Aus der Medizinischen Universitätsklinik

Aus der Medizinischen Universitätsklinik

- Abteilung Innere Medizin I (Schwerpunkt Hämatologie und Onkologie) -

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

IDENTIFIZIERUNG UND FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG

VON ZIELGENEN DES LEUKÄMIE-SPEZIFISCHEN

TRANSKRIPTIONSFAKTORS AML1/ETO

INAUGURAL-DISSERTATION

zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

Vorgelegt 2010

von Jesús Duque Afonso

geboren in Santa Cruz de Tenerife, Spanien

Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum

1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Lübbert

2. Gutachter: Fr. Prof. Dr. Charlotte Niemeyer

Jahr der Promotion: 2011

Diese Doktorarbeit wurde von September 2004 bis Juli 2007 unter der Betreuung von Prof.

Dr. M. Lübbert in der Abteilung I der Inneren Medizin der Universitätsklinik Freiburg

angefertigt.

Teile dieser Doktorarbeit wurden in folgende Publikationen aufgenommen:

Duque-Afonso J., Yalcin A. Berg T., Abdelkarim M., Heidenreich O. and Lübbert M.. The HDAC class I specific inhibitor Entinostat (MS-275) effectively relieves epigenetic silencing of the LAT2 gene mediated by AML1/ETO. (Oncogene, Januar 2011, angenommen) Duque-Afonso J., Solari L., Essig A. Berg T., Pahl H. L. and Lübbert M. Regulation of the adaptor molecule LAT2, an in vivo target gene of AML1/ETO, during myeloid differentiation (British Journal of Haematology, Dezember 2010, angenommen) Müller AM., Duque J., Shizuru J.A. and Lübbert M.. Complementing Mutations in Core Binding Factor Leukemias: From Mouse Models to Clinical Therapeutic Implications. Oncogene 2008; 27(44): 5759-73 Claus R., Fliegauf M., Stock M., Duque J., Kolanczyk M. and Lübbert M. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation independently relieve AML1/ETO-mediated lysozyme repression. J. Leuk. Biol. 2006; 80: 1462-72

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

1.- Einleitung ......................................................................................................................................................... 1

1.1.- Akute Myeloische Leukämie ................................................................................................................. 1

1.2.- Pathogenese akuter myeloischer Leukämien. ....................................................................................... 2

1.2.1.- Die „Two-hit“-Hypothese............................................................................................................ 2

1.2.2.- Klinische Daten bestätigen die „Two-hit“-Hypothese .............................................................. 3

1.2.3.- Bestätigung der „Two-hit“ -Hypothese in Maus-Modellen...................................................... 3

1.3.- Das chimäre Fusionsprotein AML1/ETO ............................................................................................. 4

1.3.1.- Das AML1/RUNX1-Gen und der CBF-Transkriptionfaktorkomplex.................................... 5

1.3.2.- Das ETO-Gen............................................................................................................................... 6

1.3.3.- Das AML1/ETO-Fusionsgen ...................................................................................................... 7

1.3.4.- AML1- und AML1/ETO-Zielgene ............................................................................................. 8

1.4.- Epigenetische Aktivität von chimärer Fusionsproteinen in AML ...................................................... 9

1.4.1.- Die epigenetische Regulation der Gentranskription................................................................. 9

1.4.1.1.- DNA-Methylierung .............................................................................................................. 10

1.4.1.2- Histonmodifikation ............................................................................................................... 12

1.4.1.3.- Die Kooperation von DNA-Methylierung und Histonmodifikation in der Regulation der

Gentranskription................................................................................................................................ 12

1.4.1.4.- Die pharmakologische Beeinflussbarkeit der epigenetischen Genregulation:

demethylierende Substanzen und HDAC-Inhibitoren.................................................................... 13

1.4.2.- Das PML/RARα-Fusionsprotein .............................................................................................. 14

1.4.2.1.- PML/RARα: ein Modell der Kooperation von DNA-Methyltransferase und

Histondeacetylasen bei der Entstehung der AML........................................................................... 14

1.4.2.2.- RARβ2: Tumorsuppressor-Gen und Zielgen des PML/RARα Fusionsproteins. ........... 15

1.4.3.- Epigenetische Ereignisse in der Pathogenese des AML1/ETO-Proteins: therapeutische

Konsequenzen. ...................................................................................................................................... 15

1.5.- Die U937-9/14/18-Zelllinie .................................................................................................................... 16

1.6.- Methoden zur Analyse der DNA-Methylierung ................................................................................. 18

1.6.1.- Restriction Landmark Genomic Scanning (RLGS)............................................................... 18

1.6.2.- Bisulfit-Sequenzierung .............................................................................................................. 20

1.7.- LAT2-Gen als neues Zielgen von AML1/ETO ................................................................................... 20

1.8.- Myeloische Differenzierung.................................................................................................................. 23

2.- Ziele des Projektes ......................................................................................................................................... 25

3.- Materialien und Methoden ........................................................................................................................... 26

3.1.- Materialien............................................................................................................................................. 26

3.1.1.- Zellen .......................................................................................................................................... 26

3.1.1.1.- Zelllinien ............................................................................................................................... 26

3.1.1.2.- Bakterien............................................................................................................................... 27

3.1.1.3.- Primäre Zellen von gesunden Spendern ............................................................................ 28

3.1.1.4.- Primäre Zellen von Patienten ............................................................................................. 28

3.1.2.- Materialien für Zellkultur ........................................................................................................ 29

3.1.2.1.-Zellkulturmedien, Zusätze und Reagenzien ....................................................................... 29

3.1.2.2.- Sonstige Materialien, Plastikwaren .................................................................................... 29

3.1.3.- Materialien für die Bakterienkultur ........................................................................................ 30

3.1.4.- Materialien für molekularbiologische Arbeiten...................................................................... 30

3.1.4.1.- Chemikalien und Reagenzien.............................................................................................. 30

3.1.4.2.- Standardlösungen und Puffer ............................................................................................. 33

3.1.4.3.- Radiochemikalien................................................................................................................. 35

3.1.4.4.- Enzyme.................................................................................................................................. 35

3.1.4.5.- Nukleinsäuren ...................................................................................................................... 35

3.1.4.6.- Antikörper ............................................................................................................................ 37

3.1.4.7.- Kits ........................................................................................................................................ 38

3.1.4.8.- Sonstige Materialien ............................................................................................................ 39

3.1.5.- Geräte ......................................................................................................................................... 40

3.1.6.- Bioinformatische Software........................................................................................................ 41

3.2.- Methoden ............................................................................................................................................... 43

3.2.1.- Aufarbeitung des primären Materials. .................................................................................... 43

3.2.1.1.- Isolierung der peripheren Blutzellen.................................................................................. 43

3.2.1.2.- Lymphozyten-Isolierung ..................................................................................................... 43

3.2.1.3.- Monozyten-Isolierung.......................................................................................................... 44

3.2.1.4.- Granulozyten-Isolierung ..................................................................................................... 44

3.2.1.5.- Patientenproben ................................................................................................................... 44

3.2.1.6.- Isolierung von CD34+ Zellen .............................................................................................. 45

3.2.1.7.- Isolierung von Alveolar-Makrophagen. ............................................................................. 45

3.2.2. Zellkultur..................................................................................................................................... 45

3.2.2.1.- Kultivierung der Zellen ....................................................................................................... 46

3.2.2.2.- Einfrieren und Auftauen der Zellen................................................................................... 46

3.2.2.3.- Zellzahl- und Viabilitäts-Bestimmung durch Trypan Blau Färbung..............................47

3.2.2.4.- Zellzahl- und Viabilitäts-Bestimmung durch Färbung mit Türklösung......................... 47

3.2.2.5.- Abtrennung toter Zellen und Zelltrimmern mittels Ficollgradientenzentrifugation..... 48

3.2.2.6.- Beurteilung der Morphologie durch Zytospin und Färbung ........................................... 48

3.2.2.6.2- May-Grünwald Giemsa Färbung (Pappenheim Färbung)........................................... 48

3.2.2.6.3.- Benzidin Färbung........................................................................................................... 48

3.2.3.- Behandlung der Zellen .............................................................................................................. 49

3.2.3.1.- Induktion der Expression des AML1/ETO-Proteins in der 9/14/18-Zelllinie................. 49

3.2.3.2.- Myeloische Differenzierung der HL60, U937, NB4 und K562 Zelllinien. ....................... 49

3.2.3.3.- Ex vivo myeloische Differenzierung der CD34+ Zellen. ................................................... 50

3.2.3.4.- Behandlung der Kasumi-1 Zellinie mit epigenetisch aktiven Substanzen. ..................... 50

3.2.4.- Isolierung der Nukleinsäuren ................................................................................................... 51

3.2.4.1.- DNA-Isolierung mittels Phenol-Chloroform Extraktion. ................................................. 51

3.2.4.2.- DNA-Isolierung mittels Qiagen Kit .................................................................................... 52

3.2.4.3.- RNA-Isolierung mittels Guanidiniumthiocyanat. ............................................................. 52

3.2.4.4.- RNA-Isolierung mittels Qiagen Kit .................................................................................... 53

3.2.4.5.- Photometrische Bestimmung der DNA- und RNA-Konzentration.................................. 53

3.2.5.- cDNA Synthese........................................................................................................................... 53

3.2.5.1.- DNAse Verdau...................................................................................................................... 53

3.2.5.2.- Reverse Transkription – Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)...................................... 54

3.2.6.- Protein-Isolierung...................................................................................................................... 55

3.2.6.1.- Isolierung von Membranproteinen..................................................................................... 55

3.2.6.2.- Isolierung von nukleären und zytoplasmatischen Proteinen............................................ 55

3.2.6.3.- Proteinquantifizierung mittels Bradford Assay ................................................................ 56

3.2.7.- Sonden-Herstellung für Southern Blot .................................................................................... 56

3.2.7.1.- Entwicklung der Primer...................................................................................................... 56

3.2.7.2.- Amplifikation der Sonde durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)........................... 56

3.2.7.3.- Auftrennung von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese ....................................... 57

3.2.7.4.- Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen ...................................................... 57

3.2.7.5.- Klonierung des PCR Produkts............................................................................................ 57

3.2.7.6.- Transformation von kompetenten Bakterien.................................................................... 58

3.2.7.7.- Herstellung von Bakterien-Stocks ...................................................................................... 58

3.2.7.8.- Mini-Präparation von Plasmid-DNA ................................................................................. 58

3.2.7.9.- Maxi-Präparation von Plasmid-DNA................................................................................. 59

3.2.7.10.- Extraktion der Sonde aus dem Plasmid. .......................................................................... 59

3.2.8.- Sonden-Herstellung für Northern Blot .................................................................................... 59

3.2.9.- Restriktionsverdau der genomischen DNA ............................................................................. 60

3.2.10.- Southern Blot ........................................................................................................................... 60

3.2.10.1.- Vorbereitung und Auftrennung der genomischen DNA................................................. 60

3.2.10.2.- Transfer der DNA nach der Southern Blot Methode ..................................................... 60

3.2.11.- Northern Blot ........................................................................................................................... 61

3.2.11.1.- Vorbereitung und Auftrennung der RNA ....................................................................... 61

3.2.11.2.- Transfer der RNA nach der Northern Blot Methode ..................................................... 61

3.2.12.- Hybridisierung der Membranen von Southern und Northern Blot.................................... 62

3.2.12.1.- Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten ............................................................ 62

3.2.12.2.- Hybridisierung mit radioaktiv markierten DNA-Sonden .............................................. 62

3.2.13.- Western Blot ............................................................................................................................ 63

3.2.13.1.- Vorbereitung der Proben .................................................................................................. 63

3.2.13.2.- Elektrophoretische Auftrennung im Gel ......................................................................... 63

3.2.13.3.- Blotting................................................................................................................................ 64

3.2.13.4.- Protein-Detektion mittels Antikörper. ............................................................................. 65

3.2.14.- Durchflusszytometrie .............................................................................................................. 65

3.2.14.1.- Vorbereitung der Zellen für die Messung von Oberflächen-Antigenen........................ 65

3.2.14.2.- Messung der Oberflächen-Antigene................................................................................. 66

3.2.15.- "Real-time"-RT-PCR.............................................................................................................. 66

3.2.15.1.- Mechanismen...................................................................................................................... 66

3.2.15.2.- Durchführung..................................................................................................................... 67

3.2.15.3.- Relative Quantifizierung ................................................................................................... 68

3.2.16.- Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP).............................................................................. 69

3.2.17.- Densitometrie ........................................................................................................................... 70

3.2.18.- Statistische Auswertung .......................................................................................................... 70

4.- Ergebnisse....................................................................................................................................................... 71

4.1 Biologische Effekte der AML1/ETO-Induktion in 9/14/18-Zellen. ..................................................... 71

4.2.- Funktionelle Untersuchung des AML1/ETO-Zielgens LAT2 (WBSCR5/NTAL/LAB).................. 72

4.2.1.- Charakterisierung der Repression des LAT2-Gens in einer AML1/ETO induzierbaren

Zelllinie .................................................................................................................................................. 72

4.2.2.- Untersuchung der LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in myeloischen Zelllinien....... 73

4.2.3.- Untersuchung der Protein-Expression des LAT2-Gens in primären AML-Blasten von

Patienten mit unterschiedlichen chromosomalen Aberrationen....................................................... 75

4.2.4.- Untersuchung der Re-Expression des LAT2-Gens mittels siRNAs gegen AML1/ETO in

Kasumi-1-Zellen.................................................................................................................................... 79

4.2.5.- Re-Expression der LAT2-mRNA durch epigenetisch aktive Substanzen in der

AML1/ETO-positiven Kasumi-1-Zelllinie. ......................................................................................... 81

4.2.6.- Histonmodifikation nach der Behandlung mit MS-275 auf dem LAT2-Promotor in

Kasumi-1-Zellen.................................................................................................................................... 83

4.2.7.- Histonmodifikation nach der Induktion von AML1/ETO auf dem LAT2-Promotor in

9/14/18-Zellen. ....................................................................................................................................... 84

4.3.- Identifizierung neuer AML1/ETO-Zielgene mittels RLGS-Methode............................................... 86

4.3.1- RLGS-Ergebnisse ....................................................................................................................... 86

4.3.2.- Klonierung und Annotation der detektierten Sequenzen ...................................................... 88

4.3.3.- Funktionelle Annotationen der Gene....................................................................................... 89

4.3.4.- Southern Blots............................................................................................................................ 90

4.4.- Untersuchung der Expression des LAT2-Gens während induzierter myeloischer Differenzierung

von AML-Zelllinien. ......................................................................................................................................93

4.4.1.- Regulation von LAT2-mRNA und -Protein in der ATRA-induzierten granulozytären

Differenzierung der NB4-Zelllinie. ................................................................................................... 93

4.4.2.- Regulation von LAT2-mRNA und -Protein in der ATRA-induzierten granulozytären

Differenzierung der U937-Zelllinie. .................................................................................................. 95

4.4.3.- Regulation von LAT2-Protein in der ATRA-induzierten granulozytären Differenzierung

der HL60-Zelllinie. ............................................................................................................................. 98

4.4.4.- Regulation von LAT2-mRNA und -Protein in der DMSO-induzierten granulozytären

Differenzierung der HL60-Zelllinie. ............................................................................................... 100

4.4.5.- Regulation von LAT2-mRNA und Protein in der PMA-induzierten monozytären

Differenzierung der HL60-Zelllinie. ............................................................................................... 101

4.4.6.- Regulation von LAT2-Protein in der PMA-induzierten monozytären Differenzierung der

U937-Zelllinie. .................................................................................................................................. 104

4.4.7.- Expression von LAT2-Protein bei der Hemin-induzierten erythrozytären Differenzierung

der K562-Zelllinie............................................................................................................................. 106

4.4.8.- Expression von LAT2-Protein in der PMA-induzierten megakaryozytären

Differenzierung der K562-Zelllinie................................................................................................. 108

4.5.- Expression von LAT2-Protein in humanen primären Zellen.......................................................... 110

4.6.- Regulation von LAT2-Protein in der granulozytären und monozytären-dendritischen

Differenzierung der CD34 + Zellen durch Zytokine. ............................................................................... 112

5.- Diskussion..................................................................................................................................................... 114

Das Fusionsprotein AML1/ETO ................................................................................................................ 114

Epigenetische Regulation vom LAT2-Gen durch AML1/ETO ............................................................... 114

Screening von AML1/ETO Zielgenen auf Promoter- DNA-Methylierungsveränderungen. ................ 118

Regulation vom LAT2-Gen während der myeloischen Differenzierung. ............................................... 119

6 .- Zusammenfassung ...................................................................................................................................... 122

7.- Danksagung.................................................................................................................................................. 123

8.- Bibliographie................................................................................................................................................ 124

9.- Lebenslauf .................................................................................................................................................... 134

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.- Schematische Darstellung des AML1- und AML1/ETO- Proteins.........................................Seite 6

Abbildung 2.- Chemische Reaktion von Cytosin zu 5´-Methyl-Cytosin......................................................Seite 10

Abbildung 3.- Schematische Darstellung der DNA-Methylierung im normalen und Tumor-Gewebe........Seite 11

Abbildung 4.- Schematische Darstellung der Cytidin-Analoga 5-Azacytidin und 5-Aza-2'deoxycytidin

(Decitabine)....................................................................................................................................................Seite 13

Abbildung 5.- Das AML1/ETO-Protein rekrutiert HDACs und DNMTs....................................................Seite 16

Abbildung 6.- Das Ecdyson-induzierbare System........................................................................................Seite 17

Abbildung 7.- RLGS-Methode......................................................................................................................Seite 19

Abbildung 8.- Bisulfit-Konversion der DNA................................................................................................Seite 20

Abbildung 9.- Transduktionssignalwege des LAT2-Proteins in Mastzellen................................................Seite 22

Abbildung 10.- Schematische Darstellung der Myelopoese.........................................................................Seite 24

Abbildung 11.- Funktionelle Analyse der AML1/ETO-induzierbaren U-937 Zellen..................................Seite 74

Abbildung 12.- Repression von LAT2-mRNA und -Protein nach der ektopen Expression vom AML1/ETO in

der 9/14/18-Zelllinie.......................................................................................................................................Seite 76

Abbildung 13.- LAT2-Expression in verschiedenen Zelllinien....................................................................Seite 77

Abbildung 14.- LAT2-Protein-Expression in Knochenmarksproben von Patienten mit AML von

unterschiedlichen Karyotypen........................................................................................................................Seite 78

Abbildung 15.- LAT2 Protein-Expression in Knochenmarksproben von Patienten mit AML zu Zeitpunkt der

Erst-Diagnose (ED) und der Vollremission (CR)..........................................................................................Seite 81

Abbildung 16.- Re-Expression der LAT2-mRNA nach Knock-down von AML1/ETO mittels siRNAs in der

Kasumi-1-Zelllinie.........................................................................................................................................Seite 83

Abbildung 17.- LAT2-mRNA Re-Expression durch epigenetische aktive Therapien in der AML1/ETO positiven

Kasumi-1-Zellen.............................................................................................................................................Seite 85

Abbildung 18.- Induktion der aktivierenden Histon-Modification durch MS-275 und AML1/ETO -vermittelte

Rekrutierung von HDAC-Aktivität in den 9/14/18-Zellen............................................................................Seite 87

Abbildung 19.- Intensitätsveränderung von Spot 2D24 (Dematin-Gen) in RLGS Gelen nach der Induktion des

AML1/ETO-Proteins in 9/14/18....................................................................................................................Seite 89

Abbildung 20.- RLGS-Ergebnisse................................................................................................................Seite 91

Abbildung 21.- Southern Blot für Dematin-Gen...........................................................................................Seite 93

Abbildung 22.- Southern Blot von PTPN11-Gen.........................................................................................Seite 95

Abbildung 23.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch ATRA induzierten granulozytären

Differenzierung der NB4-Zellen....................................................................................................................Seite 97

Abbildung 24.- LAT2-mRNA- und Protein-Expression in der granulozytären Differenzierung der NB4- Zellen

durch ATRA...................................................................................................................................................Seite 98


Differenzierung der U937-Zellen...................................................................................................................Seite 99

Abbildung 26.- LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in der granulozytären Differenzierung der U937

Zelllinie durch ATRA..................................................................................................................................Seite 100


Differenzierung der HL60-Zellen................................................................................................................Seite 101

Abbildung 28.- LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in der granulozytären Differenzierung der HL60-

Zelllinie durch ATRA..................................................................................................................................Seite 102



Abbildung 30.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch PMA induzierten monozytären-macrophagen


Abbildung 31.- LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in der monozytären-macrophagen Differenzierung der

HL60-Zelllinie durch PMA..........................................................................................................................Seite 106

Abbildung 32.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch PMA induzierten monozytären-macrophagen

Differenzierung der U937-Zellen................................................................................................................Seite 108

Abbildung 33.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch Hemin induzierten erythrozytären

Differenzierung der K562-Zellen.................................................................................................................Seite 109

Abbildung 34.- LAT2-Protein-Expression während der durch Hemin induzierten erythrozytären Differenzierung

der K562-Zelllinie........................................................................................................................................Seite 110

Abbildung 35.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch PMA-induzierten megakaryozytären

Differenzierung der K562-Zellen.................................................................................................................Seite 111

Abbildung 36.- LAT2-Protein-Expression in der megakaryozytären Differenzierung der K562-Zelllinie durch

PMA.............................................................................................................................................................Seite 113

Abbildung 37.- LAT2-Protein-Expression in primären Blutzellen und alveolären Makrophagen.............Seite 114

Abbildung 38.- LAT2-Protein-Expression in der myeloischen Differenzierung von normalen CD34+ Zellen.

......................................................................................................................................................................Seite 115

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.- Zusammenfassung der AML1- und AML1/ETO-Zielgene..........................................................Seite 8

Tabelle 2.- Reagenzien für eine „real-time“-RT-PCR…...............................................................................Seite 68

Tabelle 3.- Temperatur- und Zeit-Bedingungen für eine „real-time“-RT-PCR............................................Seite 68

Tabelle 4.- Klinischen Daten der untersuchten Patienten..............................................................................Seite 79

Tabelle 5.- Ergebnisse der sequenzierten RLGS-Spots................................................................................Seite 92

Abkürzungsverzeichnis

Aberr. Aberrationen

A/E AML1/ETO

AG: Arbeitsgruppe

ALL: Akute lymphatische Leukämie

AIMS: Amplification of inter-methylated sites

AML: Akute myeloische Leukämie

AML1: Akute myeloische Leukämie Gen 1

APL: Akute promyeloische Leukämie

ATRA: All trans-Retinsäure

BCL-2: B cell CLL/lymphoma 2

bp: Basenpaare

BSA: Bovine Serum Albumine

CBF: Core binding factor

CBFB: Core binding factor subunit β

cDNA: Zirkuläre Desoxyribonucleinsäure

C/EBPα: CAATT enhancer binding protein α

Cp: Cross points

CPM: counts pro minute

CSF-R: Colony stimulating factor receptor

CREB: c-AMP response element binding

CTP: Cytosine Triphosphate

dL: Deciliter

DAC: Decitabine

DC: Dendritische Zellen

DDT: Dithiothreitol

DMSO: Dimethylsulfoxid

DNA: Desoxyribonukleinsäure

DNMT: DNA Methyltransferase

Dnmt1: DNA Methyltransferase Typ 1

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

EAP: EBER-associated protein

EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure

ENU: N-Ethyl-N-Nitrosurea

ETO: Eight-Twenty-One Gen

EVI1: ecotropic viral integration site 1

FAB: French-American-British

FACS: Fluorescence-activated cell sorting

FBS: Fetal Bovine Serum

FcЄR I: Fc epsilon receptor I

FITC: fluorescein isothiocyanate

FLT3: fms-related tyrosine kinase 3

FS: Vorwärtsbeugung

FW: Forward

GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphate Dehydrogenase

gDNA: Genomische DNA

GEM: glycosphingolipid enriched membrane

G-CSF: Granulocyte colony stimulating factor

GM-CSF: Granulocyte-macrophage colony stimulating factor

GTP: Guanosine Triphosphate

GUSB: β-Glukoronidase

H3: Histon H3

H4: Histon H4

HAT: Histon-Acetyl Transferase

Hb: Hämoglobin

HCl: Salzsäure

HDAC: Histon-Deacetylase

HDAC1: Histon-Deacetylase Typ 1

bHLH: basic Helix-Loop-Helix

HSW Buffer: “High Stringency Wash” Puffer

IL-3: Interleukin 3

IL-4: Interleukin 4

IL-6: Interleukin 6

inv: Inversion

ITD: Internal tandem duplication

JAK2: Janus Kinase 2

kB: Kilobasen

kDa: Kilodalton

KM: Knochenmark

KK: Komplexer Karyotyp

LAB: Linker for activation of B cells

LAT: Linker for activation of T cells

LB Medium: Luria Broth Base Medium

LSW Buffer: Low Stringency Wash Buffer

M: Molar

MBD: Methyl binding protein

M-CSF: Macrophage colony stimulating factor

MDS: Myelodysplastische Syndrom

MES buffer: 3–(N–Morpholino) Ethansulfonsäure-Puffer

MIP-1α: Macrophage inflammatory protein - 1α

MPO: Myeloperoxidase

min: Minuten

MOPS: 3-N-morpholino Propan-sulfon-säure

MSP: Methylierungs-spezifische-PCR

MDR1: multiple drug resistance Gen 1

MTG8: myeloid translocation gene on 8q22

MYH11: Myosin heavy chain 11

ml: Milliliter

µl: Mikroliter

µg: Mikrogramm

µM: Mikromolar

mm: Millimeter

mM: Millimolar

mg/mL: Milligramm pro Milliliter

MTA: Medizinisch-Technischer Assistent

NaCl: Natriumchlorid

NaCitrate: Natriumcitrat

NaF: Natriumfluorid

NaOH: Natriumlauge

Na3VO4: Natrium-Orthovanadat

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NEB: New England Biolabs

NN: Normalkaryotyp

nm: Nanometer

ng: Nanogramm

NP40: Nonidet P40 Lösung

NTAL: Non T cell activation linker

OH: Ohio

PB: Peripheres Blut

PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

PE: Phykoerythrin

PCR: Polymerase-Ketten-Reaktion

PLC-γ1: Phospholipase C gamma 1

PMA: Phorbol 12-Myristat 13-Acetat

pmol: picomol

PML: Promyelocytic leukemia Gene

PMSF: Phenylmethylsulphonylfluorid

Pon A: Ponasteron A

p14arf: p14arf /CDKN2A Gen

PTPN11: Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (Noonan syndrome 1) Gen

RARβ2: Retinoid acid receptor beta 2

RARa: Retinoid acid receptor alpha

RDA: Representational Difference Analysis

RLGS: Restriction Landmark Genomic Scanning

RNA: Ribonukleinsäure

rpm: Revolutionen pro Minute

RT-Reaktion: Reverse Transkriptase Reaktion

RUNX1: Runt related Transkription-faktor 1

RHD: Runt homology domain

RW: Reverse Primer

s.: Siehe

SAHA: Suberoylanilid- hidroxam-säure

sAML: Sekundäre AML

SCF: Stem cell factor

SDS: Natriumdodecylsulfat

sec Sekunden

SS: Seitwärtsstreuung

SSC: Kochsalz/Natriumcitrat-Puffer

Std: Stunden

t: Translokation

tAML: Therapy-related AML

TBS-T: Gepufferte Kochsalzlösung mit Tween

TE Buffer: Tris EDTA Puffer

TSA: Trichostatin A

U/mL: Einheiten pro Milliliter

UV Ultraviolett

usw: Und so weiter

vs: versus

V: Volt

WBSCR5: Williams Beuren Syndrome Critical Region 5 Gen

WHO: World Health Organisation

µL: Mikroliter

µg: Mikrogramm

µg/ µL: Mikrogramm pro Mikroliter

X-Gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolzl-b-D-Galactopyranosid

WBC: white blood cells, Leukozyten

Tsd: Tausend

1.- Einleitung Seite - 1 -

1.- Einleitung

1.1.- Akute Myeloische Leukämie

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine hämatologische Krankheit, die durch

eine erhöhte Zahl von Blasten im Knochenmark und eine Blockade ihrer Reifung

charakterisiert ist. Dies führt zu einer Insuffizienz der Hämatopoese mit oder ohne

Leukozytose. In den Industrieländern liegt die Inzidenz bei rund 2-3 Fällen pro 100000

Einwohner pro Jahr. Diese Zahl steigt aber im Alter auf bis zu 12 Fälle pro 100000 Personen

über 65 Jahre an (Löwenberg et al., 1999).

In der ersten French American British (FAB) Klassifikation waren mehr als 30 %

Blasten im Knochenmark für die Diagnose einer AML notwendig (Bennett et al., 1976). Je

nach morphologischen Charakteristika der AML-Blasten kann man nach der FAB-

Klassifikation 8 verschiedene Subgruppen unterteilen. (Bennett et al., 1976, 1980, 1985,

1991).

Diese Klassifikation wurde von der WHO (World Health Organisation) durch eine

Einteilung aus der Kombination von Morphologie, Immunophänotyp, genetischen und

klinischen Charakteristika ergänzt und revidiert. In der WHO-Klassifikation reichen 20 %

Blasten im Knochenmark für die Diagnose einer AML aus (Harris et al., 1999). Die WHO-

Klassifikation unterscheidet 5 Gruppen: AML mit rekurrenten chromosomalen

Translokationen, AML mit multilineärer Dysplasie, AML und Myelodysplastisches Syndrom

(MDS) nach vorausgegangener Therapie, AML nicht in anderen Gruppen klassifiziert, und

biphänotypische AML (Harris et al., 1999).

In der Ära der Zytogenetik konnte gezeigt werden, dass die verschiedenen

chromosomalen Translokationen eine bessere Korrelation mit der Prognose der AML haben

(Arthur et al., 1989) als die FAB-Klassifikation. Es wurde auch festgestellt, dass bestimmte

Translokationen sehr häufig in manchen Subgruppen der FAB-Klassiffikation vorkommen,

wie z. B. die Translokation t(15;17) in der FAB M3 Subgruppe (de Thé et al., 1990), und die

Inversion inv(16) in der M4eo Subgruppe (Le Beau et al., 1983). Infolgedessen wurde

angenommen, dass die verschiedenen chromosomalen Aberrationen eine Rolle in der

Entstehung der AML und der Charakteristika der Blasten spielen.


1.2.- Pathogenese akuter myeloischer Leukämien.

Für den molekularen Pathomechanismus der AML sind chromosomale und genetische

Veränderungen von entscheidender Bedeutung. Dies sind beispielweise:

Chromosomentranslokationen t(8;21), t(15;17), inv(16), Deletionen eines Chromosomenteils

oder eines ganzen Chromosoms (5q-, 7q-, 20q-, 12p-), Trisomien (8, 13, 21), Aktivierung von

Onkogenen (Punkmutationen in N-Ras oder K-Ras Genen, Mutationen und Insertionen in Typ

III-Tyrosinkinaserezeptoren wie FLT3 und c-Kit) und Geninaktivierung durch Promoter-

Hypermethylierung (p15, Oestrogen Gen Rezeptor, E-cadherin) (Löwenberg et al., 1999)

1.2.1.- Die „Two-hit“-Hypothese

In den letzten Jahren hat sich die „Two-hit“ Hypothese für die Entstehung der AML

von Knudson (Gilliland, 2001) sowohl in klinischen Studien als auch in Mausmodellen

bestätigen lassen. Nach dieser Hypothese gibt es zwei verschiedene genetische Ereignisse für

die Entstehung der AML. Zum einen gibt es die der Klasse I-Mutationen, die den Zellen ein

proliferatives Signal und eine Hemmung der Apoptose vermitteln. Beispiele von Klasse I-

Mutationen sind die Punkmutationen in Codon 12, 13 und 61 der Onkogene N-Ras und K-Ras

(Bacher et al., 2006; Bowen et al., 2005; Gari et al., 1999; Valk et al., 2004a); Mutationen,

Deletionen und Insertionen in der juxtamembranären oder in der Tyrosinkinase-Domäne der

Rezeptoren FLT3 (Kottaridis et al., 2001; Kuchenbauer et al., 2005; Schnittger et al., 2002;

Thiede et al., 2002) und c-Kit (Boissel et al., 2006; Paschka et al., 2006; Schessl et al., 2005)

und Mutationen in der Janus Kinase 2 (JAK2) (Lee et al., 2006; Schnittger et al., 2007;

Schnittger et al., 2006). Mutationen der Klasse II verursachen eine Blockade der

Differenzierung in den betroffenen Zellen. Translokationen, in denen Transkriptionsfaktoren

(wie z.B. AML1/ETO, PML/RARα, CBFB/MYH11) involviert sind, und Punktmutation von

Transkriptionsfaktoren der Hämatopoese wie z.B. AML1 (Michaud et al., 2002), CEBPα

(Pabst et al., 2001b) und Pu.1 (Mueller et al., 2002) gehören zu solchen Klasse II Mutationen.

Klasse I-und Klasse II-Mutationen kooperieren in der Pathogenese akuter myeloischer

Leukämien.


1.2.2.- Klinische Daten bestätigen die „Two-hit“-Hypothese

Diese Hypothese wurde in den letzten Jahren durch Mutations-Screening in

verschiedenen klinischen AML-Studien bestätigt. Es wurde nachgewiesen, dass einige Klasse

I Mutationen in bestimmten Karyotypen von AML-Patienten häufiger sind. Mutationen von

FLT3-Rezeptor finden sich in 30 % der Patienten mit der Translokation (15;17) (Kuchenbauer

et al., 2005) und mit Normalkaryotyp (NN) (Schnittger et al., 2002; Thiede et al., 2002).

Mutationen des c-Kit-Rezeptors sind in 17-30 % der Patienten mit "Core Binding Factor

Leukämie", das heißt mit Translokation t(8;21) oder Inversion inv(16) beschrieben (Boissel et

al., 2006; Paschka et al., 2006; Schessl et al., 2005). N-Ras Punktmutationen sind in 10-30 %

der Patienten mit inv(16) vorhanden (Bacher et al., 2006).

Die Untersuchung verschiedener Mutationen in Verbindung mit dem Karyotyp in

AML-Patienten hat einen groβen Einfluss auf die Prognose und die klinische Behandlung.

Zum Beispiel haben AML1/ETO-positive Patienten allgemein eine gute Prognose, bei

Koexistenz einer Mutation des c-Kit-Rezeptors zeigt sich eine schlechtere Prognose (Paschka

et al., 2006) mit entsprechenden therapeutischen Konzequenzen wie Therapieintensivierung

(z.B. allogene Stamzelltransplantation in erster kompletter Remission). Zurzeit werden neue

spezifische Medikamente entwickelt, die die Effekte von FLT3- und c-Kit-Mutationen

blockieren oder N-Ras- und K-Ras-Onkogene inhibieren können (Tallman et al., 2005). Diese

Medikamente können bei Vorliegen der Mutationen z. B. in Kombination mit einer

Chemotherapie eingesetzt werden.

1.2.3.- Bestätigung der „Two-hit“ -Hypothese in Maus-Modellen.

Die „Two-hit“ Hypothese für die Entstehung von Leukämien konnte auch in

Mausmodellen bestätigt werden. Transgene knock-in Mäuse für AML1/ETO (Yergeau et al.,

1997) und CBFB/MYH11 (Castilla et al., 1999) verstarben am 14. Tag der embryonalen

Entwicklung an intrakraniellen Blutungen und fehlender Leberhämatopoese. Dieser Phänotyp

ist sehr ähnlich im Vergleich mit AML1- (Okuda et al., 1996) und CBFB- (Wang et al., 1996)

knock-out Mäusen. Das zeigt die dominante Rolle der Fusionsgene AML1/ETO und

CBF/MYH11 über den Transkriptionskomplex CBF („Core Binding Factor“) und die

Blockade der myeloischen Differenzierung, die diese Fusionsgene in AML Blasten

verursachen. Im Weiteren wurden AML1/ETO Knock-in Mäuse mit einem Tetracyclin-

induzierbaren System (Rhoades et al., 2000), mit einer Cre/loxP Rekombination (Higuchi et


al., 2002) und unter Kontrolle des myeloischen spezifischen Promoters hMRP8 (Yuan et al.,

2001) generiert. Obwohl die Hämatopoese einer präleukämischen Phase ähnlich war,

entwickelten die Mäuse keine akute myeloische Leukämie. Nur unter zusätzlicher

Behandlung mit dem DNA-alkylierten-Mutagen N-Ethyl-N-nitrosurea (ENU) (Yuan et al.,

2001) oder wenn die Knochenmarkstammzellen mit dem Transgen einer aktivierten Rezeptor

Kinase wie TEL/EVI1 (Grisolano et al., 2003) oder FLT3-ITD (Schessl et al., 2005)

transfiziert wurden, entwickelten die AML1/ETO-Knock-in Mäuse eine AML-ähnliche

Krankheit. Weitere Hinweise dafür zeigten Knock-in Mäuse für PML/RARα in Kombination

mit dem FLT3-ITD Mutant (Kelly et al., 2002) und die Knock-in Mäuse für CBF/MYH11 in

Kombination mit ENU (Castilla et al., 1999) oder retroviraler Transfektion (Castilla et al.,

2004), die jeweils APL bzw AML-ähnlichen Krankheiten entwickelten und daran starben. In

Sp1/PU.1 knock-out Mäusen, deren Proerythroblasten eine Blockade in der Differenzierung

zeigten und eine Erythroleukämie zu einem späteren Zeitpunkt entwickelten, wurden

sekundäre genetische Ereignisse zur Entstehung der akuten Erythroleukämie untersucht. 86 %

der Tumorzellen wiesen eine Mutation des c-Kit-Rezeptors im letzten Stadium der Krankheit

auf (Kosmider et al., 2005).

Um spezifischere Therapien der einzelnen Subtypen der AML zu entwickeln, ist ein

fundamentales Verständnis dieser molekularen Veränderungen in der Leukämogenese von

entscheidender Bedeutung.

1.3.- Das chimäre Fusionsprotein AML1/ETO

Die Translokation t(8;21) führt zur Produktion eines Fusionsproteins, welches aus 177

Aminosäuren des N-terminalen Teils des AML1- (RUNX1) Gens von Chromosom 21,

einschlieβlich der DNA-Bindungs- und der CBF-Interaktionsdomäne, und fast dem gesamten

ETO-Gen von Chromosom 8 besteht (Miyoshi et al., 1991). Diese reziproke chromosomale

Translokation war die erste, die bei AML nachgewiesen werden konnte (Rowley, 1973).

Morphologisch sind die Blasten, die diese Translokation tragen, Myeloperoxidase positiv,

haben häufig mehrere Nukleolen, Vakuolen, Globuli und rötliche Granula. Charakteristisch

sind auch Auerstäbchen im Zytoplasma (Nucifora and Rowley, 1995). Immunophänotypisch

sind die Blasten häufig positiv für die myeloischen Antigene CD13, CD15, die Stammzell-

Antigene CD34 und HLA-DR und den B-Zell Marker CD19 sowie das Antigen CD56. Die

Blasten sind negativ bezüglich der Expression des MDR1-Gens und der Expression des CD33


Antigens (Hurwitz et al., 1992; Kita et al., 1992; Orazi et al., 1992). Die Blasten mit der

Translokation t(8;21) gehören gemäß FAB-Klassifikation hauptsächlich zur Subgruppe M2.

1.3.1.- Das AML1/RUNX1-Gen und der CBF-Transkriptionfaktorkomplex

Das physiologische AML1-Gen ist ein Transkriptionsfaktor, der zur Familie der

RUNX-Gene gehört. Die RUNX-Gene haben einen sehr hohen Grad an Sequenzhomologie

zum Drosophila Transkriptionsfaktor "runt" (Gergen and Wieschaus, 1986; Ogawa et al.,

1993) und spielen eine wichtige Rolle in der embryonalen Entwicklung verschiedener

Organsysteme: AML1/RUNX1 in der Hämatopoese (Okuda et al., 1996; Wang et al., 1996),

AML3/RUNX2 in der Osteogenese (Otto et al., 1997) und AML2/RUNX3 in der

Neurogenese (Levanon et al., 2002) und der Entwicklung der gastrischen epithelialen Zellen

(Li et al., 2002).

Das AML1-Protein gehört zu einem aktivierenden Transkriptionskomplex, der als

„Core Binding Factor“ (CBF) bekannt ist. Das AML1/RUNX1-Protein besitzt eine DNA

Bindungstelle in der „Runt Homologous Domäne“ (RHD), welche die Sequenz TGTGGT an

den Promotoren von Zielgenen erkennt (Meyers et al., 1993; Otto et al., 2003). Es hat eine

sehr hohe Homologie zur „runt“ Domäne der transkriptionellen Regulatoren der

Segmentierungsgene von Drosophila (Gergen and Wieschaus, 1986). Es gibt 3

unterschiedliche Splicing-Varianten: AML1a (Meyers et al., 1995), AML1b und AML1c

(Miyoshi et al., 1995), die möglicherweise verschiedene Funktionen in der Regulation der

Genexpression haben könnten.

Die CBFB-Untereinheit besitzt keine DNA-Bindungsdomäne, aber sie interagiert mit

dem AML1/RUNX1-Protein in der „RHD“-Region. Die CBFB-Bindung erhöht die Affinität

des CBF-Komplexes an den DNA-Doppelstrang (Ogawa et al., 1993). Diese Interaktion

zwischen CBFB und AML1/RUNX1 stabilisiert und schützt vor der Degradation durch

Ubiquitinierung (Huang et al., 2001). Der CBF-Komplex reguliert die Transkription von

verschiedenen für die Hämatopoese wichtigen Genen durch Interaktion mit transkriptionellen

Co-Aktivatoren wie p-300 und CREB-binding Protein, die ihrerseits mit Histon-Acetyl-

Transferasen (HAT) interagieren und sie an Genpromotoren rekrutieren (Kitabayashi et al.,

1998). HATs sind Proteine, die die Aminosäuren Lysin und Arginin der Histone H3 und H4

acetylieren und somit die Konformation von Histonen zu einer aktiven Form verändern

können (Santos-Rosa and Caldas, 2005). Dadurch wird Chromatin im Bereich von

Promotoren der AML1-Zielgene in eine zugänglichere Struktur verwandelt, so dass die


Transkription dieser Gene stattfinden kann. RUNX1 rekrutiert zusätzlich SUV39

Methyltransferase und kann auch durch Methylierung von Lysin 9 im Histon 3 (H3) die

Expression der Gene beeinflussen (Reed-Inderbitzin, Oncogene 2006).

