Analyse de gènes candidats au cancer du sein impliqués ...

SYLVIE DESJARDINS

ANALYSE DE GENES CANDIDATS AU CANCER DU SEIN IMPLIQUÉS DANS LES INTERACTIONS AVEC

BRCA1 ET BRCA2.

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en Physiologie-Endocrinologie pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

DEPARTEMENT DE MEDECINE MOLECULAIRE FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2010

© Sylvie Desjardins, 2010

RESUME La susceptibilité d'un individu à développer un cancer du sein est le résultat d'une

interaction complexe de facteurs reliés au style de vie, à l'histoire reproductive et aux

déterminants génétiques propres à chaque individu. Jusqu'à présent, un nombre limité de

gènes ont été impliqués dans une telle susceptibilité. Il est présentement estimé que des

mutations et variations de l'ensemble des gènes de susceptibilité connus (par exemple

BRCA1, BRCA2, TP53, STK11, PTEN, ATM, PALB2, CHEK2, BR1P1 et les alleles de

faible penetrance identifiés récemment) ne seraient responsables que d'un maximum de

30% des cas de cancers clairement familiaux. Dans cette thèse, la contribution de certains

gènes a été investiguée dans une cohorte de femmes provenant de la population canadienne

française et présentant des évidences claires de l'implication forte de facteurs génétiques de

susceptibilité non reliés à BRCA1 ou BRCA2. Notre étude concerne les gènes candidats

ZBRK1 (Zinc finger and BRCA1-interacting protein with KRAB domain 1), GADD45A

(Growth arrest and DNA-damage-inducible alpha) et NBS1 (Nijmegen breakage syndrome

1). Notre analyse de ZNF350/ZBRK1 a permis de mettre en évidence trois haplotypes

modulant de façon significative le risque de cancer du sein dans notre population. Parmi

ceux-ci, deux pourraient être associés à un effet protecteur (p=0.01135 et p=0.00268) alors

qu'un autre haplotype est lié à une augmentation du risque (p=0.00143). Dans le cas de

GADD45A, nous avons identifié un haplotype commun démontrant une fréquence plus

élevée dans le groupe contrôle, bien que cette association soit faible. En ce qui concerne

NBN, le variant du promoteur c.-242-l lOdelAGTA est significativement surreprésenté dans

notre groupe de femmes atteintes. Des essais de type gène luciférase rapporteur n'ont pas

démontré de variation d'expression dans la lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7, mais

ont indiqué une réduction de l'expression dans les lignées cellulaires HEK293 et LNCaP.

Ces résultats indiquent qu'il est possible que des variations de ces gènes, bien que n'étant

pas très fréquentes, soient impliquées dans la susceptibilité au cancer du sein dans notre

population et des études plus approfondies sur de grandes cohortes seront nécessaires afin

de confirmer ou infirmer nos résultats.

11

ABSTRACT An individual's susceptibility to develop breast cancer is the result of a complex interaction

between lifestyle factors, reproductive history and genetic determinants unique to each

individual. To date, a limited number of genes have been implicated in such susceptibility.

It is estimated that mutations and variations in all known susceptibility genes (for example

BRCA1, BRCA2, TP53, STKll, PTEN, ATM, PALB2, CHEK2, BR1P1 and low penetrance

alleles recently discovered) account for less than 30% of clearly familial cancer cases. In

this thesis, the contribution of certain genes has been investigated in a cohort of women

from the French Canadian population and presenting clear evidence of strong non-BRCA 1

or -BRCA2 genetic factors. The focus of my thesis is on candidate genes such as ZBRK1

(Zinc finger and BRCA1-interacting protein with KRAB domain 1), GADD45A (Growth

arrest and DNA-damage-inducible alpha) and NBS1 (Nijmegen breakage syndrome 1). Our

analysis of ZNF350/ZBRK1 allowed the identification of three haplotypes modulating

breast cancer risk in a significant manner in our population. Among those, two could be

associated with a protective effect (p=0.01135 et p=0.00268) while another haplotype is

linked to an increased risk (p=0.00143). In the case of GADD45A, we identified a common

haplotype displaying an increased frequency in the control group, although this association

is weak. Regarding NBN, the promoter variant c.-242-110delAGTA is significantly over-

represented in our group of affected women. Luciférase reporter gene assays failed to

indicate a variation in promoter activity in the breast cancer cell line MCF-7, although a

reduced activity was observed in both the HEK293 and LNCaP cell lines. These results

indicate that variations in those genes may be implicated in breast cancer susceptibility in

our population, albeit at low frequency. Further studies in larger cohorts are warranted to

confirm or infirm our results.

AVANT-PROPOS Le cancer, en particulier le cancer du sein chez la femme, est l'une des causes principales

de maladie dans les pays occidentaux, occasionnant un fardeau émotionnel et financier

important pour les individus, familles et sociétés. La compréhension des facteurs pouvant

affecter l'initiation et la progression du cancer, par exemple les facteurs génétiques pouvant

être associés à une prédisposition à développer un cancer, est primordiale. Ultimement, ces

connaissances devraient permettre de cibler la population à risque et de fournir des soins de

santé adaptés. Cependant, bien du chemin reste à faire puisque les alleles de risque connus

actuellement ne peuvent expliquer qu'une minorité des cas de cancer du sein d'origine

clairement héréditaire.

L'objet de la présente thèse est donc d'évaluer la contribution à la susceptibilité au cancer

du sein de gènes candidats sélectionnés sur la base de leur interaction avec les deux gènes

majeurs de susceptibilité connus, soit BRCA1 et BRCA2. Il s'agit d'une thèse avec insertion

d'articles, qui sont rédigés en langue anglaise afin de se conformer aux exigences des

revues dans lesquelles ils ont été publiés. Ces articles sont présentés dans leur version

intégrale. Tous les articles présentés dans cette thèse sont des manuscrits pour lesquels je

suis l'auteure principale.

La première partie de la thèse sera constituée d'une introduction générale, qui sera suivie

aux chapitres I à III par les manuscrits publiés. Finalement, les conclusions de mes

recherches entreprises pour l'obtention de mon grade de Philosophiae Doctor constitueront

la 3 e et dernière partie de la thèse. Le corps de la thèse sera constitué de 3 chapitres. Les

résultats de mes travaux effectués sur les gènes ZNF350/ZBRK1 et GADD45A constitueront

les chapitres I et II, respectivement. Le chapitre III présente les résultats de l'analyse du

gène NBN dans notre cohorte de familles à risque élevé de cancer du sein. Les résultats de

l'analyse des gènes ZNF350/ZBRK1, GADD45A et NBN font chacun l'objet d'une

publication. Les détails de l'état de chacun des manuscrits est précisé dans la liste suivante:

Chapitre I : Desjardins S, Belleau P, Labrie Y, Ouellette G, Bessette P, Chiquette J, Laframboise R, Lépine J, Lesperance B, Pichette R, Plante M; INHERIT BRCAs, Durocher

IV

F. Genetic Variants and Haplotype Analyses of the ZBRK1/ZNF350 Gene in High-Risk non BRCA1/2 French Canadian Breast and Ovarian Cancer Families. Int J Cancer. 2008; 122(1): 108-16.

Chapitre II : Desjardins S, Ouellette G, Labrie Y, Simard J; INHERIT BRCAs, Durocher F. Analysis of GADD45A sequence variations in French Canadian families with high risk of breast cancer. J Hum Genet. 2008; 53(6):490-8.

Chapitre III : Desjardins S, Joly Beauparlant C, Labrie Y, Ouellette G, INHERIT BRCAs, Durocher F. Variations in the NBN/NBS1 gene and the risk of breast cancer in non-BRCA1/2 French Canadian families with high risk of breast cancer. BMC Cancer. 2009:9:181.

Les résultats présentés dans ces chapitres sont l'aboutissement d'un travail d'équipe. Les

recherches décrites dans ces chapitres ont toutes été effectuées dans le cadre du programme

interdisciplinaire INHERIT BRCAs, dont le Dr Jacques Simard est l'instigateur, et ces

travaux ont été effectués sous la direction du Dre Francine Durocher au Laboratoire de

Génomique des cancers du centre de recherche du CHUL, faisant partie intégrante du

Centre hospitalier universitaire de Québec (CHUQ). Par conséquent, Dre Francine

Durocher a été responsable, au sein des divers projets élaborés dans cette thèse, de la

conception et de la coordination des études, en plus de son aide précieuse lors de la

préparation et de la révision critique des manuscrits. Le Dr Yvan Labrie a, quant à lui,

fourni une expertise technique de premier plan et a participé activement à la préparation des

manuscrits et aux analyses bio-informatiques présentées au Chapitre II. Mme Geneviève

Ouellette a été responsable des extractions d'ADN, d'ARN, ainsi que du maintien des

cellules en culture, matériel essentiel à la réalisation de chacun des projets traités dans cette

thèse. De plus, soulignons l'aide précieuse de Mme Ouellette dans les études moléculaires

par séquençage (Chapitre II), la réalisation des transfections nécessaires aux essais gène

rapporteur luciférase (Chapitre III). Notons aussi l'apport de M. Pascal Belleau, qui a

fourni une aide précieuse pour l'ensemble des analyses bioinformatiques présentées au

Chapitre I et l'aide de M. Charles Joly Beauparlant qui a été en charge du séquençage chez

les contrôles au Chapitre III. Au Chapitre I, les autres auteurs sont des chercheurs cliniciens

dont l'apport au projet est essentiel dans le cadre d'une étude effectuée chez des sujets

humains.

À titre de premier auteur de tous les manuscrits présentés aux chapitres I à III, j 'ai été en

charge de la majeure partie des analyses moléculaires au laboratoire. En plus du séquençage

de ces gènes, j 'ai aussi effectué les expériences de gène rapporteur luciférase incluses au

Chapitre III. Dans le cadre de ces 3 chapitres, j'ai aussi été responsable des analyses bio

informatiques et statistiques des résultats, et de leur interprétation. J'ai rédigé les

manuscrits présentés dans le corps de la thèse, avec les commentaires et suggestions des

Drs Francine Durocher et Yvan Labrie. J'ai été en charge de la soumission et de la révision

de chacun de ces manuscrits, avec le support de ma directrice de recherche. Il est de plus

important de mentionner que tous les contributeurs ont lu et approuvé la version finale des

manuscrits présentés dans le cadre de cette thèse.

REMERCIEMENTS C'est avec une grande fierté, beaucoup de soulagement, une touche de mélancolie et une

énorme gratitude que s'achève mon aventure doctorale. Par conséquent, je tiens à utiliser

ces quelques lignes afin d'articuler mes remerciements aux personnes qui m'ont offert le

soutien moral et technique ayant rendu ce projet possible. Il s'agit d'une tâche dont la

complexité réside à la fois à trouver les mots adéquats mais surtout à n'oublier personne. Je

vais donc accuser tout oubli de ma part sur la faute d'un épuisement cérébral, et je remercie

sincèrement à l'avance toute personne m'ayant apporté un soutien et dont le nom a été

accidentellement omis. Toutes mes excuses et merci de votre compréhension.

Je tiens en premier lieu à remercier ma directrice de thèse, Dre Francine Durocher, pour

m'avoir accueillie au sein de son laboratoire à la maîtrise, puis au doctorat. Elle a su

m'offrir l'encadrement nécessaire à la réalisation des travaux présentés dans cet ouvrage.

Ses encouragements, ses directives et ses conseils m'ont été d'une grande aide tout au long

de ces années, au cours desquelles elle m'a donné l'opportunité de voyager et m'a confié

des responsabilités qui se sont avérées des atouts précieux dans ma croissance personnelle

et professionnelle. Par conséquent, je tiens à lui réitérer mes remerciements pour la

confiance et l'attention qu'elle m'a accordée au cours de ces années ainsi que pour son

énergie et sa détermination.

Je tiens également à reconnaître l'apport du Dr Jacques Simard à mes études doctorales, et

à le remercier de m'avoir dirigée dans un premier temps vers Dre Durocher lors de notre

première rencontre à la fin de mes études de baccalauréat, ce qui aura lancé ma trajectoire

aux études graduées. Je le remercie pour ses conseils, et la diligence avec laquelle il a su

répondre à mes demandes au cours de ces années.

Mes plus sincères remerciements aux membres de l'équipe du Dr Durocher : Dr Yvan

Labrie, Geneviève Ouellette, Charles Joly Beauparlant et Frédéric Guénard, à qui j'adresse

une pensée particulière pour toute leur patience à mon égard. J'aimerais aussi exprimer

mon respect pour tous les membres présents et passés de l'équipe du Dr Simard, avec

laquelle j 'ai collaboré durant ces années. Je tiens à mentionner le plaisir particulier que j'ai

Vil

eu à côtoyer Dr Anne-Marie Moisan, en qui j'ai trouvé une amie précieuse qui apporte une

couleur particulière à notre amitié. Merci pour tes encouragements répétés !

J'aimerais aussi souligner l'appui répété que j'ai reçu de la part de toute l'équipe de la

Plateforme de séquençage et de génotypage du CHUL, Marc-André Rodrigue, Annie-

Claude Collin-Deschesnes et Guy Reimnitz, ainsi que toute l'équipe du Dr Vincent

Raymond, qui ont su m'encourager à terminer ce projet.

Je tiens de plus à remercier ma famille et mes amis. Paul et Monique : ils m'ont offert un

soutien et des encouragements constants au cours de ces années et ils ont toujours été fiers

de moi. Mon grand frère Vincent, sa conjointe Véro et les deux petits amours Victor et

César : je vous aime. Mes frères Benoît et André, pour leur support. A mes amies Caroline,

et Manon : dix ans d'amitié et bien d'autres à venir !

Finalement, je ne veux pas passer sous silence la contribution financière de la Fondation

Desjardins, qui m'a offert une bourse mais surtout de la Fondation René Bussières qui m'a

accompagnée sans faille au cours de toutes ces années de doctorat. Votre intérêt à mon

égard a été une grande source d'inspiration.

La réalisation d'une thèse nous paraît parfois bien solitaire. À la lumière de ces

remerciements, je lève mon chapeau à tous mes compagnons de fortune (ou d'infortune).

Votre présence a été précieuse et cet ouvrage vous appartient aussi...

A ma famille : Monique et Paul; Véronique, Vincent, Victor et César; Benoît; André. Pour m'avoir accompagnée et soutenue au cours de toutes ces années, chacun à sa façon...

A Caroline et Manon. Lorsque j ' a i besoin d'un rire ou d'un simple sourire; d'un encouragement ou d'une épaule sympathique; de mettre de l'ordre dans mes pensées ou de me changer les idées. Votre amitié vaut de l'or...

TABLE DES MATIERES RÉSUMÉ i ABSTRACT ii AVANT-PROPOS iii REMERCIEMENTS vi TABLE DES MATIÈRES ix LISTE DES TABLEAUX xii LISTE DES FIGURES xiv LISTE DES ABRÉVIATIONS xvi INTRODUCTION 1 1. Le cancer 1

1.1 Epidemiologic : les conséquences du cancer à travers le monde et au Canada 2 1.1.1 L'épidémiologie du cancer du sein 2

1.2 Le cancer du sein 4 1.2.1 Le sein normal 4 1.2.2 Lésions et maladies du sein 5

1.3 Les facteurs de risque du cancer du sein 6 2. Déterminants génétiques du cancer du sein 12

2.1 Anecdotes historiques : cancer du sein, histoire familiale et prédisposition 12 2.2 Gènes de susceptibilité au cancer du sein connus 14

2.2.1 Alleles de forte penetrance 17 2.2.1.1 Le syndrome de cancer du sein et de l'ovaire héréditaire, BRCA1 et BRCA2

17 2.2.1.2 Le syndrome de Li-Fraumeni et TP53 22

2.2.2 Alleles de penetrance incertaine 24 2.2.2.1 Le syndrome de Cowden et PTEN. 24 2.2.2.2 Le syndrome de Peutz-Jegher et STK11 25 2.2.2.3 Le syndrome du cancer gastrique héréditaire diffus et CDH1 26

2.2.3 Alleles de penetrance modérée 27 2.2.3.1 L'ataxie-télangiectasieetj4rM 27 2.2.3.2 CHEK2 28 2.2.3.3 BRIP1/BACH 1/FANCJ 30 2.2.3.4 PALB2/FANCN 31

2.2.4 Alleles de faible penetrance 32 2.3 Modèles de la susceptibilité génétique au cancer du sein 37

3. Fonctions et partenaires cellulaires deBRCAl etBRCA2 41 3.1 Structure des protéines BRCA1 et BRCA2 41 3.2 Fonctions de BRCA1 et BRCA2 44

3.2.1 Régulation de la transcription 45 3.2.1.1 Régulation transcriptionnelle de GADD45A par BRCA1 et ZNF350 46

3.2.2 Détection, signalisation et réparation des dommages de l'ADN 49 3.2.2.1 Interaction entre la nibrine et BRCA1 52 3.2.2.2 Implication de BRCA1 et BRCA2 dans l'Anémie de Fanconi 54

3.2.3 Autres fonctions de BRCA1 et BRCA2 61 4. Types de variations de séquence 63

5. Problématique 66 5.1 Collection familiale étudiée : les familles à risque élevé de la population canadienne française 66 5.2 Objectifs de l'étude 67

CHAPITRE I : Genetic Variants and Haplotype Analyses of the ZBRK1/ZNF350 Gene in High-Risk non BRCA1/2 French Canadian Breast and Ovarian Cancer Families 69

Résumé 72 Abstract 73 Introduction 74 Materials and Methods 76 Results 80 Discussion 85 Acknowledgements 90 Appendix 1 91 References 92 Figure legends 103

CHAPITRE II : Analysis of GADD45A Sequence Variations in French Canadian Families with High Risk of Breast Cancer 106

Résumé 108 Abstract 109 Introduction 110 Materials and methods 112 Results 114 Discussion 118 Acknowledgements 122 Appendix 123 References 124 Legends to Figures 130

CHAPITRE III : Variations in the NBN/NBS1 gene and the risk of breast cancer in non-BRCA1/2 French Canadian families with high risk of breast cancer. 133

Résumé 135 Abstract 136 Background 138 Methods 141 Results 143 Discussion 148 Conclusion 153 Abbreviations 154 Competing interests 154 Authors' contributions 154 Acknowledgements 155 Appendix 156 References 157 Figure legends 162

DISCUSSION ET CONCLUSION 174 1. CHAPITRE I : Analyse du gène ZNF350/ZBRK1 174 2. CHAPITRE II : Investigation du gène GADD45A 177

XI

3. CHAPITRE III : Étude du gène NBN 179 4. L'approche gène candidat dans la population canadienne française : considérations méthodologiques 181 5. Conclusions et perspectives 183 BIBLIOGRAPHIE 185

LISTE DES TABLEAUX INTRODUCTION Tableau 1. Classification des lésions bénignes du sein suite à l'examen histologique,

selon le risque relatif de cancer du sein 6 Tableau 2. Facteurs de risque modifiant le risque de développer un cancer du sein 8 Tableau 3. Principaux alleles de susceptibilité au cancer du sein connus 15 Tableau 4. Caractéristiques des familles présentant des cas de cancer du sein

héréditaires, familiaux et sporadiques 16 Tableau 5. Pourcentage des familles présentant des mutations de BRCA1 ou BRCA2,

selon le type de cas sélectionné 18 Tableau 6. Risque d'autres types de cancers associé à une mutation délétère de

BRCA1 ou BRCA2 22 Tableau 7. Critères de diagnostic des familles Li-Fraumeni 24 Tableau 8. Caractéristiques des gènes associés à l'Anémie de Fanconi 55

CHAPITRE I Table I. Coding and intronic sequence variations and genotype frequencies in familial

breast cancer cases and controls 97 Table IL Estimated haplotype frequencies in cases and controls using PHASE. 99 Table III. Estimated haplotype numbers and associated breast cancer risks for cases and

controls using PHASE and Haplostats 100 Supplemental Table I. Oligonucleotide primers used for amplification and sequence

analysis of the ZBRK1 gene 101 Supplemental Table II. Global p-value for case and control comparison using PHASE,

Cocaphase and Haplostats programs 102

CHAPITRE II Table 1. GADD45 sequence variations and genotype distribution in familial breast cancer

cases and controls 127 Table 2. Haplotypes as estimated by PHASE and WHAP, and their estimated frequencies in

cases and controls using all SNPs genotyped in both case and control series. ...128 Supplemental Table 1. PCR and sequencing primers 729

CHAPITaRE III Table 1. Oligonucleotides used for NBN PCR amplification and sequencing. 164 Table 2. Exonic sequence variations of the NBN gene in French Canadian breast cancer

cases and healthy controls 166 Table 3. Promoter and intronic variations of the NBN gene in French Canadian breast

cancer cases and healthy controls 167

Xlll

Table 4. Estimated haplotypes using the Whap program and all variants identified, for cases and controls combinend. 168

Table 5. Estimated haplotypes using the WHAP program and SNPs with a frequency greater than 5% for cases and controls combined. 169

LISTE DES FIGURES INTRODUCTION Figure 1. Le cancer est un processus à étapes multiples 1 Figure 2. Répartition relative des 5 types de cancers les plus fréquents au monde et au

Canada 3 Figure 3. Anatomie du sein humain normal 4 Figure 4. Représentation du taux de cancer du sein par pays, par 100 000 habitants 7 Figure 5. Événements sélectionnés de l'histoire de la génétique et du cancer 13 Figure 6. Estimation de la proportion des familles présentant une forte histoire familiale

pouvant être associées à des mutations de BRCA1, BRCA2 ou aucun de ces deux gènes. D'après les données de Ford et collaborateurs.66 19

Figure 7. Modèle polygénique de la répartition du risque de cancer du sein chez les cas et dans la population 38

Figure 8. Proportion des cas de cancer du sein expliqués par la proportion de la population à risque élevé 38

Figure 9. Variation de la taille de l'échantillon 40 Figure 10. Représentation des domaines des protéines BRCA1 et BRCA2 humaines 42 Figure 11. Structures chromosomiques aberrantes de cellules déficientes en Brca2 44 Figure 12. Mécanismes de la régulation de GADD45A par p53, BRCA1 et ZBRK1 47 Figure 13. Recrutement des premières protéines de détection/réparation au site de bris 50 Figure 14. Mécanisme de la recombinaison homologue 51 Figure 15. Implication de BRCA1 et BRCA2 dans la voie Fanconi/BRCA 57 Figure 16. La réparation des ICLs rencontrés lors de la replication par la voie

Fanconi/BRCA 57 Figure 17. Implication de BRCA1 dans la régulation du cycle cellulaire 62 Figure 18. Position des altérations pouvant affecter l'expression d'un gène 64

CHAPITRE I Figure 1. Proportional genomic structure of the ZBRK1 gene and protein structure of

ZBRK1 illustrating domains involved in function/regulation of the protein 104 Supplemental Figure 1. Pairwise linkage disequilibrium (LD) measures for SNPs identified

in ZBRK1 and LD measures according to HapMap for ZBRK1 chromosome region 105

CHAPITRE II Figure 1. Pairwise LD measures of\D'\ and r2 for the 12 SNPs identified in the breast

cancer and control series 131 Figure 2. Haploview predictions of haplotype blocks using SNPs displaying a MAF higher

than 5% 132

XV

CHAPITRE III Figure 1. Schematic representation of the NBN gene on chromosome 8q21 770 Figure 2. In silico analysis of the effect of coding variants on putative exonic splicing

enhancer (ESE) motifs by the ESEfinder program 777 Figure 3. Effect of the c.-242-l WdelAGTA deletion on NBN promoter activity 772 Figure 4. Linkage disequilirium across the NBN gene and neighbouring chromosome

region 773

LISTE DES ABREVIATIONS

3 75'UTR ADN/DNA ADNc/cDNA ADNâb/dsDNA ADNsb/ssDNA AF/FA aa AIR AKAP9 ALL ANGPT1 ARNm/mRNA ATBF1 ATM BACH1 BARD1 BDB/DSB BOC bp BRCA1/2 BRCT BR1P1 C5orf35 CASP8 CDX2 CDK CEPH CEU CDH1 CDX2 CHEK2 cSNP CtlP dbSNP ECHDC1 EM ER+/-ESE/ESS ESRI FAAP FGFR2 FHA GADD45A

3 75 ' untranslated region Acide Désoxyribonucléique/DeoxvnTjortwc/e/c acid ADN complémentaire/complementary DNA ADN double brins/double stranded DNA ADN simple brin/single stranded DNA Anémie de Fanconi/Fanconi Anemia Acides aminés/a/m'Ho acids ATM interacting region A kinase anchor protein 9 Acute lymphoblastic leukemia Angiopoietin 1 Acide ribonucléique messager/messenger Ribonucleic acid AT motif-binding factor 1 Ataxia Telangiectasia Mutated BRCA1-associated C-terminal helicase 1 BRCA1 -associated RING domain 1 Bris double brinslDouble strand breaks Breast and ovarian cancer Base pair Breast cancer 1/2, early onset BRCA1 c-terminal BRCA 1-interacting protein 1 Chromosome 5 orf35 Caspase 8 Caudal-type homeobox 2 Cyclin-dependent kinase Centre d'Étude du Polymorphisme Humain CEPH-Utah residents of Northern and Western Europe ancestry Cadherin 1 Caudal-type homeobox 2 Checkpoint Kinase 2 Coding SNP CTBP interacting protein SNP database Enoyl coenzyme A hydratase domain containing 1 Expectation maximized Estrogen receptor positive/negative Exonic splicing enhancer/silencer Estrogen receptor 1 Fanconi anemia associated protein Fibroblast growth factor receptor 2 Forkhead-associated Growth arrest and DNA damage-inducible alpha

XV11

Y-H2AX GNG12 GWAS HaR HBOC HMGA2 HR HWE IC/CI ICL ID IGF2 1RES ISE/ISS kb kDa LFL LFS LKB1 LD LDA LSP1 MAF MAP3K1 Mf MER3 M R MLPA MMC MMP9 MRE11A M/RJN MRPL23 MRPS30 MTBFl MYB N-/C-terminus NBN/NBS1 NBS NCBI NER NHEJ NKX3-1 OB OCCR OR PALB2

Gamma-H2AX G-Protein gamma 12 subunit Genome-wide association study Hazard ratio/Rapport de risque Hereditary breast and ovarian cancer High mobility group A T-hook 2 Homologous recombinationAtecombinaison homologue Hardy- Weinberg equilibrium Intervalle de confiance/confidence interval Interstrand crosslink Identification number Insulin-like growth factor 2 Internal ribosome entry site Intronic splicing enhancer/silencer Kilobase Kilo Daltons Li-Fraumeni-like syndrome classic Li-Fraumeni syndrome Liver kinase BI Linkage disequilibrium LD analyzsis program Lymphocyte-specific protein 1 Minor allele frequency Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 Macaca fascicularis Mesoderm induction early response family member 3 MRE11A interacting region Multiplex ligation-dependent probe amplification Mitomycin C Matrix metallopeptidase 9 MRE11 meiotic recombination 77 homolog A MRE11A/RAD50/Nibrin Mitochondrial ribosomal protein L23 Mitochondrial ribosomal protein S30 Muscle-specific MT binding factor v-myb Myeloblastosis viral oncogene homolog Amino-ZCarboxy-terminus Nibrin/ Nijmegen breakage syndrome 1 Nijmegen breakage syndrome National center for biotechnology information Nucleotide excision repair Non-homologous end joining NK3 homeobox 1 Oligonucleotide/oligosaccharide binding Ovarian cancer cluster region Odd ratio/i\appori de cotes Partner and localizer ofBRCA2

xviu

PCR PHTS PI3K PPP2R1A PTEN QRT-PCR RAD50/51 RC RING RNF146 RR RT-PCR SEN SERBP1 SIR SLN SNP SR SSPNN STK 11 SUMO TGFB1 TNNT3 TLS TNS T0X3 TP53 tSNP UCSC USP1 ZBRK1 ZFHX3 ZNF350 ZNF432 ZNF613 ZNF614 ZNF615

Polymerase chain reaction PTEN hamartoma tumor syndrome Phosphatidylinositol-3-kinase Protein phosphatase 2 regulatory sub-unit 1, alpha Phosphatase and tensin homolog Quantitative real-time PCR Rad50/5l homolog Risque cumulatif Really interesting new gene Ring finger protein 146 Risque relatif/Relative risk Real-Time PCR Séquence d'exportation nucléaire SERPINE1 mRNA binding protein 1 Standardized incidence ratio Séquence de localisation nucléaire Single nucleotide polymorphism Serine/arginine-rich Splice site prediction program using neural network Serine/threonine kinase 11 Small ubiquitin-like modifier Transforming growth factor beta 1 Troponin T type 3 Translesion synthesis Type non spécifique TOXhigh mobility group box family member 3 Tumor Protein 53 Tagging SNP University of California Santa Cruz Ubiquitin specific protein 1 Zinc finger and BRCA1-interacting protein with a KRAB domain 1 Zinc finger homeobox 3 Zinc finger protein 350 Zinc finger protein 432 Zinc finger protein 613 Zinc finger protein 614 Zinc finger protein 615

INTRODUCTION

1. Le cancer Le cancer est un groupe hétérogène de maladies : plus de 100 sous-types de cancers sont connus chez l'humain, dont plusieurs peuvent affecter un même organe.1 Le cancer est associé à une croissance anormale des cellules, qui présentent une dérégulation des processus de prolifération et de mort cellulaire. Ces cellules peuvent acquérir de nouvelles capacités, telle la propriété d'envahir les tissus adjacents et de former des métastases à d'autres tissus ou organes, pouvant ainsi entraîner la morbidité ou la mort de l'hôte. Les changements observés au niveau de ces cellules sont ultimement le résultat d'une expression anormale de gènes. Ce dérèglement peut avoir plusieurs sources : l'hérédité, l'action d'un composé mutagène, la translocation d'une partie d'un chromosome, l'amplification ou la perte d'hétérozygosité d'une région du génome, ou tout autre mécanisme pouvant mener à une transcription anormale ou à une translocation d'une partie d'acide désoxyribonucléique (ADN ou desoxyribonucleic acid; DNA). ' Dans plusieurs cas, les causes exactes du cancer sont inconnues, mais il reste clair qu'il s'agit de l'action conjuguée de facteurs environnementaux et génétiques agissant ensemble pour l'initiation (modification initiale de l'ADN) ou la promotion (prolifération des cellules initiées) du cancer (Figure 1). Les changements de l'ADN peuvent suivre soit un modèle génétique (changement dans la séquence même de l'ADN) ou un modèle épigénétique (modification de l'expression d'un gène sans que la séquence de l'ADN soit affectée), bien que ces deux modèles ne soient pas mutuellement exclusifs.3'4

4e -.Hautrw S j \^m\ normale mutation mutation

Figure 1. Le cancer est un processus à étapes multiples. La cellule accumule des mutations lui permettant de passer les étapes d'initiation, de promotion, de multiplication clonale et de progression. Dans le cas du cancer du sein, les métastases sont retrouvées le plus fréquemment au niveau des poumons, du foie et des os.

1.1 Epidémiologie : les conséquences du cancer à travers le monde et au Canada. Le cancer est l'une des causes principales de mortalité au monde, arrivant au second rang

derrière les maladies coronariennes. Pour l'année 2007, on estime qu'il y a eu 12 millions

de nouveaux cas et 7,6 millions de morts dus au cancer à travers le monde.5 D'ici 2050, on

estime que l'incidence du cancer grimpera à 27 millions de nouveaux cas par an et sera

associée à 17,5 millions de décès annuels, et ce dû seulement à des facteurs

démographiques de croissance et de vieillissement de la population. Dans les pays en voie

de développement, on s'attend à observer un changement de l'incidence et des types de

cancers retrouvés. Ce phénomène serait associé à un prolongement de l'espérance de vie

(baisse de la mortalité infantile et de la mortalité associée aux maladies infectieuses) et à

l'adoption d'un mode de vie «occidental» (hausse du taux de fumeurs, adoption d'une diète

riche en gras saturés et en calories, baisse de l'activité physique).5

Les types de cancers et leur incidence varient selon la région géographique et le statut

socio-économique des pays (Figure 2). Chez les hommes, le cancer du poumon est le plus

fréquemment diagnostiqué, bien qu'il soit devancé par le cancer de la prostate dans les pays

économiquement développés. Le cancer du poumon est aussi le type de cancer responsable

de la plus grande proportion de décès, et ce quel que soit le statut socio-économique. Chez

la femme, le cancer du sein est à la fois le plus diagnostiqué et le responsable de la plus

grande proportion des décès mondialement, bien qu'il arrive au second rang derrière le

cancer du poumon en termes de causes de décès par cancer au Canada.

1.1.1 L'épidémiologie du cancer du sein En raison de son incidence élevée et de son pronostic relativement bon (les taux de survie

sont en moyenne de 73% dans les pays à économie développée et de 57% dans les pays en

voie de développement), le cancer du sein est le cancer le plus prévalent au monde. La

prévalence est habituellement calculée sur 5 ans puisque le risque encouru par les

survivants après cette période est généralement près de celui de la population en général.

Les individus toujours en vie après cette période sont donc considérés «guéris», bien que

dans le cas du cancer du sein, les femmes ayant été atteintes présentent un risque plus élevé

que la population pour une longue période (voir la section 1.3 Les facteurs de risque du

cancer du sein). On estime que 4,4 millions de femmes vivent actuellement avec un cancer

du sein diagnostiqué au cours des 5 dernières années mondialement, ce qui est trois fois

plus que la prévalence du cancer du poumon pour la même période, hommes et femmes

confondus.7 La prévalence élevée du cancer du sein a eu pour effet d'attirer l'attention sur

ce type de cancer. Cette attention s'est à son tour traduite par des améliorations des

techniques de prévention, de diagnostic et de traitement, permettant d'obtenir une meilleure

définition de la biologie du cancer du sein et des facteurs pouvant modifier le risque d'une

femme de développer cette maladie.

NUII*.eaux cas

Pays à économie dt-aeloppée

Pays ra voie de développement

Canada

• 4. •

c-Çdç ■ Poumon ■ Prostate ■ Estomac "Colorectal ■Foie ■Sein

Col de l'utérus ■ Oesophage -"Thyroïde ■ Pancréas ■ Corps de

l'utérus m Lymphome non

Hodgkinien ■ Vessie ■Ovaire J Autres

Figure 2. Répartition relative des 5 types de cancers les plus fréquents au monde et au Canada. La partie centrale de la figure montre la sous-division de ces cancers en fonction du statut socio-économique des pays. Les pays à économie développée comprennent l'Amérique du Nord, le Japon, l'Europe, l'Australie et la Nouvelle-Zélande. Les pays en voie de développement comprennent le reste du monde. D'après les données de Global Cancer Facts and Figures 20075 et Canadian Cancer Statistics 20086.

1.2 Le cancer du sein

1.2.1 Le sein normal

Le sein a pour fonction primaire la synthèse, la sécrétion et l'éjection du lait. Le sein est composé de la glande mammaire proprement dite, de tissu conjonctif, de tissu adipeux, de vaisseaux sanguins et lymphatiques, de nerfs et des ligaments suspenseurs du sein (Figure 3). Le développement de la glande mammaire est particulier puisqu'il se fait tardivement, et que celle-ci subit un remodelage au cours de la vie. La glande mammaire (qui existe aussi bien chez l'homme que chez la femme) est rudimentaire à la naissance. C'est à la puberté que s'effectue une grande part de son développement. L'action de la testosterone en inhibe le développement chez l'homme, alors que chez la femme, l'action des hormones ovariennes (estrogènes et progestérone) le stimule. On observe alors une accumulation de tissus adipeux et fibreux, qui occupe 80% ou plus du volume du sein chez une femme adulte n'allaitant pas. Ceci est accompagné de l'épaississement, l'allongement et le branchement des canaux, du développement de lobules glandulaires, ainsi que des changements de pigmentation et de dimensions du mamelon et de l'aréole. Au cours des cycles menstruels subséquents, on observe une phase de prolifération légèrement accrue lors de la phase lutéale du cycle, avec une augmentation du volume du sein qui peut atteindre jusqu'à 15%.8

Figure 3. Anatomie du sein humain normal. Les canaux lactifères se rejoignent près du mamelon, et de 4 à 18 canaux en sortent. Le réseau des canaux lactifères est très complexe, avec un arrangement enchevêtré comparable aux racines d'un arbre. Ces canaux se branchent jusqu'à former des acini sécrétoires responsables de la production du lait. Adapté d'une illustration de Patrick J. Lynch, illustrateur médical, 2006.

C'est au moment de la première grossesse menée à terme que la différenciation la plus

poussée se produit. À ce moment, les changements hormonaux associés à la grossesse

produisent une croissance et une prolifération intenses, et induisent la formation des acini

sécrétoires (produits par un branchement plus poussé des canaux et leur différenciation),

une augmentation de la quantité de tissu adipeux et une augmentation du flux sanguin. Au

moment du sevrage, la glande mammaire involue (arrêt de l'activité sécrétoire et retour à

un état moins différencié qui implique majoritairement les acini retrouvés au bout des

canaux) jusqu'à la grossesse suivante. Le dernier changement important de la glande

mammaire survient après la ménopause. À ce moment, il y a arrêt de la production des

hormones ovariennes, ce qui provoque une involution de la glande mammaire.

Contrairement à l'involution observée après une période d'allaitement, cette involution

touche à la fois les lobules et les canaux. Ces structures régressent et sont progressivement

remplacées par du collagène et du tissu adipeux. Chez la femme âgée, il ne reste plus que

quelques acini et canaux dispersés à travers le tissu adipeux.9

1.2.2 Lésions et maladies du sein

Il existe plusieurs lésions et maladies du sein, bénignes ou malignes. La majorité de ces

lésions sont retrouvées au niveau de l'unité fonctionnelle de base du sein, l'unité terminale

ducto-lobulaire (Figure 3). Un nombre relativement grand de lésions bénignes du sein

existent, et il semble que certaines d'entre elles peuvent êtres asymptomatiques et

relativement courantes dans la population.10 La compréhension des lésions bénignes est

essentielle, car il a été démontré que le développement de certaines d'entre elles constitue

un facteur de risque de développer un cancer du sein (voir la section 1.3 Les facteurs de

risque du cancer du sein). De façon pratique, ces lésions sont classées en trois groupes,

selon le risque relatif de cancer du sein qu'elles confèrent: les lésions non prolifératives, les

lésions prolifératives sans atypie et les lésions prolifératives avec atypie (Tableau 1).

Selon leur histologie, on reconnaît plusieurs types de lésions mammaires malignes. Dans un

premier temps, on distingue les lésions sur la base de leur degré d'invasion. La principale

lésion pré-invasive est le carcinome mammaire in situ, dans lequel les cellules anormales

demeurent confinées au système ducto-lobulaire et ne présentent pas d'invasion au stroma.

Le recours aux programmes de mammographies de dépistage a grandement augmenté la

fréquence du diagnostic de ce type de lésion.11'12 Les carcinomes infiltrants sont divisés en

carcinomes canalaires de type non spécifique (TNS) et en tous ceux qui possèdent des

caractéristiques morphologiques distinctes qui permettent une caractérisation reproductible

en un type spécifique. Par conséquent, la classification des carcinomes canalaires en est une

d'exclusion. Les carcinomes canalaires TNS représentent entre 70% et 80% des tumeurs

malignes de la glande mammaire, les autres types de carcinomes canalaires (tubuleux,

crubriforme infiltrant, mucineux, papillaire infiltrant, sécrétant, apocrine infiltrant,

adénoïde kystique, médullaire) étant beaucoup moins fréquents. Le dernier type de

carcinome infiltrant est de type lobulaire, et représente de 5% à 14% de tous les carcinomes

infiltrants.11'12

Tableau 1. Classification des lésions bénignes du sein suite à l'examen histologique, selon le risque relatif de cancer du sein. Risque Prolifération Résultats de l'examen histologique Pas d'augmentation Minimale

Faible augmentation Prolifératif (risque relatif : 1,5 à 2,0) sans atypie

Augmentation modérée Prolifératif (risque relatif : >2,0) avec atypie

Changements fibrokystiques : kyste et ectasie canalaire (72%), hyperplasie épithéliale simple (40%), adénose non-sclérosante (22%), et fibrose périnanalaire (16%)*; adénofibrome simple (15-23%)+; et lésions diverses (hyperplasie lobulaire, hypertrophie juvénile et hyperplasie du stroma) Tumeurs bénignes : hamartome, lipome, tumeur phyllodeî, papillome solitaire, neurofibrome, adénome géant et adénome myoepithelial Lésions traumatiques : hématome, nécrose adipeuse et lésions résultant de la pénétration d'un corps étranger Infections : granulome et mastites Sarcoïdose Métaplasies : squameuse ou apocrine Mastopathie diabétique Hyperplasie canalaire sans atypie, adénofibrome complexe (kystes de plus de 3mm de diamètre, adénose sclérosante, calcifications épithéliales ou changements papillaires apocrines), papillome ou papillomatose, cicatrice radiale et métaplasie cylindrique) Hyperplasie atypique canalaire et hyperplasie atypique lobulaire

*Les pourcentages indiquent la proportion de seins examinés lors d'autopsies présentant ce type de lésion. Données de Sandison13 fDonnées de Goehring et Morabia.14 JLa plupart des tumeurs phyllodes sont considérées comme des tumeurs fibroépithéliales, mais certaines ont des caractéristiques cliniques et histologiques malignes. Adapté de9

1.3 Les facteurs de risque du cancer du sein

Le cancer du sein est une maladie complexe influencée par l'effet de plusieurs facteurs

génétiques et environnementaux (Tableau 2). Au sens strict, les deux facteurs de risque les

plus importants sont le sexe (bien qu'il soit rare, le cancer du sein existe chez les hommes)

et l'âge.15'16 Outre ces deux éléments, plusieurs facteurs de risque ont été étudiés en ce qui

concerne le cancer du sein, plusieurs d'entre eux étant interreliés.

Région géographique :

De façon similaire à ce qui est observé pour l'incidence et la mortalité associées au cancer

en général, on observe une grande variabilité dans l'incidence du cancer du sein par pays

(Figure 4). Bien que l'on parle de régions géopolitiques en tant que facteurs de risque,

celles-ci demeurent une mesure indirecte reflétant à la fois des particularités génétiques

propres à certaines populations et ethnies, des différences de modes de vie et des variations

d'exposition à l'environnement. De plus, bien que des corrélations aient été faites entre

l'incidence observée et le statut socio-économique des pays, il est aussi possible de voir

cette même variation au niveau d'individus vivant dans une même communauté17'18, ainsi

qu'entre des individus vivant dans des communautés urbaines par opposition à des 17

communautés rurales .

Figure 4. Représentation du taux de cancer du sein par pays, par 100 000 habitants. A. Incidence B. Mortalité. Adapté de la base de données GLOBOCAN 2002 (http://www-dep. iarc. fr/globocan/database .htm).

Facteurs hormonaux :

Il a été démontré que les hormones ovariennes sont impliquées dans le développement du

cancer du sein. Plusieurs facteurs de risque connus influencent la durée de l'exposition de

la femme à ces hormones au cours de sa vie, en particulier durant sa période reproductive.

