PENDAHULUAN :

GENUS BACILLUS

Bab 1

1. Genus Bacillus

Pada tahun 1872, Ferdinand Cohn, menggolongkan bakteri Bacillussubtilis. Organisme ini termasuk Gram-positif, yang mampu tumbuhdengan adanya oksigen, dan mampu membentuk jenis yang unik darisel resisten yang disebut endospora, mewakili anggota pertamadari apa yang menjadi genus besar dan beragam dari bakteri yangdisebut Bacillus, dalam Famili Bacillaceae. Mana-mana dankeragaman bakteri ini, perlawanan endospora mereka untuk kimiadan agen fisik, siklus perkembangan pembentukan endospora,kemampuan untuk memproduksi antibiotik, toksisitas spora dankristal protein bagi banyak serangga, telah menarik minatberlangsung sejak mereka penemuan pada 1870-an (Kennet Todar,2009).

1.1 Klasifikasi dan Filogeni

Heterogenitas dalam ekologi, fisiologi, dan genetika dari spesiesBacillus dibuat sulit untuk mengkategorikan genus Bacillus.Konsep modern dari genus Bacillus dapat berasal sebagian besarkarya Nathan R. Smith, Francis E. Clark, dan Ruth E. Gordon,

dalam tahun 1930-an kelompok ini ilmuwan, mengembangkan definisigenus Bacillus yang merupakan "bakteri berbentuk batang mampumembentuk endospora aerobik refractile yang lebih tahan dari selvegetatif terhadap panas, pengeringan, dan lembaga lainnya yangmerusak agen". Upaya pertama untuk mengklasifikasikan spesiesBacillus didasarkan pada dua karakteristik utama: pertumbuhanaerobik dan pembentukan endospora. Hal ini mengakibatkanpengelompokan banyak bakteri yang memiliki fisiologi yang berbedadan menduduki berbagai habitat. Dalam Manual Bergey tentangBakteriologi Sistematik (1st ed. 1986), Bab G+C dari spesies yangdiketahui pada Bacillus dilaporkan berkisar dari 32-69% (Holt,1986), menggambarkan heterogenitas genom dari genus. Ada variasidari spesies ke spesies, tapi kadang-kadang dapat diamatiperbedaan yang mendalam dalam Bab G+C dalam strain dari spesiesyang sama. Filogenetik klasifikasi dilaporkan dalam Manual Bergeytentang Bakteriologi Sistematik (2nd ed 2004.) Kelompok dua jenisyang paling menonjol dari bakteri endospora pembentuk, clostridiadan basil, dalam dua Kelas yang berbeda Firmicutes: Clostridiadan Basil. Bukti filogenetik, terutama didasarkan pada analisisRNA dari subunit kecil ribosom (16S rDNA) menunjukkan bahwaspesies Bacillus menunjukkan kekerabatan dengan beberapa bakterinon-pembentuk spora seperti Enterococcus, Lactobacillus, Listeria danStaphylococcus. Dengan munculnya analisis ssRNA, genus Bacillus,dibagi menjadi beberapa keluarga endospora pembentuk saat iniditugaskan untuk empat genera di Famili Bacillaceae. Dalam Familiini, genus Bacillus, yang membedakan dengan ketat anaerobikClostridium spp karena kemampuannya untuk tumbuh di paparanudara. Banyak spesies Bacillus dapat dialokasikan ke salah satudari enam taksa yang memiliki perbedaan fisiologi. Hal iniumumnya konsisten dengan Devisi dari genus berdasarkan morfologispora. Keenam kelompok tersebut adalah:

B. polymyxa kelompok (I), B. subtilis kelompok (II), B. brevis kelompok (III),

B. sphaericus kelompok (IV), dan Thermophiles (V dan VI).Kelompok I mencakup spesies yang anaerob fakultatif dan dapattumbuh kuat dalam ketiadaan oksigen. Berbagai gula difermentasiuntuk menghasilkan asam, dan endospora yang ellipsoidal.Spesies dimiliki oleh kelompok B. subtilis, yang filogenetis danphenotypically-nya konsisten. Semua bakteri ini menghasilkan asamdari berbagai gula dan beberapa strain, seperti B. cereus dan B.licheniformis, adalah anaerob fakultatif. B. licheniformis dapatmenggunakan glukosa hanya dalam kondisi anaerobik tetapi tumbuhburuk anaerob. Meskipun B. subtilis umumnya dianggap sebagai aerob,dapat tumbuh dan bersporulasi perlahan juga dalam kondisianaerobik. Ketika glukosa, dengan nitrit adalah akseptor elektronterminal, tumbuh sangat anaerob. Bakteri ini karena itu merupakantahap peralihan antara anaerob fakultatif sejati saya strainkelompok dan aerob ketat dalam kelompok III dan IV. Hal initercermin dalam produksi asam dari beberapa gula (Leuschner,Bacillus-. Laboratorium Ilmu Tengah, York, UK 2008). Paraendospora oval yang dihasilkan oleh bakteri ini tidak membengkaksel induk dan umumnya terletak terpusat atau subterminally. Kelompok III merupakan aerob ketat yang umumnya tidak memproduksiasam dari gula. Mereka menghasilkan spora ellipsoidal yangmembengkak sel induk. Pada kelompok IV semua spesies menghasilkan spora bulat yangdapat membengkak sel induk dan mengandung l-lisin atau ornithinedalam dinding sel. Semua spesies secara ketat aerobik, tetapibeberapa memiliki kemampuan terbatas untuk memproduksi asam darigula. Spesies termofilik dari Grup V yang heterogen fisiologisdan morfologis, dan tumbuh optimal pada> 50 ° C. Sebagian besarmenghasilkan spora oval yang membengkak sel induk. Pada kelompokVI adalah spesies termofilik dan acidophilic yang membrandicirikan oleh adanya asam lemak omega-alisiklik.2. Sifat umum basil

2.1 Struktur Permukaan Bacillus

Seperti banyak bakteri gram positif, sifat-sifat adhesi,ketahanan dan tanggapan taktis, membuat permukaan spesiesBacillus agak rumit.

Fig.1 Bacillus surface. C=capsule, S=S-layer, P=peptidoglycan (fromKenneth Todar PhD.2009 University of Wisconsin-Madison).

Permukaan sel vegetatif adalah struktur laminasi yang terdiridari kapsul, sebuah protein S-layer, beberapa lembaga-lapisanpeptidoglikan, dan protein yang terletak pada permukaan luar darimembran plasma.

2.1.1 lapisan-SLapisan-S termasuk dalam lapisan permukaan kristal protein atauglikoprotein subunit. Mereka dapat ditemukan di Bacillus, sepertipada bakteri lain tetapi fungsi mereka tidak sepenuhnya dipahami.Karena menutupi permukaan seluruh sel, ada kemungkinan bahwa iadapat bertindak sebagai saringan molekuler, mencegah molekulbesar dari memasuki atau meninggalkan sel. Peran lain yang telahdianggap berasal dari bakteri lapisan-S termasuk perlindungandari sel dari predasi dan penyediaan situs pelekatan exoenzymes.Baru-baru ini menunjukkan bahwa dalam beberapa bakteri Gram-positif lapisan-S dapat menutupi muatan negatif dari lembarpeptidoglikan dan mencegah proses aglutinasi.

2.1.2 KapsulSpesies Bacillus dapat menghasilkan berbagai jenis kapsul:termasuk diantaranya B. anthracis, B. subtilis, B. megaterium, dan B.licheniformis, mengandung poli-D-atau asam L-glutamat. B. circulans, B.

megaterium, B. mycoides dan B. pumilus, menghasilkan kapsulkarbohidrat, atau dengan polisakarida yang lebih kompleks.Beberapa polisakarida yang dihasilkan oleh Bacillus dapatbereaksi dengan antisera genera lain dari bakteri, termasukpatogen manusia: adalah kasus B. mycoides dengan Streptococcuspneumoniae atau B. pumilus dengan Neisseria meningitides. Kapsul inisangat penting untuk menentukan virulensi di B. anthrax: karenatidak diproduksi oleh B. cereus dan B. thuringiensis terdekat, yangdapat digunakan sebagai kriteria untuk membedakan antara spesiesini.

2.1.3 Dinding Sel

Genus Bacillus tidak hadir banyak variasi dalam struktur dindingsel yang terjadi dalam banyak bakteri Gram-positif. Dinding semuaspesies Bacillus terdiri dari peptidoglikan dari asammesodiaminopilmelic (DAP) (Weiss et al.1981). Jenis polimeradalah tipe yang sama seperti yang universal ditemukan padabakteri gram negatif. DAP dapat langsung cross-linked untuk D-alanin, seperti pada Enterobacteriaceae, dalam kasus lain,seperti di sebagian besar bakteri Gram-positif, dua rantaisamping tetrapeptide peptidoglikan menghubungkan DAP dan D-alanin, jembatan yang interpeptide. Kehadiran asam teichoicdibatasi untuk residu asam muramic telah dilaporkan dalam jumlahbesar untuk semua spesies. Namun, jenis asam teichoic bervariasiantara spesies Bacillus. Seperti di banyak bakteri Gram-positifspesies Bacillus hadir asam lipoteikoat terkait dengan membransel, yang tampaknya terlibat dalam sintesis asam teichoic dalamdinding sel.

Fig.2 Schematic representation of muropeptide subunit of Bacilluspeptidoglycan, without intrapeptide bridge for DPA and D-alanyne

connection

2.1.4 Flagella

Sebagian besar bakteri aerobik membentuk spora, yang mobile danmemiliki flagela peritrichous yang menggunakan sel untuk bergerakdalam lingkungan sebagai respon terhadap rangsangan eksternalmelalui mekanisme kemotaksis, komposisi spesies Bacillus alkaliphileseperti B. firmus, menyajikan konten rendah di dasar asam amino,pikir untuk membuat sel yang lebih stabil pada nilai pH hingga11. Sistem flagellar dan kemotaksis telah dipelajari secaraekstensif di B. subtilis.

Fig.3 Flagellar strains: B. cereus (A) B. brevis (B) (from Kenneth TodarPhD.2009 University of Wisconsin-Madison).

2.2 Kondisi Pertumbuhan dan Persyaratan Gizi

Bakteri pembentuk spora umumnya chemoheterotrophs mampumenerapkan proses respirasi menggunakan berbagai senyawa organiksederhana seperti gula asam amino dan asam organik. Dalambeberapa kasus mereka dapat memfermentasi karbohidrat denganreaksi yang menghasilkan gliserol dan butanediol. Spesies sepertiB. megaterium perlu ada faktor organik untuk pertumbuhan, sementarayang lainnya memerlukan asam amino atau vitamin. Kebanyakanmesofilik dengan optimal pertumbuhan suhu antara 30 dan 45derajat. Beberapa spesies termofilik dengan pertumbuhan yangoptimal sekitar 65°C. Psychrophiles spesies sedikit tetapi mampumengembangkan dan sporify bahkan pada 0°C. Bacillus spesies dapattumbuh dalam berbagai pH antara 2 dan 11. Dalam lingkunganlaboratorium, dan kondisi pertumbuhan yang optimal, mereka hadirwaktu regenerasi sekitar 25 menit.

2.3 Bacillus endospora

2.3.1 Sporulasi

Bakteri Gram positif milik genus Bacillus dapat menjalani prosesperkembangan diferensiasi sel yang kompleks yang memungkinkanmereka untuk beradaptasi dengan perubahan kondisi lingkungan dankurangnya nutrisi dengan memproduksi spora yang sangat tahan.

Proses ini, disebut sporulasi, melibatkan kemajuan melaluitahapan yang berbeda termasuk inisiasi, segregasi kromosom,khusus sporulasi pembelahan sel (asimetris pada bakteri berbentukbatang), ekspresi gen diferensial dan mekanisme transduksi sinyaltertentu. Kembalinya jalur, menyebabkan pertumbuhan selvegetatif, spora melibatkan diikuti dengan perkembangan darispora berkecambah. Semua aspek dari sporulasi telah dipelajariselama bertahun-tahun dengan sangat rinci dan memiliki baikdampak besar pada pemahaman kita tentang banyak proses sel dasarlainnya dan sudah mulai untuk bahan bakar penelitian terapanspora dengan ide-ide baru.

Secara umum, faktor-faktor yang dapat mempengaruhi sporulasikemampuan untuk bersporulasi adalah pH, oksigen, dan suhu.Sporulasi tampaknya disukai oleh kondisi yang mengakibatkantingkat pertumbuhan menurun dengan adanya energi yang memadai dancadangan sumber karbon. Ketika nutrisi yang cukup yang hadir, selvegetatif membagi cepat dengan pembelahan sel, tapi pemiculingkungan seperti penipisan gizi dan / atau kepadatan pendudukmelakukan memulai proses sporulasi, akhirnya menghasilkan sporabakteri (Barak dan Wilkinson, 2005; Eichenberger et al, 2004 ,Errington 2003; Piggot en Hilbert, 2004; Wang et al, 2006).Pengembangan Spore melibatkan pembelahan sel yang tidak sama, selkecil (forespore) yang ditelan oleh satu lebih besar sehinggaendospora berkembang dalam sel induk. Pada banyak spesies, selbuncit dengan spora. Pembentukan spora, yang memakan waktubeberapa jam, disertai dengan morfologi, perubahan fisiologis,dan biokimia, dan spora refractile dihasilkan secara strukturalsangat berbeda dari sel vegetatif. Pembentukan spora merupakanproses yang mahal dan kompleks untuk sel bakteri. Spora hanyadibuat dalam kondisi dimana kelangsungan hidup sel terancamseperti kelaparan untuk nutrisi atau akumulasi limbah beracuntertentu. Peraturan sporulasi ketat dan beberapa langkah pertamayang reversibel. Hal ini membantu sel menghemat energi dan hanyabersporulasi bila diperlukan. Inisiasi pembentukan spora

dikendalikan oleh Spo0A, faktor transkripsi yang memodulasiekspresi gen selama transisi dari eksponensial pada fase diam.Spo0A adalah regulator respon dari dua komponen, sinyal sistempengaturan transduksi, dan dalam menumbuhkan sel ada terutamadibagian dephosphorylated. Dalam kondisi di mana sporulasiterbentuk, ia difosforilasi oleh phosphorelay melibatkan sejumlahkinase dan dengan cara mengaktifkan atau menekan ekspresi gendengan cara berikatan spesifik pada target DNA ("kotak 0A")ditemukan hulu gen diatur. Selanjutnya, perubahan dalam ekspresigen dikendalikan oleh sintesis kondisi lingkungan dan kurangnyanutrisi dengan memproduksi spora yang sangat tahan. dan aktivasialternatif σ faktor yang berhubungan dengan RNA polimerase danmengubah spesifisitas promotor enzim. Lima faktor σ diketahuidiproduksi pada berbagai tahap.

Sporulasi adalah proses langkah tujuh di mana sel akan secaradramatis direorganisasi. Tahap pertama sporulasi terlibat dalammembentuk kompartemen terpisah untuk spora dalam sel induk.Aktivasi Spo0A dan σH dalam sel predivisional mengarah kepembagian asimetris. Setelah ini terjadi, sporulasi ireversibel.Tahap berikutnya melibatkan meletakkan berbagai lapisan spora.Baik spora dan sel induk berperan dalam proses ini. Dalam duakompartemen, pengembangan spora yang didalangi oleh RNApolimerase σE ekspresi gen diatur dalam sel induk dan σF ekspresigen diatur dalam forespore tersebut. Pada tahap akhir, diaturoleh σK dalam sel induk, dan σG di forespore (Wang et al, 2006),spora dehidrasi sitoplasma sementara pada tahap ini mothercellslisis sebagai konsekuensi dari kematian sel terprogram (Lewis,2000) , melepaskan spora di lingkungan. The sporulasi jalurdigambarkan dalam Gambar 4.

Fig. 4 The morphological stages of sporulation. Patrick Stragier.Annual Review of Genetics, 1996

2.3.2 Struktur Spora Bakteri

Struktur kompleks spora melindungi kompartemen selular daritantangan lingkungan memberikan perlawanan tangguh terhadapkondisi yang keras (Tabel 1). Properti lain yang khas spora,penting untuk umur panjang adalah dormansi spora. Penampang darispora dalam gambar 5, mengungkapkan semua kompartemen sporatermasuk inti, membran dalam, korteks, membran luar dan lapisanmantel diikuti oleh exosporium tersebut.

Lapisan terluar adalah exosporium, yang merupakan penutup tipisyang terbuat dari protein. Exosporium adalah sisi utama darikontak dengan lingkungan, termasuk pertahanan host, itu tidak adapada spora B. subtilis, tetapi tampaknya dilestarikan antara patogenbasil pada anggota kelompok B. cereus. longgar-mengepas, sepertibalon struktur terdiri dari paracrystalline lapisan basal danrambut seperti tidur siang eksternal (Gerhardt, P., 1967).Filamen dari rambut sejenak tampak seperti dibentuk olehglikoprotein kolagen seperti tunggal, sedangkan lapisan basalterdiri dari sejumlah protein yang berbeda dalam asosiasi ketatdan longgar. Exosporium adalah bagian paling sedikit dipahamidari struktur spora, tapi exosporium hadiran pada Basil patogendan, menunjukkan kemungkinan peran dalam interaksi denganorganisme inang (host). Berikut terdapat mantel spora yangterdiri dari tinggi akan keratin cross-linked dan lapisan sporatertentu protein. Peran dari kebanyakan protein mantel individumasih belum jelas. Membran luar terletak antara korteks danlapisan mantel dalam. Fungsinya masih belum juga dijelaskan,Meskipun demikian struktur penting selama pembentukan spora(Piggot, 2004). Korteks terdiri dari peptidoglikan cross-linkedlonggar. Hal ini penting untuk menjaga dormansi spora dan tahanpanas, dan diperkirakan untuk berkontribusi pada keadaandehidrasi inti (Nicholson et al, 2000 dan referensi di dalamnya).

Komposisi korteks mirip antara banyak bakteri pembentuk spora,termasuk clostridia (Atrih dan Foster, 2001). Selamaperkecambahan spora, korteks harus terdegradasi dengan cepatuntuk memungkinkan inti spora berkembang. Selama dormansi spora,spora korteks litik enzim yang hadir dalam spora dorman meskipundalam keadaan tidak aktif. Dua penting korteks enzim litik di B.subtilis spora berkecambah adalah CwlJ dan SleB. CwlJ disintesisdalam sel induk selama sporulasi, dan terletak di lapisan luarspora, sedangkan SleB, disintesis di forespore tersebut,ditargetkan untuk kedua membran dalam spora dan lapisan sporaluar (Bagyan dan Setlow, 2002; Chirakkal et al., 2002). Kita tahubahwa protein SleB B. subtilis adalah muramidase tapi kita belumtahu bagaimana diaktifkan selama perkecambahan. Tidak semuaSporeformers memiliki SleB, pasangan CwlJ enzim perkecambahankhusus litik Korteks membran dalam, mengelilingi inti sporasebagai penghalang permeabilitas selektif. Reseptor perkecambahandan produk gen dari SpoVA operon, bagian penting dari aparatperkecambahan, (Vepachedu dan Setlow, 2005) tampaknya sebagiantergabung dalam membran ini. Hal ini menunjukkan bahwa membrandalam memainkan peran penting dalam tahap pertama perkecambahan.Apalagi, setelah aktivasi reseptor perkecambahan, membran dalammemberikan kontribusi dalam sinyal transduksi langsung ke bagianlain dari spora sebagai sinyal perkecambahan. Inti mengandungkomponen sel bakteri vegetatif (dinding sel, membran sitoplasma,sitoplasma, nucleoid, DNA, ribosom, dll) serta jumlah yangsignifikan asam dipicolinic dan ion Ca2 +. Kadar air endosporahanya sekitar 10-30% dari kadar air sel vegetatif, sehinggaendospora mampu bertahan pada tingkat dehidrasi yang akanmembunuh sel vegetatif. Kadar air rendah juga menyediakanendospora dengan ketahanan kimia (bahan kimia seperti hidrogenperoksida) dan hal itu menyebabkan enzim yang tersisa dari selspora menjadi tidak aktif.

Satu senyawa kimia yang diproduksi oleh endospora yangdiperkirakan untuk memberikan pinjaman kepada resistensi yang

tinggi mereka adalah asam dipicolinic. Bahan kimia ini telahditemukan dalam sel spora semua endospora diperiksa. Asamdipicolinic berinteraksi dengan ion kalsium untuk membentukkalsium dipicolinate (DPA), yang merupakan zat utama diyakinimeminjamkan endospora perlawanan mereka dan mewakili sekitar 10%dari berat kering dari endospora. Spora juga mengandung proteinspora asam larut kecil (SASPs). Fungsi ini untuk melindungi DNAdari radiasi UV, pengeringan dan panas kering, dan mereka jugaberfungsi sebagai sumber karbon dan energi selama proses menjadikecambah (konversi kembali ke sel vegetatif).

Gbr.5 representasi skematis dari struktur spora, (dari DepartemenMikrobiologi, Cornell University. 2007)

2.3.3 Proses perbenihan

Selain bunga intrinsiknya, perkecambahan spora telah menarikminat diterapkan, karena melalui perkecambahan spora yang padaakhirnya menyebabkan pembusukan makanan dan keracunan (Setlow etal., 2003). Dalam rangka untuk memulai perkecambahan danmemulihkan pertumbuhan vegetatif ketika kondisi menjadi baik,spora bakteri harus mampu memonitor lingkungan eksternal mereka.Perkecambahan spora, seperti yang didefinisikan sebagai kejadian-kejadian yang menyebabkan hilangnya sifat spora tertentu,merupakan proses dasarnya biofisik dan degradatif (Moir danSmith, 1990). Batin meningkat membran spora dalam fluiditas (.

Stewart et al, 1979) dan fluks ion melanjutkan, kation monovalen,kalium dan natrium, bergerak melintasi membran spora, dan kalsiumion dan dipicolinate diekskresikan. Peptidoglikan dari korteksspora terdegradasi, dan lapisan mantel yang sebagian terdegradasi(Atrih et al, 1998;.. Atrih et al, 1999). ATP sintesis danmetabolisme oksidatif melanjutkan (Otani et al., 1986), kerusakanDNA diperbaiki (Nicholson et al., 1997) dan DNA-kompleks kecilprotein asam-larut (SASPs) terdegradasi oleh protease spesifik(Nessi dkk ., 1998), menyediakan sumber asam amino untukperkembangan. Hal ini terjadi tanpa memerlukan sintesismakromolekul baru, sehingga badan yang diperlukan sudah ada dalamspora dorman yang matang. Perkecambahan dalam merespon nutrisikimia yang spesifik membutuhkan protein reseptor spesifik,terletak di membran dalam spora. Setelah menembus lapisan luarmantel spora dan korteks, germinant berinteraksi dengan reseptor:salah satu konsekuensi awal mengikat ini adalah gerakan kationmonovalen dari inti spora, diikuti oleh Ca2 + dan asamdipicolinic (DPA). Molekul Germinant dapat mengaktifkan reseptorini, mungkin oleh interaksi alosterik (Wolgamott dan Durham,1971). Ini memulai kaskade proses yang secara bertahap menurunkanstruktur pelindung spora dan melanjutkan proses seluler danmetabolisme, akhirnya menyebabkan sel vegetatif (Hornstra, 2007).Pada beberapa spesies, sebuah protein transpor ion jugadiperlukan untuk tahap awal ini. Peristiwa awal termasukkehilangan tahan panas, gerakan ion dan rehidrasi parsial intispora, dapat terjadi tanpa korteks hidrolisis, meskipun yangterakhir diperlukan untuk rehidrasi inti lengkap dan pembentukankoloni dari spora. Dalam B. subtilis dua krusial korteks litik enzimtelah diidentifikasi: satu adalah CwlJ, yang DPA-responsif danterletak di persimpangan korteks-coat. Yang kedua, SleB, hadirbaik di lapisan luar dan pada membran spora dalam, dan lebihtahan terhadap panas basah daripada CwlJ. Cortex hidrolisismenyebabkan rehidrasi lengkap inti spora, dan kemudian aktivitasenzim dalam protoplas spora resume. Kami belum tahu apa yang

mengaktifkan kegiatan SleB di spore, dan kita juga tidak memilikiinformasi sama sekali pada bagaimana mantel spora yangterdegradasi (Moir, 2005).

Fig. 6 Bacillus spore germination. Kort et al. 2005

2.3.4 Reseptor BasilusSpora Bacillus dilengkapi dengan satu set spesifik reseptorperkecambahan yang memantau lingkungan untuk kondisi hasil yangtepat. Sebagai molekul sinyal disini fungsi perkecambahan,seringnya asam amino atau ribosides, yang mampu memulaiperkecambahan ketika hadir dalam konsentrasi yang tepat dancampuran di dekat spora (Foerster dan Foster, 1966; Gould, 1969).Proses perkecambahan melibatkan interaksi perkecambahan kimiadengan reseptor spesifik diduga dalam spora, dan transduksisinyal ini dalam beberapa cara. Tidak ada bukti transportasimassal atau metabolisme germinant (Scott dan Ellar, 1978).Rincian molekul penuh proses transduksi sinyal dalamperkecambahan spora belum jelas, namun hipotesis wajar dapatdibangun dengan informasi yang tersedia, yang sebagian besarberasal dari studi dengan B. subtilis. Salah satu hipotesis untukmenjelaskan perubahan perkecambahan terkait adalah bahwaperistiwa awal dalam perkecambahan akan melibatkan perubahan

membran yang mengubah sifat permeabilitas, mengarah keredistribusi ion dan air dalam spora, dan dengan demikianmengaktifkan enzim litik (Keynan, 1978); bukti penghambatanperkecambahan spora oleh saluran ion blocker mendukung ini(Mitchell, 1986), seperti halnya asosiasi membran kemungkinanproduk gen Gera (Moir dan Smith, 1990). Kecambah harus terlebihdahulu menembus lapisan luar dan lapisan korteks spora sebelumdatang di kontak dengan reseptor kecambah. Operon GerA dalam genom B. subtilis, pengkodean untuk perkecambahan(Ger) reseptor Gera, adalah perkecambahan operon pertama kalidijelaskan (Zuberi et al, 1987), dan terbukti terlibat dalam L-alanin dimulai. perkecambahan. Kemudian, Gerb dan gerKdigambarkan, keduanya terlibat dalam respon perkecambahan padacampuran L-asparagin, D-glukosa, D-fruktosa dan K + (respon AGFK)(Corfe et al, 1994). Genom hampir semua Sporeformers mengandung setidaknya satu, danbiasanya beberapa dari operon reseptor, yang mengarah padakesimpulan bahwa Sporeformers menanggapi berbagai jenis germinantmelalui beberapa reseptor, dikodekan dalam kelompok gen yangtelah menyimpang dari beberapa nenek moyang (s). Kadang-kadanglebih dari satu reseptor yang terlibat dalam penanggulanganKecambah satu atau beberapa (McCann et al, 1996;. Barlass et al,2002;. Irlandia dan Hanna, 2002). The Gera operon, sepertikebanyakan homolog nya, mengkodekan tiga protein, GerAA, GerABdan GerAC. Ini semua memiliki hubungan potensial dengan membran -GerAA dan AB adalah protein membran terpisahkan - GerAA memilikidiprediksi domain membran yang akan span membran setidaknya limakali, sedangkan GerAB diperkirakan memiliki 10 rentang membran,dan diklasifikasikan dalam istilah evolusi sebagai subfamilitunggal komponen membran transporter (Jack et al., 2000) (ituadalah satu-satunya dari tiga protein yang memiliki homologiprotein lain yang dikenal di luar bakteri pembentuk spora). TheGerAC protein merupakan lipoprotein diprediksi. Semua disajikandalam kompartemen spora berkembang, dan karena itu akan

ditargetkan ke membran dalam spora. Percobaan menggunakanantibodi terhadap GerAA dan protein GerAC menunjukkan bahwamereka yang hadir dalam membran dalam, daripada lapisan luarspora (Hudson et al., 2001) dan percobaan pada Gerba menunjukkanbahwa ini juga hadir dalam membran dalam (Paidhungat dan Setlow,2001). Bukti bahwa protein reseptor langsung mengikat germinanthanya datang, sejauh ini, dari analisis fenotipe mutan. GerminantA dapat mengikat tanpa mediasi transportasi, tetapi menyebabkanperubahan alosterik dalam protein membran (s). Oleh karena itu,kita perlu pemahaman yang lebih baik dari protein reseptor, yangtelah terhalang oleh kegagalan upaya sejauh ini untuk overexpressdan mengkarakterisasi komponen membran terkait.

3. Terjadinya Bacillus spp. dalam lingkungan Anggota genus Bacillus memiliki distribusi lingkungan di mana-mana. The endospora produksi dasar untuk dispersi Bacillus spp ..Gudang bakteri ini adalah tanah. Strain telah diisolasi dariekstrem gurun dan sampel Antartika. Kapasitas resistensi sporaekstrim telah kagum banyak ilmuwan dan telah dipelajari, mencobauntuk mengungkapkan mekanisme di balik perlawanan spora(Nicholson et al, 2000 dan referensi di dalamnya, Setlow, 2005).Mereka telah terbukti menjadi jenis yang paling tahan lama darisel yang ditemukan di alam: berkat keadaan tidak aktif, merekadapat bertahan untuk jangka waktu yang sangat lama, bahkan jutaantahun. Karena perlawanan yang luar biasa ini, keberadaan sporadapat menyebabkan beberapa masalah dimanapun higienis dan kondisisteril adalah prasyarat, seperti dalam industri makanan danlingkungan medis. Spora dapat menahan sebagian besar teknikpelestarian saat ini diterapkan dan sebagai konsekuensinyabertanggung jawab untuk infeksi, penyakit yang bertalian denganmakanan yang serius dan sejumlah besar pembusukan makanan (Brulet al, 2006). Industri telah mengembangkan metode pengawetanuntuk mengurangi kontaminasi mikroba pada produk makanan. Sebagaihasil dari upaya ini makanan kita dapat dianggap aman. Sayangnya,

metode yang digunakan saat ini tidak sepenuhnya efektif terhadapspora sebagai konsekuensi dari kapasitas ketahanan mereka yangluar biasa (Oomes dan Brul, 2004). Kehadiran spora Bacillus dilingkungan pasti menghasilkan keberadaan spora dalam produkpertanian dan susu. Dalam beberapa tahun terakhir, konsumen telahbergeser pilihan mereka pada"segar seperti" makanan, karenamemiliki rasa yang lebih baik dan karakteristik tekstur, produkini diharapkan juga lebih sehat. Namun, penggunaan kondisipengolahan makanan ringan, basal untuk mengakomodasi pilihan ini,memfasilitasi keberadaan spora dalam produk makanan, karenasering tidak selesai inaktivasi spora. Selain itu, kurangnyakompetisi mikroba setelah perawatan, memfasilitasi cepatmemfasilitasi pelepasan cepat sel-sel vegetatif dari berkecambahspora.