1.3.2.- Das ETO-Gen

Das ETO/MTG8-Gen befindet sich auf Chromosom 8 Bande q22. Obwohl seine

Expression im Gehirn sehr hoch ist (Erickson et al., 1994) und 2 putative Zinc-Fingermotive

hat (Lo Coco et al., 1997), bleibt seine physiologische Funktion unbekannt. Auf eine Funktion

bei der Entwicklung des Darms wurde in einer Arbeit verwiesen (Calabi et al., 2001). Es

Abbi ldung 1.- Schematische Darstellung des AML1- und AML1/ETO - Proteins. Das AML1-Protein ist auf dem langen Arm des Chromosoms 8 lokalisiert. Die RHD Domäne des AML1 Proteins erkennt im Bereich des Promotors seiner Zielgene die Konsensus-Sequenz TGT/cGGT. Das CBFB-Protein interagiert mit AML1 und steigert die DNA-Affinität des CBF-Komplexes. Auβerdem stabilisiert und schützt sie den CBF-Komplex vor Ubiquitin-Degradation. Durch Interaktion von AML1 mit p300 und CREB-Binding-Protein werden Histon-Acetylasen an Zielgene rekrutiert, und damit wird die Konformation der Histone zu einer aktiveren Form umgewandelt. In der t(8; 21) wird das AML1-Gen mit ETO fusioniert. AML1 behält die RHD-Domäne und somit die DNA-Bindungs-Domäne und seine Interaktion mit CBFB. ETO interagiert mit dem Co-Repressor-Komplex mit N-Cor und m-Sin3a. Dadurch werden Histon-Deacetylasen an AML1-Zielgene rekrutiert und die Konformation der Histone wird in eine inaktivere Form umgewandelt.

Chr. 8

Chr. 21

AML1

CBFßP300

HAT

CCGTGT/cGGTATGTGTCTGACTGCTGAGTATGA

Targetgenes

IL-3

GM-CSF

CSF1-R

C/EBP-α

MPO

T cell receptor subunits

CBFß


Targetgenes

IL-3

GM-CSF

CSF1-R

C/EBP-α

MPO

T cell receptor subunits

AML1

ETO

NCor mSin3

HDAC1

t(8;21)

AML1

AML1/

ETO

WBSCR5

WBSCR5


konnte gezeigt werden, dass das ETO-Protein über die Zink-Finger-Domäne direkt an die

nukleären Proteine N-Cor und mSin3a binden kann (Lutterbach et al., 1998). Diese Proteine

interagieren ihrerseits gleichzeitig mit den Histone-Deacetylasen (HDAC) 1 (Wang et al.,

1998), HDAC2 and HDAC3 (Amann et al., 2001). Dies bewirkt, dass ETO durch Interaktion

mit DNA-bindenden Transkriptionsfaktoren und durch Rekrutierung eines Co-Repressor

Komplexes die Genexpression regulieren kann (Alcalay et al., 2003; Gelmetti et al., 1998).

1.3.3.- Das AML1/ETO-Fusionsgen

Das AML1/RUNX1-Gen ist in verschiedene chromosomale Translokationen in AML

und ALL involviert. Es wird vermutet, dass die resultierende klinische Entität von der

Funktion der Partner des AML1-Gens abhängig ist (Alcalay et al., 2001). Es finden sich

Fusionen mit EVI-1 (Mitani et al., 1994), MDS-1 und EAP (Nucifora et al., 1993) auf

Chromosom 3 in AML der Erwachsenen und mit TEL auf Chromosom 12 (Golub et al.,

1995) in ALL bei Kindern. Häufigste Kooperationspartner von AML1 ist das ETO-Gen auf

Chromosom 8 in AML der Erwachsenen.

In der Translokation t(8;21) wird der N-terminale Teil des AML1-Gens von

Chromosom 21 mit nahezu dem ganzen ETO-Gen von Chromosom 8 verbunden (Erickson et

al., 1992). Es gibt unterschiedliche Transkript-Varianten, jedoch behält das AML1-Protein

immer die DNA-Bindungsdomäne und die Interaktion mit der CBFB-Untereinheit, die eine

gewisse Stabilität des chimären Fusionsproteins bewirkt und die DNA-Affinität verstärkt

(Ogawa et al., 1993). Der ETO-Teil des Fusionsproteins rekrutiert HDACs durch seine

Partner N-Cor und mSin3a an AML1- bzw. AML1/ETO-Zielgene, deren Expression durch

eine Konformationsänderung der lokalen Histone gehemmt wird (Lutterbach et al., 1998;

Wang et al., 1998).

Es wurde sowohl in einer AML1/ETO-positiven Zelllinie als auch in AML-Blasten

von Patienten gezeigt, dass AML1/ETO auch durch einen anderen epigenetischen

Mechanismus, nämlich die Rekrutierung von DNA-Methyltransferase (DNMTs) an den

Zielpromotor, die Expression des AML1/ETO-Zielgens IL-3 hemmen kann (Liu et al., 2005).

AML1/ETO kann auch durch Protein-Protein Interaktion die Expression von Genen

reprimieren, die nicht durch AML1 reguliert sind (Mao et al., 1999) und kompetitiv die

Funktion von Transkriptionsfaktoren inhibieren (Westendorf et al., 1998). Letztlich wurde

gezeigt, dass AML1/ETO durch die Interaktion mit den E Proteinen (Klasse A der bHLH


Proteine) E2A und HEB die Expression der entsprechenden Zielgene reprimieren kann

(Zhang et al., 2004).

1.3.4.- AML1- und AML1/ETO-Zielgene

Der Nachweis und die funktionelle Untersuchung von AML1/ETO Zielgenen hat zu

einem besseren Verständnis des Pathomechanismus dieses Fusionsproteins geführt.

AML1 und AML1/ETO regulieren die Expression verschiedener Gene, die zumeist

eine wichtige Rolle in der Hämatopoese spielen. AML1 aktiviert die Transkription der Gene

durch Rekrutierung seines Ko-Aktivatorkomplexes, AML1/ETO hingegen hindert die Trans-

Aktivierung dieser AML1-Zielgene durch Rekrutierung von HDACs (Gelmetti et al., 1998)

und möglicherweise DNMTs (Liu et al., 2005). Entsprechende Beispiele sind in der folgenden

Tabelle genannt:

Tabelle 1.- Zusammenfassung der AML1- und AML1/ETO-Zielgene

Gen Name Funktion des Proteins Art der Regulation Referenzen

IL-3

Wachstumsfaktor von hämatopoetischen Stammzellen und myeloischen Progenitoren.

AML1/ETO Repression mittels HDAC und DNMT in Zelllinien und myeloischen Blasten.

(Cameron et al., 1994) (Uchida et al., 1997) (Liu et al., 2005)

p14ARF

p14ARF bindet an MDM2 und fördert seine Degradation. Infolgedessen wird p53 stabilisiert und der Zellzyklus wird in G1 und G2/M Phase gestoppt

AML1/ETO bindet an den p14 ARF Promotor und reprimiert seine Expression

(Linggi et al., 2002)

T-Zell Rezeptor δ Funktion in der Entwicklung der T-Zellen

AML1-Bindung ist notwendig für die Aktivierung der Transkription.

(Redondo et al., 1992)

C/EBPα

Notwendig für die Differenzierung der Granulozyten. Aktiviert die Transkription des G-CSF Rezeptors.

C/EBPα Expression ist herunterreguliert in AML1/ETO positiven Blasten und Zelllinien. AML1/ETO blockiert die Selbst-regulation von C/EBPα.

(Pabst et al., 2001a)

M-CSF Rezeptor

Involviert in Differenzierung, Proliferation und Überleben von Monozyten.

C/EBPα und AML1 aktivieren seiner Transkription in vitro.

(Zhang et al., 1994) (Petrovick et al., 1998)

GM-CSF Zytokin, Wachstum und Differenzierung der Granulozyten,

AML1/ETO blockiert die Transaktivierung des GM-CSF Promotors durch AML1

(Frank et al., 1995)


Monozyten, Eosinophilen und Erythrozyten wird gefördert.

Myeloperoxidase (MPO)

Microbizides Protein vorhanden in primärer Granula myeloischer Zellen.

Erstes identifiziertes myeloisches Gen; reguliert durch AML1-Bindung im Promotor in vitro.

(Nuchprayoon et al., 1994)

Neutrophile Elastase

Microbizides Protein vorhanden in primären Granula der myeloischen Zellen.

AML1 bindet und aktiviert die Transkription in vitro.

(Nuchprayoon et al., 1994)

Pu.1

Reguliert die Transkription von myeloisch-spezifischen Genen wie G-CSF-R und GM-CSF-R

Die mRNA von PU.1 ist nicht detektierbar in Geweben von AML1 (-/-) und CBFB (-/-) Mäuse.

(Okada et al., 1998) (Vangala et al., 2003)

G-CSF Rezeptor

Spezifischer myeloischer Rezeptor des Wachstumfaktors G-CSF.

Indirekte Hochregulation durch C/EBPα, nach ektopischer AML1/ETO Induktion.

(Shimizu et al., 2000)

BCL-2

Reguliert den programmierten Zelltod und seine Überexpression kann Apoptose verzögern und verhindern.

Hohe Expression in AML1/ETO positiven Zelllinien, Hochregulation nach der Induktion von AML1/ETO in U937 und sequenzspezifische Bindung von AML1 und AML1/ETO.

(Klampfer et al., 1996)

MIP-1α

Proinflammatorisches Zytokin, das auch die Proliferation der hämatopoetischen Stamzellen hemmt.

AML1 bindet an dem Promotor in vitro und AML1/ETO hemmt die Aktivierung des Promoters mittles PMA.

(Bristow and Shore, 2003)

LAT2

Adaptormolekül, das durch den B-Zell Rezeptor, c-Kit Rezeptor und FcєR I aktiviert werden kann.

Herunterregulation der mRNA in AML1/ETO induzierbaren Zellen, AML1/ETO positiven Zelllinien und AML1/ETO positiven Patientenblasten.

(Fliegauf et al., 2004) (Ross et al., 2004) (Valk et al., 2004b)

1.4.- Epigenetische Aktivität von chimärer Fusionsproteinen in AML

1.4.1.- Die epigenetische Regulation der Gentranskription

Die Epigenetik beschäftigt sich mit vererbbaren Modifikationen der Genexpression,

die ohne eigentliche Veränderung der DNA-Sequenz einhergehen. Die wichtigsten

Mechanismen der Epigenetik sind die DNA-Methylierung und die

Chromatinstrukturveränderungen, die vorwiegend auf Histonmodifikationen beruhen.


1.4.1.1.- DNA-Methylierung

Bis zu 5 % der Cytosine in der genomischen DNA von Säugerzellen sind methyliert.

Diese Modifikation wird durch DNA Methyltransferasen (DNMTs) mit S-adenosyl-methionin

als Methylgruppendonor katalysiert (Bestor et al., 1988). Bisher sind 3 DNMTs beschrieben.

DNMT1 bewahrt nach der DNA-Replikation das identische DNA Methylierungsmuster in der

Tochterzelle ("maintainance DNMT") (Turker and Bestor, 1997). DNMT3a und DNMT3b

haben die Funktion von „de novo“ Methyltransferasen und spielen eine wichtige Rolle in der

Tumorgenese (Robertson et al., 1999).

Methylcytosine finden sich fast ausschließlich im Kontext von CpG-Dinukleotiden.

Die CpG Dinukleotide sind im gesamten Genom unterrepräsentiert, es finden sich jedoch

„Cluster“ von CpGs in Promotorregionen und regulatorischen Regionen von Genen (Larsen et

al., 1992). Die CpG reichen Regionen werden CpG-Inseln genannt, wenn sie bestimmte

Voraussetzungen erfüllen (Fragment > 200 bp, "observed/expected" Ratio>0.6) (Gardiner-

Garden and Frommer, 1987).

Die Funktionen der DNA-Methylierung sind vielfältig. Es wurde beschrieben, dass sie

während der embryonalen Entwicklung eine wichtige Rolle spielt (Kafri et al., 1992). DNA-

Methylierung ist in genomisches „Imprinting“ involviert, dadurch ist nur ein Allel, mütterlich

oder väterlich, von einem Gen in der Zelle exprimiert (Falls et al., 1999). Sie hat eine

Abbildung 2.- Chemische Reaktion von Cytosin zu 5´-Methyl -Cytosin. Eine Methyl-Gruppe von S-adenyl-Methionin wird in Position hinzugefügt. Das Produkt der Reaktion ist ein 5´-Methyl-Cytosin und S-adenyl-Homocystein. Diese Reaktion wird durch DNA Methyltransferasen katalysiert. (Modifiziert nach DNA Methylation, CRC Press, Manel Esteller).

NH2 NH2

O O

N

N N

N CH3

Cytosine 5-methylCytosine

S-adenyl-methionine

S-adenyl-homocysteine

DNA Methyltransferase


wichtige Funtion in der Inaktivierung des X-Chromosoms bei Frauen (Riggs and Pfeifer,

1992) und bei der Alterung von Zellen (Cooney, 1993).

Die Hauptbedeutung von DNA-Methylierung liegt in der Kontrolle der

Gentranskription (Holliday and Pugh, 1975). Die CpG-Methylierung in regulativen Regionen

von Promotoren und 5' lokalisierten Exons korreliert in vielen Genen mit transkriptioneller

Inaktivierung. So konnte gezeigt werden, dass Promotoren und Exon 1 von Genen in einem

aktiven Zustand zumeist hypomethyliert sind. In inaktiven Genen hingegen sind sie

hypermethyliert (Gonzalez-Zulueta et al., 1995).

Es gibt zwei Hauptmechanismen, mit denen DNA-Methylierung die Genexpression

reguliert. Einerseits interferieren die methylierten Cytosine mit der Bindung von

Transkriptionsfaktoren (Kass et al., 1997). Andererseits gibt es Proteine, die preferentiell an

methylierte Sequenzen im Promotorbereich binden. Die Methylierung des Promotors in einer

CpG-Insel führt zur Bindung von Methyl-CpG-bindenden Proteinen (MBDs) und

Transkriptions-Korepressoren wie HDACs, die den Transkriptionsstart blockieren (Jones et

al., 1998) (Nan et al., 1998). Bisher sind nur vier sogenannte Methyl-DNA-bindende Proteine

beschrieben: MDBP-1 (Huang et al., 1984), MDBP2 (Jost and Hofsteenge, 1992), MeCP1

(Meehan et al., 1989) und MeCP2 (Lewis et al., 1992).

Abbildung 3.- Schematische Darstellung der DNA-Methylierung im normalen und Tumor-Gewebe. Im normalen Gewebe sind Promotoren überwiegend demethyliert und die CpG-Dinukleotide der Exons methyliert. In Tumorzellen kommt häufig eine Hypermethylierung des Promotors und eine Hypomethylierung des Exons vor. Die Hypermethylierung des Genpromotors führt in Tumorzellen zu einer Repression der Genexpression (Modifiziert nach Baylin et al., 2005).


1.4.1.2- Histonmodifikation

Histone sind die Zellkernproteine, die wichtige Ordnungsprinzipien der DNA-

Verpackung ermöglichen. Acht dieser Proteine (vier Typen) formen einen Nukleosomkern,

um den die DNA verpackt ist. Das humane Genom wird in unterschiedlichem Ausmaβ

kondensiert: Euchromatin besteht aus aktiven Regionen, in denen das Chromatin eine lockere

Packung hat, Heterochromatin besteht dem gegenüber aus inaktiven Regionen, in denen eine

festere Packung der Histone vorliegt (Santos-Rosa and Caldas, 2005).

Der Verpackungsgrad, und damit die Transkription der verschiedenen Regionen der

Chromosomen, wird durch Histonmodifikationen reguliert. Die 3 wichtigsten

posttranslationalen Histonmodifizierungen sind Phosphorylierung der Serin-Reste,

Methylierung der Lysin- und Arginin-Reste und, vor allem, Acetylierung der Lysine. Die

Kombination der verschiedenen Histonmodifikationen mit den verschiedenen Aminosäure-

Resten führt zu einer aktiven oder inaktiven Konformation. Es wurde gezeigt, dass

Methylierung von Lysin 4 (Santos-Rosa et al., 2002), Acetylierung von Lysin 9 und 14 des

Histons H3 und von Lysin 12 des Histons H4 zu einer aktiven Form führt (Strahl and Allis,

2000). Hingegen bewirkte die Methylierung von Arginin 3 des Histons H4 (Lee et al., 2005)

sowie Mono- bis Trimethylierung von Lysin 9 des Histons H3 und von Lysin 20 des Histons

H4 eine inaktive Form (Schotta et al., 2004).

Die am ausführlichsten untersuchte Histonmodifikation ist die

Acetylierung/Deacetylierung. Sie wird von verschiedenen Enzymfamilien vermittelt, von

Histon-Acetyltransferasen (HAT) und den Histon-Deacetylasen (HDAC).

1.4.1.3.- Die Kooperation von DNA-Methylierung und Histonmodifikation in der

Regulation der Gentranskription.

Eine sehr interessante Entdeckung, die die Beziehung zwischen DNA-Methylierung,

Histonmodifikation und transkriptioneller Regulation verdeutlicht, war, dass die Proteine

MeCP2 und MBD2 mit Histondeacetylasen ko-präzipitieren (Jones et al., 1998; Nan et al.,

1998; Ng et al., 1999). Weitere Hinweise auf eine Kooperation zwischen der DNA

Methylierung und der Histonmodifikation wurden durch die Interaktion von DNMT1 und

DNMT3a mit HDAC1 und HDAC2 gezeigt (Fuks et al., 2000; Robertson et al., 2000;

Rountree et al., 2000). Dadurch sind DNA-Methylierung und Histonmodifikationen in der

epigenetischen Regulation der Transkription untrennbar miteinander verbunden.


1.4.1.4.- Die pharmakologische Beeinflussbarkeit der epigenetischen Genregulation:

demethylierende Substanzen und HDAC-Inhibitoren.

Während genetische Mutationen in Tumorzellen irreversibel sind, sind epigenetische

Veränderungen pharmakologisch reversibel. Sowohl die DNA-Methylierung als auch die

Histonmodifikationen können mit verschiedenen Substanzen gehemmt werden, die als

Medikamente zur Behandlung von Neoplasien eingesetzt werden können.

Die erste „demethylierende“ Substanz (=DNMTs Inhibitor), die in der Behandlung

von Tumoren benutzt wurde, war 5-Azacytidine (Vidaza®) (Glover and Leyland-Jones, 1987).

Ein Nebenprodukt dieser Substanz, 5-Aza- 2´-deoxycytidin (Dacogen®, Decitabine, DAC),

zeigte einen stärkeren Effekt als demethylierende Substanz. 5-Azacytidin wird nur in 10 % in

die DNA und in 90% in die RNA inkorporiert, während 5-Aza 2'-deoxycytidin hingegen zu

100 % in die DNA eingebaut wird (Creusot et al., 1982). 5-Aza 2'-deoxycytidin wird während

der Replikationsphase in DNA eingebaut und inaktiviert DNMTs durch eine irreversible

kovalente Bindung (Juttermann et al., 1994). 5-Aza 2'-deoxycytidin wird zurzeit in der

Behandlung von AML und MDS erfolgreich eingesetzt (Rüter et al., 2006). Beide DNMT-

Inhibitoren wurden erst kürzlich durch die FDA für die Behandlung von MDS in den

Vereinigten Staaten zugelassen.

Abbildung 4.- Schematische Darstellung der Cytidin-Analoga 5-Azacytidin und 5-Aza 2'deoxycytidin (Decitabine), die in der klinische Behandlung von AML- und MDS- Patienten eingesetzt werden. 5-Azacytidin wird teilweise (10%) in DNA inkorporiert, wohingegen 5-Aza 2'deoxycytidin komplett in DNA eingebaut wird. Sie wirken als Inhibitoren der DNMTs.

NH2

O

R

N

5-Azacytidine

NH2

O

dR

N N

5-Aza 2' -deoxycytidine

N


Als HDAC Inhibitoren sind verschiedene Substanzen beschrieben. Trichostatin A

(TSA) hat in vitro einen starken Effekt in der Reexpression von Genen durch Inhibition der

HDACs geziegt (Nervi et al., 2001; Suzuki et al., 2000). Es wurde für andere Substanzen, wie

z. B. MS-275 (Hu et al., 2003; Saito et al., 1999), SAHA (Kelly et al., 2003; Richon et al.,

1996), Depsipeptide (Nakajima et al., 1998) beschrieben, dass sie auch die Aktivität von

HDACs hemmen können. Auβerdem wurde nachgewiesen, dass die antiepileptische Substanz

Valproinsäure einen Effekt in der HDAC-Hemmung hat (Phiel et al., 2001). Deshalb wird

Valproat zurzeit in verschiedenen klinischen Studien in der Behandlung von AML (Bug et

al., 2005) und MDS (Kuendgen et al., 2004) eingesetzt.

Eine sehr wichtige Entdeckung war, dass die partielle Demethylierung von

bestimmten Genen durch Decitabine mit einen HDAC Inhibitor wie TSA einen

synergistischen Effekt in der Re-Aktivierung der Gentranskription hat (Cameron et al., 1999).

Diese Arbeit bildet die Rationale, um demethylierenden Substanzen und HDAC Inhibitoren in

Kombination bei der Behandlung von Tumorerkrankungen einzusetzen.

1.4.2.- Das PML/RARα-Fusionsprotein

1.4.2.1.- PML/RARα: ein Modell der Kooperation von DNA-Methyltransferase und

Histondeacetylasen bei der Entstehung der AML.

Als Beispiel für einen epigenetischen Pathomechanismus der Entstehung einer AML

gilt die Akute Promyelozyten-Leukämie (APL, AML M3) mit der Translokation t(15;17), die

zur Bildung des chimären Fusionsproteins PML/RARα führt. Dieses Fusionsprotein rekrutiert

HDACs und DNMTs an Promotoren von Zielgenen mit der Konsequenz, dass diese nicht

mehr exprimiert werden können (Di Croce et al., 2002). Das bewirkt, dass die myeloischen

Zellen im Promyelozyten-Stadium angehalten werden und sich nicht weiter differenzieren

können. In diesem grundlegenden Artikel wurde das erste Mal gezeigt, dass die beiden

epigenetischen Ereignisse (DNA methylierung udn Histone acetylierung) mit einem chimären

Fusionsprotein bei der Entstehung eines Tumors kooperieren.

Die APL Blasten zeigen eine hohe Sensitivität für All- trans-Retinsäure (ATRA) in

vitro (Chomienne et al., 1990) und in vivo (Castaigne et al., 1990). Die All-trans-Retinsäure

führt zu einer Differenzierung der Blasten in reife Granulozyten, charakterisiert durch

Expression von CD15 und die Anwesenheit von Auerstäbchen. Die Behandlung der APL mit

ATRA führt häufig zu einer Remission der Leukämie. Das PML/RARα Protein wird durch


ATRA auf post-translationaler Ebene degradiert. Das Verhältnis PML-RARα/RARα wird

gesenkt und die myeloische Differenzierung der APL Zellen wird wieder ermöglicht (Raelson

et al., 1996). Pharmakologische Konzentrationen von ATRA können auch das PML/RARα

Fusionsprotein von rekrutierten HDACs (Grignani et al., 1998) und DNMTs (Di Croce et al.,

2002) freisetzen und somit kann die Expression der PML/RARα Zielgene wie z. B. RARβ2

stattfinden.

1.4.2.2.- RARβ2: Tumorsuppressor-Gen und Zielgen des PML/RARα Fusionsproteins.

Das „retinoid acid receptor β2“Gen (RARβ2) ist ein klassiches Tumorsuppressor-Gen,

dessen Repression auf mRNA- Ebene im Mammakarzinom (Swisshelm et al., 1994;

Widschwendter et al., 1997), Ovarialkarzinom (Caliaro et al., 1994) und

Plattenepithelkarzinom (Crowe, 1998) bestätigt wurde. Die Hemmung der Synthese von

RARβ2 mRNA kann durch Promotor-Hypermethylierung ausgelöst werden, wie z. B. im

primären Kolonkarzinom (Coté et al., 1998) und Mammakarzinom (Bovenzi et al., 1999)

festgestellt wurde. In Kolonkarzinom-Zelllinien wurde gezeigt, dass RARβ2 durch

Hypermethylierung reprimiert ist und durch 5-Aza-2'deoxycytidin demethyliert und re-

exprimiert werden kann (Coté and Momparler, 1997; Cote et al., 1998).

RARβ2 ist ein Zielgen des leukämie-spezifischen PML/RARα Fusionsproteins (Di

Croce et al., 2002). Sein Promotor wird nach der ektopen Expression von PML/RARα in PR9

Zellen hypermethyliert und nach der Gabe von ATRA und 5-Aza-2'-deoxycytidin in NB4

Zellen und APL Blasten von Patienten demethyliert und re-exprimiert.

1.4.3.- Epigenetische Ereignisse in der Pathogenese des AML1/ETO-Proteins:

therapeutische Konsequenzen.

Da AML1/ETO ein chimäres Fusionsprotein ist, in dem ein Traskriptionsfaktor und

die Rekrutierung der Histon-Deacetylasen impliziert sind, ist ein ähnlicher Pathomechanismus

wie im PML/RARα Fusionsprotein denkbar. AML1/ETO könnte möglicherweise zusätzlich

DNMTs an die Promotoren seiner Zielgene rekrutieren, um ihre Transkription durch DNA-

Methylierung zu hemmen.

Zusammenfassend sind diese Daten Hinweise auf einen epigenetischen

Pathomechanismus der AML1-ETO-positiven AML und bilden eine mögliche Rationale für

den Einsatz demethylierender Substanzen (5-Azacytidine, 5-Aza-2-Deoxycytidine) in


Kombination mit HDAC-Inhibitoren in der Therapie der AML, um damit die Expression der

unterdrückten Genen wiederherzustellen.

1.5.- Die U937-9/14/18-Zelllinie

Die Rolle des Fusionsproteins AML1/ETO bei der Leukämogenese und der genaue

Pathomechanismus sind noch nicht ganz geklärt. Die stabile ektope Expression des

Fusionsgens wird von den meisten Zelllinien nicht toleriert und die transienten

Transfektionen und Reporter-Konstrukte geben nicht genügend Information über die „in

vivo“ Funktion dieses Proteins. Um Zielgene des AML1/ETO-Proteins zu entdecken und um

die zellulären Effekte zu verstehen, wurde von Dr. Manfred Fliegauf in der Arbeitsgruppe von

Prof. Lübbert ein induzierbares AML1/ETO-System in der U937-Zelllinie entwickelt

(Fliegauf et al., 2004).

Abbildung 5.- Molekularer Pathomechanismus vom AML1/ETO. Das AML1/ETO-Protein rekrutiert HDACs und DNMTs an seine Zielgene und so wird die Expression durch einen epigenetischen Mechanismus unterdrückt. Nach dem Einsatz der DNA-demethylierenden Substanzen und HDAC-Inhibitoren kann die Expression der AML1/ETO-Zielgene wiederhergestellt werden.

CCGTGT/cGGTATGTGTCTG

Hypomethylating agents :

5-azacytidine,

5-aza 2´-deoxycytidine

HDAC inhibitors: valproic acid, TSA,

MS-275, SAHA

CBFßAML1

ETO

NCor mSin3

HDAC1

CGTCGATCGTCGACGTATAATGCTCTC

DNMT1

MeCP2

MDB2


Targetgenes

WBSCR5

IL-3

LZM

LST1

P14

CCGTGT/cGGTATGTGTCTG

Hypomethylating agents :

5-azacytidine,

5-aza 2´-deoxycytidine

HDAC inhibitors: valproic acid, TSA,

MS-275, SAHA

CBFßAML1

ETO

NCor mSin3

HDAC1

CGTCGATCGTCGACGTATAATGCTCTC

DNMT1

MeCP2

MDB2


Targetgenes

WBSCR5

IL-3

LZM

LST1

P14


Der stabile transfizierte Klon, 9/14/18, ist mit einem Ecdyson-induzierbaren Zwei-

Vektor-Expressionssystem ausgestattet (No et al., 1996). Der erste Vektor (pVgRXR) kodiert

einen konstitutiv exprimierten heterodimeren Rezeptor (VgEcR/RXR), der durch ein

Insektenhormon (Ecdyson) aktiviert werden kann. Der aktivierte Rezeptor kann die

Expression des gewünschten Gens regulieren, welches unter der Kontrolle eines

induzierbaren Promotors auf dem zweiten Vektor (pIND-GenX) liegt. Als induzierende

Substanzen können die Ecdyson-Agonisten Muriston und Ponasteron A benutzt werden.

Bisher wurde kein Effekt dieser Moleküle oder des Hormonrezeptors in Säugerzellen

beschrieben.

Abbildung 6.- Das Ecdyson-induzierbare System besteht aus 2 verschiedenen Vektoren. Ein Vektor trägt das Fusionsgen unter der Kontrolle eines pIND-Promoters. Der zweite Vektor exprimiert einen RXR-Rezeptor und VgEcR (Ecdysone Rezeptor) konstitutiv. Wenn der Ligand (Muristone, Ponasteron) hinzugegeben wird, kommt es zu einer Heterodimerisierung der RXR und VgEcR Rezeptoren. Dadurch wird der pIND-Promoter aktiviert und die Expression des Fusionsgens AML1/ETO induziert.

The Ecdysone-inducible Expressions-System(adapted from Invitrogen, Gronigen, NL)

AML1/ETO

AML1/ETO

AML1/ETO

AML1/ETO


1.6.- Methoden zur Analyse der DNA-Methylierung

Die Methoden zur Analyse von DNA-Methylierung können in 2 Gruppen klassifiziert

werden. Zum einen Methoden, die DNA-Methylierung auf globaler genomweiter Ebene

untersuchen. Sie haben den Zweck neue Gene oder chromosomale Regionen zu finden, in

denen Methylierungsveränderungen vorliegen, oder den gesamten Methyl-Cytosinen Gehalt

der DNA zu bestimmen. Zu dieser Gruppen gehören beispielweise: Restriction Landmark

Genomic Scanning (RLGS) (Plass et al., 1996; Smiraglia and Plass, 2002, , 2003), methyl-

Cytosine ChIP (Weber et al., 2005) , MethylScope (Lippman et al., 2004), AIMS (Paz et al.,

2003), capillary electrophoretic analysis of genomic DNA (Stach et al., 2003)

Zum anderen gibt es Methoden, die die DNA Methylierung in bestimmten Genen

untersuchen. Diese haben das Ziel methylierte CpGs in einem bestimmten Gen zu

quantifizieren. Zu dieser Gruppe gehören Southern Blot mit methylsensitiven Enzymen (Bird

and Southern, 1978), Bisulfite DNA Sequenzierung (Frommer et al., 1992), Methyl-Sensitive

PCR (MSP) (Herman et al., 1996), COBRA (Xiong and Laird, 1997) und Methylierung-

Sensitive single nucleotide Primer Extension (MS-SnuPE) (Gonzalgo and Jones, 1997).

RLGS wurde als Screening Methode für DNA-Methylierungsveränderung nach der

Induktion des AML1/ETO-Proteins in dieser Arbeit benutzt, und Southern Blots wurden nach

Restriktion mit einem methylsensitiven Enzym (Not I) als Validierungsexperiment der RLGS-

Daten durchgeführt. Diese Methode wurde deshalb ausgewählt, um neue robuste

Methylierungsveränderungen innerhalb CpG-reicher Regionen der möglichen AML1/ETO-

Zielgene zu identifizieren.

1.6.1.- Restriction Landmark Genomic Scanning (RLGS)

In Kooperation mit der Arbeitsguppe von Prof. Dr. C. Plass (University of Columbus,

Ohio, USA) wurde eine RLGS-Analyse mit den induzierbaren Zellen durchgeführt, um

Methylierungsveränderungen nach der Induktion von AML1-ETO auf einer globalen DNA-

Ebene zu untersuchen. Das Ziel dieser Methode ist die Identifizierung von differentiell

methylierten Sequenzen.

Die RLGS-Methode basiert auf einem sequentiellen Restriktionsverdau, kombiniert

mit zweidimensionaler Gelelektrophorese: zuerst wird intakte genomische DNA mit dem

methylsensitiven Enzym Not I geschnitten. Not I schneidet nur an demethylierten CpGs


innerhalb der Restriktionsstellen. Die überlappenden Enden werden mit radioaktiven GTP-

und CTP-Nukleotiden gefüllt. Dann wird eine Gel-Elektrophorese auf einem zwei-

dimensionalen Polyacrylamid-Gel durchgeführt. Nach Auftrennung in der ersten Dimension

wird ein zweiter Restriktionsverdau in situ mit einem nicht-Methylierungs-sensitiven Enzym

durchgeführt. Anschließend erfolgt eine weitere Elektrophorese. Schließlich kann man im

Autoradiogramm die Signale von sogennanten Spots, die DNA-Fragmenten entsprechen,

detektieren und so zwei Proben miteinander vergleichen. Wenn eine Veränderung von einem

Spot gefunden wird, ist eine schnelle Identifikation der Spots durch den Vergleich mit

Master-Profilen, erstellt aus peripheren Blut-Lymphozyten, möglich. Ansonsten ist eine

Identifikation der Spots durch direkte Subklonierung und Sequenzierung möglich.

Abbildung 7.- RLGS Methode. A.- Die genomische DNA wurde mit dem nicht methylierungssensitive Restriktionsenzym EcoR V und dem methylierungssensitive Restriktionsenzym Not I verdaut. Die geschnittene DNA wurde mit radioaktiv markierten Cytosinen und Guanidinen an der Not I Restriktionsstelle aufgefüllt. Eine zwei dimensionale Gelelektrophorese wird durchgeführt, und die verschiedenen DNA-Fragmente werden durch Autoradiographie detektiert. B.- Methylierungsveränderungen werden nach dem Vergleich von 2 Gelen von verschiedenen Proben nachgewiesen. C.- Beispiel einer Autoradiographie von einer zwei dimensionalen Gelelektrophorese nach der RLGS Methode.

NotI

NotI

NotI

NotI

NotI

NotI

unmethylated Allele-specificmethylation

methyated

NotI

NotI

NotI

NotI digest

RLGS1st-D

2nd-D

1st-D

2nd-D

1st-D

2nd-D

endlabeling

NotI

NotI

NotI

NotI

NotI

NotI

unmethylated Allele-specificmethylation

methyated

NotI

NotI

NotI

NotI digest

RLGS1st-D

2nd-D

1st-D

2nd-D

1st-D

2nd-D

endlabeling

Plass Nat. Gen. 1996Smiraglia and Plass Oncogene 2002Smiraglia and Plass Ann. N.Y. Aca. Sci. 2003

23

1


1.6.2.- Bisulfit-Sequenzierung

Die Bisulfitbehandlung genomischer DNA (Clark et al., 1994; Frommer et al., 1992)

ermöglicht die Unterscheidung zwischen einzelnen methylierten und unmethylierten

Cytosinen über einem definierten DNA-Abschnitt. Der Schlüsselmechanismus für den

Nachweis methylierter Cytosine ist durch die selektive chemische Reaktion vom Natrium-

Bisulfit mit den unmethylierten Cytosinen festgelegt. Hierbei wird das unmethylierte Cytosin

durch Desaminierung in Uracil umgewandelt und das methylierte Cytosin bleibt unverändert.

1.7.- LAT2-Gen als neues Zielgen von AML1/ETO

Mit Hilfe des AML1/ETO-induzierbaren Systems in U937-Zellen wurden in einer

cDNA-RDA Analyse Gene identifiziert, deren Expression nach der Induktion des

AML1/ETO Proteins reguliert wurden. Ein Kandidat für differentielle Expression war das

Abbildung 8.- Bisulfit -Konversion der DNA. Der entscheidende Schritt, um Methyl-Cytosine mit Bisulfit-Sequenzierung nachzuweisen, ist die Bisulfit- Konversion der DNA. Nach der Sulfonierungs Reaktion wird eine Bisulfit-Gruppe im Cytosin aufgebaut. Bisulfit-Cytosin wird in Bisulfit-Uracil nach der Desaminierung konvertiert. Bisulfit-Uracil wird alkalisch desulfoniert und damit in ein Uracil-Molekül umgewandelt. Diese Reaktion findet nur an unmethylierten Cytosinen statt. (Modifiziert nach DNA Methylation, CRC Press, Manel Esteller).

NH2 NH2

O O

OO

O O

N

N N

NN

N

+HN

+HN

SO3-

SO3-

HSO3-

OH -

H2ONH4+

HSO3-

OH -

Cytosine CytosineSulfonate

Uracil UracilSulfonate

1.-Sulfonation

2.- HydrolyticDeamination

3.- AlkaliDesulfonation


LAT2 (WBSCR5/NTAL/LAB) Gen. Die AML1/ETO-vermittelte Repression dieses Gens

wurde in AML1/ETO-induzierbaren Zellen sowie in verschiedenen AML1/ETO-positiven vs

negativen Zelllinien und in primären Blasten von AML-Patienten validiert (Fliegauf et al.,

2004).

Das Williams Beuren Syndrom (WBS) ist eine Krankheit, die durch eine

chromosomale Mikrodeletion der Bande 7q11.23, von ca. 8x106 bp, verursacht wird. 24 Gene

sind in dieser Mikrodeletion beinhaltet und eines davon ist das Williams Beuren Syndrom

Critical Region 5 (WBSCR5) Gen. Die Diagnose wird mittels FISH Analyse mit dem

Kosmid, der Teil des Elastin-Gens enhält, gestellt. Das Elastin-Gen befindet sich in der Mitte

der gemeinsamen Deletion. (Lowery et al., 1995). Kinder mit diesem Syndrom haben

folgenden Phänotyp in unterschiedlicher Ausprägung: dismorphologe Gesichtform,

kardiovaskuläre Abnormalitäten (z. B. supravalvuläre Aortenstenose und periphäre

Pulmonalstenose), ophthalmologische und auditive Fehlfunktionen (z. B. Hyperakusis und

"Visual-Spatial processing" Dysfunktion), sowie eine Hyperkalziämie. Allerdings haben

Kinder mit WBS auch bemerkenswerte neurologische und kognitive Eigenschaften, wie einen

umfangreichen Wortschatz, musikalische Kreativität und ein ausgeprägtes soziales Gespür.

Andererseits fallen bei diesen Kindern aber auch Schwächen im kognitiven Bereich auf wie z.

B. Aufmerksamkeitsstörungen, Ängste und Phobien (Tassabehji, 2003). Bisher wurde nur die

Fehlfunktion des Elastin-Gens in Maus-Modellen mit supravalvulärer Aortenstenose

nachgewiesen (Li et al., 1998). Die Rolle anderer Gene für den Phänotyp des WBS ist

weitestgehends noch ungeklärt.

Das Produkt des WBSCR5-Gens ist ein 28 kDa Protein, inzwischen auch Linker for

Activation of T cells 2 (LAT2), Non T Cell Activation Linker (NTAL) (Brdicka et al., 2002)

oder Linker for Activation of B cells (LAB) (Janssen et al., 2003) genannt. Das LAT2-Protein

gehört zur Familie der Binder- oder Adaptormoleküle. Dies sind Membranproteine, die durch

eine nicht-kovalent Protein-Protein Interaktion die multimolekulare Transduktionsignal-

Komplexe organisieren und regulieren. Die extrazellulären Signale werden durch die

Adaptormoleküle von den Rezeptoren zum Zytoplasma vermittelt. Dadurch werden nicht nur

die extrazellulären Signale von Rezeptoren weitergeleitet, sondern auch laterale Signale, wie

z. B. die Rekrutierung anderer Rezeptoren, und die Modifizierung der Aktivität von

Membranproteinen, wie z. B. Integrine, mittels Adaptormoleküle reguliert (Simeoni et al.,

2004).

Das LAT2-Protein wird nach Cross-linking des B-Zell-Rezeptors in B-Zellen (Janssen

et al., 2003), dem FCєRI (High Affinity Receptor for IgE) und dem c-Kit- Rezeptor in


Mastzellen (Tkaczyk et al., 2004) phosphoryliert und dadurch aktiviert. Nach seiner

Aktivierung interagiert das LAT2-Protein mit Grb2, Sos-1, Gab-1 und c-Cbl (Brdicka et al.,

2002) . LAT2 kann die Entwicklung von Thymozyten in „Linker for Activation of T cells“

(LAT) und homologe Proteine von LAB in T Zellen von Knock-out Mäusen wiederherstellen

(Janssen et al., 2003). Diese Daten weisen auf eine partiell redundante Rolle von LAT2

(NTAL/LAB) und seinem Homolog in T Zellen, LAT, hin.

LAT2 reguliert negativ die Degranulation von Mastzellen nach der Aktivierung in

LAT2 (NTAL/LAB) Knock-out Mäusen (Zhu et al., 2004). Diese Funktion von LAT2 wird

durch die Hyperaktivität des LAT-Proteins in LAT2-Knock-out Mäusen verursacht, da LAT

das PLC-γ1 und dadurch den Kalziumfluss regulieren kann und mehr mRNA und

phosphoryliertes LAT-Protein vorhanden ist (Volna et al., 2004). Überraschend war, dass

keine Veränderung in der Funktion und Entwicklung der B-Zellen von LAT2-Knock-out

Abbildung 9.- Transduktionssignalwege des LAT2-Proteins in Mastzellen. Das LAT2-Protein kann durch den c-Kit-Rezeptor und FCεR I phosphoryliert und dadurch aktiviert werden. Nach seiner Aktivierung interagiert es mit zytosolischen Molekülen wie Grb2, Gab-1, Sos-1 und c-CBL. Diese Moleküle sind in der Aktivierung verschiedener Transduktionssignalwege (MAPK-Kinase, PI3-Kinase und Protein-Degradation durch Ubiquitinierung) beteiligt. Modifiziert nach Tkaczyk et al, Chem Immunol. Allerg. 2005


Mäusen zu beobachten war. (Wang et al., 2005). Letzlich könnte die Abwesenheit von

LAT2-Protein eine Hyperaktivität der T Zellen verursachen, und damit eine konsequente

Autoimmune Erkrankung in LAT2-Knock-out Mäusen auslösen (Zhu et al., 2006).

Die Funktion dieses Gens und die Bedeutung seiner Repression ist in der Myelopoese

bisher ungeklärt und deshalb sind weitere Untersuchungen notwendig. In dieser Arbeit

werden funktionelle Untersuchungen von LAT2 in der Hämatopoese durchgeführt, um die

Rolle bei der Entstehung von AML abzuklären.

1.8.- Myeloische Differenzierung

Die embryonale Entwicklung des Menschen braucht die regulierte und koordinierte

Expression von verschiedenen Transkriptionsfaktoren, die zugleich Kaskaden der

Genexpression induzieren. Dieser regulierte Prozess hat die Differenzierung der embryonalen

Stammzellen in den verschiedenen Gewebe zufolge. Die Hämatopoese ist wie die embryonale

Entwicklung durch verschiedene Transkriptionfaktoren reguliert, die von den Stammzellen

bis hin zu reifen Zellen führt (Skalnik, 2002).

Während der Differenzierung der Zellen in der myeloischen Reihe werden Gene für

wichtige Funktionen der Zellen in verschiedenen Reifungsstufen ab- und angeschaltet. Zum

Beispiel wird Myeloperoxidase im Übergang von der myeloblastären zur promyelozytären

Phase exprimiert (Borregaard et al., 1995), wobei CD11b in der letzten Stufe der

granulozytären (metamyelozytäre und segmentierte Phase) und monozytären Differenzierung

hochreguliert wird (Rosmarin et al., 1989). Die Expression dieser Gene ist durch spezifische

myeloische Transkriptionfaktoren wie AML1 (Wang and Speck, 1992), CCAAT/enhancer

binding Protein α (C/EBPα) (Landschulz et al., 1989), PU.1 (Chen et al., 1995) reguliert, die

häufig durch Mutationen, chromosomale Aberrationen und epigenetische Disregulation in

ihrer Expression und Funktion bei hämatologischen Erkrankungen verändert wird.

