Purifikasi Hasil PCR

5/28/2018 Purifikasi Hasil PCR

1/9

1. Purifikasi Hasil PCR4.1.Tujuan

Purifikasi hasil PCR adalah teknik yang bertujuan untuk memperoleh DNA hasil

PCR (DNA amplikon) yang murni.

4.2.Prinsip

Purifikasi hasil PCR merupakan suatu metode yang dilakukan untuk

membersihkan DNA dari PCRmaster mix, seperti sisa-sisa buffer, dNTPmix, primer,

nuklease, dan enzimDNA-Taqpolymerase. Pada makalah ini, kami akan membahas

tentang metode purifikasi hasil PCR menggunakan Geneaid Gel/PCR DNA

Fragments Extraction Kit.

4.3.Teori DasarSecara umum, purifikasi hasil PCR dapat dilakukan secara kualitatif ataupun

kuantitatif. Pemeriksaan purifikasi secara kualitatif dengan elektroforesis agaros gel

mini atau secara kuantitatif dengan spektrofotometer nanodrop. Purifikasi ini penting

terkait masalah reproduksibilitas karena dalam pemeriksaan atau diagnosis DNA atau

RNA yang digunakan harus dimurnikan terlebih dahulu. Setelah dilakukan PCR,

purifikasi amplikon DNA dapat dilakukan dengan metode atau kit berikut yaitu

Geneaid Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit. Purifikasi ini dimaksudkan guna

memperoleh DNA yang murni dengan sisa primer, primer dimer, nukleotida (sisa

dNTPs), enzim polymerase, dan garam-garam dengan menggunakan membran dan

sentrifugasi. Pengerjaan purifikasi DNA hasil PCR ini harus hati-hati dengan adanya

nuklease, yaitu enzim yang dapat mendegradasi DNA/RNA.

4.4.Alat dan Bahan

Alat:

1) Tabung mikro 1,5 ml (Tabung eppendorf)2) Vortex3) Inkubator4) Kolom DF5) Tabung penampung6) Sentrifugator

Bahan:

1) Genom DNA2) Loading buffer (Kristal

violet)

3) Gel agaros 1 %4) Buffer DF5) Wash buffer


2/9

7) Freezer8) Filter kolom9) Spektrofotometri Nanodrop

6) Etanol7) Aquabidest


3/9

4.5.Prosedur Kerja

Purifikasi menggunakan Geneaid Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit

mula-mula DNA hasil amplifikasi PCR sebanyak 20 l diambil dan dicampur dengan

5 l loading buffer (kristal violet) untuk dilakukan elektroforesis di gel agaros 1%.

Pita DNA yang diinginkan diiris pada gel tersebut dan dipindahkan ke dalam tabung

mikro 1,5 ml yang baru dan steril. Ke dalam irisan gel tersebut ditambahkan 300 l

dapar DF lalu divortex dan diinkubasi pada 55-60oC selama 10-15 menit hingga larut.

Campuran didiamkan pada suhu kamar. Kemudian campuran tersebut dipipet dan

dimasukkan ke dalam kolom DF yang terpasang pada tabung penampung. Lalu

disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang dan

kolom DF ditempatkan kembali pada penampung. Pada tabung tersebut ditambahkan

600 l wash buffer yang telah ditambah etanol dan disentrifugasi kembali dengan

kecepatan yang sama selama 30 detik. Cairan yang terkumpul dibuang kembali dan

kolom DF dikemablikan pada tabung penampung, sentrifugasi kembali hingga

membran kolom mengering. Kolom DF yang telah kering dipindahkan ke tabung baru

dan steril 1,5 ml dan ditambahkan dengan 25 l aquabidest pada bagian tengah kolomDF. Hal ini untuk mencegah terjadinya pengendapan pada dinding kolom. Aquabidest

dibiarkan hingga terserap lalu disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk

memperoleh DNA murni. DNA yang telah diperoleh disimpan pada suhu -20oC.

Setelah dilakukan PCR, DNA yang murni yang diperoleh tersebut dapat diamati

purifikasinya secara visual secara kualitatif dengan elektroforesis agaros gel mini atau

secara kuantitatif dengan spektrofotometer nanodrop. Secara kualitatif dapat

dibandingkan antara hasil elektroforesis DNA amplikon murni dengan penanda

ukuran molekul. Sedangkan untuk memperoleh data purifikasi secara kuantitatif dapat

digunakan nanodrop.


4/9

BAB 2

Isolasi Plasmid dan Kloning DNA

1. Isolasi Plasmid1.1. Tujuan

Pada pembahasan kali ini isolasi/ekstraksi DNA plasmid bertujuan untuk

memperoleh DNA plasmid dengan kualitas kemurnian yang baik menggunakan

metode modifikasi Alkalin Lisis dan netralisasi.

