UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DECANATO

PROYECTO DE TESIS

TÍTULO:

Caracterización de Bacillus spp. asociadas a larizósfera de Jatropha curcas L., “piñón blanco”, enLambayeque y su potencial como promotoras delcrecimiento de plantas, 2012

AUTORES:

Est. Aguilar de la Cruz Heyner IsaacEst. Coral Cruz Jorge Eduardo

PATROCINADORA:

Dra. Blga. Carmen Rosa Carreño Farfán

APROBADO POR:

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Lambayeque, setiembre de 2012UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASDECANATO

PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES

1. Título del proyecto

Caracterización de Bacillus spp. asociadas a la

rizósfera de Jatropha curcas L., “piñón blanco”, en

Lambayeque y su potencial como promotoras del

crecimiento de plantas, 2012

2. Personal investigador

2.1 Autores

Est. Aguilar de la Cruz Heyner Isaac

Est. Coral Cruz Jorge Eduardo

2.2 Patrocinadora

Dra. Blga. Carmen Rosa Carreño Farfán

3. Carrera profesional/especialidad

Biología/Microbiología y Parasitología

4. Tipo de investigación:

4.1 De acuerdo al fin que persigue: Aplicada

1

4.2 De acuerdo a la técnica de contrastación:

Descriptiva

5. Régimen de investigación

Libre

6. Localidad e institución donde se desarrollará el

proyecto

Lambayeque, Laboratorio de Microbiología y

Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas

en la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

7. Duración del proyecto

8 meses

8. Fechas probables de inicio y término

8.1 Inicio: Julio, 2012

8.2 Término: Febrero, 2013

9. Cronograma de actividades

Actividades

2012

2013

Jul

Ago

Set

Oct Nov Di

c Ene Feb

FASE DE PLANEAMIENTORevisión bibliográfica X X X

Elaboración del proyecto X X

Presentación del X2

proyectoAprobación del proyectoImplementación del proyecto X

FASE DE EJECUCIÓNRecolección de muestras X X X X

Procesamiento de muestras X X X X X

Registro de datos X X X XAnálisis estadístico de datos X X X

FASE DE COMUNICACIÓNAnálisis e interpretación X X

Elaboración del informe X X

Presentación del informe X

10. Recursos disponibles

10.1 Personal

El presente proyecto contará con el apoyo delpersonal técnico del laboratorio de Microbiología yParasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas,Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

10.2 Equipos e instrumentos

Autoclave vertical, rango T° 0-250 °C, FANEN Balanza analítica, rango 0.01-150 g, EXCELL Cámara digital 14 mega pixeles, OLYMPUS Centrífuga GT-119-200, GREETMED

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Cocina eléctrica, una hornilla, CHARITO Computadora Intel (R) Pentium (R) Dual CPUE2160 1.80 GHz Dispositivo de almacenamiento de información

(USB) de 4Gb KINSTONG Espectrofotómetro digital, 335-1000 nm,GREETMED Estufa rango T° 30-110 °C, PRECISION SCIENTIFIC Horno con temperatura máxima de 200 °C, THELCO Microscopio eléctrico binocular, modelo L200,CARL ZEISS pH metro portátil, rango de pH 0.0 a 14.0,BIOCHEMICALS INTRUMENTS S.R.L

10.3 Materiales y reactivos Material de vidrio: Placas de Petri,portaobjetos, cubreobjetos, tubos de vidrio(13x100 mm y 15x150 mm), pipetas de 1 y 10 mL,matraces de 250 mL, vasos de precipitación,viales.

Material de metal: Gradillas, asasbacteriológicas, pinzas, bisturís, tijeras.

Material de plástico: Jeringas de 1 y 5 mL,tubos de centrífuga, bolsas.

Medios de cultivo: Agar leche 1%, Agarnutritivo, Agar quitina coloidal 1 %; AgarSundara Rao Sinha SRSM, Agar tripticasa soya,Caldo extracto de suelo 10 %; Caldo peptonado,Caldo tripticasa soya suplementado contriptófano, Medio libre de nitrógeno con azulde bromotimol (Nfb) semisólido.

Reactivos y colorantes: Reactivos para tinciónde Gram, solución salina (NaCl 0,87 %, p/v).

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10.4 LocalLaboratorio de Microbiología y Parasitología,

sección Biotecnología Microbiana de la Facultadde Ciencias Biológicas, Universidad Nacional PedroRuiz Gallo en Lambayeque.

11. Presupuesto

Nº dePartid

a

Cantidad

Producto Marca Presentación

Precio S/.

2.3.15.12

Material deescritorio

118,00

04 Lápices Mongol

Unidad 4,00

04 Lapiceros Pilot Unidad 12,0003 Marcadores Artes

coUnidad 6,00

02 Correctores Artesco

Unidad 5,00

03 Cintas deembalaje

Unidad 3,00

1/2 Papel Kraft Ciento 14,0002 Papel bond A4 Xerox Millar 50,0002 Cuadernos Norma Unidad 6,0004 Rollos de pabilo Unidad 12,0002 Juegos de

etiquetaDocena 6,00

Bienes deconsumo

2.3.18.21

Material delaboratorio

4735,00

01 Agar agar Merck kg 750,00

01 Agar nutritivo Merck kg 500,0

5

001 Agar quitina Merck kg 500,0

001 Agar tripticasa

soyaMerck kg 500,0

001 Medio Nfb Merck kg 500,0

001 Caldo tripticasa Merck kg 250,0

001 Peptona Merck kg 250,0

002 Solución salina Litro 20,00100 Placas de Petri Pyrex Unidad 450,0

010 Frascos de

vidrioPyrex Unidad 20,00

60 Tubos dedilución

Pyrex Unidad 80,00

100 Tubos debioquímica

Pyrex Unidad 40,00

04 Pipetas de 1 y10 mL

Pyrex Unidad 35,00

04 Asasbacteriológicas

Unidad 8,00

04 Portaobjetos Caja 16,0004 Cubreobjetos Caja 12,0001 Algodón 500 g 12,00

2.3.15.31

Material delimpieza

25,00

Servicios 850,00

2.3.21.21

Movilidad 600,00

Publicaciones2.3.22.44

Servicio deimpresiones,encuadernación y

500,00

6

empastado2.3.21.23

Otros serviciosde tercerosInternet 100,0

0Equipamiento ybienes duraderos

640,00

2.315.99

01 Cámara digital Olympus

600,00

01 Dispositivo deAlmacenamiento(USB)4GB

Kingston

40,00

Imprevistos 700,00

TOTAL 7668,00

12. FinanciaciónEl presente proyecto será financiado por los

responsables, con ayuda del laboratorio deMicrobiología y Parasitología de la Facultad deCiencias Biológicas - Universidad Nacional “Pedro RuizGallo”.

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II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

1. REALIDAD PROBLEMÁTICA

La bioenergía y especialmente los biocombustiblesson promovidos para fortalecer la independenciaenergética, propiciar el desarrollo rural y reducirlas emisiones de los gases de invernadero. Eldesarrollo de la bioenergía ofrece muchos beneficios,pero éstos deben ser seleccionados y balanceados, conlos impactos sobre la seguridad alimentaria. En estecontexto, la Organización para la Alimentación y laAgricultura de las Naciones Unidas (FAO), con lacontribución del Ministerio Federal de Alimentación,Agricultura y Protección al consumidor de la RepúblicaFederal de Alemania, han ejecutado el proyectoBioenergía y Seguridad Alimentaria (BEFS), a fin dedeterminar cómo el desarrollo de la Bioenergía puedeser implementado sin arriesgar la SeguridadAlimentaria. El proyecto cumple un marco analítico queha sido implementado en Perú, Tailandia y Tanzania.

Bajo condiciones de secano, en la costa, no haytierras disponibles para el desarrollo de cultivosrelacionados a biocombustibles como son:Saccharum officinarum L. “caña de azúcar”; Elaeis oleifera“palma aceitera” y Jatropha curcas L. “piñón blanco”; sin

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embargo, con base a la disponibilidad deinfraestructura de agua para riego existente, se puedeafirmar que existe un potencial de tierras eriazascercano a 200 000 ha ubicadas en zonas áridas entrelas regiones de Piura y Lima, que podrían destinarse ala implementación de estos cultivos (FAO, 2010a).