3.1 Kelompok Bacillus cereus Kelompok Bacillus cereus terdiri subdivisi yang sangat homogen genusBacillus yang menunjukkan sifat yang sangat patogen berbeda.termasuk B. cereus, bersama dengan B. anthracis, B. thuringiensis, B.weihenstephanensis, B. mycoides dan B. pseudomycoides, ke grup inimikroorganisme terkait erat. Gudang bakteri ini adalah tanah,tetapi mereka tersebar luas di lingkungan, atau menghambatkehidupan dari usus serangga. Kadang-kadang spesies ini dapatmenyebabkan keracunan makanan dan infeksi jaringan lunak,terutama mata. B. cereus merupakan patogen manusia oportunistikyang paling sering dikaitkan dengan keracunan makanan(Drobniewski et al. 1993). Anggota lain dari grup ini, saat inidiklasifikasikan sebagai B. thuringiensis, terutama patogen seranggabanyak digunakan sebagai biopestisida (Schnepf et al 1998).Sebuah fenotipe patogen ketiga dipamerkan oleh B. anthracis: ituadalah agen penyebab anthrax, penyakit zoonosis yang dapatmematikan bagi manusia. B. mycoides, B. pseudomycoides dan psychrotolerantB. weihenstephanensis kurang baik ditandai. Meskipun yang terakhir,mampu tumbuh secara efisien pada suhu 4°C, dapat membentuk bahaya

dalam produk makanan disimpan pada suhu rendah (Hornstra 2007).Analisis genom B. weihenstephanensis, mengungkapkan adanya gen toksin(Stenfors et al, 2002), namun belum menunjukkan tanggung jawabnyadalam penyakit yang ditularkan melalui makanan. Meskipun studi pertama pada B. cereus kelompok mulai abad in 19tahun, hubungan antara beberapa organisme ini belum diatasisecara tuntas. Hubungan genetik yang sangat tinggi antara B.cereus, B. anthracis dan B. thuringiensis, membuat genom diferensiasiberbasis rumit atau bahkan tidak mungkin (Helgason et al, 2000;Ivanova et al, 2003). Penanda konvensional keragaman kromosom,seperti 16S dan 23S rRNA gen, pada dasarnya identik (Ash et al.1991, 1992). Beberapa penelitian menggunakan teknik yang berbedaseperti elektroforesis berdenyut-bidang gel DNA kromosom (Carlsonea al. 1994), pemetaan genom (Carlson et al.1996), multilocusenzim elektroforesis (Helgason et al, 1998, 2000.), BOX-PCRfingerprinting (Kim et al.2001), multilocus urutan mengetik(MLST) (Helgason et al 2004) dan diperkuat fragmen polimorfismepanjang (AFLP) analisis (Ticknor et al. 2001) , juga telahmenyarankan bahwa spesies ini sangat erat kaitannya bahwa merekaharus dianggap sebagai satu spesies. Di sisi lain, beberapa perbedaan dalam hal fenotipe dalam spesiesini, memungkinkan identifikasi mudah menggunakan metode klasik;B. cereus dan B. thuringiensis aktivitas hemolitik ini, yang motil,resisten terhadap penisilin, dan mampu menurunkan tirosin danmenghasilkan phosphatise, sementara B. anthracis tidak menunjukkankarakteristik tersebut. B. thuringiensis menghasilkan kristalberacun parasporal, yang dikenal sebagai δ-endotoksin, yangmemungkinkan untuk membedakan itu dari B. cereus (Schoeni dan Wong,2005 dan referensi di dalamnya). Selain itu, pola patogenisitasspesies ini sangat berbeda. Sebagian besar gen yang bertanggungjawab untuk virulensi bakteri ini plasmid berada. Dalam beberapakasus, hilangnya berkorespondensi plasmid hilangnya virulensi,membuat mustahil untuk membedakan antara bakteri yang termasukkelompok ini. Hubungan evolusi antara semua anggota kelompok

harus menjadi penting, tidak hanya untuk memahami evolusivirulensi pada kelompok B. cereus, tetapi juga untuk meningkatpesat kepentingan ilmiah dan politik yang organisme ini telahdiperoleh dalam beberapa tahun terakhir dari.

3.2 B. cereus sebagai organisme patogen B. cereus merupakan patogen manusia oportunistik yang dapatmenyebabkan dua jenis infeksi yang ditularkan melalui makanan.Sindrom muntah disebabkan oleh produksi toksin dalam produkmakanan sebelum dikonsumsi, sedangkan sindrom diare adalah hasildari tertelan B. cereus spora yang berkecambah dalam usus manusiadan menghasilkan enterotoksin dalam saluran usus (Granum, 2001;Schoeni dan Wong, 2005).

3.2.1 Sindrom Emetik Sindrom muntah adalah contoh khas dari keracunan makanan yangdisebabkan oleh racun yang disebut cereulide, yang menyebabkanmual dan muntah 1-6 jam setelah konsumsi makanan yangterkontaminasi (Kramer en Gilbert, 1989; Ehling-Schulz et al,2004). Gejala yang sama disebabkan oleh Staphylococcus aureusenterotoksin (Granum dan Lund, 1997). Cereulide adalah panas danpH yang stabil melingkar dodecadepsipeptide (Gambar 7) yangterdiri dari tiga unit berulang dari empat asam amino, masing-masing terdiri dari DO-leusin, D-alanin, LO-valin dan L-valin(Agata et al 1994;. Agata et al. 1995b). Struktur menyerupaikalium yang dikenal ionofor valinomisin (lihat Gambar 7). Memangcereulide telah terbukti menjadi racun bagi mitokondria denganbertindak sebagai ionofor kalium. Gejala umumnya ringan, danpasien sembuh dalam 24 jam, tetapi kasus-kasus kalanya merenggutnyawa akibat sindrom muntah telah dilaporkan (Mahler et al,1997).

Gbr.7 Perbandingan komposisi asam amino dari cereulide [D-Ala -DO-Leu - L-Val - LO-Val] 3 (kiri) dan valinomisin [D-Val - LO-Ala

- L-Val - DO- val] 3 (kanan) (Teplova et al. 2006)

Pada tahun 2004 dua kelompok penelitian telah menunjukkan bahwaproduksi cereulide di B.cereus adalah hasil dari mekanisme yangrumit dioperasikan oleh ribosom peptida sintetase non (NRPS)kompleks (Toh et al 2004;.. Horwood et al 2004).

3.2.2 Sindrom diare Sindrom diare ini disebabkan oleh produksi enterotoksin dalamusus kecil setelah konsumsi makanan yang terkontaminasi oleh selvegetatif B.cereus. Ini khas toxico-infeksi ditandai dengan sakitperut, kram dan diare, terjadi 8 sampai 16h setelah konsumsi(Granum dan Lund, 1997). The enterotoksin menyebabkanterganggunya air (transportasi zat terlarut) yang mempengaruhilapisan epitel dari usus kecil. Gejala penyakit ini sangat miripdengan yang disebabkan oleh penyakit yang bertalian denganmakanan dari Clostridium perfringens, tetapi mekanisme patogentampaknya berbeda: C. perfringens enterotoksin dilepaskan selamasporulasi di usus kecil, sedangkan enterotoksin B. cereusdiproduksi selama pertumbuhan di usus kecil (McClane, 1997;Granum, 2007). Selama tahun 1980-an dan 1990-an, dengan penemuan danidentifikasi enterotoksin, banyak kemajuan dalam penelitiansindrom diare mungkin terjadi. Baru teknik biologi molekulerdiizinkan untuk aquire pengetahuan pada produksi dan regulasi

enterotoksin. Berdasarkan data epidemiologi diperkirakan bahwa103-108 sel per gram makanan yang cukup untuk manifestasi gejalapenyakit (Granum dan Lund, 1997). Beberapa faktor virulensi yangdihasilkan oleh B. cereus telah dijelaskan, yang enterotoksin tigakomponen hemolisin BL dan NHE non-hemolitik ditandai dengan baik(Beecher dan Wong, 1997; Lindback et al, 2004). Lain toksinkomponen tunggal, enterotoksin T telah dijelaskan (Agata et al,1995) dikodekan oleh gen bceT, tetapi peran enterotoksin inidalam B. cereus dimulai keracunan makanan masih harus dijelaskan.Umumnya gejala yang berhubungan dengan sindrom diare agak ringan,tetapi strain B. cereus memproduksi CytK toksin, yang bertanggungjawab untuk enteritis nekrotik, menyebabkan kematian tiga orangdi Perancis (Lund et al, 2000).

Haemolysin BL (HBL) Pertama enterotoksin dijelaskan dalam B. cereus adalah hemolitiktoksin BL (HBL). Karena efek yang diamati in vivo dan in vitro(Kramer dan Gilbert, 1989), itu awalnya didefinisikan faktordiarrhoeagenic, faktor akumulasi cairan dan vaskularpermeabilitas faktor (Shinagawa et al. 1991a, 1991b Shinagawadkk, Sutherland. Dan Limond, 1993 ). HBL adalah protein toksinkomponen tiga, dikodekan oleh gen 3 diselenggarakan pada 1 operonhblA, hblC dan gen hblD menyandikan B, L1, L2 dan komponen,masing-masing. Sebuah gen keempat telah ditemukan dalam operonini, hblB, namun fungsinya belum didefinisikan. Berat molekuldari B-komponen 38 kDa1, 40 kDa untuk L1-komponen, dan 45 kDa L2-komponen.

Non enterotoksin hemolitik (NHE) Pada tahun 1996 penyelidikan lebih dari 300 strain dari berbagaisumber, termasuk strain dari sejumlah wabah, mengungkapkan bahwasatu kompleks enterotoxigenic diketahui, dengan efek sitotoksik,bisa menjadi agen penyebab di beberapa B.cereus terkait penyakityang bertalian dengan makanan ( Granum et al. 1996). Ini tiga

enterotoksin komponen, bernama NHE, ditemukan setelah wabah diNorwegia (Lund dan Granum, 1996). Meskipun NHE berisi beberapakemiripan struktural untuk HBL kompleks, dan menyebabkan gejalayang mirip dengan yang disebabkan oleh HBL, ia tidak memilikiaktivitas hemolitik dan potensi sitotoksik dari tiga komponen duaberbeda (Lund dan Granum, 1997).

Cytotoxin K Cytotoxin K (CYTK) juga mungkin terlibat masuk B. cereuskeracunan makanan. Racun ini menyebabkan diare berat termasukenteritis nekrotik. Ini terdiri dalam protein toksin tunggaldengan berat molekul 34 kDa Sekitar. CYTK Milik keluarga β-barrelsaluran pembentuk racun (termasuk leucocidins Staphylococcus aureusdan b-toxin Clostridium perfringens). Hal ini nekrotik dan hemolitik(Lund et al., 2000), dan sitotoksik Juga untuk epitel usus (Hardyet al., 2001). Ini pertama kali Ditandai di B. 91-98 cereusregangan: strain diisolasi dari kasus penyakit yang bertaliandengan makanan di Prancis Itu bertanggung jawab atas kematiantiga orang (Lund et al, 2000.). Tak satu pun dari, genenterotoksin lainnya, dijelaskan sebelumnya (hbl dan NHE)terdeteksi pada galur ini, lanjut melibatkan CYTK sebagai faktorvirulensi utama. Namun cytotoxin K Ditemukan pada wabah ini,Muncul menjadi bentuk terkuat Ditemukan sejauh ini. Kemudianpenelitian mendeteksi kurang kuat varian K cytotoxin, Jugabernama cytotoxin atau CYTK seperti K-2, dengan Sekitar 89% asamamino homolog dengan aslinya cytotoxin K (CYTK-1) tetapi 20%kurang beracun pada usus manusia Caco-2 sel dan Vero-sel. Namun,beberapa B. CYTK cereus isolat memiliki gen, (Guinebretiere etal., 2002) Meskipun hanya kehadiran gen mungkin terlibat masukvirulensi tidak cukup untuk memberikan patogenisitas, tingkattranskripsi gen mungkin penting untuk virulensi (Brillard danLereclus, 2004).

Enterotoksin T (Bc-D-THT)

Lain toksin komponen tunggal, enterotoksin T (bc-D-THT) Telahdijelaskan dalam B. cereus (Agata et al, 1995). The bc-D-THTenterotoksin, dikodekan oleh gen BCET, mampu menyebabkanakumulasi cairan di diligasi kelinci ileum loop (Punyashthiti &Finkelstein, 1971), menunjukkan sitotoksisitas terhadap sel Vero(Konowalchuk et al., 1977). Berbeda Disebutkan untuk pertama tigaenterotoksin (HBL, Nhe dan CYTK), belum ditampilkan Berkunjungbc-D-THT terlibat masuk keracunan makanan. Peran enterotoksin inidi keracunan makanan oleh B. cereus masih harus dijelaskan.

3.2.3 Cara kerja dari enterotoksin Dua tiga komponen enterotoksin HBL dan NHE menyajikan modusserupa tindakan (Lund dan Granum, 1997). Menurut VERO-selpercobaan sitotoksisitas dengan ketiga komponen HBL-kompleks yangDiperlukan untuk kegiatan enterotoxic maksimal (Powell, 1987;Rousset dan Dubreuil, 2000;. Belaiche, 2000, Black et al 2005).Itu rasio optimal setiap kegiatan komponen 1:1:1 untuk HBL(Beecher et al. 1995). Model terbaru untuk tindakan HBLdipelajari oleh Beecher dan Lee Wong (1997), disarankan Itu Semuatiga komponen mengikat ke sel target yang mengarah ke lisismereka. Bahkan untuk kegiatan dari ketiga komponen toksin NHEadalah permintaan yang kompleks, Meskipun dalam hal ini rasiooptimal 10:10:01 (NHE-A: NHE-B: NHE-C) (. Lindback et al 2004). Modus aksi cytotoxin K berbeda dari itu dijelaskan untuk keduaHBL dan NHE. Urutan asam amino dari cytotoxin K Itu menunjukkanCYTK milik β-barrel saluran pembentuk protein keluarga: sepertiβ-toksin dari Clostridium perfringens dan α - dan γ - haemolysinStaphylococcus aureus (Hardy et al, 2001.). Gejalanya meliputi lesiepitel parah dan diare berdarah.

3.2.4 Peraturan ekspresi enterotoksin Lebih dari satu sistem regulator telah diidentifikasi menjadipenting dalam B. cereus peraturan virulensi. Regulator transkripsiPlcR (Phospholipase C Regulator) mengambil bagian dalam menguasai

sebagian besar faktor virulensi dikenal di B. cereus: enterotoksin,haemolysins, phospholipases dan protease (Michel dkk 2008). Jugamengatur ekspresi fosfolipase C, kemudian disebut fosfolipase Cregulator (PlcR). Transkripsi PlcR yang autoinduced (Lereclus etal 1996) dan ditekan oleh faktor sporulasi yang Spo0A (Lerecluset al 2000). Untuk menjadi aktif PlcR Dad membutuhkan peptida.papR disajikan sebagai propeptide bawah kendali PlcR, dieksporkeluar dari sel, diproses untuk membentuk peptida aktif selamabaik ekspor maupun dalam medium ekstraseluler, dan ditangkapkembali oleh sel melalui permease oligopeptide sistem OppABCDF(Slamti et al., 2002, Gominet dkk, 2001, Declerck dkk 2007).Dengan demikian, tiga mitra PlcR, OppABCDF Ayah dan berfungsisebagai sistem quorum-sensing. PlcR Mengintegrasikan setidaknyadua kelas sinyal: pertumbuhan sel dan Spo0A diri telah melaluikerapatan sel melalui PAPR (Michel dkk 2008). Namun, Ini Sepertinya Itu sistem lain dapat berinteraksi denganPlcR, dengan asumsi peran dalam mengatur pola ekspresi B. faktorvirulensi cereus. Variabilitas dan kemampuan beradaptasi, adalahkarakteristik penting dari semua organisme Itu memiliki kemampuanuntuk bertahan dan berkembang dalam berbagai kondisi lingkungan;Seringkali faktor virulensi memungkinkan mereka untuk menaklukkanrelung yang berbeda Sepanjang infeksi. Pengakuan sinyal khususdan konversi informasi ini ke respon transkripsi yang spesifik,yang basal untuk mengatasi berbagai situasi lingkungan. Di banyakkasus, sinyal melalui satu hasil sistem dua komponen dalamperubahan terkoordinasi dalam ekspresi beberapa gen siapa produkberperan dalam adaptasi terhadap lingkungan yang khusus. Beberapapenelitian difokuskan pada Pentingnya dua komponen sistemtransduksi sinyal dalam mengendalikan kedua metabolisme danfaktor virulensi di B. cereus (Duport et al. 2006). Salah satufaktor pengendali utama ekspresi gen di B. Selama subtilisfermentasi (Nakano et al, 1997, Cruz Ramos et al, 2000)microaerobic dan aerobik pertumbuhan (Hartig et al 2004) adalahResDE sistem dua komponen, Selain itu mengatur virulensi

Staphylococcus aureus dalam kondisi rendah oksigen (Yarwood etal, 2001) . Homolognya dari B. ResDE ditemukan pada B. subtiliscereus. Itu Menunjukkan Bahwa ResDE, memainkan peran pentingdalam regulasi ekspresi enterotoksin di B. cereus. Sistemregulasi dua komponen Terdiri dari histidin kinase sensor(yield), terikat pada membran sel, dan regulator responsitoplasma (RESD), (Gbr.2). Sinyal yang terkait dengan pembatasanoksigen dibuat oleh Perceived Itu mengalami autofosforilasi padaresidu histidin dilestarikan. Fosforilasi tingkat RESD ditentukanoleh keseimbangan antara kegiatan dari kedua hasil sebagai donorfosfat untuk RESD, dan fosfatase dari RESD terfosforilasi. Di B.membuat cereus strain mutan, penghapusan produksi enterotoksinyang Diamati pada semua kondisi Diperiksa (Duport et al 2006).

Gambar 8 organisasi Gene dari B. wilayah kromosom cereusmengandung resDE. (Duport et al 2006.)

Penelitian selanjutnya dijelaskan regulator redoks lain Itumungkin bertindak secara sinergis dengan ResDE untuk mengontrolfermentasi dan ekspresi gen enterotoksin, menunjukkan itu,meskipun penting, ResDE tidak penting bagi metabolismefermentatif dan ekspresi enterotoksin. Ini regulator transkripsi,yang dikenal sebagai CRP-FNR (fumarat dan regulator reduksinitrat), merupakan anggota dari siklik AMP protein reseptor, dan

memainkan peran penting dalam modulasi ekspresi banyak genmetabolisme di beberapa fakultatif atau bakteri anaerob ketat(Korner dkk 2003). Juga fungsi mereka termasuk pengendalianfaktor virulensi (Baltes et al 2005, Bartolini et al, 2006,Schmiel et al 2000). Selain itu, satu komponen CRP-FNR regulatordikenal untuk bertindak secara terkoordinasi dengan regulator duakomponen homolog dengan ResDE sebagai respons terhadap dua sinyallingkungan: ketersediaan oksigen dan adanya akseptor elektronalternatif. Protein keluarga CRP-FNR, yang Ditandai dengan domainnukleotida-mengikat Itu membentang dari ujung N lebih dari 170residu ke motif struktural helix-turn-helix C-terminal terletak.Urutan C-terminal pendek dengan empat residu sistein mengikutidomain ini DNA-mengikat. Tiga residu Cys dari terminal C inibersama-sama dengan satu residu Cys dari bagian tengah dariprotein untuk mengikat [4Fe-4S] 2 + pusat Itu berfungsi sebagaisensor redoks (Reents et al 2006). Transkripsi hbl dan NHE secaradramatis (90%) turun-diatur setelah percobaan mutasi CRP-FNR diB. cereus strain (Duport et al. 2007).

Produksi utama virulensi faktor hemolisin BL (HBL) danenterotoksin nonhemolitik (Nhe) dalam makanan-borne patogen B.cereus, Tampaknya diatur melalui mekanisme yang kompleks. Sebuahpenelitian terbaru yang dipimpin oleh Esbelin dan rekan (2009)menjelaskan beberapa aspek dari B. cereus peraturan virulensi,Menyarankan interaksi ketat antara tiga sistem dijelaskansebelumnya. Regulator respon langsung RESD ditunjukkan untukberinteraksi dengan daerah promotor dari enterotoksin regulatorgen resDE, FNR dan plcR dan gen struktural enterotoksin NHE danhbl, tetapi dengan afinitas yang berbeda. Selain itu, fosforilasinegara target hasil RESD dalam pola ekspresi yang berbeda. Temuanini menyebabkan kesimpulan Ungkapan enterotoksin dan metabolismefermentasi dapat dikontrol secara terkoordinasi pada tingkattranskripsi. Itu juga jelas mendefinisikan peran ResDE duakomponen sistem, sebagai sentinel mampu merasakan perubahan

redoks, dan mengkoordinasikan tanggapan Itu memodulasi B.virulensi cereus.

3.3 Adanya racun dalam Bacillus spp lainnya. Dalam beberapa kasus, produksi enterotoksin dari spesies non B.cereus telah dilaporkan. Isolat B. circulans, B. lentus, B. licheniformis, B.mycoides, B. subtilis dan B. thuringiensis menunjukkan hasil positifmenggunakan assay RPLA komersial (Bacillus cereus enterotoksinterbalik pasif lateks aglutinasi) untuk mendeteksi komponen L2dari HBL-kompleks (Beattie & Williams 1999). Produksi Toksin olehdua strain lingkungan B. pumilus) dilaporkan oleh Hoult & Tuxford(1991). Produksi racun oleh Bacillus spp. lainnya sebagian besar telahdibatasi pada B. thuringiensis, anggota dari Kelompok B. cereus. Spesies B. thuringiensis, B. anthracis, B. cereus, berbeda dalam 16S rRNAurutan dengan hanya sembilan nukleotida, menyebabkan banyakkesimpulan Bahwa ini bisa dianggap satu spesies (Ash et al.1991). Perbedaan Fenotipik Dalam kelompok ini sangat sedikit,tapi pola patogenisitas berbeda secara signifikan. B. thuringiensis,yang ditandai oleh adanya kristal molekul endotoksin besar yangmembentuk selama sporulasi. Racun adalah serangga spasifik, danbeberapa kelas ini molekul toksin, yang sasaran urutan tertentuserangga, diisolasi (Schnepf et al. 1998). Namun transfer banyakplasmid conjugative antara Bacillus cereus dan B. thuringiensisditunjukkan (Yuan et al., 2007, Van der Auwera et al. 2007). B.cereus dan B. thuringiensis tidak dapat dibedakan secara ketat atasdasar karakteristik biokimia (Carlson et al, 1994 Damgaard et al1996 Yamada et al... 1999). Metode standar untuk mendeteksi B.cereus, gagal membedakan kedua organisme. Damgaard et al. (1996)terisolasi beberapa strain enterotoksin-memproduksi B. thuringiensisdari pasta, roti, dan susu. Perani et al. (1998) menemukan 29%dari strain B. thuringiensis yang diisolasi dari lingkungan yangdihasilkan B. cereus seperti enterotoksin. Dari laporan di atasyang muncul disebutkan bahwa penyelidikan menyeluruh ke mana-mana

gen enterotoksin di berbagai Bacillus spp. belum sampai dilakukan.Sedikit perhatian telah dibayar, baik dalam sistem model ataulingkungan makanan, untuk menilai kondisi itu dapat mendukungekspresi racun isolat non-B. cereus.

4. Bacillus thuringiensis 4.1 Karakteristik umum Bacillus thuringiensis, seperti makanan-borne dan berkesempatanpatogen Bacillus cereus, termasuk Famili Bacillus cereus sensu latu. Padatahun 1901 seorang ahli biologi Jepang, Ishiwata Shigetane,Ditemukan bakteri yang sebelumnya tidak digambarkan sebagai agenpenyebab penyakit pada ulat sutera. B. thuringiensis awalnya Dianggapberesiko untuk pemeliharaan ulat tetapi telah menjadi jantungpengendalian serangga mikroba. Hal ini dapat membentuk sebuahKristal parasporal selama fase stasioner pada siklus pertumbuhandan pada awalnya ditandai sebagai patogen serangga. Pada tahun1956, T. Angus menunjukkan bahwa aktivitas insektisida yangdikaitkan sebagian atau seluruhnya (Tergantung pada serangga)untuk inklusi protein kristal terbentuk dalam proses sporulasi.Pengamatan ini menyebabkan pengembangan bioinsektisidaberdasarkan B. thuringiensis untuk mengendalikan spesies seranggatertentu, terutama di kalangan perintah Lepidoptera, Diptera, danColeoptera. Produksi komersial awal Mulai di Perancis pada tahun1938 dengan nama Sporeine. Pada tahun 1982, Gonzalez dkk.mengungkapkan gen yang mengkode kristal protein dipendam padaplasmid yang ditransmisikan. Schnepf dan Whiteley (1981)merupakan orang pertama yang menandai dan mengkarakterisasi kodegen kristal protein (cry) dari plasmid DNA dari B. thuringiensissubsp. kurstaki HD-1, yang toksik untuk larva tembakau. Bakteri inidengan cepat menjadi kepentingan komersial sebagai alternatifyang bermanfaat atau suplemen untuk pestisida kimia sintetisdalam kehutanan dan pertanian, dan sekarang yang paling luasdigunakan biologis yang dihasilkan agen pengendalian hama. Pada

tahun 1995 bioinsektisida berbasis B. thuringiensis diwakili sekitar2% dari total pasar insektisida global.

4.2 Ekologi dan serotipe B thuringiensis tampaknya menjadi menghuni pada kebanyakanlingkungan (Chaufaux et al, 1997 Martin et al.. 1989). Straintelah diisolasi di seluruh dunia dari berbagai habitat, termasuktanah (Hastowo et al.1992, Martin et al., 1989), serangga(Carozzi et al 1991), debu produk yang disimpan (Burges dkk 1977Meadows. Et al. 1992) . Isolasi biasanya melibatkan pemilihanperlakuan panas untuk spora. Studi pada spora B. thuringiensis secaraterus menerus di laboratorium, lapangan atau hutan lingkunganmengungkapkan bahwa, meskipun penurunan cepat dalam populasi dantoksisitas telah tercatat, spora B. thuringiensis dapat bertahanhidup selama bertahun-tahun setelah penggunaan semprot (Addisonet al. 1993). Untuk identifikasi dan klasifikasi strain H serotipe B. thuringiensis,berdasarkan reaksi imunologi terhadap antigen flagellar bakteri,flagellin, telah ditetapkan sebagai metode mengetik (de Barjac etal. 1962). Saat ini, bermacam-macam strain B. thuringiensisdiklasifikasikan ke dalam 69 serotipe H yang berbeda (Lecadet etal. 1999) dan 13 kelompok sub-antigenik, memberikan 82 serovars,telah didefinisikan sebagai subspesies. Meskipun serotipe adalahmetode yang paling umum digunakan klasifikasi seluruh dunia, iamemiliki keterbatasan karena mencerminkan hanya satukarakteristik dari spesies dan bukti diandalkan sebagai prediktoraktivitas insektisida. Produksi kristal parasporal, yangmendefinisikan kualitas B. thuringiensis, masih terlalu sempitkriteria untuk klasifikasi taksonomi (Lysenko et al. 1983).Keseringan isolasi dari strain serotipe yang sama, beberapastrain baru, memiliki bawaan gen cry yang tidak diketahuisebelumnya, juga menunjukkan bahwa serotype H mungkin tidak cukupuntuk mewakili karakteristik molekul dari spesies B. thuringiensis.

4.3 B. protein Cry thuringiensis Toksin Cry masing-masing individu memiliki spektrum didefinisikandari aktivitas insektisida, biasanya terbatas pada beberapaspesies dalam satu urutan tertentu Lepidoptera (kupu-kupu danngengat), Diptera (lalat dan nyamuk), Coleoptera (kumbang dankumbang) dan nematoda. Isolat alam B. thuringiensis dapat menghasilkan beberapa kristalprotein yang berbeda, kombinasi tertentu protein Cry telahditunjukkan untuk menunjukkan efek sinergis. Di sisi lainspesifisitas target yang berbeda bisa lebih mungkin tidakdiinginkan, (Hofte et al, 1989, Lambert et al. 1992.). Racun awalnya diklasifikasikan menjadi empat kelas menuruthomologi urutan asam amino dan kekhususan insektisida (Hofte etal. 1989). Racun CryI adalah racun bagi lepidopterans, CryIIsberacun bagi lepidopterans dan Diptera, CryIIIs beracun bagicoleopterans, CryIVs beracun bagi Diptera. CryV dan kelas CryVI,ditambahkan untuk racun aktif terhadap nematoda (Feitelson et al.1992). Setiap protoxin baru ditemukan, memperoleh nama terdiridari Cry mnemonic dan empat peringkat hirarkis (terdiri darinomor) (misalnya, Cry25Aa1) Tergantung pada tempatnya dalam pohonfilogenetik (Crickmore et al. 1998). Penemuan berkelanjutan gen toksin B.thuringiensis baru dan cepatterakumulasi informasi tentang kegiatan insektisida mereka telahmendorong pembangunan data pada "khususnya Bt toksin": "spesifikpada data racun Bacillus thuringiensis "Http://www.glfc.cfs.nrcan.gc.ca/Bacillus. Daftar 500 delta-endotoksin dengan nama jalur akses yang sesuai untuk urutanDatabase NCBI, tersedia dalam situs ini, spesifisitas biologisadalah juga komponen nomenclatures asli.

4.4 Mode tindakan B. protein Cry thuringiensis Selama proses sporulasi, sel B. thuringiensis memproduksi inklusikristal parasporal yang mengandung polipeptida (δ-endotoksin).Ini protoxins, plasmid dikodekan oleh gen cry, massa molekul

hadir berkisar 50-140 kDa dan beracun untuk varietas spesiesserangga (Angsuthanasombat et al. 1993). Setelah diminum olehlarva serangga rentan, ini inklusi solubilised dalam lingkunganalkalin midgut dan proteolitik dicerna untuk melepaskan fragmenberacun (Brown et al. 1990). Selama aktivasi proteolitik ini, δ-endotoksin mereka menjalani proteolisis yang luas di kedua C danN termini untuk menghasilkan matang Itu bagian beracun memilikimassa molekul 60 kDa Sekitar. Sebuah proses multistage secaraumum diterima untuk menggambarkan cara kerja dari Cry toksin.Pertama, racun diaktifkan, kemudian melewati matriks peritrofik,mengikat reseptor yang sangat spesifik yang terletak pada membranmicrovillus apikal sel epitel midgut (Bravo et al. 1992 Hofmannetal. 1988). Setelah toksin mengikat reseptor, perubahan dalamkonformasi toksin itu, memungkinkan racun penyisipan ke membran.Mungkin, Menyusul oligomerisasi, yang oligomer toksin menginduksipembentukan pori litik dalam membran epitel midgut Itu Itumenyebabkan lisis osmotik sel, penghentian makan, dan kematianlarva (Sacks et al 1986 Lorence et al.. 1995 ). Mengikat reseptormerupakan faktor kunci dalam kekhususan Cry diaktifkan racunmudah Racun yang aktif berikatan dengan reseptor spesifik diperbatasan sikat apikal mikrovili midgut. Dua serangga yangberbeda Telah Diidentifikasi protein sebagai reseptor untuk racunCry: 120-kDa aminopeptidase N (APN), dari Juga disebut Cry1Acprotein toksin-mengikat, dan 210-kDa cadherin sepertiglikoprotein, disebut Cry1Ab protein toksin-mengikat, masing-masing dimurnikan dari sikat vesikel perbatasan rentan.Glikolipid Serangga ini juga telah disarankan sebagai reseptorpada nematoda (Griffitts et al. 2005). Data terakhir menunjukkanItulah berkorelasi toksisitas dengan mengikat ireversibel Itubisa mencerminkan interaksi ketat toksin dengan reseptor ataumungkin berkaitan dengan penyisipan racun ke dalam membran (Lianget al. 1995).

