ������ ���$ ���� �� �� ���� ���"� ������ �� ���� �� ������� �� ��������� �� �� *��� ���� �% <������� ��� < :���)$ ��������� ���� �� ��� ���� ����������� �� ������ � ��� ���� ��� �� �� ������# ����$ �������� ��� ���� �������� �� � �+��� ����� �� �������

�� �������

K� ���� 0����� �� �� ��� �� �����#�������� �(� �� �� ���� ��� ��� ��� ���� ��� �������� �� �� :*����������� ��� �� ��� �( �� ������ � ����� �������� � �� �� ��"� ����� ��� �� ��� ��� �� ��� ������� ���$ � �� ��� N����� ���O �� ����"�� �������� ���$ �� ��( �������� � �� �� � �� ������ �� ���#���� ��� �� �������0� ��� �� ������ �� �� ����� ��� ������ "�� ��� �� ���� ��� �������� ��>� � � *��*��� �<������� 2 ��� � �336� �� ������ �� ���� ������ �� ��������� �� � �7����� 2 %�� �336�

%�"���� � �� ��� �� ���� ���� �� �� �� ������������ ��� �� �������� �� ������ ����� �� � � ��#��#� �� �������� �� �� ������ � ���$ � �� ������� �� ����� �������� ������ � �� ������� �� ����� ��� � ������� ���� �� �� �( �� ������ �� ���� ���� �� ���� �� �� ������ � ��� "�� ��������� ���������"� �� ��� �� ������� � ����� ��� �( �� ��� �� ������ ������� � ����� �� �� � ���� ���� ����� ������� � �� ���� �� �( �� ������ �� �� � ���������� ���� �����$�� ���� ���� � �� ���� ���������� �� ���������������$ ��� �(�����$ �� "���#����� �� ���� ���������$ ����� �� �����������$ ��� "��� �� ������� ������ ��� ���"� ��� �� ���� �� ������ ����� 9�������������� ���� � ��� ����� �� �� ;CC 9�� ��� ��� ����0�� ����� ��� ������� � � � ��� ������ ����$ �� ����# �����$ ����� ���� �� ��C 9�� ���$ �������� ��������� ����� �������� �� �6C 9��$ � � ������ ��� �� ��� �� "��� �( �� ������� ������� ��� ��� ���( �� �� ������� � ����� ���������� ��� ���� �� ����(������ ������� �� ����� � ��� �� ����� ���� ���������� � ���� ��+� ?���������� �� ��� � �� �� ����������� ����� �� ������ �� ������ �@�� �=���� �33��$ ����� ��� �� ���� ����� ���� ��� "��� �� ���� ��+� ����"��

�� ���� �� ������ �� ���� �� ���� ��� � � ����>������$ ����������� �� ����$ ����(������$ �� ����#����$ @���� ������ �$ � � �� �� ��� ������ � �����"�� �� �� �� ����� �� �� ������� �� � � ��"��� ���������� �� �����( ������ � ���$ ��� �������� ���� �� ������ �� ���� �������� ������ ���� �� �� ��(�� �� ��������� ��$ "��� ���� � ������ � "�� �� ���� ���$ ��������� �� ��$ ��� ����� �� �� ��� ����� ���� �� �������� �� "�� ���� �����( ��� ��������� ���� :��� �� ������ �� ���� �� � ��5�� ���� ������

������1����� �� (����� �� � ��'�������3 % <������� ��� � ���� ���3

����� �� ���� 2� � * ��CCC�

�������� ������ ��� ���� ����� ���� �������$ ���������� ������ �� �� :"�8 ��3F;� ���� ��� ���� ��� �� ���

����� ���� �� �� ����� �� ���� ������ ����������$���� ���� � ������� � �������� �����(� � ����������� ����� �� ���� ��� �� ������ �� �� ����� � �� ����� �� �����(� � �� �� ��� ����� ���� �� ���( �� ������ ��$ "� "��� ���� � �������� ��� �� �� ��������� �������$ ������������$ ������������$ � � �� �� ���� �� �� ������� ��������� ��� ����� �������� �������� ������ ���5� � "��� ���� ������� � "��� � ���� �$ "��� ����� �� ��� � �����0�� �� � ��� �����# ��� 9�������$ �� ��������� � �������� �� �� >��� ����" ������� ��� ��� "� � �������� ����� ����� ���� "��� �� ����� ���� � ��5�� ����� ������ �� ������� ��� �� �� ��������� �� ������ ��

1� ���� ��� * ��0���$ 9����� %�����"�$ <� � :����� $@��8 9,����� ��� *��� 9�� �� ��� �� ��� ������� �� ��������� 1� ��� ��� ��� � ���P ��� �������� ��� ���������� ���� "��� "�� ����� �� �� �� ?�� �� �� ����� �� ��������� '��� �0��$ � ���� ���� �� @������� ���������� � �O7 ��� �� ��� @�Q ����� ���Q ����� �O���� �� 3F-��B� ��� �� �� �??#'R4 9 9 "�� ����� �� �� J�� ��' � �� �� ����� !�� � �� �� %��� � ���� �! ��3F� ��� J�� ��' � �� �� ����� '���� ,���� ��� ���� /7*#3H�BHB3

���������

�����$ G 2 %�����"�$ 9 �33H 9K:<%E ������� � ;L�������� ��� ������� ��������� �� ����� �� ��(������������� 4�-0��� ��� ������ �$ �&�BC

�����$ , G �334 R������� �� �� ������� ��� ����� )��� ��� ���� ��� ��$ 444H&446;

*�����$ ' : 2 /���� ��$ 1 , �334 K����� ��� ���� ��� �� �� ����� ����� �9�� �)��� ����� )��� ��� � ��� ��� ��$�� CC4&�� C��

*�����$ ' : 2 <�����$ G / �33; ������� ��� ���� ��� ���� ���O� ����� ���� ����L ������ ������� ���� �� ������� ���� ����� )��� ��� � ��� ��� ��$ �� BB6&�� BH�

*��������$ % 2 <�������$ % �333 ������ ��� �� ���� ��*� ����S !���� ���� ���� ��� ����� � ��� �� ��� � ������� ����������� ���� ���� � ��� ��$ 6�4&6�B

*���$ = 2 <�������$ % �336 ��" ������ � �� � �� ����������� ������ �� ����� �� ���� � ���4C ������� ���� ���� � �����$ 3F;&3BH

?��$ E $ 1������$ < G $ K����$ � 2 %�����"�$ 9 �336 �������� � �� ��������� /�� ������ �� �� ����� ��������-��5�L ����� ��� ��� ��� �� ���� ���� � ������ ������� ���� �� ���� ���� � ��� ��$ �H;4&�HFH

?�������#'�� �$ � �364 ��� ������ �� ������ � ��� �����#�� ����� ���� �� )+��� � ��� ���$ �4&BF

7�����$ � 9 2 %�� $ � < �336 7���� �������� ������ ��S4���� $0� .���� /� ��� �$ H�F&H�3

,�����$ G �3H3 � ������� �����(��� ���� ������� � ���#� �� "���� ��� ����� 6���� ��$ ;4F&;6B

,������ ���$ G �346 ?���� �� "��� ��������� �� ���� ����� ��� ���� "��� �� ���� ����� ���������� ����� 6���� �$ FC�&F�C

,����$ = @ $ K����$ @ G $ :���$ / G $ @���������$ ' G $@�������$ 9 � $ ��8$ 7 ? $ <��$ � � 2 ��8$ � � �3669������ ��������� �� �� ������ ������� ����� ��$4F6&4B;

,� �$ 1 9 2 9����"� )$ 7 �34C �� �������� �� ��� ����� �������� ���� ��������� � �� � ���� ��� � � ������ ��� � �� �� � �� 0(� ��� �� � � ���� �� ���� ��� �����-� .���� �$B43&B3;

@�� ���$ � 2 @��$ 9 �33B !�������� ����������� ���� /��������� �� ����� ���� ������ ���� ����� )��� ��� � ������ �$ �� ;�4&�� ;��

@���� $ � 2 <�������$ % �333 ?�� ��� �������� �� ������ ����������L � ��� � �� ����� �� �� ���4C ������ 7���'������ ����1��� ��$ ��H&��F

@������$ � $ ������$ G : 2 G����$ / � �336 ��������� ������ �� �������� � � �� ��� ������ ��������� � ����� ��� ���� ��� .����� ���$ FFB&FB6

@���$ 9 1 $ *����$ @ 2 :���$ * , �333 9� ������������� ��� ����� ��$ �F4H&�F6�

%�����"�$ 9 2 ,5�"���$ 9 �33; ���� ��� �+������ �� ����(��� ����������$ ��(��� ���������$ ��� ��������#5������ �� ���� ��� �� ��� ��� ��� ��� ��������� �������������� � ��� $ �&B