El piñón blanco se siembra en pequeñas parcelas ycomo cerco vivo. Recientemente se han instaladoalgunos ensayos en diversas localidades del país,principalmente en la Costa Norte y en el Nororiente.Los primeros resultados indican rendimientos de 3 – 4t año-1. Siendo un cultivo bastante rústico, se podríasembrar en áreas marginales de la costa (áridas ysalinas); sin embargo, según la evaluación de aptitudde tierras (EAT) éstas son consideradas comomarginalmente o muy marginalmente aptas, es decir,presentan en términos porcentuales entre 40 – 60 % y20 – 40 %, respectivamente, de capacidad para llegaral rendimiento máximo alcanzable de 8 – 12 t ha-1 porcosecha. Según lo expuesto, se ha determinado (FAO,2010a) que en el Perú los costos para la producción debiodiesel a partir del piñón blanco estarían entre0,83 y 0,86 USD/L, superiores a los de lapalma aceitera (0,23-0,31 USD/L) y los del etanol apartir de la caña de azúcar (0,27-0,51 USD/L) y melaza(0,43-0,64 USD/L).

La investigación en piñón blanco tiene porfinalidad obtener un paquete tecnológico paraincrementar el rendimiento y disminuir los costos deproducción de biodiesel. En este contexto, lasrizobacterias promotoras del crecimiento de las

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plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR),entre las que destacan las especies de Bacillusconstituyen una alternativa que debe ser considerada,porque incrementan el rendimiento de los cultivosagrícolas a través de mecanismos directos eindirectos. Entre los primeros se incluyen la síntesisde reguladores de crecimiento (auxinas, giberelinas,citoquininas), solubilización de minerales como losfosfatos, fijación de nitrógeno atmosférico, yestimulación del sistema de absorción de iones comolos nitratos. Entre los mecanismos indirectos o debiocontrol se mencionan la competencia por un nichoecológico o por nutrientes, la interacción directa conel patógeno por parasitismo y lisis enzimática, laantibiosis, producción de sideróforos y la inducciónde resistencia sistémica en las plantas.

Bacterias como Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas yStreptomyces entre otros géneros, se encuentran en lossuelos rizosféricos y han demostrado su efectobenéfico en cultivos agrícolas; sin embargo, enLambayeque no se han realizado estudios parainvestigar la presencia de estas bacterias en larizósfera del piñón blanco, con la finalidad deaislarlas, caracterizarlas y determinar su potencialcomo promotoras de crecimiento de las plantas.

1.1. Identificación del problemaSuelos poco aptos para la siembra de los cultivos

relacionados a los biocombustibles y desconocimientode la actividad benéfica de los microorganismos de larizósfera de las plantas.

1.2. Delimitación del problemaCaracterización de Bacillus spp. asociadas a la

rizósfera de Jatropha curcas L.

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“piñón blanco” en Lambayeque y su potencial comopromotoras del crecimiento de plantas.

2. PROBLEMA CIENTÍFICO¿Cuáles son las características de Bacillus spp.

asociadas a la rizósfera de Jatropha curcas L. “piñónblanco” y cuál es su potencial como promotoras delcrecimiento de plantas?

3. HIPÓTESISImplícita.

4. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIALa producción de biodiesel en el Perú está ligada

al mercado de los aceites vegetales, por lo que seríadifícil tener márgenes provechosos de rentabilidad, yaque este producto, utilizado para consumo humano, esuna materia prima costosa y en su mayoría suproducción es de palma aceitera. Por tanto, el preciodel biodiesel será análogo al de cualquier aceitevegetal que se produce a partir de palma aceitera,maíz o especies oleaginosas como soya, canola ogirasol y no constituiría una alternativa para cumplircon los requerimientos de la norma peruana que en loque respecta al biodiesel, en el 2009 comenzó con laobligatoriedad del 2 % de mezcla y debió serincrementado a 5 % al inicio del 2011.

El piñón blanco ofrece una materia prima de menorcosto y a largo plazo la producción de biodiesel espromisoria, así como la comercialización desubproductos como la glicerina y la torta quepermitirían darle un valor agregado; sin embargo, la

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capacidad del cultivo para competir a escalaindustrial es dudosa porque se desconoce sucomportamiento agrícola y porque los suelos donde debeser cultivado no presentan las condiciones óptimaspara alcanzar el rendimiento adecuado. Como unaalternativa está la posibilidad de utilizar bacteriasdel suelo como Bacillus spp., que a través de diversosmecanismos benefician el desarrollo de las plantas yaumentan el rendimiento, por lo que se les denominarizobacterias promotoras del crecimiento de lasplantas, PGPR.

El género Bacillus incluye una variedad de especiesGram positivas, no patogénicas, con propiedadesantagonistas. Son buenas secretoras de proteínas ymetabolitos, fáciles de cultivar y altamenteeficientes para el control de plagas y enfermedades.Los mecanismos de acción de Bacillus spp., incluyencompetencia por espacio y nutrientes, antibiosis einducción de resistencia frente a los patógenos.Además, tienen efecto comprobado en la promoción decrecimiento de las plantas a través de la fijación denitrógeno, solubilización del nutriente fósforo yproducción de reguladores del crecimiento como elácido indolacético. La capacidad de Bacillus spp., deformar esporas, que sobreviven y permanecenmetabólicamente activas bajo condiciones adversas, lashace apropiadas para la formulación de productosviables y estables para el control biológico.

5. OBJETIVOS5.1 Aislar e identificar Bacillus spp. en la rizósfera

de Jatropha curcas L. “piñón blanco” en el distritode Motupe, en Lambayeque.

5.2 Determinar in vitro el potencial biológico deBacillus spp. nativas como productoras de enzimas y

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ácido indolacético, fijadoras de nitrógeno ysolubilizadoras de fósforo.

5.3 Determinar in vitro el poder germinativo de Jatrophacurcas L. “piñón blanco” por efecto de Bacillus spp.nativas caracterizadas como promotoras delcrecimiento de plantas.

6. ANTECEDENTES

6.1 Rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas

En los suelos agrícolas existen microorganismoscomo las bacterias que pueden ser benéficas yperjudiciales para la agricultura. Las bacteriasbenéficas pueden establecer una relación simbióticacon las plantas o pueden ser de vida libre en elsuelo, en cuyo caso se encuentran muy próximas a lasraíces, en lo que constituye el suelo rizosférico(Campos et al., 2007). Estas bacterias son denominadasrizobacterias promotoras del crecimiento de lasplantas, PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria),término usado por primera vez por Kloepper parareferirse a las bacterias capaces de inducir un efectobenéfico en las plantas (Peña & Reyes, 2007).

Las PGPR benefician a los cultivos agrícolas através de mecanismos directos e indirectos. Losdirectos se evidencian en ausencia de otrosmicroorganismos en estudio, mientras que losmecanismos indirectos se pueden observar en lainteracción del microorganismo de interés con unfitopatógeno, mediante la cual se reducen los efectosdañinos en el cultivo. Los mecanismos directosincluyen la síntesis de reguladores del crecimiento(auxinas, giberelinas, citoquininas), solubilizaciónde minerales como los fosfatos, fijación de nitrógeno

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atmosférico, producción de sideróforos y estimulacióndel sistema de absorción de iones como los nitratos.Entre los mecanismos indirectos o de biocontrol seencuentran la competencia por un nicho ecológico o pornutrientes, la interacción directa con el patógeno(parasitismo y lisis enzimática), antibiosis,producción de sideróforos e inducción de resistenciasistémica en las plantas (Nogales, 2005; Hernández etal., 2006; Hernández et al., 2009). Bacterias comoAzospirillum, Herbaspirillium, Enterobacter y Azotobacter promuevenel crecimiento de las plantas mayoritariamente através de mecanismos directos, así como Pseudomonas,Bacillus y Streptomyces lo hacen a través de mecanismosindirectos; no obstante, todas las PGPR presentan unmayor o menor grado de efectividad en ambos mecanismos(Kloepper et al., 2004; Guillen et al., 2006; Idriss et al.,2007; Franco, 2009; Karnwal, 2009; Doumbou et al.,2010; Salaheddin et al., 2010; Cadena & Martínez, 2011).Al respecto, Bashan & Levanony(1990) y Bashan (1999) atribuyen el efecto de las PGPRa los que ellos denominan “hipótesis aditiva”, en laque más de un mecanismo está involucrado en laasociación planta-rizobacteria, los cuales operansimultáneamente o en asociación. La suma de losdiferentes mecanismos refleja los cambios observadosen el crecimiento de las plantas, cuando soncultivadas bajo condiciones ambientales propicias.