Gbr.9 modus Usulan tindakan untuk Cry toksin

4.5 Mekanisme transkripsi dari gen cry Ekspresi gen cry yang dianggap sporulasi sebagian besartergantung. Perkembangan sporulasi, dikontrol pada tingkattranskripsi oleh aktivasi selanjutnya σ-faktor, yang mengikat RNApolimerase inti untuk memungkinkan transkripsi dari promotorsporulasi-spesifik. σA merupakan faktor sigma utama selvegetatif, lima faktor yang disebut σH, σF, σE, σG, dan σK,Muncul agar secara temporal diatur Selama pengembangan B.thuringiensis siklus sel. Beberapa promotor gen cry TelahDiidentifikasi, dan urutan mereka Telah ditentukan sebelumnya(Yoshisue et al 1993 Dervyn et al. 1995, Brizzard et al. Tahun1991, Brown et al. 1993.). Urutan konsensus Diakui oleh Bthuringiensis polimerase RNA yang mengandung σE atau σK,ditemukan setelah penyelarasan daerah promoter gen ini (Agaisseet al 1995 Baum et al. 1995.). Hasilnya Itu Kemungkinan akan σEatau σK-dependen. Low-level menangis gen transkrip Telahterdeteksi Juga Selama fase transisi B. thuringiensis siklusbiologis, yang berlangsung sampai timbulnya sporulasi (Poncet etal, 1997 Yoshisue et al.. 1995). Diperkirakan Ungkapan inimungkin dua sampai RNA polimerase σH, dan disarankan Itu Spo0Amerepresi ekspresi ini fase transisi lemah, Ketika sel memasuki

fase sporulasi (Poncet et al. 1997). Salah satu kasus gen cryDinyatakan Selama pertumbuhan vegetatif digambarkan (Malvar etal. 1994 Sekar et al. 1988). The cry3Aa ekspresi gen, terisolasidari B. coleopteran-aktif thuringiensis var. tenebrionisSepertinya To diaktifkan dengan mekanisme non-sporulasi-dependen.The cry3Aa gen promotor, promotor Menyerupai Diakui oleh sigmafaktor utama dari sel vegetatif, σA.

4.6 Pengembangan B. biopestisida thuringiensis Insektisidal B. Pertama produk thuringiensis yang diperdagangkandi Perancis pada akhir 1930-an (Lambert et al. 1992). Pada tahun1995 Badan Perlindungan Lingkungan AS (EPA) terdaftar produk Btberbasis 182, tetapi pada tahun 1999 merupakan kurang dari duapersen dari total penjualan semua insektisida (Carpenter et al.,2001, EPA et al, 2001). Seperti hama serangga telah menjadiresisten terhadap insektisida kimia. Penggunaan Bt telah sangatmeningkat. Seperti dilansir Beegle dan Yamamoto (Beegle et al.,1992), formulasi Bt awal disajikan beberapa masalah.Standardisasi didasarkan pada jumlah spora daripada potensi,produk yang terkandung Sering subsp. thuringiensis potensirendah. Setelah verolyping dari Kurstaki HD-1 oleh Barjac dan Lemille, B.ini supsp thuringiensis. Menjadi dasar bagi produk-produkkompetitif dengan insektisida kimia untuk kinerja dan biaya.Selama bertahun-tahun, semua B. perusahaan hanya menghasilkansubsp thuringiensis. kurstaki. Namun, varietas lain,: sepertiColeoptera-aktif Bt subsp. Tenebrionis (Krieg et al., 1983) dansubsp Diptera-aktif. israelensis (Goldberg et al., 1977), telahdatang untuk digunakan di seluruh dunia untuk mengontrol larvahama. Hari B. thuringiensis subsp. aplikasi israelensis terdiridari hingga 50% dari semua aplikasi insektisida. Karya-karya yangrelevan skrining dan isolasi baru B. strain thuringiensisdilakukan Selama bertahun-tahun, akhirnya mengakibatkan produksi

produk komersial serangga tertentu. Beberapa yang paling seringdigunakan tercantum dalam tabel 2.

DISTRIBUSI DAN EKSPRESI GEN PROFIL KODE UNTUK Bacillus cereus DIenterotoksin Bacillus thuringiensis Strain KEPENTINGAN UMUM

Bab 2 1. Pengantar Bacillus thuringiensis adalah gram-positif, membentuk spora bakteri dimana-mana dikenal untuk menunjukkan aktivitas insektisidaspesifik terhadap serangga tertentu, terutama dalam perintahLepidoptera, Diptera, dan Coleoptera, membentuk kristalparasporal Selama fase stasioner siklus pertumbuhannya: Iniracun, yang disebut protein kristal (protein Cry) atau δ-endotoksin, yang dikode oleh plasmid yang berbeda gen cry-jenis.Banyak gen yang berbeda pengkodean B. endotoksin thuringiensis

Telah diisolasi dan Ditandai. Kekhasan tinggi dari protein Cryterhadap serangga adalah Terutama dua dengan reseptor spesifikdalam usus serangga, yang tidak hadir dalam usus mamalia: Olehkarena Dianggap Racun ini tidak berbahaya bagi manusia. Karenaaktivitas spesifik terhadap serangga dan dampak lingkungan yangminimal, Bacillus thuringiensis digunakan secara luas di seluruhdunia sebagai pestisida di bidang kehutanan dan pertanian sebagaialternatif yang bermanfaat atau suplemen untuk pestisida kimiasintetis (Schnepf et al 1998.): Oleh karena itu dari besarkomersial bunga. Bacillus thuringiensis, seperti bawaan makanan dan manusiaoportunistik patogen B. cereus, Bacillus cereus sensu Milikkeluarga Latu. Hal ini dikenal Itu B. cereus dikaitkan dengan dua bentukkeracunan makanan manusia, muntah dan sindrom diare, mekanismepatogenik dari sindrom muntah adalah contoh khas keracunanmakanan: B. cereus dapat tumbuh dalam konsumsi pangan sebelummemproduksi toksin emetik (cereulide), terhadap panas dan pH yangstabil dodecadepsipeptide melingkar Itu mengganggu produksienergi oleh mitokondria, melewati membran mitokondria danmendorong vakuolisasi sel (Mikkola et al. 1999). Gejala utamaadalah mual dan muntah, mirip dengan gejala Disebabkan olehStaphylococcus aureus enterotoksin (Granum dan Lund, 1997). TheDiarrhoeal syndrome adalah contoh khas dari toxicoinfection,Disebabkan oleh enterotoksin setelah menelan makanan yangterkontaminasi dengan Bacillus cereus, para enterotoksinmempengaruhi lapisan epitel usus kecil menyebabkan terganggunyatransportasi zat terlarut air: hal ini dapat menyebabkan diaredan kram perut Dalam 8-16 jam setelah konsumsi makanan yangterkontaminasi. Setidaknya empat enterotoksin yang berbeda TelahDitandai: tiga-komponen haemolysin BL (HBL), non-hemolitikenterotoksin E (NHE), satu-komponen hemolitik racun CYTK dan bc-D-THT enterotoksin T (Granum dan Lund 1997, Hansen et al., 2003).

The tripartit hemolitik panas labil enterotoksin HBL, adalahproduk dari operon Itu termasuk HBLA, hblD, dan gen hblC, masing-masing yang menyandikan subunit mengikat (B) dan L1 dan L2 litikkomponen (Phelps et al, 2002). Subunit dari B. cereus 41 Bab 2 NHE Juga mencakup dua komponen litik, NH1 dan NH2, dan produk genketiga That Remains uncharacterized. Sebuah enterotoksin ketiga,yang disebut SM-D-THT Telah dijelaskan, merupakan komponenprotein enterotoksin tunggal dengan aktivitas terhadappermeabilitas pembuluh darah, terdiri dari satu subunit 41-kDa:peran yang tepat dari racun ini masih belum jelas dibandingkandengan apa yang diketahui tentang enterotoksin HBL dan NHE.Sebuah enterotoksin keempat, cytotoxin K (CYTK), adalah ons racunkomponen tunggal dilaporkan terlibat masuk ke rumah keracunanmakanan parah Itu Disebabkan kematian tiga orang (Lund et al.2000). Penelitian terbaru Menunjukkan Bahwa penentu yang paling genetikini Telah sering ditemukan tidak hanya di B. strain cereus,tetapi juga masuk B. strain thuringiensis (Gaviria Rivera et al.2000 Hansen dan Hendriksen, 2001), sedangkan toksin emetik, siapasintetase klaster gen terletak pada virulensi pXO1 sepertiplasmid, Telah ditemukan di kedua B. cereus dan B. strainweihenstephanensis (Thorsen et al., 2006), tetapi tidak untuksaat ini di B. thuringiensis (Ehling-Schulz et al., 2006). Metodebiokimia dan morfologi klasik bakteri mengklasifikasikan telahgagal untuk membedakan B. dari B. thuringiensis Yang cereus yangterkait erat dan tidak bisa dibedakan kecuali phenotipically dangenetik Bahwa mantan pelabuhan insektisida plasmid (Schnepf etal, 1997, Logan et al., 1984, Imam dkk. 1988). Namun, transferbanyak plasmid conjugative antara Bacillus cereus sensu Latukeluarga yang Menunjukkan (Yuan et al., 2007, Van der Auwera etal. 2007) khususnya antara B. cereus dan B. thuringiensis dalamtanah, larva serangga, media kultur dan bahan makanan (Battistiet al.1985, Yuan et al., 2007, Van der Auwera et al. 2007).

Meskipun ini pengetahuan, Karena kegiatan yang kuat insektisida,produk perlindungan tanaman berdasarkan strain terpilih B.thuringiensis yang digunakan di seluruh dunia dalam produksibuah-buahan dan sayuran di rumah kaca dan di lapangan. B. Memiliki strain thuringiensis Berkunjung terisolasi daripasta, PAOK roti dan susu (Damgaard et al., 1996), beberapa siap-untuk-makan makanan (Rosenquist et al., 2005), buah-buahan dansayuran (Frederiksen et al., 2006) segar, serta dari kubis untukkonsumsi manusia (Hendriksen dan Hansen 2006), sejak BeberapaTentu ini strain terisolasi tidak bisa dibedakan dari B.komersial thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, ini menyarankanstrain ini mungkin residual dari biopestisida diterapkan dalambidang (Frederiksen et al., 2006, Hendriksen dan Hansen, 2006).Kapasitas bakteri ini membentuk partikel aktif sangat resisten,yang disebut spora, Memungkinkan mereka untuk bertahan hidupdalam kondisi ekstrim, dan Sepanjang garis manufaktur. Dekadeterakhir, Ketika preferensi konsumen telah bergeser ke makananringan olahan, peluang baru muncul untuk membentuk spora patogendan pembusuk 42 Bab 2 organisme. Pelestarian pangan saat ini hanya cukup sukses melawanspora, aplikasi perawatan ringan dalam pengolahan makanan mungkintidak cukup untuk menghilangkan spora Itu dalam kondisi yangmenguntungkan, dapat berkecambah, tumbuh sel-sel vegetatif danmemproduksi beberapa faktor virulensi. Dengan mempertimbangkantemuan ini dan sebelumnya ini pertimbangan, maka bisa dipastikanBahwa kehadiran B. thuringiensis dalam bahan makanan dandampaknya terhadap keamanan pangan masih waran penyelidikan lebihlanjut. Tujuan dari bagian pertama dari penelitian ini adalah isolasistrain B.thuringiensis, Bioinsektisida dari produk komersial,untuk menyelidiki distribusi gen penyandi B. cereus sepertienterotoksin, enterotoksin untuk mengevaluasi profil ekspresi dan

untuk menilai keberadaan protein Sesuai. Kemudian model makanan,nabati, dikembangkan untuk mengevaluasi perilaku B. sporathuringiensis artifisial ditambahkan ke matriks makanan, setelahsimulasi pengobatan industri pengolahan. SEM SEM dan teknik X-raydigunakan untuk mengikuti tren B. thuringiensis siklus biologis,dari spora aktif ke sel vegetatif. Perubahan morfologi dalamstruktur spora-diamati dan dijelaskan secara rinci, pada waktuyang berbeda Selama proses perkecambahan. Dalam rangka untukMencapai informasi lebih lanjut tentang struktur spora internalkami mencoba untuk teknik pelapisan SEM karbon; analisis SEM X-ray digunakan untuk menguji pelepasan kalsium dari DPA B. sporathuringiensis Yang merupakan salah satu peristiwa awal dariproses perkecambahan. 2. Bahan dan metode 2.1 strain bakteri isolasi Strain Bacillus thuringiensis yang Diperiksa dalam penelitian inidiisolasi dari Berikut isecticidal komersial bio-produk: Delfin,BAC, VectoBac DT, Lepinox, Rapax, Jack pot, B 40, Biolarkim 14,Thuricide HPC PRO Dipel. Setelah resuspending dalam air steril, pengenceran desimal bubukinsektisida komersial, BCA berlapis di piring media selektif(Bacillus Cereus Basis Agar), dan diinkubasi pada suhu 30 ° Chingga 72 jam, untuk strain bakteri isolasi. Inklusi kristal yang diamati oleh mikroskop fase kontras dalamsemua produk yang diuji. Untuk semua analisis selanjutnya,B.thuringiensis strain terisolasi dikultur pada Otak JantungInfusion (BHI) broth pada 37 ° C, terus gemetar, atau di BHIpelat agar media pada 37 ° C. 43 Bab 2 2.2 ekstraksi DNA untuk PCR dan REP Untuk persiapan DNA, bakteri terisolasi dikultur pada OtakJantung Infusion (BHI, OXOID) kaldu dan diinkubasi semalam padasuhu 37 ° C, pada gemetar terus menerus. DNA genom untuk sidik

jari dan analisis profil toksin, diekstraksi dari 1,0-ml aliquotbudaya dengan menggunakan FTA Starter Pack (Whatman) Sesuaidengan instruksi dari pabriknya. 2.3 Deteksi protein kristal B. isolat thuringiensis berlapis pada BHI dan kemudian diperiksauntuk kehadiran kristal intraseluler dengan mikroskop fasekontras, setelah pertumbuhan selama 2-3 hari pada suhu 30 ° C.PCR analisis yang yang dilakukan untuk mendeteksi gen toksininsektisida dari semua isolat yaitu X62821 sepasang primer Fupingdilaporkan oleh Song et al. 2003 5'GCTGTCTACCATGATTCGCTTG3 ',5'CAGTGCAGTAACCTTCTCTTGCA3' digunakan untuk mengamplifikasidaerah lestari cry1I-jenis gen, yang Dipla5'CAAGCCGCAAATCTTGTGGA3 'dan DiplB 5'ATGGCTTGTTTCGCTACATC3'primer digunakan untuk cryIV September deteksi gen (Carozzi etal. 1991 ). Amplifikasi adalah dilakukan dalam Mastercycler EpGradient S Eppendorf PCR untuk 32 siklus pada 94 ° C selama 1menit, 52 ° C selama 1 menit, dan 72 ° C selama 5 menit. PCRreaksi campuran ini dielektroforesis pada 0,8% gel agarosa diTAE1X buffer dengan SYBR DNA gel Aman noda (Invitrogen) ®. 2,4 berulang extragenic palindromic urutan DNA (REP) Berulang palindromic extragenic (REP) PCR menggunakan (GTG) 5primer digunakan untuk mengidentifikasi Bacillus thuringiensisisolat pada tingkat regangan. Reaksi REP-PCR adalah dilakukan dalam total volume 25 l dengan10ng DNA, 0.5μM primer dan PCR Master mix (Promega). Amplifikasidilakukan dalam Mastercycler Ep Gradient S (Eppendorf) sebagaiberikut: denaturasi awal pada 95 ° C selama 7 menit, Diikuti oleh30 siklus pada 90 ° C selama 30 detik, 40 ° C selama 1 menit dan65 ° C selama 8 menit , dan perpanjangan terakhir pada 65 ° Cselama 16 menit. Profil hasil pengamatan Menganalisis pada 2% gelagarosa di TAE1X dengan SYBR ® DNA gel Aman noda (Invitrogen) dantangga 100 basis poin (Promega korporasi) dimuat untuk standarberat molekul. 44

Bab 2 2.5 Deteksi gen yang mengkode enterotoksin PCR digunakan untuk mengkarakterisasi profil toksin dari strainBacillus thuringiensis yang diisolasi dari bio-insektisida.Urutan primer yang dijelaskan sebelumnya dalam sebuah penelitianyang dilakukan pada tahun 2001 oleh Hansen dan Hendriksen,digunakan untuk mendeteksi gen penyandi produksi dari masing-masing enterotoksin HBL, NHE dan bc-D-THT. Primer dan kondisidijelaskan oleh Swiecicka dan Mahillon CYTK dipekerjakan untukdeteksi gen, September primer tercantum dalam Tabel 2. AnalisisPCR yang dilakukan dalam total volume 25μL Itu berisi 5NG DNA,0.5μM primer masing-masing dan GoTaq Hijau Master Mix (Promega).Reaksi dilakukan dalam Mastercycler Ep Gradient S (Eppendorf)dengan denaturasi awal dari 5 menit pada 95 ° C, Diikuti oleh 30siklus PCR setiap Terdiri 15 s pada 94 ° C, 45s pada suhu anil(Dinyatakan dalam Tabel 2 untuk setiap pasangan primer ) dan 1menit pada 72 ° C, ekstensi akhir adalah 7 menit pada 72 ° C. PCRreaksi campuran ini dielektroforesis pada gel agarosa 1% di TAE1Xbuffer dengan SYBR ® DNA gel Aman noda (Invitrogen), dan difoto. Tabel 1. Primer ditetapkan untuk deteksi gen B.thuringiensisenterotoxic di strain terisolasi. Untuk HBL dan NHE kompleks,analisis PCR diamplifikasi dilakukan untuk setidaknya dua gen dikedua tiga komponen operon: gen hblC dan hblD untuk toksinhemolitik, dan nheB nheC gen untuk toksin non-hemolitik. Gen Nama Primer SEQ (5'-3 ') Temperatur anil Produk amplifikasi Fw L2A AATGGTCATCGGAACTCTAT-5'-3 ' hblC L2B Rv CTCGCTGTTCTGCTGTTAAT-5'-3 '

52 749pb HBLD-N AATCAAGAGCTGGTCACGAAT-5'-3 ' hblD HBLD-C CACCAATTGACCATGCTAAT-5'-3 ' 51 429pb nheB 1500 S Fw CTATCAGCACTTATGGCAG-5'-3 ' nheB nheB 2269 Rv A ACTCCTAGCGGTGTTCC-5'-3 ' 50 769pb nheC 2820 S Fw CGGTAGTGATTGCTGGG-5'-3 ' nheC nheC 3401 Rv A CAGCATTCGTACTTGCCAA-5'-3 ' 50 581pb BCET-N TTACATTACCAGGACGTGCTT-5'-3 ' BCET BCET-C TGTTTGTGATTGTAATTCAGG-5'-3 ' 53 428pb cytKf GATAATATGACAATGTCTTTAAA-5'-3 ' CYTK cytKr

GGAGAGAAACCGCTATTTGT-5'-3 ' 52 617pb 2,6 persiapan RNA Untuk ekstraksi RNA, strain terisolasi ditumbuhkan semalam padasuhu 37 ° C Otak Jantung Infusion (BHI) broth dalam kondisianaerob, sampai sel mencapai fase stasioner pertumbuhan. Setelahsentrifugasi 1.0-ml aliquot budaya, pelet diobati dengan 2,0 mlRNA Lindungi Bakteri Reagen (Qiagen) solusi dan disimpan padasuhu -20 ° C. Total RNA diekstraksi menggunakan RNeasy kit Mini(Qiagen) Menurut petunjuk produsen. Kuantifikasi RNA totaldilakukan dengan Ultrospec 2100 pro 45 Bab 2 Amersham Biosciences spektrofotometer setelah pengobatanenzimatik dengan DNase (Ambion) selama 30 menit pada 37 ° C. 2.7 Analisis ekspresi racun dengan RT-PCR Terbalik transkripsi (RT) dilakukan dengan menggunakan 1 ng RNAtotal dari Bacillus thuringiensis sel strain komersial. Untukmenguji keberadaan mRNA coding untuk racun gen yang sebelumnyaterdeteksi oleh PCR (hblB - hblC, nheB - nheC, CYTK, BCET),VersoTM 1-Langkah RT-PCR Reddy MixTMKit (Thermo Scientific)protokol yang digunakan. 2,8 uji enterotoksin UC10070 Bacillus thuringiensis var. kurstaki, diuji untukkemampuan untuk produk enterotoksin diare HBL (hemolitik fraksiL2) dengan pasif uji aglutinasi lateks terbalik menggunakan BCET-RPLA racun kit deteksi (Oxoid). Setelah 1% inokulum B. reganganthuringiensis di BHI broth, dan inkubasi pada 37 ° C selama 18jam pada gemetar (250 siklus / menit), budaya disentrifugasi,supernatant adalah steril disaring dan disimpan pada suhu -20 ° Csampai tes dilakukan Mengikuti instruksi produsen ' . 2.9 Produksi Spora

UC10070 Bacillus thuringiensis var. kurstaki, dipilih untukmenghasilkan spora untuk percobaan Setelah dalam penelitian ini.Pertumbuhan dan kepadatan frekuensi sporulasi awalnyaDibandingkan dengan menggunakan Berikut tiga media agar: BHImenengah (OXOID, UK), Susu Peptonised (susu 1% peptonized, 1%dextrose, 0,2% ekstrak ragi, 1,216 mM MgSO4, FeSO4 0.072 Mm, 0139mM ZnSO4, MnSO4 0.118mM). BP menengah (Bacillus Genetika StockCenter, Ohio State University) 0,7% Bactopeptone (Difco), 0,68%KH2PO4, 0,012% MgSO4, 1,7% agar, 1,216 mM MgSO4, FeSO4 0.072 Mm,0,139 mM ZnSO4, MnSO4 0.118mM, Glukosa 0,3%. PH Susu Peptonised dan BP menengah, disesuaikan dengan 7.0 dengangaram KOH ditambahkan pada 55 ° C setelah sterilisasi denganautoklaf. Pelat dengan masing-masing media Dianggap tiga, diinokulasidengan 500μl B. thuringiensis UC10070 budaya semalam, dandiinkubasi selama 4 hari pada suhu 37 ° C. Spora dipanen dandimurnikan dengan pencucian dengan air MilliQ pada suhu 4 ° C. Tanaman spora diperiksa dengan mikroskop fase kontras untukkehadiran sel vegetatif, spora berkecambah, dan puing-puing.Untuk memperkirakan jumlah spora 46 Bab 2 terbentuk, Volume 1-ml suspensi spora kemudian Ditempatkan dalamtabung 1,5 ml, dipanaskan pada suhu 60 ° C selama 20 menit,diencerkan dan disebar pada BHI agar. Koloni-koloni dihitungsetelah 12 jam pertumbuhan pada suhu 37 ° C. 10.2 Model persiapan Makanan Tiga krim UHT komersial berdasarkan lada sayuran, artichoke danbayam, dan satu pasteurisasi Pure, diperparah dari cukini,kentang dan susu, diuji dengan tujuan mengidentifikasi yangterbaik untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme objekpenelitian ini. The UHT krim sayuran komersial (20 ml) yangdibagikan ke tabung steril dan disimpan pada - 20 ° C.

Cukini segar dan kentang, dicuci, dipotong, dikupas, danditambahkan ke susu UHT dengan perbandingan 03:01:01, campuranMemperoleh, Dinamakan CPM, dipanaskan pada 100 ° C selama 15menit, dan dibagikan ke tabung steril dengan tingkat 20 mlsebelum membeku pada - 20 ° C. Sebelum Melanjutkan dengan percobaan, nilai pH dan aw pada empatcampuran sayur tercatat. Setelah inokulum dalam empat matrikssayuran dengan 107 cfu / ml B. sel thuringiensis, kemampuanpertumbuhan B. thuringiensis akan dipantau oleh plat menghitungOtak Jantung Infusion hingga satu minggu penyimpanan pada 4 ° Cdan suhu kamar. 2.11 B. thuringiensis spora uji perkecambahan dalam model makananDalam langkah ini pekerjaan, model CPM diuji untuk B.thuringiensis spora uji perkecambahan. Resep dari model CPM telahdiubah dengan menambahkan agar bakteriologi yang konsentrasi15g / l campuran dicampur, dipanaskan pada 100 ° C selama 15menit, dan kemudian dibagikan dalam 20 ml piring. Setelahpenyebaran 100 l dari 107 cfu / ml B. spora thuringiensis, piringCPM disimpan anaerob dengan Anaerocult ® A foil tas mini danperlakuan panas selama 15 menit pada 70 ° C, untuk mengaktifkanspora. Proses perkecambahan dipantau oleh mikroskop fase kontras:pengamatan yang dilakukan pada spora, tumbuh melampaui spora,vegetatif dan bersporulasi sel: Khususnya pada 10 ', 40', 2 jam,12 jam dan 24 jam setelah aktivasi panas. 47 Bab 2 2.12 Preparasi sampel untuk pemindaian mikroskop elektron (SEM) Sampel untuk pemindaian mikroskop elektron (SEM) disusun sebagaiberikut: bagian persegi sekitar 1 cm setiap sisi model makanansetelah inokulum dengan suspensi spora, diambil dari setiappiring di kali terdaftar sebelumnya Selama proses perkecambahan.Mereka kemudian dehidrasi bertahap dalam etanol 50%, 75%, 95%,dan akhirnya 100%, masing-masing untuk bermalam pada suhu kamar.Pengeringan titik kritis dilakukan dalam CPD030 pengering Baltec.

Ketika lapisan karbon digunakan, spesimen terpasang pada cakramSEM dan dilapisi dengan karbon untuk konduktivitas listrik.Akhirnya, mereka-diamati dengan XL30 ESEM pemindaian mikroskopelektron Philips. Sampel dilapisi emas dibuat seperti dijelaskandi atas dan kemudian spesimen dilapisi dengan emas untukkonduktivitas listrik seperti yang dijelaskan oleh Palumbo et al.(2004). Spesimen Dianalisis bawah kedua rendah dan tinggi vakumSEM kondisi: vakum tinggi 3 x 10-4 Pa, 7000 laju pencacahansebesar 33% waktu mati, waktu tinggal 60 milidetik dan vakumrendah 1,199 x 102 Pa (Bass et al 2008.). 2.13 X-ray Mikroanalisis Perkecambahan spora dipelajari dalam sampel dengan cara X-rayMikroanalisis menggunakan teknik pelapisan karbon untuk persiapansampel: spesimen terpasang pada cakram SEM dan dilapisi dengankarbon untuk konduktivitas listrik. SEM gambar bidang spesimentunggal (mulai dari 1-5μm) diambil. X-ray Mikroanalisis kemudiandilakukan dengan menggunakan Philips XL30 ESEM. Unsur-unsurkalsium, fosfor dan belerang masing-masing dideteksi denganmenggunakan penyebaran energi X-ray Mikroanalisis (EDAX ModelGenesis 2000 XMS 60 SEM, Mahwah, NJ 07430, USA) dan detektor(CDU-UTW Shappire, software genesis SEM). Kondisi berperanBerikut dipertahankan konstan Sepanjang analisis: vakum tinggi 3x 10-4 Pa, 7000 laju pencacahan sebesar 33% waktu mati, waktutinggal 60 msec dan vakum rendah 1,199 x 102 Pa ElemenMikroanalisis digunakan untuk mendeteksi variasi dalam kandungankalsium spora. 3. Hasil 3.1. Karakterisasi B. strain thuringiensis diisolasi Setelah kultur dari produk bio-pestisida komersial Dianggap dalampenelitian ini, total 10 strain Bacillus thuringiensis diisolasi(Tabel 3). Bacillus thuringiensis var. 48 Bab 2

kurstaki H3a 3b hadir di BAC, Delfin, Lepinox, Rapax, Jack Potdan Thuricide HPC; B. thuringiensis israelensis var H: 14 dan 14diisolasi dari Biolarkim VectoBac DT, Bacillus thuringiensis var.kurstaki ABTS-351 PRO dari Dipel DF, Bacillus thuringiensis var.aizawai hadir dalam B40. Semua isolat dikonfirmasi B.thuringiensis, B. Milik Kelompok cereus, karena konten merekadari salah satu protein kristal, divisualisasikan oleh fasekontras mikroskop atau menangis gen, yang dideteksi oleh PCR.Seperti yang diharapkan, dari 10 isolat, 8 strain positif untukmenangis-1IA gen, yang hadir dalam komersial digunakan strain B.thuringiensis subsp. kurstaki dan B. thuringiensis subsp.aizawai. Dalam Penambahan, 2 strain dari 10 B. isolatthuringiensis, Milik serovar israelensis, positif untuk menangis-4 gen (Tabel 3). Profil Diperoleh setelah amplifikasi sekuens DNA berulangpalindromic extragenic (REP-PCR) (Gambar 1) menegaskan isolasitiga B. berbeda thuringiensis serovar dari produk dianalisis: B.thuringiensis var. kurstaki, B. thuringiensis var. israelensisdan B. thuringiensis var. aizawai. Tabel 2. Klasifikasi B. strain thuringiensis yang diisolasi dariproduk bio-insektisida Nama komersial bio-insektisida Strain Nama Serotipe Cry gen Delfin B.Thuringiensis var. kurstaki UC10070 H3a 3b menangis-1IA BAC B. thuringiensis var. kurstaki UC10071

H3a 3b menangis-1IA VectoBac DT B. thuringiensis israelensis var UC10072 H14 cryIV Lepinox B. thuringiensis var. kurstaki UC10073 H3a 3b menangis-1IA Rapax B. thuringiensis var. kurstaki UC10074 H3a 3b menangis-1IA Jack pot B. thuringiensis var. kurstaki UC10075 H3a 3b menangis-1IA B 40 B. thuringiensis var. aizawai UC10076 - menangis-1IA Biolarkim 14 B. thuringiensis israelensis var UC10077 H14 cryIV Thuricide HPC B. thuringiensis var. kurstaki

UC10078 - menangis-1IA Dipel DF DF PRO B. thuringiensis var. kurstaki UC10079 ABTS-351 menangis-1IA . 49 Bab 2 1000500M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mbp Gambar 1. Agarose gel elektroforesis REP-PCR. Tampil adalahB.thuringiensis subsp. kurstaki H3a 3b dari Delfin, Bac, Lepinox,Rapax, Jack pot, (jalur 1, 2, 3, 4, 9), B. thuringiensis subsp.aizawai dari B40 (jalur 8), isolat dibedakan dari strain Dipel(jalur 10), dan B. thuringiensis israelensis var dari VectoBac DTdan Biolarkim dan 14 (jalur 5, 6) 3.2. Deteksi dan ekspresi gen di B. enterotoxic strainthuringiensis diisolasi Analisis PCR menunjukkan Itu Semua B. tersebut strainthuringiensis yang diisolasi dari produk komersial diuji (Delfin,BAC, VectoBac DT, Lepinox, Rapax, Jack pot, B 40, Biolarkim 14,Thuricide HPC DiPelPRO) memendam gen enterotoksin HBL dan NHE,serta gen yang mengkode CYTK dan racun bc-D-THT (Tabel 4). Untuk memperjelas apakah gen enterotoxic tidak hanya hadir tapijuga Dinyatakan dalam medium laboratorium, RT-PCR dilakukan padatiga B. strain thuringiensis setiap Milik serovar berbeda Merekaterisolasi. Semua empat gen beracun mengakibatkan DiperiksaDinyatakan pada kondisi diuji (Tabel 5). Tabel 3. Deteksi gen enterotoxic dengan analisis PCR pada B.thuringiensis isolat. n ° Strain diuji

