TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA SKRIPSI - core.ac.uk · 11. Teman-teman kelas A, khususnya kelo mpok...

i

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, dan FP40

TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Alfonsia Purnamasari

NIM : 038114044

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2006

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, dan FP40

TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Alfonsia Purnamasari

NIM : 038114044

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2006


iii


iv


v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya yang terbaik adalah karya hasil dari pengorbanan diri

Karya ini walau bukan yang terbaik bagi orang lain, tetapi terbaik bagi diriku

(Shary)

Kupersembahkan karya ini untuk Jesus Christ yang selalu menyertaiku dalam segala hal

Papa, Mama, Bude, my brothers n’ sister Ius, Adit, Onna Yang selalu memberi doa, semangat dan dukungan

Untuk teman-teman terbaikku dan Almamaterku tercinta Tengkyu for all


vi

KATA PENGANTAR

Puji Syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena penulis bisa

menyelesaikan skripsi yang berjudul Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba

(Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, dan FP40 terhadap kultur sel Myeloma.

Sebagai salah satu tugas akhir di jenjang pendidikan S1, kiranya penelitian ini dapat

memberikan sumbangan informasi yang berharga bagi pengembangan obat

antikanker dari tanaman Azadirachta indica A. Juss di masa mendatang.

Dalam menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak

lepas dari bantuan dan dorongan dari berbagai pihak yang senantiasa meluangkan

waktu dan pikirannya. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih

kepada :

1. Drs. A. Yuswanto, Ph.D., S.U., Apt, yang telah memberikan bimbingan

selama penyusunan skripsi.

2. dr. Luciana Kuswibawati,MKes yang memberikan saran sebagai dosen

penguji skripsi.

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., yang memberikan saran sebagai dosen penguji

skripsi.

4. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam

identifikasi dan determinasi tumbuhan.

5. Segenap Dosen dan karyawan yang telah banyak memberikan bimbingan dan

bantuan selama ini.


vii

6. Mbak Yuli, Pak Rajiman, Mas Dwi dan segenap karyawan Laboratorium

Hayati UGM yang telah banyak membantu, membimbing dan menemani

dalam jalannya penelitian skripsi ini.

7. Arry, Candra, Robby dan Nadia yang telah memberi masukan-masukan dan

diskusi dalam terselesainya skripsi ini.

8. Mama, Papa, Bude Sur, Ius dan segenap keluarga yang bersedia

mendengarkan keluh kesahku dan atas doa dan dorongan semangat yang telah

diberikan kepadaku.

9. Vita, Jenny, Lucy, Melon, Anna, Ndari, Leea, Agnes, Wati, Mila, dan Ratih

atas kerjasama, diskusi, canda tawa dan keluh kesahnya hingga skripsi ini

bisa terselesaikan.

10. Angger, Rosa, Tata, Vera, Dita atas kesabaran mendengar keluh kesahku,

masukan dan dorongan semangat juga atas persahabatan yang indah ini.

11. Teman-teman kelas A, khususnya kelompok praktikum B atas kebersamaan

dan kerjasamanya, canda tawa dan persahabatannya yang indah.

12. Teman-teman angkatan 2003 Fakultas Farmasi Univesitas Sanata Dharma,

yang telah bersama-sama berjuang.

13. Semua pihak yang telah memberikan dukungan baik moral maupun material

yang tidak dapat disebutkan satu persatu.


viii

Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dan kesalahan. Oleh

karena itu penulis tidak menutup diri atas koreksi, kritik dan saran dari tulisan ini.

Penulis berharap, karya ini dapat bermanfaat dan mendorong mahasiswa angkatan

berikutnya untuk berkarya lebih baik lagi demi majunya dunia kefarmasian di

Indonesia.

Penulis


ix


x

INTISARI

Kanker merupakan jenis tumor ganas yang menjadi penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskular. Telah banyak dikembangkan pengobatan antikanker menggunakan obat tradisional, salah satunya adalah daun mimba. Berdasarkan penelitian yang sebelumnya, diketahui bahwa daun mimba pada fraksi 30% memiliki sitotoksisitas yang paling tinggi dibandingkan fraksi 60% dan fraksi 100% terhadap sel Myeloma dan paling berpotensi sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan melakukan fraksinasi lebih lanjut untuk mengetahui keberadaan protein yang mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel Myeloma.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan secara in vitro terhadap sel Myeloma dan sel Vero menggunakan metode MTT (3-4(4,5-dimetil-diazol-2-il)-2,5-diphenil tetrazolium bromid). Fraksi protein diperoleh dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat dengan konsentrasi 10%, 20%, 30%, dan 40%. Hasil uji dinyatakan dalam persentase kematian dan nilai LC50 dan selanjutnya dihitung menggunakan uji T.

Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa FP10 memiliki sitotoksisitas paling besar terhadap sel Myeloma dan sel Vero. Harga LC50 untuk FP10, FP20, FP30, dan FP40 berturut-turut untuk sel Myeloma adalah 0,01 ng/ml; 0,57µg/ml; 0,73µg/ml; dan 2.07µg/ml. Sedangkan untuk sel Vero adalah 0,24 ng/ml; >1g/ml; 0,01μg/ml; dan >1g/ml. FP30 menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0.05) tetapi dilihat dari nilai LC50-nya untuk sel Vero, FP30 memiliki nilai LC50 yang lebih kecil dibandingkan sel Myeloma. Berarti FP30 lebih bersifat toksik terhadap sel Vero dibandingkan dengan sel Myeloma, sehingga kurang baik untuk diterapkan dalam pengobatan kanker. Kata kunci : daun mimba, sitotoksisitas, fraksi protein, sel Myeloma


xi

ABSTRACT

Cancer is a disease to cause death only exceeded by cardiovaskular disease. Alternative therapy and traditional medicine had been developed to treat cancer, one of them is neem leaves. Previously research showed that protein fraction 30% had highest cytotoxic activity compare to that of protein fraction 60% and 100% against Myeloma cells and consider to be the most potential fraction as anticancer. This research aim to carried out a further fractination of protein fraction of neem leaves to investigate the existence protein having cytotoxic activity against Myeloma cells.

This research was an experimental research with complete random design one way pattern. The cytotoxic activity assay was conduted against Myeloma and Vero cells in vitro using MTT (3-4(4,5-dimetil-diazol-2-il)-2,5-diphenil tetrazolium bromid) method. Protein fractions were obtained by precipitating with ammonium sulphate with the concentration of 10%, 20%, 30% and 40%. Data expressed by percentage of death and LC50 value and were calculate by T test.

The result showed that FP10 had the highest cytotoxic activity against Myeloma and Vero cells. LC50 value of FP10, FP20, FP30, and FP40 for Myeloma cells are 0,01ng/ml; 0,56μg/ml; 0,71 μg/ml; dan 2,04 μg/ml. While for Vero cells are 0,24ng/ml; >1g/ml; 0,01μg/ml; dan >1g/ml. FP30 differ manifestly with cytotoxicity Vero cells (p<0.05) but LC50 of FP30 for Vero cells is smaller than Myeloma cells, so it’s less good to be use as medication of cancer. Key word: neem leaves, cytotoxicity, protein fraction, Myeloma cell


xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL................................................................................... .. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN....................................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... v

KATA PENGANTAR .................................................................................. vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... ix

INTISARI...................................................................................................... x

ABSTRACT .................................................................................................... xi

DAFTAR ISI................................................................................................. xii

DAFTAR TABEL......................................................................................... xvi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xviii

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xix

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING.............................................. xxi

BAB I PENGANTAR.................................................................................. 1

A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

1. Rumusan masalah ....................................................................... 2

2. Keaslian penelitian ...................................................................... 3

3. Manfaat penelitian....................................................................... 3

B. Tujuan .................................................................................................. 4

1. Tujuan umum…… ...................................................................... 4

2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4


xiii

BAB II PENELAAH PUSTAKA ................................................................ 5

A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss)........................................ 5

1. Keterangan Botani....................................................................... 5

2. Nama Daerah............................................................................... 5

3. Deskripsi ..................................................................................... 5

4. Kandungan kimia ........................................................................ 6

5. Kegunaan .................................................................................... 6

B. Protein .................................................................................................. 7

C. Kanker…………….............................................................................. 7

D. Sel Myeloma………............................................................................. 8

E. Sel Vero................................................................................................ 9

F. Uji Sitotoksisitas .................................................................................. 9

G. Landasan Teori..................................................................................... 10

H. Hipotesis............................................................................................... 11

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 12

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 12

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ................................... 12

1. Variabel bebas............................................................................. 12

2. Variabel tergantung..................................................................... 12

3. Variabel pengacau terkendali...................................................... 12

4. Variabel pengacau tak terkendali ................................................ 12

5. Definisi operasional .................................................................... 13

C. Alat dan Bahan ..................................................................................... 13


xiv

1. Alat ............................................................................................ 13

2. Bahan .......................................................................................... 13

D. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 14

1. Determinasi tanaman................................................................... 14

2. Pengumpulan daun mimba........................................................... 15

3. Sterilisasi alat dan bahan............................................................. 15

4. Preparasi fraksi protein daun mimba .......................................... 15

5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV ............ 16

6. Propagasi dan panen sel Myeloma .............................................. 17

a. Propagasi sel Myeloma............................................................ 17

b. Panen sel Myeloma.................................................................. 17

7. Propagasi dan panen sel Vero ..................................................... 18

a. Propagasi sel Vero ................................................................... 18

b. Panen sel Vero......................................................................... 18

8. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma. 19

9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero........ 20

E. Analisis Hasil....................................................................................... 20

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 22

A. Sterilisasi Alat dan Bahan .................................................................... 22

B. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba .................................... 22

C. Pengukuran Konsentrasi Fraksi Protein Secara Spektrofotometer UV.. 25

D. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba terhadap sel Myeloma

dan sel Vero.......................................................................................... 26


xv

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 35

A. Kesimpulan .......................................................................................... 35

B. Saran..................................................................................................... 35

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 36

LAMPIRAN.................................................................................................. 38

BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 78


xvi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan

metode spektrofotometer UV dan konsentrasi protein masing-

masing fraksi protein daun mimba.............................................. 26

Tabel II. Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein terhadap sel Myeloma .... 29

Tabel III. Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein terhadap sel Vero...... 31

Tabel IV. Harga LC50 hasil analisis probit pada sel Myeloma dan sel Vero 32

Tabel V. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan

metode spektrofotometri UV dan rasio serapan pada panjang

gelombang 280nm dan 260nm.................................................... 40

Tabel VI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

indica A Juss. FP10 terhadap kultur sel Myeloma .......................... 41

Tabel VII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta


Tabel VIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta


Tabel IX. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta


Tabel X. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta

indica A Juss. FP10 terhadap kultur sel Vero.................................. 43

Tabel XI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta indica

A Juss. FP20 terhadap kultur sel Vero ............................................ 43


xvii

Tabel XII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta


Tabel XIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun Azadirachta



xviii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Foto Sel Myeloma ....................................................................... 27

Gambar 2. Foto Sel Vero.............................................................................. 27

Gambar 3. Grafik Konsentrasi fraksi protein daun mimba VS

persen kematian sel Myeloma ................................................... 30

Gambar 4. Grafik Konsentrasi fraksi protein daun mimba VS

persen kematian sel Vero .......................................................... 31


xix

DAFTAR LAMPIRAN Halaman

Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat pada derajat

kejenuhan tertentu ................................................................. 38

Lampiran 2. Cara Perhitungan Konsentrasi Protein ................................. 40

Lampiran 3. Absorbansi Sel Myeloma dengan Metode MTT ................... 41

Lampiran 4. Absorbansi Sel Vero dengan Metode MTT .......................... 43

Lampiran 5. Hasil analisis probit fraksi protein Azadirachta indica A.Juss

terhadap kultur sel Myeloma dengan metode MTT .............. 45

Lampiran 6. Hasil analisis probit fraksi protein Azadirachta indica A.Juss

terhadap kultur sel Vero dengan metode MTT ..................... 57

Lampiran 7. Uji distribusi data sel Myeloma dengan

Kolmogorov-Smirnov ………….………………………….. 69

Lampiran 8. Uji distribusi data sel Vero dengan

Kolmogorov-Smirnov …………….……………………….. 70

Lampiran 9. Hasil uji signifikansi LC50 antara sel Myeloma dan

sel Vero dengan analisis statistic uji T-independent

sampel.........................................…………………………… 72

Lampiran 10. Foto Tanaman Azadirachta indica A. Juss ........................... 73

Lampiran 11. Foto Daun Azadirachta indica A. Juss.……………………... 73

Lampiran 12. Foto ELISA reader SLT 340ATC ........................................ 74

Lampiran 13. Foto Mikroskop Olympus....................……………………... 74

Lampiran 14. Foto Sentrifuge Hitachi ......................................................... 75


xx

Lampiran 15. Foto 96 Well Plate................................................................. 75

Lampiran 16. Foto Spektrofotometer UV..................……………….……... 76

Lampiran 17. Foto Sentrifuge K PLC Series ............................................... 76

Lampiran 18. Nilai r tabel dan r hitung pada sel Myeloma dan sel Vero .... 77


xxi

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

FP : Fraksi Protein

FP10 (PF10) : Fraksi protein (protein fraction) daun Azadirachta indica A.