El efecto positivo de las PGPR siempre estácorrelacionado con el incremento de longitud de lasraíces laterales, así como el número y longitud de lospelos radiculares, cambios que finalmente se asociancon la síntesis de auxinas, citoquininas ygiberelinas. Según el modelo P. putida, las bacterias,así como las plantas sintetizan ácido indolacético(AIA), que de por si estimula la división yalargamiento de las células, generando proliferación

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radicular (número y longitud de pelos radiculares). Elexceso de AIA también activa la enzima ACC sintetasaen las plantas y promueve la síntesis de ácido-1-amino-ciclo-propano-1-carboxilico (ACC), quenormalmente es un precursor del etileno, el cual a suvez inhibe la elongación de las raíces en lasplántulas. Cuando está presente P. putida, una partesignificativa del ACC es exudado por las raíces yentonces es hidrolizado por las bacterias como fuentede nitrógeno, originando α-cetobutirato y amonio(amino ciclo propano carboxilasa desaminasa, ACCdesaminasa bacteriana), disminuyendo el ACC y por lotanto el etileno, favoreciendo a su vez el incrementode la longitud radicular (Kloepper, 2003; Mantelin &Touraine, 2004).

Los PGPR pueden fijar nitrógeno; sin embargo, noproveen a las plantas de grandes cantidades de esteelemento, pero si tienen un gran impacto en lanutrición nitrogenada, directamente por laestimulación de los sistemas de absorción de ionescomo el nitrato e indirectamente por la proliferaciónradicular. En laboratorio se ha demostrado que elnitrógeno incrementa su propia tasa de absorción einduce ramificación radicular; es decir, en presenciade nitratos se observa la expresión de los genesrelacionados con su transporte y también elongación delas raíces laterales por incremento de la actividadmeristemática de sus ápices. El incremento de lasuperficie de las raíces y por lo tanto del volumendel suelo al que tienen acceso, así como laestimulación de los sistemas de absorción permite a suvez, aumento en la absorción de nutrientes,especialmente nitrógeno, que conlleva a la acumulaciónde biomasa aérea (Mantelin & Touraine, 2004).

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6.2 Especies de Bacillus spp. como rizobacteriaspromotoras del crecimiento de las plantas

Las bacterias del género Bacillus se caracterizan porser Gram positivas con forma bacilar, aerobiasestrictas o anaerobias facultativas que en condicionesestresantes forman una endospora que no deforma laestructura de la célula. Esta forma esporulada esresistente a las altas temperaturas y a losdesinfectantes químicos corrientes (Kokalis et al.,2006).

La taxonomía de Bacillus según Garrity, et al. (2004)es:

Las especiesde Bacillus actúancomo bacteriaspromotoras delcrecimiento de lasplantas mediantelos mecanismos directos de producción de enzimas,ácido indolacético y sideróforos, fijación denitrógeno, solubilización de fósforo y los mecanismosindirectos de antagonismo de hongos, bacteriasfitopatógenas y fitonemátodos. Bacillus spp. produce

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Dominio :

Bacteria

Phyllum :

Firmicutes

Clase :

Bacilli

Orden :

Bacillales

Familia :

Bacillaceae

Género :

Bacillus

antibióticos, lipopéptidos con actividad surfactante yreducen las enfermedades de las plantas (Kokalis etal., 2006; Márquez & Fernández, 2006).

En tres cepas de Bacillus amyloliquefaciens se demostróla presencia de fitasa extracelular (myo-inositolhexakisphosphate). La mayor actividad se detectó en lacepa F2B45 y sus filtrados crudos diluidos estimularonel crecimiento de plántulas de maíz bajo limitación defósforo y en presencia de fitato. La enzima fueproducida principalmente en la fase de crecimientoexponencial y durante la transición hacia la faseestacionaria. La capacidad de B. amyloliquefaciens paraproducir fitasas y permitir la disponibilidad defósforo a partir de fitatos puede contribuir a laactividad promotora del crecimiento de las plantas.Los productos finales de la degradación del fitano hansido identificados como mio-inositol trifosfatos yortofosfatos, derivados del inositol que constituyenuna fuente de nutrientes para las bacterias del suelo(Idriss et al., 2002). También se ha determinado quealgunas especies de Bacillus producen enzimasquitinolíticas que degradan el polímero que formaparte de los hongos fitopatógenos como Rhizoctonia solani,causando deformación y deterioro de las hifas (Reinosoet al., 2005).

Utilizando técnicas de análisis físico y genéticose demostró en B. amyloliquefaciensFZB42, la biosíntesis de ácido indolacéticodependiente de la presencia de triptófano, que es unode los principales componentes presentes en losexudados radiculares. El filtrado diluido o loscultivos de células estimularon el crecimiento deLemmna minor; sin embargo, el efecto dependió de laconcentración del filtrado o de las células. Con unaconcentración de 0,1 % el filtrado incrementó

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significativamente el peso de la biomasa fresca (17,5mg) frente al control (14,1 mg) y con unaconcentración de 0,5 % inhibió el crecimiento de lasplantas (12,0 mg). El efecto fue más significativocuando se inocularon bacterias en una concentración de2 x 105 UFC mL-1 alcanzándose 19,3 mg de biomasafresca. Por el contrario, con 1 x 107 UFC mL-1 seobservó una reducción significativa del peso (13,1 mg)de la biomasa (Idriss et al., 2007).

Para demostrar la producción de giberelinas por B.pumilus y B. licheniformis serealizaron bioensayos con la aplicación de“Paclobutrazol”, un inhibidor de la biosíntesis deestos reguladores del crecimiento y se demostró quelos síntomas de enanismo inducidos en las plantas deAlnus glutinosa L. fueron revertidos con la aplicación deextractos de cultivos de las especies de Bacillus,observándose incremento en la longitud de los tallos(5,4 cm en B. licheniformis; 5,1 cm en B.pumilus y 2,8 cm en el testigo) y en el área foliar(10,4 cm2 con B. licheniformis; 9,6 cm2 con B. pumilus y 4,8cm2 con el testigo). El análisis por cromatografía degases indicó la producción de giberelinas C19bioactivas de los tipos GA1: 130-150 ng/mL, GA3: 50-60ng/mL, GA4:8-12 ng/mL y GA20: 2-3 ng/mL (Gutiérrez etal., 2001).

Los filtrados de cultivos de B. amyloliquefaciens y B.subtilis presentaron actividad promotora del crecimiento,observándose elongación en el test de coleópteros demaíz. B. amyloliquefaciens alcanzó los mayores valorescomparables con los del ácido indolacético enconcentraciones de 106–107 mol L-

1; sin embargo, al cuantificar se detectaron bajasconcentraciones, de 10-8 a 10-9 mol L-1 de AIA. Segúnlos resultados, la concentración de AIA encontrada no

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es equivalente a la de AIA necesaria para inducir losefectos observados en las plántulas, por lo que esposible que éstos sean el resultado de más de unasustancia promotora del crecimiento (Idriss et al,2004).

Diversos investigadores (Orozco & Martínez, 2009;Cuervo, 2010; Ríos & Zúñiga, 2012), hanreportado especies de Bacillus como fijadoras denitrógeno en medio Nfb; sin embargo, también existenresultados contradictorios en donde se determinó quela mejora en la toma de nitrógeno por las plantasinoculadas con B. amyloliquefaciens y B. pumilus no fueconsecuencia de la fijación de nitrógeno, porque lasbacterias en el laboratorio no demostraron serfijadoras. Las plantas liberaron mayores porcentajesde carbono en los exudados radiculares, por lo que seincrementó la actividad microbiana. A su vez, elproceso incrementó el nitrógeno disponible en el sueloy el flujo de nitrógeno hacia las raíces de lasplantas (Adesemoye et al., 2009).

En raíces de manglares negros (Avicennia germinans L.)y blancos (Laguncularia racemosa L.) se obtuvieron 30aislamientos de bacterias solubilizadoras de fósforo,entre los que se identificaron B. amyloliquefaciens, B.licheniformis, B. atrophaeus y Paenibacillus macerans. La actividadsolubilizadora de fósforo se demostró por la formaciónde halos transparentes alrededor de las coloniasdesarrolladas en medio sólido con fosfato tribásico decalcio como fuente de fósforo (Vásquez et al., 2000).

Se monitoreó el crecimiento vegetativo de Hordeumvulgare “cebada” en suelo esterilizado e inoculado concuatro cepas de Bacillus spp. aisladas de la rizósfera de

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cebada y algodón, y que en laboratorio fijaronnitrógeno y solubilizaron fósforo. El fósforodisponible en el suelo se incrementósignificativamente por la inoculación de las semillasde cebada con Bacillus H-13 y Bacillus RCO1.También se incrementó entre 8,9 a 16,7 % el peso delas raíces, frente al control no inoculado, así comoel peso de los tallos entre 28,6 a 34,7 %. A su vez,se incrementó entre 20,3 a 25,7 % la biomasa totalfrente al testigo, valores superiores a 18,1 %obtenido con la aplicación de fósforo, pero inferior a31,1 % alcanzando con fósforo-nitrógeno (Cambolat etal., 2006).