En effet, une ménarche (premières menstruations) tardive, une ménopause précoce, la

multiparité (plusieurs grossesses à terme), un jeune âge à la première grossesse,

l'allaitement et des taux bas de prolactine dans le sang sont associés à un risque moindre de

http://wwwdep

http://wwwdep

cancer du sein, alors que l'action d'hormones exogènes ne semble augmenter le risque que

faiblement et de façon transitoire 19-25

Tableau 2. Facteurs de risque modifiant le risque de développer un cancer du sein. Facteur de Groupe risque Risque accru Risque faible Commentaires Sexe

Age

Race et ethnicité

Femmes Hommes

Caucasiennes Afro-américaines

Région géographique

Amérique du Nord et Europe

Asie, Afrique et Amérique du Sud

Statut socio-économique

Elevé Faible

Type de communauté

Urbaine Rurale

Education Avancée Faible

Taille à l'âge adulte

>l,75m <l,6m

Indice de masse corporelle Activité physique

+

Consommation d'alcool

> 10g par jour Og par jour

Irradiation thoracique

Exposition durant l'enfance

Exposition >40 ans

Age à la ménarche

<12 ans >15 ans

Age à la ménopause

>55 ans <45 ans

Nombre de grossesses à terme

Nullipare Multipare

En Amérique du Nord 1/100 cas de cancer du sein est retrouvé chez l'homme.15

L'incidence augmente avec l'âge. La probabilité de développer un cancer du sein invasif au cours des 10 années subséquentes passe de 1,5% à 40 ans à environ 3% à 50 ans et à plus de 4% à 70 ans.16

La différence d'incidence retrouvée entre les femmes caucasiennes et hispaniques, amérindiennes-inuits et asiatiques-insulaires du Pacifique est atténuée après ajustement pour les autres facteurs de risque. Bien que l'incidence soit plus faible chez les femmes afro-américaines, le taux de mortalité semble plus élevé que chez les femmes caucasiennes.26,27

Reflète probablement à la fois la présence de facteurs génétiques propres aux populations, mais aussi des différences du mode de vie et d'exposition à l'environnement.28

La différence semble demeurer significative après ajustement pour les facteurs de risque inter individus (âge, histoire familiale, parité, etc.). Le statut socio-économique de la communauté semble être distinct du statut socio-économique individuel.1

La différence demeure significative après ajustement pour les facteurs de risque inter individus ,17

En général, le niveau d'éducation reflète en partie le statut socio-économique individuel.17,18

Le risque semble augmenter avec la taille. Cette association semble plus forte chez les femmes ménopausées.29

Un indice de masse corporelle élevé est associé à une diminution du risque de cancer du sein chez les femmes pré-ménopausées, mais à une augmentation du risque chez les femmes post-ménopausées.29

La tendance indique une réduction de 6%/heure d'activité physique soutenue par semaine. L'effet de l'activité physique semble plus important chez les femmes post-ménopausées.30

Le risque de cancer du sein augmente de 7-9% pour chaque augmentation de 10g d'alcool consommé par jour.31,32

L'exposition à des radiations (par exemple les survivants des bombes atomiques ou suite à une intervention thérapeutique) augmente le risque, qui semble varier en fonction de la quantité de radiation.33

Plus la ménarche survient tôt, plus le risque de cancer du sein semble élevé. Ce facteur serait associé à la durée d'exposition aux estrogènes chez la femme.:

Plus une femme a une ménopause tardive, plus son risque de cancer du sein est augmenté. Pour tous les 5 ans de différence dans l'âge à la ménopause, le risque de cancer du sein change d'environ 17%.19

Le risque de cancer du sein diminue avec le nombre de grossesses à terme. En absence d'allaitement, chaque grossesse à terme diminue le risque relatif de cancer du sein de 7%.20

Age à la >30 ans <20 ans premiere grossesse

Allaitement +

Taux de prolactine Densité Forte (>75%) Faible (<5%) mammaire

Contraceptifs Utilisation Non-oraux récente utilisatrices

ou utilisation >10ans

Thérapies Utilisation Non-hormonales récente utilisatrices substitutives ou utilisation

>5 ans Maladie + -bénigne du sein

Histoire ' - .':,«VSS| personnelle de cancer du sein Histoire + -familiale

Mutation d'un + des gènes de susceptibilité

Une première grossesse à terme à un jeune âge est associée à une diminution du risque de cancer du sein. Le risque semble diminuer de 3% pour chaque année plus jeune la femme est lorsqu'elle a sa première grossesse à terme.20

Le risque relatif de cancer du sein décroît de 4,3% pour chaque période de 12 mois d'allaitement. Cette diminution du risque s'ajoute à la diminution associée à chaque grossesse à terme.2

Des niveaux plus élevés de prolactine pourraient être associés à un risque accru de cancer du sein. Un sein dense est associé à un plus grand risque de cancer du sein, avec un risque 4,64 fois supérieur lorsque la catégorie la plus dense (>75%) est comparée à la catégorie la moins dense (<5%). 4

Risque légèrement accru de cancer du sein. Le risque semble décroître avec le temps après l'arrêt de la prise des contraceptifs oraux et devient égal à celui de la population après 10 ans. Il est à noter que puisque les utilisatrices des contraceptifs oraux sont typiquement jeunes et que l'incidence dans ce groupe est faible, cette augmentation du risque correspond à une faible augmentation du nombre de cas de cancers.22

Le risque augmente avec le nombre d'années d'utilisation. Cet effet diminue à l'arrêt et disparaît presque entièrement après 5 ans. Le risque semble légèrement plus élevé pour les utilisatrices de combinaisons estrogène/progestérone versus estrogènes seul.' Hyperplasie confirmée par biopsie du tissu mammaire, en particulier une hyperplasie atypique, est associée à un risque accru de cancer du sein 4-5 fois plus élevé qu'une femme ne présentant pas de changement prolifératif au niveau du sein. Le risque d'une femme ayant déjà eu par le passé un diagnostic de cancer du sein est 2-6 fois plus élevé que le risque de la population générale.36

Le risque augmente avec le nombre de parents au premier degré atteints. Par exemple, pour une femme de 20 ans en santé, la probabilité qu'elle développe la maladie augmente en fonction du nombre de parents avec un cancer du sein et varie en fonction de l'âge auquel ces cancers sont diagnostiqués.37

Des mutations des gènes de susceptibilité au cancer du sein sont associées à un risque accru de développer la maladie. (Voir la section 2.0 Déterminants génétiques du cancer su sein.)38

L'histoire médicale personnelle et familiale :

Tel qu'abordé précédemment (voir la section 1.2.2 Lésions et maladies du sein), certaines

lésions bénignes du sein sont associées à un risque accru de cancer (Tableau 1). En général,

les lésions du sein présentant de l'hyperplasie (qui constitue une prolifération du nombre de

cellules formant un tissu) présentent un risque légèrement accru de cancer. Ce risque est

encore augmenté si cette prolifération cellulaire est accompagnée d'atypie, c'est-à-dire que

les cellules n'ont plus leur morphologie normale. L'hypothèse actuelle suggère que des

carcinomes mammaires pourraient se développer à partir de lésions prolifératives avec

10

atypie, et que ces dernières pourraient avoir pour origine les lésions prolifératives sans

atypie.11 C'est pourquoi les lésions du sein présentant des caractéristiques de prolifération,

en particulier celles avec de l'atypie, sont généralement considérées comme des lésions pré

cancéreuses.

En plus de ces maladies bénignes du sein, une histoire personnelle de cancer du sein

confère 2 à 6 fois le risque de la population en général de développer une seconde tumeur

primaire du sein. Une tumeur est dite «primaire» si elle se développe à partir des cellules

du tissu en question, dans le cas présent le sein, qui sont devenues cancéreuses. Une tumeur

sera dite «secondaire» si elle a pour origine des cellules détachées d'une tumeur dans un

autre organe, qui se sont propagées dans le corps (métastases). Parmi les facteurs affectant

l'incidence de cancer contralateral, on reconnaît, outre l'histoire familiale de cancer, l'âge

au diagnostic du premier cancer primaire. Par exemple, l'incidence «âge spécifique» du

cancer du sein contralateral est 50 fois plus élevée dans le groupe 30-34 ans que l'incidence

de cancer unilatéral au même âge.39 Ensuite, l'incidence de cancer contralateral diminue

avec l'accroissement de l'âge au diagnostic du premier cancer, peut-être dû en partie à

l'épuisement d'une sous-population à risque.39 Il est à remarquer que l'épidémiologie du

second cancer est tributaire de facteurs tels l'hérédité, le mode de vie, le traitement

administré suite au premier cancer, mais aussi à la surveillance accrue faisant partie

intégrante du suivi de la patiente suite au premier cancer.

De la même façon qu'une histoire personnelle de maladie du sein (bénigne ou maligne) est

associée à un risque accru de cancer du sein, l'histoire familiale joue aussi un rôle dans la

susceptibilité à ce cancer, et représente un facteur de risque majeur. Une femme ayant une

parente au premier degré (mère, sœur, fille) ayant été diagnostiquée d'un cancer du sein

présente un risque relatif de cancer du sein deux fois plus élevé.37 Le risque conféré

augmente s'il s'agit d'un cancer bilatéral et/ou si ce cancer est précoce (avant la

ménopause). Le risque est aussi augmenté avec le nombre de parentes au premier degré

atteintes (et de façon moins importante le nombre de parentes au deuxième degré), ainsi

qu'avec une histoire familiale de maladie bénigne du sein.36'37,40 Le regroupement de cas de

cancer du sein à l'intérieur d'une même famille met en évidence le partage de facteurs de

risque liés au mode de vie, mais surtout l'importance de l'hérédité dans la susceptibilité au

11

cancer du sein. Que ce soit de façon directe (par la transmission d'allèles de susceptibilité

au cancer du sein; voir la section 2. Déterminants génétiques du cancer du sein) ou

indirecte (par exemple des variants de gènes régulant un facteur de risque du cancer du sein

tel que la densité mammaire41), l'hérédité représente fort probablement une composante

pivot dans la détermination de quelle femme développera un cancer du sein au cours de sa

vie.

12

2. Déterminants génétiques du cancer du sein

2.1 Anecdotes historiques : cancer du sein, histoire familiale et prédisposition Le cancer, en particulier le cancer du sein, est connu depuis longtemps (Figure 5). Déjà

parmis les plus vieux traités médicaux connus, le papyrus Edwin Smith et le papyrus Georg

Ebers de l'époque pharaonique font mention de cancers, en particulier le cancer du sein.

Toutefois, sa prévalence devait être moindre que celle d'aujourd'hui, dû entre autres à des

changements importants du mode de vie, de l'exposition aux facteurs de risque

environnementaux, de l'espérance de vie, ainsi que des options de traitement disponibles.

L'idée d'un regroupement familial des cas de cancer du sein, bien que beaucoup plus

récente, n'est pas nouvelle. Rapporté comme une curiosité dans la littérature médicale de

l'époque gréco-romaine,42 le diagnostic de plusieurs cas au sein d'une même famille était

plutôt associé à une exposition à des facteurs environnementaux communs. Hippocrate

suggérait que la maladie est un état lors duquel le corps expérimente une difficulté à

maîtriser son environnement. Galien, un médecin réputé du Ile siècle, notait au sujet des

maladies «qu'aucune cause externe n'est efficace sans une prédisposition du corps lui-

même. Autrement, les causes externes qui affectent l'un nous affecteraient tous».

Il fallut attendre les 18e et 19e siècles avant de retrouver dans la littérature médicale des

anecdotes reliant l'histoire familiale et le cancer du sein. En 1757, le chirurgien français Le

Dran est appelé à consulter au sujet d'une religieuse de 19 ans atteinte d'un cancer du sein.

Convaincue de la nature héréditaire et systémique de sa maladie puisque sa grand-mère et

un grand-oncle en étaient décédés, elle affirmait que son sang «était porteur d'un ferment

cancéreux naturel à sa famille».43 La première étude détaillée d'une famille présentant de

nombreux cas de cancer du sein ne devait paraître que plus de 100 ans plus tard. Un autre

chirurgien français, Paul Broca, étudie l'histoire médicale d'une famille présentant 16 cas

de mort par cancer sur 4 générations, en particulier 10 cas de cancer du sein. Ses

observations, publiées en 1866, indiquent que l'influence de l'hérédité sur le

développement de tumeurs demeurait un sujet de controverse, bien que lui-même soit

convaincu qu'un tel lien puisse être établi, du moins dans certains cas.44 Selon les

13

estimations de son contemporain Lebert, un cancéreux sur sept rapporte une histoire

familiale de cancer 45

de fossiles indique la présence de tumeurs (os;

25sv .JC-5*Ccisas Première classification de tumeurs du sein 1713 Observe une fréquence accrue de

cancer du sein chez les nonnes 1*51 Heraaaaa Lebert

Traité pratique des cancéreuses et affections curables 1866 Paul Broca Traité des tumeurs 1*90 David voa Haasemann Le cancer est un désordre génétique 1900 DeVries/Correns/Tsctiennak Redécouverte des travaux de Mendel

1913 Alfred Scott Warthin Etude de famille» présentant une féquence élevée de cancen

1953 Ni L'accumulatiôô de mutations peut expliquer

la distribution de l'incidence de cancers 1M0 HwreU et Haaterford Chromosome de Phil

1976 Peter \owell Accumulation et selection de changements

génétique» lors de la tirrnorigenése

19*3 Cavanee et collaborateurs Découverte du premier gène supresseur de tumeurs

l9»Uviag»oaetHariow Point» de restriction du cycle cellulaire

1994 M U ef ca-aaaboratean i du gène BRCA1

1995 Waaster et eoUaboraSmrtr Identification du gène BRCA2

—30*4-15*0 av. JC Papyrus Smith et Ebers

4*»-375ar.JC Le cancer ressemble i un crabe (catemos)

Caiea 131-200

^ W T ^ ë S T Û D Ï - ï r

Gregor Mendd 1865 Lois de l'hérédité

Gearge Beatsoa 18 Réduction d'une tumeur chez une patiente c

1901-1914 Theodor I Les chromosomes sont des unités de 1 '1 et des abandons de ceux-ci causent le cancer

LathrapetL«ebl91S| htfhimcn hormonales sur le développement du c

Watson et Crick 1953 Structure de l'ADN

Alfred Kaadsoa 1971 Hypothèse des deux «coups»

1977 Méthode de séquençage dé l'ADN

Mallk,SaildetcaUaborateanl9M Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

Hal et collaborate»!-! 199* Premier locus de suceptibilité au cancer du sein

Wooster et collaborateurs 1994 Deuxième locus de suceptibilité au cancer du sein

Eastaa et colaboratean 2 « 7 Association de variants communs avec le cancer du sein

(FGFR2, TNRC9/LOC643714, MAP3K, LSP1.8q)

Figure 5. Événements sélectionnés de l'histoire de la génétique et du cancer.

Près de 30 ans après Broca, Alfred Scott Warthin s'intéresse à la question de l'hérédité en

relation avec le cancer lorsqu'il remarque en 1895 l'état dépressif de sa couturière,

convaincue de sa mort éventuelle du cancer dû à la fréquence très élevée de cette affliction

dans sa famille. Cela le conduit à faire l'étude détaillée de l'histoire médicale de cette

famille, ainsi que d'autres familles présentant plusieurs cas de cancer. Il publiera, en 1913,

la première étude comprehensive d'histoires familiales de cancer et mettant en relief leur

caractère apparemment héréditaire, ce qui devait paver la voie à l'étude moderne des

file:///owell

14

familles à risque élevé de cancer.4 Entre autres il concluait que la tendance héréditaire

semblait plus marquée lorsque la famille présentait une histoire familiale de cancer à la fois

du côté maternel et paternel. De plus, il observait que dans une famille présentant des

carcinomes sur plusieurs générations, il existe une tendance à développer les néoplasmes à

un âge précoce chez les membres des générations les plus récentes.

Les décennies subséquentes voient se multiplier les descriptions de familles présentant de

nombreux cas de cancer. À travers la quantité brute de cas de cancer du sein diagnostiqué,

on pouvait maintenant identifier, comme les familles décrites par Broca et Warthin, des

familles présentant des syndromes de cancer du sein héréditaires, chacun caractérisé par

une combinaison de tumeurs (Tableau 3). Le plus commun de ceux-ci est le syndrome de

cancers du sein et/ou de l'ovaire héréditaire (hereditary breast and ovarian cancer

syndrome), décrit dans la littérature au début des années 70.47'48

En parallèle de ces études, le 20e siècle voit se développer une nouvelle science dérivée de

la biologie, la génétique. Peu à peu, tel que prédit par les travaux de Boveri au début du 20e

siècle, les bases génétiques de l'hérédité et de plusieurs maladies, dont le cancer, sont

découvertes. Entre autres, on assiste à l'identification de gènes suppresseurs de tumeurs,

dont le dérèglement est associé au développement de tumeurs. Ainsi, un modèle de

développement du cancer dans lequel la cellule accumule des mutations devant

éventuellement mener au développement tumoral est articulé par Knudson au début des

années 70.49 Selon ce modèle, le premier «hit» peut être acquis ou hérité, d'où la

transmission d'une susceptibilité telle que celle qui est observée dans les syndromes de

cancers héréditaires. C'est à travers l'étude de ces familles, en particulier les familles du

syndrome de cancer du sein et de l'ovaire héréditaire, que l'identification de gènes de

susceptibilité de forte penetrance a été effectuée.

2.2 Gènes de susceptibilité au cancer du sein connus

Tel qu'illustré précédemment, l'accumulation de certains types de cancers à l'intérieur de

certaines familles a apporté un intérêt particulier à comprendre la place de la susceptibilité

héréditaire de l'individu dans la carcinogenèse. En effet, le cancer du sein tend à se

présenter en regroupement à l'intérieur de certaines familles et plus de 12% des femmes

15

atteintes d'un cancer du sein ont une parente au premier ou au deuxième degré elle aussi

atteinte.37 Bien que cette susceptibilité accrue puisse être le fruit du partage d'un même

environnement ou d'habitudes de vie semblables, des études chez des jumeaux mono- et

dizygotes indiquent que la majeure partie de cette agrégation familiale est le résultat d'une

susceptibilité transmise de façon héréditaire.50,51

Tableau 3. Principaux alleles de susceptibilité au cancer du sein connus. Type (l'allèle Gène Loci Syndrome associé

Risque de cancer du Fréquence sein (IC 95%)a des porteurs

Forte BRCA1 penetrance

BRCA2

17q21 Cancer du sein et de l'ovaire RC à 70 ans de 65% 0,10% héréditaire

13ql2 Cancer du sein et de l'ovaire RC à 70 ans de 45% 0,10% héréditaire / Anémie de Fanconi

TP53 17pl3.1 Li-Fraumeni RR: 18,1 (8,6-33,2) rare Penetrance PTEN 10q23.3 Cowden RC à vie de 25-50% rare incertaine STK11/LKB1 19pl3.3 Peutz-Jeghers RC à 70 ans de 30-50% rare :;; v

CDH1 16q22.1 Cancer gastrique héréditaire diffus RR: 6,6 (5,9-7,3) rare Penetrance A TM llq22-23 Ataxie-Télangiectasie intermédiaire CHEK2 22ql2.1

BRIP1/FANCJ 17q22-24 Anémie de Fanconi PALB2/FANCN 16pl2.1 Anémie de Fanconi

Faible FGFR2* lOq penetrance TOX3/TNRC9*.

LOC643714* 16q

MAP3K1 * 5q

RR: 2,37 (1,51-3,78) 0,40% OR: 2,6 (1,3-5,4) 0,40% RR: 2,0 (1,2-3,2) 0,10% RR: 2,3 (1,4-3,9) rare OR: 1,26(1,23-1,30) 38% OR: 1,20(1,16-1,24) 25%

MAP3K1 * 5q 8q24 - ^ i m ^ ^ Ê m S -

MRPS30* 5pl2 LSP1*,H19 l lp l5 -

2q35 2q33

OR: 1,13(1,10-1,16) 28% OR: 1,08 (1,05-1,11) 40% OR: 1,19(1,13-1,26) 25% OR: 1,07 (1,04-1,11) 30% OR: 1,20(1,14-1,26) 50% OR: 0,88 (0,84-0,92) 13%

EDHCD1*,RNF146* 6q22.33 OR: 1,41 (1,25-1,59) IC : Intervalle de confiance (Confidence interval, CI); RC : Risque cumulatif (Cumulative Risk), RR : Risque Relatif

(Relative Risk), OR : Rapport de cotes (Odds Ratio, OR). 2 Fréquence des mutations de ces gènes, ou fréquence dans les populations européennes du polymorphisme pour lequel une association a été observée. * Gènes candidats potentiels situés dans la région en déséquilibre de liaison avec le variant testé. Adapté de Turnbull et Rahman 2008 et Campeau et collaborateurs 2008.52'53

Parmi ces cancers survenant à l'intérieur d'une même famille, on considère comme

«héréditaires» ceux pour lesquels une mutation d'un gène de susceptibilité est connue, ou

qu'une telle mutation est suspectée sur la base du risque élevé retrouvé dans la famille. Le

terme «familial» est quant à lui utilisé lorsque le cancer est retrouvé chez au moins deux

parentes au premier et/ou au second degré, sans que la transmission mendélienne d'une

susceptibilité soit apparente. Le reste des cas de cancers apparaît en l'absence d'une histoire

16

familiale de cancer du sein et sont habituellement appelés des cas «sporadiques» (Tableau

4).54 Cependant, la découverte de nouveaux alleles de susceptibilité et l'étude exhaustive

des antécédents familiaux liés à certains cas pourraient permettre de reclassifier une partie

des cancers familiaux (et même certains cancers sporadiques) en tant que cancers

héréditaires.

Tableau 4. Caractéristiques des familles présentant des cas de cancer du sein héréditaires, familiaux et sporadiques.

Classification Caractéristiques des familles Cancer Transmission autosomique dominante apparente de type spécifique de cancer héréditaire Âge p*us j e u n e a u diagnostic du cancer que ce qui est attendu

Multiples cancers primaires chez un même individu Regroupement de cancers rares Cancer bilatéral ou multifocal Parents au premier degré des individus atteints ont un risque de 50% d'être porteurs de la même mutation Penetrance incomplète et expression variable, de telle façon que les porteurs obligatoires de la mutation familiale peuvent ne pas être affectés par le cancer et que l'âge au diagnostic du cancer parmi les parents sera variable Les individus qui n'ont pas la mutation familiale ont le même risque que la population générale de développer un cancer

Cancer Plus de cas d'un ou plusieurs type(s) de cancer(s) à l'intérieur d'une même famille que ce qui est familial statistiquement attendu, mais pas de patron d'héritabilité clair

Âge variable au diagnostic Peut résulter du regroupement par chance de cas sporadiques Peut résulter de facteurs génétiques communs, d'un environnement et/ou d'habitudes de vie similaires Ne présente pas habituellement les caractéristiques classiques des syndromes de cancers héréditaires

Cancer Les cancers dans la famille sont probablement dus à des causes non héréditaires sporadique Âge du diagnostic typique

Même s'il y a plus d'un cas dans la famille, il n'y a pas de patron de transmission héréditaire clair La probabilité est très basse que la recherche de mutations de gènes de susceptibilité sera positive, le test génétique n'offrira pas d'information supplémentaire sur le risque de cancer

Adapté de Berliner et collaborateurs 2007.

L'étude de l'héritabilité d'une prédisposition au cancer du sein a permis de mettre en

évidence trois catégories d'allèles de susceptibilité, chacune de ces catégories étant associée

à un risque relatif et à une prévalence dans la population.38 La première classe est

constituée d'allèles rares de forte penetrance (BRCA1, BRCA2, TP53) et de penetrance

incertaine (PTEN, STK11, CDH1) associés à un risque élevé de cancer du sein, et qui ont

été identifiés par l'intermédiaire de syndromes familiaux. La seconde catégorie d'allèles de

susceptibilité regroupe des alleles relativement rares et de penetrances modérées (ATM,

17

CHEK2, BR1P1IFANCJ, PALB2IFANCN), associés à un risque moins grand de développer

un cancer du sein. Ces gènes ont été identifiés principalement par l'intermédiaire d'une

approche de type «gène candidat» dans laquelle la recherche de mutations est effectuée

directement dans un gène sélectionné sur la base d'une probabilité antérieure liée à sa

fonction. La toute dernière catégorie d'allèles récemment identifiés est constituée d'allèles

communs de faible penetrance, associés à un risque faible de cancer du sein. Puisque ces

alleles ne confèrent qu'une augmentation très faible de la susceptibilité au cancer du sein,

leur identification nécessite l'utilisation d'études de grande envergure regroupant plusieurs

milliers d'individus provenant de plusieurs pays et représentant habituellement plusieurs

ethnies. Les caractéristiques de ces gènes et de ces syndromes sont résumées au Tableau 3.

2.2.1 Alleles de forte penetrance

2.2.1.1 Le syndrome de cancer du sein et de l'ovaire héréditaire, BRCA1 et BRCA2 Ce syndrome de cancer du sein héréditaire le plus couramment retrouvé chez les familles

présentant une forte histoire familiale. On doit à Henry Lynch, au début des années 1970, la

réalisation qu'une agrégation de cas de cancers du sein et de l'ovaire47'48 semble souvent

apparaître à un jeune âge dans certaines familles.55 Le syndrome HBOC est caractérisé par

la présence de cancers du sein avant la ménopause, de cancers de l'ovaire (peu importe

l'âge), de cancers du sein bilatéraux, de cancers du sein chez l'homme, et par la présence

chez un même individu de cancer du sein et de l'ovaire. L'analyse de ces familles semblait

suggérer l'existence d'un (de) gène(s) de susceptibilité au cancer du sein et/ou de l'ovaire

se transmettant dans ces familles selon un mode autosomique dominant et présentant une

penetrance élevée.56 La première localisation convaincante d'un locus de susceptibilité au

cancer du sein a été présentée par Hall et collaborateurs en 1990.57 L'identification de ce

locus au chromosome 17q21, appelé Breast Cancer locus 1, a précédé de quelques années

la localisation d'un second locus au chromosome 13ql2-1358 et l'identification des deux

gènes impliqués, en 1994-1995 : BRCA1 e\BRCA2 (Breast cancer 1/2, early onset).59'60

Prévalence des mutations de BRCA1 et BRCA2

La détermination de la prévalence exacte des mutations de BRCA1 et BRCA2 est un

problème complexe, puisque cette dernière est influencée par la population (ou le sous-

18

groupe de patients) et la méthode de détection employée. En effet, concernant les cas de

cancers du sein et de l'ovaire provenant de la population générale, la fréquence des

mutations de BRCA1 est estimée à 0-7% alors que celle de BRCA2 est estimée à l-3%.61

Lorsque la recherche de mutations est restreinte à des patients présentant des

caractéristiques associées à des syndromes héréditaires (cancer de l'ovaire, cancer du sein

précoce, cancer du sein chez l'homme) mais en l'absence d'histoire familiale établie ou

rapportée, la prévalence des mutations BRCA1 et BRCA2 augmente (Tableau 5). En

général, on estime que des mutations de BRCA1 et BRCA2 sont retrouvées dans 16-24%

des familles présentant une histoire familiale,62"65 et on observe une proportion variable des

cas reliés à BRCA1 et BRCA2 en fonction du type d'histoire familiale (Figure 6).66'67 Ainsi,

des mutations de BRCA1 sont retrouvées dans une grande proportion des familles chez

lesquelles on observe à la fois des cancers du sein et de l'ovaire, alors qu'il est plus

probable de retrouver des mutations de BRCA2 au sein de familles présentant des cas de

cancer du sein chez l'homme.

Tableau 5. Pourcentage des familles présentant des mutations de BRCA1 ou BRCA2, selon le type de cas sélectionné.

Type de cas BRCA1 (%) BRCA2 (%) Cancers du sein et de l'ovaire, non sélectionnés sur la base de l'histoire familiale Cancers de l'ovaire, sans indication d'histoire familiale Cancers du sein précoces, sans indication d'histoire familiale Cancers du sein chez l'homme, sans indication d'histoire familiale Cancers du sein avec la présence d'une histoire familiale

Adapté des données de Fackenthal et Olopade 2007.

Penetrance des mutations de BRCA1 et BRCA2

Suite à l'identification de BRCA1 et BRCA2, il devint rapidement évident que des

mutations de ces deux gènes conféreraient un risque élevé de cancer du sein et de l'ovaire.

Les premières estimations du risque encouru par les porteurs de mutations de BRCA1 et

BRCA2 ont été effectuées chez des familles sélectionnées sur la base de leur histoire

familiale très sévère de cancer du sein et/ou de l'ovaire. Ces études ont permis de

déterminer un risque associé à des mutations de BRCA1 de 87% pour le cancer du sein et

entre 44% pour le cancer de l'ovaire.68 Pour ce qui est des mutations de BRCA2, le risque a

été estimé au sein de ces familles à 84% (IC 95% 43-95%) et le risque de cancer de l'ovaire

à 27% (IC 95% 0-47%).69 Les hommes porteurs de mutations de BRCA2 sont à risque plus

1-7 1-3 4-29 0,6-16 0,7-10 1-6 - 7-14 0-29 1,5-25

19

élevé de développer un cancer du sein (6,9% à 80 ans ; IC 95% l,2-38,6%).70 Bien que les

hommes porteurs de mutations de BRCA1 soient à risque moins élevé, le risque de cancer

du sein atteint tout de même 5,8% (IC 95% 1,3-10,4%), ce qui est significativement plus

élevé que le risque encouru par la population masculine générale.71

«Caa»

Toutes les famille*; >6 1 4-S

Toutes les famille*; >6 1 4-S

Toutes les famille*;

Familles avec uniquement des cas de cancer du sein chez la femme

?6

4-5 aaaaaaaH Familles avec uniquement des cas de

cancer du sein chez la femme ?6

4-5

Toutes les familles sauf celles avec des cas dc cancer du 1 sein chez l'homme (incluant des cancers ovariens)

Familles avec des cas de cancer du sein et de l'ovaire. mais sans cancer du sein chez l'homme

Familles a\cc des cas de cancer du sein chez l'homme

?6 Toutes les familles sauf celles avec des cas dc cancer du 1 sein chez l'homme (incluant des cancers ovariens)



?6 Toutes les familles sauf celles avec des cas dc cancer du 1 sein chez l'homme (incluant des cancers ovariens)



4-5 >-» 1




4-5 >-» 1




4-5 >-» 1




4-5 >-» 1

>- 1 L- «

' ? - • ::•-• ■SC D ÔQ-.'c 50° c 100%

■ BRCA1 ■ BRCA2 Autre

Figure 6. Estimation de la proportion des familles présentant une forte histoire familiale pouvant être associées à des mutations de BRCA1, BRCA2 ou aucun de ces deux gènes. D'après les données de Ford et collaborateurs.**

Cependant, les études subséquentes, basées en majeure partie sur des méthodologies

différentes, ont résulté en des estimations variables du risque et souvent inférieures. Par

exemple, une méta-analyse regroupant 22 études a estimé un risque cumulatif de cancer du

sein à 70 ans de 65% (IC 95% 51-75%) pour les porteurs de mutations de BRCA1 et de

45% (IC 95% 33-54%) pour les porteurs de mutations de BRCA2. Le risque de cancer de

l'ovaire au même âge est de 39% (IC 95% 22-51%) pour BRCA1 et de 11% (IC 95% 4,1-

18%) pour BRCA2.72 Souvent biaisées par l'utilisation de l'histoire familiale, et non le test

moléculaire direct des porteurs présumés et la validation de leur statut clinique, les

estimations basées sur des cohortes de patients (au lieu de familles) tendent à estimer un

risque inférieur à celui obtenu avec des familles présentant une histoire médicale chargée.

Cependant, les ICs associés à ces estimations se chevauchent et, dans plusieurs cas, ne

présentent pas de différences significatives. Bien qu'une part de la variabilité associée à ces

estimations est clairement due à des différences méthodologiques, il semble que la

penetrance d'une mutation en particulier puisse être influencée par des facteurs génétiques

et environnementaux propres aux patients, comme c'est le cas par exemple pour certaines

mutations fondatrices.

20

Il est maintenant clair que la penetrance peut être influencée par une corrélation génotype-

phénotype puisque les estimations présentées sont la plupart du temps des moyennes d'un

ensemble de mutations. Cependant, certaines études semblent démontrer un effet

hétérogène dans lequel la position de certaines mutations pourraient influencer le risque

conféré. L'analyse des mutations de BRCA2 a permis de démontrer que la présence de

mutations dans la région centrale du gène (appelée le ovarian cancer cluster region ;

OCCR) est associée à un ratio plus élevé de cancers de l'ovaire que de cancers du sein,

contrairement aux mutations retrouvées dans les régions 5' et 3' du gène.70'73 Une

association similaire a aussi été démontrée pour BRCA1.74 Il semble aussi probable que

certaines mutations spécifiques puissent avoir un profil de risque particulier, bien que cette

hypothèse demeure à être confirmée. Les études visant à déterminer le risque de cancer du

sein et de l'ovaire chez les porteurs de mutations de BRCA1 et BRCA2 ont mis en évidence

la présence d'une variabilité du risque entre les familles de même qu'à l'intérieur d'une

même famille.64'69 La raison exacte de cette variabilité du risque entre les porteurs n'est pas

claire, mais elle peut conceptuellement être le résultat du partage d'allèles de gènes de

modification ou de facteurs de risque environnementaux.

Bien que plusieurs facteurs de risque environnementaux aient été associés au risque général

de développer un cancer du sein (voir la section 1.3 Facteurs de risque de développer un

cancer du sein), leur influence sur le risque encouru par les porteurs de mutations de

BRCA1 et BRCA2 est moins claire. Certains facteurs de risque (e.g. la densité mammaire ou

l'effet de la parité) semblent avoir le même effet sur le risque des porteurs que dans la

population générale,75'76 alors que d'autres facteurs (e.g. l'âge de la ménarche, l'utilisation

de contraceptifs oraux ou l'allaitement) semblent agir différemment.77"79 Il est à noter que la

densité mammaire est déterminée en forte partie par des composantes génétiques,80 ce qui

offre des évidences de l'impact potentiel d'autres gènes sur le risque auquel un porteur peut

être sujet.

La variabilité du risque observé peut aussi être attribuée à des polymorphismes ou des

mutations d'autres gènes. Une évidence de ce phénomène est la présence d'un

regroupement familial du site du cancer (sein ou ovaire) en fonction du type de cancer

retrouvé chez le cas de référence. On remarque que dans une famille où le cas de référence

21

est un cas de cancer de l'ovaire, les porteurs ont un risque plus élevé de développer un

cancer de l'ovaire qu'un cancer du sein. De la même façon, dans une famille où le cas de

référence est un cancer du sein, le risque de cancer du sein est plus grand chez les porteurs

que le risque de cancer de l'ovaire. ' Cette corrélation est observée sur de multiples

générations, avec des facteurs environnementaux variables, ce qui suggère fortement

l'influence de gènes pouvant modifier le risque conféré par les mutations de BRCA1 et

BRCA2. De plus, dans les familles où l'on retrouve une mutation de BRCA1 ou de BRCA2,

il est souvent assumé que les individus qui obtiennent un test négatif pour la présence de la

mutation sont au même risque que la population générale. Cependant, certaines études

semblent démontrer que le risque chez ces individus serait de 2 à 5 fois supérieur à celui de

la population.82'83 Cette augmentation pourrait être le résultat de facteurs génétiques et/ou

environnementaux se regroupant dans ces familles. Jusqu'à présent, l'association la plus

claire d'un allele de modification semble être retrouvée pour le variant de la région 5' non-

codante de RAD51 (Rad51 homolog, S. cerevisiae) 135G>C, qui semble en altérer

l'expression. Ce polymorphisme augmente le risque chez les porteurs de mutations de

BRCA2 (HaR (Rapport de risque, Hazard ratio) 1.17 IC 95% 0,91-1,51 chez les

hétérozygotes et de 3,18 IC 95% 1,39-7,27 chez les homozygotes).84 Certains variants dans

d'autres gènes pourraient aussi modifier le risque de cancer chez les porteurs BRCA1/2, du

moins dans la population ashkénaze.85'86 Récemment, des études ont permis de mettre en

évidence certains variants communs de susceptibilité au cancer du sein, identifiés suite a

des études de grande envergure de type tour du génome (genome-wide association study,

GWAS).*1'90 Certains de ces variants ont par la suite été identifiés comme modificateurs du

risque chez les porteurs de mutations de BRCA1 et/ou de BRCA2 (voir la section 2.2.4

Alleles de faible penetrance).91

En plus du risque de cancer du sein et de l'ovaire, des mutations de BRCA1 et BRCA2 sont

aussi associées à un risque accru de cancers à d'autres sites anatomiques. Un résumé des

principales études évaluant le risque d'autres cancers associé à ces mutations est présenté

au Tableau 6. Le type de cancer pour lequel les évidences d'une susceptibilité accrue sont

les plus fortes est le cancer du pancréas, chez les porteurs de mutations de BRCA2.92'95 Le

risque conféré est cependant beaucoup plus faible que celui associé au cancer du sein et de

l'ovaire et varie entre les études, probablement dû à des différences méthodologiques. En

22

plus d'être associé à d'autres types de cancers, certaines évidences semblent suggérer que

des mutations de BRCA2 pourraient être impliquées dans certains cas du syndrome de Li-

Fraumeni96, bien que l'occurrence de familles où l'on retrouve une mutation de BRCA2

présentant les caractéristiques de ce syndrome (voir la section 2.2.1.2 Le syndrome de Li-

Fraumeni et 77*5.?) soit relativement rare. Lorsque les deux alleles de BRCA2 sont

inactivés, les patients souffrent d'Anémie de Fanconi (AF ; Fanconi Anemia, FA) de sous-

groupe Dl, qui se manifeste par défaillance progressive de la moelle osseuse et une

instabilité chromosomique (voir la section 3.2.2.2 Implication de BRCA1 et BRCA2 dans

l'Anémie de Fanconi).97 De plus, les patients du sous-groupe Dl présentent une

susceptibilité marquée à certains types de cancers infantiles.98"101

Tableau 6. Risque d'autres types de cancers associé à une mutation délétère de BRCA1 ou BRCA2. Organe RR (IC 95%)

BRCA1 Thompson et coll. 200274 Brose et coll., 200271 Ford et coll. 199466

Pancréas 2,26(1,26-4,06) 2,8(1,46-4,07) Col de l'utérus 3,72 (2,26-6,10) Corps de l'utérus 2,65 (1,69-4,16) Prostate 1,82(1,01-3,29) 3,33 (1,78-6,20) Colon 2,03(1,45-2,85) 2,0(1,5-2,5) 4,11(2,36-7,15) Foie 4,06(1,77-9,34) Gastrique 6,9 (4,25-9,38)

BRCA2 BCLC 1999102 van Asperen et coll. 2005103

Pharynx et cavité buccale 2,26(1,09-4,58) 7,3(2,0-18,6) Pancréas 3,51 (1,87-6,58) 5,9(3,2-10,0) Prostate 4,65 (3,48-6,22) 2,5(1,6-3,8) Os 14,4(2,9-41,1) Mélanomes malins 2,58(1,28-5,17) Vésicule biliaire 4,97(1,50-16,52) Estomac 2,59(1,46-4,61) Foie 4,18(1,56-11,23)

2.2.1.2 Le syndrome de Li-Fraumeni et TP53 En 1969, Frederick Li et Joseph Fraumeni décrivent pour la première fois un syndrome de

sarcomes se développant à l'enfance, chez 4 familles présentant aussi une histoire familiale

médicale importante de cancers, dont des cancers du sein.104 Le syndrome de Li-Fraumeni

est caractérisé par une hérédité de type autosomique dominante, l'apparition de tumeurs à

un âge précoce, ainsi que le développement de tumeurs primaires multiples chez un même

individu. Plusieurs types de tumeurs sont retrouvés chez ces individus et les types les plus

23

courants sont des sarcomes, des cancers du sein, des tumeurs au cerveau, des leucémies et

des carcinomes des glandes surrénales. Ce n'est qu'en 1990 que Malkin et collaborateurs,

en se basant sur l'implication de TP53 (Tumor protein P53) dans la version somatique de

plusieurs des tumeurs associées au syndrome, identifient la présence de mutations du gène

TP53 au sein de certaines de ces familles.105'106 Les déterminants génétiques au sein des

autres familles restent à déterminer, bien que l'implication de mutations des gènes CHEK2

et BRCA2 aient été suggérées dans certaines de ces familles (voir les sections 2.2.3.2

CHEK2 et 2.2.1.1 HBOC, BRCA1 et BRCA2).

Le gène TP53 encode une protéine hautement conservée entre les espèces et qui agit dans le

choix de la cellule entre l'arrêt du cycle cellulaire pour la réparation de l'ADN ou

l'enclenchement du programme de mort cellulaire (apoptose).107 Cliniquement, on

reconnaît deux formes du syndrome de Li-Fraumeni : la forme classique (classic Li-

Fraumeni syndrome) et une forme évocatrice du syndrome, sans pour autant en remplir

exactement les caractères cliniques (Li-Fraumeni-like syndrome). Le diagnostic différentiel

entre ces deux formes est détaillé au Tableau 7. Des mutations de TP53 sont retrouvées

dans environ 70% des familles de la forme classique, alors qu'elles ne sont retrouvées que

dans environ 40% des familles du syndrome évocateur. Parmi les familles chez lesquelles

une mutation de TP53 a été identifiée, le risque de développer un cancer est de plus de 50%

à 30 ans et plus de 90% des porteurs de ces mutations développeront un cancer avant 70

ans.106 Ce risque très élevé à l'âge adulte est en majeure partie dû au risque important de

cancer du sein. On estime que le RR de cancer du sein associé à une mutation de TP53 est

de 18,1 (IC 95% 8,6-33,2).108 La majorité de ces cancers du sein surviennent entre 20 et 44

ans.109'110

Chez les familles du syndrome de Li-Fraumeni et porteuses de mutations du gène TP53, on

remarque que l'âge moyen au diagnostic de cancer du sein est inférieur comparé aux

familles de la forme évocatrice du syndrome sans mutation de TP53.n] On note aussi que

parmi ces familles porteuses de mutations TP53, l'âge moyen d'apparition du cancer du

sein est plus élevé lorsque la mutation est un changement faux-sens situé dans la boucle de

la protéine ne liant pas l'ADN ou dans le domaine d'oligomérisation, comparé aux

mutations faux sens des boucles liant l'ADN et aux mutations troncantes.111 Bien que les

24

mutations de TP53 soient hautement pénétrantes, le syndrome de Li-Fraumeni est un

syndrome rare, avec moins de 400 familles rapportées mondialement. Des mutations

germinales de TP53 sont rarement retrouvées chez des familles ne présentant que des cas de

cancer du sein et/ou de l'ovaire.110 Par conséquent, on estime que les mutations de TP53 ne

sont responsables que d'environ 1% des cas de cancer du sein.113

Tableau 7. Critères de diagnostic des familles Li-Fraumeni. Critères du syndrome de Li-Fraumeni

1 Cas de référence avec un sarcome osseux ou du tissu mou, diagnostiqué avant 45 ans ; 2 un parent au premier degré avec un cancer avant 45 ans ; 3 et un parent du premier ou du second degré de la même branche parentale avec un cancer avant 45 ans

ou un sarcome, peu importe l'âge. Critères du syndrome similaire au syndrome de Li-Fraumeni

1 Cas de référence avec un cancer de l'enfance ou un sarcome, une tumeur au cerveau ou un carcinome des glandes surrénales diagnostiqué avant 45 ans ;

2 avec un parent au premier ou au second degré avec un cancer typique de LFS (sarcomes, tumeurs au cerveau, un cancer du sein, une leucémie ou un carcinome surrénal), peu importe l'âge ;

3 et un parent au premier ou au second degré de la même branche parentale avec un cancer diagnostiqué avant 60 ans.

2.2.2 Alleles de penetrance incertaine 2.2.2.1 Le syndrome de Cowden et PTEN Le syndrome de Cowden est une maladie héritée de façon autosomique dominante dans

laquelle les patients présentent de multiples lésions hamartomateuses (peau, seins, intestins,

thyroïde) ainsi qu'un risque accru de cancers du sein, de la thyroïde et de l'endomètre. Les

individus atteints présentent habituellement une macrocéphalie et une atteinte de la peau et

des muqueuses. Bien que rapporté pour la première fois en 1963114, l'importance du cancer

du sein dans ce syndrome n'a été comprise que plus tard.115 Jusqu'à 75% des femmes

atteintes du syndrome de Cowden développeront une maladie bénigne du sein et le risque

de cancer du sein invasif est estimé à 25-50% au cours de la vie.116'117 L'âge moyen

d'apparition du cancer du sein est de 40-45 ans,116'117 avec quelques cas de cancer du sein

chez l'homme.118 Environ 5-10% des femmes atteintes du syndrome développeront un

cancer de l'endomètre, et le risque de cancer de la thyroïde est d'environ 10%.116

Des mutations de PTEN (Phosphatase tensin homolog on chromosome ten) ont été

identifiées dans environ 80-85% des cas de syndrome de Cowden, suggérant la présence de

25

mutations dans des régions non étudiées (le promoteur par exemple) ou alternativement,

l'implication d'autres gènes.119"121 PTEN encode une protéine suppresseur de tumeurs et

phosphatase à double spécificité (tyrosine et sérine/thréonine) impliquée dans la régulation

de la croissance en exerçant une régulation négative de la voie de signalisation de PI3K

(Phosphatidylinositol-3-kinase)/'AKT. Cette voie de signalisation est une composante

principale de plusieurs processus dérégulés lors de la progression tumorale tels

l'angiogenèse, la survie cellulaire et la transition épithelio-mésenchymateuse. PTEN

jouerait aussi un rôle important dans l'inhibition de la migration cellulaire et dans

l'inhibition de cyclines.120

Il semble que les mutations fronçantes de PTEN soient particulièrement associées à un

risque de cancer,123 bien qu'il ait été suggéré que les mutations de PTEN ne soient pas

associées à un risque accru de cancer du sein dans les familles ne présentant pas de

symptômes classiques du syndrome de Cowden.124"126 Depuis l'identification de mutations

de PTEN dans le syndrome de Cowden, des mutations de ce gène ont aussi été associées à

d'autres maladies ne présentant pas de lien évident avec ce syndrome. Des mutations de

PTEN ont jusqu'à présent été retrouvées dans environ 60% des familles avec le syndrome

de Bannayan-Riley-Rubalcava, 20% des familles avec le syndrome de Proteus et 50% des

familles avec un syndrome similaire au syndrome de Proteus.120 Les différences

phénotypiques observées entre ces syndromes sont jusqu'à présent difficilement

réconciliables avec une relation génotype/phénotype. Il est possible que le phénotype soit

influencé par l'action de gènes de modification, ou par une interaction avec

l'environnement.120 Il a récemment été suggéré que le syndrome de Bannayan-Riley-

Rubalcava constitue une manifestation juvénile du syndrome de Cowden.127 Puisque ces

syndromes (Cowden, Bannayan-Riley-Rubalcava, Proteus et Proteus-like) présentent des

symptômes cliniques se chevauchant et qu'ils sont en partie causés par des mutations de

PTEN, il a été suggéré de les regrouper sous la désignation de PTEN hamartoma tumor

syndrome.