Juss. hasil pengendapan amonium sulfat 10% jenuh







continous cell linse : sel yang berasal dari sel primer yang ditumbuhkan terus

menerus

FBS : Fetal Bovine Serum

MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid )

reagen Stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N

RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

round single cell : sel tunggal yang berbentuk bulat

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan leher

bengkok

96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam

sel pada uji sitotoksisitas


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker adalah jenis tumor yang ganas. Kanker disinyalir merupakan

penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskuler. Baik dinegara maju

maupun di negara berkembang penderita kanker dari tahun ke tahun cenderung

makin bertambah. Menurut Organisasi Kesehatan Dunia, WHO, setiap tahun jumlah

penderita kanker didunia bertambah 6,25 juta orang. Dalam 10 tahun mendatang

diperkirakan 9 juta orang akan meninggal setiap tahun akibat kanker. Kanker dapat

menimpa semua orang pada semua bagian tubuh dan pada semua golongan umur

(Anonim, 2003). Jika kanker ditemukan pada stadium dini kemungkinan

penyembuhannya cukup besar, tetapi jika telah terjadi penyebaran luas kemungkinan

penyembuhannya menjadi semakin kecil.

Penyakit kanker hingga kini termasuk salah satu penyakit yang sulit

ditemukan obatnya, terkecuali dengan operasi atau terapi kimia dan radiasi dengan

sinar γ. Di rumah sakitpun pengobatan kanker masih sangat terbatas sehingga

pelayanan pengobatan kanker ini juga terbatas. Biasanya pengobatan kanker bersifat

umum yaitu bisa digunakan untuk semua jenis kanker. Selain kerja obat yang tidak

selektif, obat-obat kanker juga merusak sel-sel tubuh yang normal. Karena itu sangat

diharapkan suatu antikanker yang memiliki toksisitas selektif menghancurkan sel

kanker tanpa merusak sel normal.

Perlu dikembangkan obat anti kanker dari bahan alam yang memiliki efek

samping kecil, mudah diperoleh serta memiliki nilai ekonomis yang relatif murah.


2

Salah satu tanaman yang dipercaya dapat menyembuhkan kanker adalah tanaman

mimba. Daun mimba telah digunakan untuk antiinflamasi, antirematik, antipiretik,

penurunan gula darah, antitukak lambung, hepatoprotektor, imunopotensiasi,

antifertilitas, antivirus dan antikanker (Sukrasno, 2003).

Suatu penelitian menggunakan total protein daun mimba yang diendapkan

dengan ammonium sulfat terbukti memiliki sitotoksisitas terhadap kultur sel

myeloma (Rahmawati, 2004) meskipun daya sitotoksiknya kecil. Fraksi protein yang

diendapkan dengan amonium sulfat 30% dan 60% berpotensi sebagai antikanker,

dan pada fraksi protein 30% jenuh mempunyai efek sitotoksik yang paling tinggi

terhadap sel myeloma dan paling berpotensi sebagai antikanker (Hariyadi, 2006).

Suatu senyawa dinyatakan memiliki potensi sebagai antikanker jika memiliki nilai

LC50 lebih kecil dari 20µg/ml (Suffness and Pezzuto cit Candra, 2006).

Diharapkan penelitian dengan menggunakan fraksi protein daun mimba

yang yang lebih kecil, yaitu fraksi protein 10%, 20%, 30% dan 40% yang

diperlakukan terhadap sel Myeloma akan memberikan daya sitotoksik dan berpotensi

sebagai antikanker tanpa membunuh sel normal dengan melihat daya sitotoksik

terhadap sel Vero.

1. Rumusan masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat dirumuskan

permasalahan sebagai berikut:

a. seberapa besar nilai LC50 fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30, dan

FP40 terhadap sel Myeloma dan sel Vero?


3

b. diantara fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30, dan FP40, manakah yang

mempunyai daya sitotoksisitas paling besar terhadap sel Myeloma dan Sel

Vero?

c. apakah fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30, dan FP40 berpotensi untuk

dikembangkan sebagai antikanker jika dilihat daya sitotoksisitasnya terhadap

sel Myeloma dan sel Vero?

2. Keaslian penelitian

Sebelumnya pernah dilakukan penelitian mengenai Sitotoksisitas Fraksi

Protein Daun Mimba Hasil Pengendapan dengan Ammonium Sulfat 30%, 60% dan

100% jenuh terhadap sel Myeloma (Hariyadi, 2006). Sejauh yang diketahui penulis,

bahwa belum pernah dilakukan penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi protein daun

mimba (Azadirachta indica A.Juss) FP10, FP20, FP30, dan FP40 terhadap Kultur Sel

Myeloma.

3. Manfaat penelitian

Penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi protein daun mimba diharapkan

memiliki beberapa manfaat antara lain:

a. manfaat teoritis ialah untuk melengkapi dan memperkaya teori yang telah ada

mengenai khasiat, kegunaan dan efek sitotoksisitas fraksi protein daun mimba

terhadap sel Myeloma dengan sel Vero sebagai pembanding

b. manfaat praktis yang dapat diperoleh ialah dapat membuktikan khasiat daun

mimba (Azadirachta indica A. Juss) sebagai obat antikanker


4

B. Tujuan Penelitian

Tujuan umum:

untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A.

Juss) FP10, FP20, FP30 dan FP40 jenuh memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai

senyawa antikanker.

Tujuan khusus:

a. untuk mengetahui nilai LC50 fraksi protein FP10, FP20, FP30, dan FP40 terhadap

sel Myeloma dan sel Vero

b. untuk mengetahui fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30, dan FP40 yang

mempunyai daya sitotoksisitas paling besar terhadap sel Myeloma dan sel

Vero

c. untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30, dan

FP40 berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker jika dilihat daya

sitotoksisitasnya terhadap sel Myeloma dan sel Vero


5

BAB II

PENELAAH PUSTAKA

A. Mimba (Azarirachta indica A. Juss)

1. Keterangan Botani

Tumbuhan mimba termasuk dalam suku Meliaceae, marga Azadirachta,

jenis Azadirachta indica A. Juss. (Backer dan Bakhuizen van den Brink, 1965).

2. Nama Daerah

Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) dengan sinonim Melia

azadirachta Linn memiliki nama daerah Jawa yaitu imba, mamba, membha,

mempheuh sedangkan nama Nusa Tenggara ialah intaran, mimba (Hutapea, 1993).

3. Deskripsi

Perawakan berupa pohon dengan tinggi 8-15m, bunga banci, batang

simpodial, kulit batang mengandung gum dan berasa pahit. Daun menyirip gasal

berpasangan, anak daun berupa helaian berbentuk memanjang-lanset-bengkok

dengan panjang 3-10cm, lebar 0,5-3,5cm, pangkal runcing tidak simetri, ujung

runcing sampai mendekati meruncing, gundul tepi daun bergerigi kasar, remasan

berasa pahit, warna hijau muda. Bunga berupa susunan malai, terletak diketiak daun

paling ujung, 5-30cm, gundul atau berambut halus pada pangkal tangkai karangan,

tangkai bunga 1-2mm, kelopak bewarna kekuningan, bersilia dengan panjang 5-

7mm. Benang sari membentuk tabung benang sari, sebelah luar gundul atau

berambut pendek halus, sebelah dalam berambut rapat, panjang putik rata-rata 3mm,

gundul. Buah berbentuk bulat, hijau kekuningan 1,5-2cm, berbunga pada bulan

Maret-Desember (Sudarsono, 2002; Sukrasno, 2003).


6

4. Kandungan kimia

Metabolit yang ditemukan dari tanaman mimba antara lain disentil vilasinin,

nimbandiol, 3-desasentil salanin, salanol, azadirachtin. Biji mengandung

azadirachtin, azadiron, azadiradion, epoksiazadiradion, gedunin, 17-epiazadiradion,

17-β-hidroksi azadiradion dan alkaloid. Kulit batang dan kulit akar mengandung

nimbin, nimbinin, nimbidin, nimbosterol, nimbosterin, sugiol, nimbiol, margosin

(suatu senyawa alkaloid). Hasil hidrolisis ekstrak bunga ditemukan kuersetin,

kaemferol dan sedikit mirisetin. Dari bagian kayu ditemukan nimaton, C24H30O5,

15% zat samak terkondensasi. Buah mengandung alkaloid (azaridin). Daun

mengandung Paraisin, suatu alkaloid dan komponen minyak atsiri mengandung

senyawa sulfida. Tangkai dan ranting hijau mengandung 2 tetranorterpenoid-

hidroksibutenolida yaitu desasetilnimbinolida dan desasetilsonimbinolida yang

berhasil diisolasi bersama dengan desasetilnimbin. Disamping itu terdapat pula

senyawa 17-epiazadiradion, 17-β-hidroksiazadiradion, azadirachtin, azadiron,

azadiradion, epoksiazadiradion dan gedunin (Sudarsono,dkk, 2002).

5. Kegunaan

Daun digunakan untuk penambah nafsu makan, untuk menanggulangi

disentri, borok, malaria, anti bakteri. Minyak untuk mengatasi eksim, kepala yang

kotor, kudis, cacing, menghambat perkembangan dan pertumbuhan kuman. Kulit

batang digunakan untuk mengatasi nyeri lambung, penguat, penurun demam. Buah

dan getah digunakan sebagai penguat (Sudarsono,dkk, 2002).


7

B. Protein

Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang

sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Suatu protein terdiri dari

asam amino yang terikat satu dengan yang lain oleh ikatan peptida (Poedjiadi, 1994).

Beberapa protein dalam tanaman memiliki sifat sebagai protein racun. Sebagian

diantaranya berperan dalam melindungi tumbuhan dari serangan mikroba. Protein

beracun lain memberikan harapan sebagai antikanker dan penyakit lain yang

disebabkan oleh virus (Robinson, 1991).

Pemurnian protein dapat dilakukan dengan cara fraksionasi, yaitu

memisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi.

Proses pengendapan protein dapat dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat

berkonsentrasi tinggi atau larutan jenuh (Poedjiadi, 1994). Hasil pengendapan

didialisis untuk menghilangkan amonium sulfat yang sebelumnya digunakan untuk

mengendapkan protein. Dialisis ini didasarkan pada perbedaan konsentrasi antara

dua permukaan membran dialisis. Molekul kecil, dalam hal ini adalah amonium

sulfat, akan keluar dari kantong dialisis dan protein yang mempunyai bobot molekul

besar akan tetap tertinggal di dalam kantong dialisis. Proses dialisis akan berhenti

setelah tercapai keadaan setimbang atau equilibrium (Kerese, 1984).

C. Kanker

Kanker adalah penyakit akibat pertumbuhan tidak normal dari sel-sel

jaringan tubuh yang berubah menjadi sel kanker dalam perkembangannya, sel-sel

kanker ini dapat menyebar ke bagian tubuh lainnya sehingga dapat menyebabkan

kematian. Kanker sering dikenal masyarakat sebagai tumor, padahal tidak semua


8

tumor adalah kanker (Anonim, 2003). Perbedaan yang utama yaitu kanker

merupakan neoplasma yang menyebar dan ganas atau disebut malignant neoplasm

dan tumor merupakan neoplasma yang tidak menyebar dan tidak ganas atau disebut

benign neoplasm (Bosman, 1996).

Tingkatan perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut:

1. hiperplasi yaitu pembengkakan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel baru

yang abnormal karena kehilangan kontrol pertumbuhan.

2. metaplasi yaitu perubahan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi jaringan

lain yang juga dewasa.

3. displasi yaitu eprubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal bentuk, besar

dan orientasinya, masih bersifat reversibel.

4. anaplasi yaitu perubahan serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari

normal. Bersifat ireversibel.

5. karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum terdapat

pertumbuhan infiltratif.

6. invasi yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan.