Las bacterias del género Bacillus son consideradascomo ayudadoras de la micorrización (MHB,mycorrhizatium helper bacteria), concepto según elcual estas bacterias no pueden estimular directamenteel crecimiento de las plantas en ausencia de unapropiado hongo micorrítico. Para investigar esteefecto se realizó la co-inoculación del hongomicorrítico Pisolithus tinctorius con B.licheniformis y B. pumilus en Pinus pinea. Las bacterias delgénero Bacillus incrementaron el crecimiento de lasplantas del pino. Debido a que se observó incrementoen la longitud de las plantas inoculadas, por un mayorcrecimiento de las zonas internodales pero no por unincremento en el número de nudos, se relacionó elefecto biológico con la producción de giberelinas. Porsu parte, el incremento de la superficie radicular seatribuyó a la producción de ácido indolacético. A suvez, estas bacterias interfirieron con lasobrevivencia del micelio micorrítico, observándosedisminución en la concentración de ergosterol(membrana citoplasmática) y quitina (pared celular),considerados como indicadores de la biomasa fúngica

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metabólicamente activa y de la integración del hongoen el sistema radicular, respectivamente (Probanza etal., 2001).

Bacillus subtilis es conocido como antagonista de muchoshongos fitopatógenos, debido a la continua producciónde antibióticos, metabolitos volátiles, competenciapor nutrientes, exclusión de sitios y colonización delpatógeno por la bacteria (Butt et al., 1999,mencionados por Bernal et al., 2006).Con el objetivo de investigar la utilización de B.subtilis ATCC 6051, Pseudomonas aeruginosa 7NSK2, P.fluorescens CMR12 y Serratiaphymuthica 1270, en el control de Stemphylium solani enLycopersicon esculentum Mill. “tomate”, se realizó unexperimento en invernadero. Los inóculos se obtuvieroncon las bacterias cultivadas en agar King B yla concentración de las suspensiones celulares fueestandarizada a 108 UFC mL-1. Las aplicacionesfoliares se realizaron cada 7 días, con un atomizadormanual, iniciándose 15 días después del transplantehasta la fase fisiológica de aparición del tercerracimo floral. Todos los tratamientos presentaronefectividad frente al testigo. A los 21 días, losmenores valores en el porcentaje de intensidad deataque (5 y 8 %), se obtuvieron con oxidoruro de cobrey B. subtilis, respectivamente, sin diferenciassignificativas, concluyéndose que esta bacteriaantagonista constituye una alternativa de protecciónfrente a los hongos causantes de manchas foliares entomate (Bernal et al., 2006).

Con Bacillus spp. la promoción del crecimientovegetal está asociada generalmente al controlbiológico a través de la antibiosis (endotoxinas,sideróforos), competencia por espacio o por

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nutrimentos, interacción directa con el patógeno(microparasitismo y lisis enzimática) e inducción deresistencia sistémica. La resistencia inducida esdefinida como un perfeccionamiento de la capacidaddefensiva de la planta frente a un amplio espectro depatógenos y plagas, adquirida después de un estimuloapropiado. La inducción de resistencia porrizobacterias es referida como resistencia sistémicainducida (ISR, induced systemic resistance) y no causaalgún síntoma de necrosis en las plantas hospederas(Kloepper et al., 2004).

Las especies de B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B.pasteurii, B. cereus, B. pumilus, B. mycoides y B. sphaericusinducen significativas reducciones en la incidencia oseveridad de varias enfermedades con una diversidad dehospederos. La ISR ha sido demostrada en invernadero ycampo, en Lycopersicon esculentum Mill. “tomate”, Capsicumannuum “ají”, Citrullus vulgaris Schrad“sandía”, Beta vulgaris L. “remolacha”, Nicotianatabacum L. “tabaco”, Cucurbita maxima Duch “zapallo”,Pinus pinea L. “pino” entre otros cultivos, paraenfermedades como manchas foliares fungosas ybacterianas, virosis sistémicas, nematodos del nudo dela raíz y hongos causantes de chupadera y tizóntardío. Los mecanismos para la ISR son similares enalgunos casos a los de Pseudomonas; independientes delácido salicílico, pero dependientes del ácidojasmónico, etileno y el gen regulador NPRI. En otroscasos, los mecanismos son dependientes del ácidosalicílico e independientes del ácido jasmónico y elgen NPRI (Kloepper, 2003; Kloepper et al.,2004).

Se investigó el potencial de mezclas de B.amyloliquefaciens, B. sphaericus y cinco cepas de B. pumilus

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para inducir resistencia sistémica a las enfermedadescausadas por Ralstonia solanacearum en tomate,Colletotrichum gloeosporioides en ají, Rhizoctonia solani enBrassica oleracea L. var capitata “col” y el virus delmosaico (CMV) en Cucumis sativus “pepinillo”. Paradeterminar la compatibilidad in vitro, las siete cepasde Bacillus fueron evaluadas individualmente entre ellasy frente a tres de los patógenos identificados, noobservándose algún efecto de antibiosis. Acontinuación, se determinó que cuatro (B.amyloliquefaciens más B. pumilus y mezclas de cepas de B.pumilus) de las 21 combinaciones de Bacillus y una cepade B. pumilus individualmente redujeronsignificativamente la severidad de las cuatroenfermedades frente al testigo, concluyéndose que lasmezclas de PGPR pueden inducir en un mayor grado laresistencia sistémica frente a hongos, bacterias yvirus fitopatógenos en comparación con los testigos(Jetiyanom & Kloepper, 2002).

La resistencia sistémica inducida (ISR) es unarespuesta de defensa de la planta ante la presencia yactividad de un agente biológico no patogénico,específico, que reduce la severidad o la incidencia dela enfermedad o daño causado por un patógeno que seencuentra especialmente separado del agente inductor.La resistencia sistémica también puede ser inducidapor sustancias químicas o por la presencia depatógenos, denominándose entonces resistenciasistémica adquirida (SAR). Las diferencias entre ISR ySAR son el agente inductor y los signos que presentala planta. ISR es un fenómeno independiente del ácidosalicílico, etileno y ácido jasmónico y no produce laacumulación de proteínas relacionadas con lapatogenicidad (PR). Estas proteínas son acumuladas enla SAR inducida por patógenos o químicos. (Chaves,

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2007). Según lo expuesto, en remolacha con B. mycoides yB. pumilus la resistencia sistémica se asoció con elincremento de la actividad peroxidasa y producción deisozimas quitinasa y B, 1,3-glucanasa. En tabaco B.pumilus incrementó los niveles de ácido salicílico. Enraíces de guisantes se detectó engrosamiento de lasparedes de las células epidermales y corticales quelimitaron la invasión por Fusarium oxysporum f. sp.pisi. Además, las paredes celulares presentaronelevados porcentajes de callosa e infiltraciones decompuestos fenólicos. En plantas de Cucumber tratadascon B. pumilus se observó una rápida lignificación enrespuesta a Colletotrichum orbiculare y la actividadperoxidasa y superóxido dismutasa (SOD) se incrementófrente a los testigos no tratados (Jetiyanom &Kloepper, 2002; Kloepper et al., 2004).

En tomate cultivado en invernadero se investigó laposibilidad de reducir la dosis del fertilizantequímico mediante su aplicación combinada conB. amyloliquefaciens y B. pumilus. Según la curva derespuesta a las diferentes dosis del fertilizante, losmayores valores en el peso de las plantas de tomate sealcanzaron con 100 % de fertilizante, nodiferenciándose significativamente del fertilizantemás Bacillus spp. (19,9 y 21,5 g respectivamente).También se observó que en los tratamientos PGPR mas 80y 70 % de fertilizante químico se alcanzaron valoresestadísticamente similares con los de 100 % defertilizante sin PGPR (22,2; 21,3 y 19,9 grespectivamente), por lo que se concluyó que las PGPRmás 75 % de la dosis del fertilizante químico puedenutilizarse como parte de una estrategia en el manejointegrado del cultivo del tomate (Adesemoye et al.,2009).

