Struktur Penjelasan dari Toksin Baru dari rubellus Jamur Cortinarius Menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)

1. PendahuluanManusia telah dikenal oleh keracunan jamur beracun dari tahap awal peradaban. Daya tarik dari jamur sebagai makanan bergizi lezat telah diketahui humanoids mulai dari kera humanoid. Pengelompokan Nonbotanical hanya mengklasifikasikan jamur sebagai dimakan, nonedi-ble, dan beracun [5]. Dalam Kekaisaran Romawi, beracun bubur-kamar menjadi alat politik dan digunakan untuk as-sassination politisi sangat peringkat termasuk beberapa imperators. Mithradates VI (Yunani: ά ς), Raja Pontus dikenal karena penggunaan yang luas dari jamur beracun untuk meracuni dan sebagai penangkal [5]. Dalam Kekaisaran Romawi, budak-koki diwajibkan untuk makan makanan yang mengandung jamur satu hari menjelang imper-ator-jika budak-cook adalah baik satu hari setelah, makanan dihidangkan untuk imperator tersebut Namun, bahkan ini precau-tion tidak bisa menyelamatkan kehidupan imperator jika. orellanus atau C. rubellus dibaringkan di atas meja sebagai bagian dari makanan, karena periode laten antara konsumsi jamur ini dan munculnya pertama gejala-gejala keracunan dapat meregang hingga dua atau tiga minggu [2-6]intoksikasi oleh C. orellanus atau C. rubellus adalah dicirikan oleh hilangnya fungsi ginjal , yang disebut " sindrom orellanus " dengan pe - riod sangat panjang - laten hingga tiga minggu [ 2-6 ] sebelum gagal ginjal , dan sering memperluas kerusakan ginjal yang parah dan kebutuhan untuk pencernadengandialisis , atau bahkan sampai mati sebagai hasilnya . Saat ini, signifikansi dari konsumsi dosis kecil dari jamur beracun tidak jelas , terutama jika jumlah in- gested toksin tidak melebihi tingkat beracun , tapi diulang dalam interval pendek ( dalam satu atau dua hari ) , atau dalam interval waktu yang panjang ( dalam beberapa minggu atau bulan ) . Akankah ginjal pulih dari keracunan atau akan ada gangguan jangka panjang , misalnya selama berbulan-bulan atau bertahun-tahun ? Apakah kerusakan diperbaiki dalam jangka panjang atau akan berulang mengkonsumsi dosis kecil , bahkan selama interval waktu yang panjang , menyebabkan efek kumulatif dan mengakibatkan fungsi gagal ginjal atau bahkan kematian ? Ini bukan hanya pertanyaan akademis , tetapi juga yang lebih praktis karena puing-puing dari C. orellanus atau C. ru - bellus dapat muncul dalam campuran " hutan jamur " disiapkan dan dijual secara komersial . Munculnya peningkatan jumlah pasien dengan gagal ginjal dapat dijelaskan oleh intoksikasi ini atau intoksikasi dengan pestisida seperti paraquat dan Diquat , yang mirip dalam rumus kimia dan dalam gambar mereka keracunan .

Namun, untuk pengetahuan kita , tidak ada diterbitkan menyala - erature yang menggambarkan kehadiran orellanine dalam sampel darah setelah kasus keracunan oleh C. orellanus atau C. rubellus . Uraian tentang adanya orellanine di ginjal setelah kasus keracunan oleh C. orellanus atau C. rubellus diberikan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis ( TLC ) [ 9] , di mana Rohrmoser et al . menyatakan : " Orellanine dapat terdeteksi setelah jangka waktu yang relatif panjang setelah keracunan dengan melakukan lapisan tipis teknik kromatografi sederhana dengan menggunakan sejumlah kecil bahan biopsi ginjal . . Tidak ada racun yang ditemukan dalam air seni atau darah sampel " Dalam laporan

lain , kehadiran orellanine adalah pem-lished tidak langsung : " Dengan pengujian orellanine dalam plasma dan dua biopsi ginjal pasien setelah spesifik foto - dekomposisi menjadi metabolit non - toksik yang disebut orel -line " [ 10 ] . Penentuan ini tidak langsung orellanine dengan menggunakan bukti kehadiran nya orelline produk degradasi memiliki beberapa kelemahan .