2.2.2.2 Le syndrome de Peutz-Jegher et STK11 La présence de multiples polypes hamartomateux du système gastro-intestinal et des taches

pigmentaires bleues ou brunes des lèvres, de la muqueuse buccale et de la peau constituent

26

des symptômes clés du syndrome de Peutz-Jeghers, une maladie autosomique dominante

rare.128'129 Les patients atteints de ce syndrome présentent de plus un risque accru de

cancers du sein, du pancréas, du testicule, de l'endomètre, de l'ovaire, de l'utérus, du col,

des poumons, de l'estomac et du côlon.130"131 Il est estimé qu'entre 37% et 93% des patients

atteints du syndrome de Peutz-Jeghers développeront un cancer avant 65 ans.132 On estime

qu'entre 29 et 54% des patientes atteintes du syndrome de Peutz-Jeghers développeront un

cancer du sein avant 65 ans.130'132

Le syndrome de Peutz-Jeghers est causé par des mutations du gène STKll/LKBl

(Serine/threonine kinase 11/Liver kinase 57)133'134, encodant une sérine/thréonine kinase

impliquée dans l'inhibition de la prolifération cellulaire, la réponse cellulaire au stress

énergétique et le contrôle de la polarité cellulaire.135'136 Il est à noter que des mutations de

STK11 ne sont pas identifiées chez tous les patients, bien que les estimations aient pu être

faussées par la présence de grands réarrangements non-détectés.137"139 Puisque les patients

présentent une variabilité phénotypique intra- et inter-familiale, spécialement en ce qui

concerne le risque de cancer, il est possible que le phénotype soit influencé par des facteurs

environnementaux ou par l'action d'autres gènes. Des mutations somatiques de STK11 ont

été rapportées dans certains types de cancers, bien que ce ne semble pas être un phénomène

fréquent.140 L'inactivation épigénétique (hyperméthylation du promoteur) de STK 11 a aussi

été notée dans 50% des tumeurs papillaires sporadiques du sein, bien que le phénomène

semble peu commun ou absent dans les autres types de cancers du sein.141

2.2.2.3 Le syndrome du cancer gastrique héréditaire diffus et CDH1 Le cancer gastrique est une forme prévalente de cancer, en particulier dans les pays

asiatiques. On estime qu'entre 5% et 10% de tous les cancers gastriques seraient

familiaux.142 Le cancer héréditaire gastrique diffus constitue la forme autosomique

dominante de la susceptibilité à ce type de cancers. Il s'agit d'un adénocarcinome peu

différencié infiltrant la paroi de l'estomac, en causant l'épaississement sans pour autant

former une masse distincte. Ce syndrome s'accompagne aussi d'un risque accru de cancer

du sein de type lobulaire.143 Chez les patients atteints du syndrome, le risque cumulatif de

développer un cancer gastrique avant 80 ans est de 67% chez les hommes et de 83% chez

les femmes, avec un âge moyen d'apparition de la maladie de 38 ans.144'145

27

Des mutations de CDH1 (Cadherin 1), qui encode la cadhérine E, ont été associées à des

cas de cancers gastriques héréditaires diffus. Les cadherines sont des protéines impliquées

dans l'adhésion cellule à cellule dépendante du calcium.146 La fonction de la cadhérine E

est essentielle dans le maintien d'un epithelium polarisé et différencié au cours du

développement. Cette protéine joue un rôle important dans la transmission des signaux, la

différenciation, l'expression génique, la mobilité cellulaire et l'inflammation.146 Des

mutations de CDH1 ne sont identifiées que dans 30% à 50% des cas de cancer gastrique

héréditaire diffus.1 ' 7 Bien que l'incidence du cancer gastrique soit plus élevée dans les

pays asiatiques (Japon et Chine), la plupart des mutations de CDH1 ont été retrouvées dans

les populations européennes.147 Entre 39% et 52% des femmes porteuses d'une mutation de

CDHl ou atteintes du syndrome de cancer gastrique héréditaire diffus développeront un

cancer du sein de type lobulaire.148'149 On note aussi que dans de rares cas, des familles

porteuses d'une mutation de CDHl présentent uniquement, ou presque exclusivement, des

cas de cancers du sein de type lobulaire,150'151 ce qui peut suggérer que certaines mutations

de CDHl ne seraient pas identifiées en utilisant uniquement une sélection des cas basée sur

la présence de cancers gastriques diffus. L'expression de la cadhérine E est perdue dans la

plupart des cancers du sein de types lobulaires sporadiques, bien que son expression soit

maintenue dans les cancers du sein de type canalaire.152

2.2.3 Alleles de penetrance modérée

2.2.3.1 L'ataxie-télangiectasie et A TM L'ataxie-télangiectasie est une maladie autosomique récessive rare aussi connue sous le

nom de syndrome de Louis-Bar et, plus rarement, de syndrome de Boder-Segwick. Ce

syndrome a été décrit pour la première fois en 1926 par Syllaba et Henner,153 mais ce n'est

qu'en 1958 que Boder et Segwick étudient 8 cas provenant de 5 familles et introduisent la

dénomination d'ataxie-télangiectasie.154 Cette maladie se manifeste par une ataxie

cérébelleuse, des télangiectasies oculaires et cutanées, un déficit immunitaire et des

infections sino-pulmonaires à répétition. En plus de ces symptômes, les individus atteints

d'ataxie-télangiectasie ont un risque 100 fois plus élevé de développer un cancer que le

reste de la population.155 Les leucémies prédominent à l'enfance, alors que des cancers

épithéliaux, dont le cancer du sein, sont observés chez l'adulte.156

28

L'ataxie-télangiectasie est causée par des mutations du gène ATM (Ataxia-telangiectasia

mutated), clone en 1995.157 ATM joue un rôle central dans la réponse de la cellule aux

agents induisant des bris double-brins (BDBs) de l'ADN. ATM initie une cascade de

signalisation en induisant la phosphorylation de plusieurs protéines telles p53, BRCA1 et

CHEK2. En 1976 une étude épidémiologique conduite au sein de familles de patients

atteints d'ataxie-télangiectasie a démontré que les femmes apparentées à ces patients

présentent un risque accru de cancer,158 dont le cancer du sein.159 Une étude récente

regroupant 1160 individus de 169 familles de patients atteints d'ataxie-télangiectasie a

permis d'estimer que les porteurs d'une mutation du gène ATM ont un risque relatif de

cancer du sein de 2,23 (IC 95% 1,16-4,28) comparé au reste de la population. De plus, ce

risque semble plus élevé chez les femmes de moins de 50 ans (RR 4,94; IC 95% 1,90-

12,9).160 Ces résultats sont aussi consistants avec ceux de Olsen et collaborateurs

regroupant 1445 individus de 66 familles de patients atteints d'ataxie-télangiectasie.161

Une hypothèse découlant de ces études épidémiologiques veut que des mutations

hétérozygotes du gène ATM devraient être plus fréquemment observées chez les individus

atteints de cancer du sein que chez la population. En conséquence, l'étude de mutations du

gène ATM chez des individus atteints de cancer du sein a été effectuée par plusieurs

investigateurs avec des résultats mitigés.156'162 Dans une étude de cas de cancers du sein

familiaux comparés à des contrôles sains, Renwick et collaborateurs163 ont démontré une

association entre des mutations d'ATM et le cancer du sein, avec un risque relatif estimé à

2,37 (IC 95% 1,58-3,78), ce qui est similaire au risque estimé suite aux études

d'association. En conséquence, des mutations d'ATM semblent conférer un risque

d'environ deux fois, ce qui est généralement considéré comme un allele de susceptibilité de

penetrance intermédiaire.

2.2.3.2 CHEK2 En 1999, Bell et collaborateurs identifient des mutations du gène CHEK2 (Checkpoint

kinase 2) chez des familles atteintes de LFS pour lesquelles la recherche de mutations de

TP53 s'était avérée négative.164 Le rôle de mutations de CHEK2 en tant qu'allèles pouvant

causer un syndrome de cancer de forte penetrance tel le LFS a cependant été remis en

question par la suite. En effet, ces mêmes mutations ont aussi été retrouvées chez des

29

patientes atteintes de cancer du sein et des individus sains.1 Bien que le rôle de mutations

de CHEK2 comme agent causant le LFS soit disputé, il demeure possible que ces mutations

soient responsables de certains cas de cancer de sein dans les familles du syndrome de Li-

Fraumeni ou qu'il agisse comme gène de modification en contribuant au phénotype

observé.165

Le gène CHEK2 encode une protéine sérine/thréonine kinase qui joue un rôle clé dans la

transmission de signaux intracellulaires suite à son activation par phosphorylation par

ATM.166 Une fois activée, CHEK2 phosphoryle à son tour p53 et BRCA1, deux protéines

impliquées dans la tumorigénèse mammaire, ce qui permet la régulation de la réponse

cellulaire aux bris de l'ADN.167'168 CHEK2 est aussi impliqué dans le contrôle du cycle

cellulaire en empêchant l'entrée de la cellule en mitose.166

La mutation 1 lOOdelC de CHEK2, décrite à l'origine par Bell et collaborateurs164, constitue

la mutation de CHEK2 la plus couramment étudiée en tant qu'allèle de susceptibilité au

cancer du sein. Une méta-analyse récente regroupant plus de 26000 cas de cancers du sein

et plus de 27000 contrôles provenant de 16 études a mis en évidence un risque accru de

cancer à la fois chez les cas non sélectionnés (OR 2,7; IC 95% 2,1-3,4), chez les cas de

cancers du sein précoces (OR 2,6; IC 95% 1,3-5,5), ainsi que chez les cas familiaux (OR

4,8; IC 95% 3,3-7,2).169 Ces estimations sont comparables à celles obtenues par le

consortium CHEK2170 chez les populations d'ascendance nord européenne. De façon

intéressante, cette mutation de CHEK2 semble absente dans les populations non-

caucasiennes. 71 Le risque de cancer du sein chez l'homme associé à IlOOdelC demeure

controversé, avec certaines études rapportant un risque accru (OR 4,1-10)172'173, alors que

d'autres études demeurent non concluantes.174"176 Récemment, Cybulski et collaborateurs177

ont étudié la contribution d'autres variants de CHEK2 dans la susceptibilité au cancer du

sein dans une large étude. Leur étude rapporte un risque accru de cancer du sein chez les

porteurs de certaines mutations fondatrices polonaises del5395 (OR 2,4; IC 95% 1,5-3,8),

IVS2+1G>A (OR 3,6; IC 95% 2,3-5,5) et I157T (OR 1,6; IC 95% 1,4-1,9). Un risque accru

de cancers de la prostate et de cancer colorectal a aussi été suggéré,178"181 bien que cette

association demeure controversée.

30

2.2.3.3 BRIP1/BACH1/FANCJ A la recherche de partenaires cellulaires interagissant spécifiquement avec le domaine C-

terminal de BRCA1, Cantor et collaborateurs182 identifient une nouvelle protéine, BACH1

(BRCA1-associated c-termial helicase 1), membre de la famille des hélicases DEAH. Aussi

connu sous le nom de BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), l'association de la forme

phosphorylée de cette protéine à BRCA1 serait nécessaire au point de restriction cellulaire

G2/M suite aux dommages à l'ADN.183'184 Jusqu'à présent, les évidences suggèrent que

l'activité helicase de BRIP1/FANCJ (déroulement des duplexes d'ADN en direction 5' vers

3') serait nécessaire à son activité en aval de la monoubiquitination de FANCD2 dans la

voie Fanconi/BRCA, au niveau des foci de réparation. À cet endroit, BRIP1/FANCJ serait

essentielle au passage de la polymerase aux sites de blocage de la fourche de replication.

Ces notions seront abordées plus à fond dans la section 3.2.2.2 Implication de BRCA1 et

BRCA2 dans l'Anémie de Fanconi.

La première analyse du gène BRIP1 chez des cas de cancers du sein et de l'ovaire a permis

d'identifier deux variants faux-sens affectant le domaine helicase (1/35 cas de cancers du

sein familial et 1/30 cas de cancers du sein précoces, ces mutations n'étant pas observées

chez 200 contrôles sains), ce qui semblait indiquer que BRIP1 pouvait être la cible de

mutations augmentant le risque de cancer du sein.182 L'association convaincante d'une

susceptibilité au cancer du sein avec des mutations de BRIP1 a été démontrée en 2006

lorsque Seal et collaborateurs185 ont identifié des mutations fronçantes hétérozygotes chez

9/1212 individus atteints de cancer du sein ne présentant pas de mutations de BRCA1 ou

BRCA2 et chez seulement 2/2081 contrôles sains (RR 2,0; IC 95% 1,2-3,2). Le risque

conféré semble plus élevé chez les porteurs de moins de 50 ans (RR 3,5; IC 95% 1,9-5,7).

Bien que le risque de cancer du sein associé à des mutations faux-sens de BRIP1 n'a pu être

confirmé par cette étude, il demeure possible que celles-ci confèrent un risque moindre

nécessitant une étude de plus grande envergure. À cet égard, il est intéressant de noter que

l'étude de variants de séquence de BRIP1 chez des familles non-BRCAl/2 de la population

canadienne française n'a pas permis de mettre en évidence des mutations délétères de ce

gène.186 En plus du cancer du sein, des évidences récentes suggèrent que certaines

mutations fronçantes et variants de séquence de BRIP1 pourraient être associés à un risque

accru de cancer de la prostate.187

31

En 2005, les équipes de Cantor, Auerbach et Joenje188"190 identifient indépendamment des

mutations troncantes bi-alléliques de BRIP1 chez des patients atteints d'AF de groupe de

complémentation J (d'où l'appellation « FANCJ »). Ainsi, comme BRCA2, des mutations

mono-alléliques sont associées à un risque accru de cancer du sein alors que des mutations

bi-alléliques sont associées à un syndrome de pancytopénie (diminution des globules

blancs, des globules rouges et des plaquettes associée à une défaillance progressive de la

moelle osseuse) infantile (voir la section 3.2.2.2 Implication de BRCA1 et BRCA2 dans

l'Anémie de Fanconi).

2.2.3.4 PALB2/FANCN A l'aide d'expériences de co-immunoprécipitation, PALB2 (Partner and localizer of

BRCA2) a été identifié comme nouveau partenaire cellulaire de BRCA2 impliqué dans la

localisation/accumulation nucléaire de BRCA2 et promouvant sa stabilité.191'192 PALB2

serait probablement impliqué dans l'association de BRCA2 avec les structures nucléaires,

ce qui empêcherait sa dégradation par le protéasome et faciliterait ses fonctions dans la

réparation de l'ADN et la suppression tumorale. Puisque les cellules déficientes en PALB2

présentent des caractéristiques cellulaires similaires à celles des cellules déficientes en

BRCA1 ou BRCA2}91 une fonction de protéine supresseure de tumeurs a également été

suggérée pour PALB2. Dans le contexte de la voie Fanconi/BRCA, PALB2/FANCN agit

tout comme BRIP1/FANCJ en aval de la monoubiquitination de FANCD2 aux sites de

réparation des bris double brins. À ce niveau, l'interaction FANCN-BRCA2 serait

essentielle à la réparation par recombinaison homologue. Les détails de la voie

Fanconi/BRCA 1 seront abordés plus en détails dans la section 3.2.2.2 Implication de

BRCA1 et BRCA2 dans l'Anémie de Fanconi.

L'analyse de PALB2 chez des individus atteints de cancer du sein et présentant une histoire

familiale a permis de mettre en évidence la présence de mutations troncantes à l'état

hétérozygote, qui semblent conférer un risque relatif de 2,3 (95% IC 1,4-3,9).192 Ces

résultats ont été confirmés par une seconde étude chez des familles finlandaises avec une

histoire familiale de cancer du sein, qui a permis d'identifier chez ces familles une mutation

fondatrice récurrente introduisant un changement du cadre de lecture et un codon d'arrêt

prématuré.193 Cette mutation semble enrichie chez les cas de cancers du sein familiaux

32

finlandais et semble associée à un phénotype tumoral aggressif et un risque d'environ 40%

de développer un cancer du sein avant 70 ans.194,195 En plus d'avoir identifié cette mutation

au sein d'une famille de cancer de la prostate, des mutations troncantes de PALB2 ont été

rapportées chez des individus atteints de cancer du pancréas de type familial et du cancer de

l'ovaire, ce qui suggère l'implication potentielle de mutations de PALB2 dans d'autres

types de cancers.193'196'197 D'autres variants fréquents (fréquence de l'allèle mineur de plus

de 5%) ont aussi été associés à un risque accru de cancer du sein (OR 1,21-1,36) dans la

population chinoise.198

En parallèle de la découverte de l'implication de PALB2 dans la susceptibilité au cancer du

sein, les groupes de Rahman et de de Winter annonçaient indépendamment, dans le même

numéro du magazine Nature Genetics, la découverte de mutations bi-alléliques de PALB2

chez des patients atteints d'AF de groupe N (voir la section 3.2.2.2 Implication de BRCA1

et BRCA2 dans l'Anémie de Fanconi).199'200 PALB2 devenait ainsi le troisième gène

associé par des mutations mono-alléliques à un risque accru de cancer du sein, alors que des

mutations bi-alléliques causent l'AF.

2.2.4 Alleles de faible penetrance

Au cours des deux dernières années, la conduite d'études d'association de grande envergure

a permis de mettre en évidence certains variants conférant un risque modeste, mais très

fréquents dans la population. Ces études, qui adressent l'implication de polymorphismes

d'un gène en particulier ou qui investiguent une multitude de variants par un tour du

génome, ont mené à l'identification d'allèles dont l'association avec le cancer du sein a pu

être confirmée par des études subséquentes. De façon intéressante, les polymorphismes

identifiés sont situés dans des régions régulatrices, introniques, ou intergéniques et leur

impact biologique n'est pas clairement apparent. Ces alleles sont retrouvés sur des blocs

comprenant plusieurs polymorphismes adjacents qui sont souvent corrélés (en déséquilibre

de liaison; linkage disequilibrium, LD) les uns avec les autres. Il est par conséquent

possible que le variant identifié initialement par l'étude d'association ne soit pas à l'origine

de l'effet observé, mais que celui-ci soit dû à d'autres gènes ou éléments cryptiques

adjacents.

33

Locus lQq25.3-q26 (intron 2 du gène FGFR2)

L'un des alleles de susceptibilité de faible penetrance pour lequel les évidences actuelles

d'association avec le cancer du sein sont les plus convaincantes est un polymorphisme d'un

nucleotide (single nucleotide polymorphism; SNP), rs2981582, sur un bloc de LD de 25

kilobases (kb) situé dans l'intron 2 du gène FGFR2 encodant un récepteur du facteur de

croissance des fibroblastes (Fibroblast growth factor receptor 2).87'88'90 Ce variant a une

fréquence de l'allèle mineur (minor allele frequency, MAF) de 0,38 dans la population du

Royaume-Uni, avec une fréquence et un risque semblables estimés dans d'autres

populations caucasiennes.87,88'90 Des données récentes indiquent que cette association

pourrait être prédominante dans le cas de tumeurs exprimant le récepteur des estrogènes

(Estrogen receptor positive, ER+).90'20* De plus, le variant rs2981582 pourrait agir comme

gène de modification chez les individus porteurs d'une mutation de BRCA2 (HaR par allele

1,32; IC 95% 1,20-1,45), mais pas chez les individus porteurs d'une mutation du gène

BRCAl.9i II est de plus intéressant de souligner que l'association de FGFR2 avec un risque

accru de cancer du sein a aussi été retrouvée dans une étude regroupant des femmes afro-

américaines.2013

Des altérations somatiques de FGFR2 ont été rapportées dans plusieurs cancers (par

exemple dans certains cas de cancers de la prostate, de cancers urothéliaux et de cancers du

sein202"204) et résultent en une suractivité de la protéine produite. L'intron 2 de FGFR2 est

conservé au cours de l'évolution des mammifères et contient plusieurs sites potentiels de

liaison à des facteurs de transcription. Émettant l'hypothèse que l'action de ces variants

pouvait se produire par une régulation de la transcription de FGFR2, Meyer et

collaborateurs ont examiné les interactions protéines-ADN dans cette région. Leurs

analyses ont mis en évidence deux SNPs (rs7895676 et rs2981578) en LD avec ceux

identifiés précédemment, qui modifient l'affinité de facteurs de transcription (Oct-l/Runx2

et C/EBPB) pour leur site de reconnaissance, ce qui amènerait une augmentation de

l'expression de FGFR2 et une plus grande propension à former des tumeurs.

Locus 16ql2.1 (TOX3/TNRC9 ou LOC643714)

La plus forte association retrouvée par Easton et collaborateurs au locus 16q implique le

SNP rs3803662 situé sur un bloc de LD de 160 kb87, et cette association a été confirmée

34

dans une seconde étude dans la population islandaise.89 Ce variant encode un changement

synonyme du gène putatif LOC643714 situé 8 kb en amont du gène TOX3 (TOX high

motility group box family member 3) aussi connu sous le nom de TRNC9. Basé sur son

homologie de séquence, on assume que TOX3 serait impliqué dans la modification de la

structure de l'ADN et agirait comme facteur de transcription.206 L'augmentation de

l'expression de TOX3 a récemment été suggéré comme facteur prédictif de la production de

métastases du sein vers les os207 et rs3803662 semble être particulièrement associé à des

tumeurs ER+.89'201 De façon intéressante, la classification ER+ constitue le plus important

facteur histo-pathologique prédictif associé à la formation de métastases aux os.208 TOX3

pourrait de plus agir comme gène de modification puisque le SNP rs3803662 est associé à

une augmentation du risque chez les porteurs de mutations de BRCA1 et BRCA2 (HaR par

allele 1,13; IC 95% 1,06-1,20).91

Locus 5qll (MAP3K1/MEKK ou MGC33648 ou MIER3)

Une association a été retrouvée dans l'étude de Easton et collaborateurs sur le bras long du

chromosome 5 pour le SNP rs889312, qui se situe sur un bloc de LD de 280 kb couvrant les

gènes MAP3K1 (Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1), le gène hypothétique

C5orf35 (Chromosome 5 orf 35) et M1ER3 (Mesoderm induction early response 1, family

member 3).87 MAP3K1 est présentement considéré comme le candidat le plus probable, et il

encode une protéine sérine/thréonine kinase qui est impliquée dans une cascade d'enzymes

de phosphorylation intégrant les réponses cellulaires suite à des signaux de croissance et du

métabolisme.209 Tout comme dans le cas de FGFR2, le variant rs889312 est associé à une

augmentation du risque chez les porteurs de mutations de BRCA2 (HaR par allele 1,12; IC

95% 1,02-1,24), mais pas chez les porteurs de mutations de BRCA1.91

Locus 11 pi5 (LSP1 ou H19 ou TNNT3 ou MRPL23 ou LOC728008)

Le SNP rs3817198 situé sur un bloc de 180 kb sur le chromosome 11 a été associé à un

risque accru de cancer du sein.87 Ce polymorphisme est situé dans l'intron 10 du gène LSP1

(Lymphocyte-specific protein 1), qui est exprimé dans la lignée hématopoïétique et dans les

cellules endothéliales. Ce gène serait responsable de la régulation de la mobilité des

neutrophiles, leur adhésion aux protéines de la matrice de fibrinogène et leur migration à

travers l'épithélium endothelial.210 L'allèle mineur du variant rs3817198 a été associé à un

35

risque accru de cancer chez les porteurs de mutations dans BRCA2 (HaR par allele 1,16; IC 95% 1,07-1,25) uniquement 211

Un autre variant (rs2107425) est retrouvé 110 kb plus loin sur le même bloc dans la région

couverte par H19. L'association de ce variant avec le cancer du sein est moins prononcée

que celle observée pour LSP1. H19 est un gène non-traduit soumis à l'empreinte

parentale, dont l'allèle maternel est exprimé. L'ARNm produit est impliqué dans la

régulation d,IGF2 (Insulin-like growth factor 2). Bien que H19 soit un petit gène, des

études chez son orthologue murin ont démontré qu'il subit une régulation complexe avec

un ensemble de séquences promotrices tissus-spécifiques situées en aval du gène.212 Les

autres gènes potentiels retrouvés sur ce même bloc de déséquilibre de liaison sont TNNT3

(Troponin T type 3), MRPL23 (Mitochondrial ribosomal protein L23) et le gène

hypothétique LOC728008*7

Locus 2q35

Dans une étude de grande envergure de la population islandaise, Stacey et collaborateurs

ont retrouvé une association avec le variant rsl3387042 situé dans une région de LD de 117

kb du chromosome 2.89 Aucun gène n'a jusqu'à présent été identifié sur ce bloc de LD. Le

risque conféré par le variant rsl3387042 semble lié aux tumeurs ER+.89 Bien que ce locus

n'ait pas été identifié dans d'autres études, cette association a été confirmée dans une étude

indépendante de la population du Royaume-Uni, avec un risque estimé similaire (OR par

allele 1,17; 95% IC 1,07-1,27).50 Ce variant serait associé avec une augmentation du risque

à la fois chez les porteurs de mutations de BRCA1 et de BRCA2.2U

Locus 5pl2 (MRPS30)

Basé sur les résultats de leur première étude de grande envergure89, ainsi que ceux de deux

autres études préalables,87'88 Stacey et collaborateurs ont identifié une région de 310 kb du

chromosome 5 présentant certaines évidences d'une association avec le cancer du sein.90

Une seconde étude de cette région dans des populations d'ascendance européenne ont

permis d'identifier les variants rs4415084 (OR par allele 1,16; 95% IC 1,10-1,21) et

rsl0941679 (OR par allele 1,19; 95% IC 1,13-1,26) qui semblent associés à des tumeurs

ER+.90 Le seul gène dans cet intervalle est MRPS30 (Mitochondrial ribosome protein S30),

un gène encodant l'une des composantes de la petite sous unité du ribosome mitochondrial,

36

qui est impliqué dans certains événements pro-apoptotiques. De façon intéressante,

MRPS30 fait partie du profil d'expression génique permettant la distinction entre les

tumeurs ER+ et ER-.90'213

Locus 8q24

Parmi les variants identifiés dans l'étude de Easton et collaborateurs, on retrouve le SNP

rsl3281615 situé dans un «désert génique» (grande région chromosomique où aucun gène

n'a été identifié jusqu'à présent) sur la bande q24.21 du chromosome 8.87 Ce variant est

retrouvé sur un bloc de LD de 110 kb qui ne comprend aucun gène connu. De façon

importante, l'association de ce bloc de LD avec le cancer du sein a été reproduite et semble

spécifique au cancer du sein,214"217 bien que des régions adjacentes de 8q24.21 présentent

de multiples variants indépendamment associés à une susceptibilité aux cancers colorectal,

de la prostate, de l'ovaire et de la vessie. 214-218"226 Le locus 8q24 serait particulièrement

impliqué dans la formation de tumeurs ER+.201 Plusieurs déserts géniques ont été associés à

des maladies (par exemple la maladie de Parkinson,227 la maladie de Crohn,228 la fibrillation

auriculaire, et le cancer ), ce qui laisse présager que ces régions pourraient avoir

certaines fonctions. Des évidences suggèrent que cette région puisse arborer des régulateurs

tissus-spécifiques de la transcription, qui pourraient agir sur de grandes distances.230

Locus 6q22.33 ŒDHCD1 ou RNF146)

En utilisant la population fondatrice juive ashkénaze, chez laquelle le LD entourant les

alleles de susceptibilité potentiel est théoriquement accru, Gold et collaborateurs ont

identifié quatre variants (dont la plus forte association avec rs2180341) situés sur un bloc

de LD d'environ 200 kb sur le chromosome 6. : Ces variants sont fortement associés à

deux gènes de cette région : RNF146 (Ring finger protein 146), qui encode probablement

une E3 ubiquitine ligase, et ECHDC1 (Enoyl Coenzyme A hydratase domain containing 1),

qui est impliqué dans l'oxydation mitochondriale des acides gras.

Locus 2q33 (CASP8)

Dans une étude de type gènes candidats, Cox et collaborateurs ont génotype neuf variants

de séquence pour lesquels il existait des évidences préalables d'association avec le cancer

du sein.232"234 Parmi ceux-ci, le SNP rsl045485, qui est associé à un changement faux-sens

p.Asp302His du gène CASP8 (Caspase 8), présente un effet protecteur qui semble associé

37

aux tumeurs ER+.234 La caspase 8 est un initiateur important de la mort cellulaire

programmée (apoptose) en réponse à des dommages importants de l'ADN ou à des signaux

apoptotiques extracellulaires. De façon intéressante, une étude de CASP8 dans la

population chinoise, chez laquelle le variant p.Asp302His est très rare, a démontré une

association d'une deletion de 6 nucleotides de la région promotrice avec un risque réduit de

plusieurs cancers dont le cancer du sein (OR hétérozygotes 0,65; IC 5% 0,54-0,78)235 et

l'effet de ces deux variants de CASP8 a été confirmé dans une méta-analyse récente.236

En plus des variants identifiés dans les sections précédentes, il existe des évidences que

certains autres gènes pourraient être impliqués dans la susceptibilité au cancer du sein, tels "yxn TIR

que certains alleles de TGFB1 (Transforming growth factor beta 1), ' ESRI (Estrogen

receptor l),2i9 AKAP9 (A kinase anchor protein 9).240 Cependant, les résultats de ces études

d'association demeurent à être reproduits dans d'autres cohortes.

2.3 Modèles de la susceptibilité génétique au cancer du sein

Depuis plusieurs années, des outils de modélisation génétique ont été utilisés afin de tenter

de mieux comprendre les effets des déterminants génétiques de la susceptibilité au cancer

du sein. Ces analyses consistent à simuler de façon mathématique l'occurrence de la

maladie en combinant l'action de gènes connus et/ou hypothétiques ayant chacun sa

prévalence, sa penetrance et son mode de transmission. Ces simulations sont ensuite

comparées à la fréquence observée du cancer dans la population. Bien que les premiers

modèles (établis avant l'identification de BRCA1 et BRCA2) aient favorisé un type de

transmission autosomique dominant56, les simulations ultérieures (où l'effet de ces deux

gènes est ajouté) favorisent un modèle polygénique.64'72'241"243 Ce modèle suggère que chez

les cas tirés de la population, le risque de cancer du sein pourrait être expliqué par plusieurs

variants génétiques agissant de façon indépendante sur le risque. Il existerait ainsi dans la

population une répartition étendue du risque, présentant une distribution normale à l'échelle

logarithmique et un écart type estimé à 1,2.244 Sous ce modèle, dans l'éventualité où tous

les alleles de susceptibilité seraient identifiés, plus de 50% des cas de cancer du sein

pourraient en théorie survenir dans un 12% de la population démontrant une prédisposition

plus forte pour la maladie (Figure 7).244 De façon intéressante, les alleles communs de

38

faible penetrance identifiés au cours de la dernière année peuvent être intégrés à ce modèle

(Figure 8).245 Sur la base des alleles identifiés associés à FGFR2, TOX3, MAP3K1, LSP1,

CASP8, 8q et 2q, la distribution théorique du risque est assez étendue pour identifier un

groupe à risque élevé et un groupe à risque faible, avec un risque 6,3 fois plus élevé pour

les femmes présentant le risque le plus élevé comparé à celles ayant le risque le plus faible.

o% 70% 80% 20% 30% 40% 50% 60%

Roque fc it\ttmtt M CMCtr fc sein avant 70 u*

les cas de cancers du sein. Adapté de Phroah et collaborateurs 2002.

Figure 7. Modèle polygénique de la répartition du risque de cancer du sein chez les cas et dans la population. Selon ce modèle, 50% de tous les cas de cancers du sein seraient diagnostiqués chez un 12% de la population présentant un risque a 10% à 70 ans d'avoir un cancer. De la même façon, 50% de la population aurait un risque de cancer s3% et représenterait 12% de tous

Figure 8. Proportion des cas de cancer du sein expliqués par la proportion de la population à risque élevé. Les estimations basées sur les alleles de susceptibilité connus actuellement sont représentées par la ligne grasse. Les estimations basées sur le meilleur scénario possible, dans lequel tous les alleles de susceptibilité possibles sont connus, sont représentées par la ligne mince. Le graphique montre que la moitié de la population à risque plus élevé de cancer du sein sur la base des génotypes aux 7 loci de susceptibilité connus comptent pour 60% de tous les

cas de cancer du sein (cercle plein) et le 20% avec le risque le plus élevé compte pour 28% de tous les cas (carré plein). Si tous les alleles de susceptibilité étaient connus, les proportions respectives, basées sur le génotype, serait 88% (cercle vide) et 64% (carré vide) . Adapté de Phroah et collaborateurs 2008.245

39

Plus de 10 ans après l'identification de BRCA1 et BRCA2, des efforts considérables ont été

consacrés à l'identification de gènes de forte penetrance additionnels pouvant agir au sein

des familles présentant une forte prédisposition au cancer du sein. Il est maintenant clair

que la découverte d'un troisième gène de susceptibilité au cancer présentant des

caractéristiques similaires à celles de BRCA1 et BRCA2 soit peu probable, bien que cette

possibilité ne puisse être totalement exclue. Ainsi, il est probable que les autres alleles

demeurant à êtres identifiés sont des alleles de penetrance faible ou modérée. Une

alternative aux études de liaison utilisées pour identifier les gènes de forte penetrance est

l'approche par étude d'association de gènes candidats, qui a porté fruit par le passé.185'193

Dans ce type d'étude, les gènes sont sélectionnés sur la base d'une plausibilité biologique

(qui est toutefois tributaire des connaissances actuelles des mécanismes cellulaires de la

carcinogenèse) et la fréquence des variants est comparée entre un groupe de cas et un

groupe de contrôles.

Certains aspects méthodologiques doivent cependant être pris en considération. Des études

sur ce type d'allèles demandent de larges cohortes et représentent un coût important. Il est

cependant possible d'optimiser le pouvoir des études visant l'identification de nouveaux

gènes de susceptibilité, principalement de deux façons. La première consiste à utiliser une

cohorte enrichie pour une prédisposition génétique, par exemple en sélectionnant des cas

présentant une histoire familiale chargée, des cas de cancer du sein bilatéral ou des cas

précoces. La taille de l'échantillon requis pour obtenir une puissance de 90% avec une

valeur P= 0,0001 a été modélisée par Antoniou et Easton.246 Cette analyse a permis de

démontrer que l'utilisation de cas familiaux (2 parentes au premier degré atteintes) peut

réduire de 4 fois la taille de l'échantillon requis pour détecter un allele de susceptibilité

présentant une fréquence de 10% (Figure 9).

Alternativement, il est aussi possible d'utiliser un enrichissement géographique, en

effectuant une première analyse des gènes dans une population isolée (population

fondatrice). Au sein de ces populations, il est théoriquement probable d'observer un

enrichissement pour des mutations fondatrices et l'hétérogénéité génétique est réduite, ce

qui augmente la probabilité d'identifier une mutation.247 Cependant, il est aussi possible

qu'un allele de susceptibilité identifié soit spécifique à cette population. Un exemple de ce

40

phénomène dans la recherche d'allèles de susceptibilité au cancer du sein est le gène

RAD50, pour lequel des mutations troncantes ont été décrites jusqu'à présent uniquement

dans la population finlandaise.248'249

■lu

a a

JD

3

10000

1000

O Non sélectionné B Mère atteinte A Mère et soeur atteintes ® Cas bilatéraux O Forte histoire familiale

(incluant la mère)

0.15 0.2 Fréquence allélique

0.35

Figure 9. Variation de la taille de l'échantillon.

Taille de l'échantillon requise pour obtenir une puissance de 90% (p = IO"4), selon un modèle multiplicatif et RR=2.0. Adapté de Antoniou et Easton 2003.246

41

3. Fonctions et partenaires cellulaires de BRCA1 et BRCA2 Depuis leur identification au milieu des années 90, BRCA1 et BRCA2 ont été

considérablement étudiés. Alors que des mutations de ces gènes sont retrouvées avec une

grande fréquence dans les familles présentant une histoire familiale très chargée de cancer

du sein et de l'ovaire (voir la Figure 6), des altérations de ces deux gènes ne sont que

rarement associées à des cancers du sein de type sporadique.250'251 Cette dichotomie

apparente dans les causes moléculaires sous-jacentes à ces deux groupes est intrigante et a

poussé la recherche des mécanismes cellulaires affectés par des altérations de BRCA1 et

BRCA2.

BRCA1 et BRCA2 jouent des rôles importants dans le maintien de l'intégrité du génome.

Ceci est illustré par l'instabilité chromosomique retrouvée chez les cellules déficientes en

ces protéines, qui accompagne fréquemment des défauts de gènes associés à la détection, la

signalisation ou la réparation des bris de l'ADN.252"255 Tel qu'illustré précédemment, la

compréhension des rôles cellulaires de BRCA1 et BRCA2 et leurs interactions avec les

autres protéines cellulaires est importante et a permis de mettre en évidence certains gènes

candidats dont les altérations sont associées à un risque accru de cancer du sien. '

3.1 Structure des protéines BRCA1 et BRCA2

Bien qu'étant toutes deux associées au syndrome HBOC, les protéines BRCA1 et BRCA2

ont des structures protéiques présentant peu de similarité l'une avec l'autre et avec des

protéines aux fonctions connues. Les domaines protéiques de BRCA1 et BRCA2 sont

présentés à la Figure 10.

BRCA1 :

Le gène BRCA1 encode une grosse protéine de 1863 acides aminés (aa). Seules les régions

N- (amino) et C- (carboxy)- terminales sont fortement conservées entre les espèces

mammifères.256'257 La protéine comprend un domaine RING (nommé d'après le gène

modèle de cette classe, Really interesting new gene) en N-terminal, 2 copies en tandem du

42

domaine BRCT (BRCA1 C-terminus), ainsi que des signaux d'importation et d'exportation

nucléaire.59'258"260

BRCAl 1863 aa

Domaine RING

Domaines BRCT

SLN

H

BARD1 ZNF350 Complexe M/R/N

BR1P1

BRCA2 3418 aa

Domaine en tonr

PALB2 RAD51 DSS1 ADNtb RADS1

Figure 10. Représentation des domaines des protéines BRCAl et BRCA2 humaines. Certaines des protéines interagissant avec BRCAl et BRCA2 sont indiquées en dessous du site d'interaction. Les sites principaux de phosphorylation de BRCAl par CHEK2 (S988), ATM (S 1387), ATR (S 1457) et de BRCA2 par des CDKs (S3291) sont indiqués par des points jaunes. SEN : séquence d'exportation nucléaire. SLN : séquence de localisation nucléaire. OB : oligonucleotide/oligosaccharide binding. Modifié de Venkitaraman 2009.26'

Le motif RING de BRCAl (aa 24-64) est caractérisé par la présence de 8 résidus cysteines

et histidines responsables de la liaison de deux atomes de Zn2+.262 Ce motif fait partie d'un

domaine plus étendu (aa 1-109) qui inclus des résidus en N- et C-terminal du motif. Ces aa

forment des hélices a antiparallèles qui sont critiques pour la formation des interactions

protéiques dans cette région.

Les deux domaines BRCT sont retrouvés à l'extrémité C-terminale de BRCAl et sont

constitués d'environ 100 aa. Le domaine BRCT a été identifié à l'origine dans BRCAl,

suite à l'analyse de sa séquence primaire. Le domaine BRCT simple de base est replié en 4

feuillets |3 parallèles entourés de deux hélices a d'un côté et d'une hélice a unique de

l'autre.263 L'analyse de séquences protéiques a par la suite permis de constater que les

domaines BRCT sont souvent retrouvés dans une superfamille de protéines impliquées dans

43

la réponse aux dommages de l'ADN, la réparation de l'ADN et la régulation du cycle

cellulaire.264 Le domaine BRCT est impliqué dans des interactions protéiques et des

évidences suggèrent que les domaines BRCT en tandem (incluant ceux qui sont retrouvés

dans BRCAl) constituent un motif de reconnaissance et de liaison de peptides

phosphorylés.265'266 Des analyses de liaisons peptidiques ont de plus démontré que le

domaine BRCT de BRCAl lie spécifiquement les peptides contenant la séquence pSer-X-

X-Phe, telle que celle qui est retrouvée dans BACH 1/BRIP1/FANCJ.266

Bien qu'elle soit de façon prédominante une protéine nucléaire, BRCAl a aussi été

retrouvée au niveau du cytoplasme et de la mitochondrie.267 Cette migration de BRCAl

entre les compartiments cellulaires est modulée par une séquence d'exportation nucléaire

(SEN) retrouvée à l'extrémité du domaine RING (aa 81-99),268 par deux séquences de

localisation nucléaire (SLN) dans la portion centrale de la protéine (aa 503-508 et aa 606-

615) ' ainsi que par l'interaction de BRCAl avec certains de ces partenaires

cellulaires271. En plus de cette régulation spatiale, BRCAl est aussi sujette à une régulation

de son activité par phosphorylation. BRCAl est le substrat de plusieurs kinases cellulaires,

dont ATM et CHEK2 dont les altérations ont aussi été associées à une susceptibilité accrue

au cancer du sein. La kinase la mieux caractérisée de BRCAl est ATM, qui phosphoryle la

protéine sur plusieurs résidus serine (serll89, 1298, 1330, 1387, 1423, 1457, 1466, 1524 et

1542),272 bien que d'autres kinases phosphorylent aussi la protéine.273

BRCA2:

Le gène BRCA2 encode une très grosse protéine de 3418 aa. BRCA2 présente très peu

d'homologie avec d'autres protéines, et aucune avec BRCAl. En comparant la protéine à

elle-même, l'analyse de la séquence protéique a permis de mettre en évidence la présence

d'un motif (appelé BRC) d'environ 70 aa répété 8 fois dans la région centrale de

BRCA2.274 Une percée majeure dans la compréhension des fonctions cellulaires de BRCA2

est venue de la réalisation que l'interaction entre BRCA2 et RAD51 est médiée par ces

répétitions.275'276 Puisque les motifs BRC divergent à divers degrés d'une répétition à

l'autre, ils n'ont pas tous la même affinité pour la recombinase RAD51, et les répétitions

BRC5 et BRC6 présentent l'affinité la plus faible. Il a été proposé que BRCA2 interagit

44

avec RAD51 en imitant le motif qui permet à RAD51 de s'oligomériser, maintenant ainsi 277 RAD51 dans un état monomérique.