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Bajo condiciones de campo se estudió el efecto detres niveles de fertilización con nitrógeno (0,120 y240 kg ha-1) en el crecimiento y componentes delrendimiento de Solanum tuberosum L. “papa” inoculada conBacillus sp. OSU-142. Esta bacteria incrementósignificativamente el peso de las plantas, número detallos por planta y peso promedio de tubérculos, peroel incremento no fue significativo en el número totalde tubérculos por planta y el número de tubérculossegún el tamaño (<35mm, 35-50mm, >50mm), frente a lostestigos. La inoculación de Bacillus sp. en parcelasfertilizadas incrementó el rendimiento total detubérculos frente a los testigos no fertilizados,alcanzando el mayor valor de 21,3 t ha-1 con la dosis120 kgN ha-1. Según los resultados, Bacillus sp. OSU-142sólo o en combinación con el fertilizante químicotiene un gran potencial para incrementar elrendimiento y sus componentes, además, de reducir lanecesidad del fertilizante químico (Ekin et al., 2009).

Nueve cepas de Bacillus spp. caracterizadas comopromotoras del crecimiento de diferentes cultivosagrícolas fueron inoculadas en semillas depiñón blanco con y sin la aplicación del suplemento dequitina, determinándose que B. pumilus, B. circulans, B. lentusy B. polymyxa, junto a la quitina, así como B. polymyxa yBacillus sp. sin quitina permitieron alcanzar 100 % deemergencia frente al testigo con 80 %. Por su parte,con B. pumilus suplementado con quitina se observópromoción del crecimiento de plántulas hasta los 42días, incrementando la altura (113 %), peso de labiomasa aérea (360 %) y radicular (467 %), área dehoja (256 %) y contenido de clorofila (74 %). A suvez, en las plántulas de semillas tratadas con esta

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bacteria sin quitina se incrementó la biomasa aérea(473 %), biomasa total (407 %) y el contenido declorofila (82 %). Se concluyó que B. pumilus solo o encombinación con las otras bacterias mejoran elcrecimiento inicial de las plántulas de piñón blanco ypor lo tanto pueden incrementar el establecimiento encampo (Desai et al., 2007).

6.3 Cultivo de Jatropha curcas L. “piñón blanco”El piñón blanco es una oleaginosa originaria de

México y Centroamérica, pero crece en la mayoría delos países tropicales. Es cultivada en AméricaCentral, Sudamérica, Sureste de Asia, India y África.(Figura 1).Su taxonomía mencionada por Recalde & Duran (2009) es:

El piñón es unaplanta perenne, cuyociclo productivo seextiende entre 45 a 50años. Es de crecimientorápido y con una alturanormal de 2 a 3 metros.El grosor del tronco es de 20 cm con crecimiento desdela base en distintas ramas. La corteza es blancogrisácea y exuda un látex translúcido. Normalmente seforman cinco raíces, una central y cuatro periféricas.Los tallos crecen con discontinuidad morfológica encada incremento. La corteza es de color verdeamarillenta, pálido y casi lisa, delgada como papel,

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Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Euphorbiales

Familia: Euphorbiaceae

Género: Jatropha

Especie: Jatropha curcas L.

con desprendimientos en tiras horizontales. La cortezainterna blanca con rayas rojas, exuda una saviaamarillenta y sabor astringente. A su vez, las hojasnormalmente se forman con tres a siete lóbulosacuminados, poco profundos y grandes con pecíoloslargos de 10 a 15 cm y de igual ancho. El haz esverde, el envés verde claro, glabro o este último conpelillos finos (Recalde & Duran, 2009; Quimbayo,2010).

La inflorescencia del piñón es una panícula, conlas flores femeninas (10-20 %) en los ápicesdel tallo principal y las ramas de las flores. Lasflores masculinas son más numerosas (80-90 %) y ocupanposiciones subordinadas en la inflorescencia. Lasflores masculinas se abren durante un período de8-10 días, mientras que las flores femeninas solo seabren durante 2-4 días. El desarrollo del frutonecesita 90 días, desde la floración hasta que madurala semilla. El fruto es una cápsula drupácea verdosa-amarillenta y carnosa, pero café oscuro o negro ydehiscente cuando está seca. La fruta produce tresalmendras negras, cada una aproximadamente de 2 cm delargo 1 cm de diámetro. Las semillas (dos a tres porfruto), contienen un aceite no comestible que se puedeutilizar directamente para aprovisionar de combustiblelámparas y motores de combustión o se puedetransformar en biodiesel. Además, se usa para fabricarjabones y también se puede obtener un colorantes. Unavez colocada la semilla en el sustrato adecuado y conuna buena humedad la geminación toma 5 días. Se abrela cáscara de la semilla, sale la radícula y se formancuatro raíces periféricas pequeñas. La germinación esepígea (cotiledones surgen sobre la tierra). Pocodespués que las primeras hojas se han formado, los

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cotiledones marchitan y se caen (Quimbayo, 2010; Pérezet al., 2012).

Actualmente, existen plantaciones o planes deinstalación de piñón blanco en casi todo el mundo(África, Asia, Centroamérica, Sur América, EstadosUnidos), debido a su alta adaptabilidad a diferentestipos de suelos y su característica tóxica, por locual, a diferencia de otros cultivos energéticos, nocompiten con la seguridad alimentaria. El rango dealtitud en la que crece es de 0 a 1200 msnm (conpreferencia 0-600 msnm), con un requerimiento de aguaentre 200 a 2000 mm y con capacidad para soportarlargos periodos de sequía. En la región Lambayeque lasparcelas de siembra se localizan en el distrito deMotupe en los sectores: Tongorrape, Chanduví, Motupe yEscusa Baraja, contándose en la actualidad con 33 hade cultivo instaladas (Pérez et al., 2012).

La producción de biodiesel a partir de piñón ypalma aceitera se inicia con el ingreso de la materiaprima para la extracción mecánica. El aceite obtenidose mezcla en la unidad adecuada con el materialnecesario para la transesterificación más un pequeñoexceso del mismo catalizador. El producto de lareacción compuesto por metilésteres (biodiesel),glicerina, metanol en exceso y catalizador, ingresa ala unidad de neutralización, donde con un ácidomineral se neutraliza el catalizador remanente.Posteriormente en la unidad de destilación al vacio sedespoja al producto de los volátiles, fundamentalmentecompuestos por alcohol metílico. Los vapores demetanol se condensan y se envían al tanque dealmacenamiento para ser nuevamente introducidos en elciclo. El producto de fondo de la unidad dedestilación, que contiene al biodiesel, glicerina ysales se envía a la unidad de decantación continua, en

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la cual se separa el biodiesel del resto de losproductos. La fase ligera (biodiesel) se envía a lacolumna de lavado, mientras que la fase pesada(glicerina bruta) que contiene aproximadamente 90% deglicerina, eventuales impurezas y sales discurren altanque de almacenamiento. En la columna de lavado, elbiodiesel se “lava” retirando la trazas de glicerinaque pudiera contener y el producto lavado de la partesuperior de la columna se separa, y se lleva a launidad de secado y se almacena (FAO, 2010b).

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Figura 1. Planta de Jatropha curcas L. “piñón blanco”.

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7. MATERIALES Y MÉTODOS7.1 Materiales7.1.1 Material biológicoEl material biológico estará conformado por

muestras de suelo rizosférico de “piñón blanco”cultivado en el distrito de Motupe, en Lambayeque, porcepas nativas de Bacillus spp. y semillas de piñónblanco.

7.1.2 Material de laboratorio Placas de Petri. Láminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos. Viales. Pipetas de 1 y 10 mL Tubos de vidrio (13x100 mm y 15x150 mm). Agitadores de vidrio. Asas bacteriológicas. Algodón de 500 g Gradillas.

7.1.3 Medios de cultivo Agar leche 1 % Agar nutritivo. Agar quitina coloidal 1 % Agar tripticasa soya. Agar Sundara Rao Sinha, SRSM. Caldo extracto de suelo 10 % Caldo nutritivo. Caldo peptonado. Caldo tripticasa soya suplementado con triptófano. Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol,

(Nfb)

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7.1.4 Reactivos y colorantes Colorantes para tinción de Gram. Peróxido de hidrógeno. Tiras reactivas para oxidasa. Azul de bromotimol. Reactivo de Salkowski. Solución oxidante para determinación de amonio. Solución salina esterilizada 0,87 % (p/v)

7.2 Métodos7.2.1 Población y muestra de estudioLa población estará constituida por bacterias del

género Bacillus, presentes en el suelo rizosférico depiñón blanco y se trabajará con las bacterias aisladasde 54 muestras, durante setiembre a diciembre de 2012.El número de muestra fue calculado según la fórmulamencionada por Alvitres (2000), tomando en cuenta unaprevalencia del 90 % (Desai et al., 2007).

n=Z2.p.q

t2

Donde:n = Tamaño de muestraZ = 1,96 ( = 0,05); valor estándarP = tasa de prevalencia (0,90) presencia de Bacillusen rizósfera de piñón blancoq = tasa de ausencia 1-p (0,10)t = error permitido (0,08)

n=(1,96)2 (0,90) (0,10)

(0,08)2

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n=54

7.2.2 Variables en estudioLas variables cualitativas serán las cepas nativas

de Bacillus spp. productoras de enzimas y ácidoindolacético, fijadoras de nitrógeno, solubilizadorasde fósforo y que no afecten negativamente el podergerminativo del piñón blanco.