1) penentuan kuantitatif tidak didukung oleh tekad yang dinamis dan kuantitatif output dari reaksi yang dilakukan. 2) Tidak ada bukti bahwa zat selain orellanine bukanlah sumber untuk menghasilkan produk "orelline" dalam percobaan ini. 3) Tidak ada bukti bahwa orelline itu absen dalam darah sebelum disebut "degradasi reaksi dengan penyinaran". Dengan kata lain, orelline bisa datang langsung dari jamur itu sendiri. Orelline mungkin hadir dalam basidiocarps jamur sebagai metabolit detik-ondary dan sebagai produk degradasi orella-sembilan. Masalah ini adalah kelemahan terbesar dalam penelitian ini. 4) Argumen bahwa orelline yang dihasilkan sepenuhnya dari reaksi fotodegradasi tidak didukung dalam [10] dan tidak dapat didukung dengan cara ini.

Hal ini dapat menjelaskan ketidakmampuan untuk mendeteksi orellanine - 4 , 4 - diglucopyranoside dalam cairan lambung dalam percobaan yang dijelaskan dalam [ 2-4 ] . Dalam penelitian ini , pendekatan yang lebih berhati-hati untuk analisis cairan lambung diambil oleh op - timizing gas kromatografi - spektrometri massa ( GC - MS ) dengan balok molekul supersonik ( SMB ) . Basidio - carps dari C. rubellus diperiksa untuk kehadiran racun baru / s . Prioritasnya adalah untuk mendeteksi bahan / s yang bisa hadir dalam cairan perut sebagai akibat dari di- gestion C. rubellus dan yang dapat diserap dan diangkut dalam darah ke ginjal . Telah terbukti [ 14-16 ] bahwa semisintetik thermolabile heterosiklik sub - sikap dapat berhasil dianalisis dengan menggunakan GC - MS dengan teknik SMB . Dibandingkan dengan konvensional GC - MS , suhu analisis di GC - MS dengan SMB secara signifikan lebih rendah , waktu analisis tunggal yang lebih pendek , aliran gas dalam kolom kapiler lebih tinggi , dan kontak - bebas fly -through EI teknik sumber ion mencegah kontaminasi . GC - MS dengan SMB tech - nique digunakan untuk merekam ion massa dan untuk merekam gambar fragmentasi rinci . Semua keunggulan ini digunakan untuk penjelasan tentatif struktur rubelline

2.Bahan dan Metode2.1 Biological Material, Standar, dan Ekstrak untuk Pengujian Biologisjamur C. rubellus yang baik yang disediakan oleh Jupiter Ltd, Norwegia dan beku-kering untuk berat konstan seperti yang dijelaskan dalam [4]. Prosedur untuk ekstraksi dan isola-tion racun mereka dilakukan seperti yang dijelaskan dalam [17]. Standar orellanine disumbangkan oleh Jupiter Ltd, Norwegia. Sel Chlamydomonas reinhardtii yang pra-dikupas seperti yang dijelaskan sebelumnya secara rinci [18,19]

2.2 InstrumensasiGC - MS instrumentasi memungkinkan pemisahan sub - sikap dalam sampel biologis dan ekstrak dari C. rubellus dijelaskan secara rinci dalam [ 16 ] . Sub - sikap diekstrak dilarutkan dalam metanol pa kualitas ( Merck , Darmstadt , Jerman ) . Kolom kapiler yang digunakan adalah RXi -

5Sil MS fase polaritas rendah; Crossbond 1,4- bis ( dimetil siloxy ) Katalog phenylene dimetil polisiloksan no . 13620 , 15 m , ID 0,25 mm , ketebalan film 0,25 m ( Restek , Bellefonte , PA , USA ) . Kolom dikurangi menjadi sekitar 4,5 m di laboratorium . Laju aliran kolom helium adalah 8 mL / menit . Sampel ( 1 L ) pada konsentrasi perkiraan 20 ppm massa kering disuntik dengan rasio split 10:1 menggunakan Varian 1079 injektor dioperasikan pada 150 ˚ C. GC oven diprogram dari 130 ˚ C sampai 330 ˚ C pada 20 ˚ C / menit . Degradasi sumber ion dicegah berdasarkan surat fly -through EI sumber ion kontak-bebas [ 16 ] , dan degradasi - tion zat dalam sampel selanjutnya dihindari menjadi- penyebab penggunaan kolom pendek dan laju aliran gas yang tinggi . MS Instrumen dioperasikan dalam dampak elektron ( EI ) mode pada 70 eV . Spektrum massa antara m / z 50 dan m / z 700 diperoleh pada kecepatan scan 200 satuan m / z scan / s dengan resolusi massa sesuai dengan 1 unit di setengah puncak ketinggian . Pemisahan dan deteksi sub - sikap di dalam perut Mus rattus L. ditunjukkan dalam kromatogram ion direkonstruksi ( RIC )