(Yuswanto&Sinaradi, 2000)

D. Sel Myeloma

Multiple myeloma dikenal juga sebagai Myeloma atau sel plasma Myeloma,

merupakan kanker sel plasma, bagian penting dari sistem imun yang menghasilkan

immunoglobulin (antibodi) untuk melawan infeksi dan penyakit. Karakteristik

multiple myeloma ditandai dengan jumlah sel plasma yang abnormal dalam sumsum

tulang belakang dan produksi yang berlebihan dari monoclonal immunoglobulin


9

(IgG, IgA, IgD, atau IgE) atau protein Bence-Jones. Hiperkalsemia, anemia,

kerusakan ginjal, meningkatnya kerentanan terhadap infeksi bakteri dan rusaknya

produksi immunoglobulin normal yang merupakan manifestasi umum dari multiple

myeloma. Ditandai dengan osteoporosis dalam tulang panggul, tulang punggung,

tulang rusuk dan tulang tengkorak (Anonim, 2006 b).

E. Sel Vero

Sel vero diambil pertama kali dari ginjal African Green Monkey dewasa

oleh Y. Yasamura dan Y. Kawakita dari Universitas Chiba, Jepang. Meskipun secara

luas digunakan untuk produksi vaksin dan transinfection, sel vero juga sering

digunakan untuk deteksi verotoxin, (Anonim, 2006a). Sel vero mempunyai

morfologi fibroblastik dan telah digunakan secara ekstensif untuk propagasi virus

dan deteksi mikoplasma. Sel vero umumnya digunakan untuk menyelidiki

toksoplasma, trikomonas, tripanosom dan infeksi klamidia. Sel ini sensitif terhadap

infeksi yang disebabkan virus dan parasit protozoa yang telah menyebar luas (Doyle,

2002).

F. Uji Sitotoksisitas

Suatu obat atau senyawa agar dapat dinyatakan sebagai antikanker harus

melalui beberapa tahap pengujian. Salah satu dari pengujian yang sering dilakukan

adalah uji praklinik. Uji praklinik biasanya dilakukan terhadap hewan percobaan

yang mempunyai sifat-sifat tertentu yang mirip dengan manusia. Penelitian dengan

menggunakan hewan percobaan pada masa sekarang ini mulai dikurangi. Sekarang

yang lebih sering digunakan adalah dengan kultur sel untuk mengidentifikasi agen

kemoterapetik kanker yaitu tes invitro. Adapun pertimbangan digunakan kultur sel


10

ini adalah karena lebih ekonomis dibandingkan dengan tes invivo, adanya perbedaan

fisiologis antara hewan percobaan dan manusia, dan adanya pertimbangan moral

dalam menggunakan hewan untuk penelitian (Freshney, 2000).

Uji MTT, didasarkan pada kemampuan enzim mitokondria dehidrogenase

dari sel sehat untuk merusak cincin tetrazolium pada MTT dan membentuk suatu

kristal formazan yang berwarna biru tua yang tidak dapat menembus membran sel,

sehingga terakumulasi dalam sel sehat. Jumlah sel yang hidup berbanding lurus

terhadap jumlah formazan yang dihasilkan. Warna kemudian dapat diukur

menggunakan metode kolorimetri sederhana. Hasil dapat dibaca pada multiwell

scanning spectrophotometer ( ELISA reader) (Anonim, 2006c).

Uji sitotoksisitas pada umumnya menggunakan parameter nilai LC50. Nilai

LC50 adalah besaran konsentrasi yang dapat mengakibatkan kematian 50% pada

subyek uji. Suatu senyawa dikatakan memiliki daya antikanker bila memiliki nilai

LC50 lebih kecil dari 20µg/ml (Suffness and Pezzuto cit Candra, 2006).

G. Landasan Teori

Berbagai macam penelitian tentang daun mimba telah banyak dilakukan

untuk menanggulangi penyakit kanker. Dari penelitian-penelitian sebelumnya yang

telah berhasil membuktikan adanya senyawa antikanker. Diketahui bahwa senyawa

protein yang terkandung dalam tumbuhan dapat beraktivitas untuk menghambat

pertumbuhan sel kanker, salah satunya adalah terhadap sel Myeloma. Sel Myeloma

digunakan sebagai model untuk mengetahui daya sitotoksisitas.

Hasil penelitian yang menggunakan fraksi protein dari beberapa tanaman

telah diujikan daya sitotoksiknya terhadap sel Myeloma diantaranya fraksi protein


11

daun Mirabilis jalapa L (Aceka, 2003), fraksi protein daun cangkring (Handayani,

2000), fraksi total protein daun Azadirachta indica A.Juss (Rahmawati, 2004). Fraksi

protein yang diendapkan dengan amonium sulfat 30% dan 60% berpotensi sebagai

antikanker, dan pada fraksi protein 30% jenuh mempunyai efek sitotoksik yang

paling tinggi terhadap sel Myeloma dan paling berpotensi sebagai antikanker

(Hariyadi, 2006).

Pernyataan tersebut mendasari dilakukannya penelitian menggunakan fraksi

protein daun mimba yang yang lebih kecil, yaitu fraksi protein 10%, 20%, 30% dan

40% yang diperlakukan terhadap sel Myeloma akan memberikan daya sitotoksik dan

berpotensi sebagai antikanker tanpa membunuh sel normal dengan melihat daya

sitotoksik terhadap sel Vero.

H. Hipotesis

Fraksi protein dari daun mimba hasil pengendapan dengan ammonium sulfat

10%, 20%, 30% dan 40% berpotensi sebagai antikanker.


12

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30, dan

FP40 terhadap kultur sel Myeloma termasuk penelitian eksperimental murni dengan

rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel penelitian dan Definisi operasional

1. Variabel bebas

Kadar fraksi protein daun mimba.

2. Variabel tergantung

Persentase kematian sel Myeloma dan sel Vero.

3. Variabel pengacau terkendali

1) pH dan suhu pembuatan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan suhu

4oC.

2) medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-

serum (untuk sel Myeloma) dan M199 (untuk sel Vero).

3) tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan

memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

4. Variabel pengacau tak terkendali

Kematian alami sel Myeloma dan sel Vero dan kandungan kimia tanaman

mimba.


13

5. Definisi operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari fraksi protein daun mimba

terhadap sel Myeloma dan sel vero.

b. Fraksi protein ialah fraksi protein daun mimba yang diperoleh dari hasil

pengendapan dengan garam amonium sulfat pada konsentrasi 10%, 20%,

30% dan 40%, dinyatakan dalam µg/ml.

c. LC50 ialah konsentrasi fraksi protein daun mimba yang mampu membunuh

atau menyebabkan kematian sejumlah 50% sel Myeloma atau 50% sel Vero

dan dinyatakan dalam µg/ml.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas,

stamper, mortir, timbangan analitik (AND ER-400 H), alumunium foil, magnetic

stirrer, tabung conical, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge (PLC),

inkubator (Nuaire), mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin, cell

counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), spektrofotometer UV (Cecil CE-292), ELISA

reader (SLT 340 ATC), laminar air flow (Nuaire), mikroskop (Olympus IMT-2),

haemocytometer (Nebauer), kain monel, tissue, glove, masker.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah

a. daun mimba segar

b. kultur sel Myeloma yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.


14

c. kultur sel Vero yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas

Gadjah Mada, Yogyakarta.

d. pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi fraksi protein daun mimba

1) larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 (Merck)

2) larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M

NaCl (Merck)

3) amonium sulfat p.a. (Merck)

e. Pereaksi-pereaksi untuk uji sitotoksisitas

1) media pencuci: RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes

2) media penumbuh: RPMI 1640, M199, FBS (Foetal Bovine Serum)

10%, Penisilin-Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco).

3) reagen Stopper : SDS (sodium dodeksil sulfat) dalam HCl 0,01 N

(Merck)

4) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

(Sigma)

5) bahan untuk isolasi sel Vero : tripsin 0,5%

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba,

telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga

kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen van den Brink,

1965).


15

2. Pengumpulan daun mimba

Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di

pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada bulan

Juni 2006.

3. Sterilisasi alat dan bahan

Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat

yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat

tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan

alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 1210C.

4. Preparasi fraksi protein dari daun mimba

Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dan ditimbang

sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan air mengalir kemudian

dibungkus plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus

dalam mortir bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi sedikit dapar

natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin

(dengan penambahan es di sekitarnya). Bahan diperas dan disaring dengan kain

monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang

diperoleh disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh

merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beker gelas dan diukur volumenya.

Supernatan ekstrak gubal yang diperoleh, diendapkan proteinnya dengan

menambahkan amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 10%. Penambahan

amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit, diikuti pengadukan teratur dengan

magnetic stirrer pada suhu dingin semalaman, dilanjutkan dengan sentrifugasi ultra


16

dengan kecepatan 10000 rpm 4ºC selama 25 menit. Supernatan (1) ditampung dalam

labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin

larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya endapan tadi didialisis

dengan memasukkan larutan endapan dalam dapar natrium fosfat ke dalam membran

dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan penjepit khusus membran

kemudian ujung membran yang lainnya ditutup dengan dijepit dengan penjepit

khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu digantung dalam bekerglass

yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sebanyak 1000 ml. Proses dialisis

dilakukan dalam almari es selama semalam dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan

penggantian dapar natrium fosfat satu kali. Hasil dialisis disentrifus dengan

kecepatan 8000 rpm selama 20 menit. Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan

diambil. Supernatan ini merupakan sampel fraksi protein daun mimba dengan

konsentrasi amonium sulfat 10% jenuh.

Supernatan (1), (2) dan (3) ditampung secara bertahap kemudian ditambah

dengan ammonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 20%, 30% dan 40% dengan

menggunakan langkah yang sama dengan konsentrasi 10% jenuh.

5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV

Sampel fraksi protein daun mimba 10%, 20%, 30% dan 40%, masing-

masing sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl

larutan dapar natrium fosfat 5 mM, diukur serapannya dengan spektrofotometer UV

pada panjang gelombang 280 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat 5 mM.

Untuk mengoreksi adanya serapan oleh asam nukleat pada panjang gelombang

tersebut maka pengukuran juga dilakukan pada panjang gelombang 260 nm.


17

Perbandingan antar serapan pada 280 nm dan 260 nm merupakan rasio serapan R

280/260, dan digunakan untuk menghitung faktor koreksi dengan cara ekstrapolasi

terhadap tabel kadar protein (Layne cit Candra, 2006). Selanjutnya, kadar protein

dihitung dari perkalian antara serapan pada 280 nm, faktor koreksi dan faktor

pengenceran.

6. Propagasi dan panen sel Myeloma

a. Propagasi sel Myeloma

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul

dibuka dan sel Myeloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi

medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan

dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan

perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian

dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium

penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai

homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan

diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah

24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan

jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney cit Candra, 2006).

b. Panen sel Myeloma

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media

diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari

dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel


18

dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai

volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang

dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian

dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah

medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 μl dan siap

dipakai untuk penelitian (Freshney cit Candra, 2006).

7. Propagasi dan panen sel Vero

a. Propagasi sel Vero

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul

dibuka dan sel normal dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi

medium M199. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang,

diganti dengan medium M199 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.

Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang

sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang

mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen,

kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan

dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam,

medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya

cukup untuk penelitian (Freshney cit Candra, 2006).

b. Panen sel Vero

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), sel dicuci

dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask,


19

diberi tripsin 2,5% sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril

yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan

FBS 10% sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang

sama dan disentrifuse selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin, sel

dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet

ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah

sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah

medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 μl dan siap

dipakai untuk penelitian (Freshney cit Candra, 2006).

8. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel Myeloma dengan

kepadatan 2,5x104/100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang

telah berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 200 µg/ml pada sumuran

A1, B1 dan C1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A2, B2 dan C2 di kolom 2

ditambahkan 100 μl suspensi sel Myeloma pada sumuran yang telah berisi 100 μl

fraksi protein daun mimba dengan kadar 100 µg/ml, demikian seterusnya hingga

diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Sebagai

kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium

RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi,

100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan

dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama

24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 1986;

Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).


20

Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl

MTT 2,5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu

37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT

dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 μl reagen

stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap

sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya

serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.

9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero

Untuk uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero

menggunakan langkah yang sama dengan uji sitotoksisitas fraksi protein pada sel

Myeloma, tetapi pada sel Vero menggunakan medium M199.

E. Analisis Hasil

Pada metode MTT ini, serapan terbaca menunjukkan jumlah sel yang hidup

dan hasil akhir uji sitotoksisitas yaitu persentase kematian sel yang dihitung

menggunakan modifikasi rumus Abbot, dengan persamaan berikut:

% Kematian sel = 100% x A

C)(BA −−

Keterangan :

A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan

C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel

(Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nochols, Mc Laughlin, 1982)


21

Untuk menghitung harga LC50 dilakukan perhitungan secara statistik

menggunakan analisis probit sedangkan untuk membandingkan LC50 anatara sel

Myeloma dan sel Vero menggunakan uji T-indepndent.