Der molekulare Mechanismus der Genregulation beruht auf der Interaktion von

Transkriptionfaktoren und dem Promotor-Enhancer solcher Gene, wie am Beispiel der

Neutrophilen Elastase gezeigt wurde (Oelgeschlager et al., 1996). Außerdem werden die

Promotoren von Proteinase 3 und MPO während der myeloischen Zelldifferenzierung

(Lübbert et al., 1991b; Lübbert et al., 1999) demethyliert, ihre Chromatinstruktur verändert,

und dadurch wird die Expression dieser Gene induziert.


Myeloische Zelllinien wurden aus Patienten mit AML oder CML in der Blastenkrise

etabliert. Sie sind auf verschiedenen Stufen der myeloischen Zelldifferenzierung blockiert und

können durch Substanzen wie DMSO, Phorbolester, ATRA, 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in

vitro differenziert werden (Lübbert et al., 1991a). Diese Differenzierungsmodelle der

Myelopoese werden benutzt, um die Expression myeloischer Gene während der

verschiedenen Phasen der Zelldifferenzierung zu untersuchen. Diese Arbeit hatte das Ziel, die

Expression von LAT2-Gen während der myeloischen, erythrozytären und megakaryozytären

Differenzierung von verschiedenen Zelllinien zu untersuchen.

Abbildung 10.- Schematische Darstellung der Myelopoese. Die myeloische Progenitorzellen

können sich in Myeloblasten oder Pronormoblasten differenzieren. Die Pronormoblasten sind Vorläuferzellen der roten Reihe. Myeloblasten können sich weiter in Promyelozyten, Megakaryozyten, unreife Monoblasten, Eosinophile und Basophile differenzieren. In jeder Differenzierungsreihe werden unter der Kontrolle von myeloischen spezifischen Traskriptionsfaktoren wichtige Gene für die Funktion der Zellen exprimiert oder abgeschaltet. Modifiziert nach http://www.userlogic.com/anll/studyaids/maturationchart/maturation_chart.html


CD34+ ist der Oberflächemarker für hämatopoetische Stammzellen, die sich in alle Zellen des

myeloischen und lymphatischen Systems differenzieren können (Srour et al., 1991). Die

Kultivierung dieser Zellen erfolgt in serumfreiem Medium mit einem Zytokincocktail (IL-3,

IL-6, SCF und FLT3) (Guo et al., 2006). Mit G-CSF kann die Differenzierung in

Granulozyten (Berliner et al., 1995) und mit GM-CSF und IL-4 in Monozyten/Dendritische

Zellen (Ferlazzo et al., 2000) ex vivo erfolgen. Diese Differenzierungmodelle wurden in der

vorliegenden Arbeit benutzt, um die Expression der Gene während der CD34+

Zelldifferenzierung zu untersuchen.

2.- Ziele des Projektes Seite - 25 -

2.- Ziele des Projektes

Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war die Validierung der RLGS-Daten mittels

Southern Blots, um neue Zielgene des AML1/ETO-Proteins zu entdecken. Mit der

Validierung der RLGS-Daten konnte ein neuer epigenetischer Mechanismus des AML1/ETO-

Proteins bestätigt werden, durch den das chimäre Fusionsprotein die Expression seiner

Zielgene beeinflussen kann. Bisher wurde nur ein Artikel in der wissenschaflichen Literatur

veröffenlicht, in dem eine methylierende Aktivität des AML1/ETO-Proteins in einer

bekannten AML1/ETO-Zielgen gezeigt wurde. Diese Arbeit wäre die Erste, in der Zielgene

von AML1/ETO durch Methylierung auf ihren Promotoren mit einem randomisierten

globalen Screening untersucht wurde.

Eine weitere Fragestellung dieser Doktorarbeit war, ob die durch Methylierung von

Zielgenen des AML1/ETO-Proteins, deren Expression nach der Induktion des Fusionsproteins

verändert wird. Die Charakterisierung der ermittelten Gene in Bezug auf das Vorhandensein

von CpG-Inseln und die Bestätigung der Vermittlung des Effekts durch AML1-ETO wären

die nächsten Schritte.

Funktionelle Analysen der validierten Gene als Beitrag zum Verständnis ihrer Rolle

für die Pathogenese der AML waren das dritte Ziel dieser Doktorarbeit. Ein von unserer

Arbeitsgruppe identifiziertes AML1/ETO-Zielgen, LAT2, wurde durch funktionelle Analysen

untersucht, um seine Rolle in der Hämatopoese und Leukemogenese aufzuklären. Da die

Funktion dieses Gens bisher in der Hämatologie nicht untersucht wurde, war die

Untersuchung seiner Funktion und die Methodik dafür offen. Den Mechanismus der

Repression durch AML1/ETO zu untersuchen und diese Repression durch epigenetische

aktive Therapien zu hemmen, war ebenso ein Ziel dieser Arbeit.

Die Entdeckung neuer Zielgene und der Mechanismus der Repression vom

AML1/ETO konnte weiter die Pathogenese der AML aufklären und die Therapie der AML

durch neue zielgerichtete Substanzen verbessern. Dies könnte künftig die Überlebensdauer

und die Lebensqualität von AML-Patienten optimieren.

Momentan wird auch nach molekularen Markern gesucht, die die Wirkung der

zielgerichteten Therapien überwachen. Ein Zielgen, das durch epigenetische aktive Therapien

in vitro re-exprimiert ist, wäre geeignet für das Monitoring der Effektivität dieser Therapien.

3.- Material und Methoden Seite - 26 -

3.- Materialien und Methoden

3.1.- Materialien

3.1.1.- Zellen

3.1.1.1.- Zelllinien

Alle Zelllinien wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

(DSMZ) GmbH, Braunschweig bezogen.

• Kasumi-1

Die Zelllinie Kasumi-1 wurde 1989 aus dem peripheren Blut eines siebenjährigen japanischen

Jungen mit akuter myeloischer Leukämie im zweiten Rezidiv nach

Knochenmarktransplantation gewonnen (Asou et al., 1991). Die Kasumi-1-Zellen wurden

einer akuten myeloblastischen Leukämie, nach der Französich-Amerikanisch-Britischen

Klassifikation FAB-M2, zugeordnet. Die Kasumi-1-Zelllinie weist eine chromosomale

Abnormalität auf, die Translokation t(8;21)(q22;q22). Das resultierende Fusionsgen heißt

AML1/ETO.

• HL-60

HL-60 ist eine Zelllinie, die 1976 aus dem peripheren Blut einer 35-jährigen Patientin mit

akuter myeloischer Leukämie etabliert wurde. Es erfolgte die Zuordnung der Zellen zu einer

akuten myeloblastischen Leukämie in Reifung FAB M2 (Dalton et al., 1988). Die HL60

Zelllinie weist einen komplexen Karyotyp auf.

• U-937

Die Zelllinie U-937 wurde 1974 aus dem Pleura-Exsudat eines 37-jährigen Mannes mit

generalisiertem histiozytären Lymphom gewonnen (Sundstrom and Nilsson, 1976). Der

histiozytäre Ursprung dieser Zelle wurde durch den Nachweis hoher Lysozym-Produktion

und starker Esterase-Aktivität gesichert. Diese Zelllinie weist einen komplexen Karyotyp auf

und hat die t(10;11)(p14;q23), die zur MLL chromosomalen Aberrationen gehört und typisch

für die AML FAB M5 ist.


• NB-4

NB-4-Zellen wurden aus dem Knochenmark einer 23-jährigen Frau mit akuter

Promyelozyten-Leukämie (FAB M3) im zweiten Rezidiv etabliert (Lanotte et al., 1991).

Diese Zelllinie weist die Translokation t(15;17)(q22;q11-12) auf und trägt somit das

Fusionsgen PML-RARα.

• LCL-GK

LCL-GK-Zelllinie ist eine Epstein-Barr Virus (EBV) immortalisierte lymphoblastische B-

Zelllinie (Kapp et al., 1999).

• Jurkat

Die Jurkat-Zelllinie wurde im Jahr 1976 aus dem peripherischen Blut eines 14-jährigen

Patienten mit einer akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) in erstem Rezidiv isoliert. Die

Zellen gehören zur Kategorie „menschlicher T Zell Leukämie“ Zelllinie (Schneider et al.,

1977).

• 9/14/18

Die 9/14/18-Zelllinie wurde aus der U937-Zelllinie mit einem Ecdyson- induzierbaren

Expressionsvektor, pVgRXR und dem AML1/ETO Konstrukt im pIND-Vektor (Invitrogen)

gemacht (Fliegauf et al., 2004). Diese Zelllinie wurde in der AG Prof. Lübbert entwickelt

und ist eine von 3 Zelllinien, in denen AML1/ETO induzierbar ist. In anderen Zelllinie wird

die AML1/ETO konditionelle Expression durch Zink und Tetrazyklin-off induziert (Alcalay

et al., 2003; Burel et al., 2001).

• K562

Die K562 Zelllinie wurde 1970 aus dem Pleuraerguß einer 53-jährigen Patientin mit

chronischen myeloischen Leukemia (CML) in Blastenkrise isoliert. Die Zellen bilden

Hämoglobin und tragen das Philadelphia-Chromosom mit dem BCR-ABL Fusionsgen

(Lozzio and Lozzio, 1975).

3.1.1.2.- Bakterien

E. Coli OneShot Mach1tm T1RChemically Competent (Invitrogen) mit dem pENTR/D-

TOPO® Cloning Kit wurden benutzt.


3.1.1.3.- Primäre Zellen von gesunden Spendern

• Periphere mononukleäre Zellen

Peripheren mononukleären Zellen des peripheren Blutes wurden aus Eigenblutspenden durch

Auftrennung im Dichtegradienten mit Ficolllösung gewonnen.

• Granulozyten

Nach Ficollgradienten-Zentrifugation von peripherem Blut wurden die Granulozyten aus der

untersten Phase isoliert, nach osmolarischer Lyse der Erythrozyten.

• Monozyten

Sie wurden aus den peripheren mononukleären Zellen des peripheren Blutes isoliert und von

den Lymphozyten durch ihre eigene Adhärenz in einer Kulturflasche getrennt.

• Lymphozyten

Die Zellen, die von den mononukleären Zellen des peripheren Blutes keine eigene Adhärenz

hatten, wurden als Lymphozyten isoliert.

3.1.1.4.- Primäre Zellen von Patienten

• Blasten

Patienten-Proben wurden aus der Tumorbank der Abteilung I der Inneren Medizin des

Univertätsklinikum Freiburg genommen, nach Genehmigung von Prof. Dr. Finke, Prof. Dr.

Veelken und PD. Dr. Martens. Alle Patienten hatten der Klinik die Erlaubnis für die Nutzung

ihrer Proben für Forschungszwecke unterschrieben. Manche Patientenproben, die in der

Tumorbank nicht vorhanden waren, stammen aus dem Molekulardiagnose-Labor der

Abteilung.

• CD34+ Zellen

Die CD34+ Zellen wurden aus dem Blut von Patienten mit soliden Tumoren isoliert. Diese

Zellen werden als "normale Stammzellen (CD34+ Zellen)" bezeichnet, da sie aus Patienten

ohne hämatologische Krankheit gewonnen wurden.


3.1.2.- Materialien für Zellkultur

3.1.2.1.-Zellkulturmedien, Zusätze und Reagenzien

5-Aza-2'-deoxycytidin (DAC, Decitabine) #A3656 Sigma Aldrich

ATRA (all trans Retin-Säure) #A2625 Sigma

Dimethylsulfoxid (DMSO) #D8418 Sigma Aldrich

Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Gibco BRL / Invitrogen

Fötales Kälberserum (FCS) Gibco BRL / Invitrogen

Geneticin (G418) #11811-064 Gibco RBL

Hemin #51280 Sigma

Lymphocyte Separation Medium (LSM 1077) PAA Laboratories Gmbh

MS-275 #02112316 Schering

Natriumpyruvat (100 mM) Gibco BRL / Invitrogen

Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL) Gibco BRL / Invitrogen

PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) #P1585 Sigma

Ponasteron A #H101-03 Invitrogen

Suberoylanilid Hydroxam Säure (SAHA)

#270288M005

Alexis Biochemicals

RPMI 1640 mit L-Glutamine Gibco BRL / Invitrogen

Trichostatin A #T8552 Sigma

Trypanblau 0.4% Gibco BRL / Invitrogen

Türks Lösung Merck

Valproic acid #P4543

Zeocin # R325005 Invitrogen

3.1.2.2.- Sonstige Materialien, Plastikwaren

Glaspipetten (2,5,10,25 ml) Corning

Kryoröhrchen (1,8ml) Corning

Mikro-Schraubröhrchen Sarstedt

Neubauer Zählkammer Marienfeld

Reaktionsgefäße ( 1,5 , 2 ml ) Eppendorf, Greiner

Sterile Schraubdeckelröhrchen (15, 50 ml) Greiner


Sterile Spitzen Molecular Bio Products , Corning

Zellkulturflaschen Nunc

Pipetboy Integra Biosciences

3.1.3.- Materialien für die Bakterienkultur

Ampicillin, Natriumsalz Merck

Bacto-Agar Difco

Bacto-Hefe-Extrakt Difco

Bacto-Trypton Difco

LB (Luria-Bertani)-Medium (1% Bacto-Trypton, 0.1% NaCl, 0.5% Bacto-Hefe-Extrakt, pH

7.0): Zur Herstellung von LB-Medium wurden die einzelnen Komponenten in H2O aufgelöst,

der pH mit NaOH-Lösung eingestellt und das Medium anschließend autoklaviert. Die

Aufbewahrung erfolgte bei +4ºC im Kühlschrank. Antibiotika (50 µg/ml Ampicillin) wurden

stets unmittelbar vor Beimpfung des Mediums zugesetzt.

Alternativ wurde auch folgendes Fertigpulver verwendet:

LB-Medium Gibco BRL / Invitrogen

LB-Agarplatten (15 g Bacto-Agar pro 1000 ml LB-Medium, 150 µg/ml Ampicillin):

Zur Herstellung von LB-Agarplatten wurden 15g Bacto-Agar zu 1000 ml LB-Medium vor

dem Autoklavieren zugesetzt. Nach dem Abkühlen (ca. 37°C) wurden Antibiotika

zugefügt (150 µg/ml Ampicillin), die Platten gegossen und bei 4°C aufbewahrt.

3.1.4.- Materialien für molekularbiologische Arbeiten

3.1.4.1.- Chemikalien und Reagenzien

Agarose Serva

Ammoniumacetat Merck

Aprotinin Sigma-Aldrich


Aqua ad iniectabilia Braun

Aqua Roti-Phenol Roth

Borsäure Merck

Rind Serumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Invitrogen

Bromphenolblau Merck

Chloroform Merck

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma Aldrich

Dithiothreitol (DTT) 0,1 M Invitrogen

ECLPlus Western Blot Detektionsreagenzien Amersham

EDTA Sigma Aldrich

Essigsäure Merck

Ethanol Merck, BDH Prolabo

Ethidiumbromid Qbiogen

Formaldehyd Riedel de Häen

Formamid Merck

GammaBind G Sepharose GE Healthcare

Glyzerin Serva

Glykogen Ambion

Guanidiniumthiocyanat Fluka

HEPES Sigma-Aldrich

Isoamylalkohol Merck

Isopropanol Roth

Kaliumhydrogencarbonat Merck

Lachssperma-DNA Sigma-Aldrich

Leupeptin Sigma-Aldrich

Light Cycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche

Magermilchpulver AppliChem

Methanol Merck

3- N-morpholino propanesulfonic acid

(MOPS)

Serva

Natriumacetat, wasserfrei Merck

Natriumchlorid Fluka

Natriumchlorid (5M) Merck

Natriumcitrat Merck


Natriumdeoxycholat Merck

DiNatriumdihydrogenphosphat Merck

Natriumhydrogenphosphat Merck

Natronlauge 1mol/l Merck

Natronlauge 5mol/l Merck

N-Lauryl-Sarcosine Sigma-Aldrich

Nonidet P40 (NP40) Sigma-Aldrich

NuPAGE Antioxidant Invitrogen

NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Invitrogen

NuPAGE Sample Loading Buffer (4x) Invitrogen

NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) Invitrogen

NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen

PBS Invitrogen

Pepstatin A Sigma-Aldrich

Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich

Propidium-Iodid Sigma-Aldrich

Protein-G-Plus-Agarose Santa Cruz Biotechnology

Proteinase K Merck

Restriktionspuffer NEB 1-4 New England Biolabs

RNase A Sigma-Aldrich

RNAsin Plus (RNAse Inhibitor) Promega

Salzsäure 1mol/l Merck

Salzsäure 5 mol/l Merck

Dodecylsulfat-Natriumsalz (SDS) Serva

SeeBluePlus2 Gel Marker Invitrogen

Sephadex G50 fine Pharmacia

Sephadex G50 medium Pharmacia

Sukrose Sigma-Aldrich

tri-Natriumcitrat Merck

tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck

Tris-Base Sigma-Aldrich

Tris-Hydrochlorid Sigma-Aldrich

Titriplex III / EDTA Merck

Triton X-100 Sigma-Aldrich


Tween 20 Sigma-Aldrich,

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-

Galactopyranosid (X-Gal)

Merck

Xylencyanol Sigma-Aldrich

β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich

3.1.4.2.- Standardlösungen und Puffer

Die Herstellung von Puffern und gepufferten Salzlösungen sowie alle Methoden für Arbeiten

mit Nukleinsäuren wurden, soweit nicht anders angegeben, ausgeführt wie in Sambrook,

Fritsch, Maniatis, “Molecular Cloning“ (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)

beschrieben. Für alle molekularbiologischen und biochemischen Arbeiten wurde hochreines

Nuklease- und Protease-freies Wasser verwendet (Wasser für Injektionszwecke). Für

Bakterienmedien, Agarosegel-Elektrophorese-Puffer sowie Transfer-Puffer und

Waschlösungen wurde meist Wasser verwendet.

Benzidin Stocklösung 3 % Benzidin Lösung gelöst in 90 % Essigsäure und 10 %

Wasser.

Church Puffer 0.33 M Na2HPO4, 0.16 M NaH2PO4, 7 % SDS,

1 mM EDTA pH 8.0

Chloroform Lösung 24 Volumen Chloroform

1 Volumen Isoamylalkohol

Denaturierungs-Lösung 0.5 M NaOH

1.5 M NaCl

DNA-Lyse Puffer 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM EDTA pH 8.0, 0.4

mg/mL Proteinase K und 0.4 % SDS

DNA-Ladepuffer 0,15% Bromphenolblau

0,15% Xylencyanol

42% Sucrose

in 1xTBE

Erststrangpuffer (5x) für

cDNA Synthese

Invitrogen

High-stringency wash (HSW) 0.1 x SSC


Puffer 0.1 % SDS

Lösung D 4 M Guanidiumsothiocyanat,

25 mM Natrium Citrate pH 7.0,

0.5 % Natrium-Lauryl-Sarkosyn

Lösung D+ Lösung D

+ 0,1 M β-Mercaptoethanol

(bei 4°C aufbewahrt,

meist frisch angesetzt)

Low-stringency wash (LSW)

Puffer

2 x SSC

0.1 % SDS

Membranprotein-Lysie Puffer 50 mM Tris HCl pH 7.4, 1 % NP-40, 1 % Laurylmaltoside,

150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM Na3VO4,

1 mM NaF

MOPS, 20x 400 mM 3-(N-Morpholino) propansulfonsäure

100 mM Natriumacetat

20 mM EDTA

pH 7.0

Phenol-Chloroform Lösung 25 Vol Phenol, 24 Vol Chloroform, 1 Vol Isoamylalkohol

Prehybridisierungslösung ChurchBuffer

+ 100 µg/mL Salmon Sperm DNA

RNA-Ladepuffer 50 % Formamid

17.5 % Formaldehyd 37%ig

1-2 % Ficoll

In 1x MOPS-Puffer + Bromphenolblau

SDS, 20% 20.0 g SDS in ca. 90.0 ml H2O lösen (in 68°C Wasserbad),

mit HCl pH auf 7.0, einstellen auf 100.0 ml H2O.

Sephadex G50 20.0 g Sephadex in 500 ml Flasche mit H2O auffüllen

über Nacht quellen lassen

H2O abgießen

mit H2O auffüllen

ausschlieβend autoklavieren

SSC 10x 1.5 M NaCl,

0.15 M NaCitrate, pH 7.0

TAE (50x) Für 1000ml

3 mal


242 g Tris-Base, 57.1 ml Essigsäure, 100 ml 0.5 M EDTA

ph 8.0, auf 1000 ml mit Wasser.

TBE (10x) Für 1000ml

890 mM Tris-Borat (108 g Tris-Base + 55 g Borsäure pro

Liter), 25mM EDTA pH 8.0

TBS 40mM Tris, 270 mM NaCl

TBS-T 40mM Tris, 270 mM NaCl, 1 mL Tween 20, pH 7.6

TE-Buffer 10 mM Tris HCl pH 7.4, 1 mM EDTA pH 8.0

Western Blot Blocking-Puffer TBS-T mit 5 % fett-freiem Magermilchpulver

Western Blot Running Buffer 1x NUPAGE® MES SDS Running Buffer

Western Blot Transfer Buffer 1x NUPAGE® Transfer Buffer,

10 % Methanol für eine Membrane

20 % Methanol für zwei Membrane

3.1.4.3.- Radiochemikalien

[α32P]- dCTP (3000 Ci/mmol) Amersham

3.1.4.4.- Enzyme

Superscript II Reverse Transcriptase Invitrogen

HotStarTaq DNA Polymerase Qiagen

Klenow-Polymerase Amersham

EcoR V New England Biolabs

Not I New England Biolabs

EcoR I New England Biolabs

RNase A Qiagen

rDNase 1 (DNA-free) Ambion

Proteinase K Merck

3.1.4.5.- Nukleinsäuren

Lachssperma-DNA Sigma-Aldrich


Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs) (dATP,

dCTP, dGTP, dTTP) Fermentas

1 kb Molekulargewichtstandard Fermentas / Invitrogen

100 bp Molekulargewichtstandard Fermentas / Invitrogen

Oligo(dT) Primer Invitrogen

Oligonukleotide als forward und reverse Primer wurden von Herrn Dr. Igloi (Institut für

Biologie III, Universität Freiburg) und von der Firma Operon bezogen,

Sequenzen der Oligonukleotide

für Southern Blot Sonden Annealing Temp.

Dematin forw CTCAGGGAACCCTCTGTGTT

Dematin rev AGCCATTGTTCTCTGGCTTC 55,3 °C

PTPN11 forw GGTTCCCTCCTCGTCCC

PTPN11 rev TCTGATAGGGCTGTGGTCAG 60,7 °C

CDC28 forw TTGGAATCTGGAATATGGGC

CDC28 rev GTTAGTGAGCCAAGACTG 53,9 °C

OTX1 forw GCAACACCTCGTGTATGCAG

OTX1 rev AGTGCAGGCAATGGACATCT 55,0 °C

PELI2 forw CTTCGAAACGTCCTCTACGC

PELI2 rev GCTGGAGTTCGATGGGATTA 56,4 °C


für Northern Blot Sonden Annealing Temp.

LAT2-1 forw ACAAGAGGCAACACCAGGAG

LAT2-1rev GGACCCCGTAAAGCTCTGTT 55,0 °C

Lysozyme forw GCCAAATGGGAGAGTGGTTA

Lysozyme rev ATCACGGACAACCCTCTTTG 55,0 °C

β-Aktin forw GGACTTCGAGCAAGAGATGG

β-Aktin rev AGCACTGTGTTGGCGTACAG 55,0 °C

GAPDH forw GAAGGTGAAGGTCGGAGTC

GAPDH rev GAAGATGGTGATGGGATTTC 55,0 °C


für Bisulfit-Sequenzierung Annealing Temp.

RARβ2 forw TTTAAAGTGTGGGTTGGG 54,8 °C


RARβ2 rev TCCCAAATTCTCCTTCCAAA

Die Myeloperoxiedase (MPO) Northern Blot Sonde wurde aus cDNA hergestellt.

Die Oligonukleotide für die „real-time PCR“ wurden von Operon / Qiagen hergestellt.


für "real-time"-RT-PCR Annealing Temp.

LAT2-1 forw GAACCGGATTACGTGAATGG

LAT2-1 rev TAGCTCTGGGAAATGGTCCT 60,0 °C

GAPDH forw GAGTCAACGGATTTGGTCGTATT

GAPDH rev GAATTTGCCATGGGTGGAAT 60,0 °C

GUSB forw CGCCCTGCCTATCTGTATTC

GUSB rev TCCCCACAGGGAGTGTGTAG 60,0 °C

AML1/ETO forw CCGAGAACCTCGAAATCGTACT

AML1/ETO rev TCAGCCTAGATTGCGTCTTCAC 60,0 °C


für "real-time"-DNA-PCR Annealing Temp.

LAT2-1 forw CATTGCCAGAGACTGGTGAA,

LAT2-1 rev TTTCCCCTGACCTGTGTAGG 60,0 °C

p21 forw CAGCTGCATTGGGTAAATCC

p21 rev CACGAAGTGAGCCACAAATC 60,0 °C

3.1.4.6.- Antikörper

Antikörper für Western Blot

Antikörper Firma Verdünnung

Esel anti Ziege-HRP #sc2033 Santa Cruz

Antibodies 1:2000

Kaninchen anti-NTAL, polyklonal #11-485-C100 ExBio 1:1000

Maus anti-NTAL, monoklonal #11-374-C100 ExBio 1:1000

Maus anti-β-Aktin monoclonal # A2228 Sigma Aldrich 1:50000

Ziege anti Kaninchen -HRP- #sc2004 Santa Cruz 1:2000


Antibodies

Ziege anti Maus -HRP- #sc2005 Sigma Aldrich 1:20000

Ziege anti-ETO, polyklonal #sc9737 Santa Cruz

Antibodies 1:1000

Antikörper für FACS

Maus anti-Human CD41a-PE monoklonal #555467 BD Pharmigen

Maus anti-Human CD61FITC monoklonal #555753 BD Pharmigen

Maus IgG1-FITC #X0927 DakoCytomation

Maus IgG1-PE #0928 DakoCytomation

Maus anti-Human CD11b-PE monoklonal #555388 BD Biosciences

Maus anti-Human CD11c-PE monoklonal #555392 BD Biosciences

Antikörper für ChIP

Rabbit anti-Human AcH3 #06599 Upstate

Rabbit anti-Human AcH4 #06598 Upstate

Rabbit anti-Human 3meH3K4 #06745 Upstate

Rabbit anti-Human AcH3K9 #07352 Upstate

3.1.4.7.- Kits

Bio-Rad Protein Assay Bio Rad

DNAfree Ambion

Nuclear Extract Kit Active Motif

RNAse free DNAse Set Qiagen

RNAeasy Mini Kit Qiagen

DNeasy Tissue Kit Qiagen

Megaprime DNA Labelling Kit Amersham

QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen

QIAPrep Spin MiniPrep Kit Qiagen

QIAquick™ Gel Extraction Kit Qiagen

EZ DNA Methylation Kit Zymo Research

TOPO TA Cloning Kit for Sequencing Invitrogen

ECL Plus Western blotting Detektion System Amershams

Nucleospin Exbio

SuperScript™ III Reverse Transcriptase Invitrogen


3.1.4.8.- Sonstige Materialien

384 Loch-Microtiterplaten Roche

96-Loch-Microtiterplatten Greiner

Aluminium-Folie

Autoklavierklebeband 3M

Blotting Pads NuPAGE / Invitrogen

Kryoboxen mit Deckel 50 mm, Rastereinsatz 10x10 RZ

Erlenmeyerkolben (100, 250, 1000 ml) Schott

Filterpapiere / Blottingpapiere Whatman, Schleicher & Schüll

Flatcap PCR-Tubes (0.5 ml) Peqlab

Glaswolle, silanisiert Serva

Haushaltsfolie, Saran Roth

Hybond N+ Nylonmembran Amersham

Hybond-P Membranen Amersham

Hyperfilm Amersham

Impfösen und -nadeln Nunc

Kanüle 26 G (0.45 mm) B. Braun

Messbecher Kartell

Multiply-Strip mit Deckelkette, dünn (0.2 ml) Sarstedt

NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen

Pasteurpipetten Brand

PCR-Tubes Abgene

PCR-Tubes, dünn (0.2 ml) Peqlab

QPCR Seal Roche

Reaktionsgefäß (0.5, 1.5, 2.0 ml) Eppendorf, Greiner

Reaktionsgefäß safe lock (0.5, 1.5, 2.0 ml) Eppendorf

Röhrchen, konisch (225 ml) Falcon

Röhrchen, Polypropylen (15, 50 ml) Falcon

Schaumstoffplatten, Schwämme Bauhaus, Freiburg

Skalpelle Feather

Thermo-Fast 96 Detektionsplatte Abgene

Thermoprintpapier K65HM Mitsubishi

Wägeschalen (40/40/10, 80/80/20, 140/140/20) Bender& Hobein


Wägeschalen (40/40/10, 80/80/20, 140/140/20) Bender & Hobein

X-OMAT-AR Röntgenfilme Kodak

3.1.5.- Geräte

ABI Prism 7700 Sequenzierer Applied Biosystems

Auflicht-Mikroskop Leica DMIL Leica

Cyan ADP (Durchflußzytometer) DakoCytomation

Durchflusszytometer FACSCalibur Becton & Dickinson

Entwickler X-Omat M35 Kodak

Gelkammern BioRad

Gelkammern Hans Thoma Laborbedarf,

Freiburg

Gelkammern DNA sub cell Bio-Rad

Gelkammern Wide mini sub cell Bio-Rad

Heizblock TCR100 Roth

Heizblock DB-2D Techne

Heizblock Dri-Block Techne

Heizblock TCR100 Roth

Hybridisation Oven 640 Affymetrix

Inkubator Heraeus 6000 Heraeus

Kühlschrank -80°C Heraeus

Kühlschrank -20°C Liebherr

Kühlschrank 4°C Liebherr

Kühlschrank HFU586STD-U12 -80°C Heraeus

Kühlschrank UF80-450S Colora

Kühlzentrifuge 5417R Eppendorf

Mikroskop Zeiss Axioskop 2 MOT und AxioCam Zeiss

Mikrowelle AEG/Siemens

Netzteile LKB ECPS 3000/150 Pharmacia

Netzteile LKB EPS 500/400 Pharmacia

Optimax X-Ray Film Processor Typon

Photoprinter PGGE (Video Copy Processor) Mitsubishi Electric Corporation


Schüttelinkubator Incubator shaker series 25 New Brunswick scientific Co.,

Inc.

Spektrometer DU640 Beckman

Spektrometer, GeneQuant Pro Amersham

Sterile Werkbank CaminAir HB2448 Heraeus

Sterile Werkbank Variolab Mobilien W90 Waldner Laboreinrichtungen

T3 Thermocycler Biometra

T-Gradient Thermocycler Biometra

Thermocycler PTC200 MJ Research, Biozym Diagnostik

Thermomagnetrührer Heidolph

Thermomixer Comfort 1,5ml Eppendorf

Tischzentrifuge 5417C Eppendorf

Tischzentrifuge Biofuge 13 Heraeus

Tischzentrifuge Biofuge 15 Heraeus Heraeus

Ultraviolett Transilluminator UVP Herolab

UV Stratalinker 2400 Stratagene

Vacuum Concentrator BA-VC-300 Bachhofer

Vortexer Heidolph

Vortexer Janke und Kunkel, IKA-

Labortechnik

Waage basic BA1103 Sartorius

Waage portable PT120 Sartorius

Waage portable PT6 Sartorius

Wasserbad W26/PC3, Haake

XCell SureLock Mini-Cell NuPage / Invitrogen

Zentrifuge Megafuge 1.0R Heraeus

Zentrifuge Megafuge 3.0R Heraeus

Zentrifuge Varifuge 3.0R Heraeus

3.1.6.- Bioinformatische Software

Chromas Technelysium


CpGPlot http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/

European Bioinformatics Institute (EBI) (Cambridge, England)

Repeat Masker (http://repeatmasker.genome.washington.edu/)

University of Washington, USA

Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)

Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, USA

NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

National Center for Biotechnology Information, USA

MethPrimer (www.urogene.org/methprimer/)

Urology Research Center, Veterans Affairs Medical Center and

University of California, San Francisco, USA

Blast/Special/alignment

2 Sequences

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)

National Center for Biotechnology Information, USA

NEB Cutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)

New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)

Universal Probe Library (https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/index.jsp)

Roche Diagnostics (Basel, Schweiz)

Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)

National Institutes of Health, USA

Summit v 4.2 (www.dakousa.com)

Dakocytomation, California, USA

FlowJo v. 6.2 (www.flowjo.com)

Tree Star inc, Oregon, USA


3.2.- Methoden

3.2.1.- Aufarbeitung des primären Materials.

3.2.1.1.- Isolierung der peripheren Blutzellen

Mononukleäre Zellen aus Blut gesunder Spendern wurden mittels

Ficollgradientenzentrifugation isoliert und als Zellpellets für DNA- und Proteinisolierung

eingefroren. Blut von gesunden Spendern wurde in zwei 10 ml EDTA Röhrchen

aufgenommen. Die peripheren mononukleären Zellen wurden so rasch wie möglich isoliert.

Dazu wurden zunächst 20 ml Ficoll Lösung in ein steriles Schraubdeckelröhrchen pipettiert.

10 ml Blut wurden mit 10 ml PBS Puffer verdünnt und vorsichtig auf die Ficolllösung

geschichtet. Nach Zentrifugation für 30 min bei 2300 rpm ohne Bremse reicherten sich die

mononukleären Zellen an der Phasengrenze als feine gelbliche Bande an. Im Zellpellet

befanden sich die Erythrozyten und Granulozyten. Die peripheren mononuklearen Zellen

(MNC) wurden aus der Interphase geerntet, mit PBS gewaschen und anschließend mit Türks-

Lösung gefärbt und gezählt. In Abhängigkeit von der Zellenausbeute wurden 5x106 bis 1x107

Zellen als Zellpellets bei -80°C eingefroren.

3.2.1.2.- Lymphozyten-Isolierung

Die Lymphozyten und Monozyten wurden aus der Interphase nach dem

Ficollgradientenzentrifugation isoliert. Die Zellen, die in der Interphase lagen, wurden in

37ºC warmen RPMI 1640 Medium, Gibco, plus 10 % FCS aufgenommen und in einer 175

cm2 Zellkulturflasche bei 37°C und 5 % CO2 für 1 Stunde inkubiert.

Nach dieser Zeit wurden die nicht adhärenten Zellen durch Beklopfen der Flasche abgelöst

und in einem 50 ml Röhrchen zusammen mit dem Überstand überführtzugegeben. Die

adhärenten Zellen wurden zweimal mit 10 ml PBS gewaschen und diese Flüssigkeit zu den

nicht-adhärenten Zellen in die 50 ml Röhrchen pipettiert.

Die nicht-adhärenten Zellen wurden mit 1800 rpm und 5 min. zentrifugiert und mit 10 ml

PBS gewaschen. Anschließend wurden sie mit Türks-Lösung gefärbt und in einer Neubauer

Zählkammer gezählt und als Lymphozyten definiert.


3.2.1.3.- Monozyten-Isolierung

Die adhärenten Zellen, die auf dem Boden der Zellkulturflasche haften, wurden mit Trypsin-

EDTA Lösung abgelöst. Dabei wurde der Flaschenboden mit 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung

bedeckt und 5-10 min. bei 37°C inkubiert. Durch leichtes Klopfen auf die Unterseite des

Gefäßes wurden die Zellen abgelöst und wurden durch Auswaschen der Flasche mit PBS als

Monozyten geerntet. Die Zellzahl wurde nach Färbung mit Türks-Lösung in einer Neubauer-

Zählkammer bestimmt.

3.2.1.4.- Granulozyten-Isolierung

Die Granulozyten wurden aus der untersten Phase des Fikollgradienten isoliert. Zuerst wurde

das Pellet mit den Granulozyten und den Erythrozyten in 50 ml Lösung (25 ml PBS, 25 ml 3%

Dextran gelöst in 0.9 % NaCl) resuspendiert und 30 bis 60 min. bei 4 ºC sedimentiert. Der

Überstand wurde 10 min. bei 1600 rpm zentrifugiert. Um die noch vorhandenen Erythozyten

zu lysieren, wurde das Pellet für 30 sec. mit 10 ml eiskalten 0.2 % NaCl Lösung und dann für

30 sec. mit 10 ml eiskalter 1.6 % NaCl-Lösung gemischt.

Danach wurden die Zellen 10 min. bei 1600 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen und

das Pellet mit den Granulozyten einmal mit PBS gewaschen. Die Zellzahl wurde mit Türks-

Lösung in einem Neubauer-Zählkammer bestimmt.

3.2.1.5.- Patientenproben

Die Patienten, deren Proben wir auf Proteinexpression hinuntersucht haben, wurden aus den

behandelten AML-Patienten der Universitätsklinik Freiburg ausgewählt. Kriterien, um

Patienten für unseren Projekt einzuschlieβen, waren: 1) AML, diagnostisiert in der

Universitätsklinik Freiburg, 2) schriftliche Erlaubnis für die Verwendung der Proben für

Forschungszwecke unterschrieben, 3) bekannter Karyotyp der Blasten festgestellt und 4)

ausreichend Proben in der Tumorbank für anderen Zwecke. Nach einer schriftlichen

Vorstellung unseres Vorhabens erhielten wir die Genehmigung von der Tumorbank für die

Benutzung dieser Proben.

Die meisten Proben waren aus dem Knochenmark der Patienten nach

Ficollgradientenzentrifugation gewonnen und in einem mit 50 % FCS und 10 % DMSO


angereicherten RPMI 1640 Medium eingefroren. Die Auftrennung mittels

Fikollgradientenzentrifugation und das Einfrieren der Proben wurden von MTAs der Abteilung

I der Inneren Medizin durchgeführt.

In weiterem wurden die Proben der Patienten in einem Wasserbad bei 37ºC aufgetaut und in

10 ml RPMI Medium, Gibco, zweimal gewaschen, um das DMSO so schnell wie möglich zu

entfernen. Dann wurden die Zellen in 1 mL PBS aufgelöst und nach Trypanblau Färbung

gezählt. Anschließend wurden die Proteine nach der Methode für die Isolierung der

Membranproteine gewonnen (s. u. 3.2.6.).

3.2.1.6.- Isolierung von CD34+ Zellen

CD34+ Zellen sind hämatologische Stammzellen und werden in der Klinik für die

Stammzelltransplantation eingesetzt. Diese Zellen kann man durch Zugabe verschiedener

Zytokine in die Differenzierung zu lymphatischen und myeloischen Zellen treiben. Die CD34+

Vorläuferzellen werden durch G-CSF Gabe mobilisiert und in das Blut ausgeschwemmt. Sie

werden dann mittels einer Leukapherese (Cobspektra) abgesammelt. Aus diesem

Leukapherisatprodukt werden die CD34+ Zellen durch Antikörpermarkierung mit

Magnetbeads und dem sogenannten Clinimacs angereichert. Anhand eines

Durchflußzytometers wird dann die Reinheit der CD34+ Zellen bestimmt.

3.2.1.7.- Isolierung von Alveolar-Makrophagen.

Die Alveolar-Makrophagen stammten aus einer bronchoalveolären Lavage von Patienten, bei

denen zu Diagnose Zwecken eine Bronchoskopie notwendig war. Die Zellen der Patienten

wurden von Fr. Dr. Brassel aus der Abteilung für Pneumologie, des Universitätsklinikums

Freiburg zur Verfügung gestellt. Nach der bronchoalveolären Lavage wurden die Zellen

zweimal in PBS gewaschen, mit der Türk-Färbung in einer Neubauer-Zählkammer gezählt und

als Zellpellet eingefroren.

3.2.2. Zellkultur

Alle Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit im Inkubator kultiviert.

Sämtliche Zentrifugationsschritte von Zellen, die weiter in Kultur gehalten wurden, wurden

für 5 min bei 1200 rpm in einer Heraeuszentrifuge durchgeführt. Zellkulturarbeiten wurden


ausschließlich an einer sterilen Werkbank verrichtet. Die fertig angesetzten Kulturmedien

wurden bei 4 °C aufbewahrt und vor der Benutzung im 37 °C Wasserbad vorgewärmt.

3.2.2.1.- Kultivierung der Zellen

Alle Medienansätze mit RPMI-1640, Gibco, wurden mit 5 ml Penicillin-Streptomycin-

Lösung je 500 ml versetzt (100 U/ml). Die Zellkultur wurde mit einer Zellkonzentration von

ca. 5x105 Zellen/ml gestartet. Mediumwechsel und Aufteilung der Zellen erfolgten alle zwei

bis drei Tage. Die Zellkonzentration wurde im weiteren Kulturverlauf zwischen 0.25 und

1x106 Zellen/ml gehalten. Eine deutliche Menge an Zelldebris war stets während der Kultur

der Kasumi-1 Zelllinie zu beobachten.

Die Zelllinie Kasumi-1 erhielt das Medium RPMI-1640, Gibco, mit 20% FCS. Zusätzlich

wurde gelegentlich noch 5 ml Natriumpyruvat-Lösung zum Medium hinzugefügt. Die

Zelllinien HL60, U937, 9/14/18 und K562 wurden in RPM1-1640 mit 10% FCS und 100

U/mL Penicilin-Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden alle zwei Tage aufgeteilt und mit

frischem Medium versetzt, so dass Zellkonzentrationen zwischen 0.5 und 2x106 Zellen/ml

erreicht wurden. Die Zelllinie NB4 wurde in RPMI-1640, Gibco, mit 10 oder 20 % FCS unter

den gleichen Bedingungen wie HL60 und U937 kultiviert.

Zum Mediumwechsel wurden die Zellen für 5 min bei 1200 rpm in Falcon-Röhrchen

zentrifugiert. Der Überstand mit dem alten Medium wurde verworfen, das Zellpellet in

frischem Medium resuspendiert und auf die Zellkulturflaschen verteilt.

3.2.2.2.- Einfrieren und Auftauen der Zellen

Sowohl das Einfrieren als auch das Auftauen von Zellen erfolgte sehr zügig, um toxische

Wirkungen von DMSO auf die Zellen möglichst gering zu halten.

Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen mit den Zellen kurz im 37°C Wasserbad

geschwenkt. Nach dem Auftauen der Zellsuspension wurde diese direkt in 10 ml 37ºC

warmes Medium pipettiert und für 5 min bei 1200 rpm zentrifugiert, um das DMSO

auszuwaschen. Das Zellpellet wurde dann in frischem Kulturmedium aufgenommen und in

der gewünschten Dichte auf Kulturflaschen aufgeteilt.