1.2. PrinsipInti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga

semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA

ekstrakromosomal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja perlu dilakukan

pemurnian dari debris mebran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Tahapan yang

digunakan untuk isolasi plasmid menggunakan PrepEase MiniSpin Plasmid Kit

ada 9 tahap, yaitu penyiapan kultur LB, Pemanenan sel bakteri, Sel lisis dan

netralisasi, Pemurnian hasil lisis, Penempelan plasmid ke kolom, Penyiapan

plasmid kolom, Pencucian kolom, Pengeringan kolom, dan Elusi.

1.3. Teori DasarPlasmid adalah molekul DNA ekstrakromosomal yang ukurannya bervariasi

antara 1 kb hingga lebih dari 200 kb. Pada umumnya plasmid berbentuk double-

stranded, covalend closed, sirkular yang dapat diisolasi dari sel bakteri dalam

bentuk superheliks. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa

genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid

juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa

mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama penggunaan plasmid ini adalah karena

plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah

gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah

dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu.

1.4. Alat dan BahanAlat:

1) Sentrifuge mikroBahan:

1) Bakteri yang berisi plasmid


5/9

2) Tabung mikro 1.5 mL3) Pipet mikro 1 mL, 200 L beserta

tip-nya

4) Beberapa beaker glass5) Rak tabung mikro6) Tabung reaksi steril7) Vortex mixer8) PrepEase MiniSpin Plasmid

Columns

9) PrepEase Collecting Tubes

2) Medium LB yang mengandungantibiotic yang sesuai

3) A1 buffer4) A2 buffer5) A3 buffer6) A4 buffer7) AW buffer8) AE buffer9) Etanol

1.5. ProsedurPenyiapan kultur LB dilakukan dengan cara diambil stok bakteri yang berisi

plasmid, diinokulasi ke dalam medium LB (5-10 ml) yang mengandung antibiotik

yang sesuai. Inkubasi semalaman sambil digoyang-goyangkan (12-16 jam).

Selanjutnya pemanenan sel bakteri dilakukan dengan cara memanen sebanyak 1-5

ml kultur LB lalu dimasukkan ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml, lalu

lakukan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 30 detik , dan hati-hati membuang

supernatan. Ulangi seperlunya untuk mendapatkan pelet dari volume kultur yangdiinginkan. Langkah-langkah ini dilakukan pada suhu kamar, kecuali dinyatakan

lain.

Tahap selanjutnya adalah sel lisis dan netralisasi, pertama-tama resuspensikan

pelet sel bakteri dalam 250 l A1 buffer, lalu vortex kuat. Selanjutnya suspensinya

di lisis dengan menambahkan 250 l A2 buffer, dicampur secara lembut dengan

cara membalik-balikan tabung perlahan (6-8 kali). Inkubasi hasil lisis yang

dihasilkan selama 2-3 menit pada suhu kamar (max. 5 menit). Jangan divortex,

karena hal ini akan membuat kontaminasi kromosom DNA dari puing-puing selular

ke dalam suspensi. Selanjutnya netralisasi hasil lisis dengan menambahkan 300 l

A3 buffer, dicampur secara lembut dengan cara membalik-balikan tabung perlahan

(6-8 kali) atau sampai keputihan.


6/9

Tahap berikutnya adalah pemurnian hasil lisis, memperjelas hasil lisis dengan

sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya pelekatan plasmid ke

kolom dilakukan dengan cara tempatkan kolom PrepEase MiniSpin dalam 2 ml

tabung penampung, tambahkan hasil lisis ke tabung. Lalu lakukan sentrifugasi pada

1.000 rpm selama 1 menit. Buang cairan.

Selanjutnya pilihan pencucian menggunakan AW buffer dilakukan untuk

menghapus semua nuklease, dan khususnya untuk strain inang yang mengandung

nuclease tingkat tinggi. Tempatkan kolom PrepEase MiniSpin ke 2 ml tabung

pengumpul. Tambahkan 500 l AW buffer, lalu lakukan sentrifugasi pada 1.000

rpm selama 1 menit. Buang cairan

Selanjutnya pencucian kolom dilakukan dengan menempatkan kolom PrepEase

MiniSpin ke dalam 2 ml tabung pengumpul. Tambahkan 600 l A4 Buffer (lengkap

dengan etanol). Lalu lakukan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 1 menit. Buang

cairan. Selanjutnya untuk mengeringkan kolom, sekali lagi tempatkan Kolom

PrepEase MiniSpin kembali ke 2 ml tabung pengumpul. Lakukan sentrifugasi pada

1000 rpm selama 2 menit. Residual etanol wash bufferyang mungkin menghambat

reaksi enzimatik, dihilangkan dengan langkah ini. Tahap yang terakhir adalah elusi

yang dilakukan dengan menempatkan kolom PrepEase MiniSpin ke tabung

microcentrifuge1,5 ml. Lalu tambahkan 50 ml AE Buffer. Inkubasi 1 menit. Lalulakukan sentrifugasi pada 1000 rpm selama 1 menit. Supernatan berisi plasmid

yang telah dielusi.