La portion C-terminale de BRCA2 comprend une région d'environ 800 aa qui forme des

structures secondaires, dont des motifs similaires à des domaines de liaison à l'ADNsb

(ADN simple-brin). Le premier motif de cette région est appelé le domaine hélical et

comprend 190 aa qui forment principalement des hélices a. Le domaine hélical est suivi de

trois domaines d'environ 110 aa (OBI, OB2 et OB3) qui présentent une homologie avec le

repliement OB présent chez plusieurs protéines liant l'ADNsb. OB2 contient en plus une

insertion de 130 aa qui adopte une conformation en tour perpendiculaire au repliement

OB.278 La région C-terminale contient de plus deux SLNs279 et un site de phosphorylation

par des kinases dépendentes des cyclines (CDK; cyclin-dependent kinases) qui semble

réguler l'association de RAD51 à un deuxième motif de liaison à cet endroit.280

3.2 Fonctions de BRCAl et BRCA2 BRCAl et BRCA2 sont exprimées de façon ubiquitaire chez l'humain, avec une expression qui corrèle de près avec les niveaux de prolifération cellulaire. L'expression est de plus variable au cours du cycle cellulaire, avec des niveaux maximum à la transition Gl/S.281

BRCAl et BRCA2 sont des protéines «caretakers», dont l'inactivation crée un état permissif dans lequel la cellule accumule des défauts cellulaires qui amènent une instabilité chromosomique. Un exemple de ce phénotype peut être facilement observé en étudiant le caryotype des cellules de souris déficientes en BRCA2 (Figure 11).282

Q Figure 11. Structures chromosomiques aberrantes de cellules déficientes en Brca2.

ctb Structures chromosomiques aberrantes dans les X \M a "̂ \9 fibroblastes embryonnaires de souris

f& homozygotes pour une protéine Brca2 tronquée > ' \ V* *u niveau de son exon U (Brca2 t r t r)* A)

ir Étalement de cellules Brca2tr/tr en métaphase au 3e passage, présentant de nombreuses anomalies structurales (flèches). B) C) et D)

A montrent des grossissements d'un bris typique de la chromatine (ctb), d'une structure triradiale (tr) et d'une structure quadriradiale

U A (qr). Adapté de Patel et collaborateurs 1998.282

**h. / «•

Y n A*

45

Bien que les fonctions de BRCAl et BRCA2 ne soient pas entièrement comprises, il est

clair que ce sont des protéines multifonctionnelles, qui ont des fonctions indépendantes.

Jusqu'à présent, BRCAl et BRCA2 ont été impliquées dans plusieurs fonctions dont la

régulation de la transcription, la détection et la réparation des bris de l'ADN, le contrôle du

cycle cellulaire et le remodelage de la chromatine.

3.2.1 Régulation de la transcription

Le rôle de BRCA2 dans la transcription demeure obscur. Des analyses utilisant des

fragments protéiques de BRCA2 ont proposé que les aa 23-105 pourraient activer la

transcription.283 Cette activation pourrait être effectuée par son interaction avec des

protéines co-activatrices (P/CAF et GRIP1) qui possèdent des activités d'acétylase et de

méthylase d'histones. ' Il est par conséquent possible que BRCA2 établisse un lien

entre des protéines de remodelage de la chromatine et le complexe de transcription afin

d'en activer l'activité. Un autre aspect de l'implication de BRCA2 dans la transcription a

été mis en évidence avec la découverte d'un nouveau partenaire d'interaction, EMSY, qui

lie les aa 23-46 et qui semble agir comme répresseur de la transcription.286 EMSY serait

aussi capable d'interagir avec HP1-P et BS69, deux protéines impliquées dans la régulation

de la chromatine. De façon intéressante, Hughes-Davies et collaborateurs ont aussi

démontré qu'EMSY est amplifié dans un nombre significatif de tumeurs du sein

sporadiques et est associé avec un mauvais pronostic.286

Contrairement à BRCA2, le rôle de BRCAl dans la régulation de la transcription est mieux

compris. Des évidences suggèrent que BRCAl serait une composante de la machinerie

transcriptionnelle de base, en interagissant avec le complexe de l'ARN polymerase II par

l'intermédiaire de l'ARN helicase A.287 '288 BRCAl peut réguler l'activité de l'holoenzyme

ARN polymerase II en modifiant l'état de phosphorylation de son domaine C-terminal par

la kinase CAK.289 De plus, BRCAl associée à BARD1 (BRCAl-associated RING domain

1) pourrait utiliser son activité ubiquitine ligase afin de bloquer l'initiation de la synthèse

de l'ARNm en ubiquitinant le complexe de pré-initiation transcriptionel.290

En plus de son activité avec la machinerie transcriptionnelle de base, il a été démontré que

BRCAl pourrait agir en tant que co-régulateur sélectif de la transcription de gènes

46

spécifiques. Bien que BRCAl ne semble pas lier l'ADN de façon séquence-spécifique,

plusieurs facteurs de transcription, à la fois des co-répresseurs et des co-activateurs,

interagissent avec BRCAl dont p53, ESRI (Estrogen receptor 1), CtIP (CTBP-interacting

protein) et ZNF350 (Zinc finger protein 350).291"298 BRCAl s'associe à p53, ce qui la

stabilise et stimule son activité transcriptionnelle. Cette activation induit un sous-groupe de

gènes régulés par p53, et il semble que l'association de BRCAl à p53 redirige l'activité de

celle-ci des voies apoptotiques vers la réparation de l'ADN et l'arrêt du cycle cellulaire.291"

BRCAl a aussi été associée à une répression de la signalisation par ER-a, probablement T-a/a a * j r t j -

à travers la liaison compétitive de co-facteurs (p300/CBP, cycline Dl, BRD7). " Cette

répression cause l'inhibition de la croissance cellulaire induite par l'estrogène.29

3.2.1.1 Régulation transcriptionnelle de GADD45A par BRCAl et ZNF350

GADD45A (Growth arrest and DNA damage-inducible alpha) est membre d'un groupe de

gènes (comprenant aussi GADD45B et GADD45G) qui sont induits par des agents

endommageant l'ADN et divers stress cellulaires. GADD45A est impliqué dans la stabilité

génomique par ses rôles dans le contrôle de la transition G2/M du cycle cellulaire,

l'induction de l'apoptose et la réparation de l'ADN.299"303 Chez la souris, l'inactivation de

Gadd45A résulte en une augmentation de la tumorigénèse et de l'instabilité

chromosomique, ainsi que des problèmes d'auto-immunité.303"305

Une grande variété de stress cellulaires, y compris les dommages à l'ADN, le stress

oxydatif, le choc osmotique et la restriction en nutriments, induisent l'expression dose-

dépendante rapide de GADD45A. La régulation de l'expression de GADD45A se fait de

façon complexe et multiple. Les niveaux constitutifs de GADD45A sont bas, et le maintien

d'une faible expression de GADD45A s'effectue par le biais de répresseurs de transcription.

Son expression peut être induite par la dissociation de ces facteurs et l'association

d'activateurs de la transcription. L'induction ou la répression de GADD45A varie en

fonction du stade cellulaire et du type de dommages à l'ADN.306

ZNF350, aussi connu sous le nom de ZBRK1 (Zinc finger and BRCAl-interacting protein

with KRAB domain 1), est une protéine à doigts de zinc qui réprime l'expression de

GADD45A en liant une séquence spécifique de l'intron 3. ZNF350 interagit avec BRCAl et

47

ce complexe de répression est responsable du maintien du faible niveau constitutionnel

d'expression de GADD45A (Figure 12).307 La portion C-terminale de ZNF350 contient un

domaine de répression dépendant de BRCAl et d'histones dé-acétylases.308 De façon

intéressante, des mutations de BRCAl associées avec le cancer du sein perturbent son

association avec ZNF350. Cette inhibition de son activité de co-répresseur suggère que

cette activité est importante pour la fonction supresseur de tumeurs de BRCAl. 307

Radiations ionisantes

G,/M J

o Cycle cellulaire

Figure 12. Mécanismes de la régulation de GADD45A par p53, BRCAl et ZBRK1. Plusieurs mécanismes sont impliqués dans la régulation de l'expression de GADD45A. Parmi ceux-ci, on retrouve l'association de BRCAl et d'activateurs au niveau du promoteur, l'association de BRCAl avec le co-répresseur ZBRK1 au niveau de l'intron 3 et l'activation par p53 phosphoylée par la reconnaissance d'un motif spécifique dans l'intron 3.

Suite à un stress cellulaire, y compris des dommages de l'ADN, les répresseurs sont 309 inactivés. Dans le cas du complexe ZNF350/BRCA1, Yan et Lee ont identifié une région

48

de ZNF350 requise pour son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome, ce qui

semble relâcher la répression et permettre l'induction de GADD45A. De plus, il a été

suggéré que la surexpression de BRCAl peut titrer ZNF350 de sa séquence de

reconnaissance dans l'intron 3 et ainsi permettre l'expression. De concert avec le

relâchement de cette répression transcriptionnelle, l'expression de GADD45A augmente

rapidement suite à l'action d'activateurs de la transcription. De façon paradoxale, il a été

démontré que BRCAl peut aussi activer l'expression de GADD45A en s'associant à des

facteurs de transcription, autres que ZNF350, au niveau du promoteur. BRCAl s'associe

avec Oct-1 et NF-YA et lie les deux motifs OCT-1 et la boîte CAAT présents dans le

promoteur.310 Cependant, cette activation par BRCAl semble réduite par son association

avecBARDl.311

GADD45A est le seul membre de la famille GADD à être régulé par p53, bien que les

mécanismes de régulation transcriptionnelle de GADD45A peuvent êtres dépendants ou

indépendants de celui-ci. L'induction de GADD45A suite aux radiations ionisantes requiert

p53,312 qui lie un site conservé dans l'intron 3 du gène GADD45A (Figure 12). L'induction

de GADD45A suite à d'autres types de dommages à l'ADN (rayonnement ultraviolet,

traitement aux agents alkylants ou restriction en nutriments), n'est que partiellement

dépendante de p53, puisque dans les cellules n'exprimant pas p53 la réponse est affaiblie

mais non abolie.313'314

L'ARNm (acide ribonucléique messager ; messenger ribonucleic acid, mRNA) de

GADD45A est aussi sujet à une régulation post-transcriptionnelle importante. La liaison de

protéines à sa portion 3' non transcrite (3'UTR, 3 ' untranslated) a été impliquée dans la

régulation de la traduction et dans le contrôle de la stabilité de son ARNm.315"316 L'action

de ces protéines de liaison à l'ARNm régule étroitement la quantité d'ARNm disponible

dans la cellule et sa capacité à être traduit.317 En état de stress intense, il a aussi été suggéré

que l'ARNm de GADD45A peut être traduit par un mécanisme indépendant de la coiffe

(qui est responsable chez la vaste majorité des ARNms du recrutement du ribosome) et -ai o

dépendant d'un site interne d'entrée du ribosome (1RES, internai ribosome entry site).

Jusqu'à présent, les études analysant l'implication des gènes ZNF350 et GADD45A dans la

susceptibilité au cancer du sein sont limitées. Les éludes visant à identifier des mutations de

49

ces deux gènes dans des cas de cancer du sein (familiaux, sporadiques ou en âge précoce)

ou dans d'autres types de cancers se sont avérées mitigées. Puisqu'il s'agit de l'un des

sujets principaux de la présente thèse, ces études seront abordées plus en détails dans les

Chapitres I et II, et seront discutés en fin de thèse.

3.2.2 Détection, signalisation et réparation des dommages de l'ADN

Les cellules déficientes en BRCAl ou BRCA2 démontrent clairement une inefficacité à

effectuer la réparation des bris de l'ADN, en particulier les lésions impliquant des

BDBs.329'330 Les BDBs constituent des lésions particulièrement dommageables pour la

cellule. En fonction du type cellulaire ou du moment du cycle, la cellule dispose des voies

de réparation par recombinaison homologue (homologous recombination, HR) ou par la

jonction des extrémités non-homologues (non-homologous end-joining, NHEJ) pour

réparer les BDBs. La voie NHEJ ne nécessite pas d'homologie. Cette voie peut résulter en

une perte ou une addition de nucleotides aux sites de réparation et est habituellement

considérée comme introduisant des erreurs. La réparation homologue, qui nécessite une

chromatide sœur intacte comme modèle (et par conséquent ne peut survenir que dans les

phases cellulaires S et G2), est considérée comme une voie de réparation fiable.

Bien que les cellules déficientes en BRCAl ou en BRCA2 toutes deux présentent des

défauts de la réparation BDB, celle-ci provient de rôles distincts. Les fonctions cellulaires

de BRCAl dans la réparation des BDBs semblent consister majoritairement dans un rôle de

médiateur entre les protéines de détection des bris et les protéines impliquées dans la

réparation proprement dite, ce qui assure l'activation des mécanismes adéquats. En plus

d'être impliquée dans la voie de réparation par recombinaison homologue, certaines

évidences suggèrent que BRCAl pourrait aussi jouer un rôle dans la réparation NHEJ en

inhibant les mécanismes utilisant une micro-homologie et enclins à introduire des

erreurs.331'332 Le principal rôle de BRCA2 consiste à réguler l'action de la recombinase

RAD51 impliquée dans la réparation homologue.261

BRCAl est impliquée dans les voies de réparation des BDBs, bien que ces fonctions soient

moins bien comprises que celles de BRCA2. Des évidences suggèrent que le recrutement

des protéines de détection ATM et la nibrine est l'un des premiers événements ayant place

50

au niveau du site du bris, ce qui permet l'activation de la kinase ATM.333 ATM assure la

phosphorylation du variant d'histone H2AX et H2AX phosphorylée (y-H2AX) permet

l'accumulation de plusieurs protéines au niveau du bris, incluant BRCAl, MDC1 et le

complexe MRE11A/RAD50/Nibrin (M/R/N, voir la section 3.2.2.1 Interaction entre la

nibrine et BRCAl).334'335 À son tour, BRCAl est phosphorylée et est requise pour la

phosphorylation par ATM et ATR de protéines de signalisation et de réparation (Figure

13). 336

Complexe MRN Reconnaissance du bris et concentration des extrémités d'ADN

BRCA1.536P1.MDC1 Ç *) ' Amplification du signal par le recrutement de médiateurs/effecteurs de la réparation

\J

Figure 13. Recrutement des premières protéines de détection/réparation au site de bris. Le complexe MRN reconnaît les sites de bris et concentre les brins d'ADN, permettant ainsi le recrutement de facteurs responsables du relâchement de la chromatine, l'amplification du signal de bris et le recrutement des protéines de réparation.

L'évidence de la participation de BRCAl dans plusieurs aspects de la réponse aux bris de

l'ADN se reflète par ses interactions protéiques et sa présence dans plusieurs complexes

distincts. Par exemple, le recrutement de MDC1 aux sites de bris induit une poly-

ubiquitination de H2AX, modification qui est reconnue par RAP80. À son tour, RAP80

s'associe au dimère BRCAl-Abraxas et permet de promouvoir l'activité ubiquitine ligase

de BRCAl pour augmenter l'ubiquitination aux sites de bris. Cette modification permettrait

un remodelage de la chromatine permettant à la réparation d'avoir lieu.337 9 BRCAl est

aussi impliquée dans l'ubiquitination de protéines par l'intermédiaire de son association

avec BARD1, qui pourrait augmenter son activité ubiquitine ligase.340 L'hétérodimère

BRCAl-BARD1 est présent dans plusieurs complexes protéiques. Il a été suggéré qu'une

des activités importantes de BRCAl-BARD1 puisse être le contrôle de la recombinaison

homologue en interagissant avec BRCA2, RAD51 et PALB2.341

http://BRCA1.536P1.MDC1

51

L'implication de BRCA2 dans les mécanismes de la réparation de l'ADN se fait en

particulier par l'intermédiaire de son activité dans la HR, et la réparation NHEJ semble

intacte chez les cellules déficientes en BRCA2.342 BRCA2 est étroitement impliquée dans

la réparation de l'ADN, entre autres par son interaction avec la recombinase RAD51 et la

régulation de celle-ci.343'344 À la suite de dommages à l'ADN, BRCA2 et RAD51 co

localisent à l'intérieur de foci nucléaires dépendants de BRCA2, ce qui suggère que

BRCA2 est nécessaire à la localisation adéquate de RAD51 et à ses fonctions.345'346 Ces

foci sont considérés comme des sites de la chromatine où la réparation de l'ADN est en

cours.

BRCA2 interagit avec RAD51 par ses motifs BRCs, ce qui pourrait permettre à BRCA2 de séquestrer RAD51 en période où la réparation n'est pas nécessaire. Une fois le processus de HR enclenché, BRCA2 serait responsable de la relocalisation de RAD51 au niveau de la chromatine, ce qui permettrait à RAD51 de former des filaments en hélice autour des extrémités de l'ADN. Cette interaction de RAD51 avec l'ADN serait stabilisée par une seconde interaction des multimères de RAD51 impliquant la portion C-terminale de BRCA2. Suite à la formation des filaments sur les extrémités de l'ADN au site du bris, RAD51 permet l'invasion de la seconde molécule d'ADN et la recherche de la séquence homologue qui servira de modèle pour la réparation (Figure 14). De façon intéressante, BRCA2 peut être phosphorylée dans la région C-terminale d'interaction avec RAD51 sur la serine 3291. Cette phosphorylation a pour effet d'inhiber la liaison à RAD51 et ainsi pourrait permettre de réguler la recombinaison par RAD51.347

A -mm ™°= Figure 14. Mécanisme de la recombinaison homologue.

—\j L'attachement du complexe M/R/N au niveau du site de bris (A) permet de former les

ff" "Jfi ' ÀUÀU1- extrémités d'ADNsb nécessaires à la HR (B). RPA s'associe à l'extrémité d'ADNsb et

^nV»' ' ^^tfrJfai i permet d'enlever les structures secondaires (C). Par la suite, BRCA2 serait responsable

M rrrr-- du recrutement de RAD51 à l'extrémité, qui déloge RPA (D). L'extrémité d'ADNsb

111 recouverte de RAD51 (E) pourrait alors envahir la seconde molécule d'ADN (F),

^ rapprochée par le complexe M/R/N.

B i ' T*

_ , ' m . '

O '

I . ' ' '

F ' i ^ T T - \ " I *

i i i T i i i i i i i i i Tgja-i-r ' i % ^ * > N - r V ^ i i n

" * ^ Ï Ï N e , e ' R P A * R-5-0 5 1

52

3.2.2.1 Interaction entre la nibrine et BRCAl

Tel que mentionné précédemment, le complexe M/R/N est composé des protéines

MRE11A (MRE11 meiotic recombination 11 homolog A, S. cerevisiae), dont les très rares

mutations sont associées à une variante d'ataxie-télangiectasie appelée VAtaxia

telangiectasia-like disorder, de RAD50 qui n'est pas présentement associé à un syndrome,

et de la nibrine. MRE11A possède une activité nuclease requise pour la formation des

extrémités d'ADNsb nécessaires à la réparation des BDBs. RAD50 possède une activité

helicase nécessaire au déroulement de l'ADNdb (ADN double brins). La nibrine est quant à

elle impliquée dans l'interaction avec ATM, la localisation nucléaire de MRE11A-RAD50

et le positionnement de MRE11A-RAD50 aux sites des BDBs par son interaction avec

l'histone y-H2AX.348"350 Le complexe forme une structure typique qui suggère qu'il est en

mesure de lier les extrémités de l'ADN de façon à les rapprocher (Figure 13 et Figure

14).351 De façon intéressante, des travaux récents par van der Linden et collaborateurs352

suggèrent que les protéines du complexe M/R/N pourraient former plusieurs complexes

distincts stables, avec une composition protéique et une stœchiométrie variables, et qui

pourraient être associés à des variations fonctionnelles.

Plusieurs évidences indiquent que BRCAl interagit directement avec le complexe

M/R/N353"355, en particulier avec la nibrine (protéine encodée par le gène NBN aussi connu

sous le nom de NBS1 : Nijmegen breakage syndrome 1). Récemment, il a été démontré que

le complexe M/R/N s'associe aux protéines BRCAl et CtlP de façon dépendante du cycle

cellulaire, et cette association serait impliquée dans les mécanismes de réparation des

BDBs. Selon ce modèle, CtlP forme un pont entre la portion C-terminale de BRCAl et la

nibrine, et la portion N-terminale de BRCAl s'associerait aussi avec la nibrine. La

formation de ce complexe serait régulée par la phosphorylation de CtlP par la kinase

CDK.356 La participation de CtlP au sein de ce complexe pourrait être liée à la régulation de

l'activité nuclease de MRE11A.357

53

Outre son interaction avec BRCAl, le complexe M/R/N est aussi impliqué dans le contrôle

du cycle cellulaire puisqu'il semble être nécessaire pour obtenir une phosphorylation

adéquate des substrats d'ATM.348 De façon intéressante, la phosphorylation de BRCAl par

ATM semble aussi être nécessaire à l'obtention d'un niveau de phosphorylation optimal de

certains substrats d'ATM tels la nibrine, CtlP et p53.336 En plus de ces activités, le

complexe M/R/N a aussi été associé à des activités de réparation lors de la replication et de

la méiose, ainsi que le maintien des telomeres.358"360

NBN et le syndrome des cassures chromosomiques de Nijmegen (Nijmegen breakage

syndrome ; NBS).

Décrit pour la première fois par Weemaes et collaborateurs en 1981,361 NBS est un

syndrome récessif rare caractérisé par un retard de croissance, une microcephalic, une

immunodéficience, des manifestations pigmentaires de la peau et un risque très élevé de

cancers.362 Les caractéristiques cliniques du NBS s'apparentent à ceux de l'ataxie-

telangiextasie et de l'AF.363'364 Au plan cellulaire, on observe une instabilité

chromosomique spontanée365, une sensibilité accrue aux radiations ionisantes (induisant des

BDBs) et des défauts de cycle cellulaire.366"368 On observe chez ces patients des

lymphomes, hépatomes, méningiomes, gonadoblastomes, médulloblastomes et des

rhabdomyosarcomes et peu de ces patients survivent passé la trentaine.369

La nibrine est composée d'un domaine FHA (Forkhead-associated domain) et de deux

domaines BRCT en N-terminal et de domaines de liaison à MRE11A et à ATM en C-

terminal.351 C'est par ses domaines FHA et BRCT que la nibrine peut reconnaître l'histone

y-H2AX et recruter ses partenaires MRE11A et RAD50 aux sites des dommages. La

nibrine est une protéine essentielle aux cellules.370 Chez les patients atteints du syndrome

de Nijmegen, on retrouve dans la majorité des cas la mutation hypomorphique de NBN

(657del5) qui permet l'expression d'une protéine de 70 kDa (kilo Daltons) par l'utilisation

d'un site d'initiation de la traduction interne.371

Avant même l'identification du gène NBN, il a été reconnu que les parents de patients

atteints du NBS (hétérozygotes présumés pour les mutations de NBN) présentent un risque

accru de cancers.372 Plusieurs investigations se sont concentrées sur la mutation 657del5,

présente chez plus de 90% des patients atteints de NBS. La fréquence des porteurs de cette

54

mutation est de 0,6% dans les populations d'ascendance slave d'Europe Centrale et de

l'Est.373 La contribution de cette mutation ou autres variants de NBN au risque de cancer

demeure controversée,374"384 et sera discuté dans le contexte de mes recherches au Chapitre

III et mis en perspective dans la section discussion de la thèse.

3.2.2.2 Implication de BRCAl et H RCA 2 dans l'Anémie de Fanconi

En 1927, le médecin et scientifique suisse Guido Fanconi décrit trois frères présentant une

combinaison de pancytopénie, d'anomalies congénitales et d'hyperpigmentation se

transmettant sous forme autosomique récessive.385 Le phénotype typique, qui est présent

chez 70-75% des patients, se caractérise par une petite stature en combinaison avec une

variété d'anomalies congénitales (défauts de l'axe radial, changements pigmentaires,

malformations urogénitales, atrésie du canal auditif externe, et plusieurs autres), des

anomalies endocriniennes et de l'infertilité.386 En 1964, Schroeder et collaborateurs

démontrent l'existence d'une instabilité chromosomique (entre autres des bris de la

chromatide) chez des patients AF,38' ce qui suggérait une implication des défauts

génétiques sous-jacents dans la réparation des BDBs associée à une fréquence accrue de

cancers chez ces patients. Près d'im tiers des patients ne présente pas d'anomalie

congénitale, et la première manifestation de la maladie est le développement d'une

défaillance de la moelle osseuse ou l'apparition d'un cancer.388 Le risque de leucémies est

estimé à 40% à 30 ans, et le risque de tumeurs solides à 76% à 45 ans.389

Il est intéressant de noter que les cellules de patients atteints d'AF présentent plusieurs

caractéristiques communes avec les cellules déficientes en BRCAl ou BRCA2.390 En plus

d'une instabilité chromosomique, les cellules de patients AF sont hypersensibles aux agents

induisant des ponts de l'ADN (interstrand crosslinks; ICL), tels la mitomycine C (MMC),

le diepoxybutane, la cisplatine ou les agents de type «moutarde à l'azote».390 La sensibilité

à ce type d'agents est encore utilisée à ce jour pour confirmer le diagnostic clinique. Les

cellules de patients atteints d'AF présentent aussi une sensibilité légère aux radiations

ionisantes ainsi qu'aux radicaux libres de l'oxygène.390

Au plan génétique, l'AF est fortement hétérogène. Des expériences de complémentation,

qui consistent à insérer dans les cellules en culture du patient l'ADNc (ADN

55

complémentaire) pertinent et à évaluer la sensibilité des cellules à la MMC, ont permis

d'identifier au moins 13 groupes de complémentation (FANCA, B, C, Dl, D2, E, F, G, I, J,

L, M et N). Chaque groupe de complémentation est associé à des mutations d'un gène

différent, qui sont répartis à travers le génome (Tableau 8). De façon notable, des mutations

bialléliques de BRCA2 ont été retrouvées chez les patients de sous-groupe Dl.391 Bien que

des mutations de BRCA2 aient aussi été suggérées chez les patients de sous-groupe B,

Meetei et collaborateurs392 ont par la suite identifié le gène FANCB sur le chromosome X.

Il existe très peu de corrélations entre les mutations identifiées dans les différents gènes et - , , , -a *aûy4

le phénotype observé, qui peut varier à l'intérieur d'une même famille. ' Cependant, les

données actuelles suggèrent que les patients appartenant aux groupes Dl, D2 et N

présenteraient un phénotype plus sévère, avec une susceptibilité particulièrement élevée

aux cancers infantiles pour les groupes Dl et N-99*395*396 Le s protéines FANCs présentent

très peu de domaines fonctionnels connus et, à l'exception de FANCD2 et FANCI, aucune

homologie protéique.

Tableau 8. Caractéristiques des gènes associés à l'Anémie de Fanconi Gènes Fréq Loci Exons Protéine Domaines protéiques Commentaires

(%) (kDa) FANCs

FANCA 66 16q24.3 43 163 Motif partiel «leucine zipper», SEN, SLN

Lie BRCAl

FANCB ~2 Xp22.3 10 95 SLN FANCC 10 9q22.3 15 63 -FANCD1/ ~2 13ql2.3 27 384 Répétitions BRCs, SLN,

BRCA2 Domaines OB, à hélices a, en

FANCD2 ~2 3p25.3 44 155/162 tour Motif de monoubiquitination Lie BRCA2

FANCE ~2 6p21-22 10 58 -FANCF ~2 l lpl5 1 42 - Homologie à ROM FANCG/XRCC9 9 9pl3 14 68 Répétition tétratricopeptide Lie BRCA2 FANCI ~2 15q25-26 38 140/147 SLN, motif de

monoubiquitination -40% de similarité avec FANCD2 (motif de monoubiquitination)

FANCJ/BRIP1/ ~2 17q22 20 140 Helicase DEAH Lie BRCAl BACH1

FANCL/PHF9 <0,2 2pl6.1 14 43 Répétitions WD40, Doigts PHD Activité ubiquitine ligase FANCM/Hef <0,2 14q21.3 23 250 Domaine helicase, endonucléase FANCN/PALB2 ~2 16pl2 13 131 Similaire à WD40 Lie BRCA2

Associés au FANCs \\\WÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊÈÊÊÊÊÊ? FAAP100 - 17q25.3 9 100 Lie FANCB et FANCL FAAP24 - 19ql3.11 5 24 ERCC4 inactif, 2 motifs hélice-

pince-hélice Lie FANCM, 31% de similarité (C-terminal de FANCM)

USP1 - lp31.3 9 88 Enzyme de dé-ubiquitination UBE2T - lq32.1 7 22 Enzyme conjuguant l'ubiquitine

56

L'étude des bases génétiques de l'AF ont mis en évidence des liens étroits entre BRCAl,

BRCA2 et les protéines FANCs, en plus d'identifier tout un réseau cellulaire de réponse

aux dommages de l'ADN (Figure 15).397 Jusqu'à présent, il a été démontré que FANCA, B,

C, E, F, G, L et M forment un complexe (complexe de base) avec les protéines associées

FAAP24 et FAAP100. Aucune mutation des gènes encodant FAAP24 et FAAP100 n'a

jusqu'à présent été identifiée, d'où leur appellation de FAAP (Fanconi Anemia associated

protein), suivi du poids moléculaire. Par l'intermédiaire de FANCM et FAAP24, le

complexe de base interagit avec l'ADN aux sites de bris, possiblement pour stabiliser les

fourches de replication bloquées par la présence des ICLs.398 Le complexe de base possède

aussi une activité ubiquitine ligase, dont FANCL est la sous-unité catalytique.399'400 Cette

activité est responsable de la mono-ubiquitination d'un deuxième complexe formé des

protéines FANCD2 et FANCI (complexe ID) suite à la formation de ICLs dans l'ADN

(Figure 16). Ces bris peuvent aussi activer certaines kinases, dont ATR et CHEK1, qui à

leur tour sont responsables de l'hyperphosphorylation du complexe de base en

phosphorylant FANCA, FANCM, FANCE et FANCG.401"404

La mono-ubiquitination de FANCD2 et FANCI sert de signal d'activation de localisation

au niveau de foci de réparation des bris. Certaines évidences semblent suggérer que

FANCD2 mono-ubiquitinée présente une affinité accrue pour l'ADN. Il est aussi possible

que FANCD2 et FANCI peuvent interagir au niveau de l'ADN avec des protéines

possédant des motifs de liaison de l'ubiquitine. De façon intéressante, l'enzyme USP1

(ubiquitin-specific protease 1) serait responsable de la régulation d'une part de l'activité du

complexe en dé-ubiquitinant FANCD2 et FANCI. Une autre part de la régulation du

complexe ID pourrait être effectuée par phosphorylation par ATM/ATR, ce qui pourrait

servir de signal d'amplification et d'activation du point de restriction en phase s.405"408

Un troisième groupe de protéines FANCs est situé en aval, ou du moins en parallèle, du

complexe ID. Ce groupe est composé de FANCD1/BRCA2, FANCJ/BRIP1/BACH1 et

FANCN/PALB2. Une caractéristique importante des gènes encodant ces protéines est leur

association avec le cancer du sein lorsque mutés sur un seul allele (voir les sections 2.2.1.1

HBOC, BRCAl et BRCA2, 2.2.3.3 BRIP1/BACH1/FANCJ et 2.2.3.4 PALB2IFANCN).

La fonction exacte du complexe ID au niveau de la chromatine est inconnue. Toutefois, le

57

complexe ID pourrait être responsable du recrutement de protéines (dont FANCJ, N, Dl et

BRCAl) aux sites de bris pour réguler directement ou indirectement certaines fonctions de

FANCD1/BRCA2 dans la réparation des ICLs et la HR.409'410

Figure 15. Implication de BRCAl et BRCA2 dans la voie Fanconi/BRCA. La formation adéquate du complexe de base est nécessaire à la monoubiquitination de FANCD2 et FANCI, ce qui assure leur re-localisation au niveau de foci de réparation où se retrouvent aussi BRCAl, BRCA2, FANCJ et FANCN.

Le mécanisme exact de la réparation des ICLs n'est pas bien compris, bien qu'un modèle

ait été proposé (Figure 16). Dans la cellule, le ICL bloque la fourche de replication en

empêchant la séparation des deux brins de l'ADN. L'arrêt de la fourche de replication

recrute le complexe de base, qui stabilise la fourche, et la kinase ATR. ATR est activée et

phosphoryle par la suite le complexe ID (et probablement aussi les protéines FANCA, G et

M du complexe de base et FANCE par l'intermédiaire de la kinase CHEK1). En parallèle,

le complexe de base induit la relocalisation du complexe ID à la chromatine par mono

ubiquitination. Pour effectuer la réparation, le bris ICL doit d'abord être décroché sur l'un

58

des brins par les endonucléases XPF-ERCC1 et MUS81-EME1. Le brin brisé est ensuite

réparé par une polymerase TLS (translesion synthesis) qui passe au-delà de la lésion, mais

qui est sujette aux erreurs. La réparation par excision nucléotidique (nucleotide excision

repair, NER) enlève ensuite l'adduit et répare la séquence brisée. Le résultat à cette étape

est un BDB qui est à son tour réparé par HR par BRCA2, PALB2 et RAD51.397

Figure 16. La réparation des ICLs rencontrés lors de la replication par la voie Fanconi/BRCA. La création d'un ICL cause l'activation du complexe ID par le complexe de base. Une fois activé, ID s'associe à la chromatine où il serait impliqué dans le recrutement de protéines de remodelage de l'ADN et de protéines impliquées dans la réparation.

Polymerase JM rçs- B1n-rcAi*s® *-■■> A ^ L X R r a HR

Les protéines FANCs et BRC A1/2 interagissent de plusieurs façons au sein de cette voie

cellulaire de réparation. La première évidence d'un lien avec la voie Fanconi a été

identifiée en 2001, lorsqu'il a été démontré que BRCAl est nécessaire à la re-localisation

de FANCD2 mono-ubiquitinée au niveau de foci nucléaires,4" et à son interaction avec

l'histone y-H2AX.412 En plus de l'implication de BRCA2, BRIP1/BACH1 et PALB2 dans

l'AF, une interaction constitutive de FANCA avec BRCAl a aussi été démontrée,41 et

certaines évidences suggèrent que les protéines FANCs pourraient avoir certaines activités

hors de la voie de réparation décrite plus haut.414 De façon intéressante, FANCD2 interagit

59

directement avec BRCA2 dans un sous complexe qui comprend aussi FANCG et XRCC3

(un paralogue de RAD51), peut-être pour promouvoir la HR en aval de la voie

Fanconi/BRCA.415'416

Tel que mentionné précédemment, le risque de cancer est fortement accru chez les patients

atteints d'AF. Ceux-ci présentent majoritairement des leucémies myélocytaires aiguës et

certains types de cancers solides (en particulier carcinomes tête et cou, gynécologiques ou

de l'œsophage). 7 II est aussi notable que les patients AF de sous-groupe Dl et N

présentent fréquemment des tumeurs cérébrales et de Wilms.199'395'396 De par leur sensibilité

aux agents induisant des bris de l'ADN, leur implication dans les voies de réparation de ces

bris ainsi que leur association avec plusieurs gènes altérés dans le cancer, les gènes FANCs

sont des candidats intéressants dans la recherche de gènes altérés dans la tumorigénèse.

Certaines évidences suggèrent que les cellules de porteurs de mutations des gènes FANCs

pourraient être plus sensibles aux agents induisant des bris de l'ADN, bien que les

différences observées ne sont pas toujours significatives.418"420 Outre le risque de cancer

associé à des mutations mono-alléliques de BRCA2/FANCD1, PALB2/FANCN et

BRIP1/BACH 1/FANCJ (voir les sections 2.2.1.1, 2.2.3.3 et 2.2.3.4), certaines altérations de

la voie Fanconi/BRCA ont aussi été rapportées dans certaines cohortes de patients non-AF.

L'étude des familles d'individus atteints d'AF a jusqu'à présent apporté des évidences

contradictoires. Une étude initiale par Swift et collaborateurs421 a suggéré un risque accru

de cancers chez les parents de patients AF, bien que cette association n'ait pas été retrouvée

dans d'autres éludes subséquentes limitées par le nombre de familles disponibles pour

analyse.422"423 Une étude récente chez 944 parents (majoritairement des grands-parents) de

patients atteints d'AF semble suggérer une augmentation du risque de cancer du sein chez

les grands-mères des patients, en particulier chez les familles porteuses de mutations de

FANCC avec un rapport d'incidence standardisé (standardized incidence ratio; SIR) de 2,4

(IC 95% l,l-5,2).424 Il est à noter que la sous-division des familles en fonction du groupe

de complémentation réduit de beaucoup le nombre d'individus par groupes et peut rendre

difficile l'identification d'un possible effet gène-spécifique. Une autre étude regroupant 575

individus de 36 familles n'a pas été en mesure de reproduire ce résultat, bien que cette

étude ait mis en évidence une association possible avec un risque accru de cancer de la

60

prostate chez les porteurs obligatoires (RR 3,089 IC 95% 1,09-8,78). Cependant, la division

des individus en fonction du groupe de complémentation n'a pas été possible dans cette

étude.425

L'implication de variants des gènes FANCs, ou une altération de leur expression, a été

suggérée dans certaines instances de leucémies,426"428 de cancer de l'ovaire,429 du

pancréas,430'431 et des carcinomes des cellules squameuses de la cavité orale et de

l'œsophage.432 Entre autres, une duplication de 13 nucleotides dans le promoteur de

FANCA a été étudiée dans une cohorte de 352 cas de cancer du sein, 390 cas de cancer de

l'ovaire et 256 contrôles sains. Alors qu'aucune association n'est retrouvée chez les cas de

cancers du sein, la duplication est significativement plus fréquente chez les patientes

atteintes de cancer de l'ovaire par rapport aux contrôles sains, ce qui suggère qu'elle

pourrait avoir un effet protecteur (OR 0,72; IC 95% 0,53-0,99).429

Un cas particulier de l'implication des gènes FANCs dans la carcinogenèse est l'altération

de l'expression de FANCF suite à l'hyperméthylation de son promoteur. Jusqu'à présent, la

répression épigénétique de FANCF a été observée dans de nombreux cancers dont des

leucémies,433 des cancers de la vessie,434 des cancers du col de l'utérus,435 des cancer du

poumon,436 et des cancers de l'ovaire.437'438 Il est logique de penser que par leur rôle dans le

maintien de la stabilité génomique, les gènes FANCs soient la cible d'une inactivation

résultant ultimement dans la formation de tumeurs. Cependant, il est jusqu'à présent

difficile de déterminer si cette altération est un événement de l'initiation ou de la

progression tumorale. De façon intéressante, des études récentes suggèrent que FANCC,

F AN CL, FANCNIPALB2 pourraient aussi être la cible d'une altération de leur expression

par hyperméthylation dans certains cas de leucémies ou de cancers du sein. ' ' De plus,

FANCB, FANCF, FANCD2 et FANCJ/BRIP1/BACH1 pourraient voir leur expression

altérée dans certaines lignées cellulaires cancéreuses et tumeurs primaires de carcinomes de

la tête et du cou440'441 ou de cancers du sein (à la fois sporadiques et héréditaires).442

Jusqu'à présent, l'implication des gènes FANCs (autres que FANCD1/BRCA2,

FANCN/PALB2 ou FANCJ/BRIP 1/BACH1) dans la carcinogenèse mammaire a été peu

étudiée. L'analyse des gènes FANCA, B, C, D2, E, F et G a été effectuée par Seal et

collaborateurs443 dans une cohorte de 88 familles avec une histoire familiale chargée de

61

cancer du sein du Royaume-Uni. Bien que cette étude n'ait pas identifié de mutation

clairement pathogène, deux variants faux-sens observés (FANCA p.Leull43Val et FANCE

p.Arg365Lys) étaient absents des 300 contrôles sains génotypes et semblaient être transmis

avec la maladie. Bien que l'analyse de FANCD2 dans une cohorte australienne de cas de

cancers du sein n'ait pas permis de mettre en évidence une association,444 l'étude de 7

variants fréquents de FANCA, FANCL et FANCD2 dans une cohorte de 897 cas de cancer

du sein sporadiques et 1033 contrôles sains a démontré une association possible du variant

L1366L de FANCD2 (OR par allele de 1,35 IC 95% 1,09-1,67). Le variant p.Leul366Leu

pourrait être en déséquilibre de liaison avec un autre variant situé dans une région

conservée du promoteur.445 Jusqu'à présent, ces évidences suggèrent une association des

gènes FANCs dans le développement de cancers, bien que cette association ne soit pas

définitive446"448 et doive être sujette à des analyses plus poussées.

3.2.3 Autres fonctions de BRCAl et BRCA2

Outre ces activités, BRCAl et BRCA2 possèdent d'autres fonctions cellulaires, bien

qu'elles soient généralement moins bien comprises.

BRCAl et le remodelage de la chromatine.

L'activité de régulation de la transcription de BRCAl semble s'effectuer à la fois par

l'intermédiaire du recrutement de co-activateurs et co-répresseurs, mais aussi par le

recrutement de protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine. BRCAl interagit

avec des acétylases d'histones (HDAC1/2), la composante BRG1 associée au complexe de

remodelage SWI/SNF, ainsi que les protéines hGCN5/TRRAP, TRAP220 et p300/CBP qui

font partie de complexes acétyl-transférases.449"453 L'interaction de BRCAl avec ces

différentes protéines de remodelage de la chromatine permettrait ainsi l'accès des facteurs

de transcription aux sites appropriés.

BRCAl. BRCA2 et la régulation du cycle cellulaire.

Le contrôle du cycle cellulaire est un mécanisme essentiel permettant l'arrêt de la

croissance afin de procéder à la réparation des bris de l'ADN. L'activité de BRCAl dans la

régulation de plusieurs points de restriction du cycle cellulaire est effectuée en partie par le

contrôle transcriptionnel de certains gènes clés (par exemple GADD45A, Figure 12) et

62

d'autre part par son association à des protéines de régulation (Figure 15). L'implication de

BRCA2 dans les mécanismes de régulation du cycle cellulaire est moins claire. Certaines

analyses suggèrent que BRCA2 pourrait être nécessaire à la progression de la cellule à

travers la mitose par son association avec BRAF35 et leur co-localisation au niveau des 454 chromosomes. De plus, BRCA2 s'associe à la kinase BUBR1/BUB1B, qui est

impliquée dans l'attachement adéquat des chromosomes au fuseau mitotique. BUB1B

inhibe APC/C, ce qui retarde l'anaphase et assure la ségrégation appropriée des chromosomes 456

Phosphorylation de BRCAl par ATM Phosphorylation dépendante de BRCAl de p53 (Serl5) Régulation transcriptionnelle de CDKtflA

Régulation de la transcription du gène MÂD2L1

G2/M

Phosphorylation de BRCAl par A' (Serl3875

-ATM

Activation de la kinase CHEK1 (requiert BRCAl) Régulation de la transcription des gènes Wctl, PLK1,14-3-3 et GADD45A

Figure 17. Implication de BRCAl dans la régulation du cycle cellulaire. L'implication de BRCAl dans la régulation du cycle cellulaire a été démontrée au niveau des principaux points de restriction cellulaires.

L'activité ubiquitine ligase de BRCAl.

BRCAl s'associe de façon constitutive dans la cellule à BARD1, et cette association est

requise pour l'activité ubiquitine ligase de BRCAl.457 À son tour, le complexe peut être

activé par la conjugaison d'une protéine SUMO (small ubiquitin-like modifier)?5* Il a été

suggéré que l'hétérodimère BRCAl-BARD1 participe à plusieurs complexes cellulaires qui

pourraient ubiquitiner différents substrats. Parmi ceux-ci, RNA pol II, ERa, CtlP et TFIIE

ont été suggérés.459"463 Les conséquences biologiques de l'ubiquitination par BRCAl -

BARD1 ne sont pas bien comprises, car le signal induit n'a pas encore été déterminé. En

fonction du type de chaine d'ubiquitination, plusieurs types de procédés cellulaires peuvent

être signalés.464 Il a été suggéré que la spécificité de la réaction d'ubiquitination résulte de

l'interaction différentielle avec plusieurs enzymes E2 de conjugaison de l'ubiquitine.465

63

4. Types de variations de séquence Les gènes possèdent une structure spécifique nécessaire à leur expression adéquate. Par

conséquent, ils peuvent être la cible de plusieurs types d'altérations, certaines délétères,

certaines bénignes et d'autres dont les conséquences sont mal comprises dans le cadre de

nos connaissances actuelles. En fonction du type et de la position de la variation, le gène

sera exprimé de façon normale, sera plus/moins exprimé qu'à la normale ou produira

ultimement une protéine tronquée incapable de fonctionner normalement à l'intérieur de la

cellule. Généralement, on reconnaît trois types d'altérations de la séquence : les

substitutions nucléotidiques, les deletions ou insertions d'un ou plusieurs nucleotides

(moins de 20) et les réarrangements génomiques (grandes insertions, grandes deletions,

inversions, duplications ou translocations). Souvent, ces derniers sont produits suite à une

recombinaison entre séquences similaires mais non identiques (par exemple en implicant

des répétitions ALU dispersées au sein du génome).