Zum Einfrieren wurden die Zellen 5 min bei 1200 zentrifugiert und anschließend in einer

Zelldichte zwischen 0.5 und 1x107 in Einfrierungsmedium (20% FCS, 10% DMSO und 70%

RPMI-1640, Gibco) aufgenommen. Je 1 ml der Zellsuspenison wurde in Kryoröhrchen


aliquotiert. Das langsame Einfrieren der Zellen wurde durch die Lagerung der Röhrchen bei -

80ºC in einem isolierenden Isopropanol enthaltenden Gefäß gewährleistet. Nach 2-3 Wochen

wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.

3.2.2.3.- Zellzahl- und Viabilitäts-Bestimmung durch Trypan Blau Färbung

Zellzahl und Viabilität der Zellen wurden mittels Trypanblau-Färbung bestimmt. Dieser

Färbung liegt das Prinzip zu Grunde, dass lebende Zellen den Farbstoff Trypanblau nicht

aufnehmen, während tote Zellen angefärbt werden.

Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 50 µl Zellsuspension mit dem gleichen Volumen

0,4%iger Trypanblaulösung vermischt. Die Mischung aus Farbstoff und Zellen wurde in einer

Neubauer-Zählkammer gegeben und jeweils die vier großen Quadranten unter dem

Durchlichtmikroskop ausgezählt. Blau gefärbte Zellen wurden als tot gewertet, ungefärbte

helle Zellen als lebend. Da jeder Quadrant einem Volumen von 0,1 mm3 (10-4ml) entspricht,

wurden die Zellzahl und Viabilität in 1 ml mit folgende Formeln berechnet.

Zellzahl/ml = Anzahl gezählter Zellen / Zahl der ausgezählten Eckquadrate x 2

(Verdünnungsfaktor) x104

Viabilität = Anzahl lebender Zellen / Summe aller Zellen (lebende + tote) x 100 %

3.2.2.4.- Zellzahl- und Viabilitäts-Bestimmung durch Färbung mit Türklösung

Die Anzahl solcher Zellen, die direkt aus dem Blut gewonnen wurden, wurde mit der

Türklösung bestimmt, um Artefakte mit Erythrozyten zu vermeiden. Die Türklösung färbt nur

die Zellen der weiβen Reihe und nicht die Zellen der roten Reihe, allerdings kann damit nicht

die Viabilität der Zellen bestimmt werden.

Die Methode ist analog der Trypanblau Färbung, doch wurden die Zellen in einem Verhältnis

vom 1:100 mit der Türklösung versetzt. Dann wurden die Zellen mit einem Neubauer

Zählkammer gezählt und die Zellzahl wurde mit einem Wert von 100 als Verdünnungsfaktor

errechnet.


3.2.2.5.- Abtrennung toter Zellen und Zelltrimmern mittels

Ficollgradientenzentrifugation

Zur Abtrennung von toten Zellen und Debris wurde die Ficollgradienten Zentrifugation

durchgeführt. Dazu wurde zunächst in einem 50 ml Falcon Röhrchen 1 Volumen der Ficoll-

Lösung gegeben und diese mit dem entsprechenden Volumen an Zellsuspension vorsichtig

überschichtet. Anschließend wurde für 30 min bei 2300rpm ohne Bremse zentrifugiert.

Während sich die toten Zellen und Debris im Pellet sammeln, reichern sich die lebenden

Zellen in einer weiß-gelben Schicht an der Phasengrenze an. Diese Zellen wurden vorsichtig

mit der Pipette entnommen, zweimal mit PBS gewaschen und dann wieder in Kultur

genommen.

3.2.2.6.- Beurteilung der Morphologie durch Zytospin und Färbung

3.2.2.6.1.- Zytospin

Die Zellen wurden zentrifugiert, mit PBS gewaschen und anschließend in einer Dichte von

1 x 105 Zellen in 200 µl PBS resuspendiert. 100 µl dieser Zellsuspension wurden in die

vorbereiteten Trichter pipettiert und bei 800 rpm 3 min auf die Objektträger zentrifugiert. Die

Objektträger wurden dann an der Luft getrocknet und anschließend mit der Panoptischen

Färbung nach Pappenheim gefärbt.

3.2.2.6.2- May-Grünwald Giemsa Färbung (Pappenheim Färbung)

Hierzu wurden die Zytospinpräparate 3 min mit May-Grünwald-Lösung bedeckt,

anschließend mit Wasser abgespült und weitere 3 min in Wasser stehen gelassen. Im weiteren

wurden die Präparate mit Giemsa-Gebrauchslösung (1:20 in PBS verdünnt) für 20 min gefärbt

und abschließend wieder mit Wasser abgespült. Die Objektträger trockneten dann

schrägstehend an der Luft.

3.2.2.6.3.- Benzidin Färbung

Für die Benzidin Färbung wurde die Benzidin Lösung immer frisch hergestellt. Es wurden 1

Teil Benzidin Stammlösung (3 % Benzidin Lösung gelöst in 90 % Essigsäure und 10 %

Wasser), 1 Teil Wasserstoffperoxid 30 % und 5 Teile bidestiliertes Wasser gemischt.


2 ml Zellsuspension wurden mit 0.2 ml Benzidin Lösung gemischt, 5 min. bei Raumtemperatur

inkubiert und dann wurden die gefärbten und farblosen Zellen in einer Neubauer Zählkammer

gezählt. Das Photographieren der Zellen erfolgte innerhalb einer Stunde, da die Färbung sehr

unstabil ist.

3.2.3.- Behandlung der Zellen

3.2.3.1.- Induktion der Expression des AML1/ETO-Proteins in der 9/14/18-

Zelllinie

Die 9/14/18-Zelllinie wurde in 600 µg/ml Geneticin und 150 µg/ml Zeocin kultiviert, um die

Präsenz der Vektoren zu gewährleisten. Die AML1/ETO-Expression wurde durch 5 µM in

Ethanol gelöstem Ponasteron A induziert. Zur Kontrolle wurde das gleiche Volumen Ethanol

den nicht-induzierten Zellen hinzugegeben. Bei Induktionsexperimenten mit einer Dauer von

mehr als 48 Stunden wurde alle 48 Stunden ein Mediumwechsel unter Hinzugabe von

Ponasteron A durchgeführt.

3.2.3.2.- Myeloische Differenzierung der HL60, U937, NB4 und K562 Zelllinien.

Die HL60-, U937-, NB4- und K562-Zelllinien wurden für myeloische Differenzierungs-Assays

benutzt. Zellen wurden in einer Dichte von 2.5 x105 Zellen/ml auf ca. 20-40 ml Medium auf

den Kulturflaschen verteilt. An jedem Tag wurde die Zellzahl und die Viabilität mit Trypan-

Blau-Färbung bestimmt, und es wurden Zellen für weitere Expressionsanalyse mittels Western

und Northern Blot geerntet. Am letzten Tag wurden 2x105 Zellen für Morphologieanalysen

mittels May-Grünwald-Giemsa-Färbung und 1x105 Zellen für Antigen-Expressionanalyse

mittels Durchflusszytometrie (FACS) genommen.

Bei der ATRA-Behandlung der HL60-, U937- und NB4-Zellen wurde das ATRA (in Ethanol

aufgelöst) jeden Tag in einer Endkonzentration von 10-6 M zugegeben. Das Medium wurde

jeden Tag gewechselt und die Substanzen neu hinzugegeben. Bei der Hemin-Behandlung der

K562-Zellen wurde auch täglich die Substanz ersetzt und das Medium gewechselt.

Für die PMA-Behandlung (in Wasser aufgelöst) der HL60- und K562-Zellen wurden die

Substanzen nur einmal am ersten Tag zugegeben und das Medium wurde während des

Versuches nicht gewechselt.


3.2.3.3.- Ex vivo myeloische Differenzierung der CD34+ Zellen.

Nach dem Auftauen der CD34+ Zellen in einem auf 37ºC vorgewärmten Wasserbad wurden

die Zellen zweimal in 10 ml CellGro Medium gewaschen und anschlieβend in diesem Medium

resuspendiert. Die Zellen wurden mit der Trypanblau-Färbung gezählt und in einer

Konzentration von 1x105 Zellen/ml Medium auf 75 cm2 Flaschen verteilt. Als Kulturmedium

wurde das CellGro Medium benutzt, versetzt mit einem Expansion-Cocktail (modifiziert nach

Guo et al. Leukemia 2006) aus den folgenden Zytokinen: SCF (100 ng/ml), FLT3 (100 ng/ml),

IL3 (50 ng/ml) und IL6 (20 ng/ml).

Durch Zugeben von G-CSF (50 ng/ml) differenzieren die Zellen in reife Granulozyten, durch

GM-CSF (50 ng/ml) wird die monozytäre Differenzierung angeregt und mit GM-CSF (50

ng/ml) plus IL-4 (50 ng/ml) erfolgt eine monozytär-dendritische Differenzierung. Als

Kontrolle wurde ein Teil der Zellen nur mit dem Expansion-Cocktail kultiviert. Die Zellen

wurden am Tag 0, 1, 3, 7 und 14 als Zellpellet bei -80ºC geerntet und jeweils 1x105 Zellen

wurden für Antigenanalyse mittels Durchflusszytometrie und die morphologische

Untersuchung mittels May-Grünwald Giemsa Färbung gewonnen.

3.2.3.4.- Behandlung der Kasumi-1 Zellinie mit epigenetisch aktiven Substanzen.

Die Zellen wurden mit 5-Aza-2'-deoxycytidine (Decitabine, DAC) (in PBS aufgelöst)

Konzentrationen zwischen 25 und 200 nM behandelt. Zu Beginn der Behandlung wurden die

Zellen auf eine Konzentration von 2,5x105 Zellen/ml gebracht. DAC wurde in einer

Konzentration von 100 µM in sterilem PBS gelöst. Die Reagenzien wurden unter sterilen

Bedingungen in die Kulturflaschen eingebracht. Aufgrund der Instabilität von DAC musste

die Substanz alle 24 Stunden mit frischem Medium frisch angesetzt werden. Die Behandlung

erfolgte daher in 3 Pulsen jede 24 Stunden. Die Zellen wurden innerhalb dieser Zeit täglich

zentrifugiert, mit frischem Medium versorgt und gezählt. Anschließend wurden die Zellen für

weitere 72 Stunden ohne Mediumwechsel in Kultur gehalten. Die Zellen wurden sowohl am

sechsten Tag, als auch zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Behandlung geerntet.

Als Leerkontrollen wurden jeweils Ansätze mit entsprechenden Volumina an PBS versetzt.

Wenn die Kasumi-1 Zellen mit der Kombination von demethylierenden Substanzen (DAC)

und HDAC Inhibitoren ATRA, TSA (in Ethanol aufgelöst), MS275 (in DMSO aufgelöst),

SAHA (in Methanol aufgelöst) behandelt wurden, haben wir drei Pulse vom DAC in den


ersten drei Tage gegeben. Nach 72 Stunden wurde der HDAC-Inhibitor mit frischem Medium

zugegeben. Die Zellen wurden anschlieβend am sechsten Tag gezählt und geerntet.

Das Ernten der Zellen erfolgte nach Bestimmung der Zellzahl und Viabilität zu verschiedenen

Zeitpunkten während oder nach der Behandlung. Dazu wurden 0,5 bis 1x107 Zellen in 1,5 ml

Reaktionsgefäße überführt und bei 4°C für 5 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Nach Absaugen

des Mediums im Überstand wurden die Zellpellets je nach Weiterverwendung in RNA-Lyse-

Puffer oder als Pellet im -80°C Gefrierschrank gelagert.

3.2.4.- Isolierung der Nukleinsäuren

3.2.4.1.- DNA-Isolierung mittels Phenol-Chloroform Extraktion.

Zelllinien und mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut wurden in DNA Lysis-Buffer

resuspendiert und über Nacht in einem bei 55ºC vorgewarmten Wasserbad lysiert. Während

der DNA Isolierung wurden abgeschnittene Pipettenspitzen zur Vermeidung von Scherung

der DNA-Doppelstränge verwendet. Auf 107 Zellen wurde 1 ml DNA Lysis Puffer gegeben

und die Zellen wurden in einem 15 ml Röhrchen resuspendiert.

An folgendem Tag wurde die DNA aus dem Lysat nach Phenol/Chloroform-Extraktion und

Natrium Acetat-Isopropanol -Fällung gewonnen. Zu einem Volumen des Lysates wurde ein

Volumen von Phenol gegeben. Die Suspension wurde 15 min. in einem horizontalen Schüttler

gemischt und dann für 5 min. bei 2500 rpm zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde

vorsichtig mit einer angeschnitteten Pipettenspitze abgenommen und in ein frisches 15 ml

Röhrchen überführt. Dazu wurde ein Volumen von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol

(25/24/1) gegeben und es wurde wieder 15 min. im horizontalen Schüttler gemischt und 5

min. bei 2000 rpm zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues 15 ml

Röhrchen überführt. Nach Zugabe von einem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (49/1)

wurde im horizontalen Schüttler gemischt, um die Reste vom Phenol zu entfernen.

Anschlieβlich wurde 5 min. bei 2000 rpm zentrifugiert.

Die DNA wurde mit 0,3 M Natrium Acetat pH 4,8 und 60 % Endvolumen von Isopropanol

bei Raumtemperatur gefällt. Die gefällte DNA wurde in 70 %iger Ethanollösung gewaschen

und 15 min. bei Raumtemperatur trocken gelassen. Anschlieβlich wurde die DNA in TE

Puffer resuspendiert, bei 37 ° in einem Brutschrank gelöst und im Kühlschrank bei +4ºC

aufbewahrt.


3.2.4.2.- DNA-Isolierung mittels Qiagen Kit

Genomische DNA wurde mit dem DNeasy Tissue Kit von Qiagen entsprechend den

Vorgaben des Herstellers isoliert, wenn kleine Menge DNA für die folgenden Experimente

(PCR, bisulfite Konversion) notwendig waren. Dazu wurden die Proben zuerst mit Proteinase

K lysiert und in Puffer resuspendiert, die eine optimale Bindung der DNA in die Silica-Gel-

Membranen ergeben. Nach einer Zentrifugation ist die DNA an die Säule gebunden, und die

Kontaminanten sind abgetrennt. Danach wurden Enzyme und Reste von Kontaminanten von

der DNA mit den verschiedenen Waschschritten entfernt. Anschlieβend wurde die DNA in

TE Buffer gelöst und bei +4ºC gelagert.

3.2.4.3.- RNA-Isolierung mittels Guanidiniumthiocyanat.

Die RNA-Isolierung wurde nach der Methode von Chomczynski und Sacchi (Anal Biochem

1987) durchgeführt.

Die Zellen wurden direkt nach der Zellkultur in eiskaltem PBS gewaschen und in einem

Alliquot von 1x107 zentrifugiert. Dann wurden sie in 1 ml frischer Lösung D+ resuspendiert,

lysiert und ggf. bis zur weiteren Verarbeitung bei –80°C eingefroren.

Zur Reinigung der RNA wurde zunächst eine Phenol/Chloroform-Extraktion durchgeführt

und anschließend mit Isopropanol gefällt. Die weitere Beschreibung der RNA-Isolierung

bezieht sich auf jeweils 500 µl dieses Isolates in 1.5 ml RNase-freien Reaktionsgefäßen. Nach

Zugabe von 50 µl 2 M Natriumacetat pH 4.0 und erneutem Vortexen wurde das Lysat durch

mehrmaliges Aufziehen in Insulin-Spritzen mit Kanülen (26 G, Durchmesser 0.45 mm) weiter

homogenisiert. Im Weiteren wurden 500 µl H2O-gesättigtes Phenol zugesetzt, wiederum

gevortext und bis zu 15 min auf einem Schüttler gemischt. 100 µl Chloroform/Isoamylalkohol

im Volumenverhältnis 49:1 wurden zugesetzt, intensiv gevortext und die Ansätze für 15 min

auf Eis inkubiert. Zur Trennung der Phasen wurde es für 15 min bei 13000 rpm und 4°C

zentrifugiert, die wässrige Phase abgenommen und in ein frisches Reaktionsgefäß transferiert.

Die RNA wurde anschließend durch Zugabe von 500 µl Isopropanol und Lagerung über

Nacht bei -80°C präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch erneute Zentrifugation für 15 min bei

13000 rpm und 4°C pelletiert, und der Überstand wurde verworfen. Das RNA-Pellet wurde

dann einmal in eiskaltem 70%igen Ethanol gewaschen, getrocknet und in einem geeigneten

Volumen RNAse freiem Wasser aufgelöst. Die RNA-Konzentration wurde photometrisch

bestimmt und die Aufbewahrung der RNA erfolgte bei -80°C.


3.2.4.4.- RNA-Isolierung mittels Qiagen Kit

Die RNA Isolierung wurde mit dem RNeasy Kit von Qiagen durchgeführt. Diese Methode

nutzt die selektiven Nukleinsäure Bindungseigenschaften von Silicagel-Membranen. Alle

Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Zellen wurden dabei zunächst mit dem

stark denaturierenden, Guanidiniumthiocyanate enthaltenden RLT-Puffer lysiert. Durch diese

Behandlung werden RNAsen effizient inaktiviert, sodass die Isolierung von intakter RNA

gewährleistet ist. Anschließend wurde das Zelllysat durch mehrmaliges Passieren einer 20-

Gauge Kanüle (0,9 mm Durchmesser) homogenisiert. Um die optimale Bindungskapazität der

RNA an die Säulen zu erreichen, wurde 1 Volumen 70%iges Ethanol hinzugefügt. Die

Zelllysate wurden auf die RNeasy-Säulen geladen. Nach kurzer Zentrifugation bei 10000 rpm

lag die Gesamt-RNA an die Membran gebunden vor. Durch weitere Waschschritte mit 700 µl

Puffer RW1 und zweimal mit 500 µl des ethanolhaltigen Puffer RPE wurden alle anderen

Bestandteile entfernt. Im letzen Schritt wurde RNA in 40 µl RNAse-freiem Wasser eluiert

(siehe auch RNeasy Mini Protokoll für die Isolierung von Gesamt RNA aus tierischen Zellen).

Die RNA wurde anschließend bei -80°C gelagert

3.2.4.5.- Photometrische Bestimmung der DNA- und RNA-Konzentration

Die Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA erfolgte photometrisch unter

Verwendung von Quarzkapillaren mit dem Densitometer GeneQuant Pro. Hierbei wurde die

Eigenschaft der Nukleinsäuren ausgenutzt, Licht bei einer Wellenlänge von 260 nm maximal

zu extingieren. Mittels der optischen Dichte bei 260 nm (OD260) und des Warburgschen

Extinktionskoeffizienten lässt sich die Konzentration berechnen. Proteine hingegen

absorbieren Licht bei 280 nm maximal. Das Verhältnis OD260/OD280 ist ein Maß für die

Proteinverunreinigung, Werte unter 1.7 weisen auf einen zu hohen Proteingehalt hin. Der

Leerwert wurde mit Wasser oder TE Buffer gemessen.

3.2.5.- cDNA Synthese

3.2.5.1.- DNAse Verdau

Bei einer Verwendung der RNA für quantitative RT-PCR und bei der Herstellung von Sonden

für Northern Blots wurde die RNA zusätzlich DNase behandelt, um die Kontamination mit


genomischer DNA zu minimieren. Der DNase-Verdau erfolgte dabei entweder direkt auf der

RNeasy-Säule mit Hilfe des RNAse-Free DNase Sets von Qiagen oder nach Eluation mit dem

DNA-free Set von Ambion durchgeführt.

Bei der DNAse Behandlung auf der Säule wurde zunächst Lyse, Homogenisation und

Absorption der RNA an die Silicagelmembran wie oben beschrieben durchgeführt. Nach

einem Waschschritt mit 350 µl Puffer RW1 wurde die RNA für 15 min bei Raumtemperatur

mit DNAse I in RDD Puffer inkubiert. Anschließen wurde mit weiteren 350 µl Puffer RW1

gewaschen und der Durchfluss verworfen. Für die folgenden Waschchritte und die Eluation

wurde nach dem RNeasy-Standardprotokoll (siehe oben) verfahren.

Die DNAse-Behandlung mit dem DNA-free Set von Ambion wurde in 50µl Reaktionen

durchgeführt. Dabei wurden 5 µl Volumen 10x DNase I-Puffer und 1µl rDNase I (2U/µl) zu

der gewünschten RNA-Menge dazugegeben und mit RNAse freiem Wasser auf 50µl

Reaktionsvolumen aufgefüllt. Nach einem Inkubationsschritt für 20-30 min bei 37°C wurde

0.1 Volumen DNase-Inactivation-Reagenz dazugegeben und die Lösung für weitere 2 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Zeit wurde der Ansatz zwei bis dreimal durch

Pipettieren gemischt. Es folgte eine Zentrifugation bei 10000 g für 1.5 min. Der RNA-

enthaltende Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und bei -80°C gelagert.

Das DNAse- und DNAse-Inactivation-Reagenz-enthaltende Pellet wurde verworfen.

3.2.5.2.- Reverse Transkription – Polymerasekettenreaktion (RT-PCR).

Die cDNA-Synthese erfolgte mit RNA-Startkonzentrationen zwischen 250 ng und 2 µg.

Dabei wurde zunächst die RNA mit 250 ng Oligo(dT)12-18 Primern (Invitrogen) gemischt und

Wasser wurde bis auf ein Gesamtvolumen von 10 µl hinzugefügt. Zur Hybridisierung der

Primer an den poly(A)-Schwanz der mRNA wurde der Ansatz für 5 min bei 65°C inkubiert,

anschließend auf Eis plaziert und kurz zentrifugiert. Im nächsten Schritt wurden 2 µl 10 mM

dNTP Mix (Fermentas), 4 µl 5x First Strand Puffer und 2µl 0.1 M DTT (beide Invitrogen)

hinzugefügt. Optional wurden noch 1µl RNAsin (Promega) zu dem Ansatz gegeben. Nach

Inkubation für 2 min bei 25°C wurde 1 µl (200 Einheiten) Superscript II Reverse

Transkriptase hinzugefügt. Nach weiteren Inkubationsschritten für 10 min bei 25°C, 50 min

bei 42°C und 15 min bei 70°C wurde die gewonnene cDNA bei -20°C gelagert. Als

Negativkontrolle zum Ausschluβ einer Kontamination mit genomischer DNA wurde für jeden

Ansatz eine negative RT-Reaktion durchgeführt. Dabei wurden alle Schritte wie oben


beschrieben durchgeführt, aber anstelle des Enzyms Superscript II wurde 1µl H20 zu dem

Reaktionsansatz hinzugefügt.

3.2.6.- Protein-Isolierung

3.2.6.1.- Isolierung von Membranproteinen

Das LAT2-Protein liegt in der GEM (Glycosphingolipid Enriched Membrane), eine Region

der Zellmembran, die sehr wichtig für die Initiierung der Aktivierung von Immunorezeptor-

Transduktionsignalwege ist (Brdicka et al., 2000). Die GEMs sind kleinen Inseln in der

Zellmembran (<70 nm), reich an Glykosphingolipiden, Sphingomyelin und Cholesterin

(Brown, 1998). Die Hauptcharakteristika sind ihre Insolubilität in Detergenzen wie z.B Triton

X-100 und NP-40 bei 0-4 °C. Sie sind jedoch löslich in N-alkyl-glykosidic Detergenzen wie

z. B. N-Lauryl-Maltoside (Brown and Rose, 1992).

Um Membranproteine zu isolieren, wurden die Zellen zuerst nach der Zellkultur in PBS

gewaschen, dann wurden die Zellen im frischen Membranprotein-Lysis-Puffer resuspendiert,

gevortext und 15 min. bei 4°C in einem orbitalen Schüttler inkubiert. Das Lysat wurde 15

min. bei 13000 rpm und 4°C zentrifugiert und der Überstand wurde in ein neues Gefäß

gegeben. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Biorad Bradford-Assay (s.u.) bestimmt,

danach wurden die Proteine aliquotiert und bei -80°C aufbewahrt.

3.2.6.2.- Isolierung von nukleären und zytoplasmatischen Proteinen

Die Isolierung von kompletten Zelllysaten erfolgte mit dem Nuclear Extract Kit (Active

Motif, Rixensart, Belgien) und nach den Herstellersempfehlungen durchgeführt. Dabei

wurden 3x106 Zellen in 100 µl des vollständigen Lyse-Puffers (bestehend aus 89 µl Lyse

Puffer AM1, 10 µl 10mM DDT und und 1 µl Proteaseinhibitorcocktail) resuspendiert und für

10s gevortext. Nach einer 10 minütigen Inkubationsphase auf Eis wurden die Lysate für

weitere 30s gevortext und anschließend für 20 min bei 13 000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der

Überstand mit dem Zelllextrakt und den darin enthaltenden Proteinen wurde abgenommen

und das Pellet verworfen. Die Proteinlysate wurden alliquotiert und bei -80°C gelagert.


3.2.6.3.- Proteinquantifizierung mittels Bradford Assay

Die Konzentrationsbestimmung erfolgte in 96-well Microtiterplatten mit Flachboden und

dafür wurde der Bradford Protein Assay (BioRad) entsprechend den Herstellerempfehlungen

eingesetzt. Es handelt sich hierbei um einen einfachen kolorimetrischen Assay zur Messung

der totalen Protein-Konzentration, (Bradford, 1976):

1 µl des Proteinlysats wurden mit 200 µl PBS und 50 µl Phosphorsäure und Methanol haltiges

Bradford-Reagenz gemischt und die Absorption der Wellenlänge wurde bei 595 nm im

Spektometer gemessen. Alle Proteinlysate wurden als Triplikate gemessen. Die Ermittlung

der Proteinkonzentrationen erfolgte mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard.

3.2.7.- Sonden-Herstellung für Southern Blot

3.2.7.1.- Entwicklung der Primer

Die Sequenzen, die wir vom RLGS Versuch bekommen haben, wurden zuerst mit dem

Program Repeat Masker der Universität von Washington

(http://repeatmasker.genome.washington.edu/) analysiert, um repetitive Elemente der DNA in

unserer Sonde zu vermeiden. Danach wurden die Primer mit dem Program Primer3

(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) in den Bereichen, in denen es

keine repetitiven Elemente gab, nach optimalen PCR Bedingungen (Oligonucleotides 20 bp

lang, Annealing Temperature 60 °C, GC< 60 %, usw) entwickelt. Die Primer wurden mit

Hilfe von NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) auf ausreichend Spezifität für

die uns interessierenden Sequenzen untersucht. Die Oligonukleotide für "forward" und

"reverse" Primer wurden von Herrn Dr. Igloi (Fakultät der Biologie, Universität Freiburg)

oder von Operon (Qiagen) hergestellt.

3.2.7.2.- Amplifizierung der Sonde durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)

Mit den Primern haben wir zuerst eine Gradienten-PCR mit folgenden Bedingungen

durchgeführt: 100 ng gDNA, 5-10 pmol FW and RW Primer, 10 µl Eppendorf PCR Master

Mix und Wasser auf 25 µl angesetzt. Dann haben wir mit optimaler Annealing-Temperatur

eine Standard-PCR mit einem gröβeren Volumen (50µl) durchgeführt. Die PCR-Produkte

wurden in einem Agarose-Gel aufgetrennt, die jeweils gewünschte richtige Banden wurde


ausgeschnitten und schließlich wurde mit Gel-Extraktion (Gel Extraktion Kit, Qiagen) das

PCR Produkt isoliert.

3.2.7.3.- Auftrennung von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese

Je nach Länge der aufzutrennenden DNA-Fragmente wurde Agarose in Konzentrationen von

0.7% bis 2.0% in 1x TAE-Puffer oder 1xTBE Puffer durch Aufkochen vollständig aufgelöst.

Nach Abkühlen auf ca. 50°C wurde das Gel in einen mit entsprechendem Aussparungskamm

vorbereiteten Gelträger gegossen. Wenn das Gel im +4ºC Raum erstarrten war wurde, wurden

die PCR Produkte mit 6x DNA-Ladepuffer gemischt und vorsichtig in die Taschen des

erstarrten Gels pipettiert. In einer mit 1x TAE oder 1x TBE als Laufpuffer gefüllten

Horizontalkammer wurden die Proben bei Spannungen zwischen 50 und 130 V im

elektrischen Feld aufgetrennt. Zusätzlich zu den Proben wurden jeweils 5 µl Längenstandards

(100 bp, 1 kb) als Maßstab für die Länge der aufgetrennten Fragmente geladen. Nach der

Elektrophorese wurde das Gel 10-15 min. in 0,025 % Ethidium Bromide gefärbt.

Anschließend wurde das Gel unter Ultraviolett-Transillumination (254 nm) fotografiert.

3.2.7.4.- Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Die entsprechende Bande mit der richtigen Größe wurde aus dem Gel unter UV-Licht mit

einem Skalpell geschnitten und in einem sterilen 1.5 ml Reaktionsgefäß bei -20 ºC gelagert.

Das PCR Produkt wurde mittels des Qiagen „QIAquick Gel Extraction Kit“ entsprechend den

Vorgaben des Herstellers extrahiert, aufgereinigt, und in einem geeigneten Volumen H2O

eluiert.

3.2.7.5.- Klonierung des PCR Produkts

Das PCR Produkt wurde mit dem TOPO-TA-Cloning-Kit (Invitrogen) subkloniert. Zuerst

wurden 4 µl vom PCR Produkt mit 1 µl Salt Lösung (1,2 M NaCl, 0,06 M MgCl2, Invitrogen)

und 1 µl Vektor (pCR®2.1-TOPO®, Invitrogen) in einem Reaktionsgefäβ gemischt. Nach 5

min. Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung auf Eis abgekühlt.


3.2.7.6.- Transformation von kompetenten Bakterien.

Kompetente Bakterien (E. coli OneShot Mach1tm T1RChemically Competent, Invitrogen)

wurden auf Eis aufgetaut. Die Ligationslösung wurde zu den Bakterien gegeben. Nach einer

Inkubationszeit von 30 min. auf Eis wurden die Bakterien 30 sec. auf 42 ºC in der Hitzeblock

erwärmt und anschließend kurz auf Eis gestellt. Dann wurden sie in 250 µl S.O.C Medium

(Invitrogen) resuspendiert und in einen 15 ml Röhrchen für Bakterienkultur überführt. Die

Bakterien wurden 1 Stunde bei 37 ºC in einem Schüttler inkubiert und in der Folge wurden

zwischen 50 und 200 µl von den Bakterien zur Selektion auf LB Platten, versetzt mit 150

µg/ml Ampicilin (Sigma) und 40 µl X-Gal (20 mg/ml, Sigma), ausgestrichen. Anschlieβend

wurden die Bakterien bei 37 ºC über Nacht inkubiert.

Am nächsten Tag wurden die LB-Platten 4 Stunden bei +4ºC gelagert, um die weiβe

Kolonien, die das PCR Produkt im Plasmid enthalten, besser zu unterscheiden. Die blauen

Kolonien waren die Bakterien, den Vektor, aber kein PCR Produkt erhielten. Die weissen

Kolonien wurden mit einem Zahnstocher gepickt, in 4 ml LB Medium versetzt mit 150 µg/ml

Ampicilin in einen Röhrchen geimpft und über Nacht bei 37ºC in einem Schüttler wachsen

gelassen.

Am nächsten Tag wurden die Bakterien in ein steriles Reaktionsgefäβ überführt und 5 min.

bei 10000 rpm zentrifugiert. Das Bakterien-Pellet konnte für Bakterien-Stocks oder für

Plasmid-Extraktion benutzt werden.

3.2.7.7.- Herstellung von Bakterien-Stocks

Zur Aufbewahrung nach Transformation mit rekombinanten Plasmiden wurden Aliquots der

Kultur einzelner Bakterien-Klone in 1.5 ml Reaktionsgefäße überführt, mit Glycerin in einer

Endkonzentration von 20% versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend

bei -80°C gelagert.

3.2.7.8.- Mini-Präparation von Plasmid-DNA

Nach der Isolierung der Bakterien konnten wir mit dem Mini Prep Kit (Qiagen) die Plasmide

extrahieren. Das Bakterien-Pellet wurde in 250 µl Puffer P1 (50 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 mM

EDTA, 100 µg/ml RNase A) resuspendiert und der Ansatz in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß


übertragen. Die Isolierung der Plasmide erfolgte anschließend nach Angaben des Herstellers

und Verwendung der mitgelieferten Puffer über die Bindung an eine Säule. Die so

gewonnenen Plasmide wurden anschließend in H2O aufgenommen.

3.2.7.9.- Maxi-Präparation von Plasmid-DNA

Die Isolierung größerer Mengen Plasmid-DNA bis zu 100 mg erfolgte mit dem „QIAGEN

Plasmid Maxi Kit“ von Qiagen. 100 bis 500 ml LB-Medium wurden mit 2 bis 5 ml einer

Starter-Kultur beimpft und über Nacht für ca. 12 bis 16 h bei 37°C und 300 rpm im Schüttler

inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 3000 rpm und 4°C pelletiert und das Pellet in 10 ml

Puffer P1 resuspendiert. Die anschließende Plasmid-Präparation erfolgte nach Angaben des

Herstellers unter Verwendung der „QIAGEN-tips 500“ und der entsprechenden Puffer. Die so

gewonnenen Plasmide wurden anschließend in H2O aufgenommen und die Konzentration

photometrisch ermittelt.

3.2.7.10.- Extraktion der Sonde aus dem Plasmid.

Zwischen 5-10 µg Plasmide wurden 2-3 Stunden mit 2 µl (40 Einheiten) vom

Restriktionenzym EcoR I (New England Biolabs) und NEB Puffer EcoR I (New England

Biolabs) verdaut, immer wenn das Insert keine EcoR I-Schnittstelle hatte. Die Produkte des

Restriktionsverdaus wurde in einem 1,5 %igen Agarose Gel getrennt, und schließlich wurde

die gewünschte Bande ausgeschnitten und mit dem Gel Extraktion Kit (Qiagen) isoliert.

3.2.8.- Sonden-Herstellung für Northern Blot

Die Entwicklung der Primer wurde wie so oben (3.2.7.1) für Sonden Herstellung für Southern

Blot durchgeführt. Als Template für die PCR wurde cDNA einer Zelllinie benutzt, die das uns

interessierende Gen exprimiert. Die RNA wurde von der Zelllinie mit dem RNeasy Kit von

Qiagen isoliert (sieh oben 3.2.2.4) und davon cDNA synthetisiert (sieh oben 3.2.5). Die

weitere Herstellung der Sonde wurde mit der oben beschriebenen Prozedur für die Southern

Blot Sonde durchgeführt.


3.2.9.- Restriktionsverdau der genomischen DNA

10 µg genomische DNA von jeder Zelllinie und von den mononukleären Zellen aus dem Blut

wurden über Nacht verdaut: es wurden 60 Einheiten EcoR V (nicht methylsensitive Enzyme)

für den einfach Verdau und zusätzlich 30 Einheiten Not I (methylsensitive Enzyme) für den

Doppelverdau, BSA in einer Endkonzentration von 100 µg/ml und der NEB 3

Reaktionsbuffer in einfacher Konzentration benutzt. Die Ansätze wurden je nach der

verwendeten Restriktionsendonuklease nach den Angaben der Hersteller inkubiert.

3.2.10.- Southern Blot

3.2.10.1.- Vorbereitung und Auftrennung der genomischen DNA

Die genomische DNA wurde zuerst durch Gelelektrophorese aufgetrennt und danach wurde

die DNA auf eine Membran nach der Southern Blot Methode (Southern, 1975) übergetragen.

Die durch Restriktionenzyme verdaute gDNA wurde mit abgeschnittenen Spitzepipetten auf

ein 0.7 %iges Agarose Gel in 1xTAE Puffer aufgetragen. Die Gelelektrophorese wurde über

Nacht bei 20-30 V durchgeführt. Zur Ladekontrolle wurde das Gel mit Ethidiumbromid

(Sigma) gefärbt und fotographisch dokumentiert.

3.2.10.2.- Transfer der DNA nach der Southern Blot Methode

Die DNA im Gel wurde dann durch Behandlung mit 0.25 M HCl für mindestens 20 min oder

bis zum Umschlag der Bromophenol-Farbe im DNA-Ladepuffer depuriniert, anschließend in

Denaturierungs-Lösung (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) für eine Stunde (zweimal 30 min.)

denaturiert.

Der Transfer erfolgte über Nacht auf eine positiv geladene Nylon-Membran (Hybond N+,

Amersham), als Transferpuffer wurde Denaturierungs-Lösung verwendet. Vor dem Aufbau

der Blot-Apparatur wurde die Membran zunächst kurz in H2O und anschließend in

Denaturierungs-Lösung äquilibriert. Der Aufbau der Blots erfolgte prinzipiell nach dem

Prinzip des Kapillar-Transfer-Systems, wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben. Als

Modifikation wurde jedoch statt des vorgegeben Docht-Prinzips ein Schaumstoff-Schwamm

als Basis verwendet (Fourney et al., 1988), durch den ein gleichmäßiger Transferpuffer-Strom

über die gesamte Gelfläche gewährleistet wurde.


Nach dem Transfer wurde die Membran zur Entfernung von Gelresten vorsichtig kurz in 2x

SSC gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Eine Immobilisierung der DNA auf

der Nylon-Membran erfolgte durch zweimalige Bestrahlung mit einem UV-Crosslinker (UV

Stratalinker 2400, Stratagene; Einstellung: Auto crosslink entspricht 30 sec). Vor der

Hybridisierung wurde die Membran erneut mit 2x SSC benetzt.

3.2.11.- Northern Blot

3.2.11.1.- Vorbereitung und Auftrennung der RNA

Vorbereitend wurden Gelkammern, Träger und Kämme, die zur elektrophoretischen

Auftrennung von RNA dienen sollten, zur Denaturierung von RNasen mindestens 12 Stunden

in 2 M NaOH eingelegt. Agarose wurde in RNAse freien H2O durch Kochen aufgelöst, nach

dem Abkühlen auf ca. 60°C mit 10x MOPS-Puffer und 37%igem Formaldehyd versetzt

(Endkonzentration: 1% Agarose, 1x MOPS-Puffer, 0.66 M Formaldehyd) und in den

entsprechenden Gelträger gegossen.

15 µg RNA wurden in 10 µl H2O gelöst, mit 30 µl RNA Laddebuffer (75 % Formamide, 1x

MOPS Buffer, 10 % Formaldehyde, 10 % Glycerol und Bromophenol Blau) gemischt und 15

min. bei 65 °C denaturiert. Danach wurde die RNA 5 min. auf Eis gestellt und durch

Elektrophorese in einem 1 %igen Agarose-Gel unter denaturierenden Bedingungen (1x

MOPS und 0,66 M Formaldehyde) für 3-4 Stunden bei 70 V aufgetrennt. Als

Elektrophoresepuffer wurde 1x MOPS benutzt. Qualität und Quantität der RNA wurden durch

Ethidiumbromid-Färbung der ribosomalen RNA (rRNA) der 28S- und 18S-Banden

abgeschätzt.

3.2.11.2.- Transfer der RNA nach der Northern Blot Methode

Vor dem Transfer der RNA vom Gel auf eine Nylon-Membran (Hybond N+, Amersham)

wurde das Gel für 30 min in 0.05 M NaOH/1x SSC inkubiert und anschließend zweimal für

20 min in 10x SSC gewaschen. Der prinzipielle Aufbau der Blot-Vorrichtung erfolgte wie in

Sambrook et al. (1989). Vergleichbar der Southern-Blot-Technik wurde das Verfahren wie

oben beschrieben durch Verwendung eines Schaumstoff-Schwammes als Basis modifiziert

(Fourney et al., 1988). Der Transfer erfolgte über Nacht in 10x SSC als Transferpuffer. Nach


dem Transfer wurde die Membran zur Entfernung von Gelresten kurz in 2x SSC geschwenkt

und anschließend an der Luft getrocknet.

Die Effizienz und Qualität des Transfers wurde durch Kontrolle des Gels und der Membran

unter UV-Licht überprüft. Durch zweimaliges Bestrahlung mit einem UV-Crosslinker (UV

Stratalinker 2400, Stratagene; Einstellung: Auto crosslink entspricht 30 sec) wurde die RNA

auf der Nylon-Membran immobilisiert. Vor der Hybridisierung wurde die Membran erneut

mit 2x SSC benetzt.

3.2.12.- Hybridisierung der Membranen von Southern und Northern Blot

3.2.12.1.- Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die Sonde wurde mit dem Kit „Megaprime DNA Labelling System“ (Amersham)

entsprechend den Herstellerempfehlungen markiert. Hierzu wurden 5-25 ng Sonde in 5 µl

angesetzt, mit 5 µl Random Primer gemischt und 5 min. bei 100 °C denaturiert. Dann wurden

21 µl Wasser, 10 µl Labelling Buffer, 2 µl Klenow Enzyme und 5 µl α-32P-dCTP (radioaktiv,

3000 Ci/mmol von Amersham) im Arbeitsraum für radioaktive Tätigkeit zugegeben und für 30

min bei 37°C inkubiert. Die inkorporierte Radioaktivität wird anschließend durch einen

Sephadex-Filter (Amersham) mit Hilfe einer Zentrifuge (5 min., 2500 rpm) von restlichen

Radioisotopen getrennt. Schließlich wurde die Sonde bei 100°C denaturiert, auf Eis abgekühlt

und die Aktivität der markierten Sonde mit einem β-Counter (Ercicount 2000, Scotlab)

gemessen.

3.2.12.2.- Hybridisierung mit radioaktiv markierten DNA-Sonden

Zuerst wurden die Northern- und Southern-Blot-Membranen für 15 min. in 2x SSC Buffer

gewaschen. Die Membranen wurden mit der Nukleinsäure tragenden Seite nach innen gerollt

in eine Hybridisierungsröhre (Glaszylinder mit abdichtendem Schraubdeckel) eingebracht.

Dann wurden sie 3-4 Stunden bei 65°C, mit 10 mL vorgewärmten Church Buffer (0.33 M

Na2HPO4, 0.16 M NaH2PO4, 7 % SDS, 1 mM EDTA pH 8.0) und 100 µl Salmon Sperm

DNA (10 mg/mL) in einem Hybridisierungsofen vorinkubiert. Danach wurde die radioaktiv

markierte Sonde (wie oben beschrieben) zu den Membranen pipettiert und anschlieβend

wurde die Hybridisierung über Nacht bei 60-65 ºC durchgeführt.


Am nächsten Tag wurde die Membran zweimal 10 min. bei 42°C in LSW Buffer (1xSSC, 0.1

SDS) und zweimal 20 min. bei 65°C in HSW Buffer (0.2 SSC, 0.1 SDS) gewaschen. Dann

wurde die Radioaktivität auf der Membran mit einem β- Counter (LB122 Berthold, UMO)

gemessen. Wenn die Radioaktivität einer Membran unter 40 CPM war, wurde die Membran

mit einer Plastikfolie in eine Filmkassette eingepackt und ein Film auf die Membran im

Dunkelraum gelegt. Die Kassette wurde dazu 3-4 Tage, in Abhängigkeit von der

Radioaktivität, bei -80°C aufbewahrt. Dann wurde der Film entwickelt und, je nach Stärke des

Signals ein weiterer Film auf die Membrane für eine längere oder kürzere Dauer der

Exposition gelegt.