22

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi alat merupakan langkah pertama sebelum dilaksanakannya

penelitian. Sterilisasi alat dan bahan ini dilakukan untuk menghilangkan kontaminan

atau mikroorganisme yang mungkin ada dialat atau bahan yang akan digunakan,

sehingga tidak menggangu jalannya penelitian. Sterilisasi dilakukan selama kurang

lebih 20 menit dengan suhu 1210C menggunakan autoklaf. Prinsip kerja autoklaf

adalah dengan menaikkan tekanan untuk mendapatkan suhu tinggi sehingga

terbentuk uap air panas (Ansel, 1989). Uap air panas yang dihasilkan akan masuk

kedalam mikroorganisme dan mematikannya dengan mekanisme denaturasi dan

koagulasi beberapa protein esensial dari mikroorganisme tersebut.

Sterilisasi medium digunakan membran filter. Dilakukan penyaringan untuk

sterilisasi medium ini karena bahan-bahan tersebut dapat rusak dengan adanya panas.

Penyaringan bertujuan agar pengotor akan tertahan pada memban filter sehingga

cairan yang telah melewati membran akan bebas dari mikroorganisme.

B. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba

Sampel yang digunakan untuk penelitian ini adalah fraksi protein daun

mimba. Daun mimba yang digunakan diperoleh dari tanaman Azadirachta indica A.

Juss yang terdapat didaerah jalan Kaliurang pada bulan Agustus 2006. Daun mimba

segar dipetik dan dicuci bersih dengan air mengalir. Hal ini bertujuan untuk

menghilangkan berbagai macam pengotor yang kemungkinan besar menempel pada

daun. Daun kemudian dimasukkan kedalam freezer untuk membekukan daun


23

sehingga daun lebih mudah ditumbuk. Semua perlakuan protein dilakukan secara

steril pada suhu dingin (4ºC) untuk mencegah denaturasi dan reaksi enzim proteolitik

yang dapat merusak protein. Fraksi protein ekstrak gubal diperoleh dengan

penambahan sejumlah larutan dapar Natrium Phospat 5mM pH 7,2 yang

mengandung 0,14M NaCl pada daun yang ditumbuk halus. Larutan dapar berfungsi

untuk memudahkan protein terekstraksi dari selnya yang terdapat pada daun, dengan

pH 7,2 ditujukan untuk menciptakan kondisi isotonis dengan cairan didalam sel

tumbuhan. Dengan adanya NaCl, protein akan berada dalam keadaan terlarut dan

stabil didalam dapar. Bahan diperas dan cairan yang diperoleh disentrifuse selama 20

menit. Supernatan yang diperoleh sebanyak 500ml merupakan ekstrak gubal dari

daun mimba.

Pembuatan fraksi protein dalam penelitian ini menggunakan metode salting

out. Adanya amonium sulfat pada konsentrasi tertentu dalam larutan akan

mengurangi kelarutan protein. Ion anorganik dari molekul amonium sulfat akan

bersaing dengan molekul protein yang mengikat air karena amonium sulfat bersifat

lebih polar dibandingkan dengan protein maka air akan lebih banyak terikat pada

amonium sulfat sehingga terjadi penurunan kelarutan protein dan menyebabkan

protein terendapkan. Maka pada proses fraksinasi, protein nonpolar akan mengendap

terlebih dahulu diikuti pengendapan protein yang bersifat polar dengan derajat

kejenuhan tertentu. Oleh karena itu, protein yang terkandung pada masing-masing FP

tidak sama.

Pengendapan protein ini dilakukan secara bertingkat yaitu dengan derajat

kejenuhan 10%, 20%, 30% dan 40%. Hal ini bertujuan agar diperoleh pemisahan


24

protein dalam fraksi-fraksi tertentu. Penambahan amoium sulfat untuk masing-

masing fraksi 10%, 20%, 30% dan 40% adalah 27.45gram, 27.48gram, 28.35gram

dan 29.29gram. Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit sambil

diaduk agar pengendapan berlangsung dengan sempurna.

Sampel fraksi-fraksi protein yang diperoleh ini berwarna hijau kecoklatan

dan disimpan dalam suhu dingin. Proses preparasi sampel fraksi protein ini dilakukan

dalam suhu dingin untuk menjaga agar tidak terjadi denaturasi protein dan

penguraian protein karena protein dapat rusak atau terurai pada suhu tinggi atau pH

yang ekstrim.

Pemurnian fraksi protein dalam penelitian ini menggunakan cara dialisis.

Dialisis ini berguna untuk menghilangkan amonium sulfat yang mungkin terikat pada

protein yang terendapkan. Dialisis didasarkan pada perbedaan gradien konsentrasi

yang besar didalam dan diluar permukaan tubing dialisis sehingga memungkinkan

terjadinya mekanisme difusi pasif. Konsentrasi amonium sulfat pada tubing dialisis

lebih tinggi dibandingkan diluar tubing dialisis, sehingga mengakibatkan amonium

sulfat akan keluar dari dalam tubing dialisis dengan mekanisme difusi pasif. Selain

adanya gradien konsentrasi yang besar, tubing dialisis bersifat semipermeabel,

memiliki pori yang hanya mengeluarkan partikel-partikel berukuran sekitar 15000-

20000 Dalton, sehingga amonium sulfat yang berukuran lebih kecil dari protein akan

keluar dari dalam tubing dialisis sedangkan protein yang merupakan makromolekul

akan tetap tinggal didalam tubing dialisis.

Keempat fraksi protein dimasukkan tubing dialisis dan direndam dalam

larutan dapar Natrium fosfat 5mM pH7,2 dibeker gelas sambil diaduk. Pengadukan


25

dengan stirer ini untuk mencegah terjadinya kejenuhan yang tidak merata pada

larutan dapar Natrium fosfat 5mM pH7,2 yang berada diluar tubing dialisis sehingga

dapat mengakibatkan proses dialisis berjalan kurang sempurna. Dilakukan

penggantian dapar setelah 5jam. Hal ini bertujuan agar amonium sulfat yang keluar

dari tubing dialisis tidak terlalu jenuh sehingga perbedaan gradien konsentrasi

amonium sulfat yang berada diluar maupun didalam tubing dialisis tetap besar dan

mekanisme difusi pasif dapat terus berjalan.

C. Pengukuran Konsentrasi Fraksi Protein Secara Spektrofotometer UV

Sampel fraksi-fraksi protein daun mimba yang diperoleh kemudian diukur

kadarnya menggunakan spektrofotometer UV dengan kuvet kuarsaglass. Pengukuran

dilakukan pada dua panjang gelombang yaitu 280 nm dan 260 nm. Pemilihan metode

pengukuran kadar fraksi protein menggunakan spektrofotometer UV didasarkan pada

adanya residu asam amino dari protein yaitu tirosin, triptofan, dan fenilalanin yang

memberikan absorbansi maksimal pada panjang gelombang 280 nm. Panjang

gelombang 260nm digunakan sebagai faktor koreksi, karena adanya senyawa-

senyawa lain seperti asam nukleat serta adanya senyawa-senyawa yang mengandung

cincin purin dan pirimidin yang memiliki kemampuan untuk mengabsorbsi secara

maksimal pada panjang gelombang 260nm sehingga dapat mempengaruhi

pembacaan kadar protein yang didapat.

Penggunaan metode spektrofotometer UV memiliki beberapa keuntungan

yaitu sensitif, waktunya singkat, tidak perlu menggunakan reagen dan tidak merusak

protein. Namun kelemahannya, metode ini kurang selektif (Bachrudin, 1992).


26

Hasil yang diperoleh dari pengukuran menggunakan spektrofotometer UV ini adalah

absorbansi fraksi protein daun mimba (tabel I).

Tabel I: Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV dan konsentrasi protein masing-masing fraksi

protein daun mimba

Fraksi protein daun mimba (%)

Absorbansi pada λ 280 nm


Konsentrasi fraksi protein (mg/ml)

10 0.197 0.186 16.331 20 0.191 0.177 16.101 30 0.223 0.245 15.899 40 0.195 0.276 9.379

Nilai absorbansi masing-masing fraksi protein yang diperoleh tidak sama,

mungkin dikarenakan sifat protein yang terendapkan pada tiap FP berbeda.

Kandungan protein yang berbeda maka sifat asam amino aromatik penyusunnya

dapat berbeda-beda pula sehingga memberikan hasil serapan yang tidak sama.

Rumus perhitungan kadar protein dapat dilihat pada Lampiran 2.

D. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba terhadap Sel Myeloma dan

Sel Vero

Uji sitotoksisitas pada penelitian ini menggunakan kultur sel Myeloma dan

kultur sel Vero yang ditumbuhkan dari stok kultur sel Myeloma dan kultur sel Vero

di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada. Uji sitotoksisitas dalam penelitian

ini dilakukan secara invitro menggunakan metode MTT. Seri kadar yang digunakan

sebanyak 11 seri kadar, dengan konsentrasi tertinggi 200μg/ml dan konsentrasi

terendah 0.2μg/ml.

Morfologi sel myeloma dapat diamati. Sel Myeloma sehat tampak berbentuk

bulat, berkoloni, menempel didasar dinding dan berwarna transparan. Sedangkan sel

yang mati memiliki warna atau bintik hitam ditengahnya (Gambar1).


27

(a) (b) Gambar1. Sel Myeloma tanpa perlakuan fraksi protein daun mimba (a) sel Myeloma yang

diinkubasi dengan fraksi protein daun mimba FP20 dengan konsentrasi 0.2 μg/ml (b) (i) sel hidup (ii) sel mati

Sel Vero sehat berbentuk panjang dan menempel pada dasar dinding. Sel

Vero yang hidup tampak berbentuk berbentuk seperti serabut-serabut panjang dan

menempel pada dasar flask. Sedangkan sel Vero yang mati tampak berbentuk bulat

dan tidak menempel pada dasar flask (Gambar 2).

(a) (b)

Gambar 2. Sel Vero tanpa perlakuan fraksi protein daun mimba (a) sel Vero yang diinkubasi

dengan fraksi protein daun mimba FP10 dengan konsentrasi 0.2 μg/ml (b) (i) sel hidup (ii) sel mati

Metode yang digunakan untuk menentukan prosentase kematian sel adalah

metode MTT. Metode MTT akurat digunakan karena absorbansi yang terbaca


28

sebanding dengan jumlah sel hidup yang masih aktif melakukan metabolisme. Uji ini

dirasa cukup aman karena tidak menggunakan zat-zat yang berbahaya, sederhana

karena perlakuan yang harus diberikan pada sampel sebelum diuji relatif cukup

mudah, cepat karena waktu yang dibutuhkan cukup singkat sehingga memungkinkan

untuk menguji sampel dalam jumlah cukup banyak (menggunakan multiwell ELISA

Reader).

Metode MTT merupakan metode pengukuran secara kolorimetri.

Penambahan MTT pada sumuran akan menyebabkan terjadinya pemecahan garam

tetrazolium MTT oleh enzim reduktase suksinat tetrazolium yang terdapat didalam

mitokondria sel sehingga terbentuk kristal formazan berwarna ungu yang tidak larut.

Kristal formazan yang tidak larut ini hanya terbentuk pada sel Myeloma dan sel Vero

yang tetap hidup setelah pemberian senyawa uji. Sel yang masih hidup menandakan

sel tersebut masih aktif melakukan aktivitas metabolisme, sehingga dengan adanya

MTT pada lingkungan akan segera dipecah oleh enzim reduktase suksinat

tetrazolium yang terdapat dalam mitokondria sel tersebut membentuk kristal

formazan berwarna ungu. Semakin banyak sel yang hidup, maka akan warna ungu

yang dihasilkan semakin pekat. Jumlah formazan yang terbentuk berkorelasi dengan

sel yang aktif secara metabolik (sel hidup). Hal ini berbanding lurus dengan nilai

absorbansi pada ELISA Reader.

Penghentian reaksi enzimatik dilakukan dengan penambahan reagen stop

solution SDS 1% dalam HCl 0,01N yang berfungsi melarutkan formazan, kemudian

diinkubasi pada suhu kamar semalaman. Dari hasil pengukuran dengan ELISA

reader, didapat absorbansi yang sebanding dengan jumlah sel yang hidup. Intensitas


29

warna formazan pada sumuran perlakuan lebih rendah daripada sumuran kontrol. Hal

ini menunjukkan pada sumuran perlakuan sel yang mati lebih banyak sehingga

intensitas warna ungu yang dihasilkan lebih rendah.