Serotipe hblC hblD nheB nheC CYTK BCET 5 B. T var. kurstaki H3a 3b + + + + + + 2 B. t var. israelensis H14 + + + + + + 1 B. t var. aizauwai - + + + + + + 1 B. t var. kurstaki ABTS-351 + + + + + + 1

B. T var. kurstaki - + + + + + + 50 Bab 2 Tabel 4. Enterotoxic gen ekspresi B. thuringiensis isolat Dinilaidengan RT-PCR Gen Strain diuji serotipe hblC hblD nheB nheC CYTK BCET B. t. var. kurstaki H3a 3b + + + + + + B. t. var. israelensis H14 + + + + + + B. t var. aizauwai - + + + + + + 3,3 produksi enterotoksin Produksi komponen L2 enterotoksin HBL, yang terlibat di dalamnyasindrom diare, yang Dinilai dalam supernatan B. thuringiensisUC10070 kaldu budaya. Kegiatan-diamati enterotoxic, dilaporkandalam Gambar 2. Deteksi komponen L2 dari hemolisin BL, memberikanhasil yang positif di objek strain studi untuk kondisipertumbuhan diuji. 123456 BCDEFG hLatex controlsensitizedlatex Latekscontrolsensitizedlatex EnterotoxincontrolB. thuringiensisUC10070budaya

Gbr.2 enterotoksin-Terbalik Pasif reaksi aglutinasi lateks. Wellsdari "a" sampai "g" Mengandung pengenceran sampel, baik "h"adalah kontrol negatif. Baris pertama, menunjukkan reaksiaglutinasi positif yang dihasilkan oleh enterotoksin kontrol,yang disediakan oleh kit (kontrol negatif Masing-masing adalah dibaris 2). Respon positif dari lateks peka ditambahkan ke B. Jelasbudaya thuringiensis ditampilkan di baris keempat. 3.4 Pemilihan media sporification dan spora produksi Seperti yang digunakan di seluruh dunia untuk produksi skalabesar bio-insektisida, Bacillus thuringiensis var UC10070.kurstaki, dipilih untuk menghasilkan spora untuk analisisberikut. Percobaan dilakukan untuk mengidentifikasi media terbaikuntuk induksi sporification. Semua tiga media diuji, sporamenghasilkan jumlah tinggi (Tabel 5), sel vegetatif Namun masihterlihat utuh dalam susu Peptonised dan media BHI. DiBertentangan Meskipun jumlah yang lebih rendah Dicapai pada BPagar, hanya sedikit sel vegetatif dan spora berkecambah (kurangdari 1%) yang diamati dalam media ini, Ketika spora 51 Bab 2 tanaman diperiksa oleh fase kontras. Oleh karena itu, spora dariB. UC10070 thuringiensis diproduksi dari sel dibudidayakan di BPdengan inkubasi selama 4 hari pada suhu 37 ° C, MembiarkanMendapatkan suspensi spora 1,5 x108 cfu / ml. Tabel 5. Perbandingan efisiensi pertumbuhan B. strainthuringiensis dalam tiga media. Standar deviasi adalah sebagai berikut: BHI /7.08 E 08, Susu / 1,41 Peptonized E 08, BP / 5,63 E +07. N ° CFU / ml di: Menyiksa BHI Susu Peptonized BP

B.Thuringiensis UC10070 1,22 E 09 2,57 E +08 1,51 E +08 3.5 Pengembangan Model Makanan Dalam studi ini empat jenis sayuran yang berbeda matriks diujiuntuk kemampuan untuk mendukung pengembangan komersial B. Setelahspora thuringiensis dan pertumbuhan sel-sel vegetatif. Analisiskimia dari Faktor utama yang Mempengaruhi pertumbuhan mikroba, pHdan ketersediaan air bebas (aw), memungkinkan pilihan pertamadari model terbaik untuk digunakan untuk analisis. Nilai yangdiamati tercantum dalam Tabel 6. Tabel 6. pH dan aw Dinilai parameter dalam empat sayuran matriks dipertimbangkan. Pepper4.630.97Artichoke5.63 0.94Spinach5.94 0.94CPM 5,95 0.97pH aw Lada krim disajikan nilai optimum aw, sebagai model CMP, tetapipH Tampak terlalu sempit untuk mendukung pertumbuhan B.thuringiensis. Krim artichoke dan bayam Menunjukkan nilai pH yangcocok untuk pengembangan bakteri, tetapi ketersediaan air yangrendah mungkin spora terbatas perkecambahan dan pertumbuhan sel-sel vegetatif. CPM Menunjukkan nilai-nilai optimum untuk keduaparameter dianalisis. 52 Bab 2 B. dinamika pertumbuhan thuringiensis pada sayuran yang berbedaDianggap, dipantau selama seminggu, kurva pertumbuhan diperolehdilaporkan dalam angka 3.a dan 3.b.. Beberapa B. strainthuringiensis dapat tumbuh hingga 55 ° C sementara yang laindapat tumbuh serendah 4-5 ° C. Percobaan dilakukan dalam dua kondisi yang berbeda: suhu permisif(suhu kamar) dan satu lagi membatasi (8 ° C), hanya untuk mengujikemampuan B. UC10070 thuringiensis, tumbuh dalam model makananbahkan pada suhu lemari es. Jelas, perbedaan relevan yang

ditemukan dalam kinetika B. thuringiensis ditentukan dalam setiapkondisi. Hasil menegaskan Itu bisa Berkontribusi suhu kamar dinamikapertumbuhan yang lebih tinggi dari B. thuringiensis, suhuserendah 8 ° C menunda terjadinya pertumbuhan bakteri tetapitidak menangkap B. tersebut thuringiensis siklus biologi, karenadapat diamati oleh meratakan kurva kinetika. Seperti yangdiharapkan CPM menghasilkan yang terbaik untuk mendukungpertumbuhan B. sel thuringiensis, pH rendah, Tampak parameteryang paling membatasi untuk pengembangan mikroorganisme, sepertiyang ditunjukkan oleh kurva kematian sel pada tanaman cabai krim.Pertumbuhan bt dalam model makanan di RT1, 00E +001,00 E E+011,00 +021,00 +031,00 E E E +041,00 +051,00 +061,00 E E E+071,00 +081,00 E 09 T0T 24hT 48hT 72hT 7daysBt UFC /mlartichokepepperspinachCPM A 53 Bab 2 Pertumbuhan bt dalam model makanan di 8 ° C1, 00E +001,00 +011,00E E E +021,00 +031,00 +041,00 E E E +051,00 +061,00 +071,00 E E E+081,00 09 T0T 24hT 48hT 72hT 7daysBt UFC /mlartichokepepperspinachCPM B Gambar 3 Kinetika pertumbuhan B. thuringiensis Diamati dalamempat campuran sayuran yang berbeda pada suhu kamar (A) dan suhukulkas (B). Mengingat temuan di atas, model CPM dipilih untuk mengujikemampuannya untuk mendukung, tidak hanya pertumbuhan sel tetapijuga proses perkecambahan B. spora thuringiensis untuk langkah-langkah berikutnya dari karya tersebut. Resep dari model CPMtelah diubah dengan menambahkan agar bakteriologi untukmengeluarkan matriks di piring dan untuk memfasilitasi penyebaranB. thuringiensis spora suspensi. Perlakuan termal selama 15 'pada70 ° C, dan inkubasi dalam kondisi anaerobik, yang digunakan

untuk mereproduksi, dalam model makanan, bahan makanan industripengolahan yang adalah Dikirimkan, untuk bermain sebagai trennyata perkecambahan spora, perkembangan, dan pertumbuhan seldalam makanan olahan. 3,6 SEM pengamatan proses perkecambahan Untuk mengidentifikasi langkah-langkah penting dari B.thuringiensis perkecambahan, proses tersebut dipantau melaluipemindaian mikroskop elektron (SEM) dan teknik SEM-Xray (Bass etal. 2009) pemanenan sel pada berbagai titik waktu Selamapertumbuhan dalam model CPM makanan. 3.6.1 hasil pelapisan emas Pertama, pengamatan yang dilakukan menggunakan teknik pelapisanemas di bawah kondisi vakum tinggi. Teknik ini memungkinkan kitauntuk melihat perubahan morfologi terbatas pada permukaan B. selthuringiensis dan spora. Spora, Memperoleh seperti diuraikandalam bagian 2.9, 54 Bab 2 yang Ditransfer ke piring CPM dan dipanaskan pada 70 ° C selama15 menit. Aktivasi ini biasanya Diikuti oleh kaskade reaksi Itumenghasilkan perubahan morfologi yang cepat dan signifikan dalamstruktur keseluruhan spora. Pada Gbr.4 ABCD, diperlihatkan spora dorman, dan spora dilapisioleh residu dinding sel (exosporium), exosporium bukanlah bagianuniversal struktur spora tetapi Tampaknya dilestarikan antarapatogen basil dan itu hadir pada anggota B . Kelompok cereus.Spora mantel, menyediakan spora dengan resistensi terhadap enzimlitik eksogen, pelarut organik dan berbagai bahan kimia oksidatif(Driks, 1999;.. Nicholson et al, 2000 Setlow et al, 2000). Parasporal inklusi protein tubuh, yang mengandung protein Cry,yang-diamati (Gambar 5 ABCD). Protein kristal diproduksi Selamasporulasi dan akumulasi baik sebagai inklusi dan sebagai bagiandari mantel spora. Inklusi Parasporal diproduksi oleh hadirterisolasi morfologis jatuh ke dalam tiga kelompok: bulat (Gambar

5 C), belah ketupat (Gambar 5 BD), dan tidak teratur berbentuk(Gambar 5 D). Sepuluh menit setelah kejutan panas di piring, spora serentakdimulai perkecambahan (Gambar 6). Analisis mikroskopis optiksampel Diperoleh pada titik waktu ini, Menunjukkan transisihampir lengkap dari fase-fase cerah untuk spora-sel gelapberkecambah, itu bertepatan dengan masuknya air ke inti, yangterjadi di lingkungan inti sebagian dehidrasi. Analisis mikroskopis SEM mengungkapkan Bahwa setelah 40 menit,lapisan luar spora Mulai larut, untuk memecah spora Mulai lapisaneksternal mereka dan diasumsikan blackberry struktur memanjangsehubungan dengan bentuk bulat spora dorman (Gambar 7). Setelah dua jam dari aktivasi panas, sel meledak pasti keluardari struktur yang tersisa pelindung spora (mantel spora) danmemprakarsai segregasi kromosom, seperti Menunjukkan olehpembentukan septa dan putaran pertama pembelahan sel. Dalam Angka8, diperlihatkan bentuk sel berbentuk bulat. Ini mungkin berasaldari protoplas yang aktivitas litik sel tumbuh melampaui baru,ditandai dengan dinding sel yang lemah. Sel vegetatif matang, bisa-diamati 12 jam setelah aktivasi spora,kepadatan seluler yang tinggi bersama-sama dengan awal autolisisyang diwakili dalam Gambar 9. 55 Bab 2 Gambar 4. Spora dorman B. UC10070 thuringiensis dalam modelmakanan A B C D Gbr.5 protein kristal di B. thuringiensis UC10070 A B C

D 56 Bab 2 Gambar 6 B. spora thuringiensis UC10070 10 menit setelah aktivasipanas 57 Bab 2 3.6.2. Analisis SEM X-ray Hall dan Gupta, 1982; Murr, 1982; Hobbs et al, 1986;. Hiom (1) (1) (7) (7) (6) (6) 223 344 558 899 (10) Sudah ap ofansen Tidak menunjukkan kalsium di dalamnya, seperti Diwakili oleh ABCEdari tempat neon. Ini striggered proses perkecambahan. 58 Bab 2 Kompleks HBL, dua menjadi CYTK dan BCET sebagai gen tunggal, coding untuk cytotoxin K danenterotoksin bc-D-THT masing-masing; Pentingnya sering terjadinyaBCET di B. organisme cereus belum sepenuhnya dipahami, peran CYTKdalam makanan borne disease memerlukan penelitian lebih lanjut,Meskipun baru-baru ini menunjukkan Berkunjung Itu CYTK gen sangatditranskripsikan dalam strain klinis yang bertanggung jawab ataskematian tiga orang (Lund et al, 2000). Uji transkripsi balik,Menunjukkan Bahwa gen beracun terdeteksi oleh PCR, yangDinyatakan dalam semua strain terisolasi; Selain tes aglutinasimemberikan hasil positif untuk komponen L2 dari HBL kompleksberacun di UC10070 B. regangan thuringiensis dianalisis. Sepertiyang dinyatakan sebelumnya para anggota B. Kelompok cereus, yangterkait erat. Studi pada B. cereus, B. anthracis dan B. thuringietingkat tinggi secara kromosom identitas berurutan. Tidakdikonfirmasi makanan ditanggung kasus penyakit yang disebabkanoleh B. thuringiensis Telah belum dijelaskan. Ini, Namun, mungkin

juga dua sampai kesulitan yang dihadapi dalam diskriminasi antaraB. cereus dan B. thuringiens th metode yang dapat diandalkan untuk membedakan dua spesies masihdeteksi nclusions parasporal di B. thuringiensi itu p pelabuhan dan expr bc-D-THT dan CYTK, ada risiko Bahwa tingkat tinggi Organisme inidapat menyebabkan penyakit manusia. Studi terbaru menemukanjumlah tinggi B. organisme cereus-seperti di cucum segar tomat dan sayuran segar lainnya, jumlah dilakukan pada makanansegar untuk dijual di toko-toko ritel Denmark, terungkap Itulebih 104 CFU / g B. strain thuringiensis, 59 Bab 2 dibedakan dari strain komersial dari biopestisida, hadir,blackberry Mungkin tidak dua sampai pertumbuhan organisme, tetapisebagai kontaminan alam atau residu B. insektisida thuringiensis(Rosenquist et al. 2005). Jumlah tinggi signifikan dari B. Jugaorganisme cereus seperti semakin terkait dengan produkdipanaskan, di mana pendinginan tidak setelah memasak dapatmenyebabkan pertumbuhan organisme ini setelah perkecambahanspora. Model CPM diusulkan dalam pekerjaan ini adalah cho pertumbuhan B. sel thuringiensis, Selain itu, model itu ditemukantidak hanya substrat yang sangat baik untuk pertumbuhan seltetapi juga untuk B. thuringiensis spora berkecambah. Denganmenggunakan CPM adalah mungkin untuk mereproduksi tren nyataspora Germin perkembangan, dan pertumbuhan sel, melalui simulasi dari suatubahan makanan industri pengolahan yang adalah Dikirimkan, setelahpengobatan pasteurisasi dan kemasan anaerobik, B. sporathuringiensis yang diaktifkan dari yang melakukan

Yang mengarah ke metabolisme Realise sel vegetatif baru danduplikasi mereka. Temuan ini, bersama dengan profil patogendijelaskan di atas, memberikan bukti Bahwa popularitasPeningkatan makanan dingin dimasak dapat menyebabkan masalahdengan bakteri pembentuk spora: seperti B. cereus dan B.thuringiensis. Untuk lebih menyelidiki pada perubahan morfologiSelama perkecambahan, kami menggunakan teknik SEM, dikombinasikandengan X-ray Mikroanalisis. Metode SEM dapat digunakan untukmengamati morfologi permukaan spora, X-ray Mikroanalisismengizinkan kita untuk membedakan mana yang berkecambah sporadengan Menentukan komposisi kimia mereka (yaitu pelepasan kalsiumDPA). Selain itu, morfologi dan kimia bisa dipelajari secarasimultan, memungkinkan kita untuk mengamati struktur spora ketikamereka memulai proses perkecambahan. Studi kami Menyediakanmetode yang cocok untuk memperoleh pengetahuan baru pada siklusbiologis patogen oportunistik Itu dapat terjadi dalam makananolahan. B. thuringiensis menunjukkan berbagai kekhususaninsektisida terhadap beberapa spesies serangga, yang tergantungpada kekhususan gen delta-endotoksin dikodekan oleh teriakan,Oleh karena itu, racun Cry Sepertinya yang paling menonjol darisejumlah faktor virulensi Membiarkan perkembangan bakteri dalamlarva serangga: blackberry terbaru penokohan Itu telahmenunjukkan protease dan chitinases, dapat berkontribusi untukvirulensi. Karena faktor-faktor ini adalah virulensi untuk mengendalikan hama pertanian biologis, Namun, penelitiankami menunjukkan Pentingnya mempertimbangkan kemampuan bakteriini untuk menghasilkan Juga berbagai racun lainnya dan faktorvirulensi Itu dapat mempengaruhi manusia. 60 Bab 2 61 Penyelidikan tambahan diperlukan untuk memperjelas apakah gentersebut Dinyatakan dalam makanan setelah kontaminasi bakteriatau spora, namun potensi ini enterotoxigenic mempertimbangkan,

serta reputasi B. tidak dapat dipisahkan dari B. thuringiensiscereus pada tingkat kromosom, produsen sayuran dan makananOtoritas bertanggung jawab untuk keamanan pangan, HarusPertimbangkan jumlah B. thuringiensis residu insektisida tersisapada produk setelah panen. Data yang diperoleh dalam penelitianini, menyarankan otorisasi Itu yang memungkinkan pelepasansejumlah besar B. thuringiensis dalam bioinsektisida HarusRevisi, melalui prosedur yang memadai untuk mengevaluasikeselamatan, dan termasuk penggunaan strain enterotoksigenik. TheEuropean Food Safety Authority telah merekomendasikan prosesorItu Harus Pastikan Itu B. cereus tingkat bakteri antara 103 dan105 / g yang tidak tercapai pada hari konsumsi (Eur FoodAuthority Saf., 2005). Ini akan menjadi penting untukPertimbangkan Pernyataan ini harus juga berlaku untuk residukomersial-encoding enterotoksin B. strain thuringiensis.

BAB 3 GENOME WIDE ANALISIS transkriptom DARI Bacillus thuringiensis Hasil perkecambahan spora DAN RACUN DALAM PRODUKSI PANGAN MODEL Bab 3 1. Pengantar Bacillus cereus kelompok sensu lato, membentuk subdivisi yangsangat homogen genus Bacillus dan Terdiri enam Gram-positif,membentuk spora spesies: B. anthracis, B. thuringiensis, B.weihenstephanensis, B mycoides, B. pseudomycoides dan B. cereus.Notorious adalah B. anthracis, penyebab penyakit anthrax Sering-mematikan, dan pada tahun 1877 itu adalah bakteri pertama kaliditunjukkan bertanggung jawab dari penyakit. Makanan patogen B.cereus, merupakan penghuni normal tanah, tetapi dapat teraturdiisolasi dari makanan: seperti biji-bijian dan rempah-rempah:bertanggung jawab dari dua jenis penyakit bawaan makanan yangmenyebabkan muntah atau sindrom diare. Serangga patogen B.

thuringiensis, adalah Pentingnya ekonomi yang besar, yangdigunakan di seluruh dunia sebagai insektisida. Kapasitas bakteri ini membentuk partikel aktif sangat resisten,yang disebut spora, Memungkinkan mereka untuk bertahan hidupdalam kondisi ekstrim dan menempati siklus hidup penuh danlengkap dalam beberapa relung lingkungan yang berbeda (tanah,membusuk bahan organik, permukaan tanaman, serangga dan mamalianyali ). Dalam kondisi menguntungkan, spora dapat berkecambah,kehilangan kapasitas ketahanan mereka, dan tumbuh sel-selvegetatif. Kemahahadiran spora Bacillus di lingkungan Tak pelakmengakibatkan keberadaan spora dalam produk pertanian dan susu.Karena spora yang Mampu menahan sebagian besar teknik pelestariansaat ini diterapkan, mereka bertanggung jawab untuk infeksi,penyakit yang bertalian dengan makanan yang serius dan sejumlahbesar pembusukan makanan (Brul et al, 2006). Spora Bacillusdilengkapi dengan satu set spesifik reseptor perkecambahan Ituterus memantau lingkungan untuk kondisi perkembangan yang tepat:mungkin pertimbangan latar belakang ekologi telah mengakibatkanberbeda dikembangkan set reseptor perkecambahan, tetapi sedikityang masih diketahui tentang siklus hidup bakteri ini .Ketersediaan informasi dengan kemajuan dalam sekuensing genombakteri, alat bantu untuk blackberry diselidiki fitur Bacillus. Perbandingan B. anthracis, B. cereus dan B. genom thuringiensis(Ivanova et al., 2003, Han et al 2006), telah memungkinkan genomskala perbandingan urutan yang berkaitan dengan fisiologi,sporulasi dan virulensi bakteri ini, hubungan genetik yang sangattinggi yang ditemukan, membuat genom diferensiasi berbasis rumitatau bahkan tidak mungkin dan menyebabkan kesimpulan Bahwa tigataksa Harus Dipertimbangkan spesies bakteri tunggal. Meskipunargumen biologis lagi tersedia untuk unifikasi, status spesiesterpisah untuk Bakteri ini Telah dipertahankan Karena fiturpatogen khas mereka, pola patogenisitas mereka berbeda secarasignifikan: faktor virulensi utama B. anthracis dikodekan oleh

dua gen yang terletak di plasmid pXO1 dan pXO2 (Okinaka et al1999). Demikian pula, 65 kristal Bab 3 gen protein yang bertanggung jawab untuk fitur utama toksisitasserangga B. isolat thuringiensis hampir selalu plasmid encoded(Schnepf et al 1998). Gen-gen virulensi B. cereus, adalahkromosom (Guttmann et al, 2000 Ivanova et al 2003). Hubunganevolusi antara semua anggota kelompok belum secara definitifditetapkan, ini penting, tidak hanya untuk memahami evolusivirulensi di B. Kelompok cereus, tapi Juga untuk cepat dan akuratKarakterisasi Organisme ini, yang telah menjadi perhatian ilmiahdan politik Pentingnya Peningkatan dalam beberapa tahun terakhir.B. thuringiensis adalah bakteri Gram-positif umum lingkungan.Seperti anggota lain dari B. keluarga cereus, dapat eksis dalamdua morfologi: sel vegetatif dan spora dorman. Yang paling khasmilik B. thuringiensis, adalah patogenisitas dan produksiinsektisida protein toksin Cry itu terakumulasi dalam sel induksebagai inklusi kristal Selama sporulasi bakteri. Karenaaktivitas spesifik terhadap serangga, formulasi B. sporathuringiensis Telah dimanfaatkan sebagai pestisida, selama lebihdari 40 tahun, untuk mengendalikan hama pertanian dan medispenting. Namun, sebagian besar dari faktor genetik terlibat masukB. cereus terkait penyakit makanan ditanggung, seperti haemolysinBL (HBL), enterotoksin non-hemolitik (NHE), cytotoxin K, dan bc-D-THT enterotoksin, Telah sering ditemukan juga masuk B. strainthuringiensis. Sebagai B. spora thuringiensis bertahan banyaksaat ini diterapkan perawatan pengawetan makanan, mereka dapatbertahan dalam makanan seperti residu biopestisida diterapkandalam bidang (Frederiksen et al, 2006;. Hendriksen dan Hansen,2006). Hanya Metode ketat Telah terbukti mampu menghancurkansemua spora hadir dalam makanan. Oleh karena itu, kehadiran B.thuringiensis dalam bahan makanan dan dampaknya terhadap keamananpangan masih perlu penyelidikan lebih lanjut.

Penelitian dalam tesis ini bertujuan untuk Menjelaskanperkecambahan B. spora thuringiensis dalam makanan nabati. Tujuanpertama dari penelitian ini adalah pengembangan model makanannabati, Yang akan memungkinkan untuk menilai perilaku B. sporathuringiensis dalam makanan, setelah simulasi pengobatan industripengolahan. Genome analisis Transkriptome berbasis microarray,digunakan untuk mengeksplorasi perubahan transkripsi dan memahamimekanisme molekuler di balik proses B. thuringiensis sporaperkecambahan, pertumbuhan dan produksi racun dalam model pangan.Analisis RT-qPCR dilakukan untuk mengukur ekspresi, dalammakanan, dari gen virulensi utama yang terlibat masuk B. cereusterkait makanan ditanggung penyakit. Produksi komponen L2enterotoksin HBL, sindrom diare terlibat masuk Dinilai dalammedium kultur dan dalam model makanan, untuk mengkonfirmasi Itutren HBL mRNA, Dievaluasi dengan RT-qPCR, dan analisismicroarray, menyebabkan beracun 66 Bab 3 biosintesis protein. Transcriptomic Telah Menunjukkan untuk tidakhanya alat yang ampuh untuk mempelajari perkecambahan danperkembangan dari B. spora thuringiensis, tetapi juga metode yangcocok untuk menilai respon lingkungan untuk bakteri patogen dalammakanan. Memperoleh Tanggal, Memberikan pengetahuan dasar barupada kelompok Bacillus cereus. 2 Bahan dan metode 2.1. Strain bakteri, dan kondisi pertumbuhan UC10070 Bacillus thuringiensis var. kurstaki serotipe H3a 3b,dipekerjakan untuk semua percobaan. Strain ini diisolasi dariproduk bio-insektisida komersial di laboratorium kami, BCA denganpelapisan di piring selektif medium agar, pengenceran desimalkomersial bubuk setelah inkubasi pada 30 ° C hingga 72 jam (lihatbagian 2.1, bab 2). Ketegangan kemudian dibiakkan secara rutinpada Otak Jantung Infusion (BHI, OXOID) kaldu pada 37 ° C, padagemetar terus menerus.

2.2 generasi dan kondisi perkecambahan Spore Spora B. UC10070 thuringiensis diproduksi dari sel dikultur dalammedium BP (Bacillus Pusat Bursa genetik, Ohio State University).BP piring diinokulasi dengan 500μl B. thuringiensis UC10070budaya semalam, dan diinkubasi selama 4 hari pada suhu 37 ° C.Spora dipanen dan dimurnikan dengan pencucian dengan air MilliQpada suhu 4 ° C (Nicholson, et al., 1990). Tanaman spora,diperiksa dengan mikroskop fase kontras, bebas (> 99%) dari selvegetatif, spora berkecambah, dan puing-puing (lihat bagian 3.3,bab 2). Suspensi spora disimpan pada suhu -20 ° C untuk digunakandalam analisis selanjutnya. Model CPM dijelaskan dalam bab sebelumnya dipekerjakan untukmemantau proses perkecambahan B. spora thuringiensis dikembangkandalam matriks makanan (lihat bagian 3.4, bab 2). Setelah menyebardengan 100 l B. thuringiensis spora suspensi (107 cfu / ml) padapelat CPM, campuran sayuran diinokulasi dengan anaerobik disimpanAnaerocult ® A foil tas mini dan perlakuan panas selama 15 menitpada 70 ° C, untuk mengaktifkan spora. Proses perkecambahandipantau oleh mikroskop fase kontras: pengamatan yang dilakukanpada spora, tumbuh melampaui spora, sel vegetatif dan berspora. Pada saat yang sama, 1 ml sampel untuk isolasi RNA dipanen denganair garam secara berkala. Sampel yang berputar turunmicrocentrifuge, dan pelet dengan cepat dibekukan dalam nitrogencair. 67 Bab 3 2.6. Konstruksi Microarray Genom B. thuringiensis 97-27 Sv. Konkukian serotipe H34(referensi urutan NCBI: NC_005957 kromosom, plasmid NC_006578 -penjelasan IMG, Doe Joint Genome Institute), dipilih untukhomologi tinggi dengan B. UC10070 thuringiensis, untuk merancangprobe Sesuai dengan 5.197 gen terlihat di duplikat keElectraSenseH 12K Chip microarray (CombiMatrix Corp Seattle, WA).Chip yang digunakan berisi elektroda 12.544 individualdialamatkan dihubungkan oleh sirkuit semikonduktor. Hubungi

bantalan pada array memungkinkan untuk konektivitas listrikdengan perangkat eksternal untuk mengontrol sintesis kustom probeyang unik pada setiap elektroda, dan deteksi elektrokimia denganmicroarray pembaca ElectraSenseH (CombiMatrix Corp, WA). Setiapelektroda memiliki probe DNA yang berbeda di atasnya, dan setiapelektroda dapat dibaca secara elektronik atau fluorescent untukMenentukan tingkat hibridisasi untuk urutan DNA spesifik. Probedirancang menggunakan Probe-CombiMatrix Automated Design Suiteprogram (CombiMatrix Corp, WA) dan dipilih tanpa struktursekunder dan dengan suhu leleh homogen (Tabel 1). Program inimulai desain pada 3'end sampai menemukan oligo penyelidikan yangbaik. Jarak maksimum dari ujung 3 'adalah 1500 bp. Probe Sesuai dengan 5.197 gen B. thuringiensis genom disintesisdi 2 ulangan didistribusikan secara acak pada chip. Probe kontrolnegatif Tiga belas dirancang pada 3 gen Arabidopsis (Tabel 1)disintesis di 30 ulangan didistribusikan secara acak pada chip.13 probe kontrol lonjakan (Ambion, USA) disintesis di 30 ulangandidistribusikan secara acak pada chip. Probe kontrol negatiflainnya yang dirancang pada tanaman, genom bakteri dan fag (Tabel1). Tabel 1. Program desain oligo dan kontrol negatif dirancang padachip Panjang 35-40 oligo Kisaran 80-86 tm 35-60% GC Struct tm 65 ° C (Tm -10 min) Tm X HYB 65 ° C (Tm -15 min) Nbr Oligo 1 Dist 3'-1500 Dilarang (NTP) 5 68 Bab 3 kontrol negatif: Neg_lambda1_1283_35_S

Neg_lambda1 CTGATGCCGTTAACGATTTGCTGAACACACCAGTG Neg_lambda1_1070_35_S Neg_lambda1 AAAACAGCCGCATTATGGGGATCCTCAACTGTGAG Neg_lambda1_847_35_S Neg_lambda1 CTTGTTAACAGCACCGATGCGATCACCGTCATGCG Neg_lambda1_587_35_S Neg_lambda1 GTAATTACGGTGCTGCGCTGGAGAAACAGGGTGTG Neg_lambda1_359_35_S Neg_lambda1 ATCCGATGGTGGACGGCATTCTGCTCGATATGGAC Neg_agro1_1065_35_S Neg_agro1 CGATTTCTCAGGCATATACCAGCTTCGTATGGCTG Neg_agro1_614_35_S Neg_agro1 AATGCGTGTTACCCTGGGATGTTCGTGGAACAACG Neg_agro1_407_35_S Neg_agro1 GAAGACGCGAAGGCAATGGGGAAGACAGTCCTTTG Neg_agro1_192_35_S Neg_agro1 CATGATCGCCACGAACACCAAGCCATTTCATCCGG Neg_bant_349_38_S Neg_bant CCACAAGCATTAACAAATGCAGTTGAGATTTTAGGTGG Neg_lambda4_665_35_S Neg_lambda4 GCGGCTTCCTTTCCATTAACAAACTTTCGCAGTAA Neg_lambda4_348_35_S Neg_lambda4

GAACTTCGTCAACGGAAACAGTTACGCCGATCCGG Neg_lambda4_9_35_S Neg_lambda4 TATCCGGCAGGAAACACTGAATGAATGCACCCGTG Neg_lambda6_866_35_S Neg_lambda6 CAAACACAGACTGGATTTACGGGGTGGATCTATGA Neg_lambda6_647_35_S Neg_lambda6 ATTTTGCTGGGTGGGCTAACGATATCCGCCTGATG Neg_lambda6_290_38_S Neg_lambda6 ATATTATCAAGCAGCAAGGCGGCATGTTTGGACCAAAT Neg_lambda6_89_36_S Neg_lambda6 CCAGACTATCAAATATGCTGCTTGAGGCTTATTCGG NM_129257.2_3147_40_S NM_129257.2 CCGATTCATAGCTTATTTCTGCATGGTTACATTCCAGAAG NM_129257.2_2946_39_S NM_129257.2 AGATAAAGAAAGCATGGTCCTTAAGTATCTCGGAAGCTT NM_129257.2_2701_40_S NM_129257.2 GCACATTTTATGGCTAAAGACACAATGGACCATTTAAACA NM_129257.2_2500_40_S NM_129257.2 GCGTTAGATTTCCTAATATTATTAGTTGCGGGAGCTTGTT Neg_lambda2_992_35_S Neg_lambda2 ACCCTGATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGGCGTAA Neg_lambda2_752_35_S Neg_lambda2 TCGTGTATTCCGGACAGTACGTGGAAAACGGCGTC