%�����"�$ 9 2 %������ �$ � �33; ��������� ��� ��������������S )����� ���$ �;

%����$ ' �33� <� ���� �� ��� ������ ����� ����� �$����� �$ ��� �������� ������ �� ��������� � ���� � ����� ��$ �6�6&�6�H

%�� $ � < $ :������ G�$ G 9 $ %����$ * $ /����$ 9 1 $/���� ��$1 , 2 7�����$� 9 �333 9����������� ��� ���� �� � ����L ������� ���� �� ������ ���� �� ��� ����������!!��� � ��� ��� ���� �����)��� ��� � ������ ��$ B6C&B6B

=�������$ � $ %������ �$ � $ �������$ E $ 9����$ E $�������$ , $ K���� �$ = $ '����)$ 9 2 %�����"�$ 9 �33H ?����� � ���� ��� ������� �� �� ����� ������� ������ ��� ������ ��� �� ��� � ����� ��� � ���� � ��������#����� ������ �$ .����� 0���������L ������ ���� ��� �� ������ �������� �� ������ �� 7� �����-� �&�'��� ��$ �C3B&��C;

=����$ � % �33� ��� ����� ���� ��� �� ������ ��L � �����#���� ������ ��� ����� ��$ H��&H�4

:����$ / / $ @�������$ G % $ �����$ � � 2 '����$ 9 : �33; '���� ���� ��������� ���A �� 8�9�-�� :��� ��� �� ��� ��� �� 0�� ����� �� �� ������ � ��� ���������-� ��������� ��$ F�&F6

:����� $ < $ ' ���$ 9 $ %����$ 9 2 <����$ / �33F��������� ���� ������ ���� ���� � ���� ������ � ����� �������� ���� ��� ���� ���� � ��� ��$ HCB&H��

:����� $ < G $ :����$ � 1 $ ' ���$ 9 $ 1������$ < G 2<����$ / �33H 7��� ��� �� ���������� ��� �� ���������#�����L �� ������� �� �������� �� �� �� ������ �������� �����)��� ��� � ��� ��� ��$ �3;C&�3;F

:����� $ < G $ ' ���$ 9 � $ *�������$ � ? $ %���$ / $?������ ��$ 9 � 2 %�"�$ ? G �336 � ������ ��� ������(������ ������� ��������� � � � �� �� �(����� ��� �#��� �� � �������� ���� ���� � ��� ��$ ��6;&��66

:�����$ 1 , 2 '�� �$ / 1 �33C 9������ ��������� ��/���������- ��� ��- �� ��� ��� ������ ��������� �����)��� ��� � ��� ��� ��$ 3C3;&3C34

:���)$ < $ ,�� ����$ < 2 <�������$ % �333 ��� ��� �� �� ��� ������ �� �� ���� �� �� ������� ����� 7����� � �����$ F3H&BC6

:"�8$ � �3F; 2;�� ����� 0�������<��� �� �� � �� 0����� � (��������5 ��� -��������-�� <����L %������ � ?��

9����� �$ 9 9 2 ,� �$ 1 9 �33B ��� ��� �� ����������� ����� �� ������� ���� ��� ���� ���� � ��� �$ BC;&B�;

9������$ / $ :� @�����$ % 2 <�������$ % �CCC ��� ������ ����� �����L ������ ���� ��� �� ���� ��� �� ��������� � )������ �!� �� ����� �

������$ @ G < 2 *��"�$ 1 9 �336 ������(� �� ���������/��$ ����� � ���������$ ��� �� ���� � �� �������� ������� ���������� �� ������� ����� ���� ��$ H�&4H

<� �����$ / 2 '����$ 9 �33� 7����� � ������� ��� ��� �� ��������� � !� &�� ��� � � ����� �( ��� ���� ��� % %�� ���2 = 9� ����$ �� �;&FH '��������L 1���� '��� �0

<�"��"���$ G $ *������$ ! $ ,�����$ G , $ /�R�����$ ? $ @��$ 9 2T����� �$ : �334 7( ���� ��8������ �� �� �� �� ����������� ��� �� ������������ �������� �� ��������� �� ���������

���C % <������� ��� � ���� ������1����� �� (����� �� � ��'�������3

����� �� ���� 2� � * ��CCC�

/�� ������� ��� �� ������ ����� ���� ���� � ��� ��$ F36&BCB

<���� �������$ 7 $ *������$ ? $ <���� $ < $ /+�($ , $ 9� �����$@ $ @��$ 9 $ 9��� $ * 2 R������$ ? < �3369������������ ���0�����5�� �����$ � �������� ����#�� � "� � �� ���� ���������� ���������� �� �������������� ��� � :'J ���� ����� � �� �������� ��� )������ � ���� �$ ;B�;&;B�C

<�������$ % �33; 9J'�$ � ��� �� ������ �� ��������� ��� ��� ��� ������� ��� ���� )���� �� � ���� �$ B�HF&B�4�

<�������$ % �334 ����� ���������L �� ����� �� ������������������ 7� ���� � ��� ��$ 4��&4�B

<�������$ % 2 ��� �$ � �336 ��� ������� ��������� ��7����� �L ����� �� � ��� ��� ��� ��� !� � �������� ���������0� �-�� �����5�� ��� @ ?�����$ = R�������$ 9 '�����2 � 1������$ �� �B&BH :�����L ?������ 2 %���

<�������$ % 2 @���� $ � �CCC <�������� �� ������ �� ������� ��������� ���L ���� ����� � �� ��� ��� ������ �������� ���� ��� ���� ���� � ��� ��$ 6;C&6;F

<�������$ % 2 :���� $ G �336 %�" ���� ��� ���� �����#���� � ����S 4���� $0� .���� /� ��� �$ H�H&H�;

<�������$ % $ ?�����$ � 2 ��� �$ � �33F ?�� ��?������� �(������� �� �������� ����� ������� �����#����S /� ���0-�� ���'��� �$ �B&�B

'����$ 9 �334 %�� ��� ��������� L "��� "�� �� �� ����#����� ������S 4���� $0� .���� /� ��� �$ 43�&433

'����$ 9 : 2 '��������$ G / �336 7��� ��� �� �� ��� �� ���� ��� �� �� ������ �� ���� �� ������ ��� �� ���������� ��� �� =�� 7� ��������� �$ ��&�C

'����$ 9 : $ @�������$ G % $ 7�"���$ % G $ ������$ � � 2<�� ��$ / � �363 <�������� � ������� �� �� �������

���� L �� ���� ��������� ��� ���� .�� � ��-1�� ����� ��$ 4B&44

' �����$ G 2 %���$ * �333 :���#����� � �� ��� ��� �� �/������� �� ����� ������ � ���� ��� ���� ���� � ��� ��$��4C&��43

'������$ G 2 '"�8���$ / : �334 ��� ����� ���� ����� �S��� ����� ��� �� ����� � ������ �� ������� �������#�� �� 7� ��--� � ��� �$ 44&6H

'"�8���$ / : �33; ����> 0��������� ������ ��� 0���-��� ���� ?�"�" ?��������$ !:L !������� �� ��� %�� ���'����

�M��$ ? 2 ' ���$ 9 �336 9������� �� ������� ���� ������� ���� ��� ��� � ��� ����� ����� ���$ H;&3�

1������$ 1 �33C ���� ��� ������ ��������� ��� ������� ����� 4�� ���� �$ ;H;&;H4

1����$ ? � 2 ,�($ @ 7 �344 <�������� � � � �� �� ���������� � ������L �� ������� �������� ����� )��� ��� ���� ��� ��$ BC66&BC3C

1����$ ? $ �������$ : $ �������$ < 2 9������$ : �33�������� ���������L ���(����� ��� �� �� ��������� � ����# ��� �� ����������1�� (��� �� �� ���� �� �� ��� ������ ���#����� �� ��� � ����� �00�� ����1��� ��$ ;HF&;4�

E���$ T �33H �����#�� � �� � ����� ��� ��� � � ���� ����������� � �������� &�� � ����� � ��� ��$ ;H4&;4C

E���$ T �334 ���������� ������ 1� -�9-�- �'����� ����2�$ ���� "�?� *�������$ ?�L /���� ��� �� !� ���� ��� *������$J������� � �� ?��������� � *�������

�� ��� ����� �(���� �� ��(��� ���� � �������� ����� ��$ �� � ���� ���� ������ � �� ��� � � ���� ��� �� �

������1����� �� (����� �� � ��'�������3 % <������� ��� � ���� ����

����� �� ���� 2� � * ��CCC