Les substitutions et les insertions/deletions auront des conséquences variables en fonction

de la région dans laquelle elles sont situées. Ces altérations au niveau de la région codante

auront des conséquences lors de la traduction. Une insertion ou deletion impliquant un

multiple de 3 nucleotides créera une insertion ou une deletion d'un ou de plusieurs aa.

Lorsqu'elles impliquent un nombre de nucleotides qui n'est pas un multiple de trois, ces

types de variations entraîneront une modification du cadre de lecture qui introduit un codon

d'arrêt prématuré résultant en la production d'une protéine tronquée souvent non

fonctionnelle. Les substitutions nucléotidiques de la région codante peuvent quant à elles

induire le changement d'un aa (changement faux-sens) ou déterminer un arrêt de la

traduction en introduisant un codon Stop (changement non-sens). Peu importe leur

emplacement dans la séquence du gène ou de son promoteur, les subtitutions

nucléotidiques, les insertions et les deletions peuvent aussi modifier l'expression du gène

(Figure 18 A).

64

I Modification Altération du site Création d'un Alteration Alteration du l d'un site de d' initiation de la nouveau site d'unsite5'3 ' sitedepoly-4. liaison d'un transcription d'épissage d'épissage adénylation

d'un site de liaison d'un facteur dc

transcription

Altération d'un facteur de transcription

Modification d'un site de liaison d'un facteur de

transcription séauences de maturation de l'ARNm

nouveau site d'épissage

Modification d'un motif exomque de promotion (ESE) ou de répression

(ESS) de l'épissage Mutation non-sens prés d'une jonction exon

intron induisant la dégradation de l'ARNm

Altération Modification d ' un du Mie de motif de stabilisation

branchement dégradation de l'ARNm

Modification d'un motif intronique de promotion (ISE) ou de répression

i ISS i dc l'épissage

B

Figure 18. Position des altérations pouvant affecter l'expression d'un gène. (A) Le niveau de transcrits produits peut être influencé par l'altération de divers mécanismes de régulation de la transcription du gène, ou de la maturation et de la stabilité de l'ARNm. (B) Séquences consensus pour les sites donneurs, accepteurs et de branchement. Les nucleotides en rouge sont habituellement invariables (bien qu'il existe certains types d'exons dont les nucleotides AG du site accepteur sont remplacés par AC, et les nucleotides GT du site donneur sont remplacés par AT). Aux autres positions indiquées, les nucleotides les plus fréquemment retrouvés sont indiqués. Les bandes vertes et rouges représentent des séquences promouvant l'inclusion et l'exclusion des exons, respectivement. ESE : Exonic splicing enhancer. ESS : Exonic splicing silencer. ISE: Intronic splicing enhancer. ISS: Intronic splicing silencer. Pyrn: Répétition pyrimidique.

Lors de son expression, le gène eukaryote est d'abord transcrit en un ARNm précurseur qui

subit par la suite une maturation permettant d'enlever les séquences introniques (épissage)

ainsi que l'ajout d'une coiffe à son extrémité 5' et une queue poly-adénylée à son extrémité

3'. La réaction d'épissage est un mode très important de régulation et nécessite la présence

65

de certaines séquences de signalisation qui permettent de reconnaître le début et la fin de

l'intron, et ce sur de grandes distances. Ces séquences sont au minimum constituées d'un

site donneur en 5' de l'intron, ainsi que d'un site de branchement et d'un site accepteur en

3' (Figure 18B). Ces séquences sont reconnues par divers complexes snRNP qui sont

composés d'une part d'une molécule d'ARN et d'autre part de protéines. La réaction

d'épissage s'effectue en deux étapes. Dans un premier temps, l'ARNm précurseur est clivé

en 5' d'un intron et cette extrémité est liée au site de branchement. Au cours de la seconde

étape, l'ARNm précurseur est clivé à l'extrémité 3' de l'intron, les exons sont ligués et la

boucle formée par l'intron (lariat) est relâchée.458

Bien que les signaux aux extrémités 5' et 3' de l'intron permettent l'épissage, ces

séquences sont fréquemment insuffisantes afin de distinguer les exons des introns. Des

séquences additionnelles de promotion (enhancer) et d'inhibition (silencer) sont retrouvées

à la fois dans les introns et les exons. Ces séquences peuvent être près (50-100 pb) ou loin

(de 100 à plusieurs milliers de pb) du site d'épissage. En plus de permettre l'épissage

correct des transcrits, ces séquences et l'action des protéines régulatrices avec lesquelles

elles interagissent permettent un épissage alternatif selon le type cellulaire et/ou le stade du

développement et/ou les conditions physiologiques. De cette façon, plusieurs messages

(isoformes d'ARNm) peuvent êtres produits à partir d'un même gène et il est présentement

estimé que plus de 60% des gènes pourraient être sujets à de l'épissage alternatif.459

66

5. Problématique Tel qu'illustré dans les sections précédentes, le cancer du sein est une maladie très

complexe qui affecte une vaste proportion d'individus mondialement. Bien que certains

facteurs de risque aient été identifiés, les connaissances actuelles sont insuffisantes pour

permettre d'identifier tous les individus ayant un risque plus élevé au sein de la population,

ou de comprendre les effets «écogénétiques» (c'est-à-dire l'interaction entre la génétique

d'un individu et son environnement) affectant la susceptibilité d'un individu à développer

un cancer du sein. En ce sens, les études de jumeaux mono- et dizygotes mettent en

évidence la place prépondérante de la génétique dans la prédisposition à cette maladie.50'51

Au cours des 15 dernières années, des progrès majeurs ont été effectués dans

l'identification de gènes/allèles de susceptibilité. Malgré cela, il est présentement estimé

que les alleles de susceptibilité connus sont responsables d'au maximum 30% du risque

familial de cancer du sein.38 Dans la population canadienne française, les analyses

effectuées dans les groupes des Drs Durocher et Simard indiquent que les alleles connus

(de penetrance forte à intermédiaire) ne seraient responsables que d'environ 25% du

regroupement familial de cancer du sein.65'1 6-468"470 Globalement, ces données indiquent

qu'il demeure des alleles de susceptibilité au cancer du sein à identifier.

5.1 Collection familiale étudiée : les familles à risque élevé de la population canadienne française Les recherches présentées dans les chapitres suivants ont été effectuées dans le cadre des

projets du programme interdisciplinaire INHERIT BRCAs (Interdisciplinary Health

Research International Team on BReast CAncer susceptibility), dirigé par le Dr Jacques

Simard, et dont l'équipe du Dre Durocher fait partie. Dans un premier temps, ce

programme visait entre autre l'étude des facteurs génétiques et environnementaux associés

au cancer, ainsi que la détermination des enjeux éthiques, légaux et psychosociaux associés

aux tests de dépistages génétiques. C'est par l'intermédiaire de ce programme que les Drs

Simard et Durocher ont entre autres été en mesure d'évaluer la fréquence et la penetrance

des mutations de BRCAl et BRCA2 dans une cohorte de familles à risque élevé de cancer

du sein et/ou de l'ovaire de la population canadienne française.65 Brièvement, les 250

familles participant à ce programme ont été recrutées selon des critères précis indicatifs

67

d'une forte prédisposition génétique : 1) des individus de familles à risque élevé avec

quatre cas de cancer du sein et/ou de l'ovaire diagnostiqués chez des parents de premier ou

deuxième degré; 2) des familles présentant trois cas de cancers du sein et/ou de l'ovaire

chez des parents de premier degré; 3) des familles chez lesquelles une mutation des gènes

BRCAl ou BRCA2 avait déjà été identifiée au préalable 4) des familles présentant des

évidences claires d'une transmission héréditaire. Les familles chez lesquelles la recherche

de mutations de BRCAl et BRCA2 s'est avérée négative ont été invitées à participer au

projet du Dre Durocher visant l'identification d'autres alleles de susceptibilité au cancer du

sein.

Des recherches génétiques dans une population telle que celle du Québec, majoritairement

canadienne française, offrent des opportunités particulières. Cette population provient d'un

effet fondateur qui se manifeste entre autres par la présence à une fréquence accrue de

certaines mutations.471 Entre la fondation de la ville de Québec, il y a 400 ans, et la

conquête par les Britanniques en 1759, plus de 25000 colons français (provenant

majoritairement de la côte atlantique et de la région de Paris) se sont établis en Nouvelle-

France. Cependant, seulement 8500, dont 1600 femmes, se sont établis de façon

permanente.472 Après la conquête, des barrières de religion et de langue ont limité les

mariages avec les nouveaux arrivants majoritairement anglophones protestants. On estime

que les 2600 colons établis en Nouvelle-France avant 1680 contribuent pour environ les

deux tiers du bassin génétique actuel de la population canadienne française.471 Par

conséquent, la population canadienne française est constituée à partir d'un petit échantillon

non représentatif de la population française, d'où l'effet fondateur observé qui entraîne un

changement dans la fréquence de certains alleles. L'historique de la population canadienne

française peut être utilisé afin de faciliter l'identification de nouveaux gènes de

susceptibilité.

5.2 Objectifs de l'étude Ainsi, mon projet de recherche vise à évaluer la contribution de nouveaux gènes de

susceptibilité au cancer du sein par une approche de type «gène candidat». Les gènes

étudiés ont été choisis sur la base de leur pertinence biologique dérivant de leur implication

dans des voies cellulaires communes avec les alleles de susceptibilité connus, en particulier

68

leur étroite interaction avec BRCAl et BRCA2. En ce sens, les chapitres I et II présentent les

analyses génétiques de ZNF350/ZBRK1 et de GADD45A qui sont associés à certains

aspects de la régulation de la transcription opérée par BRCAl. Dans certaines

circonstances, ZNF350 agit comme co-répresseur de l'activité transcriptionnelle de

BRCAl, entre autres afin de réguler négativement l'expression de GADD45A et permettre

la progression cellulaire de la phase G2 à la phase M. Au chapitre III sont présentés les

résultats de l'étude du gène NBN dans notre cohorte de familles à risque élevé de cancer du

sein et/ou de l'ovaire. Tel qu'indiqué à la section 3.2.2.1, la nibrine joue un rôle essentiel à

l'intérieur de la cellule en participant à la reconnaissance précoce des bris, en activant les

voies de réparation adéquates (dont celles impliquant BRCAl et BRCA2) et en rejoignant

les molécules d'ADN pour permettre une réparation appropriée.

69

CHAPITRE I : Genetic Variants and -Haplotype Analyses of the ZBRK1/ZNF350 Gene in High-Risk non BRCAl72

French Canadian Breast and Ovarian Cancer Families.

70

Genetic Variants and Haplotype Analyses of the ZBRK1/ZNF350 Gene in High-Risk

non BRCA1/2 French Canadian Breast and Ovarian Cancer Families.

Sylvie Desjardins1, Pascal Belleau2, Yvan Labrie1, Geneviève Ouellette1, Paul Bessette3,

Jocelyne Chiquette4, Rachel Laframboise5, Jean Lépine6, Bernard Lesperance7, Roxane

Pichette7, Marie Plante8, INHERIT BRCAs* and Francine Durocher1**

'Cancer Genomics Laboratory, Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre,

Centre Hospitalier Universitaire de Québec and Laval University, Québec, Canada;

2Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre, Centre Hospitalier Universitaire

de Québec and Laval University, Québec, Canada;

3Service de gynécologie, Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke, Fleurimont,

Canada;

4CHnique des maladies du sein Deschênes-Fabia, Hôpital du Saint-Sacrement, Québec,

Canada;

5Service de medicine génétique, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Pavillon du

CHUL, Canada;

6Centre Hospitalier Régional de Rimouski, Rimouski, Canada;

7Service d'hémato-oncologie, Hôpital du Sacré-Cœur, Montréal, Canada ;

8Service de gynécologie, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Hôpital Hôtel-Dieu

de Québec, Québec, Canada.

Short title : ZBRK1 variants and haplotypes in French Canadian BOC families.

71

*Other members of INHERIT BRCAs involved in this study are listed in Appendix 1.

**Corresponding author:

Dr. Francine Durocher

Cancer Genomics Laboratory, Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre,

Centre Hospitalier Universitaire de Québec and Laval University,

2705 Laurier Boulevard, T2-53

Québec city, Québec

Canada, G1V4G2

Telephone: (418) 654-2296

FAX: (418) 654-2761

E.mail: Francine.duroeher(Sscrchul.ulaval.ca

Keywords : Breast cancer susceptibility, ZBRK1 variants, haplotype, tagging SNPs

Abbreviations: 3'UTR, 3'untranslated region, ANG1, angiopoietin-1; CI, Confidence

interval; cSNP, coding SNP; EM, Expectation Maximized; LD, Linkage disequilibrium;

MAF, Minor allele frequency; MLPA, Multiplex ligation-dependent probe amplification;

OR, Odd Ratio; PPP2R1A, Protein phosphatase 2 regulatory sub-unit 1 alpha; tSNP,

TaggingSNP; ZBRK1, Zinc finger and BRCAl-interacting protein with a KRAB domain 1.

Int J Cancer. 2008;122(1):108-16.

72

Résumé Notre compréhension actuelle de la susceptibilité au cancer du sein implique

principalement des mutations de deux gènes majeurs, BRCAl et BRCA2, retrouvées chez

approximativement 25% des familles à risque élevé, ainsi que des mutations dans des gènes

de plus faible penetrance, tels ATM et CHEK2. Près des deux tiers des familles présentant

des cas multiples de cancers du sein devront être expliqués par des mutations dans des

gènes encore non identifiés. Dans une approche «gène candidat» visant l'identification de

nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la susceptibilité au cancer du sein, nous

avons analysé les variants génomiques du gène ZBRK1, un co-répresseur impliqué dans la

répression de GADD45 induite par BRCAl. Le séquençage de la région codante de ZBRK1,

chez des individus atteints de cancer du sein provenant de 97 familles à risque élevé de

cancer du sein et de l'ovaire canadiennes françaises et 94 contrôles sains a mené à

l'identification de 18 variants génomiques. L'analyse des haplotypes par les programmes

PHASE, COCAPHASE et HaploStats, at mis en évidence trois haplotypes spécifiques

pouvant potentiellement influencer le risque de cancer du sein. Parmi ceux-ci deux sont

associés à un effet protecteur potentiel (p=0.01135 et p=0.00268) alors qu'un autre

haplotype est surreprésenté dans le groupe des cas (p=0.00143). Des analyses plus poussées

de ces haplotypes indiquent qu'une composante importante de la différence observée entre

les deux groupes émerge des 5 premiers variants (parmi les 12 utilisés pour la

détermination des haplotypes). Cette étude a aussi permis de déterminer un ensemble de

SNPs marqueurs pouvant être utilisés lors d'analyses dans des études d'association de

grande envergure. Des études additionnelles, dans de larges cohortes et d'autres

populations, seront cependant nécessaires afin de mieux évaluer si des variants de séquence

et des haplotypes communs et/ou rares de ZBRK1 peuvent être associés à un risque

modéré/intermédiaire de cancer du sein.

73

Abstract Our current understanding of breast cancer susceptibility involves mutations in the two

major genes BRCAl and BRCA2, found in about 25% of high-risk families, as well as few

other low penetrance genes such as ATM and CHEK2. Approximately two-thirds of the

multiple cases families remain to be explained by mutations in still unknown genes. In a

candidate gene approach to identify new genes potentially involved in breast cancer

susceptibility, we analyzed genomic variants in the ZBRK1 gene, a co-repressor implicated

in BRCAl-mediated repression of GADD45. Direct sequencing of ZBRK1 entire coding

region in affected breast cancer individuals from 97 high-risk French Canadian

breast/ovarian cancer families and 94 healthy controls led to the identification of 18

genomic variants. Haplotype analyses, using PHASE, COCAPHASE and HaploStats

programs, put in evidence three specific haplotypes which could potentially modulate

breast cancer risk, and among which two that are associated with a potential protective

effect (p=0.01135 and p=0.00268), while another haplotype is over-represented in the case

group (p=0.00143). Further analyses of these haplotypes indicated that a strong component

of the observed difference between both groups emerge from the first 5 variants (out of 12

used for haplotype determination). The present study also permitted to determine a set of

tagging SNPs that could be useful for subsequent analyses in large scale association studies.

Additional studies in large cohorts and other populations will however be needed to further

evaluate if common and/or rare ZBRK1 sequence variants and haplotypes could be

associated with a modest/intermediate breast cancer risk.

74

Introduction

In western countries, breast cancer is a major cause of malignancies in women with

an estimated incidence of approximately one in 9 by age 70 years. However, it has been

hypothesized that as much as 50% of all breast cancer cases fall within 12% of the

population with an increased risk of breast cancer, based on a polygenic model assuming a

multiplicative effect on risk.1'2 As such, determining the genetics underlying causes of

familial and sporadic cases can have an important impact on breast cancer population

screening and prevention.

There are currently few known susceptibility genes to breast cancer. Highly

penetrant mutations in BRCAl and BRCA2 are found in high-risk breast cancer families

which represent approximately 10% of all breast cancer cases. Among families with a clear

inherited pattern of breast cancer, only 15-20% are found to harbour BRCAl or BRCA2

mutations. Alterations in few other genes, such as PTEN3, TP53, ATM*, PALB25'7 and

CHEK2, account for less than 5% of cases in some populations, including the French-

Canadian population (for a review see Ref. 8). Consequently, there are too many families

with clear inheritance of breast cancer presenting no mutations in the known susceptibility

genes to be an association of random events, thus fuelling searches to find other breast

cancer susceptibility genes. Evaluation of the number of such genes is difficult as a limited

number of genes with moderate penetrance is as plausible as a large number of genes each

resulting in a small risk increase.9 However, finding new susceptibility genes with moderate

impact in a case-control study design requires a large sample size, which can be greatly

reduced when cases are drawn from high-risk families.1 '

Since its identification12, BRCAl has been shown to be involved in many cellular

processes such as double strand break repair, chromatin structure, transcription-coupled

DNA repair and regulation of transcription.8 Among these processes, the role of BRCAl in

transcription is poorly understood, but it has been reported to regulate the transcription of

p 2 1 n and GADD4514, which are both involved in cell cycle arrest, and ANGPT1 involved

75

in angiogenesis.15 GADD45 in particular has been shown to be involved in the activation of

the G2/M checkpoint following DNA damage16 and maintenance of genome stability.17

ZBRK1 (Zinc finger and BRCAl-interacting protein with a KRAB domain I), also

known as ZNF350, is a co-repressor of GADD45 expression.18 ZBRK1 interacts with amino

acids 341 to 748 of BRCAl and binds to the GGGxxxCAGxxxTTT consensus sequence

within GADD45 third intron. Over-expression of BRCAl has been shown to lead to the

release of ZBRK1 -mediated repression18 but is not required for DNA damage induced

degradation of ZBRK1 through the ubiquitin-proteasome pathway.19 The integrity of the

ZBRK1 region interacting with BRCAl, as well as the KRAB domain (constituted of a box

A and a box B), are essential to the repression of GADD45.

Previous studies of examining the implication of ZBRK1 in breast cancer did not

provide strong evidence for ZBRK1 alterations in inherited breast cancer susceptibility.20'21

On the other hand, analysis of breast carcinomas has shown frequent alterations of ZBRK1

expression without correlation with BRCAl mRNA expression or tumor phenotype22, and a

recent study performed on two population-based cohorts from USA and Poland found a

weak significant association of ZBRK1 p.Ser472Pro rare variant with breast cancer risk.23

Based on the key role played by ZBRK1 and its implication in BRCAl-mediated

repression of GADD45, it represents a very attractive candidate gene that could potentially

play a role in breast cancer. Consequently, we analyzed the ZBRK1 gene for sequence

alterations among a series of 97 breast cancer cases selected from high-risk French-

Canadian breast/ovarian cancer families and a series of healthy controls from the same

population. No germline mutation leading to a premature termination of the protein or

sequence change affecting the normal splicing of the gene was identified. However, we did

observe 18 sequence variants, and the estimated haplotypes obtained displayed a significant

difference between the case and control groups. In addition, five variants seem to be

responsible for this difference, which are all located in the most 5' coding part of the gene.

Haplotypes analysis also permitted to establish tagging SNPs (tSNPs), which would be

most useful to genotype for subsequent analyses in larger cohorts to further ascertain

ZBRK1 variants and haplotypes impact on breast cancer susceptibility.

76

Materials and Methods

Ascertainment of families

Recruitment of high-risk French Canadian breast/ovarian families (i.e. families in which

multiple cases of breast/ovarian cancer are present in close relatives -3 cases in 1st or 4

cases in 2nd degree relatives- or with strong evidence of a familial component) was part of

the major interdisciplinary research program INHERIT BRCAs further explained

elsewhere, in which a major component was to identify and characterize BRCA1/2

mutations.24'25 A subset of 97 high-risk French Canadian breast/ovarian cancer families was

drawn from the initial study based on the absence of detectable BRCA1/2 mutation and

constituted the cohort used for another study specifically aiming at the identification of

other susceptibility loci/genes to breast cancer. This latter study obtained ethics approvals

from all participating institution, and each participant, knowing their inconclusive BRC A1/2

test results signed a specific informed consent, and had to be at least 18 years old and

mentally capable. One individual affected with breast cancer per family was selected for

analysis, with a selection preference for the youngest subject available in each family. The

ascertainment criteria of recruitment and BRC A1/2 status analysis have been described

previously.25'26 In all instances, diagnosis of breast cancer was confirmed by pathology

reports. The mean age at diagnosis of these 97 breast cancer subjects was 48 years old (30-

74 years).

To further strengthen the 5./?C47/2-negative status of these families, BRCA1/2 were

analyzed by southern techniques (36 of the 97 individuals) as well as by Multiplex

Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA, MRC Holland, Amsterdam, The

Netherlands) (84 of the 97 subjects) to rule out large genomic rearrangements.27 For the

remaining subjects, another family member was analyzed by MLPA, with the exception of

two families on which analyses were not performed.

77

DNA extraction

For each breast cancer participant, total RNA and genomic DNA was extracted from

immortalized cell lines established from blood lymphocytes, and infected with the Epstein-

Barr virus, using CTAB or the Tri-Reagent method according to the manufacturer's

instructions (Molecular Research Center inc, Cincinnati, USA). Genomic DNA was also

obtained from 94 unrelated healthy controls of French Canadian origin (mean age of 46

years; 22 to 68 years). Genomic DNA extraction and description of the control cohort have

been described previously.26 Genomic DNA from three cynomolgus monkeys (one male

and two females) was also extracted from blood samples using Tri-Reagent.

ZBRK1 sequencing and protein alignment

PCR amplification of ZBRK1 in breast cancer individuals was carried out using primers

designed to amplify the entire coding region of the gene, composed of 5 exons, as well as

intron-exon boundaries. Amplification was performed on breast cancer cases and healthy

controls using primers located in intronic sequences, as listed in Supplemental Table I. PCR

amplification with 75ng of genomic DNA from breast cancer subjects and 5 ng of DNA for

the controls series (due to limited material available) has been performed using standard

procedures. Cynomolgus DNA was amplified using primers designed for amplification of

human genomic DNA encompassing ZBRK1.

ZBRK1 direct sequencing was carried out on an ABI3730XL automated sequencer using

version 3.1 of the Big Dye fluorescent method according to the manufacturer's instructions

(Applied Biosystems, Foster City, USA). Sequences were analyzed using Pregap4 and

Gap4 implemented in the Staden package (http^/staden.sourceforge.net/X Accession

numbers of the sequences used in this paper are as follow: NM021632.3 (human ZBRK1

cDNA sequence), NP067645.3 (human ZBRK1 protein sequence), XP512864.1

(chimpanzee ZBRK1 protein sequence), XP541453.1 (canine ZBRK1 protein sequence)

and XP593338.1 (bovine ZBRK1 protein sequence). Protein alignment was made using

version 1.82 of ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).29

http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).29

78

Linkage disequilibrium, haplotype estimations and tSNPs selection

Linkage disequilibrium (LD) measurements were performed with all 18 SNPs identified in

our breast cancer cases using the LDPlotter program

(http://innateimmunity.net/IIPAG2/index_htmn. Lewontin's |D'| and r2 (for review see 30)

was used to calculate linkage disequilibrium between SNPs pairs. Splice site prediction

scores were evaluated using MaxEntScan

(http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan scoreseq.htmQ31, Splice Site

Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)32. Splice Site Finder

(http://www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html)33 and GeneSplicer

(http://www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html')34 programs with default parameters.

Haplotype estimations were performed using the PHASE 2.1.1 software

(http://www.stat.washington.edu/stephens/software.html)35 using a Bayesian approach. The

program was initially run 5 times with 1000 permutations for both the cases and controls

combined. The p-value for case-control comparison was further reduced by running the

program with 100 000 permutations in order to verify the accuracy of haplotype

estimations. A subset of 4 haplotypes (HI, H13, H15 and H20) were also confirmed by

amplification of the cDNA sequence covering the SNPs region followed by subcloning in a

pCR®II vector using a TA Cloning® Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Individual

clones were subsequently sequenced to resolve haplotypes.

Determination of the minimum set of tSNPs was performed on the control group, using

SNPtagger (http://www.well.ox.ac.uk/~xiayi/haplotypeA.36 An additional haplotype

estimation was then performed with PHASE using the tSNPs identified by SNPtagger

(100 000 case-control permutations) to further ascertain if a significant variation in

frequency of the tagged haplotypes was still present between both groups.

http://innateimmunity.net/IIPAG2/index_htmn

http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan

http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)32

http://www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html)33

http://www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html')34

http://www.stat.washington.edu/stephens/software.html)35

http://www.well.ox.ac.uk/~xiayi/haplotypeA.36

79

Statistical analyses

Three programs were used to estimate haplotype frequencies between case and control

subjects: PHASE, COCAPHASE and HaploStats. These programs implement two different

algorithms to calculate haplotype frequencies: a Bayesian method for PHASE, and

Expectation Maximized (EM) algorithm for COCAPHASE37 and HaploStats.38 Regarding

calculated test for significant differences in haplotype frequencies in case and control

groups, the PHASE program uses a permutation-based likelihood ratio test, COCAPHASE

uses standard unconditional logistic regression and the log-linear modeling of Mander, and

HaploStats is based on score statistics. Finally, R software was used to calculate Fisher's

exact test, and odds ratio with 95% confidence interval were evaluated between each

specific haplotype and the most frequent haplotype.

80

Results

Screening of the ZBRK1 gene. Direct sequencing oïZBRKl genomic and complementary

DNA of 97 j5Z?Cj4//2-negative breast cancer subjects from high-risk French Canadian

breast/ovarian cancer families and 94 healthy controls led to the identification of 18

variants, among which 11 are located in the coding region while two are situated in the 3'-

untranslated region (3'UTR) (Figure 1). Among these, three are novel: SNPs 1 and 3 are

situated in intronic regions while SNP 18 is located in 3'UTR of the gene. As shown in

Table I, 9 out of 18 variants display a minor allele frequency (MAF) of less than 5% in the

cases series, the remaining SNPs having a MAF greater or equal to 0.05. Among the

identified genomic variants, only c.243+4A>G, c.370+101T>C and c.622C>T (SNPsl, 3

and 9) are found exclusively in breast cancer cases and are very rare, displaying a

frequency of 0.5%, 0.5% and 1% respectively. The c.622C>T variant, which causes a

Arg>Cys modification of amino acid 132, is observed in two breast cancer individuals. No

other affected family members were available from these two families. However, three

unaffected first and second degree relatives from one family were also analysed, and were

found not to be carriers of this variant (data not shown). None of the identified variants

show a significant deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (Pearson' chi-square), or a

clear significant association with breast cancer. Of the 14 variants identified in other

studies, they all display a similar MAF (Table I). Among the coding variants, SNPs2 and 4

fall within the KRAB domain (c.333T>C and c.425T>C), while 3 are located within the

zinc finger domain (c.936T>C, C.13470A and c.l383A>C; SNPslO, 11 and 12) and 6

(SNPsl 1 to 16) are present in the C-terminus region, reported to bind to BRCAl18'39

(Figure 1).

Determination of the putative impact of ZBRK1 variants. Analysis of intronic variants

using splice site prediction programs (MaxEntScan, Splice Site Prediction, Splice Site

81

Finder and GeneSplicer) indicated no evidence that any of the intronic SNPs identified in

our cohort of breast cancer cases could potentially disrupt or create consensus splice sites,

which would lead in aberrant splicing of ZBRK1 mRNA (data not shown). Among the

intronic variants identified, c.243+4A>G is the only intronic sequence variation located in a

proximal splice site region. Although this variant reduced the splicing site score in all four

prediction programs used, its value remains relatively high, and sequence analysis of

ZBRK1 mRNAs of the only carrier did not reveal any alternative spliced transcripts caused

by this variant (data not shown).

To further examine the coding genomic variants modifying an amino acid, the whole

ZBRK1 protein sequence was compared with its putative orthologs of other species.

Alignment of human ZBRK1 protein sequence shows a high degree of conservation with

Macaca fascicularis and Pan troglodytes (96% and 97%, respectively) as well as with Bos

taurus and Canis familiaris sequences (72% and 75%, respectively). Out of six silent

polymorphisms, five (p.Asp35Asp, p.Cys236Cys, p.Pro373Pro, p.Thr385Thr and

p.Ser476Ser) are located at positions well conserved among the species examined, while

the residue leucine corresponding to the c.425T>C (p.Leu66Pro) variant is not conserved in

higher species. Among the non-synonymous changes, two residues (Arg501 and Val524)

are conserved in all species studied, and are also located in the BRCAl-interacting region.

As for the other ZBRK1 sequence coding variants identified in our study, they occur among

non conserved residues of the protein.

Linkage disequilibrium structure determination. Data from all 191 individuals (97 breast

cancer cases and 94 controls) were used to determine linkage disequilibrium (LD) structure

oïZBRKl gene. D' calculations show, as expected upon a short distance, a high degree of

LD between all ZBRK1 variants (more than 9.6 kb apart on genomic sequence;

Supplemental Figure 1A). As expected, r2 coefficient calculated for ZBRK1 displays lower

values, as this measure is dependent on allelic frequency (Supplemental Figure 1A).

HapMap data (http://www.hapmap.org) were also used to determine LD blocks in the

vicinity of ZBRK1, and permitted to identify a region of 160 kb in strong LD. This block

extends approximately 110 kb upstream and 30 kb downstream of the ZBRK1 gene and

http://www.hapmap.org

82

encompasses the second half of ZNF613, as well as the complete coding region OÏZNF615,

ZNF614 and ZNF432 genes (Supplemental Figure IB). All these genes encode zinc finger

proteins, a motif known to regulate transcription of other genes, although their exact targets

on the genome are still unknown.

ZBRK1 haplotypes estimations. In order to assess the haplotype diversity, the PHASE

program was used, along with the frequency associated with each haplotype in the case and

control series, using coding variants (SNP2-4-5-9-10-11-12-13-14-15-16) and the

C.1900C/T (SNP 17) variant located in 3'UTR. Other variants were not included in the

analysis as intronic regions show little conservation between species and are less likely to

display biological relevance. As means of confirmation, HaploStats and COCAPHASE

programs have also been used, as these two programs use the EM algorithm to obtain

maximum likelihood estimates of haplotypes frequencies, instead of the Bayesian method

used by PHASE, and perform their analyses by pooling rare haplotypes together. Moreover,

HaploStats and COCAPHASE programs allow an analysis of individual p-values associated

with specific haplotypes, which is not a feature of the PHASE program. As shown in Table

II, a high predominance of haplotype HI is observed in both cases and controls. Given its

high frequency, we could expect that HI likely represents the ancestral haplotype.

However, sequencing of the ZBRK1 region in 3 cynomolgus monkeys (one male and two

females) could not confirm that HI is indeed the ancestral haplotype. According to PHASE

estimations, 67% of all chromosomes in the data set are estimated to carry haplotype HI.

Five haplotypes are observed only once in the combined data set (H4, H6, Hl l , H14 and

H18) while the five most frequent haplotypes (HI, H13, H15, H16 and H20) can explain

89% of the 382 alleles (data not shown). Among all estimated haplotypes, only two rare

haplotypes are found exclusively in breast cancer cases (H9 and H14), and 8 haplotypes are

unique to the control group. Among the 10 haplotypes present in both groups, only HI3

displays a large variation in frequency between both groups, being nearly eight times more

frequent in the breast cancer series.

According to PHASE, a significant difference between haplotypes estimated in both groups

was obtained. Indeed, twenty calculations were performed under the null hypothesis (HO:

83

No difference in haplotypes composition and frequency between the case and control

series), with 100 000 case-control permutations, and all p-values obtained were < 4.8X10"4.

To make sure that the significant p-values were not due to rare variants, we excluded

variants with MAF <5% and repeated the analysis (data not shown). The same level of

significance was achieved, as most of the observed differences between the two groups are

represented by three relatively frequent haplotypes (H8, H13 and H16). Moreover,

verification of PHASE accuracy in estimating haplotypes correctly was performed by

subcloning ZBRK1 cDNAs from a subset of 3 individuals estimated by PHASE to carry 4

different haplotypes (HI, H13, H15 and H20). A complete concordance was cobtained

between observed and estimated haplotypes for these individuals.

To further confirm haplotypes estimations and frequencies, comparison analysis between

both groups was then performed using Haplostat and COCAPHASE. Global estimation of

differences between the case and control groups is estimated to be 4.8X10"5 with

COCAPHASE, and 4.0X10"5 with the HaploStats program (data not shown).

Association of ZBRK1 haplotypes and breast cancer. As shown in Table III, association

analyses of haplotypes with breast cancer susceptibility revealed that, when considering

only haplotypes showing a frequency >2% with HaploStats, HI3 is over-represented in

breast cancer cases (OR=6.98, p=0.00143) while two other haplotypes are observed

exclusively in controls (H8; p=0.01135 and H16; p=0.00268), and thus could be associated

with a protective effect. Of these, two remain significant when accounting for multiple

testing (Table III). A similar degree of association is obtained when using calculations from

PHASE data. For comparison purposes, data from COCAPHASE have not been displayed

as this program uses a different calculation method. Nonetheless, this program also yielded

similar significant p-values (data not shown).

Determination of a sub-group of ZBRK1 SNPs with greatest impact on haplotype

significativity. Further analyses aiming at circumscribing the coding SNPs responsible for

84

the effect seen in Table III were performed using sliding windows of 3, 4 and 5 SNPs along

the coding region. It was possible to highlight that a strong component of the observed

difference between cases and controls is represented within the first 5 coding SNPs

(cSNPs) (Supplementary Table II), and that similar patterns of significant p-values are

observed with all three programs, namely PHASE (p=2X10'5), COCAPHASE

(p=1.34867X10~6) and HaploStats(p=2X10"5). As illustrated in this Table, combinations of

these first five cSNPs (SNPs2-4-5-9 and 10) display a higher significant p-value than

combinations which include variants located in the 3'-region of the mRNA (i.e. SNPsl 1,

12,13, 14,15, 16 and 17).

Determination of tSNPs and association with breast cancer. Thereafter, in order to

identify ZBRK1 tSNPs useful for well-powered studies using larger sample sets, PHASE

haplotypes have been used as input for the SNPtagger program, which generated tSNPs

used for further haplotype analyses. Only haplotypes estimated in the control group were

used to perform tSNP selection, as this group would be more representative of the general

population.

Using the SNPtagger program, 6 tSNPs have been identified, namely SNPs2, 4, 10, 11, 14

and 17. These tSNPs could correctly represent the 8 haplotypes showing a frequency higher

than 1.5% and recovered 91% of the haplotype diversity. However, if 4 tSNPs are used

(SNPs2, 4, 10 and 17), these could distinguish 6 haplotypes (with an estimated frequency of

> 2%), recovering 88% of the haplotype diversity. Using the identified tSNPs, further

analyses were performed to verify if a significant difference would still be observed

between both groups. Significant p-values were observed in all instances: PHASE (4

tSNPs: p=lX10"5; 6 tSNPs p=6X10"5), COCAPHASE (4 tSNPs: p=3.49521X10"8; 6 tSNPs

p=9.74407X10"7) and HaploStats (4 tSNPs: p<lX10"5; 6 tSNPs p<lX10"5). Analyses of

tSNPs derived from the combined data set (cases and controls combined) resulted in similar

p-values (data not shown).

85

Discussion

It is now well established that the residual familial risk of breast cancer, not caused

by BRCAl or BRCA2 genes, could be explained by a polygenic or high-risk genes

heterogeneity model.40 Thus, in order to increase the power of our study aiming at finding

genetic variants involved in breast cancer susceptibility, we selected individuals affected

with breast cancer from high-risk families (one individual per family), without mutations in

BRC A1/2. So far, several genes have been investigated based on their interaction with

BRCA1/2 or their involvement in DNA repair mechanisms. Since BRCA1/2 genes are

intimately linked to genomic stability, other genes involved in this pathway represent very

good candidates to be additional breast cancer susceptibility gene. ZBRK1 is involved in

BRCAl-mediated repression of GADD45 and certain BRCAl variants have been shown to 1 8

display deficient repressor activity on GADD45 expression. This gene thus became of

great interest as a potential breast cancer predisposition gene since the ZBRK1 -BRCAl

interaction may be important for BRCAl-mediated repression.

Direct sequencing of the ZBRK1 gene in 97 affected individuals from high-risk

breast/ovarian French-Canadian cancer families, as well as in 94 healthy controls, led to the

identification of 18 variants, among which 5 are missense changes that may alter the

protein activity. Only 3 variants (SNPsl, 3 and 9) are found exclusively in breast cancer

cases. Unfortunately, no additional family members were available to determine

segregation of these variants with breast cancer. Few studies examined genetic variations

and expression of the ZBRK1 gene and their potential association with breast cancer

susceptibility. Garcia et al.*] investigated the relation of GADD45, ZBRK1 and BRCAl

expression in colon carcinomas, and found a correlation between these mRNAs expression,

with ZBRK1 having a tendency to be under-expressed in these types of tumors. A recent

mutational analysis oîZBRKl in 21 BRCAl- and 5/îG42-negative probands, 58 early-onset

breast cancer cases and 30 reference individuals, detected 17 sequence variants20, of which

86

14 were also identified in the current study. Although one silent variation (C.1383A>C) and

one missense (C.1642T>C) variant were observed only in their breast cancer cases group,

no exhaustive statistical analyses have been performed in this latter study to examine a

putative association with breast cancer susceptibility.2 A recent analysis of ZBRK1

variations in two population-based cohorts from USA and Poland did identify a weak

significant association of the C.1642T>C variant with breast cancer risk (OR 1.24 ; 95% CI

1.05-1.48; p=0.01).23 Analysis of ZBRK1 gene variations identified in the current study did

not point out any specific polymorphisms susceptible to be associated on its own with

breast cancer susceptibility, which prompted us to examine haplotypes distribution among

our French-Canadian cases and controls series. Indeed, it is now well recognized that

haplotype analyses (group of SNPs) could have more significance than individual

polymorphisms of a gene to reveal an association with a given syndrome.42'43

The haplotype estimations presented here revealed that among those with a

frequency greater than 2%, three relatively frequent haplotypes were significantly

differentially represented in cases and controls, namely H8, H13 and H16. Preliminary

observations suggest that H8 and HI6 could confer a protective effect, both haplotypes

being observed exclusively in controls, while HI3 is over-represented in cases, and

therefore could be associated with an increased susceptibility to the disease. To date, only

one study was performed to investigate the involvement of ZBRK1 haplotypes with breast

cancer predisposition. Indeed, using the HaploStats program on a subgroup of SNPs

analysed in the present study, Garcia-Closas et al.231 detected a weak significant association

of 2 rare haplotypes in the USA population. However, this was not confirmed in their

Polish series and their reported global p-value was nonsignificant in both populations. In

agreement with this study, we also demonstrate a potential significant effect of ZBRK1 SNP

haplotypes on susceptibility to breast cancer. Indeed, one particular haplotype displays a

significant association with breast cancer, using two different programs (OR=6.80 (CI:

1.55-62.19) and 6.98 (CI: 1.59-63.84), using PHASE and HaploStats program,

respectively). According to Antoniou and Easto10, in a study with 100 cases from high-risk

families and 100 healthy controls, and given a rare allele frequency of 0.10, it could in

theory be possible to detect a relative risk of 2. Obviously, given the limited number of

individuals included in the present study, one has to be cautious when interpreting such a

87

result. Nonetheless, these preliminary results represent an interesting avenue for further

investigations. A direct comparison of our haplotype data with those of Garcia-Closas et

al. is somewhat difficult as our analysis involves a greater number of variants (including

the four used in their study), thus leading to a more complex set of haplotypes. However,

all five haplotypes found in their study are present in our 20 haplotypes, although these are

of course represented in more than one haplotype (Table II). In the sole other study

presenting ZBRK1 haplotype estimations20, no formal comparison was performed between

the case and control groups. Therefore, a direct comparison of the haplotypes obtained is

somewhat difficult as a different (but overlapping) set of SNPs is obtained compared with

the one presented here (Table II).

If we look at haplotypes H8, H13 and H16 more closely, we can see that haplotype

H8 carries two synonymous changes as well as an Arg>Ser non-synonymous change at

codon 501, which is a conserved position among species, and is situated in the region of

ZBRK1 interacting with BRCAl. H16 is composed of a synonymous variant (Asp35) and a

Leu>Pro change at codon 66, which is located in the KRAB domain at the end of box B.

Sequence alignments of human KRAB domains44 show that the consensus sequence

displays a proline at this position (data not shown), which is also observed in amino acid

sequences from Macaca and Pan species. This may indicate that a proline at this specific

position would be more effective, and thus could possibly explain the protective effect seen

for this haplotype. Moreover, the KRAB box B has been demonstrated to be accessory, but

its presence seems to strengthen repression.45 As for H13, this haplotype carries a

synonymous change (p.Asp35Asp) and a variant in the 3'UTR region (C.1900C>T). At first

glance, it is tempting to speculate that C.1900C>T would be the causative variant. However,

it is difficult to pinpoint which SNP in the haplotype would be responsible for this effect, as

no SNP taken on its own shows a significant effect. However, we can not rule out the

possible effect of the synonymous change for any of these 3 haplotypes, as it has been

shown that synonymous changes, and variants in the 3'UTR region, may have a functional

impact on the allele by affecting mRNA stability and gene expression.46'47 Nonetheless,

other mechanisms have been associated with regulation of expression, including tissue-

specific tRNA expression, mRNA secondary and tertiary structures, and mRNA trafficking.

As these processes are dependent upon mRNA sequence, we can not rule out a possible

88

effect of certain ZBRK1 alleles on the efficiency of such processes.48"51 In addition,

ZBRK1-mediated repression has been demonstrated to be also dependent upon its

tetramerisation52, and this interaction may be influenced by subtle changes in ZBRK1

expression and protein sequence. Alternatively, a given haplotype may be in linkage

disequilibrium with other nearby genes or with another yet unidentified variant in the

promoter region of ZBRK1. As mentioned before, ZBRK1 is part of a linkage

disequilibrium block of approximately 160 kb encompassing other zinc finger genes with

still unknown targets. This block was determined by analysis of HapMap CEPH trio data

(Caucasians). However, the French Canadian population is a founder population and as

such, LD blocks may extend over a longer distance than those estimated from the HapMap

project. Indeed, a recent analysis of the French Canadian founder mutation R1443X in

BRCAl demonstrated that the shared haplotype extends over approximately 9.3cM.53 The

region of chromosome 19 harbouring ZBRK1 is a cluster of several zinc finger proteins and

also carries the regulatory subunit A of the protein phosphatase 2 (isoform alpha;

PPP2R1A), which is approximately 200 kb apart from ZBRK1. Interestingly, a study from

Câlin et al.54 found PPP2R1A to be altered with low frequency in carcinomas of the breast,

lung as well as in a melanoma. Genotyping of other variants in adjacent genes may

therefore be necessary to better understand the extent of LD in the ZBRK1 region and

further evaluate the potential influence of these other genes on breast cancer susceptibility.

To further restrict which SNP or which portion of the gene seems to provide the

significant difference observed in our cases and controls, sliding windows of 3, 4 and 5

polymorphisms were used, and we were able to determine that the effect seemed to be

caused specifically by coding SNPs located in the 5' region of the ZBRK1 gene. The

highest p-values were observed for the same 4-5 SNPs, depending on the window used.

Interestingly, consistent significant p-values are obtained with every program used;

PHASE, COCAPHASE and HaplStats.