Neg_lambda2_528_35_S Neg_lambda2 CACGTATGACCCGACCGACGATATCGAAGCCTACG Neg_lambda2_234_35_S Neg_lambda2 CAAGCCGAAGCATGAAGTGAATCCGCAGATGACCC Neg_lambda2_34_39_S Neg_lambda2 GCAAATGAGCAGAAATTTAAGTTTGATCCGCTGTTTCTG Neg_agro2_848_35_S Neg_agro2 ATGTGAAGCGCGTCCTAAAGGAGGTGAGAGGATGA Neg_agro2_648_40_S Neg_agro2 TGTACGCATACCCTCCATCTACACGATAAATCCGGATGGA Neg_agro2_448_35_S Neg_agro2 GCACAAGAGAAGGCTGTTGCAGACCGTATACGTGC Neg_agro2_248_35_S Neg_agro2 ATTATCTTTTCTTCAAGGCTAGCAAGGTTCTCCCA NM_105969.2_1475_40_S NM_105969.2 TTTGAACCTAAAGCCGATGTGGTGCTAATACATAAACAAT NM_105969.2_1243_40_S NM_105969.2 GCTGGAATCAGGGTACTCACTCATAAATGAACAGAAACTT NM_105969.2_1014_40_S NM_105969.2 ACGAGAAAGATGGTATATCGCGGAAAGATGTTATAAGCAT NM_105969.2_813_40_S NM_105969.2 TGATGAATCTTGCGGATAATCCTACAAGGGTAAGTGTAGG NM_105969.2_610_39_S

NM_105969.2 AGTTATAATGTCTGCAGGAGAGTTGGAATCTGATAGAGC Neg_labmda3_656_35_S Neg_labmda3 TTGCTGCAGGCAAGGTCAACATTCCGGTTGTATCC Neg_lambda5_558_35_S Neg_lambda5 CAATGTTCTGCCTGTTCTGTACGGGGAAATGCGCG Neg_lambda5_260_35_S Neg_lambda5 TAATTCATATTGTTCCCAGAGTCGCCGGGGCCAAG Neg_agro3_619_35_S Neg_agro3 AAGGAGCATCAAAAGACTGCGGTCATCTTTGGGGC Neg_agro3_400_35_S Neg_agro3 GACAACCTGGAGACGATGGACAAACGCTTAACAGC Neg_agro3_180_35_S Neg_agro3 TTATGGCGTCACCGGCCTACTAACTTCGCTCAACC Neg_haedu_403_35_S Neg_haedu GAGATTTTAAATAACGCAATAAGACGCGCGCTACG Neg_haedu_203_38_S Neg_haedu AGCGTTATAATAAAGGCTACACCGGCAACATATTACAG NM_117721.1_3446_35_S NM_117721.1 TCGTTATCGAACTCCCGGTTCCTCTAATGATGATG NM_117721.1_3246_35_S NM_117721.1 CGGATTCTCCGCTGTACGTTTGGAGTTCAGAATGG NM_117721.1_3037_35_S NM_117721.1

GTGGTAAGCCAAGTCATGTTGGTGGTGAGAGAGAG NM_117721.1_2837_40_S NM_117721.1 CATTGAGTGGATTGCGTTTCACAAATTCATTGCTGGAAGA 69 Bab 3 2.7. Isolasi RNA, sintesis cDNA, pelabelan dan hibridisasi Setelah panen dengan air garam, sel-sel tumbuh pada agar pelatCPM, RNA diekstraksi menggunakan RNeasy kit Mini (QIAGEN) Menurutpetunjuk produsen. Sampel lisis adalah yang dilakukan dalaminstrumen FastPrep (MP Biomedicals) dengan pengaturan yangberbeda untuk spora, berkecambah spora dan sel vegetatif: sporadan berkecambah spora diproses tiga kali selama 50 detik setiapdalam pengaturan mesin FastPrep 6,5 m / s menggunakan manik-manikzirkonium , sel vegetatif diperlakukan hanya satu kali selama 40detik pada 6,0 m / s. Sampel RNA disuspensi kembali dalam 40 ml air RNase-bebas dancepat beku pada -80 ° C. Kuantitas dan kualitas ditentukan olehNanoDrop ® ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc) dan analisis padaRNA 6000 Nano LabChip (Agilent Technologies) menggunakan 2100Bioanalyzer (Agilent Technologies). Amplifikasi RNA dilakukan dengan menggunakan MessageAmp ™ II-Bakteri Kit untuk prokariotik RNA (Ambion, USA). The MessageAmpII-Bakteri Kit adalah RNA linear in vitro transkripsi sistemamplifikasi berbasis (Van Gelder et al., 1990) untuk menghasilkandiperkuat RNA (ARNA Juga Biasa disebut RNA atau disalin Crna).Lima ratus nanogram RNA template yang telah polyadenilated setiappoli (A) sampel RNA dikonversi menjadi cDNA menggunakan T7 oligo(dT) primer dan amplifikasi secara in vitro transkripsi untukmensintesis amino alil-dimodifikasi Arna. The dimurnikan ARNA (20g per sampel) diberi label dengan Cy-5 dye, Cy5-ARNA kemudiandimurnikan dan konsentrasi ditentukan dengan menggunakan NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc). Selama reaksifragmentasi, Cy5-ARNA (6 mikrogram per sampel) sudah terpecah-

pecah ke panjang 50-200 basis. The terfragmentasi Cy5-ARNAkemudian dicampur dengan hibridisasi penyangga (6 × SSPE, 0,05%Tween-20, 20 mM EDTA, 25% formamida deionisasi, 0,1 mg / mLdicukur salmon sperma DNA dan 12:04% SDS). Hibridisasi danpencucian dilakukan Dinyatakan oleh CombiMatrix. Slides dipindaidengan Perkin Elmer 4000 XL data mentah ScanArray diekstraksidengan ScanArray ekspres 4.0 dan Microarray Imager (CombiMatrix)perangkat lunak. Penelitian yang dilakukan dalam rangkap tiga (triplikatbiologis). Setiap gen hadir setidaknya dua kali pada slide, sehingga masing-masing sampel hibridisasi dalam rangkap pada microarray yang sama(duplikat teknis). 70 Bab 3 2.8. Mikroarray pengupasan Re-hibridisasi Target RNA berlabel dilucuti dari CombiMatrix microarray 12KMenurut petunjuk produsen dari Kit Stripping CustomArraypengupasan dan re-hibridisasi diulang enam kali untuk setiapmicroarray digunakan untuk total 12 hibridisasi. 2.9. Analisis data microarray Fluoresensi sinyal Cy5 saluran dan pengurangan latar belakangditentukan dengan Microarray Imager software (CombiMatrix Corp).Fluoresensi sinyal tempat masing-masing dihitung sebagaiperbedaan antara rata-rata intensitas pixel dan rata-rata sinyalfluoresensi latar belakang, didefinisikan oleh sekitarnyaintensitas pixel (Heiskanen et al. 2000). Tingkat latar belakangdidefinisikan sebagai sinyal rata-rata kontrol negatif ditambahdua kali dan degradasi deviasi standar mereka. Normalisasi antaraarray dilakukan dengan menggunakan metode normalisasi kuantilmenggunakan perangkat lunak R. Sinyal Normalisasi adalah Log2Berubah dan diferensial Disajikan gen dalam kondisi yang berbedadiuji Diidentifikasi dengan uji satu-way ANOVA untuk p-value<0,05 dan untuk induksi atau represi rasio sama atau lebih tinggi

dari 1 kali lipat. Microsoft Excel digunakan untuk perluasandata, untuk mengontrol kualitas dari data diperkirakan menurutFungsional analisis komponen utama (PCA). Data disaring kemudian Menganalisis menggunakan perangkat lunakViewer Ekspresi Microarray (MEV-TIGR, http://www.tm4.org/mev.html), (. Saed et al, 2003) untuk mengidentifikasi kelompokgen dengan profil transkripsi yang sama, gen secara signifikandiatur dibagi ke dalam cluster dengan pola ekspresi yang berbedadengan menggunakan K-means (MacQueen, 1967). Untuk menghitung kelimpahan mRNA dalam spora dorman, AnalisisSignifikansi mikroarray (SAM) menggunakan kelas satu desain yangdigunakan (Tuscher et al., 2001). Untuk interpretasi fungsional dari aktivitas transkripsi, B.thuringiensis 97-27 Sv. Konkukian genom penjelasan (disediakan diMikroba Genom sistem terpadu pengelolaan data (IMG),http://img.jgi.doe.gov/, US Department of Energy Joint GenomeInstitute (DOE JGI)), yang digunakan. Enam kelompok genfungsional terkait yang Diidentifikasi dan HCL diperintahkan olehhierarchical clustering menggunakan Microarray Ekspresi softwareViewer MEV-TIGR (lihat di atas). 71 Bab 3 2.10 kuantifikasi relatif ekspresi gen enterotoxic Kuantifikasi RNA digunakan untuk semua percobaan, sama disiapkanuntuk analisis microarray seperti dijelaskan di atas (bagian2.7). Sebuah langkah ekstraksi tambahan dilakukan 24 jam setelahaktivasi panas spora dalam model makanan. RT-qPCR dilakukan padainstrumen Light-Cycler dan FastStart DNA MasterPlus SYBR Hijau Ikit (Roche). Perubahan level mRNA dari setiap gen dalam kondisiyang berbeda enterotoxic Dianalisis dinormalkan tingkat mRNA darigen penyandi P1-P4 diatur untuk 16S rRNA. Berbagaioligonukleotida primer set digunakan untuk referensi dan gentarget amplifikasi, ditunjukkan pada Tabel 2. Set primer yangdirancang terhadap urutan nukleotida lengkap, seperti yang

diendapkan pada GenBank, menggunakan Vector NTI 9.0.0 (InforMax,Frederick, MD). Optimum suhu pendinginan untuk setiap primer padabulan September ditentukan sebelum analisis sampel eksperimental.Transkripsi balik dilakukan dengan menggunakan 200 ng RNA DNAbebas, primer acak, dan Transcriptor Pertama Strand Sintesis cDNAkit (Roche), Mengikuti rekomendasi pemasok. Sebuah volume sampel20 l digunakan untuk semua tes kuantifikasi, yang berisikonsentrasi akhir 1X SYBR green PCR Master mix, 0,5 mM primer genspesifik, dan 1 atau 2 Template ml. LightCycler eksperimentalmenjalankan protokol yang digunakan untuk amplifikasi. Sampeldipanaskan pada 95 ° C selama 10 menit sebelum bersepeda selama45 siklus 95 ° C selama 10 detik, 56 ° C atau 57 ° C selama 20 s,dan 72 ° C selama 25 s. Dalam setiap langkah tingkat transisisuhu adalah 20 ° C / s. Sebuah kurva leleh diplot pada akhirmenjalankan setiap diverifikasi kekhususan dari produkamplifikasi. Semua sampel dan standar dijalankan dalam rangkaptiga. Sebelum analisis kuantitatif, kurva standar yang dibangununtuk rumah tangga dan gen target menggunakan cDNA dari akhir logB. sel thuringiensis tumbuh di BHI menengah: pengenceran serialcDNA (1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000) dengan nuklease bebasair yang digunakan untuk menghasilkan kurva standar untuk gentarget serta P1P4, yang meliputi 3-5 lipat di kisaran sampeluntuk menghitung efisiensi tertentu (E) dengan menggunakanLightCycler Software 3.5. Setelah selesai PCR, perangkat lunakLightCycler Menghitung jumlah salinan molekul target denganmemplot logaritma fluoresensi dibandingkan jumlah siklus danmenetapkan dasar sumbu x. Baseline mengidentifikasi siklus dimana sinyal log-linear dapat dibedakan dari latar belakang untuksetiap sampel. Sumbu x titik persimpangan setiap standar yangTerukur dan diplot terhadap logaritma konsentrasi untukmenghasilkan kurva standar. Konsentrasi target urutan dalamsampel ekstrapolasi dari kurva standar. The LightCycler Software3.5. hanya menampilkan kemiringan kurva standar, yang dapatdigunakan untuk menghitung efisiensi dengan menggunakan

72 Bab 3 persamaan E = 10-1/slope. Tingkat ekspresi relatif antara sampelkemudian dihitung sebagai perubahan kali lipat, di mana setiapsiklus PCR Merupakan perubahan dua kali lipat. Tabel 2. Primer set empat gen sasaran enterotoksin digunakanuntuk RT-qPCR Gen SEQ (5'-3 ') Temperatur anil Produk amplifikasi Fw AAATTATTGAACCGGCTGCTC-5'-3 ' hblC nyata Rv TCAATTGCTTCACGAGCTGC-5'-3 ' 57 168pb Fw GCTGGATTCCAAGATGTAATG-5'-3 ' nheC nyata Rv TTGATGCTGAATCATATTCCC-5'-3 ' 57 149pb Fw GAGGATAAAGAACATTTAGACG-5'-3 ' BCET nyata Rv CTGCGTAATCGTGAATGTAG-5'-3 ' 57 159pb Fw CTGGCGCTAGTGCAACATTA-5'-3 '

CYTK nyata Rv GGCGTTGCAGAAGCTTTAAC-5'-3 ' 56 171pb 2:11 uji enterotoksin dalam model makanan Spora B. UC10070 thuringiensis yang ditambahkan ke model CPM padakonsentrasi 106 cfu / g;. Sampel diinokulasi kemudian disimpananaerob dengan Anaerocult ® A foil tas mini dan perlakuan panasselama 15 menit pada 70 ° C, untuk mengaktifkan spora. Pada waktuyang ditetapkan setelah aktivasi panas (40 ', 2h, 12h, 24h) satuvolume larutan natrium klorida (0,85%) ditambahkan ke 10g sampelcampuran sayuran. Setelah homogenisasi, setiap sampeldisentrifugasi (9,000 g) selama 30 menit pada 4 ° C, supernatandisaring dan Analisa untuk kehadiran komponen L2 darienterotoksin diare HBL Menurut protokol BCET-RPLA. 3. Hasil dan diskusi CPM Model (lihat bagian 2.10 dan 3.5, bab 2), diinokulasi denganB. spora thuringiensis digunakan untuk menganalisis mekanismemolekuler di balik proses perkecambahan spora, sel mengatasi danracun produksi dan kemungkinan peran B. thuringiensis padaintoksikasi makanan. B. UC10070 regangan thuringiensis, digunakan dalam penelitian inikarena, untuk digunakan dalam pertanian biologis yang besar untukmengontrol berbagai macam ulat dalam sayuran, tomat, anggur,pohon buah-buahan, buah kiwi dan tembakau, diharapkan makananmungkin terkontaminasi. Spora B. UC10070 thuringiensis diproduksi dari sel dikultur dalammedium pelat agar BP, setelah inkubasi selama 4 hari pada suhu 37° C dalam suspensi spora 1,5 x 108 cfu / ml diperoleh. Model CPMdijelaskan sebelumnya, dipilih karena kemampuannya untukmendukung pengembangan B. thuringiensis siklus biologis, darispora dorman yang ke 73

Bab 3 produksi sel vegetatif, melalui proses perkecambahan. Ini JugaMenyediakan model yang cocok untuk simulasi industri pengolahanbahan makanan yang adalah Dikirimkan, Membiarkan sistem yangefisien untuk menilai perilaku patogen potensial dalam makanan. Untuk mengidentifikasi saat kritis bagi RNA mengekstraksi darisel-sel tumbuh melampaui, proses perkecambahan dipantau oleh SEMdan SEM-Xray teknik (lihat bagian 3.6, bab 2) pemanenan sel padaberbagai titik waktu Selama pertumbuhan dalam model CPM makanan. 3.1 Genome-wide analisis ekspresi gen 3.1.1. Microarray validasi Jumlah ekstraksi RNA dilakukan pada waktu yang berbeda untukMenentukan tingkat B. UC10070 gen thuringiensis diferensialDinyatakan dalam model makanan, Selama perkecambahan spora,perkembangan dan pertumbuhan sel vegetatif. Sampel untuk isolasiRNA dipanen dari spora dorman (SP), setelah 40 menit dariaktivasi panas (GSP), setelah 2 jam Selama proses tumbuhmelampaui (C2h), dan dari sel vegetatif / berspora (C12hr), 12jam dari aktivasi spora. Untuk setiap sampel, sel dipanen dandibekukan dengan cepat, untuk menstabilkan asam nukleat dalamlangkah-langkah yang berbeda dari siklus biologis, metode manik-pemukulan yang dilakukan pada instrumen FastPrep, adalah sistemyang efisien untuk mengekstrak RNA tanpa pengobatan enzimatik:asam nukleat bisa secara efisien diisolasi dari spora, sporaberkecambah dan sel vegetatif. Setelah isolasi, RNA dihitung danintegritas RNA diverifikasi, (lihat gambar 10), nilai jumlahintegritas RNA (RIN) dari 7 hingga 9 diperoleh. Dua bandterkemuka, Sesuai dengan 16S dan subunit 23S rRNA, yang-diamatipada semua sampel pada Bioanalyzer gel (Gambar 10), RNA darispora Menunjukkan satu pita tambahan Sesuai dengan spesies rRNA(Gambar 10-A, Gambar 11. , sampel 1-2-3), sedikit lebih kecildari 23S rRNA normal, seperti dijelaskan Sudah Bacillus subtilisdan Clostridium di novji (Plomp et al. 2007). 74

Bab 3 A B C D Gambar 10 elektroforegram Ringkasan integritas RNA pada setiapwaktu ekstraksi: A = SP, GSP = B, C = C2h, D = C12hr. Gambar 11 RNA integritas Gel Gambar, Diukur dengan 2100Bioanalyzer (Agilent Technologies). Dalam semua sampel Menganalisis ada dua band utama Sesuai dengan16S dan 23rRNA subunit. Band ekstra lebih kecil dari satu 23S, Muncul hanyadalam spora. 75 Bab 3 RNA diisolasi dari setiap kondisi, digunakan untuk mempersiapkanfluorescently berlabel cDNA hibridisasi ke mana disintesis 35-meroligonukleotida slide. Setelah mencuci dan pemindaian, Dataintensitas fluoresensi diekstraksi dan dianalisis. Karena RNAtotal digunakan untuk pelabelan, RNA eksogen dari kontrol negatiftanaman yang digunakan untuk menentukan tingkat latar belakangdan untuk menghilangkan sinyal hibridisasi non-spesifik Selamanormalisasi data. Principal Component Analysis (PCA) dari array diberikanMenunjukkan dalam Grafik 1. Dua komponen utama menjelaskan 60,38%dan 13,26% dari perbedaan. Ekspresi gen ditemukan menjadi sangatdinamis Selama B. thuringiensis siklus hidup dan ditemukan untukmelibatkan sejumlah besar gen. Grafik 1. Distribusi sinyal selama tiga biologi ulangan. Dalamanalisis komponen utama dua dimensi (PCA) 1.646 gen diferensialdinyatakan teridentifikasi dan termasuk dalam cara yang diawasiuntuk membedakan antara 4 kondisi yang berbeda dianalisis. 12bola Merupakan setiap empat ulangan untuk masing-masing kondisi

B. thuringiensis siklus biologis. Spheres dengan warna yang samaMerupakan sampel biologis dari kondisi yang sama (Red = SP, GSP =Orange, Kuning = C2h, Hijau = C12hr.) Dua komponen utama accountuntuk 73,64% dari variasi data (PC1 = 60 , 38%, PC2 = 13,26%). 76 Bab 3 3.1.2. Analisis transkripsi Ekspresi gen ditemukan menjadi sangat dinamis Selamaperkecambahan dan perkembangan dari spora berkecambah, danditemukan untuk melibatkan sejumlah besar gen, yang konsistendengan perubahan metabolik dan morfologi yang relevan Itumenyertai siklus hidup Bacillus. Lipat-perubahan dipekerjakansebagai ukuran signifikansi biologis untuk seleksi gen (Chen etal., 2006). Seperti ditunjukkan pada Tabel 3, empat perbandingandilakukan untuk mengidentifikasi gen diatur Selama tahapan yangberbeda dari B. thuringiensis siklus hidup. Sebanyak 1.646 setpenyelidikan ditemukan secara berbeda Dinyatakan dan termodulasi.Dalam gambar 12 jumlah probe set diferensial Dinyatakan dalamempat perbandingan yang dilakukan diwakili grafis. Tabel 3 .. Jumlah probe diferensial Dinyatakan set dengan minimalperubahan 2 kali lipat dilaporkan sebagai jumlah up-dan genmenurunkan regulasi dimaksud Bila Dibandingkan dengan kondisipertama dengan yang kedua. Perbandingan tercantum dalam kolompertama. 14.299.313 Jumlah regulatedProbe set> 2DOWN regulatedProbe set>2up regulatedComparisonSP GSP24 vs 18 vs 42GSP C2h60 1 612h vs12h150 SP C12hvs 463 613-400-300-200-1000100200300400500600SP vsGSPGSP vsC2HC2H vsC12HC12H vsSPUP-regulatedDOWN-regulated Gambar 12 Representasi grafis dari jumlah probe set diferensialDinyatakan dalam 4 perbandingan dilakukan Selama tahapan yangberbeda dari B. thuringiensis siklus hidup.77 Bab 3

Spora adalah sel aktif metabolismenya dan tanggapan transkripsiadalah dilemahkan. Oleh karena itu, perbandingan antara kontenRNA dari spora dan semua kondisi lain Analisa, Menunjukkanperbedaan dalam kelimpahan mRNA. Ipotehetically, transkripmemiliki peran dalam perkecambahan Sudah hadir dalam spora,ditranskripsikan Selama fase sebelumnya. Kehadiran 299 gen up-diatur dalam "GSP" vs "SP" mencerminkantransfer spora aktif menjadi bentuk yang aktif, itu memulaidengan kaskade proses yang secara bertahap menurunkan strukturpelindung dari spora dan melanjutkan proses seluler dan yangmetabolisme, akhirnya menyebabkan sel vegetatif. Hanya transkrip14 gen, hadir di SP kurang hadir di GSP. Transkrip ini, siapafungsi akan Dijelaskan secara lebih rinci dalam bagianberikutnya, mungkin ditranskripsikan Selama fase sporulasi untukmelengkapi sistem dengan spora adaptasi terhadap kondisilingkungan yang keras dan kode untuk transposase IS660, proteinforespore-spesifik, kecil protein terlarut asam, PAP2 proteinkeluarga, dan protein lain dengan fungsi yang tidak diketahui. Perbandingan antara dua kondisi menengah: seperti "GSP" dan "C2h"Menunjukkan hanya 42 gen diferensial Dinyatakan, temuan inibersama-sama dengan jumlah kecil dari total gen diatur dalam"C2h" vs "C12hr", memberikan bukti transisi besar dalam Selamasel bakteri membutuhkan proses perkecambahan, dan mungkin berartiitu melanjutkan aktivitas metabolik Mengembangkan Selama 40 menitpertama setelah aktivasi spora. 3.1.2. QT-pengelompokan Untuk mengidentifikasi gen co-diatur potensial dan untukmengungkapkan pola temporal ekspresi gen, profil ekspresiindividual dari 1.646 probe set diferensial dinyatakanteridentifikasi sebelumnya, yang dikelompokkan menjadi 5 kelompokgen dengan profil ekspresi serupa oleh K-means (Gambar 14 ). Genyang dibagi dalam jumlah optimal kelompok diungkapkan oleh"Gambar merit" analisis (Gambar 13). Kelompok-kelompok tersebutkemudian diperintahkan oleh waktu berekspresi.

Cluster pertama (Grup 1) kelompok Mayoritas gen, dan terdiri dari824 gen, transkrip yang hadir dalam spora aktif dan menghilangdengan cepat Selama tahap akhir dari siklus biologis. Di clusterkedua dan ketiga (Grup 2, dan 3) dikelompokkan Sekitar 407 gen,ekspresi yang terjadi Selama 40 menit pertama dari prosesperkecambahan. Menurut data yang diterbitkan sebelumnya pada 78 Bab 3 Selama gen Ekspresi temporal Bacillus spp. spora hasil (Keijseret al, 2007), gen pekerjaan rumah tangga penting, pengkodeanterjemahan faktor inisiasi: seperti protein, protein ribosom, danfaktor elongasi, ditemukan dituliskan dalam 40 menit pertamasetelah aktivasi spora dorman, bersama-sama dengan banyakmodulasi tingkat ekspresi mereka Selama perkembangan dan siklusvegetatif. Kelompok 4 terdiri dari 210 gen itu disajikan profilekspresi atas di inisiasi pertumbuhan vegetatif. Sekitar 205 gen,berkerumun di Grup 5, yang kuat modulasi positif dalam waktu yangterjadi antara pertumbuhan vegetatif dan inisiasi fase diam. Gbr.13 Gambar teknik jasa digunakan untuk mengidentifikasi jumlahklaster yang optimal berguna untuk analisis data microarray.Nomor 5 dipilih karena sesuai dengan titik belok 79 Bab 3 Grup 110-1 10-1 Grup 2spore spore40'2h cells12h cellssporespore40'2h cells12h cells10-1 Grup Grup 310-1 4spore spore40'2hcells12h cellsspore spore40'2h cells12h cellsGroup 510-1 sporaspore40'2h sel cells12h Gbr.14 profil ekspresi gen Selama perkecambahan spora danperkembangan. Dengan K-berarti clustering.According pola ekspresigen mereka, gen dikelompokkan menjadi 5 kelompok. Rasio rata-ratalog2 dari gen individu dalam 5 K-means cluster diplot padaberbagai titik waktu (waktu yang berbeda dari siklus hidup dalammodel makanan) di atas nilai rata-rata. Bar menunjukkan standardeviasi dari gen individu dalam 12 K-means cluster

3.1.3. Analisis Transkriptome spora Bahwa dalam perjanjian dengan studi terbaru mengkonfirmasikeberadaan RNA stabil dalam spora, transkrip Sekitar 950 gen yangditemukan untuk hadir dalam spora dorman Selama analisis (Gambar15). Pada 38% Tentu ini mRNA tidak memiliki fungsi diketahui,kelompok terbesar kedua (10%) diperkirakan untuk mengkodekanprotein untuk aminoacids transportasi, karbohidrat, lipid,nukleotida dan kation. The 7% dari transkrip didirikan terdiridari gen yang mengkode enzim transferase, Terutama Milikasetiltransferase (AGAS) keluarga, Terlibat dalam regulasipertumbuhan sel Untuk peran penting mereka dalam 80 Bab 3 perbaikan transkripsi dan DNA (Carrozza et al. 2003). LainnyamRNA diperkirakan untuk mengkodekan untuk aminoasil-tRNAsintetase (7%), produksi energi dan konversi (5%), faktorregulator transkripsi (4%), protein ribosom (30 dan 50 S) bersamadengan 5S, 16S rRNA dan 23S ( 3%), perbaikan DNA (2%), danprotein membran (2,3%). Banyak transkrip Diidentifikasi dalamspora dorman, milik gen Dinyatakan pada tahap akhir pembentukanpra-spora, transkrip sporulasi akhir ditemukan, termasuk gen yangmengkode protein larut asam kecil (SASPs), transposase, proteinforespore khusus, RNA polimerase-σK faktor, dan protein sporulasiuntuk tahap 0, II, III, V (keluarga gen Spoa), para SASPs yangmelindungi DNA Selama dormansi spora oleh kejenuhan lengkap danketat mengikat, mengubah struktur kepada mereka untuk konformasilebih stabil (Setlow, 1995). Penyisipan urutan sepertitransposases ISS, adalah unit kecil DNA Mobile, yang berfungsisebagai situs untuk pengakuan dan pembelahan oleh Tpases dalamreaksi transposisi, mereka memainkan peran penting dalampenyusunan ulang genetik internal genom, Kemungkinan untukmendukung mekanisme adaptasi terhadap ekstrim lingkungan, SepertiMereka dengan pH tinggi atau rendah, suhu tinggi atau rendah,tekanan tinggi, atau salinitas tinggi (Takami et al. 2001). RNA

polimerase faktor σK-faktor memainkan peran kunci dalamsporulasi, karena itu adalah pertama faktor transkripsi kegiatansiapakah sel spesifik, dan set menjadi gerak seluruh kaskadeekspresi gen terkotak. Spo0A gen bertindak baik sebagai aktivatordan represor ekspresi gen Selama tahap awal proses sporulasi(Molle et al. 2003). Di samping, ada semacam transkrip Sudah hadir dalam spora dorman,Itu Tampaknya Diperlukan untuk memasok cepat akan sporaberkecambah: mRNA didirikan untuk protein perkecambahan spora(dikodekan dari Gera operon), protein mantel spora sepertidegradasi dinding sel endopeptidase, glycosyltransferase,terlibat masuk sel biogenesis dinding, dan sistem rehidrasi(seperti aquaporin Z) Harus penting untuk memulai kaskade prosesyang bertahap menurunkan struktur pelindung dari spora danmelanjutkan proses seluler dan metabolisme, akhirnya menyebabkansel vegetatif . 81 Bab 3 SAM Plotsheet untuk spora dorman transkrip-20-10010203040-10-8-6-4-20246810Expected ScoreObserved ScoreSignificant: Nomor950Median positif palsu: 0.471 Salah Penemuan Rate (%): 0.05kekuatan Tail (%): 65,9 if (% ): 105.4 Gambar 15. Analisis statistik mRNA transkrip hadir di B.thuringiensis aktif spora. SAM petak dihasilkan dari "satu kelas"analisis data, menunjukkan distribusi dari 950 gen yang ditemukanmenjadi signifikan untuk Delta = 1.738 Diperoleh dengan arrayyang berpusat pada normalisasi. 3.1.4. Analisis fungsional Dalam rangka untuk memiliki interpretasi fungsional dariaktivitas transkripsi Selama proses perkecambahan danperkembangan, enam kelompok gen fungsional yang terkaitDiidentifikasi menggunakan B. thuringiensis 97-27 Sv. Konkukiangenom penjelasan dan diperintahkan oleh hierarchical clustering(Gbr. 16). Kategori fungsional kemudian dianalisis dalam

kaitannya dengan pola ekspresi mereka seperti yang ditunjukkanpada Tabel 4. Tabel 4. Analisis menduduki gen dengan fungsi yang spesifikSelama perkecambahan, perkembangan, dan pertumbuhan selvegetatif. Secara signifikan menduduki gen dengan fungsi tertentuDinyatakan dalam warna merah, oranye kotak menunjukkan genMewakili signifikan, sedangkan gen yang sedikit termodulasiditunjukkan dengan warna kuning. SPORE SPORE40 ' 2H SEL SEL 12H Transciption-regulasi Transportasi Aktivitas ribosom Biosinthesis dinding sel Perbaikan DNA Kedahsyatan 82 Bab 3 Dinding sel-Peraturan RibosomalactivityTransportTranscriptionbyosinthesisDNA repairVirulence Gbr.16. Pengelompokan hierarkis profil transkripsional gen yangterkait dengan: transkripsi dan regulasi transkripsi,transportasi, aktivitas ribosom, biosintesis membran, perbaikanDNA, dan virulensi. Baris Merupakan waktu poin dari spora untukvegetatif / berspora sel. Merah dan hijau Itu ditunjukkan gendiinduksi dan ditekan, masing-masing. 83 Bab 3 • Transportasi Salah satu yang terbesar secara signifikan menduduki kelompok genfungsional Diidentifikasi, mengkode protein yang terlibat masukpengangkutan berbagai molekul, transporter ABC untuk ion