7.2.3 Tipos de estudio y diseño de contrastaciónde hipótesis

El trabajo de investigación será descriptivo ytranseccional (Hernández et al., 2003) ypara contrastar la hipótesis se utilizará el diseño deuna sola casilla (Alvitres, 2000), según el cual seaislará e identificará Bacillus spp. y sedeterminará la producción de enzimas y ácidoindolacético, el nitrógeno fijado y el fósforosolubilizado, así como el efecto en el podergerminativo del piñón blanco.

7.2.4 Zona de muestreoPara aislar Bacillus spp. durante setiembre a

noviembre de 2012 se colectarán 54 muestras de suelorizosférico de piñón blanco, en campos comerciales deldistrito de Motupe, provincia de Lambayeque (Figura2).

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Figura 2. Ubicación geográfica de la zona de muestreocorrespondiente al distrito de Motupe, provinciade Lambayeque, en el departamento de Lambayeque,2012.

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7.2.5 Obtención de muestras de rizósferaEn la zona rizosférica de plantas de piñón blanco

se extraerán aproximadamente 100 g de suelo. Cada unade las muestras se depositarán en bolsas plásticasdebidamente etiquetadas e inmediatamente setransportarán para su procesamiento en el laboratoriode Microbiología y Parasitología, secciónBiotecnología Microbiana de la Facultad de CienciasBiológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, enLambayeque.

7.2.6 Aislamiento e identificación de Bacillus spp.Para el aislamiento de Bacillus spp. según Ríos y

Zúñiga (2012), cada muestra de suelo rizosférico depiñón blanco se tamizará y del material obtenido setomarán 10 g para realizar diluciones en soluciónsalina esterilizada (0.87 % NaCl p/v) hasta 10-2. Estadilución se llevará a tratamiento térmico a 80 ºCdurante 10 minutos y luego se enfriará rápidamente. Acontinuación, se tomará una alícuota y se sembrarámediante la técnica de estría sobre la superficie deagar nutritivo (Anexo 1) en placas de Petri. Seincubará en aerobiosis a 30 ºC durante 24 horas y serealizará tinción de Gram a las coloniasdesarrolladas. En caso de observar bacilos Grampositivos, catalasa positivos,serán cultivados en viales con agar tripticasa soya(TSA) constituyendo los cultivos puros que seránguardados en refrigeración (8 ºC).

El género Bacillus se identificará según el Manual deBergey de Bacteriología Sistemática (Vos et al., 2001)identificando la posición de las esporas, crecimientoa 45 y 65º C; pH 5,7; NaCl 3,5 y 7 %; utilización delcitrato como fuente de carbono y energía, prueba deoxidación – fermentación (O-F); pruebas de oxidasa ycatalasa, crecimiento anaerobio en glucosa; producción

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de ácido a partir de arabinosa, manitol y xilosa;hidrólisis del almidón, gelatina y caseína; reducciónde nitratos y producción de acetoína o 2,3 butanodiolen la prueba de Voges-Proskauer (Guillén et al., 2006;Cuervo,2010).

7.2.7 Producción de enzimas Cada una de las cepas nativas de Bacillus spp. serán

sembradas mediante la técnica de estría sobre agarleche 1 % y agar quitina coloidal al 1 % (Anexo 2) yserán incubadas a 30 oC por 48 y 120 horas,respectivamente, en aerobiosis, para la investigaciónde la producción de proteasas (Carreño y Muñoz, 2012)y quitinasas (Franco, 2009).

a. ProteasasSe observarán las colonias bacterianas

desarrolladas sobre agar leche 1 % en busca de halo dehidrólisis (zona clara alrededor de la colonia). Lacaseína es la proteína principal de la leche y sepresenta como una solución coloidal responsable delaspecto blanco y opaco. Cuando los microorganismosproducen caseinasa, hidrolizan la proteínaoriginándose derivados solubles y cristaloides yobservándose un halo transparente alrededor de lascolonias formadas (Wiseman, 1985; Carrillo, 2003).

b. QuitinasasSe observarán las colonias bacterianas

desarrolladas sobre agar quitina coloidal al 1 %, enbusca del halo de hidrólisis a su alrededor. Laquitina es degradad por las quitinasas, enzimas quehidrolizan un enlace entre dos unidades de N-acetilglucosamina (NAG) consecutivas, observándose un halode hidrólisis alrededor de las colonias (Hoster et al.,2005).

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7.2.8 Detección y cuantificación de ácidoindolacético (AIA) producido in vitro

Para la detección y cuantificación de ácidoindolacético producido in vitro según la reaccióncolorimétrica de Salkowski descrita por Mantilla(2007) cada cepa nativa de Bacillus spp. será cultivadaen caldo nutritivo por 24 horas, de donde se tomarán0,6 mL para inocularlos en 5 mL de caldo tripticasasoya suplementado con triptófano (Anexo 3). Después dela incubación a 30 ºC por 72 horas en agitaciónconstante (150 rpm), los cultivos serán centrifugadosa 2000 rpm durante 15 minutos. A continuación, 0,4 mLde cada uno de los sobrenadantes se depositarán entubos, se agregarán 1,6 mL del reactivo de Salkowskimodificado (Anexo 3) en una relación 1:4 se mezclarány se dejarán en reposo durante 30 minutos enoscuridad. La positividad a la producción de ácidoindolacético estará dada por la aparición de unacoloración violácea y se leerá la absorbancia enespectrofotómetro de luz visible a 530 nm. Lasconcentraciones se calcularán en una recta patrón quese obtendrá con diluciones sucesivas de una solución100 ppm de ácido indolacético.

7.2.9 Detección y cuantificación de nitrógenofijado in vitro

Para la detección y cuantificación de nitrógenofijado in vitro por las cepas nativas de Bacillus spp.nativas, se seguirá la metodología descrita porLara et al. (2007) y Cadena & Martínez (2011). Cada unade las cepas de Bacillus spp. serán sembradas porpuntura en 6 mL de medio libre de nitrógeno con azulde bromotimol (Nfb) semisólido (Anexo 4), a razón deuna cepa por tubo. La incubación se realizará enaerobiosis a 30 ºC, hasta por 1 semana y seconsiderarán como bacterias fijadoras de nitrógeno los

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tubos donde se observe el viraje del indicador delverde al azul y la presencia de una película gruesablanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie.

Para la cuantificación del nitrógeno fijado, segúnel método colorimétrico del fenolhipoclorito (Anexo 4)cada una de las cepas nativas de Bacillus spp.cultivadas en agar nutritivo por 24 horas, seráninoculados en tubos de 15 x 150 mLconteniendo 5 mL de caldo extracto de suelo 10 %(Anexo 4) y se incubarán a 30 ºC por 72 horas enagitación constante (150 rpm).

A continuación, se agregarán 15 mL de KCl 2M, seagitarán a 150 rpm durante 1 hora y se dejarán enreposo por 1 hora adicional, para después tomar 10 mLdel sobrenadante y centrifugarlos (2000 rpm) durante20 minutos. Luego, los sobrenadantes se verterán entubos de dilución y se añadirán 0,4 mL denitroprusiato de sodio 0,5 %; 0,4 mL de soluciónalcohólica de fenol 10 % y 1 mL de solución oxidante.Los tubos se agitarán para mezclar y se dejarán enreposo durante 1 hora adicional.

La positividad a la fijación de nitrógeno estarádada por la aparición de una coloración azul y seleerá la absorbancia en espectrofotómetro de luzvisible a 632,9 mm. Las concentraciones se calcularánen una recta patrón obtenida con diluciones sucesivasde una solución de 100 ppm de cloruro de amonio.

7.2.10 Detección y cuantificación de fósforosolubilizado in vitro

Para la detección y cuantificación de fósforosolubilizado in vitro por las cepas nativas de Bacillusspp. se utilizará la metodología descrita porVásquez et al (2011). Cada cepa nativa de Bacillus spp.