3.Hasil

3.1 tes biologi untuk kadar racun

Tes toksikologi dijelaskan dalam [18,19]. Konsentrasi thres-memegang rubelline zat kering dari C. rubellus digunakan untuk penghambatan pertumbuhan Chlamydomo-nas reinhardtii sel adalah 10 ppm. Hanya hasil kualitatif dicatat. Gerakan sel dihapuskan setelah mantan posure untuk ekstrak. Ini penghapusan gerakan sel merupakan hasil dari flagella penyumbatan [20]; penulis [20] mencatat: "Bukti terkuat untuk peran dalam memicu penumpahan flagella oleh alga uniseluler klamidia-domonas reinhardtii bawah tekanan asam. Analisis kinetik yang cepat menunjukkan bahwa phosphoinositide hidrolisis oc-curs dalam setengah detik dan bisa memicu hilangnya cepat flagella. "Sebagian besar sel kehilangan klorofil mereka dan lisis sel dimulai sebagai akibat dari paparan toksin.

3.2. Analisis Perut Cairan dari Mus rattus L

Waktu pencernaan makanan yang mengandung C. rubellus dalam perut mouse Mus rattus L. dikurangi menjadi 1 jam. Suhu injektor di GC yang ditetapkan sebesar 150 ˚ C (rendah dibandingkan dengan analisis sebelumnya) untuk meminimalkan degradasi pada injektor. The VF-5HT kolom, I.D. 0,25 mm, ketebalan 0,1 Film m, dan 4 m panjang (Varian, Middelburg, Belanda) diubah menjadi sebuah RXi-5Sil MS fase polaritas rendah; Crossbond 1,4-bis (dime-thylsiloxy) phenylene dimetil polisiloksan, katalog no. 13.620,15 m, I.D. 0,25 mm, ketebalan 0,25 Film m (Restek) kolom, yang berkurang panjangnya sekitar 4,5 m di laboratorium. Tingkat aliran tinggi di kapiler digunakan untuk mengurangi waktu analisis dan menghindari degradasi dari analit.

Orellanine dan rubelline adalah sama dan mereka adalah re-lated struktural untuk paraquat dan Diquat. Paraquat dan Diquat adalah herbisida bipyridyl nonselektif; rubelline menunjukkan efek sitotoksik herbisida. Sebagaimana dinyatakan oleh Jones dan Vale [23] "Diquat adalah redoks pengendara sepeda

ampuh dan mudah diubah menjadi radikal bebas yang, dalam reaksi dengan molekul o xygen, menghasilkan anion superoksida dan produk redoks kemudian lainnya. Produk-produk ini dapat menginduksi peroksidasi lipid di membran sel, dan yang berpotensi menyebabkan kematian sel. "Efek sitotoksik rubelline diuji dalam model tertentu [19] pada uniseluler ganggang Chlamydomonas reinhardtii. Model ini dikembangkan untuk menguji kemampuan primakuin dan quinocide antar-fere dengan rantai transpor elektron, untuk mengais elec-trons, dan untuk menghasilkan peroksida dan radikal dalam sel hidup

4.kesimpulan.

1) Berat molekul rubelline adalah 256 dan struktur rubelline secara tentatif dijelaskan dengan menggunakan GC-MS. 2) Rubelline kurang polar daripada orellanine dan konsekuensi-paling sering lebih cocok untuk penyerapan pada lambung dan saluran pencernaan dan transportasi dalam darah untuk mencapai target organ seperti hati dan ginjal. 3) Rubelline dikonversi dalam mitokondria untuk orellanine dan secara bertahap berkonsentrasi di ginjal. 4) biotransformasi rubelline untuk orellanine merusak fungsi ginjal dengan gangguan transpor elektron, dengan produksi radikal dan peroksida, dan dengan toksisitas langsung. 5) Orellanine adalah zat beracun yang secara bertahap con-centrates pada organ sasaran sampai konsentrasi akan-datang sehingga kerusakan permanen kritis terjadi. 6) Proses biotransformasi dari rubelline ke orellanine membutuhkan waktu dan ini dapat menjelaskan periode panjang laten keracunan Cortinarius. Perbedaan individu dalam aktivitas enzim pada pasien yang berbeda dapat menjelaskan perbedaan dalam periode laten: pada beberapa pasien ini adalah 2 hari, pada orang lain sampai 3 minggu. 7) Penemuan molekul dengan m / z 256 menunjukkan bahwa molekul dengan m / z 580 mungkin ada. Sebuah molekul hipotetis dengan m / z 580.