tertentu, gula, dan senyawa organik lain seperti obat /metabolit, didirikan pada spora Sudah transkrip. Untuk hasil yang efisien dan cepat memasok spora berkecambahdengan metabolit penting, inisiasi langsung dari fungsitransportasi Kemungkinan akan diperlukan. Ekspresi dari glisin betain transportasi protein OpuAB, luasmenyebar dalam sistem sel bakteri untuk perlindungan terhadapkonsentrasi zat terlarut tinggi, mungkin menyarankan osmotik Itupertahanan penting dalam tahap awal perkembangan, sesuai denganpenelitian sebelumnya pada proses perkecambahan (Keijser et al,2007). Gen yang mengkode protein aquaporin ditemukan secarasignifikan diwakili dalam kategori ini: karena ini pori pembentukprotein membran integral, memungkinkan sel-sel bakteri untukefisien mengontrol dan mengatur homeostasis air, penting untukbanyak proses biologi, aquaporins mikroba Kemungkinan untukterlibat masuk dalam Langkah pertama berkecambah, yang memerlukanre-hidratasi cepat sitoplasma seperti yang diusulkan oleh Kruseet al. (2006). Sejumlah besar gen transporter diduga dikodekanmultidrug transporter, dan SMR: seperti BCR / CFLA keluarga, yangtelah diregulasi Selama pertama 40 menit dari hasil, mungkin jugaMenyediakan spora berkecambah dengan resistensi sementaraterhadap kompleks antimikroba. Ekspor aktif Selama tahap awalperkembangan juga dapat Memberikan spora berkecambah denganresistensi sementara terhadap kompleks antimikroba, yang membuatsel-sel resisten terhadap senyawa antimikroba yang berbeda. • Transkripsi dan regulasi Banyak gen yang terlibat di dalamnya regulasi transkripsi untukmemulihkan cepat fungsi sel yang ditemukan untuk hadir di antaraspora Sudah transkrip kolam renang. Sejumlah besar, termasuk genyang mengkodekan protein terlibat masuk regulasi proses biologisyang berbeda dalam menanggapi rangsangan eksternal, contoh adalahanggota TetR, Marr dan Merr (expecially ditemukan di C12hr)keluarga faktor transkripsi (TF), Itu yang Diidentifikasi sebagai

umum keluarga untuk Bacillales, Lactobacillales dan Clostridia(Samadhi Moreno-Campuzano et al, 2006), yang bertanggung jawabuntuk adaptasi cepat bakteri terhadap perubahan kondisilingkungan, termasuk resistensi terhadap senyawa antimikroba yangberbeda dan agen stres oksidatif, mengendalikan ekspresi pompapenghabisan obat . Anggota keluarga protein GntR, 84 Bab 3 Juga ditemukan dalam spora dorman, Menanggapi perubahanlingkungan Mempengaruhi metabolisme karbohidrat dari sel dandapat Memberikan bakteri kemampuan untuk tumbuh di hadapanbeberapa sumber karbon dan ekspresi gen mereka untuk cepatberadaptasi dengan perubahan kondisi gizi (Reizer 1991).Transkrip coding untuk fumarat dan regulator reduksi nitrat CRP-FNR, anggota dari protein reseptor AMP siklik, sedikit up-diaturdalam spora, diketahui memainkan peran penting dalam modulasiekspresi banyak gen metabolik di beberapa fakultatif atau ketatbakteri anaerob, Juga fungsi mereka termasuk pengendalian faktorvirulensi (Baltes et al 2005, Bartolini et al 2006). DalamPenambahan, transkrip RNA polimerase untuk σ-faktor, jenis ECF,gen yang terlibat masuk Itu fungsi kontrol amplop sel (sekresiprotein dan proses transportasi), dalam respon terhadap stresekstra-sitoplasma di B. subtilis dan B. licheniformis (Tina Weckeet al., 2006), dan RNA polimerase faktor σK, bertanggung jawabuntuk ekspresi gen sporulasi-spesifik dalam sel induk, ditemukandi spora dorman. Selama perkembangan dan pertumbuhan sel-selvegetatif, gen yang mengatur kompleks yang terlibat masukreplikasi DNA, transkripsi (DNA polymerase III, DNA-RNApolimerase delta diarahkan subunit) dan translasi RNA, sepertitranskripsi faktor elongasi antitermination protein NusG, baru-baru ini di mana Dinilai fungsi dalam B. subtilis (Yakhnin et al.2008), banyak menduduki. Selama tahap akhir perkembangan, selMuncul untuk mempersiapkan septation, Dinyatakan oleh berlebihdari septation cincin pembentukan regulator Ezra (Jeff Errington,

2001), memberikan bukti Bahwa transisi dari spora aktif untuk selvegetatif aktif tumbuh, Tampaknya menjadi selesai. Transkripuntuk regulator PlcR transkripsi (Phospholipase C Regulator) yangditemukan up-diatur dalam tahap akhir dari pertumbuhan selvegetatif. Dibutuhkan bagian dalam pengendalian faktor virulensiyang paling dikenal di B. cereus (enterotoksin, haemolysins,phospholipases dan protease), (Michel dkk, 2008) bertindaksebagai sistem quorum-sensing. Untuk menjadi PlcR aktifmembutuhkan peptida PAPR, transkrip Yang Apakah Juga ditemukanmenduduki sel vegetatif / berspora. Diperkirakan PlcR Itu dapatmemantau pertumbuhan sel yang melalui Spo0A protein sporulasi,dan densitas sel melalui self PAPR peptida. Transkrip coding untuk sensor histidin kinase regulator respondua komponen, yang ditemukan up-diatur dalam sel vegetatif.Beberapa penelitian difokuskan pada Pentingnya dua komponensistem transduksi sinyal dalam mengendalikan kedua metabolismedan faktor virulensi di B. cereus (Duport et al. 2006). 85 Bab 3 • Aktivitas ribosom Proses perkecambahan Bertempat melalui urutan waktu kejadian-memerintahkan. Distribusi transkrip coding untuk rRNA Itumenunjukkan spora dorman mengandung populasi ribosom atauprekursor ribosom: gen yang mengkodekan 16 S, 5 S, dan 23 Sribosom RNA banyak menduduki, tetapi analisis Menunjukkan jumlahrendah transkrip untuk rRNA kecil maupun besar subunit (30 dan50S). Spore Tampaknya menjadi rusak Juga transkrip untuk proteinribosom (L1-L34, S1-S21), sintesis yang dimulai Selama 40 menitpertama setelah aktivasi Ketika spora tingkat kedua rRNA ribosomdan protein sintesis sangat meningkat. Tingkat transkrip terlibatmasuk proses seluler penerjemahan tetap stabil untuk langkah-langkah selanjutnya dari analisis. • Biosintesis dinding sel

Analisis pola ekspresi gen yang mengkode protein yang terlibatmasuk biosintesis dinding sel, Mengungkapkan distribusi melimpahdi spora dorman mRNA untuk enzim transpeptidase (D-Alanyl-D-alanin protein keluarga carboxypeptidase) Itu cross-link rantaipeptidoglikan untuk membentuk dinding sel yang kaku danglycosyltransferase, terlibat masuk sel biogenesis dinding,banyak usaha Telah diajukan untuk identifikasiglycosyltransferases Karena Pentingnya mereka untuk sintesisdinding sel matriks polisakarida: enzim yang terlibat masuk jugapenting adalah transportasi gula nukleotida Karena potensi untukmemanipulasi komposisi dinding sel melalui kontrol tingkatsubstrat (David M. Gibeaut dkk. 2000). • Perbaikan DNA Sejumlah gen perbaikan DNA umum aktif Dinyatakan Selama selvegetatif / berspora (12H) sel. Ini transkrip tertentu masihmelimpah di spora dorman mana Kemungkinan untuk mengerahkanfungsi mereka pada perkecambahan spora. Pada saat yang samatranskrip dari gen penyandi protein yang terlibat masukblackberry kegiatan perbaikan yang spesifik dapat ditemukan dalamspora dorman. Perbaikan eksisi nukleotida, dan DNA perbaikanprotein RADC, Itu seharusnya terlibat di dalamnya perlindunganterhadap spora kondisi yang keras dan merusak lingkungan X danUV-Setelah iradiasi (Felzenszwalb et al. 1986). DNA spora dormandiyakini berada dalam keadaan supercoiled, memberikanperlindungan terhadap kerusakan. Aktivitas helikase dari RuvBHolliday persimpangan, dan metionin gamma-liase, MenunjukkanSelama tahap awal perkecambahan, mungkin Diperlukan untukbersantai cepat 86 Bab 3 DNA supercoiled Membiarkan suatu reaktivasi efisien transkripsi,Kemungkinan setelah degradasi parsial SASPs yang melapisi danmelindungi DNA Selama spora yang tidak aktif. •

Kedahsyatan B. thuringiensis awalnya ditandai sebagai patogen serangga, danaktivitas insektisida yang telah dikaitkan dengan kristalparasporal dikodekan oleh gen cry dikenal. Dalam bab sebelumnya hasil kami menunjukkan B. Itu thuringiensismenunjukkan satu set gen yang mengkode faktor virulensi umumuntuk patogen oportunistik B. cereus. Ini set gen termasuk hbloperon (hblCDBA) Itu kode untuk enterotoksin hemolitik, dan tiganon-hemolitik enterotoksin gen nheABC, mana yang Dianggap sebagaifaktor utama dalam diare B. cereus keracunan makanan. ApalagiBCET gen coding untuk enterotoxinT, fungsi yang tidak dipahamidengan baik dan gen CYTK coding untuk hemolitik citotoxin K.Terakhir ini Pertama Diidentifikasi ke B. cereus ketegangan daridalam kasus penyakit bawaan makanan dan bertanggung jawab ataskematian tiga orang (Lund et al., 2000). Juga satu saluranmembentuk tipe III hemolisin dan sistem pertahanan lainnya tidakberbahaya bagi manusia, seperti phospholypase, ditemukan di keduaB. cereus dan B. thuringiensis. Dalam percobaan microarray nilai intensitas probe khusus untukoperon baik hbl dan NHE, dan gen BCET, tidak Dianggap signifikandengan analisis data statistik. Gen yang mengkodekan delta-endotoksin (cry1Ia), cytotoxin K, haemolysin tipe III, dankemungkinan phospholipases, ditemukan dimodulasi Selama B.thuringiensis siklus biologis, transkrip untuk enterotoksin selprotein dinding-mengikat, ditemukan harus diatur secarasignifikan juga. Dari analisis profil transkripsi Bahwa itudisarankan untuk gen yang terkait virulensi, yang diregulasiterutama Selama tahap akhir pertumbuhan sel. Namun analisis RT-qPCR dilakukan untuk memvalidasi tanggal ini dan untukmemperjelas pola ekspresi nyata dari gen virulensi utama dalam B.thuringiensis. Seperti ditunjukkan dalam gambar 17, transkrip pengkodean untuktoksin kristal insektisida (Cry1IA gen) aktif terhadap spesiesserangga dari ordo Lepidoptera, ditemukan sangat Peningkatan

kerangka waktu antara 2 dan 12 jam setelah aktivasi spora.Karakteristik umum dari gen menangis adalah ekspresi merekaSelama fase stasioner, dalam banyak kasus, sintesis δ-endotoksindan sporulasi erat digabungkan. Ini δ-endotoksin, disintesissebagai protoxins, diproduksi dalam jumlah besar Selama sporulasidan dikemas dalam inklusi intraseluler. Teriakan transkripsibanyak gen (misalnya, cry4Aa, cry4Ba, cry11Aa, cry15Aa, dll.)Apakah Kemungkinan untuk menjadi ekspresi σK-tergantung danteriakan Semua ini 87 Bab 3 Oleh karena itu gen Dianggap sporulasi tergantung (Schnepf et al1998). Namun, dalam penelitian kami, transkripsi gen di B. cry1IAthuringiensis terdeteksi Selama fase transisi, bahkan tanpaadanya melimpah σK RNA polimerase transkrip. Studi DilaporkanBahwa transkripsi tingkat rendah dari cry4A, cry4B, dan cry11Agen di B. thuringiensis, mungkin untuk dua polimerase RNA lainnyaσ faktor, TELAH TERDETEKSI Selama fase transisi, yang berlangsungsampai timbulnya sporulasi (Poncet el al 1997 Yoshisue et al.1995.). Masuk 2 cry1IA ratioCy5/Cy3C12hC2hGSPSP Grafik Gbr.17 untuk rasio Ekspresi gen dari spora (SP) ke selvegetatif (C12hr) gen Cry1IA, coding untuk δ-endotoksin diB.thuringiensis Hasil kami mengungkapkan Itu CYTK aktivasi transkripsi dari gen,pengkodean untuk cytotoxin K, mulai cukup awal Selama B. siklussel thuringiensis: setelah hanya 40 menit setelah aktivasi spora(Gambar 18), overekspresi gen yang CYTK Diamati. Tanpa diduga,dalam kerangka waktu antara SP dan GSP, CYTK transkrip Tampaknyasedikit diatur, mungkin dua sampai transkripsi gen Selama fasesporulasi, Mengakibatkan sedikit akumulasi transkrip di CYTKspora. Cytotoxin K pertama kali Ditandai di B. cereus regangan391-98, strain diisolasi dari kasus penyakit yang bertaliandengan makanan dan bertanggung jawab atas kematian tiga orang(Lund et al., 2000), yang menarik, tidak ada, gen enterotoksin

Umumnya dijelaskan lainnya (misalnya hbl dan NHE ) terdeteksipada galur ini, lanjut melibatkan CYTK sebagai faktor virulensiutama. Dalam produksi in vitro B. cereus seperti enterotoksin,yang mulai Teramati Ketika jumlah total adalah sekitar 107 cfu /ml, jumlah yang tersedia lebih lama biasanya ditemui dalam(akhir) fase pertumbuhan eksponensial (Maria Lucas wijnands,2008). Mengingat Kenaikan kuat CYTK transkrip ditemukan setelah40 menit dalam model makanan, orang bisa berasumsi Bahwa 88 Bab 3 produksi enterotoksin Terjadi segera setelah. Selain itu, kuatup-regulasi gen terlibat masuk memulihkan aktivitas metabolikdidirikan dalam kondisi GSP, dan jeram perubahan morfologi,dengan teknik SEM Diamati Selama dua jam pertama setelah aktivasispora (bagian 3.6, bab 2), Itu bisa diatur B.thuringiensisUC10070 siklus total biologis, dalam model makanan berkembanglebih cepat, dari media laboratorium. Bacillus cereus dikenal untuk menghasilkan beberapa hemolysinsekstraseluler, termasuk hemolisin tipe III, Dianggap sebagaifaktor potensi virulensi dari patogen oportunistik. Studi di B.cereus aktivitas hemolisin III disarankan Itu Bertindak sebagaihemolisin pori pembentuk Itu menunjukkan aktivitas in vitro padaeritrosit manusia. Selama analisis kami B. thuringiensistranskrip untuk hemolisin tipe III, yang ditemukan mendudukiexpecially dalam tahap akhir dari pertumbuhan sel (Gambar 18),seorang Meningkatkan ringan tetapi masih signifikan dari tingkattranskripsi, yang diamati segera setelah 40 menit pertama Selamaperkecambahan. cytKLog2 ratioCy5/Cy3C12hC2hGSPSPhemolysintypeIIIgeneLog2 ratioCy5/Cy3C12hC2hGSPSPGrafik Gbr.18 untuk rasio Ekspresi gen dari spora (SP) ke selvegetatif (C12hr) CYTK gen, coding untuk cytotoxinK, dan homologdi B. cereus hemolisin gen coding untuk tipe III. Transkrip coding untuk kemungkinan enterotoksin sel proteindinding-mengikat, yang ditemukan diekspresikan pada tahap akhir

pertumbuhan (2-12 jam), ini bisa menunjukkan Kemungkinan Bahwasel diaktifkan untuk memproduksi protein komponen enterotoxickompleks di kemudian tahap sporulasi. Tingkat signifikan ekspresi gen CYTK dan faktor virulensi terkaitgen lain (tipe III hemolisin, enterotoksin sel protein dinding-binding), Diamati Selama siklus biologis B. thuringiensis,memberikan bukti patogenisitas manusia yang potensial dari 89 iniBab 3 mikroorganisme, yang mungkin memiliki kemampuan untukmenghasilkan racun yang dikenal untuk terlibat masuk makananborne disease. 3.2 enterotoksin profil ekspresi gen Penggunaan teknologi microarray untuk menilai tingkat ekspresigen sekarang tersebar luas, Namun, untuk mengevaluasi kinerjaekspresi gen tertentu dan memvalidasi hasil, mRNA teknikkuantisasi independen microarray, tetap menjadi elemen yangdiinginkan. Mengingat ekstensif menggunakan B.thuringiensisUC10070, di bidang kehutanan sebagai pestisida pertanian, ituTampaknya penting untuk memperdalam diselidiki dalam modelmakanan tingkat ekspresi gen yang mengkode faktor virulensiterlibat masuk keracunan makanan dengan menggunakan kuantifikasirelatif ekspresi gen enterotoxic (RT- qPCR) teknik. RNA totaldari sampel yang sama digunakan untuk microarray Transkriptomeanalisis, digunakan untuk kuantifikasi relatif untuk mengevaluasihblC, nheC, BCET dan tingkat mRNA CYTK, B. Selama thuringiensisdalam makanan model siklus hidup. Pada tabel 5 dilaporkan sebagairasio normalisasi, ekspresi relatif gen target dalam sampel tes,yang ditentukan dengan menggunakan Apakah tingkat mRNA yang tidakdiatur P1-P4 gen (pengkodean untuk 16S rRNA) sebagai normalisertersebut. Dalam model makanan, mRNA racun terdeteksi dalam jumlahbervariasi, diteliti pada semua tahap pertumbuhan B. UC10070thuringiensis, termasuk 40 menit pertama setelah aktivasi termalspora. Kita bisa mengamati toksin Ekspresi itu B. Selama mulaicukup awal thuringiensis siklus biologis dalam model pangan;

Namun tingkat mRNA, untuk semua empat gen dianalisis, ditemukanuntuk Meningkatkan Khususnya dalam waktu Sesuai dengan 2 jamsetelah aktivasi spora (C2h) dengan pengecualian CYTK. Daripengamatan kami sebelumnya, C2h sesuai dengan fase log awal B.Pertumbuhan thuringiensis dalam model makanan: perkembangan selselesai dan pembelahan sel pada tingkat maksimum (lihat bagian3.6 Bab 2). Dengan demikian, pada magang ini, sebagian besar genterlibat masuk aktivitas metabolik yang menduduki analisismicroarray. Secara keseluruhan, dua kinetika ekspresi yang berbeda-diamati(Gambar 19): transkrip toksin tripartit hblC nheC dan menyajikanekspresi maksimum pada C2h, dengan nilai masing-masing tiga kalilipat dan dua kali lipat lebih besar maka dalam berkecambah spora(GSP). Ketika sel-sel memasuki akhir log / fase diam dini (C12hr)menurunkan tingkat mRNA untuk Kedua gen. Pada Bertentangan,transkrip Sesuai dengan CYTK dan gen BCET, menimbulkan blackberrysecara bertahap mencapai ekspresi maksimum pada C12hr (BCET) danC 24 (CYTK). 90 Bab 3 Orang mungkin hipotesa Itu produksi besar dan awal hblC dan nheCdua sampai waktu yang dibutuhkan untuk perakitan protein tigakomponen HBL dan NHE, Dibandingkan dengan CYTK dan bc-D-THT, duaracun komponen tunggal. Meskipun tidak ada informasi tentang B.Ekspresi toksin cereus dalam makanan yang tersedia, studi tentangB. enterotoksin produksi cereus dalam kaldu, laporan Bahwatingkat toksin tertinggi Dicapai Selama log / budaya fasestasioner awal ditanam untuk terlambat, dan itu tidak adaPeningkatan yang signifikan dalam produksi toksin Terjadi Selamafase diam penuh dan akhir (John L. McKillip 2000). Analisis kamidalam makanan, menunjukkan tingkat yang lebih tinggi transkripSelama fase log tidak dilaporkan untuk media laboratorium.Menurut temuan sebelumnya, tidak ada Kenaikan yang signifikandalam ekspresi toksin terjadi Selama fase diam penuh dan akhir

kecuali untuk CYTK mRNA. Dengan demikian, pola ekspresi CYTKBerbeda dari tren menunjukkan lain dalam fase stasioner padalevel transkrip lebih besar dari log / fase diam awal terlambat.Relatif kuantifikasi ekspresi CYTK, mengkonfirmasi tren DiamatiSelama analisis microarray. Jumlah ekspresi toksin dalam B. cereus tergantung pada mediakultur, serta faktor ekstrinsik,: seperti pH, aerasi, dankehadiran dan konsentrasi karbohidrat tertentu (John L. McKillip2000): Bahwa kami menemukan mengkonfirmasi kehadiran pati,sebagai bahan dalam makanan Model dijelaskan dalam penelitianini, Cenderung untuk mendukung produksi enterotoksin seperti yangdijelaskan sebelumnya di B. cereus oleh Garcia-Arribas & Kramer(1990). Tabel 5: kuantifikasi relatif ekspresi gen virulensi SelamaB.thuringiensis siklus biologis dalam model makanan. m: nilaimedia eksperimen rangkap tiga dan sd: standar deviasi. Gene (s) Kuantifikasi ekspresi gen virulensi Selama B. thuringiensissiklus biologi GSP C2h C12hr C24h m sd m sd m sd m hblC 0.69 ± 1.85 2.70 ± 0.72 1,65 ± 1,85 1.24 ± 4.28 nheC 05.01 ± 0.83

2.17 ± 1.88 1,2 ± 1,6 01:22 ± 02:00 CYTK 0.69 ± 2.26 0.93 ± 2.27 1,42 ± 12:56 1.72 ± 1.61 BCET 0.93 ± 0.72 01:37 ± 0.81 01:52 ± 0.65 01:38 ± 01:44 91 Bab 3 Virulensi ekspresi gen pattern00, 511,522,53 perubahanhblCnheCcytKbceTFold dalam mRNA levelGSPC2hC12hC24h Gambar 19. Istograms Merupakan pola ekspresi gen virulensi dalamkondisi yang berbeda dianalisa Selama B. thuringiensis siklusbiologis. Perubahan tingkat mRNA untuk hbl, NHE, CYTK dan genBCET dalam kondisi pertumbuhan anaerob dalam model makanan,dihitung dalam kaitannya dengan tingkat mRNA untuk setiap targetgen dalam kondisi pertumbuhan aerobik dalam media BHI. 3.3 uji enterotoksin dalam model CPM Produksi komponen L2 enterotoksin HBL, yang terlibat di dalamnyasindrom diare, yang Dinilai dalam model CPM diinokulasi denganspora B. UC10070 thuringiensis. Analisis dilakukan pada 40 ', 2h,12h dan 24h dari aktivasi spora, untuk mengkonfirmasi Itu trenHBL mRNA, Dievaluasi dengan RT-qPCR, menyebabkan beracunbiosintesis protein. Waktu Sesuai dengan kondisi spora, tidakDinilai Karena Dianggap sebagai keadaan tidak aktif secarametabolik. Kegiatan enterotoksin-diamati dilaporkan dalam Angka20, AB. Tidak ada reaksi aglutinasi lateks ditemukan hingga 40menit setelah perkecambahan induksi dengan perlakuan termal

(baris pertama). Pendeteksian komponen L2 dari hemolisin BL,memberikan hasil yang positif pada pengenceran pertama darisampling yang dilakukan 2 jam setelah aktivasi spora (bariskeempat). Sampai dengan 24 jam setelah awal B. thuringiensissiklus biologis, komponen racun TELAH TERDETEKSI. Pengamatan ini,dalam perjanjian dengan pola transkripsi dilaporkan dalam bagiansebelumnya, Menunjukkan kuat sebagai Kenaikan hblC ekspresi gen,ditemukan dalam waktu yang Sesuai dengan dua jam setelah aktivasipanas spora, menyebabkan produksi toksin langsung. Dalam studitentang karakterisasi hemolisin BL, masa pertumbuhan 5 sampai 6jam digunakan untuk produksi rutin in vitro enterotoksin (Beecherdan Lee Wong, 1994;. Dietrich et al 1999). Data kami menunjukkanbahwa dalam food model proses penerjemahan terjadi hanya setelahdua jam 92 Bab 3 93 aktivasi spora. Mengingat temuan ini atas mengasumsikan kita bisaItu B. thuringiensis dapat menyelesaikan seluruh siklus hidupdalam sistem makanan dan menghasilkan enterotoksin Sudah sepertiMenunjukkan dalam kultur laboratorium.40'2h12h24h123456789101112a BCDEFG hsensitizedlatex Latekscontrolsensitizedlatex controlsensitizedlatex Latex Latex Latexcontrolsensitizedlatex kontrol A B 01234567two kali lipat dilutionsC24hC12hC2hGSPL2 enterotoksinHBL komponen productionL2 enterotoxincomponent Fig.20A.Enterotoxin-Terbalik Pasif reaksi aglutinasi lateks.Wells dari "a" sampai "g" Mengandung seri pengenceran dua kalilipat dari sampel, baik "h" adalah kontrol negatif. Reaksiaglutinasi dilakukan pada model makanan artifisial terkontaminasidengan B. UC10070 spora thuringiensis, sampling dihasilkan untuk40 '(baris 4), 2h (baris 7), 12h (baris 10), 24h (baris 12) sporasetelah aktivasi. Hasil diklasifikasikan sebagai (+), (+ +) yang

Dianggap positive.B. Orizontal istograms melaporkan L2 komponenenterotoksin B. Selama produksi thuringiensis siklus biologis.Pada x abs dilaporkan supernatan pengenceran 1: tidak diencerkan,2. pengenceran 1:02, 1:04 3.dilution, 4. pengenceran 1:06, 1:085.dilution, 6.dilution 1:8, 7.dilution 01:16. BIBLIOGRAPHY Alexander V. PNAS 2008 Yakhnin, Helen Yakhnin, dan Paul BabitzkeFungsi Bacillus subtilis transkripsi faktor elongasi NusG dihairpin-dependent RNA polimerase berhenti di pemimpin trp. Bart J. F. Keijser, Alex Ter Beek, Han Rauwerda, Frank Schuren,Roy Montijn, Hans van der Spek, 1 dan Stanley Brul AnalisisTemporal Ekspresi Gen Selama Bacillus subtilis perbenihan Sporedan perkembangan J Bacteriol. Mei 2007, 189 (9): 3624-3634. Baltes, N., M. Ndiaye, I. D. Jacobsen, A. Maas, F. F. Buettner,dan G. F. Gerlach. 2005. Penghapusan regulator HlyX anaerobikmenyebabkan berkurang kolonisasi dan ketekunan Actinobacilluspleuropneumoniae pada saluran pernapasan babi. Menginfeksi. Imun.73:4614-4619. Bartolini, E., E. Frigimelica, S. Giovinazzo, G. Galli, Y. Shaik,C. Genco, J. A. Welsch, D. M. Granoff, G. Grandi, dan R.Grifantini. 2006. Peran FNR dan FNR-diatur, gen fermentasi gulapada infeksi Neisseria meningitidis. Mol. Microbiol. 60:963-972. Beecher, D.J. Lee dan Wong, A.C. (1994) Peningkatan pemurnian dankarakterisasi hemolisin BL, yang hemolitik dermonecrotic vaskularfaktor permeabilitas dari Bacillus cereus. Infeksi dan Imunitas62, 980-986 Brune I. Repertoar individu dan umum regulator transkripsi DNA-mengikat Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens,Corynebacterium diphtheriae dan Corynebacterium jeikeiumdisimpulkan dari urutan genom lengkap. BMC Genomics. 2005; 6:86 Carrozza, MJ, Utley, RT, Workman, JL, dan Cote, J. (2003). Fungsiberagam kompleks asetiltransferase histone. Tren Genet. 19, 321-329.

Catherine J. Savesona dan Susan T. Lovett Tandem UlangiRekombinasi Diinduksi oleh Replikasi Cacat Fork di Escherichiacoli Membutuhkan Faktor Novel, RADC Genetics, Vol 152, 5-13, Mei1999 Copyright © 1999 Chen N, Stein LD: Konservasi dan makna fungsional topologi gendalam genom Caenorhabditis elegans. Genome Res 2006 16:606-617 Daniela Belanda, Fabrizio Cappa dan Pier Sandro Cocconcelli.Akombinasi teknik SEM dan X-ray Mikroanalisis untuk mempelajari proses perkecambahan sporaClostridium tyrobutyricum Penelitian Volume Mikrobiologi 160, Edisi 5, Juni2009, Halaman 322-329 David M. Gibeaut dan Nicholas C. Carpita Dinding Sel Biogenesisdi Sel Utuh dan Tanaman Perputaran Selektif dan Perubahan larutdan Dinding Sel Polisakarida dalam Fisiologi Tanaman Rumput97:551-561 (1991) Dietrich, R., Bung, C., Strich, S. dan Märtlbauer, E. (1999)Produksi dan karakterisasi antibodi monoklonal terhadap hemolisinBL kompleks enterotoksin yang diproduksi oleh Bacillus cereus.Terapan dan Mikrobiologi Lingkungan 65, 4470-4474. 94 Duport, C., A. Zigha, E. Rosenfeld, dan P. Schmitt. 2006. Kontrolekspresi gen enterotoksin dalam Bacillus cereus F4430/73 ResDEMelibatkan sistem sinyal redoks-sensitif transduksi. J.Bacteriol. 188:6640-6651. Elisabeth Kruse, Norbert dan Ralf Uehlein Kaldenhoff Theaquaporins Genome Biology 2006, 7:206 (doi: 10.1186/gb-2006-7-2-206) E. Schnepf, N. Crickmore, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, J.Feitelson, D. R. Zeigler, D. Dan H. Dean Bacillus thuringiensisdan yang pestisida kristal protein Mikrobiologi Dan BiologiMolekuler Ulasan September 1998 P. 775-806 Vol 62, No 3 Frederiksen K. et al. (2006). Terjadinya Bacillus thuringiensiskontaminan alami dan residu insektisida Bacillus thuringiensis

berbasis pada buah-buahan dan sayuran segar. Terapan danMikrobiologi Lingkungan 72, S. 3435-3440 Garcia-Arribas ML & Kramer JM (1990) Pengaruh glukosa, pati, danpH pada pertumbuhan, enterotoksin dan haemolysin produksi olehstrain Bacillus cereus terkait dengan keracunan makanan daninfeksi non-gastrointestinal. Intl J. Makanan Microbiol. 11: 21-34

Gordon, R. E., W. C. Haynes, dan C. H.-N. Pang. 1973. GenusBacillus. Pertanian handbook no. 427. Amerika Serikat DepartemenPertanian, Washington, DC Guttmann, D. M., dan D. J. Ellar. Tahun 2000. Perbandinganfenotipik dan genotipik dari 23 strain dari Bacillus cereus yangkompleks untuk pilihan dikenal dan diduga B. faktor virulensithuringiensis. Janin Microbiol. Lett 188: 7-13. Han, C. S., G. Xie, J. F. Challacombe, M. R. Altherr, S. S.Bhotika, D. Bruce, C. S. Campbell, M. L. Campbell, J. Chen, O.Chertkov, C. Cleland, M. Dimitrijevic, N. A. Doggett, J. J.Fawcett, T. Glavina, L. A. Goodwin, K. K. Hill, P. Hitchcock, P.J. Jackson, P. Keim, 2006. Analisis urutan Bacillus cereuspathogenomic dan Bacillus thuringiensis isolat terkait eratdengan Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 188:3382-3390. Hansen, B. M., dan N. B. Hendriksen. 2001. Deteksi Bacilluscereus enterotoxic dan strain Bacillus thuringiensis dengananalisis PCR. Appl. Lingkungan. Microbiol. 67:185-189. Heiskanen, MA, Bittner ML, Chen Y, Khan J, KE Adler, JM Trent,dan PS Meltzer (2000). Deteksi amplifikasi gen dengan hibridisasigenomik untuk microarray cDNA. Kanker Res 60: 799-802. Helgason, E., O. A. Økstad, D. A. CAUGANT, H. A. Johansen, A.Fouet, M. Mock, I. Hegna, dan A.-B. Kolstø. Tahun 2000. Bacillusanthracis, Bacillus cereus, dan thuringiensis-satu Bacillusspesies berdasarkan bukti genetik. Appl. Lingkungan. Microbiol.66:2627-2630.