3.2.13.- Western Blot

Der Western Blot dient der Detektion bestimmter Proteine. Die Proteine werden zunächst

elektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran

transferiert. Anschließend erfolgt die Inkubation mit einem antigenspezifischen

Primärantikörper, der das gesuchte Protein bindet. Durch Zugabe eines Enzyms gekoppelten

sekundären Antikörpers, der an den Fc-Teil des spezifischen Antikörpers bindet erfolgt die

Substrat Reaktion.

Die Versuchsdurchführung erfolgte mit dem NuPAGE® Elektrophoresis System (Invitrogen)

und der XCell SureLockTM Mini-Cell (Invitrogen) entsprechend des Standardprotokolls

3.2.13.1.- Vorbereitung der Proben

30 µg Protein wurde mit 4 µl NuPAGE® LDS Puffer 4x (Invitrogen) pro Probe gemischt und

auf 15 µl mit Wasser verdünnt. Dann wurden sie 10 min. bei 70 °C denaturiert und 5 min. auf

Eis gestellt. Wenn der Western Blot unter reduzierenden Bediengungen durchgeführt wurde,

wie z. B. bei der Detektion mit dem anti-ETO-Antikörper, wurde 1.5 µl NuPAGE® Reducing

Agent (Invitrogen) hinzugefügt

3.2.13.2.- Elektrophoretische Auftrennung im Gel

Zur Elektrophorese wurde das NuPAGE® Elektrophorese System (Invitrogen) entsprechend

den Herstellerempfehlungen verwendet. Hierzu wurden ein NuPAGE® 4-12 % Bis Tris Gel

und der 1x NUPAGE® MES SDS Buffer (Invitrogen) benutzt. Das Gel wurde aus der


Plastikfolie geschnitten und mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach vorsichtiger

Herausnahme des Kamms wurden die Taschen mit Running Puffer gespült. Anschließend

wurden die XCell SureLockTM Mini-Cell Kammer zusammengebaut und die Gele eingesetzt.

Es wurden 500 µl NuPAGE® Antioxidant (Invitrogen) als Laufpuffer eingesetzt, wenn

reduzierenden Bedingungen für die Proteindetektion notwendig waren. Als Laufkontrolle

wurde 5 µl des gefärbten Proteinmarkers SeePlus Blue 2 (Invitrogen) eingesetzt und als

Entwicklungskontrolle wurde gelegentlich ein fluoreszierender Proteinmarker (Invitrogen)

benutzt. Die Gelelektrophorese wurde 1.5 Stunden bei 150 V und bei Raumtemperatur

durchgeführt.

3.2.13.3.- Blotting

Für das Blotten wurde zunächst der 1x NuPAGE® Transfer Buffer (Invitrogen) mit 10 %

Methanol (J.T. Baker, Deventer-Holland) vorbereitet. Bei dem gleichzeitigen Blotting von 2

Gelen wurden 200 ml Methanol (20% Gesamtvolumen) hinzugefügt, um einen effizienten

Transfer beider Gele zu gewährleisten. Mit Hilfe des zugehörigen Gel-Messers wurden die

Gele aus der Plastikhülle herausgelöst und dem Blotten zugeführt.

Auch der Transfer erfolgte in dem X-Cell IITM Blot Modul (Invitrogen) entsprechend den

Herstellerempfehlungen. Zum Tranfer wurde zunächst eine Hybond-P Membran (Amersham)

für 30 sec. in Methanol aktiviert, 5 min. in destilliertem Wasser gespült und 5 min. im

Transfer Buffer äquilibriert. Die zugehörigen Blotting Pads wurden solange in Transfer Puffer

gelegt, bis sie vollständig mit Puffer gefüllt und keine Luftblasen mehr vorhanden waren. Das

auf Gelgröße geschnittene Filterpapier wurde ebenfalls im Transfer Puffer aufgefeuchtet.

Anschließend wurden die Blotting Pads, Filterpapiere, Gel(e) und Membranen(en) nach

Herstelleremphelung in der Transferkammer zusammengebaut.

Die Proteine wurden für 1.5 Stunden bei 30 V und auf Eis mit Hilfe der Transfer Buffer (1x

NUPAGE® Transfer Buffer, 10 % Methanol) auf die Membran geblottet.

Nach dem Blotten wurde mit einer Ponceau-Rot-Färbung kontrolliert, ob die Proteine

gleichmäßig auf die Membrane transferiert waren. Dann wurde die Membrane zuerst kurz in

Wasser und danach in TBS-T (40mM Tris, 270 mM NaCl, 1 ml Tween 20, pH 7.6)

gewaschen.


3.2.13.4.- Protein-Detektion mittels Antikörper.

Die Membran wurde eine Stunde im Blocking-Puffer (TBS-T mit 5 % fett-freiem

Magermilchpulver) inkubiert. Danach wurde die Membran kurz mit TBS-T gewaschen und

mit dem ersten Antikörper in einer vorher bestimmten Konzentration (s. 3.1.4.6.) inkubiert.

Das Immunoblotting erfolgte über Nacht bei 4°C auf einem horizontalen Schüttler.

Am nächsten Tag wurde die Membran 4 x 5 min. bei Raumtemperatur in TBS-T in einem

horizontalen Schüttler gewaschen. Danach wurde der Zweit-Antikörper in vorher bestimmter

Konzentration zugegeben (s. 3.1.4.6.). Die Membran wurde mit dem Zweit-Antikörper für

eine Stunde bei Raumtemperatur im Schüttler inkubiert, danach wurde die Membran wieder 4

x 5 min. mit TBS-T gewaschen.

Als Detektionsmethode wurde das ECL Plus Western blotting Detektions System (Amersham

Biosciences) verwendet. Lösungen A und B wurden in einem Verhältnis vom 40:1 gemischt,

auf die Membran pipettiert und es wurde 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde

die Membran auf Zellstoff kurz getrocknet und mit der Proteinseite nach unten in eine

Plastikfolie gepackt. Schließlich wurde sie in einer Filmkassette mit Autoklavierband fixiert

und HyperFilm (Amersham) für verschiedene Zeiten (1, 5, 30 min.) exponiert und dann in

einem Entwicklungsgerät (Optimax X-Ray Film Procesor, Typon) entwickelt.

3.2.14.- Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist eine Methode, bei der verschiedene Parameter einzelner Zellen

gleichzeitig bestimmt werden. Die Zellen werden durch einen Fluss geführt, in dem die Form,

Granularität, Grösse, usw, mit Hilfe eines Lasers gemessen werden können.

Wenn die Zellen vor der Durchflusszytometrie mit einem Fluoreszenz-markierten Antikörper

inkubiert werden, kann man auch den Anteil der Antikörper tragenden Zellen messen. Damit

werden oberflächen Zellmarker gemessen und ganzen Zellpopulationen charakterisiert. In

unserem myeloischen Differenzierung-Assays gewinnen wir so Information über den Anteil

der Zellen, die differenziert sind.

3.2.14.1.- Vorbereitung der Zellen für die Messung von Oberflächen-Antigenen

Die Zellen wurden nach der Zellkultur mit PBS gewaschen, gezählt und in Portionen von

1x105 Zellen auf FACS Röhrchen aufgeteilt. Dann wurden die Zellen 5 min. bei 1200 rpm


zentrifugiert und der Überstand verworfen. 5 µl Antikörper, gebunden an Fluorezenz-

Farbstoffe (PE und FITC), wurde zu den Zellen gegeben. Die Inkubation mit dem Antikörper

erfolgte 20 min. bei +4ºC im Dunkel. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mit PBS

gewaschen, zentrifugiert und in 1 mL PBS resuspendiert kurz vor der Messung. In einem

FACS Gerät (Cyan ADP, Dakocytomation) wurden die Zellen auf Fluorezenz-Intensität

analysiert. Die Werte wurden mit der Software Summit v 4.2 ausgewertet und ggf mit dem

FlowJo Software in Graphiken dargestellt.

3.2.14.2.- Messung der Oberflächen-Antigene

Zuerst wurde das Gerät nach der FS (Vorwärtsbeugung) und SS (Seitwärtsstreuung)

Eigenschaften der Zellen kalibriert. Zellpopulationen, die eine regelmäßige FS und SS

aufwiesen, wurden mit Hilfe eines elektronischen Fensters für weitere Messungen

selektioniert. In einem weiteren elektronischen Fenster wurde die Zahl der Zellen gemessen,

die eine bestimmte Fluorezenzintensität trugen und wurden in einem Histogramm

representiert. Um die reproduzierbare Messung zu erzielen, wurden die Verstärkung der

Lichtwelle so ausgewählt, dass ungefärbten Zellen innerhalb der log 100 und log 101-Stufe

lagen. Es wurden pro Ansatz 10000 Zellen gemessen. Die Fluorezenzintensität, ab der die

Zellen als positiv gewertet wurden, wurde so gewählt, dass ein Prozent der mit einem Isotyp-

Kontrolle-Antikörper inkubierten Zellen positiv waren. Anschlieβend wurden von dieser

selektionierten Zellpopulation wenigstens 10000 Zellen für die uns interessierenden Antigene

gemessen.

3.2.15.- "Real-time"-RT-PCR

3.2.15.1.- Mechanismen

Das Prinzip der quantitativen PCR beruht auf der herkömmlichen Polymerasekettenreaktion

und bietet zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung durch Fluoreszenzmessungen

mittels eines Lasers während der PCR-Zyklen. Bei verschiedenen Fluorezenzssystemen ist

das Prinzip gleich: die Fluorezenzintensität wird am Ende jedes Zyklus gemessen und diese

Daten werden während des PCR-Laufes mit der Zyklenzahl für weitere Auswertungen in

einer Graphik repräsentiert. Da die Fluorezenzintensität während der Exponentialphase der

PCR direkt mit der Menge des PCR Produktes korreliert, ist eine Quantifizierung des

synthetisierten Produkts und der Startkonzentration möglich.


Es wurde der SYBR I GREEN Farbstoff in dieser Arbeit benutzt, weil die Etablierung nur

eine klassische PCR erfordert und das Verfahren sich als ausreichend sensitiv und spezifisch

für unseren Zweck erwies. Wenn dieser Farbstoff zwischen 2 DNA Ketten interkaliert, wird

er fluoreszierend (bei 530 nm). Um spezifische von unspezifischen Produkten und von

Primer-Dimeren zu unterscheiden, wurde jeweils am Ende des PCR Laufes eine

Schmelzkurve bestimmt. Proben, bei denen die Schmelzkurve mehrere Produkte zeigte,

wurden von der Auswertung ausgeschloßen.

Die Primersequenzenzen wurden mit Hilfe der Universal Probe Library Software der Roche

Webseite (https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/index.jsp) und der Software

Primer3 entwickelt (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/ primer3/ primer3_www.cgi). Für jedes

Primerpaar wurde die PCR Reaktion solange optimiert, bis sie eine Effizienz von mehr als 1,9

ohne unspezifische Produkte erreicht hatten.

3.2.15.2.- Durchführung

Die quantitative Polymerasekettenreaktion aus cDNA-Templates wurde im Light Cycler 480

(Roche diagnostics) durchgeführt. Der Light Cycler 480 arbeitet mit 384-Well-PCR-

Mikrotiterplatten. Zur relativen Quantifizierung wurde das SYBR I GREEN® (Roche)

Fluorezenzstoff verwendet, der sich im Light Cycler 480 SYBR I GREEN Master Mix

befindet. Die Reaktionen wurden in 10 µl Ansätzen in einer 384-Well Mikrotiterplatte

(Roche) durchgeführt. Die gewonnene cDNA aus der RT-Reaktion (s.o. 3.2.5.2.) wurde in

einer Endkonzentration von 5-50 ng verwendet.

Für die relative Quantifizierung wurden Verdünnungsreihen von cDNA aus U937 (1:10,

1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000) hergestellt. Alle Proben und Standards wurden als

Duplikate gemessen und der Mittelwert für weitere Rechnungen benutzt. Als

Negativkontrollen wurden sowohl Ansätze ohne Template zum Ausschluβ eine

Kontamination des Reaktionsansatzes, als auch minus RT-Reaktionen (ohne Reverse

Transkriptase) zum Ausschluß einer Amplifikation von genomischer DNA verwendet. Nach

Zugabe aller Reaktionskomponenten wurden die Platten mit selbstklebenden optischen Folien

(Roche) verschlossen.


Tabelle 2.- Reagenzien für eine "real-time"-RT- PCR

PCR-Reaktionskomponenten Endkonzentration

SyBrGreen QPCR Master Mix Roche 1x

Primer FW (100 pmol/µl)

Primer RW (100 pmol/µl)

0,5 µM

0,5 µM

Template: cDNA 5-50 ng (aus RNA Menge)

H2O auf 10µl

Die Reaktionen wurden im Light Cycler 480 von Roche Diagnostics mit 45 Zyklen unter den

in der Tabelle aufgeführten Bedingungen durchgeführt.

Tabelle 3.- Temperatur- und Zeit-Bedingungen für eine "real-time" PCR

Schritt Temperatur Zeit Ramp Rate Zyklen Art der

Akquisition

1. Enzymaktivierung 95°C 10 min 4.8 °C/sec 1

2. Denaturierung 95°C 15 sec 4.8 °C/sec

3. Annealing 60°C 15 sec 2.5 °C/sec

4. Extension 72 °C 20 sec 4.8 °C/sec

45

einfach

5. Meltingkurve

5.1.

5.2.

95 °C

60 °C

10 sec

10 sec

4.8 °C/sec

2.5 °C/sec

durchgehend

6. Cooling 37 °C 1 min 2.5 °C/sec

3.2.15.3.- Relative Quantifizierung

In einer PCR Reaktion wird, die Zyklusnummer, bei der die Fluorezenzintensität über den

Hintergrundfluorezenz in den einzelnen Reaktionen detektiert werden kann, als "Cross point"

(Cp) bezeichnet. Diese Cp Werte ist für jede einzelne Probe charakteristisch und wird als das


"Maximun der Zweiten Ableitung" der Intensitätskurve berechnet. Die Cp Werte dienen als

Grundlage für die weitere Quantifizierung.

Zur Berechnung der unterschiedlichen Expressionslevel wurde die Menge des untersuchten

Gens nach Behandlung der Zellen mit der Menge des Zielgens in der unbehandelten Kontrolle

verglichen. Als interne Kontrolle wurde die Menge von einem Haushaltsgen in allen Proben

mitbestimmt. Die Bedingungen, die an solche Haushaltsgene gestellt werden, sind eine

konstante Expression, die nicht durch die Behandlung der Zellen beeinträchtigt wird und ein

Expressionslevel ähnlich dem des uns interessierenden Gens.

Zur relativen Quantifizierung und zur Qualitätskontrolle unserer PCR wurde die

Standardkurvenmethode gewählt. Zur Generierung der Standardkurve wurde eine

Verdünnungsreihe (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000) von cDNA der U937 Zellen

gewählt. Da eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung zwischen dem Logarithmus der

eingesetzten cDNA-Menge und dem Cp-Wert besteht, kann aus den festgelegten

Ausgangsmengen der Standardproben eine Standardkurve generiert werden. Der Logarithmus

der Ausgangsmenge der Proben wird gegen den Cp aufgetragen.

Mit Hilfe einer Exponentialfunktion kann die Ausgangsmenge in den Proben berechnet

werden. Eine solche Standardkurve und die daraus errechneten Ausgangsmengen der

unbekannten Proben werden sowohl für das Zielgen, als auch für das Haushaltsgen generiert.

Da jeder PCR Ansatz als Duplikat durchgeführt wurde, wurde anschließend der Mittelwerte

der Kopienanzahl jeder Probe bestimmt. Die relative Expression wurde so berechnet, dass die

Expression des uns interessierenden Gens durch die Expression des Haushaltgens geteilt

wurde.

Im nächsten Schritt der Normalisierung werden die errechneten Kopienzahlen des Zielgens

durch die Kopienzahl des Haushaltsgens geteilt. Um die Änderung der Expression in

Zahlenwerte fassen zu können, wurde die Expression des normalisierten Zielgens in Bezug zu

einem Referenzwert gesetzt. Als Referenzwert diente die Expression in unbehandelten oder

uninduzierten Zellen.

3.2.16.- Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)

Das Protokoll wurde bereits beschrieben (Metzger et al., 2005). Die Zellen wurden für 10

min. mit 1 % Formaldehyd bei 37 °C vernetzt ("cross-linked") und zweimal mit PBS

gewaschen. Zellpellets wurden für 10 min. mit SDS Lyse-Buffer (1 % SDS, 10 mM EDTA,

50 mM Tris-HCl) auf Eis lysiert und schlieβlich wurde die DNA in Fragmenten von zwischen


200 bp-1 kb Gröβe mit Ultraschall beschallt (4 Pulse für 30 sec., Amplitude 20 %, 1 sec

on/0.3 sec. Off). Nach dem Pre-clearing für 2 Stunden mit Protein A-Sepharose wurde 5 %

des Volumens entnommen und als Input bezeichnet. Das Lysat wurde dann in ChIP-Dilution

Puffer (1 % Triton X-100, 2 nM EDTA, 20 nM Tris/HCl pH 8.1, 150 nM NaCl) verdünnt und

über Nacht mit 5 µg des primären Antikörpers inkubiert. Am folgenden Tag wurden die

Antikörper-Protein-DNA Komplexe mit Protein A-Sepharose präzipitiert und das Pellet

wurde mit ChIP-Dilution-Puffer, TSE I-Puffer (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA,

20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl), TSE II-Puffer (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM

EDTA, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl), LiCl-Puffer (0.25 M LiCl, 1 % NP40, 1 % Na-

Deoxycholat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl) und zweimal mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl,

1 mM EDTA) gewaschen. Die Desorption erfolgte zweimal nach der Inkubation bei

Raumtemperatur mit einem frisch zubereiteten 1 % SDS, 0.1 M NaHCO3 Puffer und die

Formaldehyd-Vernetzung wurde für 4-6 Stunden bei 65 °C rückgängig gemacht. Die gelöste

DNA wurde mit dem „PCR-Purification Kit“ (Qiagen) isoliert. Die isolierte DNA wurde

mittels einer „real time“-DNA-PCR quantifiziert und mit dem Input verglichen.

3.2.17.- Densitometrie

Die Densitometrie wurde mit dem software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) durchgeführt.

Image J ist ein freies Software Programm, das von der "National Institutes of Health" der

Vereinigten Staaten entwickelt wurde. Die Fläche und die Intensität der interessierenden Bände

wurden gemessen und diese Werte wurde gegen das Produkt von der Fläche und der Intensität

von einem Haushaltsgen relativiert. Diese Werte wurden dann gegen die Positivkontrolle oder

unbehandelte Zellen normalisiert.

3.2.18.- Statistische Auswertung

Der Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten oder Klonen und die

Standardabweichung dieser Werte wurden auf statistische Signifikanz mit dem ANOVA t-

Test geprüft. Die klinischen Daten der Patienten wurden mit dem Fisher´s exact Test auf

statistische Signifikanz geprüft.

4.- Ergebnisse Seite - 71 -

4.- Ergebnisse

4.1 Biologische Effekte der AML1/ETO-Induktion in 9/14/18-Zellen.

Das AML1/ETO-Protein wurde mit 5 µM Ponasteron A in 9/14/18-Zellen induziert.

Ponasteron A und frisches Medium wurden alle 48 Stunden zu den Zellen gegeben. Viabilität

und Zellwachstum wurden am ersten und dann jeden zweiten Tag nach der Induktion von

AML1/ETO durch Trypan Blau Färbung bestimmt. Dadurch wurde festgestellt, dass die

Induktion des AML1/ETO-Proteins eine Zellwachstum-Inhibition (Zellkonzentration von

16,3 +/- 4,2 Zellen x 105 /ml in den nicht-induzierten Zellen vs. 9,9 +/- 2,9 Zellen x 105 /ml in

den induzierten Zellen, Wachstum-Inhibition von 39,3% am 4. Tag) (Abb.11a) und

Apoptose/Nekrose der Zellen (Viabilität von 89,2 +/- 5,2 % in den nicht-induzierten Zellen

vs. 72,4 +/- 11,6 % in den induzierten Zellen am 4. Tag) verursacht (s. Abbildung 11b).

Eine solche Zellwachstums-Inhibition und Apoptose-Induktion nach der ektopen

AML1/ETO-Expression in 9/14/18-Zellen wurden schon in den Arbeiten von (Berg et al.,

2007; Fliegauf et al., 2004; Lu et al., 2006)) beschrieben. Die Unterschiede im Zellwachstum

und in der Viabilität zwischen den induzierten und nicht induzierten Zellen waren umso

größer, je länger die Induktion des AML1/ETO-Proteins dauerte.

Abbildu ng 11.- Funktionelle Analyse der AML1/ETO -induzierbaren U-937-Zellen. A und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt und die AML1/ETO-induzierten Zellen wurden mit den nicht-induzierten Zellen verglichen.

9/14/18 +/- Pon A

0

5

10

15

20

25

0 24 48 72 96 120

Time (hrs)

Cel

l con

cent

ratin

(x10

*5/m

l)

9/14/18 + Pon A 9/14/18 - Pon A

9/14/18 +/- Pon A

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 24 48 72 96 120

Time (hrs)

Via

blity

9/14/18 + Pon A 9/14/18 - Pon A

A.- B.-9/14/18 +/- Pon A

0

5

10

15

20

25

0 24 48 72 96 120

Time (hrs)

Cel

l con

cent

ratin

(x10

*5/m

l)

9/14/18 + Pon A 9/14/18 - Pon A

9/14/18 +/- Pon A

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 24 48 72 96 120

Time (hrs)

Via

blity

9/14/18 + Pon A 9/14/18 - Pon A

A.- B.-


4.2.- Funktionelle Untersuchung des AML1/ETO-Zielgens LAT2

(WBSCR5/NTAL/LAB).

Funktionelle Untersuchungen wurden mit Hilfe eines bereits identifizierten

AML1/ETO-Zielgens der AG von Prof. Lübbert durchgeführt. Mit Hilfe der AML1/ETO-

induzierbaren Zellen wurden verschiedene Gene in einer cDNA-RDA-Analyse identifiziert,

deren Expression durch das AML1/ETO-Protein reguliert wurde. Die AML1/ETO-vermittelte

Repression des LAT2-Gens wurde mittels Northern Blots in verschiedenen AML1/ETO-

positiven vs. -negativen Zelllinien und in primären AML-Blasten validiert (Fliegauf et al.,

2004).

4.2.1.- Charakterisierung der Repression des LAT2-Gens in einer AML1/ETO

induzierbaren Zelllinie

Im ersten Schritt der funktionellen Untersuchungen wurde die Repression der LAT2-

mRNA nach der Induktion des AML1/ETO-Proteins in 9/14/18-Zellen mittels Northern Blot

bestätigt. Die relative Expression der LAT2-mRNA in 9/14/18-Zellen 48 Stunden nach der

AML1/ETO-Induktion war 73,8 +/- 0,4 % % der Expression der nicht-behandelten 9/14/18-

Zellen. (Abb. 12a). Ebenso konnten die Daten von Dr. M. Fliegauf, die Repression von der

LAT2- mRNA durch AML1/ETO, auf der Protein-Ebene bestätigt werden (Daten nicht

gezeigt).

Eine weitere Charakterisierung der AML1/ETO-Repression der LAT2-mRNA wurde

zu sehr frühen Zeitpunkten mittels „real-Time“-RT-PCR durchgeführt. Eine Repression von

LAT2 mRNA (0,76 +/- 0,13-fach im Vergleich zur Grundexpression in der 9/14/18-Zellen)

wurde schon nach 4 Stunden der Induktion des AML1/ETO Proteins nachgewiesen (Abb

12b). Die Expression von AML1/ETO war 2 Stunden 9,5-fach höher und 4 Stunden nach der

Induktion mit Ponasteron A 15,5-fach höher als die Grundexpression in 9/14/18-Zellen (Abb.

12c).


4.2.2.- Untersuchung der LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in myeloischen

Zelllinien.

Im Weiterem wurde die Expression von LAT2 auf mRNA- und Protein- Ebene in

verschiedenen myeloischen Zelllinien untersucht. Die B-Zelllinie LCL-GK und die T-

Zelllinie Jurkat wurden als Positiv- bzw. Negativkontrollen benutzt (Brdicka et al., 2002). In

Northern- sowie in Western Blots war die LAT2-Expression von Kasumi-1-Zellen

(AML1/ETO positiv) so niedrig wie in der Negativkontrolle (Jurkat-Zellen, T-Zelllinie).

Weitere myeloische Zelllinien exprimierten LAT2-mRNA und -Protein unterschiedlich:

Abbildung 12.- Repression von LAT2-mRNA und -Protein nach der ektopen Expression von AML1/ETO in der 9/14/18-Zelllinie. A.- Durch Northern Blot wurde die Repression der LAT2-mRNA 48 Stunden nach der Induktion des AML1/ETO-Proteins bestätigt. Die Hybridisierung mit einer AML1/ETO-Sonde zeigte, dass die mit Ponasteron A induzierten Zellen das AML1/ETO-Transkript exprimieren. B.- und C.- Die Kinetik der Repression der LAT2-mRNA durch AML1/ETO wurde durch "real time"-RT-PCR untersucht. Die Repression der LAT2-mRNA wurde schon 4 Stunden nach der Induktion mit Ponasteron A nachgewiesen. Die Expression der AML1/ETO-mRNA war zu diesem Zeitpunkt 15,5 Fach höher als die AML1/ETO-Expression der 9/14/18-Zellen.

C.-

B.-A.-

EtBr

Ponasterone A + -Time (hours) 0 48 48

9/14/18U937

AML1/ETO

LAT2

GAPDH 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10

Time (hrs)

Rel

ativ

e LA

T2/

GA

PD

H e

xpre

ssio

n

0

4

8

12

16

20

0 2 4 6 8 10

Time (hrs)

Rel

ativ

e A

ML1

-ET

O/G

AP

DH

exp

ress

ion

C.-

B.-A.-

EtBr


9/14/18U937

AML1/ETO

LAT2

GAPDH

EtBr


9/14/18U937

AML1/ETO

LAT2

GAPDH 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10

Time (hrs)

Rel

ativ

e LA

T2/

GA

PD

H e

xpre

ssio

n

0

4

8

12

16

20

0 2 4 6 8 10

Time (hrs)

Rel

ativ

e A

ML1

-ET

O/G

AP

DH

exp

ress

ion


Die relative Expression der LAT2/GAPDH-mRNA in 9/14/18-, oder HL60- Zelllinien

war so stark wie in der LCL-GK-Zelllinie (B-Zelllinie). Die U937-Zelllinie hatte eine 2-fach

stärkere und die NB4-Zelllinie eine 3-fache stärkere relative LAT2/ ß -Aktin -Expression als

die LCL-GK Zelllinie (Abb. 13a). Die Membranen der Northern Blots wurden mit einer ß-

Aktin-Sonde als Ladekontrolle hybridisiert

Diese Daten konnten durch Western Blots bestätigt werden. Die relative LAT2/β-Aktin-

Expression war 1,5-fach höher in 9/14/18-, 3-fach in HL60-, 2-fach in NB4- und U937-Zellen

als in der LCL-GK Zelllinie. Die relative LAT2/β-Aktin Expression von Jurkat- und Kasumi-

1-Zellen war unter 10 % der Expression in LCL-GK-Zellen (Abb. 13b).

Abbildung 13.- LAT2 -Expression in verschiedenen Zelllinien. A.- LAT2-mRNA-Expression wurde mittels Northern Blot in verschiedenen myeloischen Zelllinien analysiert. Die LCL-GK ist eine B-Zelllinie, die als Positivkontrolle galt, und Jurkat ist eine T-Zelllinie, die als Negativkontrolle galt. Die Membranen der Northern Blots wurden mit einer ß-Aktin-Sonde als Ladekontrolle hybridisiert. B.- LAT2-Protein-Expression wurde mittels Western Blot in verschiedenen myeloischen Zelllinien analysiert. ß-Aktin wurde als Ladekontrolle benutzt und die relative LAT2/ß-Aktin Expression wurde zwischen den verschiedenen Zelllinien verglichen.

A.-

B.-

LAT2

EtBr

LCL-GK Jurkat 9/14/18 HL60 NB4 U937 Kas- 1

β-ACTIN

LAT2

ß-Actin


A.-

B.-

LAT2

EtBr


β-ACTIN

LAT2

ß-Actin



4.2.3.- Untersuchung der Protein-Expression des LAT2-Gens in primären AML-Blasten

von Patienten mit unterschiedlichen chromosomalen Aberrationen.

Knochenmarksproben von 43 AML Patienten der Universitätklinik Freiburg wurden

auf Expression des LAT2-Proteins mittels Western Blots untersucht. Die

Knochenmarksproben der Patienten wurden so ausgewählt, dass eine representative Zahl von

AML Patienten mit verschiedenen Karyotypen untersucht wurde.

Abbildung 14.- LAT2-Protein-Expression in Knochenmarksproben von Patienten mit AML unterschiedlicher Karyotypen. Die mononukleären Zellen von Knochenmarksproben der AML-Patienten wurden mittels Fikollgradient getrennt. Diese Zellen wurden in Einfriermedium eingefroren und in der Tumorbank aufbewahrt. Nach dem Auftauen dieser Zellen wurde Protein isoliert. Die Expression des LAT2-Proteins wurde mittels Western Blot analysiert. Kein Patienten (6/6) mit der t(8; 21), mit Aberrationen auf Chromosom 7 (3/3) und mit der t(15; 17) (4/4) exprimierten das LAT2 auf der Proteinebene.

inv(16) inv(16)** inv(16)* (8;21) Complex Complex inv(16) -7 U937-7q

LAT2

ß-Actin

LAT2

ß-Actin

11q23 (8;21) (8;21) (8;21) NN NN inv(16) Complex U937

LAT2

ß-Actin

NN NN NN inv(16) +10 NN NN NN

inv(16) inv(16)** inv(16)* (8;21) Complex Complex inv(16) -7 U937-7q

LAT2

ß-Actin

LAT2

ß-Actin

11q23 (8;21) (8;21) (8;21) NN NN inv(16) Complex U937

LAT2

ß-Actin

NN NN NN inv(16) +10 NN NN NN


Tabelle 6.- Klinischen Daten der untersuchten Patienten

LAT2 fehlende bzw. niedrige Expression

LAT2 mäβige bzw. hohe Expression

Alter 61,3 +/- 12,9 56,6 +/- 16,1

Geschlecht (M/F) 9/6 19/10

WBC (Tsd/µl) 16,7 +/- 19,6 48,1 +/- 64,3

Hämoglobin 8,0 +/- 1,9 9,0 +/- 1,8

Thrombozyten 41,3 +/- 30,3 63,8 +/- 57,0

% Blasten: - KM - PB

50,1 +/- 31,2 46,5 +/- 35,7

65,1 +/- 16,1 65,2 +/- 27,7

Karyotyp: - t (8;21) - t (15;17) - inv (16) - Normal - Komplex - Aberr. 11q23 - Aberr. Chrom.7 - Einzeln Abnorm - Unbekannt Total

6/6** 4/4* 1/6

1/15 1/4 0/2

3/3* 1/2 0/1

15/43 (34,8 %)

0/6 0/4 5/6

14/15** 3/4 2/2 0/3 1/2 1/1

28/43 (65,1 %) FAB Klassifikation - M0 - M1 - M2 - M3 - M4eo - M4 - M5 - M6 - M7 - Biphenotypische Total

0/2 0/6

9/13** 4/4* 1/5 0/8 0/2 1/1 0/1 0/1

15/43 (34,8 %)

2/2

6/6* 4/13

0/4 4/5

8/8* 2/2 0/1 1/1 1/1

28/43 (65,1 %) Tabelle 4.- Klinische Daten, Karyotyp und FAB-Klassifikation von untersuchten Patienten. Protein-

Expression von Knochenmarkproben von AML-Patienten wurden mittels Weestern blot untersucht. Relative LAT2/ß-Aktin-Expression wurde mit U937 verglichen und Patienten mit weniger als 20 % relative Expression wurden in der Gruppe "LAT2 Absent-Niedrig Expression" eingeteilt. Statistische Auswertung wurde für die klinischen Daten der Patienten mit dem ANOVA t-Test analysiert und für den Karyotyp und FAB-Klassifikation mit dem "Fisher's exact Test". * p-Werte < 0.05 und ** p-Werte < 0.01


Das relative LAT2/ß-Aktin-Protein-Verhältnis wurde durch Densitometrie ermittelt.

Diese Werte wurden mit dem relativen LAT2/ß-Aktin-Protein-Verhältnis in den U937-Zellen

verglichen. Patienten wurden der Gruppe der LAT2-absent-niedrig-Expressoren zugerechnet,

wenn die relative LAT2/ß-Aktin-Expression unter 20 % der U937-Zelllinie lag.

Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den klinischen Daten der AML-

Patienten (Tab. 6). Die Patienten mit niedriger LAT2-Expression waren 61,3 +/- 12,9 Jahre

alt und die Patienten mit normaler Expression waren 56,6 +/- 16,1 Jahre alt. Das Verhältnis

Männer/Frauen war bei den Patienten mit niedriger Expression 1,5 zu 1 und in den Patienten

mit einer normalen LAT2-Expression 2 zu 1. Einen deutlichen Unterschied gab es zwischen

den Mittelwerten der Zahl der peripheren Leukozyten, 16,7 +/- 19,6 Tsd/µl bei den Patienten

mit niedriger LAT2-Expression vs 48,1 +/- 64,3 Tsd/µl bei den Patienten mit der normalen

Expression, allerdings nicht statistische signifikant. Die Hämoglobin-Werte waren fast gleich,

8,0 +/- 1,9 Hb/dL bei den Patienten mit niedriger LAT2-Expression und 9,0 +/- 1,8 Hb/dL bei

den Patienten mit normaler Expression. Die Zahl der Thrombozyten waren 41,3 +/- 30,3

Tsd/µl bei den Patienten mit niedriger LAT2 Expression und 63,8 +/- 57,0 Tsd/µl bei den

Patienten mit normaler Expression.

Der Blastenanteil im Knochenmark der Patienten mit niedriger LAT2-Expression war

50,1 +/- 31,2 %, während im peripheren Blut dieser Patienten der Blastenanteil 46,5 +/- 35,7

% war. Bei den Patienten mit normaler LAT2 Expression war der Blastenanteil 65,1 +/- 16,1

% im Knochenmark und 65,2 +/- 27,7 % im peripheren Blut. Keine statistische Signifikanz

wurde bei den klinischen Daten der Patienten mit dem ANOVA t-test gefunden.

Nach der Untersuchung von Knochenmarksproben von 43 AML-Patienten wurden 15

Patienten gefunden, die das LAT2 Protein nicht exprimierten. In den Knochenmarksproben

aller Patienten mit der t(8;21) fand sich keine Expression des LAT2-Proteins.

Interessanterweise war die Expression des LAT2-Proteins bei 4 Patienten mit t(15; 17) sowie

bei 3 Patienten mit einer Deletion des langen Armes vom Chromosom 7 abwesend.

Andererseits wurde das LAT2-Protein bei 27 von 30 Patienten mit anderen Karyotypen,

darunter Normalkaryotyp (NN), inv(16), Aberrationen in 11q23, komplexen Karyotypen und

einzeln Chromosomen-Abnormalitäten detektiert (Abb. 14).

Im Bezug auf die FAB-Klassifikation konnte festgestellt werden, dass 9 von 13

Patienten der FAB M2 Subgruppe, keine Expression des LAT2-Proteins aufwiesen

(überwiegend AML1/ETO-Positiv). Bei 4 FAB M3 Patienten (alle positiv für t(15; 17)) und 3

Patienten mit Aberrationen von Chromosom 7 wurde die LAT2-Expression mittels Western


blot nicht detektiert. Dagegen war LAT2-Protein in allen Patienten der FAB M1 und FAB M4

Subgruppe nachweisbar.

Zwei Knochenmarksproben von Patienten mit inv (16) aus der dritten Kontrolle einer

Kompletter-Remission wurden untersucht, um zu bestätigen, dass die Expression des LAT2-

Proteins in den Patientenproben nur aus den leukämischen Zellen stammt.

Mittels Western Blot konnten wir nachweisen, dass die Expression des LAT2-

Proteins in den Knochenmarksproben der Patienten im Kompletter-Remission nicht

nachweisbar und nur in den Proben der gleichen Patienten bei der Erst-Diagnose der AML

detektierbar war (Abb. 15).

Abbildung 15.- LAT2-Protein-Expression in Knochenmarksproben von Patienten mit AML zu Zeitpunkt der Erst-Diagnose(ED) und der Vollremission (CR). Die Expression des LAT2-Proteins wurde in Knochenmarksproben von Patienten bei der Diagnose und in kompletter Remission untersucht. Die Expression des LAT2-Proteins wurde nur im pathologischen Knochenmark nachgewiesen. Die Patienten, deren Knochenmark in CR untersucht wurden, sind in Abb. 14 mit * und ** gekennzeichnet.

LAT2

ß-Actin

ED CR ED CR

Pat.: 1 2

LAT2

ß-Actin

ED CR ED CR

Pat.: 1 2


4.2.4.- Untersuchung der Re-Expression des LAT2-Gens mittels siRNAs gegen

AML1/ETO in Kasumi-1-Zellen.

In Kooperation mit PD. Dr. Heidenreich (Universität Tübingen) wurde die Expression

des LAT2-Gens in einem AML1/ETO-Knock-Down-System mittels siRNAs in der Kasumi-

1-Zelllinie untersucht. Dieses System wurde bereits publiziert (Heidenreich, Blood 2003;

Martinez BMC Cancer 2004; Dunne Oncogene 2006). Die Kasumi-1-Zellen wurden mit

einem Plasmid ohne Oligonukleotid (Mock), mit einem Oligonukleotid gegen AML1/ETO-

mRNA (siAGF1) und mit einem nicht verwandten Oligonukleotid (siAGF6) elektroporiert.

Nach 16 Stunden wurde ein Teil der Zellen geerntet. Ein weiterer Teil wurde am 4. Tag nach

der ersten Elektroporation ein zweites Mal elektroporiert. 16 Stunden nach der zweiten

Elektroporation wurden die Zellen dann geerntet. Das Kultivieren der Zellen und die

Elektroporation der siRNAs wurden im Labor von PD. Dr. Heidenreich durchgeführt; die

RNA-Isolierung, Northern Blots und „real-Time“-RT-PCR, sowie Protein-Isolierung und

Western Blots wurden in Freiburg durchgeführt.

Mit Northern Blots konnte nachgewiesen werden, dass die LAT2-mRNA nach der

ersten und zweiten Elektroporation (jeweils 30 % und 50 % höhere Expression als die

Expression von den Mock-transfizierten Kasumi-1-Zellen) schwach re-exprimiert wurde

(Daten nicht gezeigt), allerdings in deutliche Grenze der Methode. Eine weitere, quantitative

Nachweis Methode war notwendig. In diesem Versuch wurde auch nachgewiesen, dass die

Lysozym-mRNA nach der Herunterregulation der AML1/ETO mRNA sehr stark re-

exprimiert wurde (s. Abb. 16a). Diese Daten wurde im Verlauf dieser Doktorarbeit publiziert

(Claus et al., 2006). Die Membranen von Northern Blots wurden mit einer ß-Aktin-Sonde als

Ladekontrolle hybridisiert.

Die Expression der LAT2-mRNA wurde mittels „real-Time“-RT-PCR untersucht, um

die Daten des Northern Blots zu bestätigen. Durch Quantifizierung mit „real-Time“-RT-PCR

wurde eine Hochregulation auf das 4,5 +/- 0,8-fache nach der ersten Elektroporation und auf

das 9,6 +/- 3,8-fach nach der zweiten Elektroporation im Vergleich zur Expression der

„Mock“-transfizierten Kasumi-1 Zellen ermittelt (Abb. 16c). Die Herunterregulation der

AML1/ETO-mRNA wurde ebenfalls mittels „real-Time“-RT-PCR in diesem Versuch

quantifiziert. Nach der ersten Elektroporation wurde die Expression von AML1/ETO um 51,8

+/- 25,9 % und nach der zweiten Elektroporation um 39,7 +/- 14,1 % reduziert im Vergleich

zur Expression der "Mock"-transfizierten Kasumi-1-Zellen (Abb. 16d). Diese Daten konnten

auch mittels Western Blots auf Protein-Ebene bestätigt werden. (s. Abb. 16b)


Abbildung 16.- Re-Expression der LAT2-mRNA nach Knock-down von AML1/ETO mittels siRNAs in der Kasumi-1-Zelllinie. A.- Northern Blot von Kasumi-1-Zellen: „Mock“ elektroporierte Zellen als Kontrolle, das siAGF1-Oligonukleotid war gegen AML1/ETO und das siAGF6 Oligonukleotid war als nicht verwandtes Oligonukleotid hergestellt wurden. Die Membran wurde mit einer AML1/ETO-Sonde als Kontrolle der Herrunterregulation der AML1/ETO-mRNA, LYSOZYM als Kontrolle für einen AML1/ETO-Zielgen und ß-AKTIN als Ladekontrolle hybridisiert. B.- Die Repression von AML1/ETO durch siRNAs konnte mittels Western Blots in Kasumi-1 Zellen gezeigt werden. C.- und D.- Die Re-expression des LAT2-Gens durch den AML1/ETO-Knock-Down wurde mittels „real-Time-PCR“ bestätigt. Die Expression von LAT2- und AML1/ETO-mRNA wurde mit der GAPDH-Expression verglichen und mit der Expression der "Mock" transfizierten Zellen normalisiert.

D.-

C.-A.-

AML1/ETO

EtBr

LYSOZYME

Kasumi-11° Electroporation 2°Electroporation

Mock siAGF1 siAGF6 Mock siAGF1 siAGF6

ß-Actin0

3

6

9

12

15

18

I. Mock I. siAGF1 I. siAGF6 II. Mock II. siAGF1 II. siAG F6R

elat

ive

LAT

2/G

AP

DH

exp

ress

ion

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

I. Mock I. siAGF1 I. siAGF6 II. Mock II. siAGF1 II. siAG F6AM

L1-E

TO

/GA

PD

H r

ela

tive

exp

ress

ion

B.-

AML1/ETO(85 kDa)β-Actin(42 kDa)

Kasumi-1

1° Electroporation

Mock siAGF1 siAGF6

D.-

C.-A.-

AML1/ETO

EtBr

LYSOZYME

Kasumi-11° Electroporation 2°Electroporation

Mock siAGF1 siAGF6 Mock siAGF1 siAGF6

ß-Actin0

3

6

9

12

15

18

I. Mock I. siAGF1 I. siAGF6 II. Mock II. siAGF1 II. siAG F6R

elat

ive

LAT

2/G

AP

DH

exp

ress

ion

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

I. Mock I. siAGF1 I. siAGF6 II. Mock II. siAGF1 II. siAG F6AM

L1-E

TO

/GA

PD

H r

ela

tive

exp

ress

ion

B.-

AML1/ETO(85 kDa)β-Actin(42 kDa)

Kasumi-1

1° Electroporation

Mock siAGF1 siAGF6


4.2.5.- Re-Expression der LAT2-mRNA durch epigenetisch aktive Substanzen in der

AML1/ETO-positiven Kasumi-1-Zelllinie.