Pada penelitian ini dilakukan pengukuran absorbansi dari pelakuan sel

Myeloma dengan fraksi protein daun mimba, perlakuan fraksi protein daun mimba

tanpa sel Myeloma, dan kontrol yaitu sel Myeloma tanpa perlakuan. Untuk sel Vero

juga dilakukan pengukuran sama dengan pengukuran pada sel Myeloma.

Nilai absorbansi uji sitotoksisitas dengan metode MTT pada inkubasi

selama 24 jam dapat dilihat pada Lampiran 3 dan Lampiran 4.

1. Sel Myeloma

Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Myeloma

Rata-rata persen kematian sel (%) Konsentrasi fraksi protein daun mimba

(μg/ml) Fraksi 10% Fraksi 20% Fraksi 30% Fraksi 40%

0.2 55.94 48.25 46.88 40.40 0.4 59.23 54.38 52.49 45.83 0.8 57.67 56.16 49.76 44.92 1.6 62.49 53.14 51.84 43.84 3.1 58.23 59.82 57.22 49.08 6.3 53.70 57.78 69.25 43.22

12.5 54.13 57.75 52.51 51.70 25 60.57 65.19 62.46 63.85 50 59.66 70.93 82.07 76.51

100 61.60 86.37 91.64 86.99 200 64.51 95.79 90.20 89.52


30

Konsentrasi VS %Kematian

30405060708090

100

0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 200

Konsentrasi

%K

emat

ian

FP10 FP20 FP30 FP40

Gambar3. Grafik hubungan antara konsentrasi fraksi protein dengan persen kematian

Persen kematian sel myeloma oleh perlakuan daun mimba diperoleh data

yang fluktuatif (tabel II). Jumlah sel yang mati seharusnya berbanding lurus dengan

peningkatan kadar fraksi potein daun mimba, semakin tinggi kadar fraksi protein

daun mimba maka persen kematian sel Myeloma akan semakin meningkat. Dari data

yang diperoleh ini tidak dapat ditarik suatu korelasi untuk menyatakan aktivitas

sitotoksisitas dari fraksi protein daun mimba. Hal ini mungkin dikarenakan adanya

kematian sel alami yang tidak dipengaruhi oleh perlakuan fraksi protein daun mimba,

tetapi juga bisa karena adanya faktor lingkungan yang rentan kontaminasi.

Persen kematian sel Myeloma pada FP20 lebih tinggi dibandingkan persen

kematian sel pada FP10, FP30, dan FP40 (gambar 3). Hal ini mungkin dikarenakan

protein yang bersifat sitotoksik terendapkan lebih banyak pada FP20 sehingga

menyebabkan kematian sel lebih besar. Namun dalam penelitian ini belum dapat

diketahui jenis protein yang bekerja memberikan efek sitotoksik.


31

2. Sel Vero

Tabel III. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Vero

Rata-rata persen kematian sel (%) Konsentrasi fraksi protein daun mimba

(μg/ml) Fraksi 10% Fraksi 20% Fraksi 30% Fraksi 40%

0.2 66.88 93.45 63.66 82.75 0.4 64.96 85.33 68.93 79.64 0.8 64.14 77.10 67.71 85.06 1.6 71.44 79.35 69.34 75.84 3.1 63.82 80.01 76.81 77.03 6.3 66.04 73.63 82.06 70.07

12.5 75.06 69.91 78.38 66.81 25 60.73 67.59 85.49 79.22 50 73.62 65.56 90.60 85.14

100 70.65 70.43 80.47 75.42 200 84.79 75.13 89.50 74.41

Konsentrasi VS %Kematian

50

60

70

80

90

100

0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 200

Konsentrasi

%K

emat

ian

FP10 FP20 FP30 FP40

Gambar 4. Grafik hubungan antara konsentrasi fraksi protein dengan persen kematian

Persen kematian sel Vero oleh perlakuan fraksi protein daun mimba, dapat

dilihat bahwa data yang diperoleh fluktuatif (tabel III). Seharusnya fraksi protein

daun mimba tidak memberikan persentase kematian karena sel Vero ini digunakan

sebagai pembanding antara sel Myeloma sebagai sel kanker dan sel Vero sebagai sel

normal. Data yang demikian mungkin dikarenakan menggunakan subyek uji biologis


32

yang relatif sulit dikendalikan sepenuhnya seperti faktor pertumbuhan, kondisi

fisiologis sel, proses kematian alami sel dan kontaminasi lingkungan. Dari data yang

diperoleh sel Vero tetap memberikan persentase kematian sehingga dapat ditarik

kesimpulan bahwa fraksi protein daun mimba juga membunuh sel Vero.

Setelah didapatkan data jumlah persen kematian sel, maka nilai LC50 dapat

dihitung menggunakan analisis probit dari program SPSS 13. Analisis probit

merupakan salah satu analisis regresi linier untuk mengetahui hubungan konsentrasi-

respon (prosentase kematian) agar diperoleh persamaan garis lurus yang dapat

digunakan untuk menentukan LC50 lebih akurat. Dari hasil analisis didapat nilai LC50

untuk setiap fraksi protein baik untuk sel Myeloma (Lampiran 5) maupun sel Vero

(Lampiran 6).

Tabel IV. Harga LC50 hasil analisis probit pada sel Myeloma dan sel Vero

Sel Myeloma Sel Vero Fraksi Protein Daun

Mimba

LC50 r hitung r tabel (95%)

LC50 r hitung r tabel (95%)

10% 0,01 ng/ml 0,452 0,602 0,24 ng/ml 0,589 0,602 20% 0,57µg/ml 0,829 0,602 >1g/ml 0,787 0,602 30% 0,73µg/ml 0,869 0,602 0,01µg/ml 0,892 0,602 40% 2.07µg/ml 0,887 0,602 >1g/ml 0,321 0,602

Gambaran toksisitas suatu senyawa dilihat dari nilai LC50, semakin rendah

nilai LC50 maka semakin besar efek sitotoksiknya. Suatu senyawa dikatakan

memiliki efek sitotoksik apabila memiliki nilai LC50 kurang dari 1000µg/ml.

Berdasarkan hasil penelitian, semua fraksi protein untuk sel Myeloma dinyatakan

bersifat sitotoksik, sedangkan untuk sel Vero hanya FP10 dan FP30 yang dinyatakan

bersifat sitotoksik.


33

Kemampuan untuk membunuh sel uji yang paling tinggi dilihat dari nilai

LC50 yang paling kecil. FP10 dengan nilai LC50 terkecil bersifat paling sitotoksik

terhadap sel Myeloma dimana dengan kadar 0,01 ng/ml sudah mampu membunuh sel

uji sebesar 50% populasi (tabel IV). Untuk sel Vero, FP10 yang bersifat paling

sitotoksik karena nilai LC50-nya terkecil. Untuk bisa dikembangkan sebagai

antikanker, menurut National Cancer Institute (NCI) suatu senyawa harus memiliki

nilai LC50 untuk sel kanker ≤ 20 μg/ml (Suffness dan Pezzuto cit Candra, 2006).

Berdasarkan hasil penelitian, LC50 untuk sel Myeloma ≤ 20μg/ml, berarti daun

mimba berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker. Untuk sel Vero pada

FP10 dan FP30 juga memiliki LC50 ≤ 20μg/ml padahal sel Vero disini digunakan

sebagai model untuk sel normal karena diharapkan pengobatan kanker bersifat

selektif dan tidak merusak sel normal. Oleh karena itu FP20 dan FP40-lah yang

berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker.

Nilai LC50 sel Myeloma FP20, FP30, dan FP40 signifikan untuk taraf

kepercayaan 95% dimana r hitung lebih besar dari r tabel. Sedangkan untuk sel Vero,

nilai LC50 untuk FP20 dan FP30 signifikan untuk taraf kepercayaan 95%. Data LC50

kemudian dianalisis dengan uji Kolmorgorov-Smirnov untuk melihat distribusi

datanya. Dari hasil pengolahan data dinyatakan bahwa data dari keempat fraksi

protein daun mimba (FP10, FP20, FP30, dan FP40) terhadap sel Myeloma maupun sel

Vero, lebih besar 0,05 (p>0,05) maka data tersebut memenuhi persyaratan uji

normalitas atau mempunyai distribusi normal (Lampiran 7 dan 8).

Berdasarkan asumsi tersebut, perlu diuji signifikansi untuk melihat adanya

perbedaan bermakna antara LC50 sel Myeloma dan sel Vero dengan uji t-independent.


34

Pertama dengan menguji kesamaan varian dua populasi (homogenitas), untuk FP30

diperoleh p>0,05 dan dikatakan kedua varian populasi sama, sedangkan untuk FP10,

FP20, dan FP40 diperoleh p<0,05 dan dikatakan kedua varian populasi tidak sama.

Kedua menguji signifikansi perbedaan rata-rata, untuk FP30 diperoleh p<0,05 maka

kedua rata-rata populasi tidak sama, hal ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan

signifikan rata-rata LC50 antara sel Myeloma dan sel Vero pada taraf kepercayaan

95%. Sedangkan untuk FP10, FP20, dan FP40 diperoleh p>0,05 berarti tidak terdapat

perbedaan yang signifikan rata-rata LC50 antara sel Myeloma dan sel Vero.

Berdasarkan hasil uji t-independent, FP30 menunjukkan perbedaan yang

signifikan tetapi dilihat dari nilai LC50-nya untuk sel Vero, FP30 memiliki nilai LC50

yang lebih kecil dibandingkan sel Myeloma. Berarti FP30 lebih bersifat toksik

terhadap sel Vero dibandingkan dengan sel Myeloma, sehingga kurang baik untuk

diterapkan dalam pengobatan kanker.


35

BAB V

KESIMPULAN dan SARAN

A. KESIMPULAN

Dari hasil penelitian dapat disimpulkan:

1. nilai LC50 fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30, dan FP40 terhadap sel

Myeloma berturut-turut adalah 0,01 ng/ml; 0,57µg/ml; 0,73µg/ml; dan

2.07µg/ml. Sedangkan untuk sel Vero adalah 0,24 ng/ml; >1g/ml; 0,01μg/ml; dan

>1g/ml.

2. dilihat dari nilai LC50, FP10 memiliki sitotoksisitas paling besar terhadap sel

Myeloma dan sel Vero.

3. fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30, dan FP40 tidak berpotensi

dikembangkan sebagai antikanker.

B. SARAN

Dari hasil penelitian dapat disarankan: perlu dilakukan uji sitotoksisitas fraksi protein

daun mimba dengan waktu inkubasi lebih dari 24 jam.


36

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2003, Apa Yang HArus Anda Ketahui Tentang Kanker, http://www.indosiar.com/v2003/pk/pk_read.htm?id=72, Diakses pada 6 Februari 2006.

Anonim, 2006 a, Normal African Green Monkey Kidney Epithelial Cells (Vero

line),http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/vero/verocells.html, Diakses pada 5 Febuari 2006.

Anonim, 2006 b, Definition Myeloma,

http://www.multiplemyeloma.org/about_myeloma/, Diakses pada 6 Febuari 2006.

Anonim, 2006c, MTT Cell Proliferation Assay,

http://www.protocolonline.org/prot/Cell_Biology/Cell_GrowthCytotoxicity/MTT_Cell_Proliferation_Assay/index.html, diakses 29 September 2006.

Anonim, 2006d, Methods for Concentrating Protein Solutions,

http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Protein%20Concentration.html, diakses tanggal 22 November 2006

Ansel, C. Howard, 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, Edisi IV, 410-413,

Penerbit UI, Jakarta. Bachrudin, Z., 1992, Petunjuk Laboratorium Isolasi, Identifikasi dan Pemurnian

Protein, 131-169, PAU-Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Backer, C.A. dan Bakhuizen Van Den Brink, R.C., 1963, Flora of Java, Vol I, 3-12

N.V.P. Noordhoof, Groningen, The Netherlands. Backer, C.A. dan Bakhuizen Van Den Brink, R.C., 1965, Flora of Java, Vol II, 116-

117, 121, N.V.P. Noordhoof, Groningen, The Netherlands. Bosman, F.T.,1996, Onkologi, diterjemahkan oleh Arjono, edisi ke5, 3-10, Panitia

Kanker RSUP Sardjito, Yogyakarta. Candra, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A.

Juss) Hasil Pengendapan Dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, 100% Jenuh Terhadap Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Doyle, A., & J. B. Griffiths, 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research,

John Willey & Sons Inc., USA.


37

Freshney, R. Ian., 2000, Culture of Animal Cells: A Manual Basic Technique, 4th Edition, John Willey & Sons Inc., USA.