Hideto Takami, Chang-Gyun Han, Yoshihiro Takaki, dan EiichiOhtsubo Identifikasi dan Distribusi Urutan Penyisipan Baru diGenome Alkaliphilic Bacillus halodurans C-125. Journal ofBacteriology, Juli 2001, hlm. 4345-4356, Vol 183, No 14 Ivanova, N., A. Sorokin, I. Anderson, N. Galleron, B. Candelon,V. Kapatral, A. Bhattacharyya, G. Reznik, N. Mikhailova, A.Lapidus, L. Chung, M. Mazur, E. Goltsman, N. Larsen, R. Overbeek,dan N. Kyrpides. 2003. Urutan genom Bacillus cereus dan analisiskomparatif dengan Bacillus anthracis. Alam 423:87-91. 95 J. B. MacQueen (1967): "Beberapa Metode untuk klasifikasi danAnalisis Pengamatan multivariat", Prosiding 5-th BerkeleySimposium Matematika Statistik dan Probabilitas, Berkeley,University of California Press, 1:281-297 Jeffery Errington, Richard A. Daniel, dan Dirk-Jan Schefferssitokinesis di Bakteri Mikrobiologi dan Biologi Molekuler UlasanMaret 2003, hal. 52-65, Vol 67, No 1 John L. McKillip Prevalensi dan ekspresi enterotoksin di Bacilluscereus dan Bacillus spp lainnya., Sebuah tinjauan pustaka.Antonie van Leeuwenhoek 77: 393-399, 2000. Maria Lucas wijnands - 2008. Bacillus cereus makanan bornedisease terkait aspek kuantitatif penilaian eksposur dan bahayakarakterisasi Tesis Wageningen University, Wageningen, Belanda -Dengan ringkasan dalam bahasa Belanda - 175p. Lund, T., DeBuyser, M.-L. & Granum, P. E. (2000). Sebuahcytotoxin baru dari Bacillus cereus Itu dapat menyebabkanenteritis nekrotik. Mol Microbiol 38, 254-261 Michel Gohar1, Karoline Faegri, Ste'phane Perchat1, SolveigRavnum, Ole Andreas Økstad, Myriam Gominet, Anne-Brit Kolstø,Didier Lereclus The PlcR Virulensi Bacillus cereus regulon PLoSONE 3 (7): e2793. DOI: 10,1371 Molle V, Fujita M, Jensen ST, Eichenberger P, Gonzalez-Pastor JE,Liu JS, Losick R (2003) The Spo0A regulon Bacillus subtilis. MolMicrobiol 50: 1683

Nicholson, W. L., dan P. Setlow. 1990. Sporulasi, perkecambahandan perkembangan, hal. 391-450. Dalam C. R. Harwood dan S. M.Cutting (ed.), metode biologi molekuler untuk Bacillus. JohnWiley & Sons Ltd, Chichester, Inggris Raya. Okinaka, R. T., K. Cloud, O. Hampton, A. Hoffmaster, K. Hill, P.Keim, T. Koehler, G. Lamke, S. Kumano, D. Manter, Y. Martinez, D.Ricke, R. Svensson, dan P. Jackson. 1999. Urutan, perakitan dananalisis pXO1 dan pXO2. J. Appl. Bacteriol. 87:261-262. Plomp, M., McCaffery, JM, Cheong, I., Huang, X., Bettegowda, C.,Kinzler, KW, Zhou, S., Vogelstein, B. dan Malkin, A.J. (2007)Spore arsitektur lapisan Clostridium novyi NT spora. J Bacteriol189, 6457-6468. Poncet, S., E. Dervyn, A. Klier, dan G. Rapoport. 1997. Spo0Amerepresi transkripsi gen toksin Bacillus thuringiensis menangisdalam. Mikrobiologi 143:2743-2751. A. Reizer Analisis glukonat (gnt) operon Bacillus subtilis. MolMicrobiol. 1991; 5:1081-1089. Saeed, A. I., Sharov, V., Putih, J., Li, J., Liang, W.,Bhagabati, N., Braisted, J., Klapa, M., Currier, T., Thiagarajan,M. et al. (2003). TM4: gratis, sistem open-source untuk manajemendata dan analisis microarray. Biotechniques 34,374 -378. Samadhi Moreno-Campuzano1, Sarath Chandra Janga2 dan ErnestoPérez-Rueda Identifikasi dan analisis faktor transkripsi DNA-mengikat dalam Bacillus subtilis dan-Firmicutes pendekatangenomik BMC Genomics lainnya tahun 2006, 7:147 doi: 10.1186/1471-2164-7. Schnepf, E., N. Crickmore, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, J.Feitelson, D. R. Zeigler, dan D. H. Dean. 1998. Bacillusthuringiensis dan protein kristal pestisida nya. Microbiol. Mol.Biol. Rev 62:775-806. 96 97 Setlow, P. 1995. Mekanisme untuk pencegahan kerusakan DNA padaspora spesies Bacillus. Annu Rev Microbiol 49:29-54.

Tina Wecke, Birgit Veith, Armin Ehrenreich, dan Thorsten Mascheryour Envelope Respon Stres di Bacillus licheniformis:Mengintegrasikan Genomics Perbandingan, Profiling transkripsi,dan regulon Pertambangan Untuk Menguraikan Kompleks PeraturanJournal Jaringan Bakteriologi, November 2006, hlm. 7500-7511, Vol188, No 21 Tusher, V.G., Tibshirani, R., dan Chu, G. (2001). AnalisisSignifikansi mikroarray diterapkan pada respon radiasi pengion.Proc Natl. Acad. Sci USA 98, 5116-5121. Van Gelder RN, von Zastrow ME, Yool A, Dement WC, Barchas JD, danEberwine JH (1990). Amplified RNA disintesis dari KuantitasTerbatas heterogen cDNA. PNAS 87: 1663-1667. Yoshisue, H., K. Ihara, T. Nishimoto, H. Sakai, dan T. Komano.1995.Expression dari gen untuk protein kristal insektisida dalamBacillus thuringiensis: cryIVA, tidak cryIVB, ditranskripsi olehRNA polimerase mengandung H dan Sigma Sigma Itu mengandung E.Janin Microbiol. Lett 127:65-72. BAB 4 Inaktivasi Virulensi PENELITIAN DAN PENGATURAN SISTEM DALAMBacillus spp. Bab 4 1. Pengantar Pada bakteri patogen, produksi faktor virulensi menggunakanberbagai jenis proses regulasi dan Sering diatur dalam menanggapiperubahan dalam lingkungan sel bakteri. Pada bakteri Gram-positif, proses ini mungkin melibatkan sistem dua komponen,faktor sigma alternatif, atau regulator transkripsi yang berdirisendiri. Dalam beberapa kasus, tiga mekanisme regulasi bertindakbersama-sama, masing-masing mengendalikan bagian dalam produksifaktor virulensi. Situasi ini ditemukan misalnya dalam aureusagen infeksi nosokomial Staphylococcus, di mana lebih dari 40permukaan sel atau disekresikan protein, terlibat masuk virulensibakteri, dikendalikan oleh jalur kompleks Melibatkan regulatortranskripsi akan, dua komponen regulator Agr dan umum stres

respon regulator SIGB (Novick 2003). Pada beberapa spesies lain,sebagian besar faktor virulensi dikendalikan oleh masterregulator, yang karena itu adalah anggota regulon yang sama.Regulons virulensi mungkin termasuk sejumlah besar gen: misalnya,regulon PrfA dari bawaan makanan Listeria monocytogenes patogentermasuk 73 gen terletak pada kromosom (Milohanic et al 2003). Identifikasi strain Bacillus cereus Mampu menyebabkan gangguangastro-intestinal, diperumit oleh mekanisme reputasi yangmengarah ke infeksi yang berbeda dan kompleks. Karakterisasi genyang mengkode racun diarrhogenic, tampaknya tidak cukup untukmanajemen risiko yang terkait dengan spesies yang berbeda. Tidaksemua strain di mana gen Diidentifikasi, menunjukkan kemampuanyang sama untuk menyebabkan penyakit. Diasumsikan Bahwa faktorgenetik lainnya, sistem: seperti regulator faktor virulensiekstraseluler, mungkin dasar untuk aktivitas patogen panduandalam Bacillus cereus dan Bacillus spp lainnya .. Tujuan daribagian dari pekerjaan adalah perolehan blackberry pengetahuandalam mengatur mekanisme virulensi dalam genus Bacillus. ResDE sistem dua komponen ini dikenal sebagai salah satu faktorpengendali utama ekspresi gen katabolik dalam fermentasi (Nakanoet al, 1997, Cruz Ramos et al, 2000), microaerobic, danpertumbuhan aerobik (Hartig et al 2004) Bacillus subtilis; Selainitu mengatur virulensi Staphylococcus aureus dalam kondisi rendahoksigen-(Yarwood et al, 2001). Homolognya dari B. ResDE ditemukanpada B. subtilis Juga Menunjukkan cereus dan untuk memainkanperan dalam regulasi ekspresi enterotoksin di B. cereus: hasilpanen mutasi menghapuskan produksi enterotoksin bawah semuakondisi Diperiksa (Duport et al 2006). Temuan ini menyebabkankesimpulan Itu enterotoksin 99 Bab 4 berekspresi dan fermentasi metabolisme dapat dikontrol secaraterkoordinasi pada tingkat transkripsi. Namun, sistem ResDE,Meskipun penting, tidak penting bagi metabolisme fermentatif dan

ekspresi enterotoksin, regulator redoks lain Itu mungkinbertindak secara sinergis dengan ResDE untuk mengontrolfermentasi dan ekspresi gen enterotoksin adalah anggota darisiklik AMP protein reseptor (CRP )-FNR (fumarat dan regulatorreduksi nitrat) keluarga (Korner et al 2003). CRP-FNR regulatormemainkan peran penting dalam modulasi ekspresi gen metabolismedalam banyak Banyak fakultatif dan bakteri anaerobik ketat. Jugafungsi mereka termasuk pengendalian faktor virulensi (Baltes etal 2005, Bartolini et al, 2006, Schmiel et al 2000). Sebuahpenelitian terbaru yang dipimpin oleh Esbelin dan rekan (2009)menjelaskan beberapa aspek dari B. cereus peraturan virulensi,interaksi yang ketat antara transduksi sinyal dua komponen sistemResDE dan satu komponen CRP-FNR regulator, digambarkan sebagaimekanisme dasar untuk mengendalikan produksi utama virulensifaktor hemolisin BL (HBL) dan enterotoksin nonhemolitik (Nhe )dalam makanan-borne patogen B. cereus. Genome macam analisis Transkriptome dari B. thuringiensis UC10070dilakukan pada bab sebelumnya, mengungkapkan ekspresi gen codinguntuk satu komponen CRP-FNR regulator. Transkrip untuk histidinkinase sensor dengan homologi yang tinggi dijelaskan untuk B.Dengan Itu cereus dua komponen regulasi sistem ResDE, jugaditemukan. Pada bagian ini, amplifikasi ResDE dan FNR lokusadalah dilakukan untuk menilai fungsi gen dari kedua regulatortranskripsi di B. UC10070 thuringiensis. Inaktivasi Of Sistem inimengatur secara umum, melalui mutan nol konstruksi, kemudianDianggap untuk mengevaluasi perubahan dalam kinerja pertumbuhan,metabolisme sel dan racun ekspresi dalam B. UC10070thuringiensis, untuk berbaring dan dasar ilmiah untuk pengelolaanpotensi risiko yang terkait dengan B. thuringiensis dan Bacillusspp lainnya. pada intoksikasi makanan. 1.2 mutagenesis kromosom Situs Tertentu Integrasi DNA plasmid telah berhasil digunakan untuk menjelaskansetidaknya bagian dari kromosom bakteri, dengan menghasilkanmutasi (Niaudet et al., 1982, Shortle et al., 1982, Stahl et al.,

1984), oleh gen unselectable pemetaan (Haldenwang et al. 1980 ,Wilson et al. 1986 Vosman et al 1982), dan oleh gen kloning(Niaudet et al 1982, Vosman et al. 1987). Pengembangan strategiintegrasi yang berguna berdasarkan penggunaan 100 Bab 4 plasmid bisa Menyediakan alat penting untuk menjelajahi kromosom.Selama beberapa organisme Telah Itu ditunjukkan Bahwa tidakplasmid mereplikasi dalam strain penerima efisien dapatdiintegrasikan ke dalam kromosom inang Ketika Ini membawa urutankromosom. Pada bakteri, pendekatan yang paling mudah untukintegrasi Bergantung pada plasmid tidak bereplikasi Yang membawasegmen DNA homolog kromosom dan penanda antibiotik-resistensi(Gutterson & Koshland, 1983; Leenhouts et al, 1989.). Wilayahhomologi disediakan biasanya merangsang integrasi DNA plasmiddengan mekanisme Campbell seperti, Yang mengarah ke duplikasimemasukkan homolog kromosom sebagai Konsekuensi dari mode iniintegrasi seperti yang ditunjukkan pada gambar 1. Acara Campbell-jenis integrasi ini pertama Menunjukkan di B. subtilis olehYoung, M. (1983). Gambar 1 Skema representasi integrasi plasmid dalam kromosommelalui Campbell Seperti mekanisme. (Young, M. 1983). Selain rekombinasi homolog dilakukan untuk percobaan awal,pendekatan baru berdasarkan Kelompok II intron properti, yangDipertimbangkan dalam penelitian ini untuk generasi mutagenesiskromosom spesifik lokasi. Ponsel kelompok II intron, dapat ditemukan dalam genom bakteridan organellar. Mereka menggunakan mekanisme mobilitas disebutretrohoming, dimediasi oleh kompleks ribonucleoprotein 101 Bab 4 (RT + intron menjerat), Sendiri untuk memasukkan ke dalam setiapDNA target yang diinginkan dan untuk menghasilkan gangguan genkromosom higly spesifik (Gambar 2). Mereka berdua RNA katalitikdan elemen retrotransposable dan menggunakan mekanisme mobilitas

yang luar biasa di mana yang dipotong intron RNA terbalik splicesLangsung ke situs target DNA dan kemudian terbalik ditranskripsioleh protein intron-encoded. Setelah penyisipan DNA, menghapusintron Sendiri oleh protein-dibantu, splicing RNA autocatalytic,demikian Meminimalkan kerugian host (Jin Zhong et al 2003).The Lactococcus lactis Ll.LtrB intron Telah berkembang menjadi"targetron" yang bisa retargeted untuk menonaktifkan gen tertentuyang menarik (Frazier et al 2003, Mohr et al, 2001, Karberg et al2000). Basal dalam sistem ini homing kompleks ribonucleoprotein(RNP) Itu Terdiri dari II intron molekul RNA kelompok (Ll.LtrB)dan protein LTRA Associated. Kekhasan dari peristiwa integrasiselanjutnya yang diberikan oleh situs pengikatan basepairingantara ekson 1 (EBS1), EBS2, dan δ dari molekul RNA, denganintron 1 situs pengikatan (IBS1), IBS2, dan δ bersarang 'dalamgen target (Gambar . 1). Oleh karena itu, intron dapatditargetkan untuk gen tertentu dengan mengganti EBS1 dan EBS2dengan urutan gratis ke situs penyisipan Dalam gen yangdiinginkan. Ll.LtrB dan LTRA yang Dinyatakan dari donor plasmid,dari mana para L1.LtrB intron Splices dari yang mengapit 5 'dan3' ekson dan bentuk yang menjerat RNA Itu asosiasi dengan LTRA(Karberg et al, 2000, Long et al 2003) . Protein LTRAMemfasilitasi pembentukan struktur katalitik intron dan pengakuangen target. L1.LtrB splices balik ke situs penyisipan, sementaraLTRA mensintesis salinan antisense dari RNA, mengkatalistranskripsi kebalikan dari urutan RNA intron. Beberapa studi telah menunjukkan dioptimalkan targetron Bahwasistem ini bekerja pada efisiensi yang tinggi dalam berbagaiClostridia spp. (Heap et al. 2007) dan bakteri Gram negatif(Rodriguez dkk 2008 Juni Yao et al. 2007.), Tetapi tidak adapenelitian yang dilaporkan dalam literatur untuk genus Bacillus.Dalam studi ini, kami telah mengadaptasi sistem mutagenesisTargeTron kelompok II intron untuk B. thuringiensis. 102 Bab 4

Gambar 2 representasi skema dari intron mekanisme retrohoming.Martinez-Abarca et al. 2000 103 Bab 4 2. Bahan Dan Metode 2.1 strain bakteri dan kondisi pertumbuhan UC10070 Bacillus thuringiensis var. kurstaki serotipe H3a3bdigunakan untuk melakukan inaktivasi insersional di bagianpenelitian. Isolasi strain yang dilakukan dari produk bio-insektisida komersial di laboratorium kami, BCA dengan pelapisandi piring selektif medium agar, pengenceran desimal komersialbubuk setelah inkubasi pada 30 ° C hingga 72 jam dari (lihatbagian 2.1, bab 2) . Untuk percobaan mutagenesis, B. UC10070thuringiensis secara rutin ditanam di Otak Jantung Infusion broth(BHI, Oxoid) pada 37 ° C pada terus menerus gemetar pada 250 rpmatau Luria-Bertani (LB) pelat agar pada suhu yang sama.Escherichia coli strain TB1 (genotipe: F-ara Δ (lac-proAB)[Φ80dlac Δ (lacZ) M15] rpsL (strr) thi hsdR) yang disebarkandalam medium LB. Bila diperlukan, antibiotik digunakan padakonsentrasi Berikut: 100 lg ampisilin ml-1, atau 15 lgkloramfenikol ml-1 untuk E. coli dan 5μg eritromisin ml-1, atau15 LG kloramfenikol ml-1 untuk B. thuringiensis. 2.2 ekstraksi DNA dan manipulasi Bacillus thuringiensis UC10070 DNA genom diekstraksi dari 1,0-mlaliquot budaya kaldu dengan menggunakan FTA Starter Pack(Whatman) Sesuai dengan instruksi dari pabriknya. Enzim restriksiyang digunakan seperti yang direkomendasikan oleh pemasok(Promega atau BioLabs, NEW ENGLAND). DNA plasmid diisolasi dariE. coli menggunakan Wizard Ditambah SV minipreps DNA PemurnianSistem kit (Promega). Untuk isolasi DNA plasmid dari B.thuringiensis UC10070 PAL prosedur miniprep digunakan (Voskuil etal 1993). 2.3 Optimasi B. sistem elektroporasi thuringiensis Percobaan transformasi yang yang dilakukan menggunakan pPSC10plasmid untuk mengoptimalkan sistem elektroporasi di B. UC10070

thuringiensis. Untuk mempersiapkan sel kompeten, B. UC10070thuringiensis ditumbuhkan di otak jantung media infus (BHI,OXOID) mengandung 0,5 M sukrosa (BHIS) pada 37 ° C dengan gemetarsampai budaya mencapai densitas optik pada 600 nm dari 0,2. Sel-sel kemudian dipanen dengan sentrifugasi selama 15 menit pada 4 °C dan 2.500 RPM. Pelet dicuci sekali dalam satu volume dan tigakali dalam volume 1/10th dari 5 HEPES mM (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N9-2-ethanesulfonic asam) 104 Bab 4 Sukrosa 0,5 M (Sue Kalaman et al. 1995). Elektroporasi dari 100 ldari suspensi sel dilakukan dalam 0,2 cm-elektroda cuvetteskesenjangan dengan Bio-Rad Gene Pulser September di: 2500 V / cm,2.5uF, 200 Ω. Setelah elektroporasi, sel-sel Ditransfer ke 3 mlBHIS dan tumbuh selama 3 jam pada suhu 37 ° C dan 250 rpm sebelumdisebar pada Luria kaldu menengah (LB) yang mengandung 250ug/mleritromisin ml-1. 2.4 Deteksi B. homolog di B. cereus regulator transkripsithuringiensis UC10070 Urutan nukleotida resDE (1.776 kbp) dan FNR (1.405 kbp) lokus,tersedia dalam entri database yang EMBL dengan Ebi-ID: DQ402422dan DQ681074 masing-masing. Primer September dilaporkansebelumnya oleh Duport et al (2006, 2007) untuk B. F4430/73cereus, yang digunakan untuk memperkuat kedua 2.91-kbp ResDE dan1405-bp FNR B. lokus cereus dari B. UC10070 thuringiensis. Reaksiberantai polimerase (PCR) adalah dilakukan dalam total volume 25l, dengan 0,5 mM primer masing-masing, 15 mm MgCl2, dan 0.5U Taqpolimerase (Promega) dan 1X penyangga disediakan dengan enzimTaq. Amplifikasi dilakukan dalam Mastercycler Ep Gradient SEppendorf PCR sebagai berikut: 1cycle pada 94 ° C selama 4 menitdan 35 siklus pada 94 ° C selama 30 detik, 50 ° C selama 1 menit,dan 72 ° C selama 5 menit. Langkah perpanjangan terakhirdilakukan pada 72 ° C selama 5 menit. PCR reaksi campuran yang

dielektroforesis pada 0,8% gel agarosa di TAE1X buffer denganSYBR DNA gel Aman noda (Invitrogen) ®. 2.5 Konstruksi hasil dan mutan FNR dengan homolog sistemrekombinasi Untuk membangun mutan insersional inaktivasi, fragmen internalyield (324 bp) dan FNR (288 bp) gen pertama kali diperkuat denganmenggunakan pasangan primer 5-CGTCTTGAAAAGATCCGTCA-3 dan 5-AAATCAACCGTTAACGCAAC-3 'dan pasangan primer 5'-GCAAACGAAGTTCCGAGATT -3 'dan 5 - GCAGAGCAATCTTCACAAGC -3, masing-masing, dan diklon ke pGEM-T Easy vektor (Promega) Menurutpetunjuk produsen. Plasmid rekombinan dicerna dengan EcoRI danNotI secara paralel dengan pMUTIN4 vektor (Bacillus Pusat Bursagenetik, USA) seperti yang dijelaskan oleh Duport et al (2006).Setelah inaktivasi panas dari enzim, fragmen dan plasmid (3:1)dicampur untuk ligasi. Campuran ligasi digunakan untuk mengubahsel kompeten E. coli TB1. Plasmid rekombinan bernama pMresE danpMfnr masing-masing, diekstraksi dan kemudian Diperkenalkan 105 Bab 4 ke B. thuringiensis UC10070 oleh dua percobaan elektroporasi yangberbeda seperti yang dijelaskan sebelumnya. Sebelum regangantransformasi, set primer dijelaskan sebelumnya digunakan untukmengamplifikasi fragmen kloning di kedua vektor. Produkamplifikasi dikirim ke fasilitas sekuensing komersial (BMR CRIBIPadova Italia) untuk sequencing. Homolog rekombinasi diharapkandalam acara silang tunggal. Para integrants dipilih pada pelat LBdengan menggunakan resistensi eritromisin. 2.6 Deteksi gen gangguan Untuk memverifikasi penyisipan sukses dari inaktivasi vektorpMresE dan pMfnr di daerah target yang diinginkan, PCR skriningpada klon ErmR dilakukan. Koloni ditumbuhkan dengan adanyaantibiotik pada Peningkatan konsentrasi dari 5 sampai 64mikrogram per ml-1. Gangguan gen telah diverifikasi oleh ukurandari fragmen PCR yang dihasilkan dari wilayah kromosom sasaran.

The oligodeoxynucleotide primer 5'-pspacF CCTTGC CTACCTAGCTTCC-3', melengkapi sebuah wilayah vektor promotor pMUTIN4, dirancangmenggunakan Vector NTI 9.0.0 (InforMax, Frederick, MD) denganprimer gen komplementer yang tersingkir, yang digunakandipasangkan dengan pspacF: masing-masing resEf2ACGCCGCTTTACAATCAAAC-5'-3 ', dan 5'-TCGT fnrLocRACAACAATTGGCCCTT-3'. Reaksi amplifikasi PCR yang dilakukan dalam total volume 25 lterkandung Itu 5NG DNA, 0.5μM primer masing-masing dan GoTaqHijau Master Mix (Promega). Reaksi dilakukan dalam MastercyclerEp Gradient S (Eppendorf) dengan denaturasi awal 4 menit pada 95° C, Diikuti oleh 30 siklus PCR setiap Terdiri 15 s pada 94 ° C,45s pada suhu anil (annealing suhu 50-55 ° C diuji untukMeningkatkan efisiensi reaksi) dan 2 menit pada 72 ° C, ekstensiakhir adalah 7 menit pada 72 ° C. PCR reaksi campuran inidielektroforesis pada gel agarosa 1% di TAE1X buffer dengan SYBR® DNA gel Aman noda (Invitrogen).2.7 Pembangunan B. hasil thuringiensis dan mutan FNR dengansistem TargeTron Situs sasaran hasil dan FNR gen inaktivasi mengirimkan urutanditemukan www.sigma-aldrich.com/targetronaccess. The "TargeTronalgoritma desain situs", mengidentifikasi semua situs penyisipanpotensi intron penyisipan sepanjang urutan gen: (1kb biasanyamenyajikan 5-11) dan satu set 3 primer (IBS, EBS1, ebs2) untuksetiap gen, intron cocok untuk re -penargetan. Dalam tabel 1terdaftar set primer untuk intron retargeting. 106 Bab 4 Tabel 1. Set primer Sesuai dengan pilihan desain yang dipilihdalam target gen TargeTron Diidentifikasi oleh algoritma. Daerahtarget yang ditunjuk oleh titik penyisipan mereka dalam urutanDNA dan Tercatat sebagai akal (s) atau anti-sense (a). gen Nama primer / posisi

SEQ (5'-3 ') IBS 563/564a AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAAACGCCAAGAAAGTGCGCCCAGATAGGGTG-5'-3 ' EBS1d 563/564a -3 5'-CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCAAGAAAGTTAACTTACCTTTCTTTGT ' hasil EBS2 563/564a 5'TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGATTGCGTTTCGATAGAGGAAAGTGTC 3 ' IBS 1062/1063s AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAGATTGCTCTGCTGTGCGCCCAGATAGGGTG-5'-3 ' EBS1d 1062/1063s 5'-CagA TTGT ACAAA T GT GGTGATAACAGATAAGTCTCTGCTTCTAACTTAC CTTTCTTTGT-3 ' FNR EBS2 1062/1063s 5'-TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGATTCAATCTCGATAGAGGAAAGTGTCT-3 Setelah situs target dan tiga primer yang teridentifikasi, intronretargeting PCR dilakukan di Mastercycler Ep Gradient S(Eppendorf) dalam volume akhir 50 l, sehingga terdiri: 1 ml dari"Empat primer induk campuran" "(IBS, EBS1 , EBS2 dan EBS yanguniversal primer yang disediakan oleh kit), 1μl template Intron,Red Taq (Sigma), 25 l, 23 ml air bebas nuklease. Sampel yangDikenakan siklus amplifikasi dengan pra-denaturasi pada 94 ° Cselama 30'', 30'' untuk anil pada 55 ° C, ekstensi pada 72 ° Cselama 30 ", dan satu siklus pada 72 ° C selama 2 '. Produk PCR dari 350 dan 288 bp yang dielektroforesis pada 2% gelagarosa dan dimurnikan dengan GenElute PCR Kit Clean-up (Sigma). Fragmen Intron (sekitar 20-25ng/μl), yang diligasi ke vektorpJIR750ai (10.262 KPB-Sigma), secara paralel setelah HindIII /BsrgI pencernaan, saya dirakit: 2μl B10X, BsrgI 1μl, 1μl HindIII,DNA 10 l, H2O 6μl: Reaksi 20μl diinkubasi selama 30 'pada 37 ° C,30' pada 60 ° C, 10 'pada 80 ° C (untuk enzim inaktivasi).