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será sembrada mediante la técnica de estría en agarpara aislamiento de microorganismos solubilizadores defósforo, Sundara Rao Sinha Medium, SRSM (Anexo 5). Lasplacas de Petri se incubarán a 30 ºC hasta por 96horas y las colonias solubilizadoras de fósforo seránreconocidas por el cambio de color del indicador alamarillo y formación de un halo traslúcido alrededorde la colonia. Después, las colonias se cultivaránnuevamente por dos veces consecutivas en agar SRSMpara verificar la actividad solubilizadora de fósforoy se medirá el halo de las colonias que conservan sucapacidad para solubilizar fósforo.

Para la cuantificación de fósforo solubilizado, seobtendrá el inóculo de cada una de las cepas de Bacillusspp. solubilizadoras de fósforo cultivadas en 1 mLde caldo SRSM a 30 ºC durante 20 horas en agitaciónconstante (150 rpm). A continuación, 0,6 mLde cada uno de los cultivos bacterianos seráninoculados en frascos con 20 mL de caldo SRSM eincubados a 30 ºC, con agitación constante (150 rpm)hasta por 96 horas. A partir del momento de lainoculación (0 horas) y cada 24 horas, hasta las 120horas, se tomarán submuestras de 3 mL de caldo SRSM enlos que se determinará el pH y se cuantificará elfósforo soluble mediante el método colorimétrico delmolibdato según Rodier & Rodi, 2005(Anexo 5).

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7.2.11 Efecto de cepas nativas de Bacillus spp. en elpoder germinativo de Jatropha curcas L. “piñónblanco”

Con cada cepa nativa Bacillus spp. cultivada en caldonutritivo hasta alcanzar la fase exponencial, seobtendrá una suspensión con una concentración de 108

células/mL y después se mezclará con un adherenteconstituido por una solución de sacarosa al 10 %previamente esterilizada (8 mL de inóculo más 2 mL desolución). Ambos serán homogenizados por movimientosde rotación durante 2 minutos e inmediatamente despuésserán vertidos sobre semillas de piñón blanco enbolsas plásticas de primer uso, a razón de 100 mL porkg de semilla, correspondiente a 3,6 mL para 36 g desemilla por bolsa El material biológico seráhomogenizado por 10 minutos y después se secará enestufa a30 ºC durante 30 minutos para favorecer la adhesióndel inóculo a las semillas (Cadena &Martínez, 2011).

En bandejas de plástico de 20 x 14 cm, en cuyofondo se colocarán tres capas de papel toallaesterilizado y humedecido con agua destiladaesterilizada y con la ayuda de pinzas estériles, sedepositarán 15 semillas de piñón blanco inoculadas conBacillus spp. (en tres hileras a razón de cinco semillapor hilera). El procedimiento se realizará portriplicado para cada una de las cepas nativas deBacillus spp. seleccionadas, teniendo como testigosemillas tratadas con caldo nutritivo no inoculado ysemillas no tratadas. Las bandejas se taparán con unagasa estéril y se mantendrán a temperatura ambiente(28 ºC), realizando riegos intermediariamente.Asimismo, cada día se contarán las semillas germinadashasta alcanzar el máximo de germinación. Los

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resultados serán expresados como porcentaje degerminación.

7.2.12 Análisis de los datosLos datos obtenidos serán ordenados en tablas y

figuras que permitan determinar el potencial de lascepas nativas de Bacillus spp. como promotoras delcrecimiento en plantas. En el presente trabajo seutilizarán los programas Microsoft Office Word y Excelversión 2007.

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9 FECHA DE PRESENTACIÓNSetiembre de 2012

…………………………………………………Dra. Blga. Carmen Rosa Carreño Farfán

50

………………………………………………..Aguilar de la Cruz Heyner Isaac

Responsable

…………………………………………..........Coral Cruz Jorge Eduardo

Responsable

ANEXO 1

Medios de cultivo para el aislamiento, y mantenimiento deBacillus spp.

(Según Ríos & Zúñiga, 2012)

51

Agar nutritivo (AN)

Componentes g/LPeptonaExtracto de carneAgar agarAgua destilada

5,03,015,01000 mLAjustar el pH a 7,0

Esterilizar en autoclave a 121 ºC y 15 lb de presión.

Agar tripticasa soya (TSA)

Componentes g/LTriptonaPeptonaExtracto de levaduraGlucosaCloruro de sodioAgar agarAgua destilada

15,05,03,05,05,015,01000 mL

Esterilizar en autoclave a 121 ºC y 15 lb de presión.

ANEXO 252

Medios de cultivo para la detección de proteasas yquitinasas in vitro

a. Agar leche 1 % (en Carreño y Muñoz, 2012)

b. Agar quitina coloidal 1% (en Franco, 2008)Componentes g/L Solución Stock K2HPO4 3 % (p/v)Solución Stock MgSO47H2O 1.5 % (p/v)Solución Stock (CaCl2 0,5 %,FeCl3 0,06 %,NaCl 0,5 % p/v)NH4Cl2

Quitina coloidal 1 % (p/v)Agar agar

10,0 mL10,0 mL10,0 mL1,0 10,015,0

Mezclar los componentes y llevar a volumen con aguadestilada, calentar al fuego durante 5 minutos paradisolver las sales, ajustar el pH a 6,8.Autoclavar (15 libras de presión y 121 ºC). Servir enplacas de Petri esterilizadas.

Obtención de la quitina de camarón

Colocar 10 g de cáscara de camarón en 100 mL de H3PO4

al 85 %, dejar reposar 24 horas a temperatura ambiente(25 ºC) y agitar eventualmente para bajar la espuma. Los

53

Componentes g/L TriptonaExtracto de levaduraGlucosaAgar agarLeche evaporadaAgua destilada

5,02,51,015,010 mL980 mL

gránulos de quitina precipitan con agua destilada. Paraseparar los gránulos del ácido utilizar cuatro capas degasa y filtrar al vacío en un matraz kitasato. Lavar conagua destilada hasta quitar el exceso de ácido yneutralizar el pH. Agregar alcohol etílico 96 % y dejarsecar extendido en papel absorbente. A continuación,esterilizar en autoclave y guardar en refrigeraciónhasta su uso posterior.

ANEXO 3

Detección y cuantificación de ácido indolacético producidoin vitro mediante la reacción colorimétrica de Salkowski (en

Mantilla, 2007)

a. Caldo tripticasa soya (g/L) suplementado contriptófano (en García yMuñoz, 2009)

Componentes g/LPeptona de caseína 17,0Peptona de harina de soya 3,0D (+) Glucosa (o dextrosa) 2,5Cloruro de sodio 5,0Fosfato dipotásico 2,5Triptófano 0,01Agua destilada en cantidad suficiente

1 L

b. Reactivo para la detección y cuantificación de ácidoindolacético producido in vitro (en Mantilla, 2007)

54

c. Procedimiento para elaborar la curva de calibración

para cuantificar ácido indolacético, AIA (en Mantilla,

2007)

c.1. Fundamento de la reacción de SalkowskiMediante la reacción de Salkowski se detectan grupos

indol presentes en el medio de cultivo y laconcentración de indol es directamente proporcional ala intensidad de color rojo producido. A su vez, elcambio de color es el resultado de una reacciónoxidativa con el ácido sulfúrico, donde por medio deuna transaminación un grupo amino es sustituido por elcloro proveniente del FeCl3, originando un compuestovisible de color rosado a rojo en el caso delindolacético. Otras coloraciones indican la presenciade productos intermedios de la síntesis del ácidoindolacético, que pueden ser generados a partir deltriptófano.

c.2. Preparación de diluciones a partir de una soluciónmadre de AlA

Para obtener una curva patrón de ácidoindolacético, preparar una solución madre de 100 µg. mL-

l, para lo cual se pesan 10 mg de ácido indolacético yse disuelven con unas gotas de NaOH en un matrazaforado a 100 mL. A continuación, enrasar con aguabidestilada y agitar hasta homogenizar. Posteriormentese realizan las siguientes diluciones:

55

La solución de cloruro de fierro 0,5M se obtiene al mezclar 1,61 g de cloruro de fierro (FeCl3) con 20 mL de

Componentes mL/LAgua destiladaÁcido sulfúrico concentradoCloruro de fierro 0,5 M en agua destilada

250,0150,07,5

*1000 µL = 1 mL

c.3. Procedimiento para la cuantificación de AIA porcolorimetría

Obtenidas las concentraciones parciales de AIAextraer de cada tubo 0,4mL de solución, verter entubos de 13 x 75 mm y agregar 1,6 mL de reactivo deSalkowski (1:4). Dejar en reposo en oscuridad por 30minutos. Observar la presencia de una coloraciónrojiza en los tubos. A continuación, leer laabsorbancia de cada dilución en espectrofotómetro a530 nm.