AML1/ETO rekrutiert an seine Zielgene HDACs der Klasse I, HDAC1-3 (Amann, MCB

2001) sowie DNMT1 (Liu, Cancer Res. 2005). Dadurch kann AML1/ETO durch

epigenetische Veränderungen die Expression verschiedener Genen beeinflussen (Fliegauf,

Oncogene 2004; Alcalay, JCI 2003).

Um einen solchen epigenetischen Einfluß auf die LAT2-Expression zu untersuchen,

wurde die Kasumi-1-Zelllinie mit verschiedenen, epigenetisch aktiven Therapien

(demethylierende Substanzen wie 5-aza-2'-deoxycytidine/Decitabine/DAC oder mit HDAC-

Inhibitoren wie MS-275, TSA und SAHA) behandelt. Die Änderung der LAT2-mRNA

Expression wurde durch „real time“-RT-PCR quantifiziert.

Die Zellen wurden 3 Tage mit verschiedenen Konzentrationen von HDAC-Inhibitoren

oder mit ATRA behandelt. Für weitere Experimenten wurden equitoxische Konzentrationen

der Substanzen so ausgewählt, dass die Viabilität der Zellen über 80 % blieb und eine

maximale Zellwachstum-Inhibition erreicht wurde. Die LAT2-mRNA wurde nach der

cDNA-Traskription mittels „real time“-RT-PCR quantifiziert und mit der Expression von ß-

Glukuronidase (GUSB) relativiert.

Die Expression der LAT2-mRNA wurde 3 Tagen nach der Behandlung mit 1 µM MS-

275 deutlich re-exprimiert (4,3 +/- 1,3-fach höher als die Grundexpression in Kasumi-1) (

Abb. 17a). Die Substanz ATRA (1µM) und die HDAC-Inhibitoren TSA (0,1-0,2 µM) und

SAHA (0,5-1 µM) hatten nach 3 Tage Behandlung kaum einen Effekt auf die Expression der

LAT2 mRNA (Daten nicht gezeigt).

Kasumi-1 Zellen wurden mit MS-275 behandelt. Alle 2 Stunden wurde Aliquots

geerntet. Daraus wurde die RNA isoliert und mit einer Reverse Transkriptase in cDNA

synthetisiert. Zeit-abhängig wurde mit MS-275 in einer Konzentration vom 0,1 µM die LAT2

mRNA re-exprimiert. Durch „real time“-RT-PCR konnte eine maximale Re-Expression (9,4

+/- 2,6 fach höher als die Grundexpression) nach 8 Stunden nachgewiesen werden und die

Expression der LAT2-mRNA blieb nach 24 Stunden nocht etwa 3 fach-höher als die

Grundexpression in den nicht-behandelten Kasumi-1-Zellen (Abb. 17b).

Die AML1/ETO bedingte Hemmung der LAT2-Expression konnte dosisabhängig

auch durch Decitabine (DAC) aufgehoben werden (Abb. 17c). Nach 3 Gaben von DAC alle

24 Stunden wurde LAT2-mRNA am 6. Tag durch „real-Time“-RT- PCR gemessen. Die

relativen LAT2/GUSB Expression der behandelten Kasumi-1-Zellen war 1,4 +/- 0,3-fach mit


25 nM DAC; 1,6 +/- 0,6-fach mit 50 nM DAC; 1,6-+/- 0,1-fach höher mit 100 nM DAC und

2,9 +/- 0,2-fach höher mit 200 nM DAC als die relative LAT2/GUSB-mRNA Expression in

den nicht-behandelten Kasumi-1-Zellen.

In der Arbeit von (Cameron et al., 1999) wurde gezeigt, dass die HDAC Inhibitoren

und die demethylierenden Substanzen einen synergistischen Effekt auf die Re-expression der

unterdrückten Gene haben können. Daher wurden die HDAC-Inhibitoren und Decitabine in

Kombination benutzt, um einen synergistischen Effekt in der Re-expression der LAT2-

mRNA in der Kasumi-1-Zelllinie zu untersuchen. Es wurden niedrigere Konzentrationen als

in Einzelgaben benutzt, um die Toxizität der Substanzen zu minimieren. Die Behandlung

erfolgte mit 3 Gaben von DAC alle 24 Stunden und anschließend wurde am 3. Tag der HDAC

Inhibitor für weitere 3 Tage eingesetzt.

Abbildung 17.- LAT2-mRNA Re-expression durch epigenetisch aktive Therapien in AML1/ETO-positiven Kasumi-1 Zellen. A.- Kasumi-1-Zellen wurden für 3 Tagen mit verschiedenen HDAC-Inhibitoren behandelt und die LAT2-mRNA Expression wurde am Tag 3 mittels „real-time“-RT-PCR quantifiziert und gegen die β-Glukuronidase normalisiert. B.- Mit dem HDAC-Inhibitor MS-275 in einer Konentration von 1 µM konnte die Expression der LAT2-mRNA in einer Zeit-abhängigen Art re-exprimiert werden. C.- Die Kasumi-1-Zellen wurden mit 3 Gaben alle 24 Stunden mit der demethylierenden Substanz Decitabine (DAC) behandelt. Am 6. Tag wurde die RNA der Zellen isoliert. Nach der Transkription in cDNA mit einer Reverse Transkriptase wurde die LAT2-mRNA mittels „real-time“-RT-PCR quantifiziert. Mit Decitabine konnte die Expression der LAT2-mRNA auch in einer Konzentrationsabhängigen Art in den Kasumi-1-Zellen induziert werden. D.- Die Kasumi-1-Zellen wurden mit 3 Gaben von DAC alle 24 Stunden behandelt. Am 3. Tag wurde MS-275 gegeben. Die Zellen wurden am 6. Tag geerntet und die LAT2-mRNA Expression durch „real time“-RT-PCR gemessen. Decitabine und MS-275 in Kombination konnten die Expression der LAT2-mRNA in einer synergistischen Form in Kasumi-1-Zellen induzieren. Die Säulen repräsentieren den Mittelwert und die Pfeile die Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten

Kasumi-1 +/- MS275

0

3

6

9

12

15

0 2 4 6 8 10 12 24

Time (hrs)

Rel

ativ

e LA

T2/

GU

SB

Exp

ress

ion

Kasumi-1 +/- single epigenetically active substances

0

1

2

3

4

5

6

untreatedcells

1 µM ATRA 1 µM S275 0,1 µM TSA 1 µM SAHA

Rel

ativ

e LA

T2/

GU

SB

Exp

ress

ion

Kasumi 1+/- DAC

0

1

2

3

4

5

0 DAC 25 nM DAC 50 nM DAC 100 nM DAC 200 nM DAC

Rel

ativ

e L

AT

2/G

US

B E

xpre

ssio

n

Kasumi-1 +/- combined epigenetically active substances

0

2

4

6

8

10

Rel

ativ

e LA

T2/

GU

SB

Exp

ress

ion

50 nM50 nM25 nM25 nM00DAC

100 nM0100 nM0100 nM0MS-275

A. B.

C. D.

Kasumi-1 +/- MS275

0

3

6

9

12

15

0 2 4 6 8 10 12 24

Time (hrs)

Rel

ativ

e LA

T2/

GU

SB

Exp

ress

ion

Kasumi-1 +/- single epigenetically active substances

0

1

2

3

4

5

6

untreatedcells

1 µM ATRA 1 µM S275 0,1 µM TSA 1 µM SAHA

Rel

ativ

e LA

T2/

GU

SB

Exp

ress

ion

Kasumi 1+/- DAC

0

1

2

3

4

5

0 DAC 25 nM DAC 50 nM DAC 100 nM DAC 200 nM DAC

Rel

ativ

e L

AT

2/G

US

B E

xpre

ssio

n

Kasumi-1 +/- combined epigenetically active substances

0

2

4

6

8

10

Rel

ativ

e LA

T2/

GU

SB

Exp

ress

ion

50 nM50 nM25 nM25 nM00DAC

100 nM0100 nM0100 nM0MS-275

A. B.

C. D.


MS-275 in einer Konzentration von 100 nM hatte nur einen leichten Effekt auf die Re-

expression von LAT2-mRNA (1,4 +/- 0,5-fach höher). Die LAT2-mRNA konnte auch in

einzelnen Therapien mit 25 nM DAC allein (1,5 +/- 0,2-fach höher) und mit 50 nM DAC (2,9

+/- 1,5-fach höher) reexprimiert werden. Eine Kombination von 100 nM MS-275 mit 25 nM

DAC zeigte eine LAT2-mRNA Re-expression von 3,2 +/- 1,2-fach verglichen mit den nicht-

behandelten Zellen; 100nM MS275 plus 50 nM DAC zeigte eine 5,8 +/- 1,4 fach Induktion

verglichen mit den nicht-behandelten Kasumi-1-Zellen (s.Abbildung 17d). Durch diesen

Versuch wurde ein synergistischer Effekt von einer demethylierenden Substanz mit einem

HDAC-Inhibitor auf die LAT2-mRNA-Expression in den Kasumi-1-Zellen festgestellt.

4.2.6.- Histonmodifikation nach der Behandlung mit MS-275 auf dem LAT2-Promotor

in Kasumi-1-Zellen.

Die nächste Fragestellung war, ob der HDAC-Inhibitor MS-275 einen direkten Effekt

auf die aktivierenden Histon-Markierungen des LAT2-Promotors hat. Hierzu wurden die

Histon-Acetylierung von H3 (AcH3) und H4 (AcH4), die Histon-Acetylierung von Lysin 9

von Histon H3 (AcH3K9) und die Tri-methylierung-Histon H3 Lysin 4 (3meH3K4), die nach

der Acetylierung von Histon H3 durch die Histon-Methyltransferase MLL4 nach Behandlung

mit HDAC-Inhibitoren katalysiert wird untersucht (Nightingale et al., 2007). Nach der

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde eine „real time“-DNA-PCR durchgeführt, um

eine direkte Quantifizierung der isolierten DNA durchzuführen. Außerdem wurde der

Promotor von p21WAF untersucht, weil bekannt ist, dass p21WAF-mRNA durch Acetylierung

der Histone seines Promotors nach der Behandlung mit HDAC-Inhibitoren induziert wird

(Richon et al., 2000). Nach 24 Stunden Behandlung mit 1µM MS-275 wurden AcH3,

AcH3K9 und 3meH3K4 auf dem LAT2-Promotor in der Kasumi-1 Zellen stark induziert,

nicht aber AcH4 (Abb. 18a). Eine vergleichbare Induktion dieser Histon-Markierungen wurde

auf dem p21WAF-Promotor gefunden (Abb. 18b). Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass der

Promotor von LAT2 durch HDAC-Inhibitoren in den Kasumi-1-Zellen moduliert werden

kann, und dass die mögliche AML1/ETO-vermittelte Rekrutierung von HDACs auf den

Promotor pharmakologisch gehemmt werden kann.


4.2.7.- Histonmodifikation nach der Induktion von AML1/ETO auf dem LAT2-

Promotor in 9/14/18-Zellen.

AML1/ETO rekrutiert HDACs zu den Promotoren seiner Zielgene (Amann et al.,

2001; Gelmetti et al., 1998). Dadurch werden die Histone zu einer geschlossenen

Konformation um den Promotor angeornet und die Transkription der AML1/ETO-Zielgene

wird gehemmt. Deshalb wurde untersucht, ob AML1/ETO HDACs auf den LAT2-Promotor

rekrutiert und welche Histon-Markierungen dadurch beeinflusst werden. Auf dem LAT2-

Promotor der U937-Zellen wurden alle untersuchten Histon-Markierungen (AcH3, AcH4,

AcH3K9 und 3meH3K4) nach der ChIP-Methode angereichert detektiert. Im Gegensatz

hierzu waren sie jedoch nahezu nicht nachweisbar in den Kasumi-1-Zellen (Abb. 18c).

A.-

B.-

C.-

D.-

ChIP for p21 promoter

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Input AcH3 AcH4 AcH3K9 3meH3K4 NIgG

Rel

ativ

e va

lues

to in

pu

t

Kas-1 untreated

Kas-1 + MS275

ChIP for LAT2 promoter

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rel

ativ

e va

lues

to In

put

Kas-1 untreated

Kas-1 + MS275

Time course 9/14/18 for AcH3

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 4 12 24 36 48

Time (hrs) after adding PonA

Rel

ativ

e va

lues

to in

put


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4


Rel

ativ

e va

lues

to In

put

U937 Kasumi-1

A.-

B.-

C.-

D.-

ChIP for p21 promoter

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rel

ativ

e va

lues

to in

pu

t

Kas-1 untreated

Kas-1 + MS275


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Rel

ativ

e va

lues

to In

put

Kas-1 untreated

Kas-1 + MS275

Time course 9/14/18 for AcH3

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 4 12 24 36 48

Time (hrs) after adding PonA

Rel

ativ

e va

lues

to in

put


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4


Rel

ativ

e va

lues

to In

put

U937 Kasumi-1

Abbildung 18.- Induktion der aktivierenden Histon-Moifikationen durch MS-275 und

AML1/ETO-vermittelte Rekrutierung von HDAC-Aktivitä t auf dem LAT2-Promotor. A. Kasumi-1-Zellen wurden für 24 Stunden mit 1 µM MS-275 behandelt und dann wurden mehrere Histon-Markierungen nach Chromation-Immunopräzipitation (ChIP) auf dem LAT2-Promotor mittels "real time"-RT-PCR untersucht. AcH3, AcH3K9 und 3meH3K4 wurden nach MS-275-Behandlung in den Kasumi-1-Zellen angereichert nachgewiesen. B. Vergleichbare Aktivierung der Histon-Markierungen wurden auf dem Promotor von p21waf gefunden. C. Aktivierende Histon-Markierungen der U937-Zellen und der Kasumi-1-Zellen wurden verglichen. Abb. 18D. Die Acetylierung von Histon H3 wurde nach der konditionalen Expression von AML1/ETO in 9/14/18-Zellen untersucht. Eine maximale Depletion dieser Histon-Markierung wurde nach 24 Stunden nachgewiesen, allerdings war sie transient. Die Säulen repräsentieren den Mittelwert und die Pfeile die Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten.


Darüberhinaus die Acetylierung von H3 und H4 nach der konditionalen Expression von

AML1/ETO in 9/14/18-Zellen untersucht. In einem „Time-Course“ wurde nach 4 Stunden

schon eine Verminderung und nach 24 Stunden eine maximale Depletion der Acetylierung

von H3 nachgewiesen, allerdings war diese, wie die Repression von LAT2-Expression nach

der Induktion von AML1/ETO in der 9/14/18-Zellen, transient (Abb 18d). Zusammenfassend

deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass AML1/ETO HDAC-Aktivität auf den LAT2-

Promotor rekrutiert, die durch HDAC-Inhibitoren wie MS-275 aufgehoben werden kann.


4.3.- Identifizierung neuer AML1/ETO-Zielgene mittels RLGS-Methode

4.3.1- RLGS-Ergebnisse

In den funktionell charakterisierten 9/14/18 System wurde durch die Arbeitsgruppe von Prof.

Plass (Columbus, OH, USA) eine RLGS-Analyse der beschriebenen Methodik entsprechend

durchgeführt (s. 1.6.1). Die Induktion des AML1/ETO-Proteins wurde mittels Western Blot in

Freiburg kontrolliert. Dort wurden die DNA-Isolierung, die RLGS und die Auswertung der

Gele durchgeführt. Schließlich wurde die Validierung der RLGS-Ergebnisse mit einem

unabhängigen Experiment mittels Southern Blot in Freiburg durchgeführt.

Nach Durchführung der RLGS-Analyse übermittelte Prof. Plass eine Liste mit Spots,

die sich als verändert zeigten. Jeder Spot auf dieser Liste entspricht einem DNA-Fragment

flankiert von einer Not I und EcoR V Schnittstelle, welches entweder detektierbar oder

abwesend war, wenn induzierte Zellen mit nicht-induzierten Zellen verglichen wurden.

Manche dieser Spots verfügen über eine definierte Adresse im oben beschriebenen

Masterprofil. Damit ist die Identifizierung der Spots einfacher und schneller machbar, denn

manche dieser Spots waren für die Master Profile bereits sequenziert worden.

Abbildung 19.- Intensitätsveränderung von Spot 2D24 (Dematin-Gen) in RLGS-Gelen nach der Induktion des AML1/ETO-Proteins in 9/14/18. Die genomische DNA der 9/14/18-Zellen wurde mit dem methylierungssensitiven Enzym Not I und mit dem nicht-methylierungssensitiven Enzym EcoR V verdaut. Die Sticky-Endungen wurden mit Radioaktiven „C“s und „G“s Nukleotiden gefüllt. Die radioaktiv markierte DNA wurde auf einem bidimensionalen Polyacrylamid Gel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Mit Hilfe eines radioaktiv sensitiven Filmes wurden die Spots (DNA-Fragmenten) detektiert. Die Abbildung zeigt ein Intensitätsveränderung des Spot 2D24 nach der Induktion von AML1/ETO. Dieser Spot konnte weiter mit Southern Blots in einem unabhängigen Versuch validiert werden.

9/14/18 -96 h Pon A

RLGS fragment 2D24 EPB49 (Dematin)9/14/18 +96 h Pon A


In den durchgeführten Experimenten wurden die nicht-induzierten Zellen des Klons

9/14/18 mit induzierten 9/14/18-Zellen zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten (48 und 96

Stunden) nach der Induktion verglichen. Es wurden verschiedene Spotveränderungen

zwischen den zwei Proben gefunden, die möglicherweise einem Methylierungs- oder

Demethylierungsereignis entsprechen könnten. Diese Spots wurden subkloniert und

sequenziert oder in der Datenbank des Master Profile gesucht. Ziel der durchgeführten

Experimente ist es, diese Sequenzen mit Southern Blots zu validieren und gegebenenfalls

weiter zu untersuchen.

Interessanterweise gab es insgesamt 35 neu aufgetretene Spots (8 von ihnen waren in

den Master-Profilen vorhanden) und 8 verschwundene Spots (7 von ihnen waren in den

Master-Profilen vorhanden), als ein Vergleich der induzierten mit den nicht-induzierten

Zellen durchgeführt wurde (Abb. 20). Der Spot 2D24 (Dematin) wurde als verschwundener

Spot 48 und 96 Stunden nach der Induktion gewertet (Abb. 19). Die verschwundenen Spots

entsprechen einem Methylierungsereignis in einer Not I Restriktionsstelle (GCGGCCGC) in

Abbildung 20.- RLGS-Ergebnisse. A.- Die „Spots“ von RLGS wurden als möglichen Methylierugs- und Demethylierungs-Ereignisse bezeichnet, wenn ein Unterschied in der Intensität des Spots nach dem Vergleich mit den RLGS-Gelen von den induzierten und nicht-induzierten Zellen zum gleichen Zeitpunkt gefunden wurde. Die „Spots“-Bezeichnung sind ihre Adresse in dem Master Profile. B.- Die Sequenzen der „Spots“ wurden mit Hilfe der „BLAST“ Software der PubMed Webseite zu einem bestimmten Gen adressiert.

6:2C2, 2C66, 2D24, 2D174D2, 2E43

5:2D10, 2D20, 2G93, 3E2, 4G87

96 +/96 -

1:2D24

3:1F07, 1G26, 2G51

48 +/48 -

Verschwundene Spots und ihreAdresse in der “Master profile”.

Neu aufgetretene Spots in den induzierten Zellen und ihre Adresse in der “Master Profile”.

Sample Paar (Stundennach der induktionvom AML1/ETO mitPonasterone A)

6:2C2, 2C66, 2D24, 2D174D2, 2E43

5:2D10, 2D20, 2G93, 3E2, 4G87

96 +/96 -

1:2D24

3:1F07, 1G26, 2G51

48 +/48 -

Verschwundene Spots und ihreAdresse in der “Master profile”.

Neu aufgetretene Spots in den induzierten Zellen und ihre Adresse in der “Master Profile”.

Sample Paar (Stundennach der induktionvom AML1/ETO mitPonasterone A)

2D20: OTX1 gene (Homeobox family gene)2D24: Dematin (Protein membrane band 4.9 of erythrocytes)2D10:2C66: PELI2 (linker for Toll/IL-1 signalling pathway)

1F07: CDC28 Protein kinase 2 gene 2G93: Homo sapiens protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (Noonan syndrome 1) (PTPN11)2D17: ion transporter protein (NRITP)

Klonierte Sequenzen und ihre Genname:

MöglicheDemethylierung-

Erreignisse

MöglicheMethylierung-

ErreignisseB.-

A.-


AML1/ETO-induzierten Zellen. Ob das Neuauftreten eines Spots ein

Demethylierungsereignis signalisiert, weiß man deshalb nicht, weil bisher nur

Methylierungsereignisse in Tumoren untersucht worden sind.

4.3.2.- Klonierung und Annotation der detektierten Sequenzen

Nach der Lokalisierung der Spots erfolgte die Identifizierung entweder durch

Sequenzierung oder durch den Vergleich mit dem Master Profile. Die Gene wurden mit der

NCBI Genbank (BLAST Software, www.ncbi.nlm.nhi.gov) verifiziert. Bisher wurden 7 Spots

sequenziert: 6 davon sind Fragmente, die zu unterschiedlichen Genen gehören.

Interessanterweise spielen 3 dieser Gene eine Rolle in der Hämatopoese (OTX1, Protein band

4.9/Dematin und Noonan Syndrom Gen/PTPN11).

OTX1 ist ein Gen, das zur HOMEOBOX Familie gehört und von dem überraschend

eine Rolle in der Hämatopoese der Mäuse gefunden wurde (Levantini et al., 2003). KO-

Mäuse für OTX1 hatten Anämie und eine niedrige Expression der erythrozytären

Transkriptionfaktoren SCL und GATA-1.

Das Dematin-Gen (Proteinband 4.9 der Erythrozyten) kodiert ein Protein, das eine

strukturelle Funktion in der Erythrozytenmembrane hat und als Bindeglied zwischen dem

Spectrin-Aktin des Zytoskeletts und der Zellmembran dient (Lutchman et al., 2002). EKLF-1,

ein essentieller Transkriptorfaktor für primitive und definitive Erythropoese, bindet an den

Dematin-Promotor und reguliert dessen Expression (Hodge et al., 2006).

Das Noonan-Syndrom-Gen 1 (PTPN11) gehört zu der Protein-Tyrosin-Phosphatase-

Familie. Heterozygote (+/-) Mäuse für dieses Gen haben ein Phänotyp ähnlich dem von

Menschen, die am Noonan Syndrom erkrankt sind, mit Aortenstenose und Reurgitation,

kraniofazialen Abnormalitäten und myeloproliferativen Erkrankungen. Angeborene

Mutationen des PTPN11-Gens werden in mehr als 50 % der Patienten mit diesem Syndrom

beschrieben (Tartaglia et al., 2001). Somatische Mutationen im PTPN11-Gen sind in 34 % der

Kinder mit JMML (Juveniler Myelomonozytärer Leukämie) zu finden einer

myeloproliferativen Erkrankung des Kinderalters, zu einem kleinen Anteil bei Kindern mit

AML und MDS (Tartaglia et al., 2003) und zu 6 % in B-ALL-Patienten (Yamamoto et al.,

2006)..

Weitere durch RLGS-Analyse gefundene Gene haben eine Funktion in der Regulation

des Zellzyklus (CDC28 Proteinkinase 2). Ein weiteres (PELI2) hat wiederum eine Funktion in

der Kaskade der Signaltransduktion von Toll/IL-1. Möglicherweise erlaubt also der Einsatz


von RLGS in unserem induzierbaren System die Identifikation von Zielgenen von

AML1/ETO welche über einen epigenetischen Mechanismus reguliert werden und welche

eine Funktion in der Hämatopoese haben.

4.3.3.- Funktionelle Annotationen der Gene

Nach Identifikation der Sequenz eines Spots wurde zunächst eine Annotation des

Gens basierend auf Daten der Genecard Datenbank (www.genecards.org) durchgeführt.

Anschließend wurde die Sequenz innerhalb des Gens lokalisiert. Dadurch erfuhr man, ob sie

in einem Exon, Intron oder in der Promotorregion liegen. Dann haben wir mit der CpG-Plot-

Software (http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/) untersucht, ob unsere Sequenz in einer

CpG-reichen Region oder in einer sog. CpG-Insel liegt. Schließlich haben wir mit der NEB

cutter 2.0 Software (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) untersucht, wie viele

Fragmente es gibt und wie groß sie nach einer Restriktionsverdau mit den Enzymen EcoR V

und Not I sein sollten (Abb. 21a, 21b und 22a, 22b).

Tabelle 5.- Sequenzierte RLGS-Spots

Spot Lokalisierung Genname nach Sequenzierung

Chromosomale Lokalisation

2D20 OTX1 (Homeobox family gene) 2p13

2D24 Dematin (Protein membrane band 4.9 of

erythrocytes) 8p21.1

2D10 kein bekanntes Gen

1F07 CDC28 Protein Kinase 2 9q22

2G93

Homo sapiens protein tyrosine phosphatase,

non-receptor type 11 (Noonan syndrome 1)

(PTPN11)

12q24

2C66 PELI2 (Pellino homolog 2) 14q21

2D17 Ion transporter protein (NRITP) 6p25.2

Tabelle 5. - Ergebnisse der sequenzierten RLGS -Spots : Die Spots, die einzelnen DNA-Fragmente entsprechen, wurden entweder einem Master-Profil zugeordnet, in denen man die Sequenzen von Spots bekannt sind, oder subkloniert und anschlieβlich sequenziert. Mit diesen Sequenzen konnte die Gene mit der Blast Software identifiziert werden.


Eine Validierung dieser Ergebnisse wurde von Sequenzen, die für Gene identifiziert

wurden, mittels Southern Blot ausgestrebt. Zuerst mussten Zellen neu induziert werden. Dann

wurde die DNA isoliert und mittels Southern Blot Methode auf eine Nylon-Membran

transferiert. Parallel wurden Primerpaare in Regionen der RLGS-Sequenzen ohne repetitive

Elemente gesucht. Mit diesen Primerpaar wurde DNA mittels PCR amplifiziert und in einem

Vektor kloniert. Plasmide mit Inserts wurden in gröβer Menge hergestellt. Schließlich wurden

die Vektoren mit Restriktionsenzymen geschnitten und die Inserts als radioaktiv-markierte

Hybridizierungssonde benutzt.

4.3.4.- Southern Blots

Abbildung 21.- Southern Blot zur Methylierungsanalyse des Dematin-Gens. A.- Das Gen wurden mit der Software CpG plot nach CpG-Inseln auf seinem Promotor analysiert. B.- Untersuchung der EcoR V und Not I Schnittstelle im untersuchtem Gen und Lokalisierung der DNA-Sonde. Dann wurden die Gröβe der Fragmente von Southern Blot je nach Methylierungsstatus der Not I Schnittstelle berechnet. C.- Southern Blot für das Dematin-Gen. Die Membran wurde mit einer radioaktiv-markierten DNA-Sonde hybridisiert. In diesem Southern Blot konnte nachgewiesen werden, dass die CpG-Dinukleotide innerhalb der Not I Schnittstelle des Dematin-Gens in periphären Blutmononukleären Zellen (PMN) demethyliert ist (Bande bei 1.5 kb), in Kasumi-1 methyliert ist (Bande bei >20 kb), in nicht-induzierten Zellen partiell methyliert ist (Bande bei >20 kb und bei 1.5 kb) und in den induzierten Zellen komplett methyliert ist (Bande bei 1,5 kb).

M 1x 2x 1x 2x 1x 2x 1x 2x

PWL Kas-1 9/14/18 9/14/18 - 48 Std + 48 Std

M = Marker

- = Not treated with Ponasterone A

+ = Treated with Ponasterone A

1x = Digested with ECORV

2x = Digested with ECORV & NOT I

Spot 2D24: Dematin

(Membranprotein Band 4.9 der Erythrozyten)

= Probe

CpG Demethylated

CpG Partial methylated

CpG Methylated

1.5 kb

17 kb

1.5 kB band

17 kB band

1.5 and 17 kB bands

Expected bandsPossible methylationstatus of Not I site

A.-

B.-

C.-


Southern Blots wurden durchgeführt, um die Daten der RLGS-Analysen zu validieren

und um die Reproduzierbarkeit der Versuche festzustellen.

Als Negativkontrolle wurden Lymphozyten aus peripherem Blut benutzt, weil bekannt

ist, dass ihre DNA überwiegend demethyliert ist. Als interne Kontrolle wurden unsere

Versuche mit der U937-Zelllinie durchgeführt, um festzustellen, wie der Methylierungsstatus

jeweiligen der Not I Schnittstelle ist. Letztlich wurde die 9/14/18-Zelllinie mit und ohne

Induktion von AML1-ETO verwendet. Die Zellen wurden zu 2 verschiedenen Zeitpunkten

(48 und 96 Stunden nach der Induktion des AML1/ETO-Proteins) geerntet. Für 5 Sequenzen

aus der primären RLGS-Analyse wurden Southern Blots zur Validierung durchgeführt (2D20,

2G93, 2D24, 1F07, 2C66). Diese entsprechen folgenden Genen: OTX1, PTPN11/Noonan

Syndrom Gen, Dematin/Proteinband 4.9 der Erythrozyten, CDC28 Proteinkinase 2 und

PELI2.

a) Im Dematin-Gen (Spot 2D24), von dem das Protein Band 4.9 aus der Membran von

Erythrozyten kodiert wird, haben wir eine Methylierungsveränderung in den AML1/ETO

induzierten Zellen festgestellt. In mononukleärem Blutzellen ist dieses CpG-Dinukleotid

demethyliert. In der Kasumi-1-Zelllinie ist es komplett methyliert, in U937- und in den nicht-

induzierten 9/14/18-Zellen ist es partiell methyliert, aber in den induzierten 9/14/18-Zellen ist

es zu beiden Zeitpunkten (48 und 96 Std) komplett methyliert (Abb. 21c).

b) Im PTPN11 Gen oder Noonan Syndrom Gen (Spot 2G93) zeigte sich, dass die Not

I-Schnittstelle in Blutlymphozyten und Kasumi-1 Zellen demethyliert ist. Trotzdem wurde ein

Demethylierungsereignis von partiell methyliert (10:1) in den nicht- induzierten 9/14/18-

Zellen zu partiell methyliert (2:1) in den induzierten 9/14/18 Zellen nach Quantifizierung des

Signals der Autoradiogramme nachgewiesen. Das bedeutet, dass unter AML1/ETO Einfluss

diese Not I-Schnittstelle teilweise demethyliert wird. Dieses Ergebnis entspricht dem

Ergebnis der RLGS-Analyse (s. Abbildung 22c).

c) Die Not I-Schnittstelle im OTX1-Gen (Spot 2D20) ist in Blutlymphozyten

demethyliert, partiell methyliert in Kasumi-1-Zellen und komplett methyliert sowohl in U937-

Zellen als auch in nicht-induzierten bzw induzierten 9/14/18-Zellen. Nach der Induktion des

AML1/ETO-Proteins gab es keine Methylierungsveränderung, die durch Southern Blots

nachgewiesen werden konnten (Daten nicht gezeigt).

d) Für die Gene PELI2 (Spot 2C66) und CDC28 Proteinkinase 2 (Spot 1F07) konnten

wir ebenfalls keine Unterschiede zwischen den nicht-induzierten und induzierten 9/14/18-

Zellen nachweisen (Daten nicht gezeigt).


Nach diesen Ergebnissen wurde erneut eine RLGS-Analyse von den induzierten und

nicht-induzierten 9/14/18-Zellen durchgeführt. Diesmal wurden die Zellen zu einem früheren

Zeitpunkt (24 Stunden) und zu einem späteren Zeitpunkt (144 Std), sowie zu 48 Std. und 96

Std. als Wiederholung untersucht. Überraschend war, dass neue De- und

Methylierungsveränderungen zu allen Zeitpunkten gefunden wurden und die im ersten

Versuch aufgetretenen und verschwundenen Spots nicht mehr beteiligt waren. Auβerdem

wurde eine neue Methylierungssignatur mit späterer Passage der 9/14/18-Zellen gefunden.

Wegen der Instabilität des Epigenoms der 9/14/18-Zellen und der geringen Sensivität

der benutzten Methode wurde zu diesem Zeitpunkt beschlossen, dieses Projekt nicht weiter zu

verfolgen. Neuere Methoden sind notwendig, um globale Methylierungsveränderungen nach

der Induktion des AML1/ETO-Proteins in den 9/14/18-Zellen nachzuweisen. Geeignete

Methoden könnten die „ChIP on CHIP“ Methode mit einem Antikörper gegen Methyl-

Cytosin und die MethScope-Methode der Firma Oriongenomics sein.

Abbildung 22.- Southern Blot zur Methylierungsanalyse des PTPN11-Gens. A.- Analyse der CpG-Inseln des PTPN11-Gen auf dem Promotor und Gen-Sequenz. B.- Untersuchung der Fragmentgröße nach Restriktion mit den EcoR V- und Not I-Enzymen und Lokalisierung der DNA-Sonde für dieses Gen. C.- Southern Blot für das PTPN11-Gen. PBL galt als Negativkontrolle und die Kasumi-1-Zelllinie galt als Positivkontrolle für AML1/ETO.

1x 2x 1x 2x M 1x 2x 1x 2x M 1x 2x 1x 2x

PWL Kas-1 9/14/18 9/14/18 9/14/18 9/14/18- 48 Std + 48 Std - 96 Std + 96 std

M = Marker

- = Not treated with Ponasterone A

+ = Treated with Ponasterone A

1x = Digested with ECORV

2x = Digested with ECORV & NOT I

Spot 2G93: PTPN11-Gene (Noonan Syndrom 1)

= Probe

CpG Demethylated

CpG Partial methylated

CpG Methylated

3.5 kb

>20 kb

3.5 kB band

>20 kB band

3.5 and >20 kB bands

Expected bandsPossible methylationstatus of Not I site

A.-

B.-

C.-


4.4.- Untersuchung der Expression des LAT2-Gens während induzierter myeloischer

Differenzierung von AML-Zelllinien.

Dr. M. Fliegauf schloss seinen Artikel mit folgenden Wörter ab: „...aber die Funktion dieses

Gens, und die Bedeutung seiner Repression durch AML1/ETO ist in der Myelopoese bisher

ungeklärt und so sind weitere Untersuchungen notwendig“.

Die AML1- und AML1/ETO- Zielgene spielen eine wichtige Rolle in der

Hämatopoese, aber die Funktion in der Hämatopoese des LAT2-Gens, einschließlich die

Bedeutung seiner Repression durch AML1/ETO, ist bisher nicht untersucht.

Daher wurde die Expression dieses Gens sowohl auf RNA- und Protein-Ebene in

Differenzierungsversuchen mit Zelllinien, auf Protein-Ebene in Zytokinen-induzierten

Differenzierungen von normalen CD34+ Zellen, und in primären myeloischen Zellen

untersucht.

4.4.1.- Regulation von LAT2-mRNA und -Protein in der ATRA-induzierten

granulozytären Differenzierung der NB4-Zelllinie.

Die NB4-Zelllinie trägt die t (15; 17) (Lanotte et al., 1991), die das chimäre

Fusionprotein PML/RARα kodiert (Goddard et al., 1991). Die Zellen sind sensitiv für ATRA

und nach ATRA-Gabe differenzieren sie zu Granulozyten (Lanotte et al., 1991). ATRA wurde

in einer Konzentration von 1 µM in 3 Gaben alle 24 Stunden zugesetzt. Das Medium wurde

mit jeder Gabe von ATRA gewechselt.

Zellwachstum und Viabilität wurden täglich mit Trypan-Blau-Färbung bestimmt. Das

Zellwachstum war am 3. Tag in den behandelten Zellen deutlich niedriger (17,5 +/- 4,4 x 105

Zellen/ml in den unbehandelten vs 8,7 +/- 1,5 x 105 Zellen/ml in den behandelten Zellen,

Wachstum Inhibition vom 50,3 %). Es konnte am 3. Tag keine signifikante Veränderung der

Viabilität beobachtet werden (92,7 +/- 0,6 % in den unbehandelten vs 91,3 +/- 1,8 % in den

behandelten Zellen) (Abb. 26a-b). Die Zellen wurden am 3. Tag auf das CD11b Antigen

mittels FACS Analyse untersucht. Die unbehandelten NB4-Zellen waren zu 60,2 +/- 21,2 %

positiv auf CD11b aber die durch ATRA-behandelten NB4-Zellen waren zu 95,7 +/- 4,2 %

positiv auf CD11b (Abb. 26c). Am 3. Tag wurden auch 1x105 Zellen nach Zytospin auf einem

Objekträger „fixiert“. Nach einer May-Grünwald-Giemsa-Färbung wurden die Zellen auf ihre

Morphologie unter dem Mikroskop untersucht (Abb. 26d). Die unbehandelten Zellen hatten

die typische Morphologie der Promyelozyten. Sie waren größer als andere myeloische


Zelllinien, die in den Differenzierungsversuchen verwendet wurden. Das Zytoplasma war

basophil. Des Weiteren war ebenfalls reichlich dicke Azurgranula zu sehen. Der Kern hatte

einen großen Teil des Zytoplasmas besetzt und lag exzentrisch. Die ATRA-behandelten

Zellen waren kleiner als die nicht-differenzierten Zellen. Das Zytoplasma war rosa-violett

gefärbt; Granula waren kaum zu sehen. Der Kern war kleiner, kondensiert und meistens in 2-3

Lobulen segmentiert.

Die Zellen wurden 0, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach Induktion der Differenzierung

geerntet. Die mRNA- und Protein-Expression wurden mittels Northern und Western Blot

untersucht. (Abb. 27a-b.). 6 und 12 Stunden nach Induktion der Differenzierung war LAT2-

mRNA und –Protein verstärkt sichtbar, danach war die Expression niedriger als in den

unbehandelten Zellen. Nach 72 Stunden hat die Herunterregulation bis zu 30 % der

Expression der unbehandelten NB4-Zelllinie auf der mRNA- und Protein-Ebene erreicht. Die

Northern-Blot-Membran wurde mit einer Myeloperoxidase (MPO)-Sonde als

Abbildung 23.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch ATRA-induzierten granulozytären Differenzierung der NB4-Zellen. A.- und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden täglich durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt. ATRA hat einen hemmenden Effekt auf das Zellwachstum der NB4-Zellen ohne groβen Einfluss auf die Viabilität der Zellen. C.- Der Differenzierungsgrad der Zellen wurde am 3. Tag mittels FACS auf CD11b-Antigen untersucht. Die NB4-Zellen wurden durch ATRA differenziert, wie die Positivität der Zellen auf CD11b zeigte. D.- Die Differenzierung der Zellen wurden am 3. Tag mit der May-Grünwald-Giemsa-Färbung nach Zytospin festgestellt. Die durch ATRA-behandelten NB4-Zellen hatten nach 3 Tagen eine ähnliche Morphologie wie die Granulozyten.

NB4 cells + ATRANB4 cells - ATRA

0 %

2 0 %

4 0 %

6 0 %

8 0 %

1 0 0 %

0 2 4 4 8 7 2T im e (h o u rs )

Via

bilit

y

N B 4 + A T R A N B 4 - A T R A

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

0 2 4 4 8 7 2T im e (h o u rs )

Cel

l con

cent

ratio

n (1

0 *5

/mL)

N B 4 + A T R A N B 4 - A T R A NB4 cells

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

without ATRA With ATRA

pos

tive

cells

to C

D11

bPE

A.-

B.-

C.-

D.-


Differenzierungskontrolle und mit einer GAPDH-Sonde als Ladekontrolle hybridisiert. β-

Aktin wurde als Ladekontrolle im Western Blot benutzt.

4.4.2.- Regulation von LAT2-mRNA und -Protein in der ATRA-induzierten

granulozytären Differenzierung der U937-Zelllinie.

Die monoblastäre U937-Zelllinie (Sundstrom and Nilsson, 1976) ist eine ATRA sensitive

Zelllinie (Olsson et al., 1982), die sich mit dieser Substanz in Granulozyten-ähnliche Zellen

differenziert. Für die ATRA-induzierte granulozytäre Differenzierung der U937-Zelllinie

wurde ATRA in einer Konzentration von 1 µM in 3 Gaben alle 24 Stunden angesetzt. Das

Medium wurde mit jeder Gabe von ATRA gewechselt.

Abbildung 24.- LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in der granulozytären Differenzierung der NB4-Zellen durch ATRA. A.- Die LAT2-mRNA-Expression wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Northern Blot untersucht. MPO galt als Differenzierungsmarker und GAPDH wurde als Ladekontrolle benutzt. B.- Die LAT2-Protein-Expression wurde mittels Western Blot untersucht. LCL-GK ist eine B Zelllinie, die als Positivkontrolle für die Expression von LAT2-Protein galt. Eine Herunterregulation der LAT2-mRNA und –Protein wurde nachgewiesen.

A.-

B.-

ATRA (10-6 M) - + + + + +

Time (hrs) 0 6 12 24 48 72

NB4

LAT2

GAPDH

EtBr

MPO

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

NB4

LAT2

β-Actin

LCL-GK

A.-

B.-

ATRA (10-6 M) - + + + + +

Time (hrs) 0 6 12 24 48 72

NB4

LAT2

GAPDH

EtBr

MPO

ATRA (10-6 M) - + + + + +

Time (hrs) 0 6 12 24 48 72

NB4

LAT2

GAPDH

EtBr

MPO

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

NB4

LAT2

β-Actin

LCL-GKATRA (10-6 M) - + + + + + -

Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

NB4

LAT2

β-Actin

LCL-GK


Zellwachstum und Viabilität wurden täglich mit Trypan-Blau-Färbung bestimmt. Das

Zellwachstum war am 3. Tag deutlich niedriger (21,1 +/- 7,7 x 105 Zellen/ml in den

unbehandelten vs. 12,6 +/- 4,3 x 105 Zellen/ml in den behandelten Zellen, Wachstums-

Inhibition vom 43,5 %). Dennoch wurde am 3. Tag keine Veränderung der Viabilität

beobachtet (94,2 +/- 1,0 % in den unbehandelten vs. 94,0 +/- 1,8 % in den behandelten Zellen)

(Abb. 28a-b). Die Inhibition des Zellwachstums war nicht so stark wie bei der ATRA-

induzierten granulozytären Differenzierung der NB4-Zelllinie. Die unbehandelten U937-

Zellen waren zu 30,7 +/- 5,6 % positiv auf CD11b allerdings waren die mit ATRA-

behandelten U937-Zellen zu 94,2 +/- 5,6 % positiv auf CD11b mittels FACS Analyse (Abb.