Hariadi, Arry, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica

A. Juss) Hasil Pengendapan Dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, 100% Jenuh Terhadap Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Hutapea, J., 1993, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 67-68, Badan LitBang

kesehatan, Departemen Kesehatan Indonesia. Kerese, I., 1984, Methods of Protein Analysis, John Wiley and Sons, New York. Poedjiadi, Anna, 1994, Dasar- Dasar Biokimia, 81-124, Universitas Indonesia Press,

Jakarta. Rahmawati, N., 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta

indica A. Juss) terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Sukrasno, 2003, Mimba Tanaman Obat Multifungsi, 9, PT Agromedia Pustaka,

Jakarta. Yuswanto, Ag & F. Sinardi, 2000, Kanker, 1-13, 29-35, Penerbitan Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.


38

LAMPIRAN Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat pada derajat kejenuhan

tertentu Penambahan amonium sulfat dihitung dengan menggunakan rumus:

13.0100)12(533

SSSG

−−

=

Keterangan: G = gram amonium sulfat yang ditambahkan per liter

S1 = % kejenuhan dari larutan awal

S2 = % kejenuhan dari larutan akhir

Rumus penambahan amonium sulfat di atas hanya dapat diaplikasikan ketika

penambahan amonium sulfat dilakukan pada suhu dingin (± 4oC).

(Anonim, 2006d)

• Gram amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai 10% kadar

amonium sulfat jenuh:

)03.0(100

)010(533x

G−

−=

= 53,3 gram/liter

Volume supernatan yang diperoleh adalah 515 ml, sehingga perlu ditambahkan

27,45 mg amonium sulfat.



)103.0(100

)1020(533x

G−

−=

= 54,95 gram/liter




39



)203.0(100

)2030(533x

G−

−=

= 56,70 gram/liter





)303.0(100

)3040(533x

G−

−=

= 58,57 gram/liter




40

Lampiran 2. Cara Perhitungan Konsentrasi Protein

Konsentrasi protein dihitung dengan menggunakan rumus:

Konsentrasi = ([1,55 x E(280)] – [0,76 x E(260)] x faktor pengenceran) mg/ml

Keterangan: E(280) = absorbansi pada λ 280 nm

E(260) = absorbansi pada λ 260 nm

(Layne cit Richterich & Colombo, 1981)

Tabel V. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometri UV dan rasio serapan pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm

Fraksi protein daun mimba



FP10 0,197 0,186 FP20 0,191 0,177 FP30 0,223 0,245 FP40 0,195 0,276

• FP10

Konsentrasi protein = [([1,55 x 0,197] – [0,76 x 0,186]) x 100] mg/ml

= 16,40 mg/ml

• FP20


= 16,15 mg/ml

• FP30


= 15,95 mg/ml

• FP40


= 9,25 mg/ml


41

Lampiran 3. Absorbansi sel Myeloma dengan metode MTT Tabel VI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP10 terhadap kultur sel Myeloma

Absorbansi Perlakuan dengan sel Perlakuan tanpa sel

Konsentrasi Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V Rata-

rata I II III Rata-rata

0.20 1.013 1.073 1.020 0.947 1.047 1.020 0.560 0.597 0.572 0.5760.40 0.907 1.040 0.982 1.058 0.969 0.991 0.584 0.556 0.602 0.5810.80 0.946 1.066 1.051 1.035 1.015 1.023 0.624 0.552 0.613 0.5961.56 0.975 1.005 1.027 1.101 1.059 1.033 0.761 0.568 0.638 0.6563.13 1.027 1.034 1.020 0.999 1.035 1.023 0.582 0.592 0.633 0.6026.25 0.995 1.046 1.025 1.063 1.032 1.032 0.606 0.565 0.527 0.56612.50 0.994 1.010 1.043 1.026 1.053 1.025 0.557 0.527 0.606 0.56325.00 0.939 0.982 0.943 1.005 0.993 0.972 0.555 0.564 0.607 0.57550.00 0.871 0.929 0.987 0.917 0.967 0.934 0.527 0.543 0.514 0.528100.00 0.897 0.838 0.880 0.887 0.925 0.885 0.495 0.497 0.504 0.499200.00 0.822 0.750 0.741 0.977 0.817 0.821 0.463 0.467 0.462 0.464

I II III IV V Rata-rata

Kontrol

1.025 1.031 0.987 0.978 1.014 1.007 Tabel VII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP20 terhadap kultur sel Myeloma




0.20 1.027 1.051 1.081 1.115 1.095 1.074 0.572 0.518 0.486 0.5250.40 1.029 1.042 1.000 0.988 1.007 1.013 0.517 0.522 0.55 0.5300.80 0.933 1.020 1.045 1.072 1.005 1.015 0.538 0.563 0.55 0.5501.56 1.001 1.006 1.027 1.064 1.002 1.020 0.477 0.55 0.543 0.5233.13 0.948 0.982 0.995 0.926 0.998 0.970 0.541 0.531 0.56 0.5446.25 0.995 0.987 0.953 0.944 0.908 0.957 0.498 0.515 0.517 0.51012.50 0.841 0.945 0.953 0.923 0.967 0.926 0.473 0.476 0.485 0.47825.00 0.784 0.740 0.788 0.883 0.836 0.806 0.427 0.442 0.443 0.43750.00 0.680 0.720 0.749 0.744 0.736 0.726 0.416 0.409 0.428 0.418100.00 0.583 0.578 0.572 0.584 0.585 0.580 0.436 0.439 0.433 0.436200.00 0.551 0.468 0.493 0.477 0.486 0.495 0.485 0.458 0.408 0.450


Kontrol

1.047 1.055 1.080 1.056 1.061 1.060


42

Tabel VIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP30 terhadap kultur sel Myeloma




0.20 1.128 1.055 1.088 1.143 1.148 1.112 0.508 0.521 0.525 0.5180.40 1.060 1.047 1.070 1.085 0.973 1.047 0.516 0.511 0.519 0.5150.80 1.045 1.052 1.100 1.054 1.098 1.070 0.496 0.503 0.524 0.5081.56 1.022 1.027 1.071 1.023 1.070 1.043 0.489 0.500 0.522 0.5043.13 0.960 1.027 0.973 1.021 1.051 1.006 0.524 0.531 0.528 0.5286.25 0.870 0.830 0.845 0.896 0.906 0.869 0.559 0.502 0.515 0.52512.50 0.902 0.965 0.990 1.046 1.039 0.988 0.409 0.467 0.495 0.45725.00 0.914 0.909 0.966 0.984 0.949 0.944 0.466 0.618 0.489 0.52450.00 0.687 0.739 0.778 0.706 0.710 0.724 0.480 0.585 0.505 0.523100.00 0.609 0.567 0.647 0.600 0.615 0.608 0.469 0.508 0.565 0.514200.00 0.636 0.619 0.600 0.635 0.625 0.623 0.499 0.525 0.516 0.513


Kontrol

1.041 1.092 1.116 1.147 1.199 1.119 Tabel IX. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel Myeloma




0.20 1.081 1.119 1.183 1.196 1.173 1.150 0.488 0.515 0.526 0.5100.40 1.136 0.997 1.088 1.055 1.104 1.076 0.473 0.498 0.510 0.4940.80 1.041 1.048 1.102 1.119 1.062 1.074 0.469 0.478 0.500 0.4821.56 1.043 1.069 1.089 1.071 1.078 1.070 0.439 0.474 0.486 0.4663.13 0.952 0.975 1.102 0.964 1.049 1.008 0.436 0.462 0.485 0.4616.25 1.047 1.076 1.050 1.045 1.044 1.052 0.430 0.450 0.446 0.44212.50 0.919 1.006 0.988 0.954 0.961 0.966 0.444 0.442 0.453 0.44625.00 0.805 0.879 0.870 0.791 0.848 0.839 0.436 0.458 0.456 0.45050.00 0.693 0.711 0.673 0.697 0.727 0.700 0.441 0.449 0.453 0.448100.00 0.608 0.603 0.588 0.556 0.621 0.595 0.446 0.464 0.456 0.455200.00 0.598 0.631 0.654 0.612 0.585 0.616 0.477 0.505 0.528 0.503


Kontrol

1.055 1.067 1.064 1.109 1.080 1.075


43

Lampiran 4. Absorbansi sel Vero dengan metode MTT Tabel X. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP10 terhadap kultur sel Vero




0.20 0.893 0.867 0.879 1.165 0.873 0.935 0.608 0.642 0.642 0.6310.40 0.842 0.858 0.861 1.117 0.871 0.910 0.594 0.602 0.566 0.5870.80 1.140 0.857 0.781 0.990 0.782 0.910 0.617 0.593 0.530 0.5801.56 1.149 0.880 0.849 0.819 0.852 0.910 0.633 0.678 0.630 0.6473.13 1.175 0.889 0.884 0.919 0.906 0.955 0.613 0.648 0.604 0.6226.25 0.869 0.883 0.803 0.875 0.874 0.861 0.643 0.641 0.361 0.54812.50 0.905 0.898 0.880 0.877 0.879 0.888 0.666 0.657 0.652 0.65825.00 0.895 0.849 0.869 0.896 0.871 0.876 0.545 0.606 0.393 0.51550.00 0.873 0.869 0.844 0.852 0.844 0.856 0.722 0.591 0.528 0.614100.00 0.790 0.853 0.806 0.827 0.846 0.824 0.600 0.575 0.488 0.554200.00 0.699 0.659 0.738 0.716 0.768 0.716 0.594 0.508 0.626 0.576


Kontrol

0.872 0.918 0.853 1.050 0.908 0.920 Tabel XI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP20 terhadap kultur sel Vero




0.20 0.879 0.900 0.931 0.889 0.891 0.898 0.844 0.939 0.724 0.8360.40 0.892 0.819 0.886 0.880 0.921 0.880 0.870 0.685 0.665 0.7400.80 0.866 0.901 0.776 0.851 0.886 0.856 0.615 0.619 0.680 0.6381.56 0.862 0.876 0.890 0.845 0.803 0.855 0.633 0.621 0.722 0.6593.13 0.890 0.903 0.916 0.855 0.904 0.894 0.737 0.676 0.697 0.7036.25 0.934 0.932 0.848 0.910 0.841 0.893 0.639 0.593 0.694 0.64212.50 0.857 0.868 1.093 0.841 0.818 0.895 0.598 0.601 0.628 0.60925.00 0.884 0.880 1.102 1.012 0.866 0.949 0.666 0.631 0.624 0.64050.00 0.853 0.880 1.151 0.829 0.841 0.911 0.556 0.610 0.583 0.583100.00 0.844 0.828 0.966 0.854 0.855 0.869 0.555 0.564 0.645 0.588200.00 0.769 0.818 0.932 0.818 0.825 0.832 0.586 0.590 0.611 0.596


Kontrol

0.904 0.852 0.924 1.122 0.957 0.952


44

Tabel XII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP30 terhadap kultur sel Vero




0.20 0.868 0.850 0.840 1.185 0.854 0.919 0.589 0.586 0.593 0.5890.40 0.886 0.796 0.857 1.167 0.798 0.901 0.596 0.648 0.612 0.6190.80 1.097 0.957 0.838 0.772 0.794 0.892 0.558 0.593 0.644 0.5981.56 1.153 0.821 0.851 0.833 0.766 0.885 0.565 0.641 0.613 0.6063.13 1.034 0.798 0.818 0.927 0.796 0.875 0.598 0.604 0.790 0.6646.25 0.824 0.814 0.807 0.746 0.782 0.795 0.557 0.680 0.658 0.63212.50 0.776 0.830 0.784 0.793 0.812 0.799 0.566 0.603 0.639 0.60325.00 0.749 0.739 0.802 0.773 0.766 0.766 0.699 0.586 0.617 0.63450.00 0.753 0.785 0.837 0.793 0.779 0.789 0.578 0.811 0.723 0.704100.00 0.783 0.708 0.835 0.724 0.725 0.755 0.577 0.593 0.563 0.578200.00 0.847 0.751 0.720 0.700 0.707 0.745 0.601 0.793 0.555 0.650


Kontrol

1.020 0.880 0.811 1.098 0.732 0.908 Tabel XIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel Vero