Recently, several groups have used tSNPs in their genetic association studies on

breast cancer susceptibility.55"57 Rutter et al.20 estimated that analysis of the c.333T>C and

c.425T>C variants (SNPs2 and 4 in the present study) would capture the haplotype

diversity in ZBRK1, since they observed only 3 haplotypes with a frequency greater than

89

2% (when using PHASE and HaploScope programs). However, our analysis using PHASE

predicted 6 haplotypes with a frequency greater than 2% in controls, which could be

captured by 4 tSNPs (SNP2, 4, 10 and 17), while SNPs2 and 10 on their own represent the

3 most common haplotypes found in our population (frequency >5%). Using 6 tSNPs (2-4-

10-11-14-17) we could correctly distinguish the 8 haplotypes showing a frequency greater

than 1.5%. When using these identified tSNPs, a significant difference is still seen between

breast cancer cases and controls, with either 4 or 6 tSNPs. Indeed, a significant p-value is

obtained with all programs examined, namely PHASE, COCAPHASE and HaploStats.

Therefore, by genotyping only four variants, a significant difference would be obtained in

the French-Canadian population.

In summary, we analyzed ZBRK1 gene alterations in 97 cases from French-Canadian high-

risk families (one individual per family) as well as 94 healthy controls from the same

population. Although no significant association of specific sequence variants with

hereditary breast cancer was observed, the results presented here suggest an association of

predicted haplotypes with breast cancer in cases or controls. An odds ratio for a disease-

associated haplotype was estimated to 6.80 (95% CI: 1.55-62.19; p=0.005331). These

haplotypes may imply coordinate effect of variants or linkage of specific haplotypes with

other unknown variants or nearby genes. As this region of chromosome 19 where ZBRK1

lies is rich in zinc-finger proteins, a motif known for its DNA-binding activity related with

transcriptional regulation, it is possible that it may have a repercussion on genes essential to

global cellular maintenance. However, analyses using larger cohorts will definitively be

needed to further ascertain the impact of ZBRK1 haplotypes on breast cancer susceptibility

in other populations.

90

Acknowledgements The authors would like to thank all individuals and families who participated in this study.

We thank Claire Brousseau, Dr. Sylvie Délos, Marie-Andrée Lajoie, Pascale Léger, Josée

Rhéaume, Carolle Samson, Martine Tranchant, Dr. Martine Dumont, Gilles Leblanc,

Hélène Malouin, Nathalie Bolduc, Andrée MacMillan and Tina Babineau of the Cancer

Genomics Laboratory for genetic counselling, sample management and mutation screening.

We also thank Anne-Marie Moisan and Lucie Larouche for Southern blot and MLPA

analyses, Melissa Ouellet for skillful technical help, and Dr. Damian Labuda and Claudia

Moreau at the Centre de Cancérologie Charles Bruneau of Ste-Justine Hospital for help

with control DNA samples. This work was supported by the Canadian Institutes of Health

Research (CIHR) and Institute of Cancer and Institute of Gender and Health for the

INHERIT BRCAs research program, the Fonds de la Recherche en Santé du Québec

(FRSQ)/Réseau de Médecine Génétique Appliquée (RMGA), the Canadian Breast Cancer

Research Alliance and the CURE Foundation. S.D. holds studentships from Fondation

René Bussières and Fondation Desjardins, and F.D. is recipient of a Research Career

Award in the Health Sciences from CIHR/R&D HRF.

91

Appendix 1

• Jacques Simard, Research Chair in Oncogenetics, Cancer Genomics Laboratory, Oncology

and Molecular Endocrinology Research Centre, Centre Hospitalier Universitaire de Québec

and Laval University, Québec.

• Bartha Maria Knoppers, Chaire de recherche en droit et médecine, Centre de recherche en

droit public, Université de Montréal, Montréal.

• Yann Joly, Centre de recherche en droit public, Université de Montréal, Montréal.

• Peter Bridge, Molecular Diagnostic Laboratory, Alberta Children's Hospital, Calgary.

92

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97

Table I. Coding and intronic sequence variations and genotype frequencies in familial breast cancer cases and controls. Table I

Coding and intronic sequence variations and genotype frequencies in familial breast cancer cases and controls Common

homozygote Hétérozygote

No. Rare

homozygote SNP SNP IDa

Location Seriesb MAFC Mo. (expected)d (expected)d No. (expected)d OR (95% CI)e Reported MAF 1 c.243+4A>G Intron 2 Cases 0.005

Controls 0.00 96(96.1) 94 (94.0)

1 (0.9) 0 (0.0)

0 (0.0) 0 (0.0)

- -

2 c.333T>C Exon 3 Cases 0.263 52 (52.7) 39 (37.6) 6 (6.7) 1.23(0.65-2.34) 0.17f, 0.27h,0.25\

0.26s

Controls 0.250 54 (52.9) 33 (35.2) 7(5.9) 0.27f, 0.26h, 0.26\ 0.38j

3 c.370+101T>C Intron 3 Cases 0.005 96 (96.1) 1 (0.9) 0 (0.0) Controls 0.000 94 (94.0) 0 (0.0) 0 (0.0) -

4 c.425T>C Exon 4 Cases 0.129 74 (73.6) 21(21.8) 2(1.6) 0.50(0.25-1.00) 0.17', 0.15s,

0.16h, 0.181, 0.02-

Controls 0.207 58(59.1) 33 (30.9) 3 (4.0) 0.18f,0.26h,0.18i, 0.00s

5 c.443T>C Exon 4 Cases 0.005 96 (96.1) 1 (0.9) 0 (0.0) 0.48 (0.01-9.39) 0.01J

0.00* Controls 0.011 92 (91.9) 2 (2.1) 0 (0.0) 0.01J

0.00* 6 c.466+18A>G Intron 4 Cases 0.268 51 (52.0) 40 (38.0) 6(7.0) 1.11(0.59-2.10) 0.14f

Controls 0.266 51 (50.6) 36 (36.7) 7 (6.7) 0.27f

7 c.466+46A>T Intron 4 Cases 0.129 74 (73.6) 21 (21.8) 2(1.6) 0.48 (0.24-0.95) 0.17f

Controls 0.213 57 (58.2) 34(31.5) 3 (4.3) 0.18f

8 c.466+62G>A Intron 4 Cases 0.263 52 (52.7) 39 (37.6) 6 (6.7) 1.17(0.62-2.22) O.H^ Controls 0.255 53 (52.2) 34(35.7) 7(6.1) 0.27f

9 C.6220T Exon 5 Cases 0.010 95 (95.1) 2(1.9) 0 (0.0) - , '„ '■ ' . v:,:,m"' WÈÊÊÈÊËÈËÈËÈÈËË mÊÊÈÊÊÊÊmBm Controls 0.000 94 (94.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

WÈÊÊÈÊËÈËÈËÈÈËË mÊÊÈÊÊÊÊmBm

10 c.936T>C Exon 5 Cases 0.119 76 (75.3) 19(20.3) 2(1.4) 0.51 (0.25-1.04) 0.14f, 0.12J

Controls 0.191 61 (61.5) 30(29.1) 3 (3.4) 0.17f,0.12j

11 C.13470A Exon 5 Cases 0.108 78 (77.2) 17(18.7) 2(1.1) 0.53(0.25-1.10) 0.10f,0.13h,0.16i,

0.02j

Controls 0.165 65 (65.5) 27 (25.9) 2(2.6) 0.15f,0.13h,0.16i, 0.02j

12 C.1383A>C Exon 5 Cases 0.041 89 (89.2) 8(7.6) 0(0.2) 1.60(0.44-6.45) 0.00f, 0.07-Controls 0.027 89 (89.0) 5(4.9) 0(0.1) 0.00f, 0.02-

13 C.1642T>C Exon 5

Cases 0.041 89 (89.2) 8(7.6) 0(0.2) 1.60 (0.44-6.45) 0.00f, 0.04g, 0.03h, 0.02', 0.08j

Controls 0.027 89 (89.0) 5 (4.9) 0(0.1) 0.00f, 0.04h, 0.02', 0*04j

14 C.16560T Exon 5 Cases 0.010 95(95.1) 2(1.9) 0 (0.0) 0.48 (0.04-3.41) 0.00f

Controls 0.021 90(90.1) 4(3.8) 0(0-1) 0.02f

15 c.l731A>T Exon 5 Cases 0.108 78 (77.2) 17(18.7) 2(1.1) 0.56(0.26-1.17) 0.10f,0.12g,0.11j

Controls 0.160 66 (66.3) 26 (25.3) \ * ' 0.15f,0.10> 16 c.l798G>A Exon 5

Cases 0.005 96 (96.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.97(0.01-76.81)

0.02f

Controls 0.005 93 (93.1) 1 (0.9) 0 (0.0) 0.00f

17 C.1900OT 3'UTR Cases 0.093 80 (79.8) 16(16.4) 1 (0.8) 2.47 (0.91-7.50) 0.02f, 0.07g

Controls 0.037 87 (87.2) 7(6.7) 0(0.1) 0.08f

18 c.2000C>T 3'UTR Cases 0.005 Controls 0.016

96 (96.0) 91 (91.0)

1 (1.0) 3 (3.0)

0 (0.0) 0 (0.0)

0.32 (0.01-4.04)

98

"According to the nomenclature of the Human Genome Variation Society b97 cases, 94 controls c Minor allele frequency d As expected under Hardy-Weinberg equilibrium eOdds ratios for comparison of hétérozygotes versus common homozygotes f42 non BRCA1/2 cases (USA), 30 controls (CEPH parents)16

g748 breast cancer cases (USA)17 h3368 unselected breast cancer cases and 2880 controls (USA)19 j1995 unselected breast cancer cases and 2296 controls (Poland)19 6̂1 breast cancer cases and 25 controls (Spain)18.

99

Table II. Estimated haplotype frequencies in cases and controls using PHASE. Table II Estimated haplotype frequencies in cases and controls using PHASE

Haplotype designation3

# S2-4-5-9-10-11-12-13-14-15-16-17 Estimated frequency

Haplotype repri other stuc

;sented in iesd

Mfb C C C C T C A T C A G C Noc Cases Control s

Garcia-Closas e ta l . 1 9

Rutter et a l . 1 6

HI H2 H3

T T T C T C A T C A G C T

257 6 3

0.705 0.005 0.010

0.637 0.024 0.005

Yes Yes Yes

Yes Yes Yes

HI H2 H3 — — &

C T

257 6 3

0.705 0.005 0.010

0.637 0.024 0.005

Yes Yes Yes

Yes Yes Yes

HI H2 H3 _ _ ~ A

257 6 3

0.705 0.005 0.010

0.637 0.024 0.005

Yes Yes Yes

Yes Yes Yes

H4 T - - - 1 - 0.004 Yes Yes H5 c - 2 - 0.012 Yes No H6 - - - - C - - - - T - - 1 - 0.004 Yes No H7 - - - - C A - - - - - - 2 - 0.011 No No H8 - - - - C A - - - T - - 6 - 0.033 No No H9 T - 2 0.010 - Yes Yes H10 - - c - 3 0.005 0.011 Yes Yes H l l - C - - C A - - - T - - 1 - 0.006 No No H12 H13 H14

C - - - - - - - - C — — — — — — — — — — T

T

3 18 1

0.006 0.082 0.005

0.011 0.011

Yes Yes Yes

No Yes Yes

H12 H13 H14

^ — — — — — — — — — — c _ _ _ _ _ a

T T

3 18 1

0.006 0.082 0.005

0.011 0.011

Yes Yes Yes

No Yes Yes

H12 H13 H14 i ^ — — — — — — — j ±

T T

3 18 1

0.006 0.082 0.005 ~

Yes Yes Yes

No Yes Yes

H15 C - - - - - C C - - 13 0.041 0.027 Yes Yes H16 c c - - - - - - - 10 - 0.055 Yes Yes H17 C C - - - - - - T - - - 5 0.010 0.016 Yes Yes H18 C C - - - A - - - T - - 1 - 0.005 Yes No H19 C C - - C - - - - - 5 0.010 0.016 Yes Yes H20 C C - - C A - - - T - - 42 0.109 0.110 Yes Yes

a S2-4-5-9-10-11-12-13-14-15-16-17 refers to SNP number as described in Table I. b Macaca fascicularis haplotype. c Represents the estimated total occurrence of the haplotype in the case-control data set.

Haplotypes represented in other studies when taking into consideration only SNPs used for haplotype estimations common to both studies (Desjardins vs Garcia-Closas: s2-4-l 1-13; Desjardins vs Rutter: s2-4-10-l 1-12-13-15-17).

100

Table III. Estimated haplotype numbers and associated breast cancer risks for cases and controls using PHASE and Haplostats.

Table III Estimated haplotype numbers and associated breast cancer risks for PHASE and Haplostats

cases and controls using

# H a p a Program Casesb Controls5 OR (95% CI) p-valuec Simulated p-valued

HI PHASE 137 117 1 (0.69-1.44) 1 Haplostats 137.7 129.9 1 (0.70-1.43) 0.15276 0.16709

H8 PHASE 0 6 0 (0.00-0.74) 0.010497 Haplostats 0 6 0 (0.00-0.76) 0.01135 0.00574

H13 PHASE 16 2 6.80(1.55-62.19) 0.005331 Haplostats 16.0 2 6.98(1.59-63.84) 0.00143 0.0014

H15 PHASE 7 5 1.20(0.32-4.91) 1 Haplostats 7 5 1.23(0.33-5.03) 0.55339 0.59705

H16 PHASE 0 10 0 (0.00-0.39) 0.000548 Haplostats 0 10 0 (0.00-0.40) 0.00268 5X10"4

H20 PHASE 21 20 0.90(0.44-1.84) 0.866208 Haplostats 20.9 20.5 0.88(0.43-1.78) 0.96603 0.96763

Haplotypes with a global frequency greater than 2% b Count of haplotypes estimated with certainty greater than 95% c p-value for case-control comparaison d p-value for empirical evaluation of significance by case-control permutations, calculated only with Haplostats (Significativity threshold after multiple testing correction: p= 0.0083)

101

Supplemental Table I. Oligonucleotide primers used for amplification and sequence analysis of the ZBRK1 gene. Supplemental Table I Oligonucleotide primers used for amplification and sequence analysis of the ZBRK1 gene

Exon Forward primer (5'-3')b Reverse primer (5'-3')b ienguf(bp) Temple?

1 GAAATGCCGTAAATGCGCTTG GGCCGTTGATCACTACAGACCC 402 60

2 GCCCACAGGTATAAAATCCGCT GGACACCATCCACCACATCAAC 776 62

3-4 GCCTGTAGAGTGGAAATGAGCAGA GGTCTCACACTGGGAGACAGATGA 775 62

5a GGAAAGTTGATCATGTGCTGGAGC TCACTGCACACAAAGGGCGT 805 62

TGAATGCCCTGAATGTGGCA ACTGCAACACTCCCAACACCA 1113 62

Exon 5 has been amplified in two PCR fragments b All primers have been used for sequencing

102

Supplemental Table II. Global p-value for case and control comparison using PHASE, Cocaphase and Haplostats programs. Supplemental Table II Global p-value for case-control comparison using PHASE, Cocaphase and Haplostats programs

Programs

Window S N p i E ) a of

PHASE"

p-value

Cocaphase

p-value

Haplos

p-value

tats Simulated p-valuec

3 2-4-5 0.02324 0.0116987 0.00596 0.00366 4-5-9 0.15319 0.06407 0.11498 0.129 5-9-10 0.16241 0.07431 0.14426 0.152 9-10-11 0.07655 0.06648 0.18821 0.194 10-11-12 0.22059 0.156 0.19487 0.171 11-12-13 0.35027 0.2152 0.23721 0.239 12-13-14 0.75091 0.4411 0.47508 0.552 13-14-15 0.37235 0.313 0.34642 0.335 14-15-16 0.44914 0.2692 0.30706 0.337 15-16-17 0.16961 0.1093 0.10723 0.092

4 2-4-5-9 0.01102 0.00793955 0.00958 0.01136 4-5-9-10 8X10"5 4.866X106 7X10"5 <1X105

5-9-10-11 0.21165 0.09914 0.19636 0.22 9-10-11-12 0.12303 0.1009 0.28265 0.304 10-11-12-13 0.18044 0.156 0.019487 0.163 11-12-13-14 0.26373 0.2688 0.29838 0.245 12-13-14-15 0.36303 0.313 0.34642 0.343 13-14-15-16 0.50818 0.3415 0.48347 0.505 14-15-16-17 0.24965 0.1336 0.14587 0.153

5 2-4-5-9-10 2X10"5 1.34867X10"6 2X105 <1X10'5

4-5-9-10-11 0.00042 6.87X10-5 0.00029 9X10"5

5-9-10-11-12 0.34413 0.1396 0.29662 0.305 9-10-11-12-13 0.13364 0.1009 0.28265 0.308 10-11-12-13-14 0.3303 0.1858 0.14888 0.132 11-12-13-14-15 0.40658 0.185 0.11182 0.089 12-13-14-15-16 0.67759 0.3415 0.48347 0.509 13-14-15-16-17 0.27917 0.2086 0.13274 0.125

According to Table I b Greatest p-value over c P-value for empirical

20 calculations (100 000 permutations) evaluation of significativity by case -control permutation

103

Figure legends

Figure 1

A. Proportional genomic structure of the ZBRK1 gene. 5' and 3'UTR regions are indicated

as dashed boxes. White flags, intronic variants. Gray flags, coding variants. B. Protein

structure of ZBRK1 illustrating domains involved in function/regulation of the protein.

Gray flags, synonymous variants. White flags, missense variants.

104

Figure 1. Proportional genomic structure of the ZBRK1 gene and protein structure of ZBRK1 illustrating domains involved in function/regulation of the protein.

5 s S

I

105

Supplemental Figure 1. Pairwise linkage disequilibrium (LD) measures for SNPs identified in ZBRK1 and LD measures according to HapMap for ZBRK1 chromosome region.

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

X oar ■ / v i ■■■ \\\m~

X %N u \%u R m vwi^il^ ■ni

MpSi inn m \ mom mm - y —

% \ v ■r VsS VsS ~\

%

- — j * M | * M M l_ I I O 0.10 0.20 0.30 0.40 0

B

V

Supplemental figure 1

A. Pairwise linkage disequilibrium (LD) measures of ID'I for SNPs identified in ZBRK1. SNPs are denoted according to Table I. B. LD measures (ID'I) according to Hapmap for ZBRK1 chromosome region, with arrows representing genes.

106

CHAPITRE II : Analysis ofGADD45A Sequence Variations in French Canadian Families with -High Risk of

Breast Cancer.

107

Analysis of GADD45A Sequence Variations in French Canadian Families with High

Risk of Breast Cancer

Sylvie Desjardins3, Geneviève Ouellette3, Yvan Labrie3, Jacques Simard3', INHERIT

BRCAs§, Francine Durocher3*

"Cancer Genomics Laboratory, Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre,

Centre Hospitalier Universitaire de Québec and Laval University, Québec, G1V 4G2,

Canada;

§Other members of INHERIT BRCAs involved in clinical aspects of the study are listed in

the Appendix.

* Corresponding author:

Dr Francine Durocher

Cancer Genomics Laboratory, Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre,

Centre Hospitalier Universitaire de Québec and Laval University

2705 Laurier Boulevard, T2-53

Québec City, Québec,

Canada, GI V 4G2

Tel: (418)-654-2296 Fax: (418)-654-2278

e.mail: [email protected]

J Hum Genet. 2008;53(6):490-8.

mailto:[email protected]

108

Résumé GADD45A est un gène conservé lors de l'évolution dont l'expression est régulée par deux

protéines suppresseurs de tumeurs majeures impliquées dans l'étiologie du cancer du sein,

p53 et BRCAl, et qui agit principalement dans le contrôle de la transition G2/M du cycle

cellulaire, l'apoptose et la réparation de l'ADN. Suite à un stress génotoxique, la protéine

p53 active la transcription de GADD45A, tandis qu'en l'absence de dommages à l'ADN,

BRCAl réprime l'expression de GADD45A par l'intermédiaire d'une interaction avec la

protéine à doigts de zinc ZNF350. De plus, BRCAl peut activer l'expression du gène

GADD45A par l'interaction de facteurs de transcription se liant au promoteur du gène. Sur

la base du réseau complexe d'interactions entre GADD45A, p53 et BRCAl, ainsi que

l'implication des mutations à la fois de BRCAl et TP53 dans la tumorigénèse mammaire,

nous avons entrepris la caractérisation de la séquence codante, les jonctions intron/exon et

les séquences de liaison de p53 et ZNF350 de ce gène candidat à la susceptibilité au cancer

du sein. Ces analyses ont été effectuées dans un échantillon de 96 femmes atteintes de

cancer du sein provenant de familles à risque élevé de cancer du sein d'origine canadienne

française, négatives pour des mutations BRCAl et BRCA2, et 95 contrôles sains de la

même population. Bien qu'aucun des 12 variants de séquence identifiés présente une

différence significative de fréquence entre les deux échantillons, le phasage des haplotypes

et les estimations de fréquences ont identifié un haplotype commun démontrant une

fréquence plus élevée dans le groupe contrôle. Puisque les variants présents sur cet

haplotype spécifique sont des variants non-codants dans l'intron 2 ou 3, ce résultat devra

être évalué de façon plus approfondie dans de plus grandes cohortes et d'autres populations.

À cet égard, notre étude a aussi identifié des SNPs marqueurs, fournissant des données

utiles pour d'autres études d'association de plus grande envergure.

109

Abstract GADD45A is an evolutionary conserved gene whose expression is regulated by two major

tumor suppressor proteins involved in breast cancer etiology, namely p53 and BRCAl, and

which acts primarily in the control of the G2/M cell cycle transition, apoptosis and DNA

repair. Following a genotoxic stress, the p53 protein activates GADD45A transcription,

while in absence of DNA damage, BRCAl represses GADD45A expression through an

interaction with the zinc finger protein ZNF350. Moreover, BRCAl can activate

GADD45A gene expression through interactions with transcription factors binding to the

gene promoter. On the basis of the intricate network of interactions between GADD45A,

p53 and BRCAl, and the fact that both BRCAl or TP53 mutations are involved in breast

cancer tumorigenesis, we undertook the characterization of the entire coding sequence,

intron/exon boundaries and p53- and ZNF350-binding sequences of this potential breast

cancer susceptibility candidate gene in a sample set of 96 women affected with breast

cancer from non-BRCAl and BRCA2 French Canadian families with a high risk of breast

cancer and 95 healthy controls from the same population. Although none of the 12

identified sequence variations show a significant difference in frequency between both

sample sets, haplotype phasing and frequency estimations identified a common haplotype

displaying a higher frequency among the control group. As the variants present on this

particular haplotype are non-coding variants in either intron 2 or 3, this finding will have to

be further investigated in larger cohorts and other populations. In this regard, our study also

identified tSNPs, providing useful data for other large-scale association studies.

Keywords: Breast cancer, GADD45A gene, sequence analysis, haplotype, tagging SNP

110

Introduction Breast cancer is a complex disease involving genetic and lifestyle components. Our current

understanding of breast cancer susceptibility is based upon a polygenic model in which

several alleles conferring variable risk act in concert. Under this model, it is hypothesized

that 88% of all breast cancer cases may be found in 50% of the population more at risk

(Pharoah et al. 2002). Thus, finding the underlying genetic components conferring such risk

may have a great impact on breast cancer prevention and treatment. However, our

knowledge of breast cancer susceptibility remains incomplete. Mutations and/or allelic loss

of tumor suppressor genes, such as BRCAl, BRCA2, TP53 as well as other genes, are

associated with an increased predisposition to breast cancer tumorigenesis (Antoniou and

Easton 2006). However, mutations in the two major predisposition genes BRCAl and

BRCA2 account for less than 25% of families with hereditary breast cancer (Antoniou and

Easton 2006), indicating that much of the underlying genetic factors involved in breast

cancer susceptibility remain to be uncovered.

GADD45A (Growth Arrest and DNA Damage-induced 45, Alpha) is a p53- and BRCA1-

regulated gene acting in the control of the G2/M cell cycle transition, apoptosis and DNA

repair (Wang et al. 1999, Harkin et al. 1999, Smith et al. 1996). Following a genotoxic

stress, the p53 protein binds - directly to a consensus sequence located in GADD45A third

intron and - indirectly, through its interaction with transcription factors, to the promoter

region, therefore activating GADD45A transcription (Zhan et al. 1998, Jin et al. 2001). In

absence of DNA damage, BRCAl represses GADD45A expression through an interaction

with the zinc finger protein ZNF350 (ZBRK1), this complex recognizing a DNA binding

site also located in GADD45A third intron (Zheng et al. 2000). Moreover, BRCAl can

activate GADD45A gene expression through interactions with transcription factors binding

to the gene promoter (Fan et al. 2002).

Given that GADD45A is a target of two major tumor suppressor proteins involved in breast

cancer, namely BRCAl and p53, and that specific haplotypes of the gene encoding BRCAl

co-repressor ZNF350 have also been recently associated with a modulation of breast cancer

risk in our cohort of non-BRCA 1/2 high-risk breast cancer families (Desjardins et al. 2008),

I l l

GADD45A therefore represents an attractive candidate gene with regard to breast cancer

susceptibility. Although no alterations of GADD45A have been found in previous studies

performed on a limited set of breast tumors, human cancer cell lines of various origins, and

familial breast carcinomas (Blaszyk et al. 1996, Campomenosi et al. 2000, Sensi et al.

2004), Gadd45a-I- cells and mice display genomic instability (Hollander et al. 2005,

Hollander et al. 1999), and the absence of Gadd45a has been associated with an

acceleration of Ras-driven mammary tumor formation in mice (Tront et al. 2006).

Therefore, we investigated the plausible implication of GADD45A in breast cancer

susceptibility by analyzing 96 individuals affected with breast cancer from our cohort of

high-risk non-BRCAl/2 breast and ovarian cancer families, along with 95 healthy controls

from the same origin. The entire GADD45A coding region, intron-exon boundaries as well

as the p53- and BRCAl/ZNF350-binding consensus sequences were examined.

112

Materials and methods Ascertainment of families and DNA extraction. All 96 non-BRCAl/2 individuals from

French Canadian families with a high risk of breast and ovarian cancer, along with 95

healthy controls included in this study provided a written informed consent. The research

project has also been reviewed by the ethics committee of each participating institution.

Details regarding selection criteria for breast cancer cases, experimental and clinical

procedures as well as the INHERIT BRCAs research program have been described

previously (Simard et al. 2007, Durocher et al. 2006, Desjardins et al. 2008). Control blood

DNA was either used directly or subjected to whole genome amplification using Illustra

GenomiPhi V2 DNA amplification kit (GE Healthcare, formerly Amersham Biosciences,

Piscataway, USA) according to the manufacturer's instructions.

PCR amplification, mutation analysis and variant characterization. The GADD45A

gene (NM001924.2) consists of 4 exons covering more than 3kb of genomic DNA. Direct

sequencing of genomic sequence was performed using sequencing primers listed in

Supplemental Table 1. Direct sequencing was performed using an ABI3730XL automated

sequencer (Applied Biosystems, Foster City, USA), according to manufacturer's

instructions. Staden preGap4 and Gap4 programs were used for sequence data analysis.

Deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) and allelic differences between both

series were measured using a X2 test with 1 degree of freedom. The effect of a given variant

on splice site consensus strength was evaluated with the Splice Site Prediction Program

using Neural Networks (SSPNN) (Reese et al. 1997), with default parameters. The putative

impact of the exonic variant on exonic splicing enhancers was also assessed using ESE

Finder (Cartegni et al. 2003, Smith et al. 2006).

LD analysis, haplotype estimation and tagging SNP selection (tSNP). The LDA

program (Ding et al. 2003) was used to calculate pairwise linkage disequilibrium (LD)

defined by Lewontin's |D' | and r2 measures on cases and controls combined (Lewontin

1964, Devlin and Risch 1995). The PHASE 2.1.1 software (Stephens et al. 2001) was used

with default parameters to estimate the total set of haplotypes present among the case and

control datasets and to evaluate the global test of significance associated with a case-control

113

comparison. Evaluation of a positive association of a specific haplotype displaying a

frequency >5% with breast cancer was further analyzed using the WHAP program (Purcell

et al. 2007), implementing a regression-based association test. The determination of

haplotype blocks and tagging SNPs (tSNPs) for each LD block was performed with

genotyping data from both sample sets combined using the Haploview software (Barrett et

al. 2005).

Electronic links. UCSC Genome Bioinformatics: http://genome.ucsc.edu/; NCBI dbSNP:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/; SSPNN: http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html;

ESE Finder: http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi; PHASE: www.stat.

washington.edu/stephens/software; WHAP: http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/whap/;

Haploview: http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview; HapMap: www.hapmap.org;

http://genome.ucsc.edu/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html

http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi

http://www.stat

http://washington.edu/stephens/software

http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/whap/

http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview

http://www.hapmap.org

114

Results Analysis of GADD45A sequence variations. Although no truncating mutation was found

in the GADD45A coding region of our French Canadian breast cancer cases, we identified

12 variants in GADD45A exonic and flanking intronic sequences, including two novel

sequence variations (C.147-103G/C and C.385-174C/T) not reported in the NCBI single

nucleotide polymorphism database (dbSNP Build 128) (Table 1). Among these sequence

variations, one is a coding silent variant (c.492A/G, p.E164E), while the 9 remaining

sequence changes are intronic nucleotide substitutions. No deviation from HWE was

observed for any of the nucleotide changes identified, with the exception of one intronic

variation (c.384+116T/C), displaying borderline significance (p= 0.045) due to an excess of

rare homozygotes among cases (Table 1). When considering all nucleotide variations, 7 are

common variants with minor allele frequency (MAF) higher than 5%, while 5 are

considered as rare sequence variations since they display a MAF below 5%. Among the

rare variants, two (c.492A/G and C.498+27C/T) are observed simultaneously within the

same breast cancer and control individuals, suggesting that both individuals carry a specific

allele. The allele frequency of variants observed in the breast cancer series were also

genotyped in healthy French Canadian controls, as denoted in Table 1. No significant

difference in MAF was observed. In addition, all variants identified also display similar

frequencies to those reported in dbSNP database including the CEU population.

As consensus binding sites located in GADD45A third intron are important regulatory

sequences, the relevant genomic regions were also analyzed by direct sequencing. No

sequence alteration was found directly within the consensus p53-binding region located in

the 5' end of the intron, the closest variation being situated 20 nucleotides downstream

(C.384+168T/C, Table 1). Likewise, amplification of BRCAl/ZNF350-binding region near

the beginning of exon 4, in the 3' part of the intron, did not lead to the identification of any

sequence alteration directly within the consensus sequence. However, a rare variant (c.385-

205A/G) located 2 nucleotides apart was identified in only one control and one breast

cancer case, but no genomic DNA from other affected family members was available for

testing. Another rare nucleotide change, present within the same amplicon (c.385-174C/T)

was also identified in only one breast cancer case and one control individual, while variant

115

C.385-137T/C (rs3171012) situated 137 nucleotides upstream of the fourth exon of

GADD45A is present at a MAF which is similar for both series, and within the range of

frequencies reported (Table 1).

In silico analysis of the effect of variants on splicing. The possible effect of all intronic

variants on splicing consensus sequences was also assessed using in silico analysis with the

SSPNN program. None of the genetic variations observed displayed a significant change in

the splicing score (data not shown), including the intronic variant most likely to have a

potential effect (C.45-23C/T), given its proximal location to a known exon boundary. The

strongest effects on the splicing score change were observed for the C.384+93A/G

(rs3783468) and the C.385-174C/T variants. The C.384+93A/G variant could affect a

pseudo donor site located 86 nucleotides downstream of the exon 3 3' boundary by

decreasing the splicing score from 0.60 to 0.41, while C.385-174C/T could create a weak

pseudo acceptor site located 189 nucleotides upstream of exon 4 (splicing score of 0.42). In

addition this variant (c.385-174C/T) could also strengthen another pseudo acceptor site

situated 164 nucleotides before exon 4 by increasing the splicing score from 0.68 to 0.76,

which would be as strong as the splice site currently used, although no evidence indicates

that this pseudo donor site is utilized by the splicing machinery. The putative impact of the

C.492A/G exonic variant was also assessed using the ESE Finder program, which examines

sequences for exonic splicing enhancer motifs. Although the C.492A/G variant slightly

modified the putative ESE motifs identified, all changes were very close to the default

thresholds and thus would be expected to act on relatively weak motifs, which would most

likely not be used by the splicing machinery (data not shown).

Evaluation of GADD45A intragenic linkage disequilibrium. LD calculations for each

SNP pair was performed in both series combined using D' and r2 measures, and are

represented in Figure 1. Perfect LD (|D'|=1) is observed between the 2 most distant

intragenic variants (SNP1: C.45-23C/T and SNP12: C.498+27C/T), which indicates that LD

at the GADD45A locus does not decline significantly with distance. This is not surprising

given that the GADD45A gene covers less than 4 kb of genomic sequence. Indeed, the

lowest pairwise LD value involves C.147-53G/T (SNP3) with C.384+116T/C (SNP5)

(D'=0.158). As expected, r2 coefficients calculated for GADD45A genomic region display

116

lower values, as this measure is sensitive to variation in allelic frequency, which is well

represented by the large spectrum of r2 values ranging from 0.0001 to 1.0. A high r2

coefficient is observed between C.384+118C/T (SNP6) and C.384+168T/C (SNP7), which

displays high and similar MAF, while the majority of lowest r2 values are observed for the

three SNPs displaying a MAF below 1% (c.l47-103G/C, C.492A/G and C.498+27C/T). As

described above, both C.492A/G and C.498+27C/T are rare, and are always observed within

the same individuals, hence this pair displays perfect LD (r2 coefficient of 1.0).

Haplotype analysis. Analysis of GADD45A haplotypes with the PHASE program, using

the 12 sequence variations genotyped in both series, led to 18 estimated haplotypes (Table

2). Among these, 5 haplotypes (PHI, 4, 7, 9, and 15) display a frequency >5%, which

represent 95.5% of all haplotypes estimated in both sample sets combined, while the

remaining haplotypes display frequencies <1%. Estimated p-value for case-control

permutation did not indicate any significant difference in the global haplotype composition

and frequency distribution between both groups (p=0.94). Among the common haplotypes,

only the haplotype PH9 shows a notable difference in frequency, this haplotype being more

represented among the controls. To further ascertain a possible association of this specific

haplotype with breast cancer, a second haplotype estimation program, WHAP, was used,

allowing for regression-based haplotype association testing. Estimation of haplotypes

within the same datasets yielded the same 5 common haplotypes, displaying remarkably

similar estimated frequencies as those obtained with the PHASE program (Table 2).

Although the global test for association was not significant (p=0.16), this haplotype-

specific testing indicated a weak but significant association of haplotype WH2 with breast

cancer (p=0.032), with an over representation of this specific haplotype among the controls.

Using a sliding window, we were able to circumscribe the specificity of this haplotype to

the first 6 genetic variants without loosing the significant association (p=0.0158, data not

shown), with the strongest effect observed when considering the first 9 variants (p=0.0155).

Tagging SNPs determination. In order to reduce genotyping costs and efforts in future

association studies without loss of power, the selection of a small fraction of SNPs,

identified as tSNP, which likely represent with a good reliability the French Canadian

population and the underlying variation at the GADD45A locus, represents an avenue of

117

choice. Indeed the selection of tSNPs that would be both frequent (MAF >0.05) and in

strong LD with the other variants will allow to capture the common alleles of GADD45A.

Thus, a causal variant may not be genotyped but will still be represented by the set of

tSNPs. Therefore genotyping data of the 12 variants from both series have been used for

final haplotype block as well as tSNP identification. Based on an algorithm of solid block

of LD, only one region of strong LD among the French Canadians was identified using the

Haploview software (expectation maximization algorithm) (Figure 2). This LD block

encompasses the whole exonic region given that SNPs 1 and 12 are comprised within the

same LD block. Thereafter, considering exclusively haplotypes having a frequency >5%, 4

tSNPs have been identified within this LD block, namely variants c.384+93A/G,

C.384+116T/C, C.384+118C/T and C.385-137T/C (rs3783468, rs3783469, rs681673 and

rs3171012). Given that only 3 genomic variants were available from HapMap data

(rs3783468, rs681673 and rs532446), and that they are all located in intron 3, it was not

relevant to perform similar analyses using CEPH/CEU sample data. To further test the

usefulness of our selected tSNPs in capturing haplotype diversity, a second haplotype

analysis was performed, using only the tSNPs selected here. These 4 tSNPs still allowed to

distinguish the five common haplotypes present in our dataset, demonstrating the efficacy

of the tSNPs identified here to accurately pinpoint all common haplotypes found in our

population. However, when using only the 3 tSNPs present in HapMap database, just 3

haplotypes could be determined delineating the importance of the added tSNPs from the

present study.

118

Discussion In search of additional breast cancer susceptibility genes, we undertook the analysis of the

GADD45A gene in our cohort of high-risk non-BRCAl/2 breast cancer families and healthy

controls based on the close involvement of GADD45A with the products of the known

predisposition genes TP53 and BRCAl. All individuals were drawn from the French

Canadian founder population, thus theoretically decreasing the underlying genetic

heterogeneity. In addition, breast cancer cases were purposely selected from high-risk

families (one per family), which has been demonstrated to increase the statistical power

(Antoniou and Easton 2003).

Although no truncating mutations were found, a total of 12 sequence variations were

identified in our datasets, including two variations not previously reported. No nucleotide

change on its own seems to be significantly associated with breast cancer risk, including

C.384+118C/T and C.384+168T/C, which are both near, but not directly within, intronic

regions of strong conservation observed in GADD45A third intron (from UCSC

conservation data, data not shown). In spite of this, we can assume they have no functional

significance given that these variants display similar frequencies in both sample sets. The

only non-coding variation present in a region of strong conservation is the rare

C.498+27C/T nucleotide change located in the 3'UTR region, which displays similar

frequencies in both groups.

Further LD analyses of the genetic variants identified highlighted relatively strong LD

between all GADD45A sequence variations. Among these, the variants c.385-205A/G,

C.492A/G and C.498+27C/T are in complete LD (for both |D'| and r2 measures), variants

C.492A/G and C.498+27C/T being observed in the same case and control individuals,

therefore suggesting that these variations are present on the same allele. As for c.385-

205A/G, we can expect this variant to be present on the other allele. Indeed, although it is

present on the same control individual as C.492A/G and C.498+27C/T, it is not present on

the breast cancer sample bearing the other two variants. HapMap data within this genomic

region display a block of strong LD encompassing GADD45A and nearly the entire

adjacent GNG12 gene (G-protein gamma 12 subunit, data not shown), which is

119

approximately 14Kb apart in the opposite direction, and is implicated in cellular signal

transduction. On its 5' end, GADD45A nearest neighbor is the SERBP1 gene involved in

the binding of mRNA 3'ends. However, the SERBP1 gene being located more than 260Kb

apart, it would not be expected to share LD with GADD45A according to HapMap data,

although we cannot exclude the possibility of a greater extent of LD in a founder

population such as the French Canadian population (Vézina et al, 2005, Laberge et al.

2005).

Given that the association of a gene with disease can be specific to certain alleles, the

haplotype diversity of GADD45A was first estimated with the use of the PHASE software.

PHASE estimated that an ensemble of 18 haplotypes solves all case and control genotypes

observed, but no significant differences in haplotypes structure and frequency were

estimated between both series. However, a closer inspection of the attributed haplotypes

among both groups highlighted a difference in frequency of the common haplotype PH9.

Therefore, to further refine our haplotype analysis, we used the WHAP program which

enables an estimation of a possible haplotype-specific association with breast cancer risk,

and which confirmed that WH2 (which is identical to PH9) was indeed over-represented

among the control group. An analysis of this same haplotype using only a subset of variants

indicated that a strong component of this specific difference is dependent on the 5' end of

the GADD45A gene.

Although none of the identified variant of GADD45A is clearly causative, we cannot rule

out the possible effect of yet unidentified variants in other regulatory portions of the gene

other than those analyzed here. Indeed, GADD45A is subject to a complex multi-levels

regulation in response to various extracellular signals, and the association of transcriptional

inductors and repressors such as p53 and ZNF350/BRCA1 with specific regions of its

genomic sequence tightly regulates its expression. However, analysis of the consensus

sequences located in intron 3 in both sample sets did not lead to the identification of any

genomic variants potentially disrupting these motifs.

Nonetheless, GADD45A is also regulated through post-transcriptional events, mainly

changes in its mRNA stability through the binding of stabilization (HuR, nucleolin) and

destabilization (AUF1) proteins on the 3'UTR distal sequence. In addition, GADD45A

120

expression has been recently shown to be regulated through a cap-independent and 1RES

(internal ribosome entry site)-dependent mechanism in response to cellular stress signals

such as arsenic-induced cytotoxic and genotoxic damage (Chang et al. 2007). This

expression is dependent on an 1RES element located in the 5'UTR region proximal to the

start codon. Since mutations of 1RES elements or impairment of binding between trans

acting factors and 1RES elements have been associated with cancer (Chappell et al. 2000),

we carefully screened both sample sets for deleterious mutations that could potentially

affect the expression through the 1RES element of GADD45A. No sequence variant was

identified within the GADD45A 1RES sequence. However, it has to be stated that the

possibility remains that changes in mRNA stability could be eventually associated with

breast cancer risk.

Although GADD45A is part of a cellular pathway that includes several genes demonstrated

to be involved in breast tumorigenesis (ATM, TP53, BRCAl), it has not been subjected to

an extensive mutation search. Blaszyk et al. (1996) analyzed a series of sporadic breast

cancer tumors (with and without p53 mutations) for alterations in GADD45A p53-binding

site (n=53 tumors) and coding sequence (n=26 tumors), and only identified one

polymorphism in intron 3. To our knowledge, the only other study of GADD45A alterations

in familial breast cancer was performed on tumors from individuals showing a high

incidence of early-onset breast cancer (n=34 families), male breast cancer (n=2 families) or

breast and ovarian cancer (n=7 families) the majority of which were not previously

screened for the presence of a BRCAl or BRCA2 mutation (Sensi et al. 2004). In

agreement to what we found in non-BRCAl/BRCA2 high-risk breast cancer families, they

did not identify any alterations of the coding sequence, the exon/intron boundaries as well

as the p5 3-binding domain.

Therefore, although GADD45A represents a very attractive breast cancer susceptibility

candidate gene, our analysis and the current knowledge of GADD45A alterations in breast

cancer individuals, cell lines and tumors do not support a strong involvement of this gene

with breast cancer risk. Nonetheless, additional investigations will be definitely needed to

further ascertain the involvement of variations within the regulatory region of GADD45A

with regard to breast cancer. However, given the limited information on sequence variants

121

data available in HapMap database, this study provides the identification of tSNPs, which

will be useful for further testing the association of GADD45A gene in larger cohorts, or

with another syndrome or disease.

122

Acknowledgements The authors are indebted to the participants and their families for their generosity and

providing DNA samples. We thank Damian Labuda and Claudia Moreau at the Centre de

Recherche de l'Hôpital Ste-Justine for providing control DNA samples. We would like to

thank Dr Martine Dumont, Gilles Leblanc, Carolle Samson and Martine Tranchant for

sample management, mutation screening, and skillful technical assistance as well as Tina

Babineau, Nathalie Bolduc, Claire Brousseau, Marie-Andrée Lajoie, Pascale Léger, Hélène

Malouin, Andrée McMillan and Josée Rhéaume, for genetic counselling and clinical data

management at the Cancer Genomics Laboratory. We would like to thank Professor Bartha

Maria Knoppers and her colleagues from the Centre de recherche en droit public de

l'Université de Montréal for their precious help with ELSI issues related to our research

program. We also appreciate advice received from ethics committees. This work was

supported by the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) through the INHERIT

BRCAs research program, the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ)/Réseau

de Médecine Génétique Appliquée (RMGA), the CURE Foundation and the Canadian

Breast Cancer Research Alliance (CBCRA). S.D. holds a studentship from Fondation René

Bussières, J.S. is Chairholder of the Canada Research Chair in Oncogenetics, and F.D. is a

recipient of a chercheur-boursier from the Fonds de la Recherche en Santé du Québec

(FRSQ) and a Research Career Award in the Health Sciences from CIHR/Rx&D Health

Research Foundation.