Una vez obtenida la absorbancia en todas lasconcentraciones de ácido indolacético, corregir losvalores y mediante regresión lineal en el programa

56

N° de tubo

Soluciónpatrón

(100 µgmL-1)[µL]*

H2Obidestilada

[µL]

Concentración

AIA (mgL -

1)01 0 1 002 2 9 203 4 9 404 6 9 605 8 9 806 1 9 1007 1 8 1508 2 8 2009 3 7 3010 4 6 4011 5 5 5012 6

040

60

Microsoft Excel 2007, obtener la ecuación de la rectay el coeficiente de correlación lineal (r2) que deberáser mayor a 0,9 para demostrar una dispersiónhomogénea de los valores sobre la recta.

57

ANEXO 4

Detección y cuantificación de nitrógeno fijado in vitromediante el método indirecto de valoración del ión amonioempleando la técnica colorimétrica de Berthelot (fenol –

hipoclorito)

a. Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol, nfb

58

Componentes g/LÁcido málicoKOHK2HPO4

FeSO4.7H2OMnSO4.7H2OMgSO4.7H2ONaClCaCl2

Na2MoO4

Azul de Bromotimol (0,5 % m/v enetanol)BiotinolAgua destilada en cantidadsuficiente

5,04,00,5Trazas0,010,010,020,010,0022,0 mL0,5 mL1000 mL

Ajustar el pH a 6,8-7,0 con NaOH. Para obtener mediosemisólido añadir 2 g de agar agar. Para medio sólidoañadir 20 mg de extracto de levadura y 15 g de agar.

a. Caldo extracto de suelo al 10 %

Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10%, depositar en un matraz 250 g de suelo agrícola y 500mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500mL con agua destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar25 mL del filtrado y completar a 500 mL con aguadestilada.

b. Reactivos

• Cloruro de potasio 2 M Cloruro de potasio 149,12 gAgua destilada 1000 mL

• Solución alcohólica de fenol 10 %Fenol concentrado 10 mL Alcohol 97º 90 mL

• Nitroprusiato de sodio 0,5 % Nitroprusiato de sodio 0,5 gAgua destilada 100 mL

• Solución oxidanteCitrato de sodio 20 g

59

Componentes g/LK2HPO4

MgCl2

MgSO4.7H2OFeCl3

CaCl2

TriptonaExtracto de levaduraExtracto de suelo al 10 %Agua destilada

0,40,10,050,010,11,01,0250 mL750 mL

Hidróxido de sodio 1 gHipoclorito de sodio 5 % lejía comercial 2 mLAgua destilada 100 mL

d. Procedimiento para elaborar la curva de calibraciónpara cuantificar el ión amonio (Lara et al., 2007)

d.1 Fundamento del método colorimétrico de Berthelot(fenolhipoclorito)Se basa en la formación de un color azul intenso de

indofenol, que resulta de la reacción del ión amonio(NH4) con los compuestos fenólicos en presencia de unagente oxidante el cual puede ser hipoclorito de sodiou o-fenol; y la presencia de un catalizador,principalmente nitroprusiato de sodio o de potasio. Elmecanismo de la reacción depende de la luz presente, latemperatura ambiente, catalizadores y pH alcalino.Cuando se utiliza fenol o sodio la reacción puede serrepresentada de la siguiente manera:

NH3 + 2C6H60-+ 3ClO- O = C6H4= N-C6H4-O+ 2H2O + OH- + 3Cl-

60

d.2 Preparación de diluciones a partir de una soluciónmadre de NH4Cl

Para obtener la curva patrón se prepara una soluciónmadre de 100 ppm de NH4CI, para lo cual se pesa 0,1 g deNH4CI y se disuelve en 1 L de agua bidestilada.Posteriormente, a partir de la solución madre seefectúan las siguientes diluciones:

N° de tuboSoluciónpatrón[mL]

H2Obidestilada

[mL]

NH4Cl(Ug/mL = ppm)

NH4Cl1 0,0 02 0,2 23 0,4 44 0,6 9,4 65 86 1,0 107 1,5 158 2,0

8,020

d.3 Procedimiento para la cuantificación de amonio porcolorimetría

Obtenidas las diluciones, agregar a cada tubo 0,4 mLde solución alcohólica de fenol al 10 %; 0,4 mL denitroprusiato de sodio al 0,5 % y 1 mL de soluciónoxidante, luego agitar para mezclar y dejar en reposodurante 1 hora. Observar una coloración que varia delverde azul al azul intenso en función de laconcentración de amonio. Leer la absorbancia de cadadilución en el espectrofotómetro a 632,9 nm.

Una vez obtenida la absorbancia de todas lasconcentraciones de amonio, corregir los valores ymediante regresión lineal con el programa MicrosoftExcel 2007, obtener la ecuación de la recta y elcoeficiente de correlación lineal (r2) que deberá sermayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea delos valores sobre la recta.

61

ANEXO 5

Detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro

a. Agar Sundara Rao Sinha SRSM (en Vazquez et al., 2000)

62

Componentes g/L GlucosaFosfato tricálcicoSulfato de amonioCloruro de potasioSulfato de magnesioSulfato de manganesoSulfato de fierroCloruro de sodioExtracto de levaduraPúrpura de bromocresolAgar agarAgua destilada en cantidadsuficientepH

10,005,000,500,200,300,00400,00205,000,500,1 151000 mL 07,2

Como fuente de fosfato se puede usar fosfato bicálcico (1g/L de fósforo), fosfato tricálcico (1 g/L de fósforo) yroca fosfórica (0,2 % de fósforo).

b. Método colorimétrico del Molibdato para cuantificarfósforo soluble (Rodier y Rodi, 2005)

b.1. FundamentoEn medio ácido y en presencia de molibdato amónico,

los ortofosfatos forman un complejo fosfomolíbdico que,reducido por el ácido ascórbico, desarrolla unacoloración azul susceptible de una determinacióncolorimétrica y cuya aparición se acelera utilizando elcatalizador emético, tartrato doble de antimonio ypotasio.

b.2 Limpieza de los recipientes de vidrio

Para la limpieza del material de vidrio no utilizardetergentes que contengan fosfato. Lavarlos con ácidoclorhídrico diluido y enjuagarlos cuidadosamente conagua destilada.

63

b.3 Reactivos Solución de ácido sulfúrico 5N

Ácido sulfúrico (d=1.84) 14 mL Agua destilada hasta enrase 100 mL

Solución de molibdato amónico 4 % 20 mL Solución de ácido ascórbico

Ácido ascórbico 1,76 g Agua destilada hasta enrase 100 mL

Solución de emético (preparar al momento deluso)

Tartrato doble de antimonio y potasio

0.0274g

Agua destilada hasta enrase 100 mL Reactivo para determinación de ortofosfatos

Ácido sulfúrico 5 N 40 mL Solución de molibdato amónico 12 mL Solución de ácido ascórbico 24 mL Solución de emético 4 mL

Solución madre de 0,2 mgl-1 de fósforo Fosfato monopotásico previamentedesecado en estufa a 100 ºC:

877 g

Agua destilada hasta enrase 100 mL Solución hija de 2 mgl-1 de fósforo

Diluir 1 mL de solución madre en 99 de aguadestilada (1/100)

b.4 Preparación de la curva de calibración Colocar en una serie de matraces aforados de 25 mL:

Número de matraces T I II

IISolución de fósforo de 2 mgL-1 (mL) 0 1 2 5

Agua bidestilada (mL) 20

19

18

15Reactivo indicador (mL) 4 4 4 4

64

Agua destilada hasta enrase (mL) 25

25

25

25Correspondencia de fósforo en mgL-1 0 0

,0,

0,

Esperar 20 minutos y efectuar las lecturas en elespectrofotómetro a la longitud de onda de 690 nm encubetas de 10 cm. Construir la curva de calibración.Los datos de la absorbancia corregida se analizanmediante regresión lineal con el programa MicrosoftExcel 2007 para obtener la ecuación de la recta y elcoeficiente de correlación lineal (r2) que deberá sermayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea delos valores sobre la recta.

b.5 Procedimiento para cuantificar fosfatos en lamuestra

Introducir 20 mL de la muestra a analizar en unmatraz aforado de 25 mL Añadir 4 mL de reactivoindicador, completar el volumen a 25 mL con aguadestilada. Esperar 20 minutos y efectuar la lectura enel espectrofotómetro de luz visible con una longitud deonda de 690 nm. Tener en cuenta el valor leído para eltestigo. Obtener los resultados en la curva decalibración. Para una muestra de 20 mL, la curvaindica el contenido de fósforo expresado en miligramospor litro. La coloración es estable 24 horas.

65

66