0.20 0.799 0.788 0.768 0.776 0.788 0.784 0.489 0.831 0.598 0.6390.40 0.813 0.762 0.759 0.815 0.770 0.784 0.552 0.560 0.728 0.6130.80 0.815 0.783 0.856 0.753 0.767 0.795 0.679 0.561 0.769 0.6701.56 0.822 0.753 0.721 0.757 0.742 0.759 0.524 0.568 0.578 0.5573.13 0.786 0.741 0.764 0.755 0.744 0.758 0.548 0.582 0.567 0.5666.25 0.762 0.790 1.027 0.764 0.730 0.815 0.541 0.554 0.597 0.56412.50 0.791 0.780 1.091 0.768 0.713 0.829 0.522 0.549 0.581 0.55125.00 0.759 0.727 0.905 0.599 0.695 0.737 0.552 0.562 0.575 0.56350.00 0.696 0.671 0.818 0.691 0.693 0.714 0.640 0.549 0.579 0.589100.00 0.754 0.753 0.782 0.746 0.709 0.749 0.515 0.553 0.561 0.543200.00 0.804 0.763 0.737 0.758 0.781 0.769 0.562 0.550 0.551 0.554


Kontrol

0.843 0.834 0.866 0.833 0.811 0.837


45

Lampiran 5. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel Myeloma dengan metode MTT Fraksi 10% Myeloma Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 5 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .03946 .04030 .97923 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .19319 .04978 3.88125 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 3.826 DF = 9 P = .922 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * *

Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob


46

-.70 100.0 55.9 56.577 -.635 .56577 -.40 100.0 59.2 57.044 2.188 .57044 -.10 100.0 57.7 57.510 .160 .57510 .20 100.0 62.5 57.975 4.514 .57975 .49 100.0 58.2 58.417 -.192 .58417 .80 100.0 53.7 58.891 -5.187 .58891 1.10 100.0 54.1 59.347 -5.212 .59347 1.40 100.0 60.6 59.807 .762 .59807 1.70 100.0 59.7 60.266 -.603 .60266 2.00 100.0 61.6 60.723 .872 .60723 2.30 100.0 64.5 61.179 3.329 .61179 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.40220E-064 . . .02 1.13589E-057 . . .03 2.74521E-053 . . .04 5.44397E-050 . . .05 2.61847E-047 . . .06 5.02300E-045 . . .07 5.04235E-043 . . .08 3.12529E-041 . . .09 1.33314E-039 . . .10 4.21969E-038 . . .15 6.87634E-032 . . .20 5.95002E-027 . . .25 1.02368E-022 . . .30 6.51484E-019 . . .35 2.18090E-015 . . .40 4.82238E-012 . . .45 8.30282E-009 . . .50 .00001 . . .55 .01943 . . .60 33.45867 . . .65 73983.46543 . . .70 247666147.429 . . .75 1576183026037 . . .80 2.71176E+016 . . .85 2.34646E+021 . . .90 3.82375E+027 . .


47

.91 1.21030E+029 . . .92 5.16274E+030 . . .93 3.19990E+032 . . .94 3.21223E+034 . . .95 6.16201E+036 . . .96 2.96384E+039 . . .97 5.87752E+042 . . .98 1.42047E+047 . . .99 1.15069E+054 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

Fraksi 20% Myeloma

2 10-1 Log of konsentrasi

0.4

0.3

0.2

0.1

Probit

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.204


48

Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 7 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .37221 .04326 8.60454 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .08957 .04972 1.80139 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 31.597 DF = 9 P = .000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 48.2 43.227 5.021 .43227 -.40 100.0 54.4 47.665 6.710 .47665 -.10 100.0 56.2 52.133 4.022 .52133


49

.20 100.0 53.1 56.574 -3.438 .56574 .49 100.0 59.8 60.736 -.914 .60736 .80 100.0 57.8 65.066 -7.281 .65066 1.10 100.0 57.7 69.071 -11.324 .69071 1.40 100.0 65.2 72.904 -7.709 .72904 1.70 100.0 70.9 76.484 -5.558 .76484 2.00 100.0 86.4 79.786 6.589 .79786 2.30 100.0 95.8 82.794 12.992 .82794 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .00000 3.19869E-014 .00008 .02 .00000 8.81326E-013 .00025 .03 .00001 7.21888E-012 .00052 .04 .00001 3.50971E-011 .00090 .05 .00002 1.26979E-010 .00140 .06 .00004 3.79232E-010 .00204 .07 .00006 9.89453E-010 .00284 .08 .00010 2.33445E-009 .00382 .09 .00014 5.09450E-009 .00501 .10 .00021 .00000 .00643 .15 .00094 .00000 .01809 .20 .00315 .00000 .04138 .25 .00886 .00002 .08465 .30 .02241 .00010 .16211 .35 .05299 .00051 .29875 .40 .11987 .00245 .54061 .45 .26410 .01089 .97888 .50 .57461 .04577 1.81526 .55 1.25019 .18097 3.57637 .60 2.75436 .65206 7.99233 .65 6.23136 2.01452 22.34231 .70 14.73122 5.21144 83.77215 .75 37.27968 12.06896 420.00529 .80 104.83144 27.48309 2829.03840 .85 349.84731 67.07742 27944.68723 .90 1593.74508 196.94147 521945.78355 .91 2298.66827 254.38347 1062957.47735 .92 3421.92597 335.49935 2304792.83971 .93 5299.89437 454.26299 5404595.67630 .94 8639.00357 636.39946 14018887.3489 .95 15082.55125 933.50733 41632616.9751


50

.96 29027.30858 1461.93905 149793145.085 .97 64916.75024 2532.98320 724248853.596 .98 189244.20831 5246.93874 5898116142.47 .99 1021864.82774 16468.89681 161441433530 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

Fraksi 30% Myeloma

210-1 Log of konsentrasi

1.5

1.0

0.5

0.0

Probit


R Sq Linear = 0.687


51

Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 8 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .42258 .04371 9.66704 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .05817 .04977 1.16882 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 36.584 DF = 9 P = .000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 46.9 40.625 6.256 .40625


52

-.40 100.0 52.5 45.621 6.867 .45621 -.10 100.0 49.8 50.687 -.922 .50687 .20 100.0 51.8 55.742 -3.904 .55742 .49 100.0 57.2 60.481 -3.263 .60481 .80 100.0 69.3 65.393 3.859 .65393 1.10 100.0 52.5 69.906 -17.395 .69906 1.40 100.0 62.5 74.180 -11.720 .74180 1.70 100.0 82.1 78.116 3.951 .78116 2.00 100.0 91.6 81.682 9.953 .81682 2.30 100.0 90.2 84.862 5.337 .84862 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .00000 4.76548E-012 .00026 .02 .00001 7.86866E-011 .00072 .03 .00003 4.65712E-010 .00137 .04 .00005 1.77314E-009 .00223 .05 .00009 5.25802E-009 .00332 .06 .00015 .00000 .00466 .07 .00023 .00000 .00627 .08 .00034 .00000 .00818 .09 .00049 .00000 .01042 .10 .00068 .00000 .01302 .15 .00257 .00000 .03292 .20 .00743 .00002 .06919 .25 .01846 .00011 .13165 .30 .04182 .00049 .23634 .35 .08923 .00198 .41034 .40 .18316 .00737 .70185 .45 .36727 .02574 1.20324 .50 .72836 .08541 2.11121 .55 1.44449 .26840 3.91095 .60 2.89648 .78190 8.04016 .65 5.94530 2.03861 19.61246 .70 12.68513 4.70681 59.68338 .75 28.73874 10.04641 229.24831 .80 71.44463 21.20876 1130.55378 .85 206.52628 47.57792 7734.09166 .90 785.28234 125.67217 90958.83277 .91 1084.24046 158.22016 165672.49935 .92 1539.30609 202.93474 318208.79755 .93 2262.95730 266.46345 653082.60162


53

.94 3480.01909 360.69798 1459837.88356 .95 5685.23033 508.73493 3658982.03418 .96 10120.24892 760.76354 10787123.7564 .97 20562.65489 1245.25186 40830756.0371 .98 52767.02760 2391.34889 240185265.490 .99 233047.25710 6659.78799 3938220648.64 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

Fraksi 40% Myeloma


1.0

0.5

0.0

Probit


R Sq Linear = 0.755


54

Probit * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 7 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .45361 .04303 10.54194 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -.14319 .05004 -2.86180 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 34.694 DF = 9 P = .000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 40.4 32.267 8.130 .32267 -.40 100.0 45.8 37.308 8.521 .37308


55

-.10 100.0 44.9 42.577 2.347 .42577 .20 100.0 43.8 47.982 -4.137 .47982 .49 100.0 49.1 53.176 -4.097 .53176 .80 100.0 43.2 58.683 -15.465 .58683 1.10 100.0 51.7 63.847 -12.151 .63847 1.40 100.0 63.9 68.826 -4.975 .68826 1.70 100.0 76.5 73.483 3.026 .73483 2.00 100.0 87.0 77.758 9.231 .77758 2.30 100.0 89.5 81.610 7.910 .81610 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .00002 1.34449E-009 .00072 .02 .00006 .00000 .00193 .03 .00015 .00000 .00360 .04 .00029 .00000 .00576 .05 .00049 .00000 .00845 .06 .00077 .00000 .01172 .07 .00115 .00000 .01562 .08 .00165 .00000 .02020 .09 .00229 .00001 .02553 .10 .00309 .00001 .03169 .15 .01074 .00010 .07790 .20 .02886 .00055 .16039 .25 .06741 .00231 .30059 .30 .14442 .00830 .53411 .35 .29257 .02671 .92321 .40 .57169 .07933 1.58491 .45 1.09306 .22015 2.76189 .50 2.06856 .57088 5.02339 .55 3.91462 1.36750 9.89072 .60 7.48472 2.98931 21.88028 .65 14.62557 6.01181 55.47173 .70 29.62899 11.49167 161.52568 .75 63.47330 21.74465 544.29706 .80 148.26379 42.43217 2194.89037 .85 398.56726 89.77076 11488.86096 .90 1383.14776 224.93824 94475.95916 .91 1868.02883 280.10651 157552.61787 .92 2589.22857 355.18874 274829.13169 .93 3707.42687 460.78558 507130.36505 .94 5535.93433 615.68833 1006118.20489


56

.95 8745.28180 856.02520 2199903.04239 .96 14965.22090 1259.39620 5521406.86654 .97 28967.25131 2021.71132 17137336.1743 .98 69693.13965 3786.06821 77377149.2892 .99 278060.19544 10145.88719 835211518.597 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

Lampiran 6. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel Vero dengan metode MTT


1.5

1.0

0.5

0.0

Probit


R Sq Linear = 0.786


57

Fraksi 10% Vero Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 7 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .11447 .04217 2.71431 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .41548 .05100 8.14716 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 15.584 DF = 9 P = .076 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob


58

-.70 100.0 66.9 63.137 3.747 .63137 -.40 100.0 65.0 64.428 .529 .64428 -.10 100.0 64.1 65.704 -1.565 .65704 .20 100.0 71.4 66.961 4.480 .66961 .49 100.0 63.8 68.144 -4.324 .68144 .80 100.0 66.0 69.392 -3.348 .69392 1.10 100.0 75.1 70.576 4.487 .70576 1.40 100.0 60.7 71.752 -11.019 .71752 1.70 100.0 73.6 72.905 .716 .72905 2.00 100.0 70.7 74.035 -3.383 .74035 2.30 100.0 84.8 75.139 9.647 .75139 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.11412E-024 6.60956E-089 2.64388E-014 .02 2.68164E-022 2.44512E-080 6.40481E-013 .03 8.69694E-021 6.67326E-075 4.84107E-012 .04 1.19126E-019 8.19507E-071 2.21748E-011 .05 1.00133E-018 1.73674E-067 7.64793E-011 .06 6.13098E-018 1.17699E-064 2.19413E-010 .07 3.00286E-017 3.57260E-062 5.52902E-010 .08 1.24552E-016 5.96291E-060 1.26500E-009 .09 4.54183E-016 6.26129E-058 2.68556E-009 .10 1.49431E-015 4.54093E-056 5.37070E-009 .15 2.06935E-013 2.28820E-048 .00000 .20 1.04170E-011 3.02155E-042 .00000 .25 3.00492E-010 5.37492E-037 .00001 .30 6.15228E-009 2.78032E-032 .00004 .35 .00000 6.46699E-028 .00020 .40 .00000 8.95996E-024 .00094 .45 .00002 9.04733E-020 .00428 .50 .00023 7.80680E-016 .01920 .55 .00294 6.59251E-012 .08799 .60 .03833 .00000 .43628 .65 .54514 .00062 2.82778 .70 8.94399 1.36991 152.93063 .75 183.11982 26.85066 2354409.62578 .80 5282.29961 236.44442 338032318291 .85 265909.30861 2514.29955 4.11834E+017 .90 36823543.7971 46262.24474 1.99068E+025 .91 121153693.058 93080.67424 1.43497E+027