28c). Die unbehandelten Zellen hatten nach der May-Grünwald-Giemsa-Färbung eine

typische monoblastäre Morphologie. Das Zytoplasma war teilweise basophil (rosa-blau) mit

kaum sichtbaren Granula. Große Vakuolen waren als Zeichen ihrer phagozytären Aktivität im

Abbildung 25.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch ATRA induzierten granulozytären Differenzierung der U937-Zellen. A.- und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden täglich durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt. ATRA hat einen hemmenden Effekt auf das Zellwachstum der U937-Zellen ohne groβen Einfluss auf die Viabilität. Dieser Effekt ist nicht so stark wie bei den NB4-Zellen. C.- Der Differenzierungsgrad der Zellen wurde am 3. Tag mittels FACS auf CD11b untersucht. Die U937-Zellen wurden durch ATRA differenziert, wie die Positivität der Zellen auf CD11b zeigte. D.- Die Differenzierung der Zellen wurde am 3. Tag mit der May-Grünwald-Giemsa-Färbung nach Zytospin festgestellt. Die durch ATRA-behandelten U937-Zellen hatten nach 3 Tagen eine ähnliche Morphologie wie die Granulozyten.

U937 cells + ATRAU937 cells - ATRA

0

5

10

15

20

25

30

0 24 48 72

Time (hours)

Cel

l con

cent

ratio

n (1

0 *5

/mL

)

U937 + ATRA U937 - ATRA

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 24 48 72Time (hours)

Via

bili

ty

U937 + ATRA U937 - ATRA

U937 cells

0 ,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

without ATRA W ith ATRA

post

ive

cells

to C

D11

bPE

A.-

B.-

C.-

D.-


Zytoplasm vorhanden. Der Kern war unregelmäßig und mit Faltenbildungen. Die durch

ATRA-differenzierten Zellen waren kleiner als die unreifen Zellen. Das Zytoplasma war

acidophil (rosa) und unregelmäßig. Der Kern war gelappt und das Chromatin kondensiert

(Abb. 28d).

Die Zellen wurden 0, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach Induktion der Differenzierung

geerntet und die mRNA- und Protein-Expression wurden mittels Northern und Western Blot

untersucht (Abb. 29a-b.). Die Expression von LAT2-mRNA und -Protein wurden während

des gesamten Versuchs herunterreguliert. Nach 72 Stunden hat diese Herunterregulation 60 %

(auf der mRNA-Ebene) und 70 % (auf der Protein-Ebene) der Grund-Expression der U937-

Zelllinie erreicht. Die Northern Blot-Membrane wurden mit einer Lysozym-Sonde als

Differenzierungskontrolle und mit einer GAPDH-Sonde als Ladekontrolle hybridisiert. β-


Abbildung 26.- LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in der granulozytären Differenzierung der U937-Zelllinie durch ATRA. A.- Die LAT2-mRNA Expression wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Northern Blot untersucht. Lysozym galt als Differenzierungsmarker und GAPDH wurde als Ladekontrolle benutzt. B.- Die LAT2-Protein-Expression wurde mittels Western Blot untersucht. LCL-GK ist eine B Zelllinie, die als Positivkontrolle für die Expression von LAT2-Protein galt. Die Expression der LAT2-mRNA und Protein wurde nach der ATRA-Behandlung der U937-Zellen herunterreguliert. Nach 6 Stunden wurde weniger Proteine im diesen Western Blot geladen.

A.-

B.-

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

U937

LAT2

GAPDH

EtBr

LYSOZYM

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

U937

LAT2

β-Actin

LCL-GK

A.-

B.-

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

U937

LAT2

GAPDH

EtBr

LYSOZYM

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

U937

LAT2

GAPDH

EtBr

LYSOZYM

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

U937

LAT2

β-Actin

LCL-GKATRA (10-6 M) - + + + + + -

Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

U937

LAT2

β-Actin

LCL-GK


4.4.3.- Regulation von LAT2-Protein in der ATRA-induzierten granulozytären

Differenzierung der HL60-Zelllinie.

Die myeloblastäre HL60-Zelllinie (Gallagher et al., 1979) wurde auch als sensitiv für ATRA

(Breitman et al., 1980) beschrieben. Die ATRA-induzierte granulozytäre Differenzierung der

HL60-Zelllinie wurde mit einer ATRA-Konzentration von 1 µM in 3 Gaben alle 24 Stunden

durchgeführt und das Medium wurde mit jeder Gabe gewechselt.

Zellwachstum und Viabilität wurde täglich mit der Trypan-Blau-Färbung bestimmt.

Dabei gab es am 3. Tag keine Veränderungen, weder im Zellwachstum (21,2 +/- 4,4 x 105

Zellen/ml in den unbehandelten vs. 18,6 +/- 6,1 x 105 Zellen/ml in den behandelten Zellen,

Abbildung 27.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch ATRA-induzierten granulozytären Differenzierung der HL60-Zellen. A.- und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden täglich durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt. ATRA hat einen leicht hemmenden Effekt auf das Zellwachstum der HL60-Zellen ohne groβen Einfluss auf die Viabilität der Zellen C.- Der Differenzierungsgrad der Zellen wurde am 3. Tag mittels FACS auf das CD11b Antigen untersucht. Obwohl der Effekt von ATRA auf die HL60-Zellen nicht so stark auf die Viabilität und das Zellwachstum war, wurden die Zellen teilweise differenziert wie die Positivität der Zellen auf CD11b zeigte. D.- Die Differenzierung der Zellen wurde am 3. Tag mit der May-Grünwald-Giemsa-Färbung nach Zytospin festgestellt. Die durch ATRA-behandelten HL60-Zellen hatten nach 3 Tagen eine ähnliche Morphologie wie die Granulozyten.

HL60 cells + ATRAHL60 cells - ATRA

0 ,0

5 ,0

10 ,0

15 ,0

20 ,0

25 ,0

30 ,0

0 2 4 4 8 7 2

Time (hours )

Cel

l con

cent

ratio

n (x

10*5

/ml)

H L60 + A TRA H L60 - A TRA

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 24 48 72

Time (hours )

Via

bilit

y

H L60 + A TRA HL60 - ATRA

HL60 cells

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

without ATRA With ATRA

post

ive

cells

to C

D11

bPE

A.-

B.-

C.-

D.-


Zellwachstum-Inhibition von 12,3 %) noch in der Viabilität (96,2 +/- 2,2 % in den

unbehandelten vs. 96,1 +/- 1,6 % in den behandelten Zellen) (Abb. 30a-b).

Im Gegenteil, die unbehandelten HL60-Zellen waren zu 14,7 +/- 11,7 % positiv auf

CD11b und die durch ATRA-behandelten HL60-Zellen waren zu 65,0 +/- 29,5 % positiv auf

das CD11b-Antigen mittels FACS-Analyse (Abb. 30c). Diese Daten haben gezeigt, dass die

HL60-Zellen durch ATRA in Granulozyten-ähnliche Zellen differenziert wurden. Die

Behandlung mit ATRA hat das Zellwachstum, Differenzierungsgrad und Viabilität dieser

Zelllinie nicht so stark beeinflusst wie in NB4- oder U937-Zellen.

Die unbehandelten HL60-Zellen hatten eine typische myeloblastäre Morphologie mit

einem sehr basophilen Zytoplasma. Der Kern war oval und die Chromatinstruktur

feinretikuliert. Die durch ATRA-differenzierten Zellen hatten eine reifere Morphologie mit

einem kondensierten, segmentierten Kern, teilweise basophilem Zytoplasma (rosa-blau) und

einen zentralen azidophilen Nukleolus. (Abb. 30d)

Die LAT2-mRNA- und -Protein-Expression wurden 0, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden

nach der Induktion der Differenzierung mittels Northern (Daten nicht gezeigt) und Western

Blot untersucht (Abb. 31). Die Expression des LAT2-Proteins wurde während des Versuches

transient herunterreguliert. Nach 24 Stunden hat die Herunterregulation das Maximum mit

55,7 % der Grundexpression der HL60-Zelllinie auf der Protein-Ebene erreicht. Nach 48 und

72 Stunden hatte die Expression des LAT2-Proteins aber wieder ca. 80 % der Expression auf

Tag 0 erreicht. β-Aktin wurde als Ladekontrolle im Western Blot benutzt. Im Northern Blot

wurde keine Herunterregulation festgestellt, da die Expression der LAT2-mRNA in der

HL60-Zelllinie insgesamt sehr niedrig war.

Abbildung 28.- LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in der granulozytären Differenzierung der HL60-Zelllinie durch ATRA. A.- Die LAT2-Protein-Expression wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Western Blot untersucht. Eine transiente Herunterregulation wurde auf der Protein-Ebene nachgewiesen. Das Maximumniveau der LAT2-Protein-Repression wurde 24 Stunden nach der ATRA-Behandlung erreicht.

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

HL60

LAT2

β-Actin

ATRA (10-6 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

HL60

LAT2

β-Actin


4.4.4.- Regulation von LAT2-mRNA und -Protein in der DMSO-induzierten

granulozytären Differenzierung der HL60-Zelllinie.

Die HL60-Zelllinie kann nach der Dimethylsulfoxide (DMSO) Behandlung sowohl in

Granulozyten-ähnliche-Zellen (Collins et al., 1978, , 1979) und auch in Monozyten-

Makrophagen-ähnliche-Zellen (Vorbrodt et al., 1979)- kontrolliert mit saurer Phosphatase-;

(Rhyner and Taetle, 1986) differenzieren.

Die DMSO-induzierte granulozytäre Differenzierung der HL60-Zelllinie wurde mit

einer Konzentration von 1,3 % in 3 Gaben alle 24 Stunden durchgeführt und das Medium

wurde mit jeder Gabe gewechselt.

Abbildung 29.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch DMSO-induzierten granulozytären Differenzierung der HL60-Zellen. A.- und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden täglich durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt. DMSO hat einen leicht hemmenden Effekt auf das Zellwachstum der HL60-Zellen ohne groβen Einfluss auf die Viabilität der Zellen C.- Der Differenzierungsgrad der Zellen wurde am 3. Tag mittels FACS auf das CD11b Antigen untersucht. Obwohl der Effekt von DMSO auf die HL60-Zellen nicht so stark auf die Viabilität und das Zellwachstum war, wurden die Zellen teilweise differenziert wie die Positivität der Zellen auf CD11b zeigte. D.- Die Differenzierung der Zellen wurde am 3. Tag mit der May-Grünwald-Giemsa-Färbung nach Zytospin festgestellt. Die durch DMSO-behandelten HL60-Zellen hatten nach 3 Tagen eine ähnliche Morphologie wie die Granulozyten.

HL60 cells + DMSOHL60 cells - DMSO

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

0 24 48 72

Time (hours)

Cel

l con

cent

ratio

n (1

0 *5

/mL

)

HL60 + DMSO HL60-DMSO

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 24 48 72

Time (hours)

Via

bilit

y

HL60 + DMSO HL60 - DMSO

HL60 cells

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

without DMSO with DMSO

post

ive

cells

to m

yello

id

mar

kers

CD11bPE CD11cPE

A.-

B.-

C.-

D.-


Zellwachstum und Viabilität wurde täglich mit Trypan-Blau-Färbung bestimmt. Es

gab schon am 2. Tag zwischen den DMSO-behandelten und den unbehandelten Zellen einen

Unterschied in der Zellwachstumskurve. Dieser Unterschied war am 3. Tag am gröβten (22,9

+/- 1,0 x 105 Zellen/ml in den unbehandelten vs 12,0 +/- 4,7 x 105 Zellen/ml in den

behandelten Zellen, Wachstums-Inhibition von 47,6 %). Dabei wurde keine Veränderung in

der Viabilität der Zellen festgestellt (93,4 +/- 1,5 % in den unbehandelten vs 92,0 +/- 0,6 % in

den behandelten Zellen) (Abb. 29a und 29b).

Die unbehandelten HL60 Zellen waren zu 14,7 +/- 11,7 % positiv auf CD11b und die

DMSO-behandelten Zellen zu 80,6 +/- 25,5 % positiv auf das CD11b-Antigen. Das reife

monozytäre Antigen CD11c wurde am 3. Tag durch FACS gemessen, um die monozytäre

Differenzierung der Zellen festzustellen. Die unbehandelten HL60-Zellen waren zu 6,8 +/- 4,8

% positiv auf CD11c und die DMSO-behandelten Zellen waren zu 31,5 +/-19,9 % positiv auf

das CD11c Antigen. Dies lässt zum Schluss zu, dass DMSO eine gemischt granulozytäre und

monozytäre Differenzierung der HL60-Zelllinie induziert (Abb. 29c).

Nach der May-Grünwald-Giemsa Färbung hatten die unbehandelten Zellen eine

typische myeloblastäre Morphologie (s. o. 4.5.4). Die DMSO-differenzierten HL60-Zellen

waren kleiner als die unbehandelten Zellen und hatten einen kondensierten und segmentierten

Kern (bis 3-4 Lobuli). Das Zytoplasma war basophil (hell blau) und sehr unregelmäßig mit

Segmentierungen (Abb. 29d).

Die LAT2-mRNA- und -Protein-Expression wurden 0, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden

nach der Induktion der Differenzierung mittels Northern und Western Blot untersucht. Die

Ergebnisse dieser Experimente waren inkonklusiv und deshalb werden sie nicht gezeigt.

4.4.5.- Regulation von LAT2-mRNA und Protein in der PMA-induzierten monozytären

Differenzierung der HL60-Zelllinie.

Die HL60-Zellen können in Monozyten differenzieren, wenn sie mit dem Phorbol-Ester PMA

behandelt werden (Huberman and Callaham, 1979; Rovera et al., 1979). Diese

Differenzierung von HL60-Zellen wurde benutzt, um die verschiedenen Schritte der

monozytären bzw. makrophagen Differenzierung zu untersuchen.

Die PMA-induzierte monozytäre Differenzierung der HL60-Zelllinie wurde mit einer

einmalige Gabe von 100 nM PMA durchgeführt und das Medium wurde 3 Tage nicht

gewechselt.


Zellwachstum und Viabilität wurden täglich mit Trypan-Blau-Färbung bestimmt.

Schon am 2. Tag gab es einen Unterschied in der Zellwachstumskurve zwischen den PMA-

behandelten und unbehandelten Zellen. Dieser Unterschied war am 3.Tag am größten (21,7

+/- 2,3 x 105 Zellen/ml in den unbehandelten vs 4,4 +/- 0,8 x 105 Zellen/ml in den behandelten

Zellen, Zellwachstum-Inhibition von 79,7 %). Ein leichter Einfluss (94,2 +/- 1,7 % in den

unbehandelten vs 82,1 +/- 8,0 % in den behandelten Zellen) wurde am 3. Tag durch PMA auf

die Viabilität der Zellen festgestellt (Abb. 30a und 30b.). Die Viabilität war jedoch nie unter

75 %. Die unbehandelten HL60-Zellen waren zu 14,7 +/- 11,7 % positiv auf CD11b und die

behandelten HL60-Zellen waren zu 82,5 +/- 11,6 % positiv auf CD11b. Das reife monozytäre

Antigen CD11c wurde am 3. Tag mittels FACS gemessen, um die monozytäre-macrophage

Differenzierung der Zellen zu bestimmen. Die unbehandelten HL60-Zellen waren zu 6,8 +/-

4,8 % positiv auf CD11c und die PMA-behandelten Zellen waren zu 90,8 +/- 1,7 % positiv

Abbildung 30.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch PMA-induzierten monozytären Differenzierung der HL60-Zellen. A.- und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden täglich durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt. Die PMA hat einen stark hemmenden Effekt auf das Zellwachstum der HL60-Zellen und hat einen geringen Einfluss auf die Viabilität der Zellen. C.- Der Differenzierungsgrad der Zellen wurde am 3. Tag mittels FACS auf das CD11b Antigen und auf das CD11c Antigen untersucht. Die HL60-Zellen wurden durch PMA nur in Monozyten-Makrophagen differenziert, weil die CD11b und CD11c Antigene gleich stark positiv waren. D.- Die Differenzierung der Zellen wurde am 3. Tag mit der May-Grünwald-Giemsa-Färbung nach Zytospin festgestellt. Die durch PMA-behandelten HL60-Zellen hatten nach 3 Tagen eine ähnliche Morphologie wie die Makrophagen.

HL60 cells + PMAHL60 cells - PMA

0

5

10

15

20

25

30

0 24 48 72Time (hours)

Cel

l con

cent

ratio

n (c

ells

x 1

0*5/

ml)

Hl60+ PMA HL60 - PMA

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 24 48 72

Time (hours)

Via

bilit

y

Hl60 + PMA HL60 - PMA

HL60 ce lls

0,0 %

2 0,0 %

4 0,0 %

6 0,0 %

8 0,0 %

10 0,0 %

without PMA with PMA

posi

tive

cells

to m

yello

id

mar

kers

CD11bPE CD11cPE

A.-

B.-

C.-

D.-


auf CD11c. PMA induzierte überwiegend eine monozytäre-macrophage Differenzierung der

HL60-Zellen (Abb. 30c).

Nach der May-Grünwald-Giemsa-Färbung hatten die unbehandelten Zellen eine

typisch myeloblastäre Morphologie wie in 4.5.4 beschieben wurde (s.o.). Die durch PMA

differenzierten Zellen hatten eine Macrophagen-ähnliche Morphologie. Die Zellen waren

größer als die unbehandelten Zellen und adhärent an die Kulturflasche. Das Zytoplasma war

sehr azidophil (rosa und blaue Flecken) und die Anwesenheit von Vakuolen zeigte

Phagozytose. Der Kern war oval und gelappt (Abb. 30d)

Die LAT2-mRNA und -Protein Expression wurden 0, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden

nach Induktion der Differenzierung mittels Northern und Western Blot untersucht (Abb. 31a-

b). Die Expression des LAT2-Gens wurde sowohl auf der mRNA- und als auch auf der

Protein-Ebene hochreguliert. Diese Hochregulation hatte 24 Stunden nach der Behandlung

mit PMA das Maximum mit einem 3,8-fachen der Grundexpression auf mRNA-Ebene

Abbildung 31.- LAT2-mRNA- und -Protein-Expression in der monozytären Differenzierung der HL60-Zelllinie durch PMA. A.- Die LAT2-mRNA-Expression wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Northern Blot untersucht. MPO wurde als myeloischer Differenzierungsmarker benutzt und das Ethidiumbromid-Bild als Ladekontrolle. B.- Die LAT2-Protein-Expression wurde mittels Western Blot untersucht. LCL-GK ist eine B Zelllinie, die als Positivkontrolle für die Expression des LAT2-Proteins galt. Die Inkubation der Membran mit einem β-Aktin-Antikörper wurde als Ladekontrolle benutzt. Das LAT2-Gen wurde durch die PMA-Behandlung der HL60-Zellen auf der mRNA- und auf der Protein-Ebene sehr stark hochreguliert.

A.-

B.-

PMA (10-7 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

HL-60

LAT2

MPO

EtBr

PMA (10-7M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

HL60

LAT2

β-Actin

LCL-GK

A.-

B.-

PMA (10-7 M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

HL-60

LAT2

MPO

EtBr

PMA (10-7M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

HL60

LAT2

β-Actin

LCL-GKPMA (10-7M) - + + + + + -Time (hrs) 0 6 12 24 48 72 72

HL60

LAT2

β-Actin

LCL-GK


erreicht. Diese Daten wurden mit den absoluten Werten der Densitometrie berechnet, da auch

die Expression von GAPDH- und β-Aktin-mRNA zum Teil reguliert war. Andererseits war

die Hochregulation des LAT2-Proteins 72 Stunden nach der Behandlung 4-fach höher als die

Grundexpression in HL60-Zellen. Die Membran des Northern Blots wurde mit einer MPO-

Sonde als Differenzierungskontrolle und Ethidiumbromid wurde als Ladekontrolle benutzt. β-


4.4.6.- Regulation von LAT2-Protein in der PMA-induzierten monozytären

Differenzierung der U937-Zelllinie.

Die U937-Zellen werden durch PMA-Behandlung in Monozyten-Makrophagen differenziert

(Dellagi and Brouet, 1984; Welgus et al., 1986). Die PMA-induzierte monozytäre

Differenzierung der U937-Zelllinie wurde mit einer Konzentration von 100 nM in 3 Gaben

alle 24 Stunden durchgeführt und das Medium wurde mit jeder Gabe gewechselt.

Zellwachstum und Viabilität wurden täglich mit der Trypan-Blau-Färbung bestimmt.

Am 3. Tag wurde ein Unterschied zwischen den PMA-behandelten und unbehandelten Zellen

in der Zellwachstumskurve (14,2 +/- 2,1 x 105 Zellen/ml in den unbehandelten vs 8,2 +/- 2,6 x

105 Zellen/ml in den behandelten Zellen, Zellwachstum-Inhibition von 42,2 %) beobachtet. In

der Viabilität der Zellen war am 3. Tag keine Veränderung zu beobachten (95,8 +/- 2,1 % in

den unbehandelten vs 94,7 +/- 1,5 % in den behandelten Zellen) (Abb. 32a-b).

Die unbehandelten U937-Zellen waren zu 28,1 +/- 4,5 % positiv und die durch PMA-

behandelten U937-Zellen waren zu 82,5 +/- 13,5 % positiv auf CD11b. Das CD11c-Antigen

wurde am 3. Tag durch FACS gemessen, um die monozytäre-macrophage Differenzierung

der Zellen zu bestimmen. Die unbehandelten U937-Zellen waren zu 8,2 +/- 0,9 % positiv und

die mit PMA-behandelten Zellen waren zu 81,7 +/- 14,2 % positiv auf CD11c-Antigen. PMA

induzierte überwiegend eine monozytäre Differenzierung der U937-Zelllinie (Abb. 32c).


Nach der May-Grünwald-Giemsa-Färbung hatten die unbehandelten Zellen eine

monoblastäre Morphologie wie in 4.5.2 beschrieben wurde (s.o.). Die durch PMA

differenzierten U937-Zellen hatten eine Monozyten-ähnliche Morphologie mit bilobulären

gelappten Kernen und teilweise basophilen Zytoplasma (rosa-blau). Die Zellen hatten auch

kleine Vakuolen durch Phagozytose im Zytoplasma und waren leicht adhärent an die

Kulturflasche (Abb. 32d).

Die mRNA- und Protein-Expression wurden 0, 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach

Induktion der Differenzierung mittels Northern und Western Blot (Daten nicht gezeigt)

untersucht. Die Expression von LAT2 war transient hochreguliert auf der mRNA-Ebene.

Nach 24 Stunden hatte diese Hochregulation das Maximum mit einem 2,4-fachen der

Expression der nicht-behandelten U937-Zellen auf der mRNA-Ebene erreicht. Die GAPDH-

mRNA war am 3. Tag auch leicht reguliert. Die Membran des Northern Blots wurde mit einer

Abbildung 32.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch PMA-induzierten monozytären Differenzierung der U937-Zellen. A.- und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden täglich durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt. Die PMA hat einen stark hemmenden Effekt auf das Zellwachstum der U937-Zellen und hat einen geringen Einfluss auf die Viabilität der Zellen. C.- Der Differenzierungsgrad der Zellen wurde am 3. Tag mittels FACS auf das CD11b Antigen und auf das CD11c Antigen untersucht. Die U937-Zellen wurden durch PMA nur in Monozyten-Makrophagen differenziert, weil die CD11b und CD11c Antigene gleich stark positiv waren. D.- Die Differenzierung der Zellen wurde am 3. Tag mit der May-Grünwald-Giemsa-Färbung nach Zytospin festgestellt.

U937 cells + PMAU937 cells - PMA

0

4

8

12

16

20

0 24 48 72

Time (hours)

Cel

l con

cen

tratio

n (c

ells

x10*

5/m

l)

U937 + PMA U937 - PMA

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 24 48 72

Time (hours)

Via

bili

ty

U937 + PMA U937-PMA

U937 cells

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

without PMA with PMA

post

ive

cells

to m

yello

id

mar

kers

CD11bPE CD11cPE

A.-

B.-

C.-

D.-


Lysozym-Sonde als Differenzierungskontrolle und mit einer GAPDH-Sonde als

Ladekontrolle hybridisiert. Diese Hochregulation der LAT2-mRNA konnte nicht auf der

Protein-Ebene bestätigt werden. Diese Experimente werden im Rahmen der Doktorarbeit von

Fr. Leticia Solari wiederholt.

4.4.7.- Expression von LAT2-Protein bei der Hemin-induzierten erythrozytären

Differenzierung der K562-Zelllinie.

Die K562 Zelllinie ist eine erythroleukämische Zelllinie, die spontan Hämoglobin bildet

(Andersson et al., 1979) und die das erythrozytäre Antigen Glykophorin auf ihrer Membran

trägt. Die Zellen produzieren nach der Behandlung mit Hemin embryonales und foetales

Hämoglobin und differenzieren in Vorstufen der erythrozytären Reihe (Rutherford et al.,

1981).

Abbildung 33.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch Hemin-induzierten erythrozytären Differenzierung der K562-Zellen. A.- und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden täglich durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt. Hemin in 25 µM und 50 µM Konzentrationen hat einen hemmenden Effekt auf das Zellwachstum der K562-Zellen ohne die Viabilität der Zellen zu beeinflussen. C.- Der Differenzierungsgrad der Zellen wurde am 3. Tag mittels Benzidin-Färbung bestimmt. Die unbehandelten K562-Zellen waren leicht positiv für Benzidin aber die mit Hemin-behandelten Zellen waren noch positiver als die unbehandelten Zellen. D.- Benzidin-Färbung von den Zellen wurde am 3.Tag nach Zytospin gemacht.

K562 - Hemin K562 + 50 µM Hemin

K562 +/- Hemin (Day 3)

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

K562 K562+ 25µM Hemin K562 + 50 µM Hemin

% p

ositi

ve c

ells

to B

enzi

dine

Sta

inin

g

0,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

0 24 48 72

Time (hrs)

Cel

l co

ncen

tra

tion

(ce

lls x

10

*5/m

l)

K562 untreated K562 + 25 microM Hemin K562 + 50 microM Hemin

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 24 48 72Time (hrs)

Via

bili

ty

K562 untreated K562 + 25 microM Hemin K562 + 50 microM Hemin

A.-

B.-

C.-

D.-


Die Hemin-induzierte erythrozytäre Differenzierung der K562-Zelllinie wurde mit

einer Hemin-Konzentration von 25 und 50 µM in 3 Gaben alle 24 Stunden durchgeführt und

das Medium wurde mit jeder Gabe gewechselt.

Das Zellwachstum und die Viabilität wurden täglich mit der Trypan-Blau-Färbung

bestimmt. Am 3. Tag gab es schon einen Unterschied zwischen den Hemin-behandelten und

den unbehandelten Zellen in der Zellwachstumskurve zu beobachten (12,2 +/- 1,4 x 105

Zellen/ml in den unbehandelten vs 9,5 +/- 1,6 x 105 Zellen/ml in den mit 25 µM Hemin

behandelten, Zellwachstum-Inhibition von 22,1 %; bzw 5,7 +/- 2,3 x 105 Zellen/ml in den mit

50 µM Hemin behandelten Zellen, Zellwachstum-Inhibition von 53,3 %) (Abb. 33a). In der

Viabilität der unbehandelten und mit 25 µM Hemin behandelten Zellen wurde am 3. Tag

keine Veränderung festgestellt (95,6 +/- 0,7 % in den unbehandelten vs 92,0 +/- 2,8 % in den

behandelten K562-Zellen). Einen geringen Unterschied in der Viabilität gab es am 3. Tag

zwischen den unbehandelten Zellen und den mit 50 µM Hemin-behandelten Zellen (76,7 +/-

9,9 %) (Abb. 33b).

Um die Differenzierung zu bestätigen, wurden die Zellen nach Zytospin mit Benzidin

gefärbt. Bei der Benzidin-Färbung wird Hämoglobin durch Wasserstoffperoxid oxidiert und

durch Benzidin kommt es zu einer Blaufärbung. Die Zellen wurden auf Benzidin-Positivität

in einer Neubauer-Zählkammer unter dem Mikroskop gezählt. Die unbehandelten K562-

Zellen waren am 3. Tag zu 1,4 +/- 0,8 % positiv, die durch 25 µM Hemin behandelten K562-

Zellen waren zu 81,0 +/- 5,8 % positiv, und die durch 50 µM Hemin behandelten K562-

Zellen waren zu 92,4 +/- 2,0 % positiv auf Benzidin (Abb. 33c-d). Mit diesen Daten konnte

bestätigt werden, dass Hemin in einer Konzentration von 25 und 50 µM die K562-Zellen

Hämoglobin-Bildung induziert.

Abbildung 34.- LAT2-Protein-Expression während der durch Hemin induzierten erythrozytären Differenzierung der K562 Zelllinie. A.- Die LAT2 Protein-Expression wurde alle 24 Std. und nach 25 µM und 50 µM Hemin mittels Western Blot untersucht. Die U937-Zelllinie wurde als Positivkontrolle für die Expression des LAT2-Proteins benutzt. Die K562-Zelllinie hatte keine Grundexpression des LAT2-Proteins und dieses wird auch nicht während der erythrozytären Differenzierung der K562-Zellen hochreguliert

A.- B.-

LAT2

ß-Actin

Hemin (µM) 0 25 50

K562 (day 3)

U937

LAT2

ß-Actin

Time (hours) 0 24 48 72

Hemin 50 µM - + + +

K562A.- B.-

LAT2

ß-Actin

Hemin (µM) 0 25 50

K562 (day 3)

U937

LAT2

ß-Actin

Time (hours) 0 24 48 72

Hemin 50 µM - + + +

K562


K562-Zellen wurden 0, 24, 48 und 72 Stunden nach Induktion der Differenzierung und

nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationenen von Hemin (0, 25, 50 µM)

untersucht. Protein wurde aus den Zellen isoliert und nach LAT2-Expression mittels Western

Blots untersucht. Die K562-Zellen exprimierten kein LAT2-Protein und die Expression dieses

Proteins war bis zum 3. Tag und zu verschiedenen Zeitpunkten mit 25 und 50 µM Hemin

nicht hochreguliert (Abb. 34a-b).

Diese Daten zeigen, dass LAT2 in einer erythroleukämischen Zelllinie nicht auf

Protein-Ebene exprimiert wird und auch bei der erythrozytären Differenzierung nicht reguliert

wird.

4.4.8.- Expression von LAT2-Protein in der PMA-induzierten megakaryozytären

Differenzierung der K562-Zelllinie.

Abbildung 35.- Untersuchung des biologischen Effektes der durch PMA-induzierten megakaryozytären Differenzierung der K562-Zellen. A.- und B.- Zellwachstum und Viabilität wurden täglich durch Trypan-Blau-Färbung bestimmt. PMA, wenn in einer Konzentration von 10 nM und 100 nM gegeben, hatte einen stark hemmenden Effekt auf das Zellwachstum der K562-Zellen. Außerdem wurde die Viabilität der Zellen leicht beeinflusst. C.- Der Differenzierungsgrad der Zellen wurde am 3.Tag mittels FACS auf CD41b und CD61c Anitgene untersucht. Die mit PMA-behandelten Zellen zeigten eine sehr starke Positivität auf die Megakaryozytenmarker CD41b und CD61c. D.- Die Differenzierung der Zellen wurde am 3. Tag mit der May-Grünwald-Giemsa-Färbung nach Zytospin morphologisch untersucht.

K562 - PMA K562 + 50 µM PMA

K562+/- PMA (Day 3)

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

K562 K562 + 10 nM PMA K562 + 100 nMPMA

% p

ositi

ve c

ells

to m

egac

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cytic

m

arke

rs

CD41PE CD61FITC

0,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

0 24 48 72

Time (hrs)

Cel

l con

cen

tratio

n (c

ells

x 1

0*5

/ml)

K562 untreated K562 + 10 nM PMA K562 + 100 nM PMA

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

0 24 48 72

Time (hrs)

Via

bili

ty

K562 untreated K562 +10 nM PMA K562 + 100 nM PMA

A.-

B.-

C.-

D.-


Die K562-Zelllinie kann in die megakaryozytäre Reihe differenzieren, wenn sie mit

Phorbol-Ester (PMA) kultiviert wird (Tetteroo et al., 1984) und exprimiert nach der PMA-

Behandlung die megakaryozytären Antigene CD41b (Integrin alpha IIb) und CD61c (Integrin

beta III)

Das Zellwachstum und die Viabilität wurden täglich mit der Trypan-Blau-Färbung

bestimmt. Am 3. Tag gab es einen Unterschied zwischen den mit PMA-behandelten und

unbehandelten Zellen in der Zellwachstumskurve (12,2 +/- 1,4 x 105 Zellen/ml in den

unbehandelten Zellen vs 1,1 +/- 0,5 x 105 Zellen/ml in den mit 10 nM PMA-behandelten

Zellen, Zellwachstum-Inhibition von 91,0 %; vs 1,3 +/- 0,4 x 105 Zellen/ml in den mit 100 nM

PMA-behandelten Zellen, Zellwachstum Inhibition von 89,3 %) (Abb. 35a). Die Viabilität

der unbehandelten und der mit PMA-behandelten Zellen unterschied sich am 3. Tag

geringfügig (95,6 +/- 0,7 % in den unbehandelten vs 84,2 +/- 5,8 % in den mit 10 nM PMA-

behandelten Zellen vs 82,0 +/- 5,9 % in den mit 100 nM PMA-behandelten Zellen) (Abb.

35b).

Um die durch PMA-induzierte megakaryozytäre Differenzierung der K562-Zellen zu

quantifizieren, wurden die Zellen am 3. Tag auf die Megakaryozytärmarker CD41b und

CD61c mittels FACS untersucht. Die unbehandelten K562-Zellen waren zu 2,0 +/- 1,2 %

positiv, die mit 10 nM PMA-behandelten K562-Zellen zu 26,2 +/- 11,3 % positiv und die mit

100 nM PMA-behandelten K562-Zellen zu 37,9 +/- 9,6 % positiv für CD41b. Die

unbehandelten K562-Zellen waren zu 3,2 +/- 2,0 % positiv, die mit 10 nM PMA-behandelten

K562-Zellen zu 45,5 +/- 12,8 % positiv und die mit 100 nM PMA-behandelten K562 Zellen

zu 50,8 +/- 14,4 % positiv für CD61c. Mit diesen Daten konnte bestätigt werden, dass die

K562-Zellen sich durch PMA-Behandlung zu Megakaryozyten differenzieren lassen (Abb.

35c).

Nach der May-Grünwald-Giemsa-Färbung hatten die unbehandelten K562 Zellen eine

typische erythroleukämische Morphologie mit einem unregelmäßigen Zytoplasma, das

überwiegend basophil war. Der Kern war unregelmäßig und hatte eine lockere

Chromatinstruktur. Die mit PMA-differenzierten K562-Zellen hatten zum Teil eine

charakteristische Polyploidie. Das Zytoplasma war überwiegend azidophil und teilweise

waren Vakuolen vorhanden (Abb. 35d).

Die Expression des LAT2-Proteins wurde am 3. Tag nach der Behandlung mit 10 nM

und 100 nM PMA Konzentration und jeden Tag nach der Behandlung mit 100 nM PMA

mittels Western Blot untersucht (Abb. 36a-b).


Die K562-Zelllinie hat keine oder eine niedrige Expression des LAT2-Proteins und die

Expression wurde weder mit Hemin (25 µM und 50 µM) (Abb. 34) in der erythrozytären

Differenzierung noch mit PMA (10 nM und 100 nM) (Abb. 36) in der megakaryozytären

Differenzierung der K562-Zellen gesteigert. Diese Daten wurden bei der Untersuchung des

gleichen Versuchs mit Hilfe von Affymetryx-Microarrays auf mRNA-Ebene bestätigt

(Ergebnisse der Doktorarbeit von cand. med. Lena Kasten, in Zusammenarbeit mit Dr.

Dietmar Pfeiffer der Abteilung I der Inneren Medizin, Uniklinikum Freiburg).

Die K562-Zelllinie hat nach der DSMZ (www.dsmz.de) den folgenden Karyotyp:

"human hypotriploid karyotype without sharp mode -61-68<3n>XX, -X, -3, +7, -13, -18,

+3mar, del(9)(p11/13), der(14)t(14;?)(p11;?), der(17)t(17;?)(p11/13;?),

der(?18)t(15;?18)(q21;?q12), del(X)(p22)". Bisher wurde in den K562-Zellen keine Deletion

des langen Arms von Chromosom 7 und damit des LAT2-Gens, 7q11.23, beschrieben.

Deshalb ist es anzunehmen, dass das LAT2-Protein (Western Blot Ergebnisse) und -

mRNA (Affymetrix Chips) in der erythroleukämischen Zelllinie K562 nicht exprimiert wird

und keine Regulation des LAT2-Gens in der erythrozytären und in der megakaryozytären

Differenzierung diese Zelllinie stattfindet.

Abbildung 36.- LAT2-Protein-Expression in der megakaryozytären Differenzierung der K562-Zelllinie durch PMA. A.- Die LAT2-Protein-Expression wurde alle 24 Stunden nach der Behandlung mit einer Konzentration von 10 nM und 100 nM PMA mittels Western Blot untersucht. Die U937-Zelllinie wurde als Positivkontrolle für die Expression von LAT2-Protein benutzt. Die K562-Zelllinie hatte keine Grundexpression des LAT2-Proteins und wird auch nicht während der mit PMA-induzierten megakaryozytären Differenzierung der K562 Zellen hochreguliert

A.- B.-

LAT2

ß-Actin

PMA (nM) 0 10 100

K562 (day 3)

U937

LAT2

ß-Actin

Time (hours) 0 24 48 72

PMA 100 nM - + + +

K562

U937

A.- B.-

LAT2

ß-Actin

PMA (nM) 0 10 100

K562 (day 3)

U937

LAT2

ß-Actin

PMA (nM) 0 10 100

K562 (day 3)

U937

LAT2

ß-Actin

Time (hours) 0 24 48 72

PMA 100 nM - + + +

K562

U937


4.5.- Expression von LAT2-Protein in humanen primären Zellen.

Um die Daten unserer Myeloiddifferenzierungsversuche in primären Zellen zu

validieren, wurden verschiedene primären Blutzellen (Granulozyten, Lymphozyten und

Monozyten) und Alveolar-Makrophagen (als reife Form von Monozyten) isoliert und die

LAT2-Protein Expression wurde mittels Western Blot untersucht.

In Granulozyten und Blutlymphozyten war die Expression des LAT2-Proteins

abwesend und in Monozyten war die Expression des LAT2-Proteins hoch (Abb. 37). Die

Expression des LAT2-Proteins in den alveolären Makrophagen war stärker als in den

Monozyten des gleichen Spenders. Die stärkere Expression von LAT2-Protein in den

alveolären Makrophagen zusammen mit den Daten der monozytären-makrophagen-

Differenzierung von HL60-Zellen und monozytären Differenzierung von U937-Zellen, lässt

eine Funktion vom LAT2 in diesen Zellen auf die Differenzierungsfähigkeit der Monozyten

vermuten.

Abbildung 37.- LAT2-Protein-Expression in primären Blutzellen und alveolären Makrophagen. Nach der Isolation von Protein wurde die LAT2-Protein-Expression mittels Western Blot untersucht. Die U937-Zelllinie wurde als Positivkontrolle für die Expression von LAT2-Protein benutzt. Die Monozyten exprimierten das LAT2-Protein. Die alveolären Makrophagen hatten eine stärkere Expression als die Monozyten. Die Blutlymphozyten und die Granulozyten zeigten keine Expression des LAT2-Proteins.

Lympho. Mono. Gran. U937Mono. BAL

LAT2

ß-Actin

Patient Gesunde Spender

Lympho. Mono. Gran. U937Mono. BAL

LAT2

ß-Actin

Patient Gesunde Spender


4.6.- Regulation von LAT2-Protein in der granulozytären und monozytären-

dendritischen Differenzierung der CD34 + Zellen durch Zytokine.

Nach dem Auftauen wurden die CD34+ Zellen in serumfreiem Medium kultiviert, das

mit den Zytokinen FLT3-Ligand, SCF, IL-3 und IL-6 versetzt wurde.

Die granulozytäre Differenzierung der CD34 +-Zellen wurde mit 50 Einheiten/mL G-CSF

durchgeführt und die monozytär-dendritische Differenzierung wurde mit 50 Einheiten/ml

GM-CSF + 50 Einheiten/ml IL-4 induziert. Die Zellen wurden zu mehreren Zeitpunkten

mittels FACS auf bestimmte Differenzierungsantigene untersucht. Zytospins wurden nach

May-Grünwald-Giemsa gefärbt, um morphologische Veränderung der Zellen nach der

monozytären bzw. granuloytären Differenzierung nachzuweisen. Es wurde Protein für

Western Blots isoliert und die Expression des LAT2-Proteins untersucht.

Die Expression vom LAT2-Protein war in beiden Induktionen am 3. und 7. Tag

transient hochreguliert und am 14. Tag herunterreguliert (s. Abbildung 38). Die Expression

Abbildung 38.- LAT2-Protein-Expression in der myeloischen Differenzierung von normalen CD34+ Zellen. A. Die isolierten normalen CD34+ wurden kultiviert und mit den Zytokinen G-CSF und GM-CSF + IL-4 jeweils granulozytär oder monozytär-DC differenziert. U937 wurde als Positivkontrolle für die Expression vom LAT2-Protein benutzt. Eine transient Hochregulation des LAT2-Proteins wurde am 3. und 7. Tag in beiden Differenzierungsmodellen nachgewiesen. Am Tag 14 war die Expression des LAT2-Proteins in den G-CSF behandelten Zellen niedriger und in den GM-CSF+ IL-4 behandelten Zellen stärker ausgeprägt. B. Cytospins wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gemacht und mit May-Grünwald-Giemsa gefärbt, um morphologische Veränderungen der Zellen nachzuweisen

A

Day 0 3 7 14 3 7 14

CD34+ cells

LAT2

ß-Actin

Cytokine + G-CSF + GMCSFCocktail and IL4

U937Day 0 3 7 14 3 7 14

CD34+ cells

LAT2

ß-Actin

Cytokine + G-CSF + GMCSFCocktail and IL4

U937

B

Day 0 Day 7 + G-CSF Day 14 + G-CSF Day 7 + GM-CSFand IL4

Day 14 + GM-CSFand IL4


des LAT2-Proteins war am 14. Tag in den durch G-CSF differenzierten Zellen niedriger als

in den Zellen, die durch GM-CSF und IL-4 differenziert wurden. Die Zellen, die ohne G-CSF,

GM-CSF und IL-4 behandelt wurden, hatten am Tag 14 eine höhere Expression als die mit G-

CSF behandelten Zellen und niedriger als die mit GM-CSF und IL-4 behandelten Zellen

(Daten nicht gezeigt). Die Hochregulation vom LAT2-Protein in der ex vivo Differenzierung

der CD34+ Zellen korreliert und bestätigt unsere Daten der monozytären bzw. granulozytären

Differenzierung der NB4-, HL60- und U937-Zelllinien.

5.- Diskussion Seite - 114 -

5.- Diskussion

Das Fusionsprotein AML1/ETO

Der molekulare Pathomechanismus des chimären Fusionsproteins AML1/ETO beruht auf der

Rekrutierung von HDACs an die Promotoren seiner Zielgene (Amann et al., 2001; Gelmetti et

al., 1998). Diese modifizieren die Acetylierung der Lysin- und Arginin-Reste von Histonen,

wodurch des Chromatins in eine geschlossene Struktur umgewandelt wird. So wird die

Transkription der AML1/ETO-Zielgene gehemmt, die überwiegend eine wichtige Rolle

während der Hämatopoese spielen und für verschiedene Schritte der Reifung

hämatopoetischer Zellen notwendig sind. Während der Durchführung dieser Doktorarbeit

wurde ein Artikel veröffenlicht, in dem ein Komplex aus AML1/ETO mit DNMT1 auf dem

Promotor von IL-3-Gen in AML1/ETO-positiven Zelllinien und primären AML-Blasten

identifiziert wurde (Liu et al., 2005).