123

Appendix Other members of INHERIT BRCAs involved in clinical aspects of the study:

Paul Bessette: Department of Obstetrics and Gynecology, Centre Hospitalier Universitaire

de Sherbrooke, Fleurimont, Canada

Peter Bridge: Molecular Diagnostic Laboratory, Alberta Children's Hospital, Calgary,

Alberta, Canada

Jocelyne Chiquette: Clinique des maladies du sein Deschênes-Fabia, Hôpital du Saint-

Sacrement, Québec, Canada

Rachel Laframboise: Medical Genetics Division, Centre Hospitalier Universitaire de

Québec, CHUL, Laval University, Québec, Canada

Jean Lépine: Haemato-Oncology Service, Centre Hospitalier Régional de Rimouski,

Rimouski, Canada

Bernard Lesperance, Roxane Pichette: Department of Haemato-Oncology, Hôpital du

Sacré-Coeur de Montréal, Montréal, Canada

Marie Plante: Gynecology Oncology Division, Hôtel-Dieu de Québec, Centre Hospitalier

Universitaire de Québec, Laval University, Québec, Canada

124

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125

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126

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127

Table 1. GADD45 sequence variations and genotype distribution in familial breast cancer cases and controls.

Table 1 Gadd45 sequence variations and genotype distribution in familial breast cancer cases . ind controls

# # Observed (expected)2

HWEp- X 2 p-# Common Rare HWEp- X 2 p- MAF in SNF ' SNP ID1 dbSNP ID Location Series individuals homozygote Hétérozygote homozygote MAF value3 value4 NCBI5

1 C.45-23C/T rs3783466 Intron 1 Cases 96 71 (71.8) 24 (22.5) 1(1.7) 0.135 0.507 0.889 0.148 Controls 92 71 (69.5) 18(20.9) 3(1.6) 0.130 0.187

2 C.147-103G/A NA Intron 2 Cases 84 83 (83.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.006 0.956 0.967 Controls 89 88 (88.0) 1 (1*0) 0 (0.0) 0.006 0,957

0.967

3 C.147-53G/T rs2759219 Intron 2 Cases 95 76 (74.3) 16(19.4) 3(1.3) 0.116 0.083 0.112 0.206 Controls 89 59 (60.7) 29 (25.6) 1 (2.7) 0.174 0.210

4 C.384+93A/G rs3783468 Intron 3 Cases 96 32 (33.2) 49 (46.5) 15(16.3) 0.411 0.597 0.465 0.025-Controls 90 31 (27.2) 27 (44.6) 22(18.2) 0.450 0.108

0.465 0.472 5 c.384+116T/Crs3783469 Intron 3 Cases 96 83(81.6) 11(13.8) 2(0.6) 0.078 0.045 0.556 0.061-

Controls 89 78 (78.4) 11(10.3) 0 (0.3) 0.062 0.534 0.556 0.083

6 C.384+118C/T rs681673 Intron 3 Cases 96 56 (55.5) 34 (35.0) 6(5.5) 0.240 0.784 0.070 0.214-Controls 89 41 (40.4) 38(39.1) 10(9.5) 0.326 0.790

0.070 0.333 7 C.384+168T/C rs532446 Intron 3 Cases 96 56 (55.5) 34 (35.0) 6(5.5) 0.240 0.784 0.078 0.300-

Controls 88 41 (40.2) 37 (38.6) 10(9.2) 0.324 0.708 0.078 0.400

8 C.385-205A/G rs3783474 Intron 3 Cases 95 94 (94.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.005 0.959 1.00 0.006 Controls 95 94 (94.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.005 0.959

9 C.385-174C/T NA Intron 3 Cases 95 94 (94.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.005 0.959 1.00 Controls 95 94 (94.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.005 0.959

1.00

10 C.385-137T/C rs3171012 Intron 3 Cases 95 71 (71.6) 23(21.7) 1 (1.6) 0.132 0.563 0.765 0.067-Controls 95 72 (69.9 19(23.2) 4(1.9) 0.142 0.080

0.765 0.147 11 C.492A/G rs3783478 Exon 4 Cases 96 95 (95.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.005 0.959 0.994 0.006

Controls 95 94 (94.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.005 0.959 0.994 0.006

12 C.498+27C/T rs3783479 3'-UTR Cases 96 95 (95.0) 1 (1.0) 0 (0.0) 0.005 0.959 0.994 0.006 Controls 95 94 (94.0) 1(1.0) 0 (0.0) 0.005 0.959

According to the nomenclature of the Human Genome Variation Society As expected under Hardy-Weinberg equilibrium p-value for deviation from HWE p-value based on single-marker analysis for allelic frequency between both series Reported MAFs in the NCBI database for global samples and populations of European descent

128

Table 2. Haplotypes as estimated by PHASE and WHAP, and their estimated frequencies in cases and controls using all SNPs genotyped in both case and control series. Table 2 Haplotypes as estimated by PHASE and WHAP, and their estimated frequencies in cases and controls using all SNPs genotyped in both case and control series.

Haplotvpe Frequencies (estimated) Haplotype SNP1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12 Cases Controls Combined

PHASE PHI CGGATCTACTAC 0.581 0.545 0.563 PH2 CGGATCTACCAC 0.003 0.000 0.002 PH3 CGGATTTACTAC 0.000 0.003 0.001 PH4 CGGGTCTACTAC 0.083 0.061 0.072 PH5 CGGGTTCACCAC 0.005 0.000 0.003 PH6 CGGGTTCGCTGT 0.005 0.005 0.005 PH7 CGGGCCTACTAC 0.070 0.053 0.061 PH8 CGTGTCTACTAC 0.005 0.000 0.003 PH9 CGTGTTCACTAC 0.103 0.174 0.139 PH10 CGTGCCTACTAC 0.000 0.005 0.003 PH11 CAGGCCTACTAC 0.003 0.003 0.003 PH12 TGGGTCCACCAC 0.005 0.005 0.005 PH13 TGGGTTTACCAC 0.005 0.000 0.003 PH14 TGGGTTCACTAC 0.010 0.000 0.005 PH15 TGGGTTCACCAC 0.104 0.133 0.118 PH16 TGGGTTCATCAC 0.000 0.003 0.001 PH17 TGGGCCTACTAC 0.003 0.000 0.001 PH18 TGTGTTCATCAC 0.004 0.000 0.002

WHAP WH1 CGGATCTACTAC 0.618 0.565 0.597 WH2 CGTGTTCACTAC 0.100 0.176 0.146 WH3 TGGGTTCACCAC 0.118 0.140 0.123 WH4 CGGGTCTACTAC 0.094 0.065 0.076 WH5 CGGGCCTACTAC 0.071 0.053 0.058

129

Supplemental Table 1. PCR and sequencing primers. Supplemental Table 1 PCR and sequencing primers.

Amplified Region PCR primer

PCR boundaries1

PCR length (bp) Sequencing primer

Exon 1 F-5 'GCCTGTG AGTGAGTGC AGA A3 ,2

R-5'GGAGTTGCCCTGTGCAAACT3'2 C.-99G to

C.44+122T 265 5 T AGCCGTGGCAGGAGC AG3 '2(F)

5 'CGGGGTAGGTAAGAGAAGTTCG3 '(R; Exon 2-3 F-5 'GGTGGTGCTTGCATTCGAGA3 '

R-5 'TGAGGGGTGAGCCAGGAATTCA3 ' C.45-108G to C.384+352A

1023 5 'GCGAGAACGACATCAACATC3 '(F) 5'AGGCAGAAAAGCGACAGGAAGTG3'(I

Exon 4 F-5'ATTTGTCTCCATGTCACATAGCCA3' R-5 'CCAG AACATGTAGTTGAACTCACTCA3 '

c.385-118Gto C.498+120A

353 Same primers as those used for PCR amplification

p53 binding site (c.384+188Gto C.384+207G)

Same primers as those used for exon 2-3 amplification 5 'CCCAGTCCCTTACCG TC AC3 '(R)

ZNF350/BRCA1 binding site

(c.385-221Tto C.385-207G)

F-5 ' GGT AG AGC A AACCGGTG AATG AT3 '

Same reverse primer as for exon 4

C.385-304A to 539 Same primer (F) as the one used for PCR C.498+120A amplification

"T 2 As published by: Yamasawa K, Nio Y, Dong M, Yamaguchi K, Itakura M (2002) Clinicopathological significance of abnormalities in Gadd45 expression and its relationship to p53 in human pancreatic cancer. Clin Cancer Res 8:2563-2569

According to the nomenclature of the Human Genome Variation Society and reference sequence NM_01924.2

130

Legends to Figures

Figure 1 Pairwise LD measures of |D'| and r2 for the 12 SNPs identified in the breast

cancer and control series. SNP numbers are denoted according to Table 1.

Figure 2 Haploview predictions of haplotype blocks using SNPs displaying a MAF higher

than 5%. The identification of SNPs is performed on a block-by-block basis and they are

denoted with an asterisk (*) above the SNP number. tSNPs are selected based on

haplotypes showing an estimated frequency higher than 5%. Haploview estimation of

haplotype frequencies is displayed on the right.

131

Figure 1. Pairwise LD measures of |D'| and r for the 12 SNPs identified in the breast cancer and control series.

0<r--<0.3

0.3 <!■•-< 0.8

0.8<r*<1.0

■

D'

0 < D ' < 0 . 3

0.3<D'<0.8

0.8<D'<1.0

4

5

6

7

8

9

10

11

12

■■ I\H ■■■■■

■■ ■ 10 11 12

132

Figure 2. Haploview predictions of haplotype blocks using SNPs displaying a MAF higher than 5%.

WH1

*** *

PHI WH1

Ho«(1'*--t-i^iJi>r-*»J'0'Ho« O O O o O o O o O r l n r l

CGGATCTACTAC .569 PH9 WH2 CGTGTTCACTAC .140 PH15 WH. TGGGTTCACCAC .116 PH4 WH4 CGGGTCTACTAC .073 PH7 WH5 CGGGCCTACTAC .055

133

CHAPITRE III : Variations in the NBN/NBS1 gene and the risk of breast cancer in non-BRCAl/2 French Canadian

families with high risk of breast cancer.

134

Variations in the NBN/NBS1 gene and the risk of breast cancer in non-BRCAl/2

French Canadian families with high risk of breast cancer.

Sylvie Desjardins1, Charles Joly Beauparlant1, Yvan Labrie1, Geneviève Ouellette1,

INHERIT BRCAs* and Francine Durocher1**

'Cancer Genomics Laboratory, Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre,

Centre Hospitalier Universitaire de Québec and Laval University, Québec, Canada;

Email: Sylvie Desjardins - [email protected]. Charles Joly Beauparlant -

charles.ioly-beauparlant(a),crchul.ulaval.ca. Yvan Labrie - yvan.labrie(Sjcrchul.ulaval.ca,

Geneviève Ouellette - [email protected]. Francine Durocher** -

[email protected]

*Other members of INHERIT BRCAs involved in this study are listed in the Appendix.

** Correspondance to: Cancer Genomics Laboratory, Oncology and Molecular

Endocrinology Research Centre, Centre Hospitalier Universitaire de Québec and Laval

University, 2705 Laurier Blvd, T2-53, Québec City, Québec, Canada, GIV 4G2

Telephone: 418-654-2296 FAX: 418-654-2278/418-654-2761

BMC Cancer. 2009; 9 :181.




135

Résumé

Contexte : Le syndrome des cassures chromosomiques de Nijmegen est un désordre

d'instabilité chromosomique caractérisé par une microcephalic, un retard de croissance, une

immunodéficience et une fréquence accrue de cancers. Des études familiales conduites chez

des parents de ces patients ont indiqué qu'eux aussi semblent présenter un risque accru de

cancers. Méthodes : Dans une étude «gène candidat» visant à identifier les déterminants

génétiques de la susceptibilité au cancer du sein, nous avons entrepris le séquençage

complet du gène NBN dans notre cohorte de 97 familles à risque élevé de cancer du sein

non-BRCAl et -BRCA2 ainsi que chez 74 contrôles sains non apparentés, aussi de la

population canadienne française. Des programmes in silico (ESEfinder, NNSplice, Splice

Site Finder et Matlnspector) ont été utilisés afin d'évaluer l'impact potentiels des variants

identifiés. L'effet du variant du promoteur a été étudié plus spécifiquement par essai gène

rapporteur luciférase dans les lignées cellulaires MCF-7, HEK293, HeLa et LNCaP.

Résultats : Vingt-quatre variants ont été identifiés dans notre cohorte de cas, et leur

fréquence a été confirmée chez les contrôles sains. Le variant potentiellement délétère

p.Ilel71Val a été observé chez un cas uniquement. Le variant p.Arg215Trp, qui pourrait

affecter la liaison de NBN à l'histone y-H2AX, a été observé chez un cas de cancer du sein

et un contrôle sain. Un variant du promoteur, c.-242-110delAGTA, présente une variation

de fréquence significative entre les deux échantillons. L'essai de type gène luciférase

rapporteur avec une construction portant ce variant n'a pas démontré de variation

d'expression dans la lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7, mais a indiqué une

réduction de l'expression de la luciférase dans les lignées cellulaires HEK293 et LNCaP.

Conclusions : Notre analyse des variants de séquence de NBN a indiqué que des altérations

potentielles de NBN sont présentes, quoiqu'à une fréquence faible, dans notre cohorte de

cas de cancer du sein à risque élevé. Des analyses plus approfondies seront nécessaires afin

de mieux déterminer l'impact exact de ces variants sur la susceptibilité au cancer du sein,

en particulier pour les variants localisés dans la région promotrice de NBN.

136

Abstract

Background: The Nijmegen Breakage Syndrome is a chromosomal instability disorder

characterized by microcephaly, growth retardation, immunodeficiency, and increased

frequency of cancers. Familial studies on relatives of these patients indicated that they also

appear to be at increased risk of cancer. Methods: In a candidate gene study aiming at

identifying genetic determinants of breast cancer susceptibility, we undertook the full

sequencing of the NBN gene in our cohort of 97 high-risk non-BRCAl and -BRCA2 breast

cancer families, along with 74 healthy unrelated controls, also from the French Canadian

population. In silico programs (ESEfinder, NNSplice, Splice Site Finder and Matlnspector)

were used to assess the putative impact of the variants identified. The effect of the promoter

variant was further studied by luciférase gene reporter assay in MCF-7, HEK293, HeLa and

LNCaP cell lines. Results: Twenty-four variants were identified in our case series and their

frequency was further evaluated in healthy controls. The potentially deleterious p.Ilel71Val

variant was observed in one case only. The p.Arg215Trp variant, suggested to impair NBN

binding to histone y-H2AX, was observed in one breast cancer case and one healthy

control. A promoter variant c.-242-110delAGTA displayed a significant variation in

frequency between both sample sets. Luciférase reporter gene assay of the promoter

construct bearing this variant did not suggest a variation of expression in the MCF-7 breast

cancer cell line, but indicated a reduction of luciférase expression in both the HEK293 and

LNCaP cell lines. Conclusions: Our analysis of NBN sequence variations indicated that

potential NBN alterations are present, albeit at a low frequency, in our cohort of high-risk

breast cancer cases. Further analyses will be needed to fully ascertain the exact impact of

137

those variants on breast cancer susceptibility, in particular for variants located in NBN

promoter region.

138

Background

Pathogenic mutations in BRCAl, BRCA2, TP53, ATM, CHEK2, BRIP1 and PALB2 have

been associated with an increased breast cancer risk and, together, are found in less than

25% of breast cancer families showing a clear pattern of inheritance (high-risk families)

[1]. It is thus clear that other susceptibility alleles remain to be identified to explain the

increased risk in the remnant high-risk families. As the number and characteristics of such

alleles are undetermined, a focussed candidate gene approach based on genes closely

interacting with the known susceptibility genes such as BRCAl and BRCA2, the two major

susceptibility genes identified yet, constitutes a study design of choice to identify rare-

moderate-penetrance susceptibility alleles.

In the cell, nibrin, encoded by the jViiW gene (also known as NBS1), participates in

pathways of double strand breaks (DSB)-induced DNA repair and, together with its

partners MRE11A and RAD50, is required for activation of these pathways in response to

DNA damages [2]. In fact, nibrin is at the crossroad of several pathways implicating genes

already associated with breast cancer susceptibility and/or chromosomal instability

disorders [2, 3]. Individuals homozygous for hypomorphic mutations in NBN suffer from

the Nijmegen Breakage Syndrome (NBS), an autosomal recessive chromosomal instability

disorder characterized by microcephaly, growth retardation, immunodeficiency and hyper-

radiosensitivity [4]. Cancers, in particular haematological malignancies, are common

adverse events in patients with NBS, as almost 40% of them develop a malignancy before

the age of 21 years, and this correlates with a marked impairment in DSB repair observed

in cells from these patients [5].

139

Some studies have associated an heterozygous NBN status with numerous types of cancers,

including breast cancer [6-10], suggesting that being a carrier of a deleterious mutation in

NBN may confer an increased risk of approximately 2 to 3-fold [6]. This was also

supported by the observation that relatives of NBS patients display a higher than expected

rate of cancers [4, 11]. However, other studies failed to find an association with an

increased risk of cancer [12, 13].

In support of a role of NBN in tumor formation, evidence from mouse models demonstrated

that Nbn heterozygosity predisposes cells to malignancies, as they display a wide variety of

tumors: liver, mammary gland, prostate, lung as well as lymphomas [14]. Indeed, cells

from these mice displayed an elevated frequency of chromosomal aberrations. These

observations were correlated by studies of NBN heterozygous mutation carriers

demonstrating that cell lines from these individuals showed spontaneous chromosomal

instability (chromatid and chromosomes breaks, and chromosomes rearrangements) [15,

16] as well as increased sensitivity to radiation-induced chromosomal aberrations [17].

Thus, it has been hypothesized that in cells of carriers of deleterious mutations in DNA

repair genes such as NBN, a decrease in DNA repair capabilities resulting from a gene

dosage effect (i.e. lower gene expression) may be sufficient to create a permissive

environment for tumor development [18, 19]. It has also been suggested that these DNA

repair genes may show differences in tissue-specific protein-dosage thresholds, below

which they may fail to operate normally [20].

Thus, based on the close relation of NBN and known breast cancer susceptibility genes in

the cell DNA repair pathways, and the studies suggesting a possible involvement of NBN

alterations in cancer susceptibility, we undertook the analysis of the entire coding sequence,

140

intron/exon junctions, as well as the proximal promoter region of the NBN gene. We

therefore performed a thorough re-sequencing of a series of 97 breast cancer cases selected

from high-risk families from the French Canadian population, and 74 unrelated healthy

controls from the same origin for sequence variations that could possibly modulate breast

cancer risk.

141

Methods

Ascertainment of families.

All 97 non-BRCAl/2 individuals from high-risk French Canadian breast and ovarian cancer

families participating in this study were part of a larger interdisciplinary program termed

INHERIT BRCAs [21]. All participants were at least 18 years of age and had to sign an

informed consent form. Ethics committees reviewed the research project at the 7

participating institutions from which the patients were referred. The details regarding

selection criteria of the breast cancer cases as well as the experimental and clinical

procedures have been described previously [21, 22].

PCR amplification and direct sequencing.

PCR amplification of NBN (NM_002485.4) coding sequence, as well as flanking intronic

regions, was performed on breast cancer cases and controls using primer pairs as described

in Table 5. Sequencing reactions and sequence analysis were performed as described

previously [22]. Alternative splice screening was also performed on cDNA on a subset of

breast cancer cases using primers as described in Table 1.

Variants characterization and haplotype estimations.

Deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) and allelic difference between both

series was evaluated using a two-sided Chi Square test with 1 degree of freedom. The

possible effect of a given variant on exonic splicing enhancers was assessed using the

ESEfinder 3.0 program [23] and on splice consensus sites using NNSPLICE [24] and

Splice Site Finder [25] web based programs. The potential impact of the promoter variant

and pairwise linkage disequilibrium were evaluated as described elsewhere [26]. Haplotype

142

analysis was performed using the WHAP program [27] implementing a regression-based

association test allowing for evaluation of haplotype-specific association. Haplotype

analyses were performed on all variants identified as well as on variants showing a minor

allele frequency (MAF) greater than 5%.

Luciférase promoter assays.

A portion of 401 bp of the NBN promoter region, and the entire 5'UTR sequence (110 bp),

was amplified by PCR from a breast cancer individual carrier of the c.-242-110delAGTA

deletion using primers introducing a Nhel or a Hindlll restriction site (Table 1). PCR

products were then digested and introduced in the pGL3 basic vector (Promega

Corporation, Madison, WI, USA). Direct sequencing of clones was performed to confirm

the presence of the reference sequence allele as well as the four nucleotides deletion.

Transient transfections in MCF-7, LNCaP, HeLa and HEK293 cells and dual luciférase

reporter assays were performed as described previously [26], with cells harvested 24-48h

after transfection. ATBF1 expression levels were measured in these four cell lines by

quantitative real-time PCR (QRT-PCR) as described previously [28], using RNA extracted

by the TriReagent method (Molecular Research Center Inc, Cincinnati, OH, USA) and

specific primers (sens: 5'-TGCAACTAAACCGCCCACATATA-3'; antisens 5'-

CCCCAAGTGAGATAAAGCTAAACAAA-3'). Levels of expression were normalized

using the housekeeping gene HPRT1, and are indicated relative to the MCF-7 cell line (sens

primer: 5'-AGTTCTGTGGCCATCTGCTTAGTAG-3'; antisens primer: 5'-

AAACAACAATCCGCCCAAAGG-3 ').

143

Results

Sequence variations in the NBN gene. Direct sequencing of NBN entire coding region,

adjacent intronic sequences as well as the proximal promoter region was performed on 97

affected individuals from French Canadian breast and ovarian cancer families (one

individual per family). Twenty-four variants were identified (Tables 1, 2 and Figure 1),

including a new rare synonymous change at codon 127 (c.381T/C) and a new variant

located in intron 15 (C.2234+86T/G), both not reported in the literature and databases, and

found exclusively among breast cancer cases. Variants identified in the case dataset were

also genotyped in 74 healthy individuals from the same population. All SNPs genotyped

were in HWE. Nine out of the 24 variations were located in the coding region (Table 2),

while the remaining 15 were located in untranslated regions (Table 3). Among all variants

identified, half (12) were considered as common (MAF a5%) while the remaining 12 were

rare variations. Two rare non-synonymous exonic variants (c.511A/G and C.797C/T) were

observed only once in the case series, of which p.Ilel71Val is located in the first BRCAl

C-terminal (BRCT) domain (Figure 1). Of these two variants, only C.511A/G could be

genotyped in an additional family member, i.e. an unaffected male cousin, who was found

non-carrier (data not shown). Two other rare variants, C.283G/A and C.643C/T, were both

observed in one breast cancer case and one control. For the C.643C/T variant, a DNA

sample from another available family member affected with ovarian cancer was analyzed

and fumed out to be wild type (data not shown). Among the variants located in untranslated

regions (Table 3), the C.2234+86T/G variant was present exclusively in two breast cancer

cases. When genotype frequencies of all variants were compared between both series, only

144

the c.-242-110delAGTA variant in the promoter showed a statistically significant

association with breast cancer (OR 3.4, 95% CI: 1.1-10.5; p=0.029).

Identification of NBN alternative splice forms. Analysis of NBN cDNA was also

performed on a subset of these breast cancer cases and highlighted the presence of two

distinct alternative splice events. The first splice variant involved the insertion of 50 bp of

the intron between exons 2 and 3 and is expected to result in a premature stop codon [29].

The other alternative splice form identified involves the skipping of exons 12 to 14 which is

expected to produce an in-frame deletion of 113 amino acids in the region of the NBN

protein involved in the interaction with its partner MRE11A (Figure 1). However, QRT-

PCR of this specific form was performed on cDNA samples from a subset of 10 breast

cancer cases from our cohort and showed a very low expression relative to the main

isoform (data not shown), which is consistent with previous work [30].

In silico analysis of the putative impact of NBN exonic and intronic sequence variants on

these splice events was also performed. Analysis of the nine exonic sequence variants using

ESEfinder indicated that, while five variants (c.283G/A, C.553G/C, C.643C/T, C.797C/T,

and c.H97T>C) might have an impact on putative score motifs of four SR proteins, a

closer examination of these results shows that these scores, while below the program

thresholds, remain relatively high and thus are unlikely to affect NBN constitutive splicing

(Figure 2). According to the Splice Site prediction program, the intronic variant

C.896+36G/A might slightly increase a putative acceptor site (score from 0.66 to 0.75).

However, this was not confirmed by the Splice Site Finder program, which predicted the

abolition of a putative donor site with a score of 71.2. As for the C.1124+91C/A intronic

variant, only the Splice Site Prediction program predicted the abolition of a weak acceptor

145

site (score of 0.45) while for the C.2234+157A/G intronic variant, the Splice Site Finder

program estimated the creation of a putative acceptor site with a score of 77.2. Hence, none

of the variants identified are expected to be responsible for the alternative splice events

observed.

Effect of the c.-242-110delAGTA variant on luciférase reporter gene expression. The

putative effect of the c.-242-110delAGTA variant located in the promoter region was also

assessed by the Matlnspector program, which predicts that this variant may abolish

recognition motifs for the ZFHX3/ATBF1 (Zinc finger homeobox 3, or AT motif-binding

factor 1), NKX3-1 (NK3 homeobox 1) and CDX2 (Caudal-type homeobox 2) transcription

factors, and create a potential binding site for the MTBF (Muscle-specific MT binding

factor) transcription factor (Figure 3A). The effect of the c.-242-110delAGTA variant on

NBN expression was therefore further assessed using a dual reporter gene system. MCF-7,

LNCaP, HeLa and HEK293 cells were then transiently transfected with a construct

containing the consensus NBN sequence or with the variant sequence, together with the

Renilla reporter plasmid as an internal transfection control (Figure 3B). While no

significant difference in expression was observed between both constructs in MCF-7 and

HeLa cells, a slight diminution of luciférase expression was observed for the variant

construct relative to the reference sequence construct in both the HEK293 and LNCaP cell

lines (Figure 3C). Interestingly, QRT-PCR measures indicated that ATBF1 mRNA is 2.4

times more expressed in HeLa cells, and more than 4.3 times more expressed in LNCaP

cells, than in MCF-7 cells (data not shown).

LD analysis across NBN genomic sequence and haplotypes determination. Pairwise LD

measures of all variants using the control dataset are presented in Figure 4. |D'| values show

146

a high degree of LD for all SNP pairs while the more stringent r2 measure, dependent upon

allele frequency, shows a limited block of LD involving mainly SNPs located in the second

half of the NBN gene. The bottom part of Figure 4 shows the r2 HapMap CEU data in the

vicinity of NBN on chromosome 8, and suggests that NBN may overlap two blocks of LD.

The major part of NBN seems to be in a strong block of LD extending 5' of the gene, while

its 3' extremity spans over another smaller block.

Haplotype phasing of NBN using the WHAP program with all 24 variants identified in our

datasets indicated that 14 haplotypes are present with an estimated frequency greater than

0.5%. Although WHAP did not estimate a significant difference between both groups, the

p-value observed was borderline significant (p=0.0588). The majority of these estimated

haplotypes (84.5%) have a frequency greater than 2%. Two haplotypes (#4 and #7 in Table

3) showed a weak significant association with breast cancer, being more frequent among

cases (p=0.0205 and p=0.0403, respectively). The same analysis, using only common

variations (MAF >5%), suggested that one haplotype is more frequent among cases than

controls (WH4, p=0.0227), with another haplotype showing a non-significant trend of over-

representation in cases (WH5, p=0.0883) (Table 5). Global estimation of haplotypes was

further confirmed using the PHASE 2.1.1 program, with concordant results (data not

shown).

A closer examination of these two haplotypes (WH4 and WH5) showed that the only

variation present on WH4 is the c.-242-110delAGTA variant, which on its own shows a

significant difference in frequency between both groups. Thus, this variant is likely to be

responsible of the association observed as any further breakdown of this haplotype using a

sliding window analysis shows that all combinations involving this variant display a

147

significant association (data not shown). As for the WH5 haplotype carrying the c l 197T/C

variant in exon 10, it does not show any significant difference in frequency between the

both groups and, despite its strong linkage disequilibrium with the adjacent variants, it

shows only a tendency towards significativity when present in combination with the major

alleles at all other positions (Table 5).

148

Discussion

Although the relevance of mutations in several DNA repair genes (BRCAl, BRCA2, TP53,

PTEN, PALB2, BR1P1) in breast cancer susceptibility have been well established, the

association of variants in other genes, potentially accounting for the remaining familial

clustering, is not well defined. For example, heterozygous carriers of deleterious mutations

in the NBN gene, in particular the Slavic founder mutation 657del5, has been associated

with a 2- to 3-fold increased risk of cancer [6]. However the impact of other NBN variants

on cancer risk is unclear. Nonetheless, studies have demonstrated an increased spontaneous

chromosomal instability in cells from heterozygous carriers of NBN mutations [7, 16]. In

addition, the presence of a specific pattern of gene expression involving pathways of DNA

repair and damage bypass, mitotic checkpoint and apoptosis was demonstrated, suggesting

that cells from these carriers may display a much less efficient DNA repair system [31]. In

this regard, a recent study by Someya et al. [32] showed a correlation between persistent

radiation-induced NBN foci and both chromosomal instability and sporadic breast cancer

risk. To address the possible implication of NBN sequence variants on breast cancer risk,

we took advantage of our resource of high-risk breast cancer families drawn from the

French Canadian population. In order to increase the statistical power of our investigation,

one affected individual from each family was selected for analysis [33], each thoroughly

screened for BRCAl and BRCA2 mutations or large genomic rearrangements in these genes

[21].

The majority of the coding variants identified in our cohort of breast cancer cases are

situated in the forkhead-associated (FHA) domain and the two BRCT domains, and these

149

domains have been demonstrated to be essential to NBN binding to the histone y-H2AX

[34, 35]. One of the rare variants identified in this study, p.Ilel71Val, was first described in

acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients [36]. This variant has been previously

reported to be over-represented in some cancer cohorts [9, 10, 37, 38], and has also been

previously described at the homozygous state in a Japanese NBS patient affected with

aplastic anemia and genomic instability [39]. Interestingly, analysis of the patient's and her

father's lymphoblastoid cell lines demonstrated a higher frequency of spontaneous

chromosomal aberrations compared with healthy controls (6- and 4-fold increase,

respectively). These results suggest that the p.Ilel71Val variation may be deleterious, also

supported by the fact that this variant alters an amino acid which is conserved in species

such as the chicken and the fruitfly [39]. However, the impact of the p.Ilel71Val

substitution remains to be clarified as a large study, including cases from Germany and the

Republic of Belarus, did not find any association with breast cancer in those populations

[40].

Another rare variant, p.Arg215Trp, has been considered pathogenic in previous studies

based on its highly conserved position and the change introduced. Moreover, this variant

has been identified in monozygotic twins compound hétérozygotes for

657del5/p.Arg215Trp and affected with a severe form of NBS [41]. NibrinTrp215 appears to

affect the correct nibrin function, and cells carrying this variant shows delayed DNA DSB

rejoining [41]. Modélisation of the tandem BRCT domains suggests that the Arg215

residue is required for correct orientation of the BRCT domains and recognition of y-H2AX

[34]. In their experiment, nibrinTrp215 seems to partially interfere with nibrinArg215 activity

and may act in a co-dominant fashion. It is also interesting to note that although this variant

150

is relatively frequent in several studies, to our knowledge no NBS cases homozygous for

this variant have been reported.

Of the other rare variants present in our cohort of breast cancer cases, the p.Pro266Leu

variant was observed in one breast cancer case, and the p.Asp95Asn variant was found in

one breast cancer case and one control. Although these variants involve conserved residues,

their putative effect on protein function remains unclear. In a previous study on non-

Hodgkin lymphoma, both variants were detected only in healthy controls [42]. Regarding

the p.Asp95Asn variant first identified in an ALL patient [36], no association was found in

a study of larynx cancer [38] or ALL [37]. This variant was found in one out of 613 and

121 unselected and familial prostate cancer cases, respectively, but not in controls [43].

However, p.Asp95Asn is not predicted to be highly damaging as its expression in NBS

cells seems to have a similar activity to the wild type protein [42]. The only other non-

synonymous change identified in our cohort is the p.Glul85Gln common variant (MAF

>25%), which has been genotyped in several association studies. Although the majority of

the studies analyzing this variant found no association with cancer [12, 38, 42-44], some

studies reported an association with breast cancer [8], basal cell carcinoma in men [45] and

a recent meta-analysis of this variant in bladder cancer revealed a significant association

after controlling for potential bias [46]. In addition, Musak et al. [47] reported that this

variant may modulate the frequency of chromatid-type aberrations among tire plant

workers. However, our data do not allow us to confirm any positive association.

Among the non-coding variants, a possible association of the c.-242-110delAGTA variant

with an increased risk of breast cancer could be observed (OR 3.4 95% CI : 1.1-10.5). This

association was further confirmed by the estimation of the haplotype diversity in our

151

dataset, which highlighted the presence of the haplotype bearing the c.-242-110delAGTA

variant at a higher frequency among the breast cancer case subset. In silico prediction of

putative transcription factor binding sites indicated that of the four transcription factor

binding sites potentially affected by the deletion, some are predicted to involve proteins not

expressed in the breast. MTBF acts in the muscle regulation of the myostatin gene [48],

while CDX2 is mainly expressed in the gut although its ectopic expression was also

reported in cases of non-gastrointestinal carcinomas [49]. As for the transcription factor

NKX3-1, it is mainly expressed in the prostate although it is also found at low levels in the

mammary gland and breast tumors, and has been suggested to act as a haplo-insufficient

tumor suppressor in prostate cancer [50]. The fourth transcription factor potentially affected

is ATBF1 (also known as ZFHX3). ATBF1 was shown to suppress the expression of the

alpha-fetoprotein[51] and the MYB oncogene [52]. ATBF1 also cooperates with p53 to

activate the CDKN1A promoter and trigger cell cycle arrest [53]. ATBF1 is expressed in the

mammary gland and breast tumors (NCBI's UNIGENE data), and the expression of

ATBF1 mRNA was correlated with a better prognosis in 153 patients with invasive

carcinomas of the breast [54]. This might suggest that deregulation of genes controlled

through ATBF1 could have an important impact on breast cancer formation and

progression.

Luciférase reporter gene assay using the promoter sequence proximal to the ATG codon

indicated a similar level of expression of the c.-242-110delAGTA variant allele as

compared to the reference sequence construct in the breast cancer cell line MCF-7 and in

HeLa cells. However, a slight decrease in luciférase expression was observed in both

HEK293 and LNCaP cells, which might indicate that this variant could have an impact on

152

NBN expression in a cell type manner. The analysis of ATBF1 gene expression indicated

that this transcription factor is weakly expressed, in particular in the MCF-7 cells. This is

comparable to a recent study performed on a panel of 32 breast cancer cell lines, which

indicated that in 75% of these cell lines, ATBF1 is expressed at 50% or less relative to the

normal breast [55]. This could in rum explain the lack of effect observed for the luciférase

assay in the MCF-7 cell line. On the other hand, one could hypothesize that NBN (or

transcription factors affecting its expression) may be regulated following irradiation or

other genotoxic stress. Additional research will however be needed to address this

possibility, as well as binding experiments to confirm ATFB1 binding to this region of the

promoter. However, it is also important to keep in mind that the promoter sequence cloned

here, although supporting NBN expression, is unlikely to constitute the entire NBN

promoter. It is indeed plausible that transcription factors acting on the proximal sequence

might be influenced by other transcription factors acting further upstream. As such, despite

the lack of variation in expression induction found in MCF-7 by luciférase assay, it is

possible that the c.-242-110delAGTA variant could be in LD with another functional

variant located elsewhere in the promoter, as a high degree of LD is present across the

whole NBN gene. Unfortunately, the promoter variant could not be associated by LD with

another variant in the coding region of the gene, which would have allowed to directly

measure NBN allelic expression.

153

Conclusion

Our analysis suggests that the variant c.-242-l lOdelAGTA identified in our cohort of breast

cancer individuals and located in the promoter region of the NBN gene may be associated

with an increased risk of breast cancer. However, the functional analysis by luciférase

promoter assay does not support a causative effect of this variant in the breast cancer cell

line MCF-7, although a reduction of luciférase expression driven by the NBN promoter can

be observed in two other cell lines tested. As the NBN genomic region displays a high

degree of LD, we cannot rule out the effect of other variants located upstream of the region

analyzed here. Alternatively, the effect of this variant may be dependent upon induction by

a genotoxic stress such as irradiation. Although NBS is a rare syndrome, carriers of

deleterious alterations in this gene are more common and may display subtle manifestations

in cellular pathways predisposing M>W-mutated carriers to malignancy. Further analyses

will therefore be needed to ascertain the impact of rare variants and promoter variants of

NBN on breast cancer susceptibility in other populations.

154

Abbreviations AIR: ATM interacting region; ALL: Acute lymphoblastic leukemia; ATBF1: AT motif-

binding factor 1; BRCT: BRCAl C-terminal; CDX2: Caudal-type homeobox 2; CI:

Confidence interval; DSB: Double strand breaks; ESE: Exonic splicing enhancer; FHA:

Forkhead-associated; HWE: Hardy-Weinberg equilibrium; LD: Linkage disequilibrium;

MAF: Minor allele frequency; MIR: MRE11A interacting region; MTBF1: Muscle-specific

MT binding factor; NBS: Nijmegen breakage syndrome; NKX3-1: NK3 homeobox 1; OR:

Odds ratio; QRT-PCR: Quantitative real-time PCR; ZFHX3: Zinc finger homeobox 3.

Competing interests The authors declare that they have no competing interests.

Authors' contributions SD participated in the molecular analysis study, performed the reporter gene assays

experiments and bioinformatics analyses, and drafted the manuscript. CJB participated in

the molecular analysis study. YL provided technical assistance and helped draft the

manuscript. GO performed DNA and RNA extractions, cell maintenance and participated

in the luciférase assays experiments. FD conceived the study, its design and coordination,

and authored the final version of the manuscript. All authors read and approved the final

manuscript.

155

Acknowledgements The authors would like to thank all individuals and families who participated in this study.

We thank C. Brousseau, Dr. S. Délos, M.-A. Lajoie, P. Léger, J. Rhéaume, C. Samson, M.

Tranchant, Dr. M. Dumont, G. Leblanc, H. Malouin, N. Bolduc, A. MacMillan and T.

Babineau of the Cancer Genomics Laboratory for genetic counselling, sample management

and mutation screening. We also thank F. Guénard for advices regarding luciférase assays,

M. Ouellet and A.-M. Bureau-Blouin for skillful technical help and Dr. D. Labuda and C.

Moreau at the Centre de Cancérologie Charles Bruneau of Ste-Justine Hospital for help

with control DNA samples.

This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and

Institute of Cancer and Institute of Gender and Health for the INHERIT BRCAs research

program, the Fond de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ)/Réseau de Médecine

Génétique Appliquée (RMGA), the Canadian Breast Cancer Research Alliance (CBCRA)

and the CURE Foundation. S.D. holds studentships from Fondation René Bussières and

Fondation Desjardins, C.J.B. holds a Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate

Scholarships - Master's Award studentship from CIHR, and F.D. is a recipient of a

chercheur-boursier from the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and

Research Career Award in the Health Sciences from CIHR/R&D Health Research

Foundation.

156

Appendix

Other members of INHERIT BRCAs involved in this study:

Paul Bessette: Service de gynécologie, Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke,

Fleurimont, QC, Canada.

Jocelyne Chiquette: Clinique des maladies du sein Deschênes-Fabia, Hôpital du Saint-

Sacrement, Québec, QC, Canada.

Rachel Laframboise: Service de médecine génétique, CHUQ, Pavillon CHUL, Québec,

QC, Canada.

Jean Lépine: Centre Hospitalier régional de Rimouski, Rimouski, QC, Canada.

Bernard Lesperance, Roxane Pichette: Service d'hémato-oncologie, Hôpital du Sacré-

Cœur, Montréal, QC, Canada.

Marie Plante: Service de gynécologie, CHUQ, L'Hôtel-Dieu de Québec, Québec, Canada.

Jacques Simard: Director and instigator of the integrated research program INHERIT

BRCAs, and chairholder of the Canada Research Chair in Oncogenetics. Cancer Genomics

Laboratory, Oncology and Molecular Endocrinology Research Centre, Centre Hospitalier

Universitaire de Québec and Laval University, Québec, Canada.

157

References

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162

Figure legends

Figurel: Schematic representation of the NBN gene on chromosome 8q21.

The upper part shows variants identified in the NBN gene. Light green boxes refer to SNPs

with MAF <5% in the cases set, and variants name are indicated according to the reference

sequence NM002485.4. Corresponding coding variations are indicated relative to the

protein structure in the bottom part of the figure. Light blue boxes refer to synonymous

variations. FHA: Forkhead-associated domain. BRCT: BRCAl C-terminal domain. MIR:

MRE11 interacting region. AIR: ATM interacting region. Yellow dots: acetylated lysine

residues (K208, K233, K334, K441, K504, K544, K665, K690, K698 and K715). Red dots:

phosphorylated serine residues (S278 and S343).

Figure 2: In silico analysis of the effect of coding variants on putative exonic splicing

enhancer (ESE) motifs by the FSE Under program.

Only scores for predicted motifs potentially abolished by exonic variants are shown. Light

gray: motif matrix scores for consensus sequences. Dark gray: motif matrix scores for

variant sequences. The name of the SR protein potentially involved is indicated for each

score pair. Doted line indicates the default threshold used by ESEfinder for the

corresponding motif.

Figure 3: Effect of the c.-242-110delAGTA deletion on NBN promoter activity.

Panel A shows the results of the in silico predictions of transcription factors binding sites

affected by the c.-242-110delAGTA variant obtained from the Matlnspector program.

Panel B shows the schematic representation of the two reporter gene constructs containing

the NBN promoter used in this study. The positions relative to the nucleotide A of the NBN

reference sequence ATG codon are indicated. Panel C shows the results of the luciférase

163

reporter assay. MCF-7, LNCaP, HeLa and HEK293 cells were transiently co-transfected

with the Renilla reporter plasmid (pRL) as a transfection control. Each data represents

mean ± standard deviation of triplicates. Data are shown as fold of induction compared to

the activity of cells transfected with the empty pGL3-basic luciférase reporter vector.

*p=0.0245 **p=0.0181

Figure 4: Linkage disequilibrium across the NBN gene and neighbouring

chromosomal region.

Upper part shows linkage disequilibrium (LD) results (r2 and |D'|) obtained from the

control genotypes data used in our study and their relative position along -/WW sequence. In

the bottom part of the figure are indicated r2 data from the International HapMap project

(release 21a) for the genomic region encompassing NBN. The intensity of the box color is

proportional to the strength of LD. r2=0 in white; 0<r2<l in shades of pink/red; r - \ in

bright red.