59

.92 441790363.419 198713.84451 1.49839E+029 .93 1832453448.69 457000.85041 2.48802E+031 .94 8975061404.70 1157185.62175 7.51561E+033 .95 54952969343.9 3335096.20755 5.07009E+036 .96 461913355042 11553157.1544 1.06977E+040 .97 6327046260182 53148679.4213 1.30807E+044 .98 2.05195E+014 403499798.721 3.55430E+049 .99 4.93896E+016 9823125012.90 1.30840E+058 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Prob

it


R Sq Linear = 0.348

Fraksi 20% Vero Probit


60

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 11 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.22322 .04515 -4.94422 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .90556 .05873 15.41923 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 15.612 DF = 9 P = .075 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 93.5 85.579 7.872 .85579 -.40 100.0 85.3 83.998 1.335 .83998 -.10 100.0 77.1 82.309 -5.213 .82309 .20 100.0 79.4 80.511 -1.159 .80511 .49 100.0 80.0 78.695 1.315 .78695


61

.80 100.0 73.6 76.643 -3.014 .76643 1.10 100.0 69.9 74.560 -4.651 .74560 1.40 100.0 67.6 72.358 -4.767 .72358 1.70 100.0 65.6 70.067 -4.507 .70067 2.00 100.0 70.4 67.693 2.742 .67693 2.30 100.0 75.1 65.245 9.883 .65245 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 3.01106E+014 41192994581.7 2.52145E+023 .02 1.80925E+013 5483374292.43 2.39653E+021 .03 3038584414623 1524970034.57 1.24963E+020 .04 793961759450 582209697.731 1.35476E+019 .05 266488459142 265985145.591 2.22352E+018 .06 105226909475 136528644.235 4.77624E+017 .07 46589818175.0 76072583.7200 1.24012E+017 .08 22463284592.4 45057482.3900 3.70805E+016 .09 11570181868.6 27981125.5850 1.23690E+016 .10 6282221127.36 18045944.0725 4.50260E+015 .15 501190366.187 2933062.26302 6.86769E+013 .20 67182985.0316 691195.29797 2475110431062 .25 11981830.0132 199739.13717 143236305880 .30 2547621.80597 65407.13707 11101417148.9 .35 606830.06241 23203.10260 1039865545.06 .40 155538.03539 8658.53202 110190903.831 .45 41669.11520 3325.58413 12599924.1576 .50 11398.85283 1290.81591 1498089.48168 .55 3118.22906 497.33387 179440.39879 .60 835.38310 186.21404 21047.55658 .65 214.11900 65.61337 2362.04690 .70 51.00202 20.31662 253.48311 .75 10.84424 4.50300 29.02594 .80 1.93403 .47079 4.64280 .85 .25925 .02107 .88092 .90 .02068 .00035 .13083 .91 .01123 .00013 .08339 .92 .00578 .00004 .05124 .93 .00279 .00001 .03006 .94 .00123 .00000 .01661 .95 .00049 .00000 .00846 .96 .00016 .00000 .00383 .97 .00004 .00000 .00145 .98 .00001 7.09174E-010 .00040 .99 .00000 6.79379E-012 .00005


62

Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

Prob

it


R Sq Linear = 0.62



63

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 9 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .28910 .04584 6.30665 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .55396 .05209 10.63538 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 9.066 DF = 9 P = .431 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 63.7 63.754 -.097 .63754 -.40 100.0 68.9 66.964 1.971 .66964 -.10 100.0 67.7 70.054 -2.345 .70054 .20 100.0 69.3 73.005 -3.667 .73005


64

.49 100.0 76.8 75.679 1.132 .75679 .80 100.0 82.1 78.379 3.681 .78379 1.10 100.0 78.4 80.815 -2.432 .80815 1.40 100.0 85.5 83.100 2.388 .83100 1.70 100.0 90.6 85.202 5.395 .85202 2.00 100.0 80.5 87.122 -6.648 .87122 2.30 100.0 89.5 88.861 .642 .88861

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.08895E-010 1.73122E-015 .00000 .02 9.54829E-010 4.02923E-014 .00000 .03 3.78598E-009 2.96705E-013 .00000 .04 .00000 1.33208E-012 .00000 .05 .00000 4.51844E-012 .00000 .06 .00000 1.27774E-011 .00000 .07 .00000 3.17860E-011 .00001 .08 .00000 7.18762E-011 .00001 .09 .00000 1.50945E-010 .00001 .10 .00000 2.98816E-010 .00002 .15 .00000 5.04625E-009 .00010 .20 .00001 .00000 .00031 .25 .00006 .00000 .00087 .30 .00019 .00000 .00218 .35 .00056 .00001 .00513 .40 .00161 .00004 .01155 .45 .00446 .00018 .02540 .50 .01213 .00075 .05540 .55 .03300 .00314 .12155 .60 .09124 .01327 .27285 .65 .26101 .05784 .64152 .70 .79021 .26146 1.64839 .75 2.61155 1.19369 5.09214 .80 9.88568 5.07036 22.83387 .85 46.65104 20.58619 174.51767 .90 328.64328 101.32731 2671.21854 .91 526.63468 147.28860 5219.44317 .92 878.98248 220.55608 10833.91663 .93 1543.82741 342.99635 24241.38871 .94 2896.00510 560.38548 59728.03472 .95 5934.52567 978.77646 167409.38756


65

.96 13786.69830 1880.44836 563152.53238 .97 38859.93216 4186.33378 2508228.22153 .98 154082.79880 12095.15216 18323765.0373 .99 1351056.60786 64115.21205 422788266.646 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Prob

it


R Sq Linear = 0.808



66

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.06298 .04458 -1.41287 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .80380 .05602 14.34896 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 17.179 DF = 9 P = .046 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 82.7 80.173 2.575 .80173 -.40 100.0 79.6 79.641 .002 .79641 -.10 100.0 85.1 79.100 5.957 .79100 .20 100.0 75.8 78.551 -2.713 .78551 .49 100.0 77.0 78.019 -.987 .78019


67

.80 100.0 70.1 77.441 -7.367 .77441 1.10 100.0 66.8 76.874 -10.064 .76874 1.40 100.0 79.2 76.293 2.929 .76293 1.70 100.0 85.1 75.703 9.433 .75703 2.00 100.0 75.4 75.106 .318 .75106 2.30 100.0 74.4 74.501 -.088 .74501 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 4.99783E+049 . . .02 2.34748E+045 . . .03 4.21220E+042 . . .04 3.62019E+040 . . .05 7.55754E+038 . . .06 2.80633E+037 . . .07 1.56349E+036 . . .08 1.17828E+035 . . .09 1.12219E+034 . . .10 1.28844E+033 . . .15 1.65276E+029 . . .20 1.33379E+026 . . .25 2.96117E+023 . . .30 1.22582E+021 . . .35 7.58906E+018 . . .40 6.09236E+016 . . .45 5.72083E+014 . . .50 5784632555877 . . .55 58491426738.3 . . .60 549245065.404 . . .65 4409240.47303 . . .70 27297.65243 . . .75 113.00269 . . .80 .25088 . . .85 .00020 . . .90 .00000 . . .91 2.98185E-009 . . .92 2.83989E-010 . . .93 2.14021E-011 . . .94 1.19238E-012 . . .95 4.42763E-014 . . .96 9.24315E-016 . . .97 7.94405E-018 . . .98 1.42545E-020 . . .99 6.69530E-025 . . Abbreviated Extended


68

Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.1

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

Prob

it


R Sq Linear = 0.103

Lampiran 7. Uji distribusi data sel Myeloma dengan Kolmogorov-Smirnov

Pada semua fraksi protein, diperoleh hasil: “test distribution is normal.” One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test


69

Sel Myeloma FP10

N 5 Mean 1 E+009

Normal Parameters(a,b) Std. Deviation ******* Absolute .473 Positive .473

Most Extreme Differences

Negative -.327 Kolmogorov-Smirnov Z 1.057 Asymp. Sig. (2-tailed) .214

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Sel Myeloma FP20 N 5

Mean .5884100 Normal Parameters(a,b) Std. Deviation .16161862

Absolute .306 Positive .161


Negative -.306 Kolmogorov-Smirnov Z .685 Asymp. Sig. (2-tailed) .736









Mean 2.0991200 Normal Parameters(a,b) Std. Deviation .51951458




Lampiran 8. Uji distribusi data sel Vero dengan Kolmogorov-Smirnov

Pada semua fraksi protein, diperoleh hasil: “test distribution is normal.”


70


Sel Vero FP10 N 5






Sel Vero FP20 N 5

Mean 310509.4340 Normal Parameters(a,b) Std. Deviation 204173.68

310 Absolute .185 Positive .139



One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test vero FP30

Sel Vero FP30 N 5






Sel Vero FP40 N 3

Normal Parameters(a,b) Mean 71273650072300000000


71

0000.0000 Std. Deviation 1234193166

275370000000000.0000

0 Absolute .385 Positive .385




72

Lampiran 9. Hasil uji signifikansi LC50 antara sel Myeloma dan sel Vero dengan analisis statistik uji T- independent sample

Levene's Test for Equality of Variances

t-test for Equality of Means

95% Confidence Interval of the Difference

F

Sig.

t

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Std. Error Difference

Lower Upper

Equal variances assumed 7.111 .029 -1.000 8 .347 .28E+058 .28E+058 -4E+058 2E+058

FP10 Equal variances not assumed -1.000 4.000 .374 .28E+058 .28E+058 -5E+058 2E+058

Equal variances assumed 38.264 .000 -1.784 8 .112 -402053.9 225304.84 -921608 117500.0

FP20 Equal variances not assumed -1.784 4.000 .149 -402053.9 225304.84 -1027600 223492.6

Equal variances assumed .784 .402 7.898 8 .000 .67101200 .08495550 47510427 86691973

FP30 Equal variances not assumed 7.898 7.552 .000 .67101200 .08495550 47306071 86896329

Equal variances assumed 6.414 .035 -1.231 8 .253 3.69E+069 2.99E+069 -1E+070 3E+069

FP40 Equal variances not assumed -1.231 4.000 .286 3.69E+609 2.99E+069 -1E+070 5E+069


73

Lampiran 10. Foto Tanaman Azadirachta indica A. Juss

Lampiran 11. Foto Daun Azadirachta indica A. Juss


74

Lampiran 12. Foto ELISA reader SLT 340ATC

Lampiran 13. Foto Mikroskop Olympus


75

Lampiran 14. Foto Sentrifuge Hitachi

Lampiran 15. Foto 96 Well Plate


76

Lampiran 16. Foto Spektrofotometer UV

Lampiran 17. Foto Sentrifuge K PLC Series


77

Lampiran 18. Nilai r tabel dan r hitung pada sel Myeloma dan sel Vero Diketahui nilai korelasi (r) pada tabel untuk taraf signifikansi 5%: r = 0,602

Nilai korelasi FP pada sel Myeloma

FP10 r2 = 0,204 r = 0,452

r hitung < r tabel, sehingga kolerasinya tidak linier

FP20 r2 = 0,687 r = 0,829

r hitung > r tabel, sehingga kolerasinya linier

FP30 r2 = 0,755 r = 0,869


FP40 r2 = 0,786 r = 0,887


• Nilai korelasi FP pada sel Vero

FP10 r2 = 0,348 r = 0,589

r hitung < r tabel, sehingga kolerasinya tidak linier

FP20 r2 = 0,620 r = 0,787


FP30 r2 = 0,795 r = 0,892

t hitung > t tabel, sehingga kolerasinya linier

FP40 r2 = 0,103 r = 0,321

t hitung < t tabel, sehingga kolerasinya tidak linier


78


79

BIOGRAFI PENULIS

.

Penulis yang bernama lengkap Alfonsia Purnamasari

lahir di Yogyakarta pada tanggal 01 Agustus 1985.

Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara

dari pasangan Bapak Eddy Purnomo dan Ibu Yustina

Maria S. Tahun 1989 hingga 1991 menempuh

pendidikan taman kanak-kanak di TK Karitas Nandan

Yogyakarta. Tahun 1991 hingga 1997 menempuh

pendidikan sekolah dasar di SD Tarakanita Bumijo

Yogyakarta, dilanjutkan dengan menempuh pendidikan

di SLTP Stella Duce 1 Yogyakarta. Tahun 2000 hingga

2003 menempuh pendidikan di SMU Bopkri II

Yogyakarta. Tahun 2003 berkesempatan untuk

melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.


TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA SKRIPSI - core.ac.uk · 11. Teman-teman kelas A, khususnya kelo mpok...

Documents

Transcript of TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA SKRIPSI - core.ac.uk · 11. Teman-teman kelas A, khususnya kelo mpok...