2. Pemotongan/Digesti DNA Plasmid dengan Enzim Restriksi2.1. Tujuan

Pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi bertujuan untuk

memperoleh fragmen DNA plasmid yang terpotong menjadi linier agar siap untuk

disisipi dengan fragmen DNA sisipan.

2.2. PrinsipPemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi bertujuan untuk

memperoleh fragmen DNA plasmid yang terpotong menjadi linier. Fragmen-


7/9

fragmen DNA ini siap disisipi oleh fragmen DNA yang akan disisipkan, dan

digunakan untuk merekonstruksi DNA plasmid untuk disisipkan ke dalam DNA

target. Teknik digesti ini banyak dipakai untuk mengklon DNA asing ke vektor,

maupun pada verifikasi Plasmid DNA rekombinan.

2.3. Teori DasarPemotongan DNA dilakukan menggunakan enzim nuklease. Nuklease

merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan

fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya. Jenis nuklease ada

dua yaitu eksonuklease dan endonuklease. Endonuklease merupakan nuklease yang

memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil pemotongan

molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan tertentu dan

menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang akan

dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya.

Dalam pemotongan DNA plasmid ini digunakan dua enzim restriksi

endonuklease, yaitu EcoRI dan BamHI. Enzim EcoRI diperoleh dari bakteri E.coli,

sedangkan enzim BamHI diperoleh dari enzim Bacillus sp. Enzim EcoRI memotong

molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5-GAATTC-3 (5 overhang).

Sedangkan enzim BamHI memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5-

GGATCC-3 (5 overhang).2.4. Alat dan Bahan

Alat:

1) Pipet mikro 0-20 l2) Pipet mikro 20-200 l3) Tabung mikro 1,5 mL4) Rak tabung mikro5) Bak es dan es yang telah

dihancurkan untuk menjaga suhu

enzim restriksi agar enzim tidak

terpengaruh dengan suhu ruangan

yang tinggi

6) Inkubator

Bahan:

1) pUC19 (yang diisolasisebelumnya)

2) Enzim endonuklease restriksi(ER):BamHI, EcoRI

3) Buffer masing-masing ER4) dH2O steril (atau 1xTE pH8)5) Standar ukuan molekul DNA


8/9

7) Dry bath8) Termometer9) Elektroforesis

2.5. ProsedurProses dimulai dengan pencampuran pUC19 dengan enzim RE EcoRI dan

BamHI pada tabung mikro yang berbeda dan diisikan dengan buffer bagi masing-

masing enzim dan pemberian aquadest.

DNA (l) 10xbuffer

(l)

EnzimRestriksi/

5 unit (l)

dH2O Steril

(l)

Total Volume

(l)

pUC19 (2) 2 0 16 20

pUC19 (2) 2 BamHI 15 20

pUC19 (2) 2 EcoRI 15 20

Masing-masing tabung mikro diinkubasikan dalam alat inkubator dengan suhu

37C selama minimal 2 jam. Dipilih suhu 37 C karena enzim restriksi yang

digunakan (BamHI danEcoRI) stabil dalam suhu ini. Namun, bila digunakan enzim

restriksi lain perlu diingat bahwa tidak semua enzim restriksi bekerja optimal pada

suhu 37C (contohnya: enzim restriksi yang diambil dari bakteri termofilik

memiliki suhu optimal 50-65 C, sedangkan enzim restriksi lainnya seperti SmaI

hanya memiliki waktu paruh hidup yang singkat dalam 37 C, sehingga harus

digunakan dalam suhu 25 C).

Setelah 2 jam, tabung ditambahkan loading buffer, lalu siapkan dry bath,

masukkan air pada lubang-lubang dry bath lalu letakkan termometer di tengahnya

tunggu hingga bersuhu 65oC, lalu masukkan tabung mikronya selama 5 menit.


9/9

Gambar. Dry Bath

Setalah itu dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis dengan urutan

sebagai berikut mulai dari yang paling kiri:

- Standar ukuran molekul (DNA ladder)

- pUC19BamH1

- pUC19EcoR1

- pUC19 utuh

Selanjutnya dibandingkan dengan standar ukuran molekul dan DNA yang tidak

di digesti.

Purifikasi Hasil PCR

Documents

Transcript of Purifikasi Hasil PCR