Epigenetische Regulation vom LAT2-Gen durch AML1/ETO

Das LAT2- (NTAL/LAB/WBSCR5) Gen wurde als ein Zielgen in der AG.von Prof. Lübbert

in AML1/ETO-induzierbaren Zellen identifiziert (Fliegauf et al., 2004). Anderen Autoren

haben dieses Ergebnis nach Untersuchung mit Affymetrix Arrays des Transkriptoms der

Blasten von einer groβen Patientenzahl bestätigt (Fliegauf et al., 2004; Ross et al., 2004; Valk

et al., 2004b). In dieser Arbeit wurden funktionelle Untersuchungen an LAT2 durchgeführt,

um seine Rolle während der Myelopoese und während der Entstehung der AML aufzuklären.

Zuerst wurde die Repression von LAT2 durch AML1/ETO auf Protein-Ebene in 9/14/18-

Zellen, AML1/ETO-positiven Zelllinien und in Knochenmarksproben von AML-Patienten

untersucht. In Anwesenheit von AML1/ETO ist die LAT2-Expression sowohl in vitro

(AML1/ETO-induzierbare Zellen und Kasumi-1) als auch in vivo (Blasten von AML-

Patienten) stark reprimiert. Zusätzlich ist die LAT2-Protein-Expression in

Knochenmarksproben von Patienten mit Aberrationen von Chromosom 7 (n=3) und in

Patientenproben mit t(15;17) (n=4) nicht exprimiert. Das könnte auf eine Funktion von LAT2

als Tumorsuppressor-Gen in der Entstehung der AML hindeuten. Da das LAT2-Gen nur in

einer Kopie bei den Patienten mit Aberrationen von Chromosom 7 (chomosomale

Lokalisation 7q11.23) vorliegt, könnte dieses durch epigenetische Depression oder nonsense

Mutationen nicht exprimiert werden und dadurch die Entstehung einer AML begünstigen. Um

diese Fragestellung zu beantworten, sollen Mikrodeletionen im Bereich des LAT2-Gens

mittels SNPs-Arrays in den KM-Proben von diesen Patienten untersucht werden. LAT2 war

jedoch in 14 von 15 KM-Proben von Patienten mit Normalkaryotyp vorhanden. Das zeigte,


dass LAT2-Repression mit verschiedenen chromosomalen und genetischen Aberrationen

korreliert.

Nach der FAB-Klassifikation haben AML-Blasten mit einer myeloblastären (FAB M2) und

promyelozytären Morphologie (FAB M3) keine oder niedrige LAT2-Expression und die

Patienten mit einer frühe myeloblastäre (FAB M1) und myelomonozytären Morphologie

(FAB M4) eine normale oder hohe LAT2-Expression. Das bestätigt wiederum die Daten der

myeloischen Differenzierungsversuche, bei denen die LAT2-Expression während der

granulozytären Differenzierung herunterreguliert aber während der monozytären

Differenzierung hochreguliert wird.

Die LAT2-Expression wurde in KM-Patientenproben bei der Diagnose und bei der Komplett-

Remissionskontrollen von 2 Patienten mit inv(16) untersucht. Mittels Western Blot wurde das

LAT2-Protein nur in den Knochenmarksproben bei der Diagnose detektiert. Dies zeigt, dass

LAT2-Expression nur in einem pathologischen KM zu finden ist und die LAT2-Repression

sehr wahrscheinlich in Patienten mit t(8;21), t(15;17) und Aberrationen von Choromosom 7

aus den AML-Blasten entsteht. Außerdem wurde in den klinischen Daten der Patienten kein

Unterschied festgestellt.

In Kollaboration mit PD. Dr. O. Heidenreich (Universität von Tübingen), der ein Knock-

Down-System von AML1/ETO mittels siRNAs in der Kasumi-1-Zelllinie entwickelt hat

(Heidenreich et al., 2003), wurde die Expression von LAT2-mRNA untersucht. Nach der

ersten und zweiten Elektroporation mit den siRNAs gegen AML1/ETO wurde eine 4,5- und

9,5-fache Hochregulation von LAT2-mRNA mit "real-time" RT-PCR nachgewiesen. Dieses

Ergebnis deutet an, dass LAT2 auch in diesem System ein transkriptionelles AML1/ETO-

Zielgen ist und dass LAT2-mRNA nach dem Knock-Down von AML1/ETO in Kasumi-1-

Zellen re-exprimiert werden kann. Mit diesem AML1/ETO Knock-down System wurden

andere transkriptionelle AML1/ETO-Zielgene nachgewiesen, die Funktionen bei der

myeloischen Differenzierung haben, die ein antiproliferatives Potential haben oder die mit

einer schlechteren Prognosen korreliert sind (Dunne et al., 2006). Interessanterweise wurde

bei 3 dieser Gene (BPI, IGFBP7 und SLA) die Bindung vom AML1/ETO am Promotor mit

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Assays bestätigt. Es wäre sinvoll zu untersuchen, ob

die Bindung von AML1/ETO am LAT2-Promotor in den 9/14/18-Zellen (AML1/ETO-

induzierbaren Zellen) und Kasumi-1-Zellen mit ChIP Assay detektiert werden kann.

Die nächste Fragestellung war, ob der AML1/ETO-Effekt auf die Expression von LAT2

pharmakologisch gehemmt werden kann. Da AML1/ETO HDACs und DNMTs zu den

Promotoren der Zielgene rekrutiert, wurde untersucht, ob LAT2-mRNA nach der Behandlung


mit HDAC- und DNMT-Inhibitoren in Kasumi-1 Zellen re-exprimiert wird. Unterschiedliche

Effekte wurden bei der Expression von LAT2 nach der Behandlung mit verschiedenen

HDAC-Inhibitoren beobachtet. Das Benzamid-Derivat MS-275 (SDX-275®) hatte den

stärksten Effekt auf die Re-expression der LAT2-mRNA bei equitoxischen Konzentrationen

der Substanzen. Equitoxische Konzentrationen wurden in dieser Arbeit definiert, als die

Konzentration, bei der ein Effekt auf Histon-Acetylierung mit Western Blot detektiert wurde

und die Zellen über 80% Viablilität hatten. Dem unterschiedlichen Effekt von HDAC-

Inhibitoren könnte zugrunde liegen, dass jeder HDAC-Inhibitor nur bestimmte HDACs oder

eine HDAC-Klasse bindet und inhibiert. MS-275 blockiert HDAC-Klasse I (HDAC1-3) mit

einer ähnlichen IC50 Konzentration wie TSA, kann aber im Gegenteil zu TSA HDAC 8 nicht

inhibieren (Hu et al., 2003). Andere Proteine (wie Transkriptionsfaktoren) können außerdem

durch HDAC-Inhibitoren abgezielt werden und ihre Funktion bzw. Expression beeinflusst

werden (Lin et al., 2006)

In einem grundlegenden Artikel wurde gezeigt, dass HDAC-Inhibitoren (z. B. TSA) in

Kombination mit DNMTs-Inhibitoren (z. B. Decitabine) einen synergistischen Effekt auf die

Re-expression reprimierter Gene in Tumorzellen haben (Cameron et al., 1999). In dieser

Arbeit wurde der DNMT-Inhibitor Decitabine in Kombination mit dem HDAC-Inhibitor MS-

275 benutzt, um einen synergistischen Effekt auf die Re-expression von LAT2 in Kasumi-1-

Zellen zu erzielen. MS-275 wurde für diese Fragestellung ausgewählt, weil er der effektivste

HDAC-Inhibitor auf die Re-expression von LAT2 in dem vorigen Versuchen war. MS-275

(100 nM) in Kombination mit einer 3-tägigen Decitabine Behandlung (25 oder 50 nM) hatte

einen synergistischen Effekt auf die LAT2-mRNA Re-expression. Dieses Ergebnis zeigte,

dass eine Kombination von HDAC-Inhibitoren und DNMT-Inhibitoren bei der Behandlung

von AML-Patienten eingesetzt werden könnte, bei denen die AML durch eine aberrante

Rekrutierung von HDACs und/oder DNMTs auf Zielgene verursacht wird. Es wurde in dieser

Arbeit gezeigt, dass Tumorsuppressor-Gene (wie z. B. MLH1, TIMP-3, p15 und p16), deren

Promotoren hypermethyliert sind, in der Kombination mit einem HDAC-Inhibitor und einem

DNMT-Inhibitor in Tumorzellen re-exprimiert werden können (Cameron et al., 1999). Nach

einer Expression-Analyse mit Affymetrix Arrays wurden mehrere Gene gefunden, deren

Expression durch die Kombination von DNMT- und HDAC-Inhibitor synergistisch in

Kolonkarzinom-Zelllinien re-exprimiert werden konnten. Allerdings wurde der Promotor von

der Hälfte der Gene als hypermethyliert gefunden (Suzuki et al., 2002). Es wurde

veröffentlicht, dass nur 50 % der Gene, deren Expression durch Decitabine induziert wurde,

eine putative CpG-Insel hatten. Von diesen Genen wurde nur Demethylierung am Promotor


des Myeloperoxidase (MPO) Gens nach Decitabine-Behandlung nachgewiesen (Schmelz et

al., 2005). Nach Anfertigung dieser Doktorarbeit wurde der Methylierungsstatus des LAT2-

Promotors von unserer Arbeitsgruppe mittels Bisulfit-Sequenzierung in Kasumi-1-Zellen

untersucht. Dabei wurde herausgefunden, dass über 95 % der CpG-Dinukleotide nicht-

methyliert waren. Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass Decitabine die

Expression von Genen, unter diesen das LAT2-Gen, durch einen anderen Mechanismus als

DNA-Methylieurung beeinflusst.

Es wurde untersucht, ob die durch AML1/ETO-vermittelte Repression von LAT2 mit

epigenetisch aktiven Substanzen aufgehoben werden kann und ob der LAT2-Promotor

epigenetisch beeinflussbar ist. Dafür wurden Chromatin-Immunopräzipition (ChIP) mit

Antikörpern gegen die aktivierenden Histon-Markierung Acetyl-Histon-H3 (AcH3), Acetyl-

Histon-H4 (AcH4), Acetyl-Histon-H3-Lysin-9 (AcH3K9) und Tri-Methyl-Histon-H3-Lysin-4

(3meH3K4) durchgeführt. Anschließend wurde die isolierte-DNA mit einer "real-time"-DNA-

PCR quantifiziert. 3meH3K4 spielt eine sehr wichtige Rolle als Bindeglied zwischen Histon-

Acetylierung und -Methylierung, da die Histon-Methyltransferase MLL4 nach der

Acetylierung von Histon-H3 durch HDAC-Inhibitoren diesen spezifischen Lysin-Rest von

Histone-H3 methyliert (Nightingale et al., 2007). Wir haben nachgewiesen, dass AcH3,

AcH3K9 und 3meH3K4, aber nicht AcH4, nach der Behandlung mit MS-275 auf dem LAT2-

Promotor in Kasumi-1-Zellen induziert wurden. Da p21WAF-mRNA durch HDAC-Inhibitoren

hochreguliert wurde (Richon et al., 2000) und als Positivkontrolle dieser Art von Behandlung

von verschiedenen Autoren benutzt wird, haben wir mittels ChIP die gleichen aktivierenden

Histon-Markierungen auf diesem Promotor untersucht. Ähnliche Ergebnisse wurden

nachgewiesen. Acetylierung von Histon H4 wurde in diesen Versuchen nicht induziert,

obwohl die Gesamt-Acetylierung von Histon H4 mittels Western Blot als hochreguliert

gefunden wurde (Ergebnisse nicht gezeigt). Es könnte sein, dass die Acetylierung von

Histon-H4 für die Expression von LAT2 und p21WAF nicht notwendig ist, der Antikörper für

Histon H4 nicht für ChIP, jedoch für Western Blot geeignet ist (obwohl Unterschiede

zwischen den Kasumi-1 und U937 Zellen in AcH4 gefunden wurden) oder dass der HDAC-

Inhibitor MS-275 die Acetylierung von Histon H4 auf diesen Promotoren nicht induziert.

Eine weitere Fragestellung war, ob AML1/ETO die untersuchten aktivierenden Histon-

Markierungen beeinflussen kann. Dafür wurden die Histon-Markierungen des LAT2-

Promotors von U937- und Kasumi-1-Zellen mittels ChIP verglichen. Deutliche Unterschiede

wurden in allen untersuchten Histon-Markierungen (auch in der Acetylierung von Histon H4)

gefunden. Um die Fragestellung zu beantworten, ob diese Unterschiede von AML1/ETO


abhängig sind, wurde während eines "Time-Course"-Versuchs nach der Induktion von

AML1/ETO die Acetylierung von Histon H3 und Histon H4 mittels ChIP in den 9/14/18-

Zellen untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Acetylierung von Histon H3

nach 24 Stunden, nicht aber die von Histon H4 (Ergebnisse nicht gezeigt) maximal

herunterreguliert wurde. Allerdings ist dieser Effekt, wie auch die Repression von LAT2 auf

mRNA- und Protein-Ebene, transient. Diese Daten deuten darauf hin, dass AML1/ETO die

Acetylierung vom LAT2-Promotor möglicherweise durch die Rekrutierung von HDACs

beeinflussen kann. Daraus könnte man schließen, dass der LAT2-Promotor durch HDAC-

Inhibitoren epigenetisch modulierbar ist und dass die AML1/ETO-vermittelten

Veränderungen auf den Promotoren seiner Zielgene pharmakologisch aufgehoben werden.

Substanzen mit HDAC-Inhibitorische Aktivität könnten somit möglicherweise in der

Behandlung von AML1/ETO-positiven Patienten eingesetzt werden.

Ein direkter Effekt von AML1/ETO auf dem LAT2-Promotor kann nur durch ChIP von

AML1/ETO untersucht werden, aber diese Experimente wurden wegen fehlender Spezifität

der kommerziellen verfügbaren Antikörper auf dem chimären Fusionsprotein nicht

durchgeführt (Anti-AML1- sowie Anti-ETO-Antikörper erkennen jeweils das endogene,

wildtyp-AML1 bzw. -ETO-Proteine). Es gibt verschiedene Methoden, um AML1/ETO

spezifisch zu immunpräzipitieren. Eine davon ist die Doppel-ChIP-Methode, in der

sequenziell ein ChIP mit einem primären Antikörper und, nach Spaltung der Antikörper mit

DTT-Lösung, einem zweiten ChIP mit einem zweiten Antikörper durchgeführt wird.

Screening von AML1/ETO Zielgenen auf Promoter- DNA-

Methylierungsveränderungen.

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob AML1/ETO, als epigenetischer Modifikator, zusätzlich

DNMTs an die Promotoren seiner Zielgene rekrutiert. Ein Ziel dieser Arbeit war

AML1/ETO-Zielgene auf DNA-Methylierungs-Ebene zu identifizieren.

Dafür wurde eine globale Analyse (RLGS-Methode) benutzt, um Veränderungen der DNA-

Methylierung genomweit nach der konditionellen Expression des AML1/ETO-Fusionsgens in

den 9/14/18-Zellen zu untersuchen. Diese Untersuchung ist nach unserer Kenntnis die erste,

die den Einfluss von AML1/ETO mit einer genomweiten Analyse auf die DNA-Methylierung

untersucht hat. Es konnte nachgewiesen werden, dass die konditionale Expression von

AML1/ETO die DNA-Methylierung verschiedener Sequenzen bzw. Gene, beeinflusst.

Allerdings waren diese Methylierungsveränderungen unter unseren experimentellen

Bedingungen nicht robust. Mögliche Gründe dafür waren, dass a) die 9/14/18-Zellen ein


nicht-stabiles Epigenom gezeigt haben, da die Zellen einen unterschiedlichen

Methylierungsmuster nach späteren Passagen hatten; b) subtile Methylierungsänderungen als

Reaktion auf einen einzelnen Transkriptionfaktor durch die RLGS-Methode möglicherweise

nicht detektierbar sind, deshalb sind wohl sensitivere Methoden für DNA-Methylierung bei

weiteren Untersuchungen notwendig; c) die konditionale ektope Expression des AML1/ETO-

Proteins in der 9/14/18-Zelllinie einen randomisierten Effekt auf DNA-Methylierung haben

könnte. Da die Auflösung der RLGS-Methode bei etwa 2000 Sequenzen begrenzt ist, könnten

Methylierungsveränderungen nach der Expression von AML1/ETO auch auβerhalb dieser

Grenze stattfinden. Trotz der genannten Schwierigkeiten, konnten wir mit einer sehr

spezifischen Methode (Southern Blot nach Restriktionsverdau mit methylsensitiven

Enzymen) in zwei unabhängigen AML1/ETO-Induktionen der 9/14/18-Zellen eine

Methylierungsveränderung innerhalb der CpG-Insel des Dematin-Promotors identifizieren.

Dematin ist ein Membran-Protein der Erythrozyten, das als Bindeglied zwischen dem

Aktinzytoskeletton und der Membran funktioniert. Damit konnte gezeigt werden, dass dieses

mögliche AML1/ETO-Zielgen eine Funktion in hämatopoetischen Zellen hat (in diesem Fall,

bei den Erythrozyten) und dass die DNA-Methylierung möglicherweise eine Rolle in der

Pathogenese des AML1/ETO-Fusionsproteins spielen könnte. Wir vermuteten allerdings, dass

Dematin keine Funktion in Leukämie-Zellen oder während der Leukemogenese hat, da seine

Expression und Funktion bisher nur bei Erythrozyten beschrieben wurde.

Regulation vom LAT2-Gen während der myeloischen Differenzierung.

Die AML1- und AML1/ETO-Zielgene haben überwiegend eine Funktion in der

Hämatopoese. Der Transkriptionsfaktor AML1 schaltet während der verschiedenen

Reifungsstufen der hämatopoetischen Zellen die Transkription der Zielgene ein- oder aus,

damit diese ihre Funktion während der Differenzierung der Zellen und in den verschiedenen

Vorstufen der hämatopoetischen Zellen kontrolliert ausüben können. Da die Funktion von

LAT2 noch nicht in der Hämatopoese untersucht wurde, wurden in dieser Arbeit

Expressionsuntersuchungen durchgeführt. Es wurde die LAT2-Expression während der

myeloische Differenzierung von Zelllinien und in normalen CD34+-Zellen, in verschiedenen

primären Zellen und während der megakaryozytären und erythrozytären Differenzierung von

K562-Zellen untersucht. LAT2-Expression wurde während der ATRA-induzierten

granulozytären Differenzierung von NB4-, U937- und HL60-Zellen herunterreguliert..

Auβerdem wurde LAT2 während der PMA-induzierten monozytären Differenzierung der

HL60 Zellen hochreguliert nachgewiesen. In dem Differenzierungs-Modell von normalen


CD34+ Zellen wurde LAT2-Protein während der granulozytären Differenzierung mittels G-

CSF herunterreguliert und während der monozytären/DC Differenzierung mittels GM-CSF

plus IL-4 hochreguliert im Vergleich zu den unbehanelten CD34+-Zellen. Eine starke

transiente Hochregulation von LAT2 wurde am Tag 7 in beiden Differenzierungen (mittels G-

CSF und GM-CSF/IL4) gefunden. In primären Zellen war das LAT2-Protein in Granulozyten

abwesend, aber sehr stark in Monozyten exprimiert. Alveolar-Makrophagen exprimierten

LAT2-Protein sogar stärker als Monozyten des gleichen Patienten.

Im Gegensatz dazu wurde das LAT2-Protein in der erythroleukämischen Zelllinie K562 nicht

exprimiert und während der mit PMA-induzierten megakaryozytären und der mit Hemin-

induzierten erythrozytären Differenzierung der Zellen nicht inuiert. Deshalb nehmen wir an,

dass LAT2 keine Rolle in der Erythropoese oder Megakaryopoese spielt. Diese Daten wurden

indirekt bestätigt, in Untersuchungen der Expression von mehreren Transmembran-Adaptor-

Molekülen, darunter auch LAT2 Protein, in verschiedenen Geweben von Patienten mit

hämatologischen Erkrankungen (Tedoldi et al., 2006). Die Expression von LAT2 wurde

sowohl in der erythrozytären Reihe als auch in der megakaryozytären Reihe mit

Immunohistochemie nicht detektiert.

Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse daraufhin, dass LAT2 eine Funktion während der

monozytären Differenzierung oder in Monozyten, nicht aber während der granulozytären

Differenzierung oder in Granulozyten hat. Sehr wahrscheinlich spielt LAT2 auch keine Rolle

während der Megakaryopoese und Erythropoese, da seine Expression während der

induzierten K562-Differenzierung mit PMA und Hemin nicht reguliert wurde.

Untersuchungen in Monozyten/Makrophagen von LAT2-Knock-out-Mäusen sind notwendig,

um Defekte der Differenzierung oder Funktion dieser Zellpopulation festzustellen. Zhu und

Mitarbeiter (Zhu et al., 2006) sind zu der gleichen Schlussfolgerung gekommen, da die

Autoimmune Krankheit der LAT2-Knock-Out-Mäuse nicht vollständig durch einen Defekt

der T-Zell-Funktion aufgelöst werden könnte. Sie haben darauf hingewiesen, dass weitere

Untersuchungen in Zellpopulationen mit höherer LAT2-Expression, wie z. B. in

Makrophagen, notwendig sind, um den Phänotyp dieser Mäuse weiter aufzuklären. LAT2-

Protein kann durch verschiedene Rezeptoren phosphoryliert und aktiviert werden, wie z. B.

FCεR I und c-Kit in Mastzellen (Tkaczyk et al., 2004), B-Zell-Rezeptor in B-Zellen (Janssen

et al., 2003) und T-Zell-Rezeptor (Zhu et al., 2006) in T-Zellen. Wir vermuten, dass LAT2

während der monozytären Differenzierung durch einen myeloischen Rezeptor, wie z.B. M-

CSF-Rezeptor, aktiviert werden könnte. Ko-Immunopräzipitation von Proteinen und

Phosphorylierung-Assays wären für diese Fragestellung geeignet. Falls LAT2 eine Rolle


während der monozytären Differenzierung spielen würde, könnte der Differenzierungs-Block

bei der Monozytären-Reifung von AML1/ETO positiven Zellen (Okuda et al., 1998) teilweise

durch die fehlende LAT2-Expression erklärt werden.

6.- Zusammenfassung Seite - 122 -

6 .- Zusammenfassung

Die Translokation t(8;21) ist eine der häufigsten chromosomalen Aberrationen bei der

akuten myeloischen Leukämie (AML) des Erwachsenen. Sie führt zur Produktion des

chimären Transkriptionsfaktors AML1/ETO, in dem der Transkriptionsfaktor AML1

(RUNX1) auf Chromosom 21 und das ETO-Gen auf Chromosom 8 fusioniert werden. Die

Arbeitsgruppe von Prof. Lübbert hat ein Ecdyson-induzierbares Expressions-System des

Fusionsproteins AML1/ETO in der U937-Zelllinie entwickelt. Mit diesem können auch

Zielgene dieses Proteins untersucht werden, um ein besseres Verständnis dieser Form der

AML zu erhalten. Wir haben funktionelle Untersuchungen an einem neuen identifizierten

AML1/ETO Zielgen, LAT2 (WBSCR5/NTAL/LAB), durchgeführt. LAT2-Expression wurde

mit Northern und Western Blot in AML1/ETO-positiven und -negativen Zelllinien untersucht.

In Blasten von AML-Patienten mit AML1/ETO war das LAT2-Protein mittels Western Blot

nicht detektierbar. Damit konnten wir nachweisen, dass LAT2 in AML1/ETO-positiven

Zelllinien und AML-Blasten reprimiert ist. Die LAT2-mRNA-Expression wurde nach dem

Knock-Down vom AML1/ETO mittels siRNAs in den Kasumi-1 Zellen untersucht. In diesem

System wurde eine Hochregulation der LAT2-mRNA-Expression nach Knock-Down von

AML1/ETO festgestellt, was als starke Evidenz für eine direkte Repression zu werten ist.

AML1/ETO-vermittelte-Repression von LAT2 wurde mittels unterschiedlicher Histon-

Deacetylasen (HDAC)-Inhibitoren und dem DNA-Methyltransferasen (DNMT)-Inhibitor

Decitabine antagonisiert. Der HDAC-Inhibitor MS275 induziert die LAT2-mRNA am

stärksten bei equitoxischen Konzentrationen und hat einen synergistischen Effekt auf die

Expression von LAT2 in Kombination mit Decitabine in Kasumi-1-Zellen. Die Re-expression

von LAT2 durch MS-275 korrelierte außerdem mit der Induktion der Histon-Modifikationen

AcH3, AcH3K9 und 3meH3K4 (mittels ChIP-Assay auf dem LAT2-Promotor in den Kasumi-

1-Zellen gezeigt). Die LAT2-Expression wurde während der myeloischen Differenzierung

untersucht. Während LAT2 während der granulozytären Differenzierung von myeloischen

Zelllinien und normalen CD34+ Vorläufer-Zellen herrunterreguliert ist, ist es in der

monozytären Differenzierung hochreguliert. Zusammenfassend lassen diese Daten eine

Funktion von LAT2 bei der monozytären Differenzierung vermuten. Die Repression von

LAT2 in Leukämien mit AML1/ETO-Expression ist mit einem Reifungsblock assoziert, der

durch epigenetische Therapie teilweise aufgehoben werden kann.

7.-Danksagung Seite - 123 -

7.- Danksagung

Diese Arbeit wurde am Universitätsklinikum Freiburg in der Abteilung Innere

Medizin I (Schwerpunkt Hämatologie/Onkologie), Ärztlicher Direktor Prof. Dr. Roland

Mertelsmann, in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Lübbert angefertigt.

Besonders bedanken möchte ich mich bei meinem Betreuer, Herrn Prof. Dr. Michael

Lübbert, der mir die ausgezeichnete Chance anbot, meine Doktorarbeit am

Universitätsklinikum Freiburg in seiner Arbeitsgruppe durchzuführen. Durch die Hilfe von

Herrn Prof. Dr. Lübbert wurde ich in die Methodik und in das selbständige Arbeiten in der

Forschung eingeführt.

Ebenso möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Roland Mertelsmann bedanken, der mich

als Doktorand in seiner Abteilung aufgenommen und kontinuierliches Interesse und

Unterstützung für meine Arbeit gezeigt hat.

Frau Prof. Dr. C. Niemeyer danke ich herzlich für das Übernehmen des Zweit-

gutachtens dieser Doktorarbeit.

Mein Dank richtet sich auch an Prof. Dr. Florian Otto, PD Dr. Ralph Wäsch und Dr.

Michael Schwabe für zahlreiche Diskussionen im Bereich der Molekularbiologie und

Hämatologie. In diesem Zusammenhang möchte ich mich bei Prof. Christoph Plass und Dr.

Björn Hackanson für ihre Hilfsbereitschaft und Kooperation mit der RLGS-Analyse und

Auswertung der Daten bedanken. PD Dr. Olaf Heidenreich danke ich für die Bereitstellung

von den Proben des AML1/ETO Knock-Down-Systems mittels siRNAs in den Kasumi-1

Zellen. Dr. Rainer Claus, Dr. Björn Hackanson, Dr. Tobias Berg, Dr. Claudia Müller-Schmah

und Dr. Bernhard Kleine danke ich für die sprachlichen Korrekturen am Manuskript.

Allen Mitarbeitern von Laboratorien Nothnagel und der Abteilung I der Inneren

Medizin danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die Hilfe, die sie mir während

der Durchführung meiner Doktorarbeit geleistet haben. Insbesonders danke ich den

Mitarbeitern meiner Arbeitsgruppe, die mich während dieser Zeit innerhalb und außerhalb des

Labors unterstützt haben.

Meiner Freundin Corina Waldkircher, meiner Familie und meinen Freunden möchte

ich ganz herzlich danken, weil diese Arbeit ohne ihre Unterstützung nicht realisierbar

gewesen wäre.

Für die finanzielle Unterstützung danke ich dem Deutschen Verein zur Förderung der

Leukämie- und Tumorforschung im Jahr 2004-2005 und dem DAAD und der Fundación La

Caixa im Jahr 2005-2007.

8.- Bibliographie Seite - 124 -

8.- Bibliographie Alcalay M, Meani N, Gelmetti V, Fantozzi A, Fagioli M, Orleth A, Riganelli D, Sebastiani C, Cappelli E,

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9.- Lebenslauf Seite - 134 -

9.- Lebenslauf

GRUNDDATEN

Vorname Atilio Jesús

Name Duque Afonso

Geburtsort Santa Cruz de Tenerife

Alter 29 Jahre

Nationalität Spanisch

E-mail [email protected]

AUSBILDUNGSDATEN

1984-1986 Colegio Echeyde (Tenerife, Spanien)

1986-1988 Colegio Echeyde (Tenerife, Spanien)

1988-1994 Colegio Miguel Pintor (Tenerife, Spanien)

1994-1998 I.B. Anaga (Tenerife, Spanien)

1998 Abitur

1998-2004 Studium, Hauptfach Medizin, Universidad de La Laguna (Tenerife, Spanien)

Juli 2004 Approbation in Medizin (Spanien)

2004- Promotion zur Erlangung des medizinischen Doktorgrades an der Universität

Freiburg, Deutschland

2004-2005 Forschungsstipendium des Deutschen Vereins zur Förderung der Leukämie

und Tumorforschung

2005-2007 Forschungsstipendium von „La Caixa“-DAAD

März 2007 Aprobation in Medizin (Deutschland)

2007-

Facharztausbildung in der Abteilung I der Inneren Medizin

(Hämatologie/Onkologie) an der Uniklinik Freiburg, Deutschland.


ZUSÄTZLICHE MEDIZINISCHE AUSBILDUNG

Februar 2005 Ärztliche Fortbildung über „Fortschritte in der Hämatologie“

April 2005 Symposium „Hämatologische Neoplasien bei älteren Patienten“

Januar 2006 III. Post-ASH Symposium des Tumorzentrums Freiburg.

Februar 2006 „3. Annual Symposium of the European LeukemiaNet“ und „7. Annual

Symposium of the German Competence Network“ in Heidelberg

Februar 2006 International Symposium „Acute Leukemias XI: Prognostic Factors and

Treatment Strategies“ in München.

März 2006 Symposium „Das Multiple Myelom 2006: Auf dem Weg zur Heilung?“

April 2006 Symposium „Grundlagen und Perspektiven in der Behandlung Thorakaler

Tumoren“

Mai 2006 Ärztliche Fortbildung „Hämatologische Neoplasien“

September 2006 Ärztliche Fortbildung „CML - Neue Aspekte für Diagnostik und Therapie“

Oktober 2006 Spanischer National-Kongress „XLVII Reunión Nacional de la AEHH“ und

„XXII Congreso Nacional de la SETH“ in Granada (Spanien)

November 2006 Ärztliche Fortbildung „Prostatakarzinom“ in Freiburg.

Januar 2007 „IV. Post ASH Symposium des Tumorzentrums Freiburg“

ZUSÄTZLICHE WISSENSCHAFTLICHE AUSBILDUNG

Oktober 2004 V. Freiburg Symposium “Molekulare Hämatologie“ in Freiburg

März 2005 XIV. Workshop der Abteilung I der Inneren Medizin in Lenzkirch.

Oktober 2005 Strahlenschutzunterweisung der Uniklinik Freiburg.

März 2006 XV. Workshop der Abteilung I der Inneren Medizin in Lenzkirch

Juni 2006 Veranstaltung „New developments in Immunotherapy of Malignant Lymphoma“

in Freiburg.

Februar 2007 EHA Meeting "The role of epigenetics in hematological malignancies" in

Cannes, Frankreich.

März 2007 XVI. Workshop der Abteilung I der Inneren Medizin in Lenzkirch


ZUSÄTZLICHE QUALIFIKATIONEN

Muttersprache Spanisch

Fremdsprachen Englisch Oberstufe von der Escuela Oficial de Idiomas, im Jahr 2000

Deutsch Oberstufe von der Escuela Oficial de Idiomas, im Jahr 2004

Französisch Mittelstufe von der Escuela Oficial de Idiomas, im Jahr 2004

EDV Kenntnisse

Grundlegende PC Kenntnisse insbesondere Erfahrung mit Windows XP, MS Word 2003, Excel 2003, Power Point 2003 und Internet Explorer,

AUSLANDSERFAHRUNG

Jahr 1999 2 Wochen freiwillige Tätigkeit in Tánger in einem Behindertenheim der

Franziskaner des Weissen Kreuzes (Marokko).

Jahr 2001-2002 7. und 8. Semester mit dem Erasmus Programm an der Universität Freiburg.

Jahr 2003 3- wöchiges Praktikum in der Abteilung I der Inneren Medizin in Freiburg.

Jahr 2004 12. Semester an der Universität Louis Pasteur in Straßburg (Frankreich).

Jahr 2004-2007 Forschungsprojekt in der AG Prof.Lübbert (Abteilung I der Inneren Medizin,

Uniklinik Freiburg) im Rahmen meiner Doktorarbeit.

Jahr 2007- Facharztausbildung in der Abteilung I der Inneren Medizin

(Hämatologie/Onkologie) der Uniklinik Freiburg

LABORERFAHRUNG

Jahr 2000 Projekt im molekulardiagnostischen Labor des "Hospital Universitario de

Canarias" auf Tenerife (Spanien)

2004- Forschungsprojekt im Rahmen der Promotion in der Abteilung I der Inneren

Medizin des Universitätsklinikums Freiburg.


PUBLIKATIONSLISTE

Originalarbeiten :

Duque-Afonso J., Yalcin A. Berg T., Abdelkarim M., Heidenreich O., Lübbert M. The HDAC class I specific inhibitor Entinostat (MS-275) effectively relieves epigenetic silencing of the LAT2 gene mediated by AML1/ETO. (Oncogene, Januar 2011, angenommen)

Duque-Afonso J., Solari L., Essig A., Berg T., Pahl HL, Lübbert M. Regulation of the adaptor molecule LAT2, an in vivo target gene of AML1/ETO, during myeloid differentiation (British Journal of Haematology, Dezember 2010, angenommen)

Almstedt M.*, Blagitko-Dorfs N.*, Duque-Afonso J.*, Karbach J.*, Pfeifer D., Jäger E., Lübbert M. The DNA demethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine induces expression of immunogenic Cancer/testis antigens in myeloid leukemia cells. Leukemia Research 2010; 34(7): 899-905. * These authors contributed equally.

Hauswald S., Duque-Afonso J., Wagner MM., Schertl FM., Lübbert M., Peschel C., Keller U., and Licht T., Histone Deacetylase Inhibitors Induce Pleiotropic Anticancer Drug Resistance In Acute Myeloid Leukemia Cells by Modulation of ABC-Transporter Genes. Clin. Cancer Res. 2009; 15(11): 3705-3715.

Becker H., Pfeifer D., Afonso JD., Nimer SD., Veelken H., Schwabe M., Lübbert M. Two cell lines of t(8;21) acute myeloid leukemia with activating c-KIT exon 17 mutation: models for the “second hit” hypothesis. Leukemia 2008; 22(9):1792-4.

Claus R., Fliegauf M., Stock M., Duque J., Kolanczyc M., Lübbert M. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation independently relieve AML1/ETO-mediated lysozyme repression. Jounal of Leukocyte Biology, 2006, 80 (6): 1462-1472.

Übersichtsartikel

Lübbert M., Duque-Afonso J., Kuendgen A. Epigenetic therapy of myelodysplastic syndromes: an update. Educational book, EHA Meeting 2010.

Müller AM., Duque J., Shizuru JA., Lübbert M. Complementing mutations in Core Binding Factor (CBF) leukemias: mechanisms und therapeutical implications. Oncogene 2008; 27(44):5759-73

Duque J., Lübbert M., Kirschbaum M. Pharmacological modifications of epigenetics: DNA methyltransferase and HDAC inhibitors. Buchkapitel, Innovative Leukemia and Lymphoma Therapy, Informa Healthcare USA, Inc., Erscheinung 04/08

Hackanson B., Becker H., Berg T., Binder M., Dierks C., Duque-Afonso J., Lairmore MD., Schafer HS., Schnitzler M., Zeiser R., Martens U., Mertelsmann R. and Lübbert M. XXIII International Association for Comparative Research on Leukemia and Related Diseases Symposium: from Molecular Pathogenesis to Targeted Therapy in Leukemia and Solid Tumors. Cancer Res 2008;68 5512-5518.

Abstracts Duque J, Carmona N., Rivero Y, Barrios Y, Salido E. Analyse des Polymorphismus im IRS-1 Gen bei Diabetes Mellitus Typ 2 bei den Einwohnern vom Norden von Teneriffa. XIV. Kongress der Medizinstudenten von der Universität La Laguna, Tenerife. Abstraktsprogramm Duque J, Berg T., Lübbert M., The AML1/ETO target gene WBSCR5 (NTAL/LAB) is regulated during myeloid differentiation. “Annals of Hematology“ Vol 85, Supplement 1, 2006, Abstrakt P-7.


Duque J., Berg T., Lübbert M., The AML1/ETO target gene WBSCR5 (NTAL/LAB) is regulated during myeloid differentiation. “Haematologica“ Vol 91., 2006, Abstrakt C-096

Claus R, Fliegauf M, Stock M, Duque J, Kolanczyc M, Lübbert M. AML1/ETO mediated lyzozyme repression is indepently relieved by inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation. Blood 2006. Nov 2006; 108: Abstract #4310

Duque J, Berg T, Heidenreich, Lübbert M The AML1/ETO-mediated repression of the WBSCR5 (NTAL/LAB/LAT2) gene is relieved in Kasumi-1 myeloid leukemia cells. EHA/ESH Workshop „The role of epigenetics in hematological malignancies“, Mandelieu (Frankreich), Februar 2007

Duque J., Hackanson B., Berg T., Plass C., Lübbert M. Does conditional AML1/ETO expression alter DNA methylation patterns of Hematopoiesis associated genes? A Global analysis by Restriction Landmark Genomic Scanning (RLGS). EHA/ESH Workshop „The role of epigenetics in hematological malignancies“, Mandelieu (Frankreich), Februar 2007

Kleine B., Berg T, Duque J, Lübbert M Epigenetic modifications at the P15/INK4B 5´ Region in AML1/ETO positive myeloid leukemias. EHA/ESH Workshop „The role of epigenetics in hematological malignancies“, Mandelieu (Frankreich), Februar 2007

Duque J, Berg T, Heidenreich, Lübbert M The AML1/ETO target gene WBSCR5 (NTAL/LAB/LAT2) is regulated during myeloid differentiation and derepressed by both HDAC inhibitiors and DNMT inhibitors in AML1/ETO positive leukemia cells DGHO 2007, Basel (Schweiz), Oktober 2007

Duque-Afonso J, Berg T, Heidenreich O, Lübbert M. Epìgenetic repression of the adaptor molecule LAT2 by the leukemic fusion protein AML1/ETO. Blood 2007. Dec 2007; 108: Abstract #987 Travel Award

Duque-Afonso J, Solari L, Lübbert M. The AML1/ETO target LAT2 membrane adaptor molecule is regulated during normal monocytic differentiation. Blood 2007. Dec 2007; 108: Abstract #2401 Travel Award

Duque-Afonso J., Heidenreich O., Lübbert M. Epigenetic regulation of the adaptor molecule LAT2 by the leukemic fusion protein AML1/ETO. DGHO Oktober 2008, Wien (Österreich), Vortrag

Duque-Afonso J., Essig A., Berg T., Heidenreich O., Pahl HL., Lübbert M. The adaptor molecule LAT2 is epigenetically regulated by the leukemic fusion protein AML1/ETO. 3. CCRTP Stanford University September 2009, San Francisco (USA)

Duque-Afonso J., Prasse A., Wäsch R., Bertz H., Finke J., Marks R. Low incidence of pulmonary Graft-versus-Host disease in older patients after reduced toxicity conditioning with fludarabin, carmustine and melphalan prior to hematopoietic stem cell transplantation. EBMT Meeting, März 2010, Vienna (Austria)

Poster Präsentationen

März 2005 XIV. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin (Freiburg)

Februar 2006 „International Symposium Acute Leukemias XI“ in München

März 2006 XV. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin Freiburg.

Februar 2007 EHA/ESH Workshop „The Role of Epigenetics in hematological malignancies“, Mandelieu (Frankreich)

März 2007 XVI. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin Freiburg. Best Poster Award

Oktober 2007 DGHO Jahrestagung, Basel (Schweiz)


Dezember 2007 49.ASH Meeting, Atlanta (USA) Travel Award

September 2009 3. CCRTP Stanford University September 2009, San Francisco (USA)

März 2010 EBMT Meeting, Vienna (Austria)

Dezember 2010 52. ASH Meeting, Orlando (USA)

Vorträge Mai 2000 XI. Kongress der Medizinstudenten von der Universität La Laguna, Tenerife (Spanien).

Dezember 2004 Vorstellung des Promotionsthemas im „Work in Progress“ Seminar.

März 2005 XIV. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin (Freiburg).

Dezember 2005 Vortrag im „Work in Progress“ Seminar.

März 2006 XV. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin (Freiburg).

Oktober 2006

Vortrag mit dem Titel „Regulation of the AML1/ETO target gene WBSCR5 during myelopoiesis“ am „XLVII Reunión Nacional de la AEHH“ und „ XXII Congreso Nacional de la SETH“ in Granada (Spanien).

März 2007 XVI. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin (Freiburg).

März 2007 Vortrag in „Combined target therapy“ Ph.D.-Studentenworkshop, Freiburg

April 2007 Vortrag im „Work in Progress“ Seminar, Freiburg.

Mai 2007 Vortrag mit dem Titel “Epigenetic regulation of the AML1/ETO gene WBSCR5 and its role during the myeolopoiesis” am 14th Annual Meeting of the European Cancer Center, Strassburg (Frankreich)

Februar 2008 XVII. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin (Freiburg).

Juli 2008 Vortrag in Real Time PCR Workshop, unterstützt von Roche Diagnostics, Freiburg.

Oktober 2008 Vortrag mit dem Titel “Epigenetic regulation of the adaptor molecule LAT2 by the leukemic fusion protein AML1/ETO” am DGHO Kongress , Wien (Österreich)

März 2009 XVIII. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin (Freiburg).

Mai 2009 Vortrag mit dem Titel “The adaptor molecule LAT2 is epigenetically repressed by the leukemic fusion protein AML1/ETO” am 16th Annual Meeting of the European Cancer Center, Freiburg (Deutschland)

Februar 2010 XIX. Workshops der Abteilung I der Inneren Medizin (Freiburg).

September 2010 1.Comprehensive Cancer Center Research Programm in Medical Oncology (Hinterzarten)

Freiburg im Breisgau, 03. Februar 2011 Jesús Duque Afonso

Aus der Medizinischen Universitätsklinik

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