164

Table 1. Oligonucleotides used for NBN PCR amplification and sequencing. Table 1 Oligonucleotides used for NBNPCR amplification and sequencing

F/R1 Oligonucleotide sequence (5'—+3') Annealing temp. (°C)

PCR lenght (bp)

MgCI2 final cone. (mM) Comments

Genomic sequence Exon

1 F GACGTTAAGACAAGTTGATTTGAACTTAGA*

60 965/ 1113 0.5 2% DMSO added to the PCR reaction

Exon 1 R TCCGCCCATGCTAACTTCCT 60 965/

1113 0.5 2% DMSO added to the PCR reaction Exon

1 F2 TTTAGTAGTGCGCAGGATGTAGAC

60 965/ 1113 0.5 2% DMSO added to the PCR reaction

Exor 2

F CCTTTGATAGCCTTCAGTGAGGC 64 743 1.0 Sequencing primer: CCACTGGTACCACTGCCACA

Exor 2 R AGCCAGAGTCATGAAGGTCTGTTC 64 743 1.0 Sequencing primer:

CCACTGGTACCACTGCCACA Exon

3 F GTCAGGAGAATCCCCACTGACTT* 60 548 1.5 Exon

3 R GGCACAGAGTCCAATACTGTGCT 60 548 1.5

Exon 4

F TGGGAAGTTACATTTCTTCGATTCC* 58 728 1.5 Exon 4 R GCACTGTCATAACCTTCTCGGTG 58 728 1.5

Exon 5

F GCAGTGACCAAAGACCGACTTCTA* 58 561 1.5 Exon 5 R TGAGGTTACCTCAGTGCCATTTACT* 58 561 1.5

Exon 6

F AAACGCGATTAGATGCTTTTTGTC* 60 630 1.5 Exon 6 R ACCCCACTTTGGTACACAGAAC 60 630 1.5

Exon 7

F CCACAGAGAGTGTAACAGTTCCAGG* 63 1100 1.0 2% DMSO added to the PCR reaction Exon 7 R TTAATTCTTGTATCGGCCGGG 63 1100 1.0 2% DMSO added to the PCR reaction

Exor 8

F TAACAGTGCCCCAGCGAGTAAG* 58 785 1.5 Exor 8 R TCCTCTTACACTGTCGACCCTTAGA 58 785 1.5

Exon 9

F TTAGATAAGCCCGTCATAGATGCC* 58 516 1.5 Exon 9 R TAACTACTCGCCGCTCCTTTACA 58 516 1.5

Exon 10

F GTTTGTCAGTCGTCTATAGTGGAGCA* 58 763 1.5 Exon 10 R AATTGCGGCAAGTAAAATAACACG 58 763 1.5

Exon 11

F CCCTGCCCACAACCTTACTACG* 60 1500 1.5 Exon 11 R GACCACAGCCATGAATGAGTGG * 60 1500 1.5

Exon 12

F TCCTACCATCTACAGACAACCATGG 58 619 1.5 Exon 12 R CCATGATCAATCCATTTCAAGGC * 58 619 1.5

Exon 13

F GCAAACAGTGCTGAGATTTTGTGTC 58 850 1.5 Exon 13 R CCTGAGCTAAAGAACCTCCTCAAGTAG * 58 850 1.5

Exon 14

F CAACATCTCCTGCTTGGACTCTG 60 638 1.0 Sequencing primer: GATGGGTTTAGAACAGAGTTACTGCT

Exon 14 R GAAGAATTTGCTTGAAGGCCACC 60 638 1.0 Sequencing primer:

GATGGGTTTAGAACAGAGTTACTGCT Exon

15 F GAACTCAGATGTGGTGACCTCCAG 58 441 1.5 Exon

15 R CAATTTCACACAATTCGGGAACC * 58 441 1.5

Exon 16

F GAGGAATGGGGATCTTTGAAGC 58 457 1.5 Sequencing primer: AAGCAACATCAAAGGGATACATGA

Exon 16 R GTAACTTAAATCGCTTCTATACAC 58 457 1.5 Sequencing primer:

AAGCAACATCAAAGGGATACATGA cDNA PCR

1 F GTTACGCGGTTGCACGTCG 64 998 1.5 Exons 1 to 8 PCR

1 R GTCATGAAAATCACCGCCAATC 64 998 1.5 Exons 1 to 8

PCR 2

F TCTTTTTGGCTCCGGGAACG 62 567 1.5 Exons 7 to 10 Overlap of 169pb with PCR1

PCR 2 R GCTGCTGCTGAGAAGCCCTATC 62 567 1.5 Exons 7 to 10

Overlap of 169pb with PCR1 PCR

3 F CCCACTGTAAAGGAGTCCTGCA 62 634 1.5 Exons 10 to 12

Overlap of 151pb with PCR2 PCR

3 R TACTTTCTGGTACTGCTTCATCACT 62 634 1.5 Exons 10 to 12 Overlap of 151pb with PCR2

PCR 4

F CCATAGAAGATGAAGTATTGGA 62 700 1.5 Exons 11 to 16 Overlap of 165pb with PCR3

PCR 4 R GTAACTTAAATCGCTTCTATACAC 62 700 1.5 Exons 11 to 16

Overlap of 165pb with PCR3

165

Promoter cloning

! „ •

F GACGACGCTAGCGACGTTAAGACAAGTTGA

62 515 1.0 2% DMSO added to the PCR reaction Added restriction sites are underlined

! „ •

F TTTGAACTTAGA 62 515 1.0 2% DMSO added to the PCR reaction

Added restriction sites are underlined

! „ • R GACGACAAGCTTATCGGTCCGGCTCCTCAG


! „ • R GGCTG

, JT-^ , T - . 1 . . .


Primer direction: forward (F) or reverse (R) Alternative primer Oligonucleotides used as sequencing primers are marked with an (*)

166

Table 2. Exonic sequence variations of the NBN gene in French Canadian breast cancer cases and healthy controls. Table 2 Exonic sequence variations of the NBN gene in French Canadian breast cancer cases and healthy controls.

SNP SNP ID1

(dbSNP ID) Protein change Location Series (No.) MAF2

Common homozygote

No. (expected)3

Hétérozygote No.

(expected)3

Rare homozygote

No. (expected)3

HWE p-value

OR (95% CI)4

Reported MAF in

Caucasian 1 C.102G/A

(rsl 063045) p.Leu34Leu Exon 2 Cases (97) 0.284 52 (49.80) 35(39.41) 10(7.80) 0.27 0.7 (0.4-1.3)

0.283-0.4505

1 C.102G/A (rsl 063045) p.Leu34Leu Exon 2 Controls (71) 0.310 33 (33.82) 32 (30.37) 6 (6.82) 0.65

0.7 (0.4-1.3)

0.283-0.4505

2 C.283G/A (NA)6 p.Asp95Asn Exon 3 Cases (97) 0.005 96 (96.00) 1 (0.99) 0(0) 0.96 0.7

(0.0-11.9) 2 C.283G/A

(NA)6 p.Asp95Asn Exon 3 Controls (71) 0.007 70 (70.00) 1 (0.99) 0(0) 0.95 0.7

(0.0-11.9) 3 C.381T/C

(NA) p.Alal27Ala Exon 4 Cases (97) 0.005 96 (96.00) 1 (0.99) 0(0) 0.96 2.3 (0.1-56.1)

3 C.381T/C (NA) p.Alal27Ala Exon 4 Controls (72) 0.000 72 (72.00) 0(0) 0(0) 1.00

2.3 (0.1-56.1)

4 C.511A/G (NA)6 p.Ilel71Val Exon 5 Cases (97) 0.005 96 (96.00) 1 (0.99) 0(0) 0.96 2.3

(0.1-57.0) 4 C.511A/G

(NA)6 p.Ilel71Val Exon 5 Controls (73) 0.000 73 (73.00) 0(0) 0(0) 1.00 2.3

(0.1-57.0) 5 C.553G/C

(rsl 805794) p.Glul85Gln Exon 5 Cases (97) 0.268 54(51.97) 34 (38.06) 9 (6.97) 0.29 0.6 (0.3-1.2)

5 C.553G/C (rsl 805794) p.Glul85Gln Exon 5 Controls (73) 0.308 34 (34.93) 33(31.13) 6 (6.93) 0.61

0.6 (0.3-1.2)

6 C.643C/T (rs34767364) p.Arg215Trp Exon 6 Cases (97) 0.005 96 (96.00) 1 (0.99) 0(0) 0.96 0.8

(0.0-12.2) 6 C.643C/T

(rs34767364) p.Arg215Trp Exon 6 Controls (73) 0.007 72 (72.00) 1 (0.99) 0(0) 0.95 0.8

(0.0-12.2) 7 C.797C/T

(rs769420) p.Pro266Leu Exon 7 Cases (97) 0.005 96 (96.00) 1 (0.99) 0(0) 0.96 2.3 (0.1-57.0) o.ooo5 7 C.797C/T

(rs769420) p.Pro266Leu Exon 7 Controls (73) 0.000 73 (73.00) 0(0) 0(0) 1.00 2.3

(0.1-57.0) o.ooo5

8 C.1197T/C (rs709816) p.Asp399Asp Exon 10 Cases (97) 0.320 47 (44.91) 38 (42.19) 12(9.91) 0.33 0.9

(0.5-1.7) 0.28-0.455 8 C.1197T/C (rs709816) p.Asp399Asp Exon 10 Controls (72) 0.313 34 (34.03) 31 (30.94) 7 (7.03) 0.99

0.9 (0.5-1.7) 0.28-0.455

9 C.2016A/G (rsl 061302) p.Pro672Pro Exon 13 Cases (97) 0.284 52 (49.80) 35 (39.41) 10(7.80) 0.27 0.8

(0.4-2.2) 0.2835 9 C.2016A/G (rsl 061302) p.Pro672Pro Exon 13 Controls (70) 0.300 34 (34.30) 30 (29.40) 6 (6.30) 0.86

0.8 (0.4-2.2) 0.2835

According to the nomenclature guidelines of the Human Genome Variation Society (reference sequence NM002485.4), nucleotide number one being the A from the ATG codon. Minor allele frequency, equilibrium. 4Odds ratios for comparison of hétérozygotes versus common homozygotes, in NCBI dbSNP database, although reported in the literature.

As expected under Hardy-Weinberg 5 From NCBI dbSNP data. 6 No entry

167

Table 3. Promoter and intronic variations of the NBN gene îealthy controls.

in French Canadian breast cancer cases and

Table 3 Promoter and intronic sequence variations of the NBN gene in French Canadian breast cancer cases and healthy controls.

SNP SNP ID1

(dbSNP ID) Location Series (No.) MAF2

Common homozygote

No. (expected)3

Hétérozygote No.

(expected)3

Rare homozygote

No. (expected)3

HWE P-

value OR (95%

CI)4

Reported MAF in

Caucasian 10 c.-110-242delAGTA

(rs36226237) Promoter Cases (97) 0.082 81 (81.66) 16(14.68) 0 (0.66) 0.38 3.4

(1.1-10.5) 10 c.-110-242delAGTA

(rs36226237) Promoter

Controls (72) 0.028 68 (68.06) 4(3.89) 0 (0.06) 0.81 3.4

(1.1-10.5) 11 C.702+149T/C

(rs3026271) Intron 6 Cases (97) 0.082 83(81.66) 12(14.68) 2 (0.66) 0.07 0.7

(0.3-1.6) 0.108-0.1175 11 C.702+149T/C

(rs3026271) Intron 6

Controls (73) 0.089 60 (60.58) 13(11.84) 0 (0.58) 0.40 0.7

(0.3-1.6) 0.108-0.1175

12 C.703-29C/T (NA)6

Intron 6 Cases (97) 0.015 94 (94.02) 3 (2.95) 0 (0.02) 0.88 1.1 (0.2-7.0)

0.021' 12 C.703-29C/T (NA)6

Intron 6 Controls (73) 0.014 71 (71.01) 2(1.97) 0(0.01) 0.91

1.1 (0.2-7.0)

0.021'

13 C.703-18G/A (rs769418)

Intron 6 Cases (97) 0.026 92 (92.06) 5 (4.87) 0 (0.06) 0.79 3.9 (0.4-34.2)

13 C.703-18G/A (rs769418)

Intron 6 Controls (73) 0.007 72 (72.00) 1 (0.99) 0(0) 0.95

3.9 (0.4-34.2)

14 C.896+36G/A (rsl 805826)

Intron 7 Cases (97) 0.026 92 (92.06) 5 (4.87) 0 (0.06) 0.79 3.9 (0.4-34.2)

0.021-0.055 14 C.896+36G/A (rsl 805826)

Intron 7 Controls (73) 0.007 72 (72.00) 1 (0.99) 0(0) 0.95

3.9 (0.4-34.2)

0.021-0.055

15 C.897-42G/C (NA)6

Intron 7 Cases (97) 0.015 94 (94.02) 3 (2.95) 0 (0.02) 0.76 0.4 (0.1-1.9)

15 C.897-42G/C (NA)6

Intron 7 Controls (73) 0.034 68 (68.09) 5 (4.83) 0 (0.09) 0.76

0.4 (0.1-1.9)

16 C.994+233G/A (rs6990969)

Intron 8 Cases (97) 0.294 50 (48.37) 37 (40.25) 10(8.37) 0.43 0.7 (0.4-1.4)

0.285 16 C.994+233G/A (rs6990969)

Intron 8 Controls (74) 0.311 34(35.15) 34(31.70) 6(7.15) 0.53

0.7 (0.4-1.4)

0.285

17 C.1124+18C/T (rs2234744)

Intron 9 Cases (97) 0.278 52 (50.52) 36 (38.97) 9 (7.52) 0.45 0.7 (0.4-1.4)

0.09-0.3065 17 C.1124+18C/T (rs2234744)

Intron 9 Controls (74) 0.304 35 (35.84) 33(31.32) 6 (6.84) 0.64

0.7 (0.4-1.4)

0.09-0.3065

18 C.1124+91C/A (rsl 805818)

Intron 9 Cases (97) 0.273 53(51.24) 35 (38.52) 9 (7.24) 0.37 0.7 (0.4-1.3)

0.283-0.3065 18 C.1124+91C/A (rsl 805818)

Intron 9 Controls (74) 0.304 35 (35.84) 33(31.32) 6 (6.84) 0.64

0.7 (0.4-1.3)

0.283-0.3065

19 C.1125-79C/A (rsl 805786)

Intron 9 Cases (97) 0.284 52 (49.80) 35(39.41) 10(7.80) 0.27 0.8 (0.4-1.5)

0.3235 19 C.1125-79C/A (rsl 805786)

Intron 9 Controls (72) 0.292 36(36.13) 30 (29.75) 6(6.13) 0.94

0.8 (0.4-1.5)

0.3235

20 C.1915-7A/G (rs2308962)

Intron 12 Cases (97) 0.284 52 (49.80) 35(39.41) 10(7.80) 0.27 0.8 (0.4-1.5)

0.20-0.3125 20 C.1915-7A/G (rs2308962)

Intron 12 Controls (70) 0.300 34 (34.30) 30 (29.40) 6 (6.30) 0.86

0.8 (0.4-1.5)

0.20-0.3125

21 C.2071-30A/T (rs3736639)

Intron 13 Cases (97) 0.284 52 (49.80) 35(39.41) 10(7.80) 0.27 0.7 (0.4-1.3)

21 C.2071-30A/T (rs3736639)

Intron 13 Controls (71) 0.310 33 (33.82) 32 (30.37) 6 (6.82) 0.65

0.7 (0.4-1.3)

22 C.2234+86T/G (NA)

Intron 15 Cases (97) 0.010 95 (95.01) 2(1.98) 0(0.01) 0.92 3.8 (0.2-80.3)

22 C.2234+86T/G (NA)

Intron 15 Controls (72) 0.000 72 (72.00) 0(0) 0(0) 1.00

3.8 (0.2-80.3)

23 C.2234+88C/G (rsl 3312970)

Intron 15 Cases (97) 0.015 94 (94.02) 3 (2.95) 0 (0.02) 0.88 0.4 (0.1-1.8)

0.017-0.0425 23 C.2234+88C/G (rsl 3312970)

Intron 15 Controls (71) 0.035 66 (66.09) 5(4.82) 0 (0.09) 0.76

0.4 (0.1-1.8)

0.017-0.0425

24

I .

C.2234+157A/G (rs!3312971)

Intron 15 Cases (97) 0.046 88(88.21) 9(8.58) 0(0.21) 0.63 2.3 (0.6-8.9)

0.000-0.0255 24

I .

C.2234+157A/G (rs!3312971)

Intron 15 Controls (71) 0.021 68 (68.03) 3 (2.94) 0 (0.03) 0.86

2.3 (0.6-8.9)

0.000-0.0255

nucleotide number one being the A from the ATG codon. Minor allele frequency As expected under Hardy-Weinberg equilibrium 4Odds ratios for comparison of hétérozygotes versus common homozygotes 5From NCBI dbSNP data. 6No entry in NCBI dbSNP database, although reported in the literature.

168

Table 4. Estimated haplotypes using the Whap program and all variants identified, for cases and controls combined. Table 4 Estimated haplotypes using the WHAP program and all variants identified, for combined.

cases and controls

SNPs1

10-1-2-3-4-5-6-11-12-13-7-14-15-16-17-18-19-8-20-9-21-22-23-24

Estimated Haplotype Frequencies

Haplotype

SNPs1

10-1-2-3-4-5-6-11-12-13-7-14-15-16-17-18-19-8-20-9-21-22-23-24 Cases Controls Combined p-value2

1 TGGTAGCTCGCGGGCCCTAAATCA 0.481 0.486 0.483 0.92 2 TAGTACCTCGCGGATAACGGTTCA 0.232 0.255 0.244 0.636 3 TGGTAGCCCGCGGGCCCTAAATCA 0.065 0.097 0.078 0.29 4 AGGTAGCTCGCGGGCCCTAAATCA 0.089 0.030 0.052 0.0205 5 TAGTAGCTCGCGGATAACGGTTCA 0.036 0.007 0.022 0.147 6 TGGTAGCTCGCGCGCCCTAAATCA 0.012 0.036 0.021 0.146 7 TAGTACCTCGCGGATAACGGTTGA 0.006 0.037 0.019 0.0403 8 TGGTAGCTCGCGGGCCCTAAATCG 0.019 0.022 0.015 0.846 9 TGGTAGCTCACAGGCCCCAAATCA 0.013 0.000 0.011 0.11 10 TGGTACCTCGCGGGCCCTAAATCA 0.012 0.008 0.010 0.749 11 TGGTAGCTTGCGGGCCCTAAATCA 0.006 0.014 0.008 0.47 12 TGGTAGCTCGCGGACCCTAAATCA 0.006 0.007 0.006 0.897 13 TGGTAGCTTGCGGGCCCTAAATCG 0.011 0.000 0.006 0.126 14 TGGTAGCTCACAGGCCCCAAATCG

. • / - . . . r • -*n . ._ -, _ j -> 2 a _ 0.011 0.008 0.006 0.128

all other haplotypes.

169

Table 5. Estimated haplotypes using the WHAP program and SNPs with a frequency greater than 5% for cases and controls combined.

Table 5 Estimated haplotypes using the WHAP program and SNPs with a frequency greater than 5% for cases and controls combined.

Haplotype SNPs1

10-1-5-11-16-17-18-19-8-20-9-21 Estimated Haplotype Frequencies

Cases Controls Combined p-value OR (95%CI) WH1 TGGTGCCCTAAA 0.511 0.558 0.538 0.361 REF WH2 TACTATAACGGT 0.250 0.293 0.264 0.399 0.9(0.6-1.6) WH3 TGGCGCCCTAAA 0.065 0.096 0.080 0.277 0.7(0.3-1.7) WH4 AGGTGCCCTAAA 0.087 0.030 0.059 0.0227 3.2(1.1-9.2) WH5 TGGTGCCCCAAA 0.038 0.008 0.027 0.0883 5.1 (0.9-30.1) WH6 TAGTATAACGGT 0.033 0.007 0.021 0.176 7.8(0.8-30.5) WH7 TGCTGCCCTAAA 0.017 0.008 0.011 0.542 2.4(0.3-16.1)

SNPs identification as in Table 2 and 3. haplotypes.

p-value for haplotype-specific test, each haplotype versus all other

170

Figure 1. Schematic representation of the NBN gene on chromosome 8q21.

171

Figure 2. In silico analysis of the effect of coding variants on putative exonic splicing enhancer (ESE) motifs by the ESEfinder program.

«JH

3,5

SRs-55

2,3 :SF2MSF

I J

0,5

-0.5

CJMSS» C.583GC C.W3OT C.6430T C.787OT c.7»7C<T c.t197T.C

i MGORMMMI **qtn*ic* WMMMWI s*qu*nc* :

172

Figure 3. Effect of the c.-242-1 lOdelAGTA deletion on NBN promoter activity.

Figure 3

A

Reference sequence: <--

NUil Tl-f ***<<>; A(*f;A*Af-TAfATJ^ |-|^^QJ«|J^ |---ATTTT*a\Tr-t ATTTA ATT A A A A ArTTT-r*TT A

c.-242-110delAGTA:

TUCAAAC titAtliA-L-it"! ACAT AACTlXjT ATTTT AATCXlATTTAArrAAAAATrTrtTTIA

TCXJTAAUTATrrTA

NBN promoter -tl -110 2

NBN promoter

TOUTA TTTTA

fc± Luciftrasc )—

LucJfttwc r—

90,0

«0,0

I MCr-7 UcU MEK293 LNCJP

Constructs I pGL3-ha«ic BN9N promoter NBN r.-J-1?-11CdslACTA

173

Figure 4. Linkage disequilibrium across the NBN gene and neighbouring chromosome region.

|D'|

0 S | O | < 0 3 < |D S.7 S |D'

03 <i.7 «1.0

c-242 )lMaH.U.lA C.102UA . : *»< . v c « l l i a. *1 ! VC. cSSXVC CAOCT

H . H I 0 M S I * C.70M1CT c.- i .VlK. \

c/TTTC/T t .»»**J«. \ tirr-oc^t

C.9M+233U/A UDOHSCff c.H24<*»ltVA C-1125-TK.A

tiim/t" C.IM5-TA/C

c .2» l * \ ( . a-2»-l -JSVI

c22J4-06TX. C-22JM<Mt <.

C J J J U ' I S T A * .

1 . . 1 . . 1 ^

1 ■■■■■

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0 ï r < C 3 U S I > « S J 0 7 S r * « l . O

DISCUSSION ET CONCLUSION 5 Le taux de cancer, dont le cancer du sein, est en hausse dans la population mondiale. Avec

l'accroissement de l'espérance de vie, les changements importants des habitudes de vie et

un environnement en constante évolution, le corps humain réagit et s'adapte dans la mesure

de ses capacités et de ses limites. Il est de plus en plus clair qu'il existe un éventail de

susceptibilité dans la population, avec un sous groupe d'individus présentant une

susceptibilité marquée à développer un cancer du sein alors que d'autres individus

démontreront une résistance accrue.244"245 Comprendre la contribution génétique et les

déterminants héréditaires de la maladie est essentiel, le cancer du sein entraînant un fardeau

émotionnel, social et économique important pour les individus, les familles et les sociétés

atteintes. Par contre, il est aussi présentement clair que cette tâche est particulièrement

ardue puisque la susceptibilité d'un individu à développer le cancer du sein est tributaire de

facteurs génétiques et environnementaux variables, et de leur interrelation. Jusqu'à présent,

les alleles de susceptibilité connus n'expliqueraient qu'environ 30% des cas observés.38

Dans cette thèse, nous avons tenté d'évaluer la contribution de facteurs génétiques sur le

développement de cancer du sein dans une cohorte de familles à risque élevé de la

population canadienne française, enrichie pour des facteurs génétiques de

susceptibilité240,471, par une approche de type gènes candidats. Ceux-ci ont été sélectionnés

sur la base d'une interaction protéique (directe ou indirecte) dans la cellule avec le produit

de l'un ou des deux principaux gènes de susceptibilité au cancer du sein connus, BRCAl et

BRCA2. Trois gènes candidats ont été analysés, dont les résultats ont été présentés dans les

chapitres précédents. Ces études ont permis de mettre en évidence des variants spécifiques

associés à une modulation du risque dans notre cohorte de femmes canadiennes françaises.

1. CHAPITRE I : Analyse du gène ZNF350/ZBRK1 Au chapitre I, nous avons re-séquencé le gène ZNF350/ZBRK1 agissant comme médiateur

de certaines activités de répression transcriptionnelle de BRCAl. Il a été démontré que

BRCAl est impliquée dans la régulation de certaines cibles jouant un rôle clair dans

l'étiologie du cancer du sein (telles p53 et ER-a).291"297 L'interaction directe entre les

protéines ZNF350/ZBRK1 et BRCAl306"307, et le rôle de ce dimère dans la répression de

175

cibles de BRCAl par l'intermédiaire de doigts de zinc reconnaissant une séquence

spécifique en fait un candidat très intéressant dans le contexte d'une recherche de nouveaux

gènes de susceptibilité. En plus de jouer un rôle dans la régulation de l'expression de

GADD45A et de CDKNlA/p21 impliqués dans le cycle cellulaire, l'association de BRCAl

et de ZNF350/ZBRK1 serait associée à une variation de l'expression d'ANGPTl

(Angiopoietin 1) impliqué dans l'angiogenèse.473 De plus, il a été démontré récemment que

le complexe BRCAl/ZNF350/CtIP réprime de façon spécifique le promoteur de HMGA2

(High mobility group AT-hook 2). La perte de cette répression résulte en une prolifération

accrue, une croissance ancrage-indépendante sur support d'agar et une augmentation de la

taille des acini produits en culture tridimensionnelle à partir de cellules de sein MCF10A.29'

Une autre étude récente suggère que ZNF350/ZBRK1 serait aussi responsable de la

répression du gène métastatique MMP9 (Matrix metallopeptidase 9), et la perte

d'expression de ZNF350/ZBRK1 dans des spécimens de cancers du col de l'utérus est

corrélée avec une expression élevée de MMP9.474

Notre investigation de ZNF350/ZBRK1 a permis dévaluer la distribution de 18 variants de

séquence répartis dans les régions codantes ainsi que les régions introniques flanquantes.

Une fois phases à l'aide d'outils bioinformatiques, les variants codants (ainsi que le premier

variant en 3' UTR) sont distribués sur un ensemble de 20 haplotypes. Parmi ceux-ci, les 5

haplotypes les plus fréquents représentent 89% de la variabilité haplotypique de notre

population. Cette analyse a fait ressortir 3 haplotypes représentés de façon différentielle

entre le groupe de femmes atteintes de cancer du sein par opposition aux haplotypes du

même gène dans un groupe de sujets sains, eux aussi de la population canadienne française.

L'effet le plus important a été observé avec l'haplotype H13 et qui est associé dans notre

cohorte à un risque estimé d'environ 6,8. Deux autres haplotypes sont présents uniquement

dans notre population d'individus sains (H8 et H16) et seraient par conséquent associés à

un effet protecteur.

Bien que ce résultat semble suggérer une contribution relativement importante de

ZNF350/ZBRK1 dans la susceptibilité au cancer du sein, il est à noter que l'analyse de ce

gène dans d'autres cohortes relativement petites s'est conclue jusqu'à présent avec des

176

résultats mitigés. L'analyse des niveaux d'ARNm de ZNF350/ZBRK1 chez 61 cas de

cancer du sein non sélectionnés sur la base de l'histoire familiale indique que

ZNF350/ZBRK1 tend à être sous exprimé dans une forte proportion de tumeurs, bien que

cette sous expression ne puisse être associée à des caractéristiques phénotypiques des

tumeurs. L'altération de l'expression de ZNF350/ZBRK1 semble être corrélée de façon

significative avec les polymorphismes p.Cys236Cys et p.Arg501Ser, et les ARNm porteurs

de ces variants démontrent une baisse d'expression dans cette étude.325 Cette tendance de

ZNF350/ZBRK1 à être sous exprimé a aussi été observée dans des tumeurs colorectales.326

De façon intéressante, le polymorphisme p.Arg501Ser a aussi été associé à une diminution

du risque de cancer de la vessie327, et est retrouvé dans notre haplotype protecteur H8. Il a

de plus été suggéré que le polymorphisme p.Asp35Asp de ZNF350/ZBRK1 pourrait être

associé à une augmentation du risque de cancer du sein chez les porteurs du variant de

BRCAl p.Pro871Leu dans la population chinoise.324 L'analyse du variant rs2278414, situé

dans le 3'UTR de ZNF350/ZBRK1, dans la population juive ashkénaze a démontré une

association avec l'apparition du cancer chez les porteurs de mutations de BRCA2, ce qui

pourrait suggérer un rôle de gène modificateur.328

Même si l'effet observé dans notre étude peut difficilement être lié aux variants directement

présents sur les haplotypes mesurés, notre étude a aussi permis de déterminer que ce gène

est présent sur un large bloc de déséquilibre de liaison dans cette région du chromosome

19. Cette région porte plusieurs protéines à doigts de zinc, un motif retrouvé dans les

protéines liant l'ADN, et dont les cibles sont mal caractérisées. Il est par conséquent

possible que l'association retrouvée ici reflète l'effet d'autres variants en déséquilibre de

liaison avec ceux du gène. En ce sens, des analyses préliminaires effectuées dans notre

laboratoire sur les individus de notre cohorte a permis de mettre en évidence certains

variants du promoteur de ZNF350/ZBRK1. Une fois phases, certains de ces variants sont

associés à un haplotype induisant une hausse de l'expression lors d'essais luciférases

comparée à l'haplotype sauvage. Si ces variants étaient associés à la perte/gain de motifs

fonctionnels du promoteur, ceci pourrait par conséquent jeter un éclairage nouveau sur

l'effet observé lors de notre étude des variants de ZNF350/ZBRK1. De plus, une étude

récente ciblant les variants de PPP2R1A a mis en évidence un haplotype de risque et un

177

haplotype protecteur qui pourraient moduler le risque de cancer du sein.475 PPP2R1A

pourrait aussi agir en tant que gène de modification chez des femmes atteintes de maladies

prolifératives bénignes du sein, un facteur de risque de cancer.475 Tel que mentionné

précédemment au chapitre I, PPP2R1A réside en dehors du bloc de déséquilibre de liaison

sur lequel est retrouvé ZNF350/ZBRK1. Il est cependant possible que dans une population

fondatrice comme la population canadienne française, le déséquilibre de liaison soit plus

important que ce qui est retrouvé dans d'autres groupes caucasiens et qui constitue les

données représentées par le projet HapMap.

2. CHAPITRE II : Investigation du gène GADD45A Le chapitre II concerne l'étude d'un second gène candidat, GADD45A, qui est l'une des

cibles de la régulation transcriptionnelle par le complexe BRCA1-ZNF350/ZBRK1.

GADD45A est impliqué dans la stabilité génomique par ses rôles dans le contrôle de la

transition G2/M du cycle cellulaire, l'induction de l'apoptose et la réparation de l'ADN.299" 303 Des études récentes suggèrent aussi que GADD45A pourrait être impliqué dans la

déméthylation de certaines séquences d'ADN par un mécanisme impliquant la voie NER de

réparation de l'ADN.476"477 Tel qu'illustré dans l'introduction, le lien étroit avec BRCAl, la

régulation par une autre protéine impliquée dans de nombreux événements du

développement tumorigénique (p53) et son action au sein du cycle cellulaire, fait du gène

GADD45A un candidat pertinent dans le contexte de notre recherche. GADD45A est présent

sur une région chromosomique qui est fréquemment l'objet d'une perte d'hétérozygosité

dans les tumeurs du sein.478 De plus, GADD45A est faiblement exprimé dans l'épithélium

mammaire humain normal, mais est fortement induit par un large éventail de stress

cellulaires et d'agents induisant des dommages à l'ADN.312"314 Chez la souris, l'inactivation

de Gadd45A résulte en une augmentation de la tumorigénèse et de l'instabilité

chromosomique, ainsi que des problèmes d'auto-immunité.303"305

La variation interindividuelle de ce gène a été évaluée dans notre cohorte par re-séquençage

des portions codantes et des séquences introniques flanquantes. De plus, les deux régions

introniques où se situent les motifs de liaison des protéines p53 et BRCAl -

ZNF350/ZBRK1 ont aussi fait l'objet de re-séquençage. Aucune mutation clairement

178

délétère, pouvant induire un codon d'arrêt prématuré ou un épissage aberrant de l'ARNm,

n'a été identifiée dans la séquence de GADD45A dans notre cohorte. Par contre, 12 variants

de séquence ont été répertoriés et la reconstruction bioinformatique des haplotypes à partir

de ces variants a permis d'identifier un haplotype fréquent qui pourrait être associé à un

effet protecteur.

Quoique les rôles cellulaires connus de GADD45A en fassent un candidat attrayant pour des

études visant la découverte de gènes impliqués dans la modulation du risque de développer

un cancer du sein, notre étude laisse entendre que la contribution de GADD45A au risque de

cancer serait minimale. Les études précédentes investiguant le rôle potentiel de variants de

GADD45A dans la susceptibilité au cancer, en particulier au cancer du sein, demeurent

équivoques. Il est clair que GADD45A, tout comme GADD45B et GADD45G, serait une

cible fréquemment inactivée lors de la tumorigénèse.479 Des études suggèrent que

l'expression de GADD45A serait réduite dans les cas de cancer du sein et de la prostate

suite à la méthylation de son promoteur.480"483 Cependant, les études génétiques semblent

indiquer que GADD45A ne serait pas fréquemment muté dans les cas de cancers. L'étude

de mutation de GADD45A dans des lignées cellulaires de sein ou des tumeurs primaires n'a

pas permis de mettre en évidence des mutations qui pourraient être impliquées dans

l'étiologie de ce cancer.321"323

Malgré cela, notre étude a été à notre connaissance la première à investiguer les variations

de séquence germinales de GADD45A. Une seconde étude dans la population chinoise,

publiée récemment, a étudié le gène GADD45A dans une cohorte de cas de cancers du sein

sporadiques, ainsi que chez des cas familiaux non reliés à des mutations de BRCAl ou

BRCA2. Leur étude suggère que certains variants et haplotypes de GADD45A pourraient

être associés avec un effet protecteur dans cette population, chez les cas sporadiques.484 Les

variants, et par conséquent les haplotypes, identifiés dans cette étude ne sont pas l'exacte

réplique de ce qui a été identifié dans notre population, et par conséquent la comparaison

directe de ceux-ci est difficile. Par contre, il est intéressant de noter que l'un des haplotypes

associé à un effet protecteur dans leur cohorte porte 3 variants aussi retrouvés dans

l'haplotype protecteur identifié dans notre population.484

179

3. CHAPITRE III : Étude du gène NBN Les résultats du re-séquençage du gène NBN sont présentés au chapitre III. Plusieurs

évidences lient le cancer et NBN. En effet, il est reconnu que les individus atteints de NBS

(par conséquent porteurs homozygotes de mutations de NBN) présentent un risque

important de développer plusieurs types de lymphomes et tumeurs solides malgré leur

jeune âge.362'369 Ceci peut s'expliquer par le rôle de la nibrine dans les processus de

détection des dommages à l'ADN, de leur réparation et son implication dans certains

aspects de la régulation du cycle cellulaire.348'350 De plus, dans le cadre de certaines de ses

fonctions, la nibrine interagit directement avec BRCAl352"355, ce qui en fait un gène

candidat intéressant dans le cadre de notre étude.

Des études épidémiologiques conduites au sein des familles de patients atteints de NBS a

aussi suggéré un risque accru de cancers chez les porteurs hétérozygotes d'une mutation de

NBN.312 Il est à noter que le NBS est présent de façon plus fréquente dans les populations

d'ascendance slave, dû à la transmission d'une mutation fondatrice au sein de ces

populations.373 L'hypothèse actuelle suggère que seules certaines mutations permettant

l'expression d'une protéine résiduelle, donc hypomorphiques, permettrait la survie

cellulaire. La contribution de cette mutation au risque de cancer demeure controversée, bien

que les évidences d'une association semblent plus fortes dans les populations d'ascendance

slave.374 Dans le cas du cancer du sein, le risque (OR) est généralement estimé à environ

3 , bien qu'une association positive ne soit pas observée dans toutes les études. " La

contribution de certains variants de NBN, autres que la mutation slave, a aussi été étudiée.

Le variant p.Arg215Trp a été associé à une diminution des niveaux cellulaires de nibrine375,

et a été décrit à l'état hétérozygote composé (avec 657del5) chez deux frères atteints d'une

forme particulièrement sévère du NBS.380 Bien qu'il a été suggéré que ce variant pourrait

perturber la liaison de la nibrine à l'histone y-H2AX , une méta-analyse de p.Arg215Trp

en relation avec le cancer du sein ne semble pas suggérer une association (OR 1,9 ; 95% IC

0,8-4,6).375 En plus de ces deux variants de séquence, p.Ilel71Val a aussi été associé à un

risque accru de cancer du sein, bien que cette association soit controversée.382'383

180

La contribution potentielle de mutations et/ou de variations du gène NBN a été évaluée dans

notre cohorte de femmes atteintes de cancer du sein, permettant d'identifier 24 variants de

séquence dans la séquence codante, les régions introniques flanquantes ainsi que le

promoteur proximal (500pb). Parmi ceux-ci, le variant p.Ilel71Val a été retrouvé chez une

femme atteinte et n'est pas présent chez les individus sains génotypes, incluant un individu

de la même famille. Bien que ce résultat concorde avec un risque associé à ce variant, la

taille de notre échantillon ne permet par d'émettre une conclusion définitive. Cependant,

puisque ce variant n'a été retrouvé que chez une femme atteinte sur les 97 individus de

notre cohorte de cas génotypes, il est peu probable que pIlel71Val soit responsable d'une

contribution importante à la susceptibilité au cancer du sein dans notre population. Quant

au variant p.Arg215Trp, notre étude n'a pas permis de l'associer à un risque accru de

cancer puisqu'il a été retrouvé à la fois chez l'une de nos femmes atteintes de cancer et

chez un individu sain.

Notre analyse de NBN a par contre permis d'identifier une deletion dans le promoteur

proximal du gène présentant une variation de fréquence notable entre les cas étudiés et les

individus sains. Des analyses fonctionnelles, par essai luciférase mesurant l'activité du

promoteur de type sauvage comparée à celle du promoteur portant la deletion, a permis de

démontrer la présence d'une variation de l'expression dans une lignée de cancer de la

prostate et une lignée de rein embryonnaire. Par contre, aucun effet n'a été observé dans la

lignée de cancer du sein MCF-7. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer

ce phénomène, tel un effet dépendant du type cellulaire ou bien d'un stress cellulaire tel les

dommages à l'ADN. Il est aussi possible que le variant c.-242-l lOdelAGTA puisse être en

déséquilibre de liaison avec un autre variant dans une portion de séquence non génotype,

qui serait responsable de l'effet observé dans notre cohorte. En ce sens, notre étude montre

aussi que NBN chevauche deux blocs de déséquilibre de liaison, dont un bloc important en

5' du gène. Il est par contre clair que nos analyses ne permettent pas pour l'instant de tirer

une conclusion définitive à cet égard.

Notre étude du gène NBN suggère que des variations de ce gène sont présentes, bien qu'à

une fréquence faible, dans la population canadienne française. Depuis notre analyse,

181

plusieurs études se sont attardées à la contribution de variants de séquence de NBN dans la

susceptibilité au cancer, en particulier le variant fréquent p.Glul85Gln situé dans la région

d'interaction avec BRCAl. Ce variant a été évalué dans le contexte du cancer du sein dans

plusieurs études, avec des résultats variables. Récemment, une méta-analyse des études

publiées analysant l'apport potentiel de ce variant à la susceptibilité au cancer du sein

semble suggérer un effet protecteur de p.Glul85Gln sur le risque (CC vs GG : 0,75 95% IC

0,74-0,98).384 Une seconde méta-analyse, celle-ci regroupant plus de 9000 patients et 10000

contrôles, s'est attardée au risque associé à p.Glul85Gln sur le risque de cancer en général

et semble suggérer une faible augmentation du risque, en particulier chez les caucasiens.485

L'analyse de p.Glul85Gln a aussi été associée à une augmentation du risque de cancer de

l'ovaire chez les porteurs de mutations de BRCAl et de cancer de la vessie chez les

fumeurs.486"487

4. L'approche gène candidat dans la population canadienne française : considérations méthodologiques Il existe plusieurs stratégies pouvant mener à l'identification de gènes de susceptibilité au

cancer du sein. Des études de liaison génétiques au sein de familles présentant de très fortes

évidences de la transmission de facteurs héréditaires ont permis par le passé de mettre en

évidence des gènes porteurs de mutations rares, mais fortement pénétrantes. Après un

succès initial, cette stratégie s'est avérée infructueuse au cours des 15 dernières années.

Ceci suggère que si de tels alleles demeurent à être identifiés, leur contribution au risque de

cancer du sein sera minimale. Une autre stratégie, employée au cours des trois dernières

années, a consisté en des études d'association génomiques sur plusieurs milliers de cas et

de contrôles. Ces études ont permis d'identifier des variants très fréquents associés à une

faible modulation du risque encouru. De telles études permettent d'interroger des centaines

de milliers de variants génétiques sans nécessiter une connaissance préalable de la fonction

des gènes étudiés. Cependant, leurs grandes envergures nécessitent des ressources

importantes et le regroupement de plusieurs cohortes de patients. Une troisième stratégie,

privilégiée dans les études présentées dans cette thèse, consiste à effectuer l'étude

systématique de gènes candidats sélectionnés sur la base de leur plausibilité préalable dans

les mécanismes de la carcinogenèse.

182

L'approche vise à identifier des variants rares (i.e fréquence de l'allèle mineur inférieure à

5%) modérément pénétrants, qui ne pourraient pas être identifiés par une étude

d'association de type « tour de génome » dû à leur fréquence trop basse. De plus, l'effet de

ce type de variants est souvent population-spécifique. Il est influencé par des

caractéristiques spécifiques à l'historique des populations (par exemple une dérive

génétique, ou un effet fondateur) et requiert l'utilisation d'une population unique. C'est

pourquoi nous avons par conséquent tiré parti ici des avantages reliés à la fois à la cohorte

de femmes atteintes de cancer du sein et présentant une forte susceptibilité génétique

recrutée par les Drs Durocher et Simard, ainsi qu'à l'effet fondateur retrouvé dans la

population canadienne française. Tel que mentionné à la section 2.3 Modèles de la

susceptibilité génétique au cancer du sein, l'utilisation de cas familiaux permet

d'augmenter le pouvoir de notre étude puisque les alleles de susceptibilité recherchés sont

en théorie plus fréquents dans les cas de cancer du sein familiaux comparés à des cas tirés

de la population. De la même façon, la population canadienne française présente un effet

fondateur qui peut permettre l'identification de mutations fondatrices présentant une

prévalence plus élevée et offre aussi l'avantage d'une « toile » génétique plus homogène

(voir la section 5.1 Familles à risque élevé de la population canadienne française).

Certaines limitations sont aussi associées à la méthode employée. Dans un premier temps,

l'aproche gène candidat cible des gènes ou une voie cellulaire en particulier (réparation de

l'ADN, le contrôle du cycle cellulaire, le métabolisme des hormones, etc) et ce choix est

directement tributaire de nos connaissances de la biologie du cancer. Dans cette

perspective, il est intéressant de noter que peu des alleles de faible penetrance identifiés par

tour de génome sont situés dans des régions (ou des gènes candidats) ciblés antérieurement,

bien qu'en rétrospective certains des gènes identifiés présentent un lien biologique avec le

cancer du sein (par exemple FGFR2). Il est possible qu'avec l'avancement des

connaissances et l'intégration des données par des méthodes d'identification de gènes

candidats bioinformatiques permettant l'intégration d'une quantité phénoménale

d'information, des candidats inattendus par les méthodes traditionnelles emmergent. Dans

un second temps, le groupe contrôle employé présente certaines limites. Bien que les

183

femmes génotypées aient été en bonne santé au moment de leur recrutement, il demeure

possible qu'elles développent un cancer du sein plus tard au cours de leur vie.

5. Conclusions et perspectives Bien que notre étude ait permis de mettre en évidence des variants et/ou haplotypes

pouvant moduler le risque de cancer du sein (à la fois de façon positive et négative) dans la

population canadienne française, bien du chemin reste à faire. Il est clair que les

associations décrites dans cette thèse sont très intéressantes bien que préliminaires et

demeurent à être confirmées dans des études plus approfondies dans de plus grandes

cohortes et d'autres populations. De plus, il demeure pour l'instant difficile de comprendre

les bases moléculaires pouvant expliquer l'effet de plusieurs des variants pour lesquels une

association a été observée. Dans cette optique, d'autres études sont nécessaires. Puisqu'une

large part de l'effet observé dans les analyses présentées ici semble se situer dans la région

5' des gènes, un examen plus détaillé des régions promotrices semble justifié (identification

de variants par re-séquençage, essais fonctionnels de type luciférase et/ou de liaison de

facteurs de transcription). Alternativement et tel que mentionné au sein des chapitres

précédents, il demeure possible que l'effet observé soit attribuable à des variants en

déséquilibre de liaison avec ceux identifiés ici. L'analyse des régions en déséquilibre de

liaison et des gènes qui y sont retrouvés constitue par conséquent une avenue qui doit être

envisagée.

Avec l'étude de la structure du génome humain, nous réalisons peu à peu la complexité de

son architecture. Plusieurs variations structurales et éléments cryptiques (variations du

nombre de copies, rearrangements complexes, expansions nucléotidiques, microARNs)

pourraient aussi avoir leur rôle à jouer dans la susceptibilité d'un individu à développer une

maladie complexe comme le cancer. Bien que les études gène candidat actuelles aient été

concentrées sur le re-séquençage d'un nombre limité de candidats, l'avenue de technologies

de très haut débit permet maintenant l'analyse d'exomes ou génomes complets, ce qui

pourrait permettre l'identification de nouvelles cibles des processus tumorigéniques. Une

approche combinée incluant des méthodes génomiques et de gènes candidats ainsi que des

idées novatrices sera nécessaire afin de relever le défi que représente la compréhension de

184

cette maladie complexe. Il est clair que beaucoup de chemin reste à faire dans

l'identification des facteurs de susceptibilité au cancer du sein, avec pour but ultime une

compréhension détaillée de sa pathologie, de meilleures stratégies de prévention et

l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

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Analyse de gènes candidats au cancer du sein impliqués ...

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