Setiap reaksi pencernaan dimurnikan dengan protokol Microclean(Labogen). Linearized vektor Disampaikan kepada pengobatan alkalifosfatase (CIAP-sapi Drive-Promega) Mengikuti instruksi daripabriknya untuk mencegah recircularization Selama ligasi. 107 Bab 4 Reaksi ligasi dirakit seperti dalam Quik-Link T4 DNA Ligasiprotokol Kit (Sigma) kemudian Berubah Menjadi. B. thuringiensisUC10070 dengan Bio-Rad Gene Pulser electroporator Set untukparameter Berikut: 2.500 V / cm, 2.5uf, 200 Ω. Sel kompetendisiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya (bagian 2.3). Untukseleksi mutan, budaya electroporated, setelah 3 jam pemulihan,tersebar di piring LB dengan 5μg/ml kloramfenikol, dan diinkubasipada pada 37 ° C. DNA plasmid dari koloni Berubah diisolasidengan sebelumnya dijelaskan (Voskuil et al 1993), dan Dilihatdari elektroforesis pada 0, 8% gel agarosa. Reaksi PCR yangdilakukan untuk memperkuat daerah intron dari koloni Transformed(pada DNA plasmid), dan dari intron Template sebelum eksperimenmutagenesis ditargetkan. Set primer dan kondisi dijelaskan untukintron-penargetan kembali PCR digunakan. Produk yang diperolehdimurnikan dan dikirim ke fasilitas sekuensing komersial (BMRCRIBI Padova Italia) untuk sequencing. 2,8 Lookup transkripsi PCR untuk mengevaluasi ekspresi intron diB. thuringiensis UC10070 RNA diisolasi dari koloni diproses alasan 1ug/ul, setelah lisisdi TE penyangga (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA), mengandung 10mg/mllisozim, dengan teknik ekstraksi kolom, Mengikuti instruksimanufaktur terhadap total protokol pemurnian RNA, dari "RNeasyMini Kit" (Qiagen). Selanjutnya, RNA diperlakukan dengan DNase(Ambion) dan disimpan pada -80 ° C dalam aliquot 10ul untukmenjaga stabilitas RNA. Untuk menilai ekspresi intron, RNA Dilihat dari RT-PCR Mengikutiprosedur "One-Step" (AB-gen) protokol, Yang Menyediakan siklusamplifikasi tunggal dalam volume reaksi 50UL, dirakit sebagai

berikut: template RNA 1UG, retro-50U transcriptase enzim(reverse-it RTase Blend), primer-rasa dan anti-sense dariTargeTron desain algoritma (khusus untuk hasil dan gen FNR)0.2um, Master-Mix 2X RT-PCR disusun oleh: Thermoprime DitambahPolymerase DNA (konsentrasi akhir 1,25 U/50ul) Buffer untukoptimasi reaksi, dNTP mix (0.2mm konsentrasi akhir untuk setiapnukleotida), MgCl2 (konsentrasi akhir 1.5mm). 2.9 Konfirmasi koloni sistem gugur dengan PCR Dua strategi dengan PCR digunakan untuk memverifikasi insersiintron. Primer spesifik untuk fragmen hasil dan FNR, panggulBahwa situs penyisipan, dirancang (Tabel 2) untuk memperkuat 108 Bab 4 seluruh intron dimasukkan. Primer gen spesifik dan primer intronkhusus digunakan untuk mengamplifikasi gen-intron junction diseluruh. Tabel 2 September primer digunakan untuk memperkuat seluruhintron dimasukkan ke dalam sistem gugur reaksi PCR untukkonfirmasi. Gen Nama Primer SEQ (5'-3 ') Temperatur anil Produk amplifikasi TTresEF GTCGGAAAACCAGTGCAATC-5'-3 ' hasil TTresER TCCCACGTGACACTTCAAAA-5'-3 ' 52 216pb fnrF GCAAACGAAGTTCCGAGATT-5'-3 ' FNR

fnrR 5 - GCAGAGCAATCTTCACAAGC -3 51 288pb 3. Hasil Peran kedua ResDE dua komponen sistem, dan satu komponen CRP-FNRregulator, sebagai penjaga mampu merasakan perubahan redoks, danmengkoordinasikan tanggapan Itu memodulasi B. cereus virulensi,telah jelas didefinisikan dalam studi terbaru (Esbelin et al2009). Genome analisis transcriptomic (lihat bagian 3.1.4,bag.3), mengungkapkan ekspresi gen yang mengkode FNR regulator,dan mungkin kinase sensor dari dua komponen sistem ResDE, B.Selama thuringiensis UC10070 siklus biologis. Dalam hal ini bagian dari pekerjaan, deteksi dengan PCRamplifikasi B. UC10070 daerah thuringiensis kromosom yangmengandung seluruh resDE (Gambar 3A) dan FNR lokus (Gambar 3B),Terindikasi Itu resDE dan FNR gen, bisa menyusun unit transkripsidimasukkan ke dalam operon yang lebih besar, yang mendukungaktivitas transkripsi Sudah Diamati dalam bab sebelumnya. Untuk menghasilkan mutasi spesifik lokasi di B. thuringiensisUC10070, pembangunan 4 vektor dilakukan. Dalam rangka untukmembangun mutan inaktivasi insersional, kami membuat beberapa tesuntuk mengoptimalkan sistem elektroporasi di B. strainthuringiensis. Sebuah protokol baru untuk mempersiapkan selkompeten, dan parameter spesifik elektroporasi dikembangkan untukMencapai frekuensi transformasi 5x105 cfu per LG pPSC10 DNAvektor di B. UC10070 thuringiensis. Fragmen kromosom B. thuringiensis UC10070, Sesuai dengan wilayahinternal hasil dan regulator transkripsi FNR, diklon ke vektorpMUTIN4 (Gambar 4) di E. coli TB1. Fragmen ini adalah dari 325dan 288 bb masing-masing, dan plasmid Hasil yang ditunjuk pMresEdan pMfnr. 109 Bab 4

Kedua pMresE dan pMfnr plasmid membawa sebuah asal replikasiuntuk E. coli (ColE1 asal replikasi) dan seleksi resistensiampisilin. Vektor gagal untuk bereplikasi di Bacillus tetapi genjuga ErmR hadir untuk memilih Mengintegrasikan Bacillus kolonijika plasmid ke kromosom. Kami Diperiksa Apakah pMresE pMfnr dandapat digunakan sebagai kendaraan untuk memasukkan urutan DNA kedalam kromosom dari B.thuringiensis UC10070. Setelah kloningpMresE dan pMfnr di E. coli TB1, PCR amplifikasi dan sekuensingfragmen FNR dibuat dan dikonfirmasi Bahwa kedua fragmen kloningdisajikan pada identitas 100% dengan urutan kromosom B. UC10070thuringiensis. E. coli TB1 DNA plasmid diisolasi dan EcoRI / NotIdicerna: analisis elektroforesis Menunjukkan baik pMresE danpMfnr linierisasi vektor dan fragmen Sesuai masing-masing menjadi325 dan 288 bp (Gambar 5 AB) memberikan bukti pembangunan yangbenar dari vektor inaktivasi. Sebagai kontrol dalam setiappercobaan elektroporasi, vektor kloning pPSC10, yang bereplikasidi B. thuringiensis, digunakan untuk mengubah sel kompeten untukErmR. Frekuensi transformasi pPSC10 konstan (dari 5x105transforman per LG pPSC10 vektor DNA). Tidak ada transformandiperoleh dengan vektor pMUTIN4 tanpa insert kromosom. Kolonidiperoleh dengan kedua pMresE dan pMfnr. Untuk menilai stabilitasfenotip ErmR dari transforman, koloni tumbuh pada konsentrasiPeningkatan antibiotik, dan dalam beberapa kasus ada pertumbuhandiamati hingga konsentrasi 15 mikrogram per ml-1. Jumlah DNAdiekstraksi dari setiap koloni tahan untuk analisis PCR. DalamGambar 6 (A dan B) secara skematis menunjukkan Campbell sepertiintegrasi yang diinginkan dari kedua vektor inaktivasi, yangdihasilkan oleh peristiwa silang tunggal. Reaksi PCR dilakukandengan primer yang dirancang pada spesifikasi gen target dandaerah promotor pspac dari kedua vektor. Panjang fragmendiharapkan 525bp dan 438 bp untuk hasil dan gen FNR masing-masing. Dalam setiap percobaan transformasi analisis PCR padakoloni tahan memberikan produk yang berbeda seperti yang

diharapkan (Gambar 7). Data yang diperoleh tidak mendukungintegrasi Campbell-seperti. 110 Bab 4 Marker1Kb1 2 Marker1Kb1 2resDELocus kbpfnrLocus 2.910 1.405 kbp A B Gambar 3 Deteksi dengan PCR amplifikasi Rede (jalur 1, A) dan FNR(jalur 1, B) Loci di B. thuringiensis UC 10070. Gambar 4 Peta plasmid pMUTIN4 Berubah di B. UC10070thuringiensis. Vektor bereplikasi di E. coli melalui asalreplikasi ColE1, dan seleksi resistensi ampisilin. Ini gagaluntuk bereplikasi di Bacillus tetapi gen juga ErmR hadir untukmemilih Mengintegrasikan Bacillus koloni jika plasmid kekromosom. Dalam situs kloning ganda, blok merah Menunjukkan enzimrestriksi digunakan untuk kloning fragmen hasil dan FNR. BaillusGenetik Stock Pusat gambar. 111 Bab 4 Markersupercoiled1 2 Markersupercoiled1 2resEfragment325bpfnrfragment288 bp A B Gambar 5 Elettrophoretic dicerna profil pMfnr dari (A) dan pMresE(B) vektor insersional. pMUTIN4 digunakan sebagai kontrol (lane1A, jalur 1 B). Not1/EcoR1 pengobatan, vektor linier dihasilkandan fragmen dimasukkan Sesuai dari 288 bp (FNR gen) dan 325bp(gen dibuat). Sebuah resDELocus: 1.776 kbreDELocFresDELocRresEF (1078 bp) Reser(1403 bp) pbresDELocFresDELocRlacZlacIblaZermAMpspac8611 325 +325 bp 112 Bab 4 B

PbfnrF 288 (773 bp) fnrR (1061pb) fnrLocRfnrLocFfnrLocus: 1.405 +288 bp kbfnrLocFlacZblaZpspacfnrLocRlacIermAM8611 Gambar 6 representasi skematis bagian yang relevan dari kromosomstrain B. thuringiensis UC10070 sebelum dan sesudah Campbellseperti integrasi pMresE plasmid (A) dan pMfnr (B) .. Petunjukdari setiap gen memendam oleh plasmid ditunjukkan oleh panah.Panah kuning Menunjukkan pspac vektor promotor gen. Marker200bp20040060080010001 2 3 4 Gambar 7 Memperoleh produk PCR setelah B. UC10070 thuringiensiselektroporasi dengan pTGRE2 inaktivasi vektor. Tidak bandtertentu ditampilkan dalam jalur 1-2-3. Tidak ada produkamplifikasi yang terdeteksi selama satu koloni diuji. 113 Bab 4 The TargeTron gen sistem knock-out telah dioptimalkan untukdigunakan dalam B. thuringiensis. Dua vektor inaktivasi dibangununtuk Mencapai inaktivasi insersional tertentu dalam B. UC10070thuringiensis. TargeTron vektor ekspresi pJIR750ai (10.262 bp)digunakan untuk percobaan ini (Gambar 8). Ini diedarkan vektordibangun untuk KO gen yang ditargetkan pada bakteri gram positif.Ekspresi kelompok II intron RNA berada di bawah kendali b-2toksin gen promotor, khusus untuk Clostridium perfringens cpb2tipe A, Selain itu menyajikan atribut Berikut: asal plasmid untukreplikasi pada E. coli untuk memfasilitasi kloning (pIP404 ori),asal plasmid untuk replikasi di Firmicutes (pMB1ori) ke genresistensi antibiotik kloramfenikol dan RNP (Ll.LtrB dan LTRA)ORF. Prinsip dasar sistem ini Apakah Itu basepairing antara dualoop (EBS1 dan EBS2) dan situs δ Dalam struktur RNA Ll.LtrB danurutan DNA target, memandu acara penyisipan. Dengan demikian,mengubah urutan EBS1 dan EBS2 untuk memungkinkan basepairingDalam situs ke gen target (IBS1 dan IBS2), melalui "retargetingPCR", Memfasilitasi penyisipan intron dalam urutan khusus ini.Itu urutan elemen sayap IBS1 dan IBS2 situs dalam gen ditargetkanJuga Diakui oleh kompleks RNP. Algoritma komputer TargeTron

mengidentifikasi potensi situs penyisipan Dalam setiap urutan DNA(Perutka et al. 2004). Untuk setiap B. gen thuringiensisditargetkan untuk inaktivasi, algoritma TargeTron (Sigma-Aldrich)digunakan untuk mengidentifikasi situs penyisipan potensial danmerancang primer Diperlukan untuk target ulang yang Ll.LtrBIntrona produk PCR meliputi Itu EBS1, EBS2, dan δ di Ll.LtrBdiperkuat dengan primer spesifik. Fragmen PCR kloning antaraHindIII dan situs BsrgI di pJIR750ai vektor target ulang kelompokII intron. Algoritma TargeTron Diidentifikasi situs penyisipan potensialDalam delapan dan sembilan dibuat di FNR. Kami memilih targetterletak antara nukleotida 563 dan 564 (563/564a) dan antarnukleotida 1062 dan 1063 (1062/1063s) masing-masing untuk hasildan gen target FNR. RNP yang Mengakui dalam satu kasus targetpada untai antisense (sebutan "a"), sementara yang lain padauntai sense (sebutan "s"). Situs-situs sasaran dipilihberdasarkan e-nilai yang diperoleh dari algoritma (563/564a e-value = 0.114; 1062/1063s e-value = 0,045). Kedua plasmid dengantargetron menargetkan posisi 563/564a (pTGRE2) dan 1062/1063(pTGOX), yang Berubah Menjadi B. UC10070 thuringiensis. Dua setprimer yang bekerja untuk setiap screening plasmid targetronuntuk PCR untuk memperkuat dalam satu kasus seluruh dimasukkanintron daerah (kurang lebih) 114 Bab 4 2.000 kbp (Gambar 9A), dan daerah lain yang lebih kecil di manaintron insersi diharapkan (Gambar 9 B). Transforman disaringuntuk CMR. Beberapa percobaan elektroporasi independen dilakukan.Isolasi koloni tahan menyimpan plasmid targetron (Gbr. 10)setelah setiap percobaan transformasi, memberikan bukti darisistem elektroporasi efisien dikembangkan untuk B. UC10070thuringiensis (bagian 2.3). Namun, screening PCR pada CMR koloni,tidak memungkinkan deteksi kelompok II intron penyisipan pada563/564 dan 1062/1063 menargetkan situs, masing-masing pada hasildan gen FNR. Urutan keberpihakan antara intron Template dan

target ulang intron dari kedua pTGRE2 dan pTGOX, Menunjukkanvariasi nukleotida tunggal dan mengganti EBS1 EBS2 daerah ditargetron plasmid. Data ini dikonfirmasi intron retargetingpTGRE2 dan vektor pTGOX. Kegiatan promotor cpb2 yang Dinilai diB. UC10070 thuringiensis. Reverse transkripsi assay dilakukanpada RNA total diisolasi dari koloni tahan, menegaskan ekspresiintron ulang ditargetkan (Gambar 11). Tidak ada fragmenamplifikasi yang Diamati dalam reaksi kontrol dilakukan tanpaenzim reverse transcriptase. Gambar 8 Peta dari pJIR750ai plasmid digunakan untuk mengubah B.UC10070 thuringiensis. The retargeted vektor khusus untukinaktivasi gen dalam mikroorganisme gram positif, mengandung sisaporsi Intron kelompok II urutan intron di promotor lantai atas,dan ketahanan terhadap kloramfenikol untuk memilih mutan. gambar www.sigmaaldrich.com. 115 Bab 4 ATGSTOPTTresEFTTresERintronresEgeneresEgeneATGSTOPfnrFfnrRintronfnrgenefnrgene A B ATGSTOPEBS2TTresERintronresEgeneresEgeneATGSTOPEBS2fnrRintronfnrgenefnrgeneGambar 9 desain primer untuk mendeteksi insersi intron. ArrowsMenunjukkan primer masing-masing digunakan. A. Amplifikasiseluruh disisipkan daerah intron. B. The re-target intron setprimer untuk PCR langkah awal (IBS, EBS1d, EBS2) dapat digunakandengan gen dipasangkan primer spesifik untuk memperkuat wilayahdi mana intron insersi diharapkan. Markersupercoiled206729723990501260307045806610,102pTGRE2pTGOX10, 262 bpvectorweight1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18

Gbr.10 DNA Plasmid dari B.thuringiensis UC10070 CMR kolonisetelah transformasi dengan pTGRE2 (jalur 1-2-3-4-5-6-7) danpTGOX (jalur 8-9-10-11-12-13-14 - 15-16-17-18) vektor. 116 Bab 4 Marker200bp350 bpIntronproduct2004006008001000 Gambar 11 Lookup assay transkripsi untuk ekspresi di retargetedintron B.thuringiensis UC10070. RNA total diekstraksi dari koloniBerubah dengan pTGRE, itu Dilihat dari RT-PCR untuk menilaiekspresi intron. 4.Discussion B. milik B. thuringiensis Kelompok cereus. Sejak B. thuringiensispelabuhan dan mengungkapkan gen coding untuk B. Faktor-cereusvirulensi, bisa Pertimbangkan berpotensi berbahaya bagi manusia.Namun sangat sedikit yang diketahui tentang bagaimana hal itudapat menyebabkan penyakit. Untuk meneliti lebih dalam padafitur-fitur penting,: seperti mekanisme virulensi bakteri,ketersediaan alat molekuler untuk menciptakan mutasi KO genterkait diperlukan. Strategi KO gen secara rutin melibatkanpengenalan DNA extrachromosomal plasmid atau lainnya ke strainpenerima untuk menghasilkan strain mutan null. Berbagai protokolTelah dikembangkan untuk elektroporasi dan inaktivasi gen bakterigram positif: agen melemahnya sel, cuci variabel komposisipenyangga dan berbagai pulsa listrik, bertujuan peningkatanefisiensi transformasi, di sisi lain, beberapa plasmid non-replikatif, berguna untuk rekombinasi homolog, Telah dibangun dandigunakan untuk Mencapai blackberry pernah integrasi kromosomefisien dalam mikroorganisme Gram-positif, contoh adalah prosedurinaktivasi gen satu langkah dikembangkan untuk Bacillus subtilisdengan menggunakan vektor pMutin non-replikatif. Tidak terakhir,targetron sistem Telah Menunjukkan berguna untuk analisis genetikpada spesies bakteri yang berbeda. Namun protokol ini tidakberhasil di tangan kita untuk B. UC10070 thuringiensis. Meskipunklon ErmR Dicapai dalam beberapa percobaan transformasi dengan

vektor derivatif pMUTIN dibangun dalam pekerjaan ini, tidaksatupun dari mereka yang Diidentifikasi sebagai mutan null. 117 Bab 4 Itu seharusnya Itu koloni yang mengandung sel-sel bermutasi dantidak bermutasi dihasilkan dari percobaan transformasi. Ini bisamenjelaskan pertumbuhan beberapa koloni di BHI broth eritromisin(15 mikrogram per ml-1). Kehadiran modifikasi pembatasan (RM) sistem dalam Bacillus isolatbandel, dilaporkan (Groot et al 2008). Yang disarankan fungsisistem RM dalam mikroorganisme adalah perlindungan terhadapinvasi DNA asing. Itu seharusnya Itu modifikasi DNA terjadi padainaktivasi setelah vektor transformasi di B. thuringiensis, bisamenjelaskan setidaknya sebagian dari frekuensi rendah rekombinasidiamati. Namun pPSC10 kedua plasmid, digunakan sebagai kontroldalam eksperimen elektroporasi, dan pJIR750ai Berubah padafrekuensi cukup tinggi dan stabil dipertahankan di B. UC10070thuringiensis. Oleh karena itu, frekuensi rendah B. thuringiensisrekombinasi dan adanya penyusunan ulang kromosom dapatmenjelaskan kegagalan percobaan ini. Untuk menggunakan pendekatan yang berbeda untuk strategi kelompokII intron diadopsi. Salah satu keuntungan dari kelompok II intronApakah Itu, Dinyatakan ons, RNP relatif host-independen faktor.Selain itu, tingginya tingkat transformasi DNA tidak diperlukan,seperti yang diperlukan untuk efisien homolog prosedurrekombinasi, targetron Karena plasmid tunggal dapatmengekspresikan beberapa salinan dari kelompok II intron. Namun,intron integrasi luas frekuensi bervariasi antara situs sasaran,dan dapat membuat upaya skrining yang diperlukan untukmengisolasi mutan prohibitively melelahkan, Terutama jika adalayar fenotipik sederhana untuk inaktivasi gen tersedia.Pendekatan ini tidak mengarah pada mutan nol untuk kedua resDEdan lokus genetik FNR. Meskipun pJIR750ai yang Berubah padafrekuensi cukup tinggi dan stabil dipertahankan di B.

thuringiensis UC10070, percobaan transkripsi mengungkapkan Bahwaintron kembali bertarget yang Dinyatakan dalam B. UC10070thuringiensis, dan bukan mutan Diinginkan menyembunyikanpenyisipan diisolasi. Untuk usaha masa depan dapat Dianggap solusi cerdik dari Heapdidirikan dan rekan kerja (2007) untuk Clostridium spp.Pengenalan gen resistensi antibiotik ke dalam kelompok II intron,yang itu sendiri terganggu oleh diri splicing intron Kelompok I,diusulkan menggunakan pMTL007 vektor, turunan dari pJIR750ai,untuk memfasilitasi mutan skrining. Ketiga unsur tersebut diaturItu lagi hanya tersedia setelah insersi berhasil kelompok IIintron ke target, Ketika bersarang kelompok I intron akandisambung, integritas gen resistensi antibiotik dipulihkan.Akuisisi antibiotik 118 Bab 4 119 Dengan demikian perlawanan ketat digabungkan dengan integrasi,dan dapat digunakan untuk secara positif memilih untuk peristiwaintegrasi. Selain itu, penggunaan promotor T7 (diinduksi denganIPTG), untuk produksi dikendalikan dari kelompok II intron RNA,dapat menyebabkan mutan seleksi yang kuat Peningkatan efisiensi.

BAB 5 KESIMPULAN UMUM Kesimpulan Kesimpulan Umum B. thuringiensis pertama Ditandai karena kemampuannya untukmenghasilkan kristal parasporal aktif terhadap beberapa spesiesserangga, terutama dari ordo Lepidoptera, Diptera, danColeoptera. Karena kegiatan serangga itu digunakan di seluruhdunia di bidang kehutanan dan pertanian untuk mengendalikan hama.Penelitian terbaru Menunjukkan Bahwa sebagian besar penentugenetik untuk B. cereus virulensi,: seperti haemolysin BL (HBL),

enterotoksin non-hemolitik (NHE), cytotoxin K, dan bc-D-THTenterotoksin, yang memendam oleh B. strain thuringiensis. Studifilogenetik berdasarkan analisis gen kromosom membawa hasilkontroversial, dan tidak jelas apakah B. cereus dan B.thuringiensis varietas dari spesies yang sama atau spesies yangberbeda (Ivanova et al. 2003). Oleh karena itu, apa yangtampaknya menjadi masalah kecil taksonomi Oleh karena itu mungkinmemiliki implikasi serius bagi virulensi dan patogenisitas. Sejak B. thuringiensis dapat terkontaminasi makanan, berada dalambentuk spora sisa setelah pengobatan di ladang, ini sangatmendesak untuk memperdalam blackberry pernah menyelidiki potensirisiko timbul dari kehadiran B. thuringiensis dalam industrimakanan. Pekerjaan tesis ini Bertujuan untuk Mencapai informasilebih ilmiah mengenai bakteri makanan-terkait, mengambilkeuntungan dari pendekatan molekuler baru berbasis genom,memfokuskan perhatian pada B. strain thuringiensis digunakansebagai biopestisida komersial. The patogen dalam profil vitro dari sepuluh B. komersial strainthuringiensis, ditandai dengan distribusi tinggi NHE, hbl, BCETdan gen CYTK. Gen enterotoksin yang terdeteksi oleh PCR dalamsemua strain dianalisis. Analisis RT-PCR dikonfirmasi ekspresigen enterotoksin. Productions racun terdeteksi oleh strain ujiRPLA Milik subsp Banyak digunakan. kurstaki. Fitur-fitur dan diskriminasi yang sulit antara B. thuringiensisdan B. cereus, itu menyarankan peran B. thuringiensis di Wabahpenyakit bawaan makanan dapat Telah diremehkan. Pengembanganmodel makanan nabati, Yang akan memungkinkan untuk menilaiperilaku B. spora thuringiensis, setelah simulasi pengobatanindustri pengolahan, adalah titik penting dalam penelitian ini.Analisis spora Bacillus amplop, dan kemampuannya untukberinteraksi dengan lingkungan makanan, Telah dilakukan denganmenggunakan SEM dan SEM X-ray Mikroanalisis diterapkan padamakanan mengajukan model. Secara lebih rinci, Perhatian khususditujukan untuk perubahan morfologi dan kimia B. Selama proses

perkecambahan spora thuringiensis dalam makanan. Kami Diamatidalam evolusi cepat dari B. thuringiensis siklus biologisDibandingkan Bahwa lainnya spora membentuk 124 Kesimpulan bakteri seperti Clostridium spp. (Bass et al 2008, komunikasipribadi.). Menarik Itu hanya dua jam setelah aktivasi spora,perkembangan sel selesai dan pembelahan sel berada pada levelmaksimum. Dalam rangka untuk menilai dan untuk meletakkan dasar untukmengelola risiko yang terkait dengan B. thuringiensisperkembangan dalam bahan makanan, kita perlu untuk mendapatkaninformasi lebih lanjut tentang siklus hidupnya, dan ini adalahapa yang telah kita lakukan melalui analisis Transkriptome dariB. thuringiensis dalam empat tahap yang berbeda dari siklusbiologis, dari spora aktif untuk sel vegetatif / berspora. Kitabisa menekankan mRNA Itu adalah komponen spora bakteri. KamiDitemukan Bahwa spora dilengkapi dengan sejumlah besar transkripmungkin berguna ke depan langkah selanjutnya dari perkembangan.Spora dorman mengandung populasi ribosom, Selama 40 menit pertamasetelah aktivasi spora, tingkat kedua dan rRNA ribosom proteinsintesis sangat meningkat. Sebuah aktivasi dasar dan kuat genpolifungsional Tampaknya dimulai pada spora germinant: sebagianbesar gen terlibat di dalamnya aktivitas metabolik (pekerjaanrumah tangga gen, faktor inisiasi terjemahan, protein ribosom,dan faktor elongasi) banyak menduduki saat ini dalam analisismicroarray. Sejumlah besar transkrip untuk protein Terlibat dalamregulasi proses biologis yang berbeda, termasuk resistensiterhadap senyawa antimikroba yang berbeda dan agen stresoksidatif, yang ditemukan untuk hadir di B. thuringiensis selvegetatif. Kami berhipotesis Itu B. Sistem ini sel thuringiensisdapat mengaktifkan dalam menanggapi rangsangan eksternal untukpertahanan sel dan adaptasi terhadap perubahan kondisi lingkungandalam model makanan. Transkrip untuk protein perkecambahan (tipe

ger) ditemukan dalam spora, merupakan indeks ekspresi gensporulasi ini dalam tahap sebelumnya dan menyarankan PentingnyaSelama dormansi, untuk memantau lingkungan untuk kondisi hasilyang tepat. Temuan ini bisa menjelaskan kemampuan B. cereusseperti microrganism untuk menempati siklus hidup penuh danlengkap dalam beberapa relung lingkungan yang berbeda. Menurutdata literatur, semua gen virulensi terkait, diwakili dalamanalisis microarray, yang up-diatur terutama Selama tahap akhirpertumbuhan sel. Analisis RT-qPCR dilakukan untuk mengukurekspresi, dalam makanan, dari gen virulensi utama yang terlibatmasuk B. cereus terkait makanan ditanggung penyakit. MRNA Toksinterdeteksi dalam jumlah bervariasi, diteliti pada semua tahappertumbuhan B. thuringiensis, dengan Meningkatkan kuat Selamafase log pertumbuhan mikroorganisme. Meskipun tidak ada informasitentang B. Ekspresi toksin cereus dalam makanan yang tersedia,sebelumnya dalam studi in vitro pada B. produksi enterotoksincereus, Dilaporkan Bahwa tingkat toksin tertinggi Dicapai Selamalog / fase diam awal terlambat. Produksi dari L2 125 Kesimpulan komponen enterotoksin HBL, yang terlibat di dalamnya sindromdiare terdeteksi dalam model makanan, bahkan dalam jumlah yangrendah, Selama fase log awal. Kami Disimpulkan Bahwa B.thuringiensis dapat menyelesaikan seluruh siklus hidup dalamsistem industri makanan setelah proses simulasi, memproduksienterotoksin yang Diamati dalam budaya kaldu. TranscriptomicTelah Menunjukkan untuk tidak hanya alat yang ampuh untukmempelajari perkecambahan dan perkembangan dari B. sporathuringiensis, tetapi juga metode yang cocok untuk menilai responlingkungan untuk bakteri patogen dalam makanan. MemperolehTanggal, Memberikan pengetahuan dasar baru pada kelompok Bacilluscereus.

Data ini memperluas pengetahuan kita tentang fleksibilitasmetabolisme B. thuringiensis Dan Juga ditambahkan ke pandangankita tentang sifat virulensi potensi ini makanan-patogen. Mengingat temuan ini, kebutuhan untuk mengidentifikasi sistemuntuk mengelola risiko yang terkait dengan B. thuringiensis dibidang industri telah Menjadi jelas. Pendekatan eksperimentalyang dijelaskan dalam bagian terakhir dari pekerjaan tesis.Identifikasi dan inaktivasi sistem umum untuk mengatur virulensi,melalui nol mutan konstruksi, yang Dianggap untuk mengevaluasiperubahan dalam kinerja pertumbuhan, metabolisme sel dan ekspresiracun, dalam mikroorganisme dipelajari. Selain rekombinasihomolog, mekanisme mobilitas kelompok II intron Dinilai untukmenghasilkan gangguan gen kromosom sangat spesifik di B.thuringiensis. Sebuah pendekatan baru dan beberapa percobaan dilakukan untukMencapai inaktivasi kromosom Diinginkan, Namun tidak ada upayamemberikan hasil yang diharapkan. Penelitian terbaru Telah Menunjukkan kesulitan yang dihadapimutan skrining diperoleh dengan kelompok II intron inaktivasi, dikhusus ketika, seperti dalam kasus ini, tidak mungkin menggunakanuji fenotipe terhadap Mengakui sel bermutasi: ketidaknyamananyang paling umum adalah adanya koloni campuran dari Yang sulituntuk memisahkan bermutasi dari sel tipe liar. Laporan literatur bagaimana pengenalan resistensi antibiotik kedalam Grup II urutan intron, dan penggunaan promotor T7(diinduksi dengan IPTG), bisa menyebabkan Meningkatkan efisiensiseleksi yang kuat dalam mutan. Karena frekuensi tinggi integrasikromosom dilaporkan untuk B. subtilis dengan menggunakan vektornon-replikatif pMUTIN, satu-langkah ini prosedur inaktivasi gentidak berguna untuk B. thuringiensis UC10070 dalam penelitianini. Itu seharusnya Bahwa industri B. strain thuringiensis yangbandel terhadap manipulasi genetik. Pembatasan modifikasi (RM)sistem dalam Bacillus isolat bandel, dilaporkan (Groot et al2008). Kehadiran sistem RM seperti perlindungan terhadap invasi

DNA asing tidak diverifikasi dalam mikroorganisme ini, tapi bisamenjelaskan 126 Kesimpulanfrekuensi rendah rekombinasi diamati meskipun efisiensi yang baiktransformasi.Sejak B. thuringiensis secara luas digunakan dan populer dibiologicalthe frekuensi rendah dari rekombinasi diamati meskipunefisiensi yang baik transformasi.Sejak B. thuringiensis secara luas digunakan dan populer dipertanian biologis, pemantauan seksama terhadap strain yangdigunakan harus dibenarkan. Sastra laporan luas risiko yangterkait dengan makanan-patogen B. cereus, tetapi merekaberhubungan dengan B. thuringiensis seringkali diremehkan. Daridata yang diperoleh dalam penelitian ini kita bisa berasumsibahwa B. thuringiensis benar-benar bisa bertanggung jawab untukbanyak makanan wabah yang ditanggung sebelumnya dikaitkan denganB. cereus, mengambil potensi ini enterotoxigenic ke rekening,serta fakta bahwa B. thuringiensis tidak dapat dipisahkan dari B.cereus pada tingkat kromosom, produsen makanan dan otoritasmakanan, bertanggung jawab untuk keamanan pangan, harusmempertimbangkan risiko residu insektisida B. thuringiensis dalamrantai makanan. pertanian, pemantauan seksama terhadap strainyang digunakan harus dibenarkan. Sastra laporan luas risiko yangterkait dengan makanan-patogen B. cereus, tetapi merekaberhubungan dengan B. thuringiensis seringkali diremehkan. Daridata yang diperoleh dalam penelitian ini kita bisa berasumsibahwa B. thuringiensis benar-benar bisa bertanggung jawab untukbanyak makanan wabah yang ditanggung sebelumnya dikaitkan denganB. cereus, mengambil potensi ini enterotoxigenic ke rekening,serta fakta bahwa B. thuringiensis tidak dapat dipisahkan dari B.cereus pada tingkat kromosom, produsen makanan dan otoritasmakanan, bertanggung jawab untuk keamanan pangan, harus

mempertimbangkan risiko residu insektisida B. thuringiensis dalamrantai makanan.