Laporan Praktikum Proyek Genetika Molekuler Mikroba

Percobaan 04

Transformasi

Nama : Ridwan Muhamad Rifai

NIM : 10408040

Tgl. Percobaan : 30 September 2010

Tgl. Pengumpulan : 7 Oktober 2010

Kelompok : 6

Asisten : Rahma

Program Studi Mikrobiologi

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati

Institut Teknologi Bandung

2010

1. Tujuan

a. Mengisolasi bakteri yang berhasil mengalami transformasi plasmid p-GEMT

b. Mengisolasi bakteri yang berhasil mengalami transformasi plasmid p-GEMT

yang telah diligasi

2. Metode

Transformasi dilihat dari namanya berarti perubahan. Perubahan yang dimaksudkan

di sini adalah perbahan karakteristik suatu bakteri karena dimasukki oleh suatu

materi genetik yang disebut plasmid yang menambah/mengubah kemampuan

metabolisme bakteri terhadap suatu substrat. Transformasi terjadi secara alami di

alam namun juga dapat dilakukan secara artifisisal. Tidak semua sel bakteri dapat

mengalami transformasi. Sel yang siap melakukan transformasi disebut sel

kompeten.(MERCK, 2010)

Sel kompeten dapat dibuat dari kultur Escherichia coli murni yang diterapi dengan

metode CaCl. Bila sel didinginkan dalam kation bivalen semisal Ca2+ membuat

membran sel permeabel terhadap plasmid DNA. Sel kemudian diinkubasi dalam es

selama beberapa lama agar terjaga kekompetenannya dan ketika akan

ditransformasikan maka diberi heat-shock pada 42oC sehingga plasmid dapat masuk.

(Alberts, 2002)

Plasmid yang digunakan adalah p-GEMT yang memiliki fragmen DNA resisten

ampicillin sehingga bila transformasi berhasil maka sel bakteri akan resisten dan

dapat hidup dalam medium ber-ampicillin. Sedangkan bila transformasi gagal maka

tak akan ada bakteri yang dapat tumbuh dalam medium berampicillin.

Selain itu ada satu jenis plasmid lagi yang digunakan yaitu p-GEMT namun telah

diligasi oleh suatu fragmen DNA dengan panjang 750 kb (lih. Percobaan 3 : Purifikasi

DNA dan Ligasi). Proses ligasi fragmen DNA ini menyebabkan gen lacZ putus

sehingga enzim β-galactosidase tak dapat diekspresikan. Enzim ini menghidrolisis X-

gal, suatu modifikasi dari galaktosa, menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-kloro-3-

hidroksiindol. Selanjutnya 5-bromo-4-kloro-3-hidroksiindol ini akan teroksidasi dan

berubah menjadi 5,5’-dibromo-4,4’-dikloro-indigo. Berikut adalah pemetaan dari

plasmid p-GEMT.

Untuk mendeteksi proses transformasi p-GEMT terligasi ini tidak cukup dengan

melihat keresistennan bakteri dalam medium ber-ampicillin. Dilakukan blue-white

screening untuk menentukan apakah proses transformasi berhasil. Telah diketahui

bahwa enzim β-galactosidase tak dapat diekspresikan pada plasmid yang terligasi

sehingga substrat X-gal pada medium tak dapat dihidrolisis menjadi galaktosa dan 5-

bromo-4-kloro-3-hidroksiindol. Otomatis tak dapat dihasulkan pula 5,5’-dibromo-

4,4’-dikloro-indigo yang berwarna biru. Karena itu, sel bakteri yang berhasil

ditransformasi oleh plasmid p-GEMT terligasi akan berwarna putih karena tak

menghasilkan 5,5’-dibromo-4,4’-dikloro-indigo. Sedangkan bila transformasi plasmid

p-GEMT terligasi gagal maka koloni bakteri akan tetap berwarna biru. (Cohen, 1972)

3. Hasil Pengamatan

Berikut adalah foto hasil pengamatan koloni bakteri kompeten

Hasil Pengamatan KeteranganTgl. Praktikum: 30.09.2010Tgl. Pengamatan: 01.10.2010Sampel: bakteri kontrol positif hasil transformasiMedium : agar LB dengan ampicillinSuhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang)Ket.: Ditumbuhi koloni berwarna putih dan membentuk koloni cukup besar.

Tgl. Praktikum: 30.09.2010Tgl. Pengamatan: 01.10.2010Sampel: bakteri kontrol negatif hasil transformasiMedium : agar LB dengan ampicillinSuhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang)Ket.: Ditumbuhi koloni berwarna putih

Tgl. Praktikum: 30.09.2010Tgl. Pengamatan: 01.10.2010Sampel: bakteri hasil transformasiMedium : agar LB dengan ampicillinSuhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang)Ket.: Ditumbuhi satu koloni berwarna putih (lingkaran kuning) dan koloni satu koloni berwarna biru (lingkaran merah).

Foto diambil sekitar 10-12 jam setelah inkubasiuntuk memastikan ampicillin bekerja

efektif

4. Pembahasan

Untuk mengamati transformasi dilakukan tiga macam perlakuan yaitu :

a. Bakteri kompeten (kontrol negatif)

b. Bakteri kompeten + p-GEMT (kontrol positif)

c. Bakteri kompeten + p-GEMT terligasi

Dari hasil pengamatan terlihat bahwa semua medium perlakuan ditumbuhi oleh

bakteri. Berikut adalah pembahasannya.

Pada kontrol negatif, terlihat ada koloni bakteri walau sedikit dan berkumpul di

tengah. Seharusnya tak ada koloni bakteri pada perlakuan ini karena bakteri

kompeten yang ditambahkan tidak memiliki kemampuan untuk bertahan dari

ampicillin dan tak memiliki plasmid resisten ampicillin. Pertumbuhan bakteri akan

terhambat dan dalam 10-12 jam seharusnya belum nampak adanya koloni.

Diasumsikan bahwa koloni yang muncul itu adalah kontaminan karena hanya muncul

membujur dari tepi ke bagian tengah.

Pada kontrol positif terlihat banyak koloni bakteri. Memang seharusnya tumbuh

koloni pada perlakuan ini namun dengan kondisi cawan petri yang terbakar dan

menimbulkan lubang di atasnya maka asumsi bahwa koloni yang tumbuh benar-

benar bakteri kompeten yang tertransformasi terbantahkan. Ada juga kemungkinan

kontaminan. Namun bagaimanapun pertumbuhan koloni mengindikasikan bakteri

yang resisten terhadap antibiotik yang dimungkinkan juga dengan proses

transformasi plasmid p-GEMT ke dalam bakteri kompeten.

Pada hasil ligasi terdapat dua koloni, satu berwarna biru dan satu lagi berwarna

putih. Warna biru mengindikasikan transformasi berhasil namun ligasi tak berhasil

karena 5,5’-dibromo-4,4’-dikloro-indigo dihasilkan yang berujung pada tidak

terputusnya lacZ karena ligasi. Warna putih mengindikasikan transformasi dan ligasi

keduanya berhasil. Warna putih menunjukkan bahwa 5,5’-dibromo-4,4’-dikloro-

indigo tidak dihasilkan yang berarti gen lacZ terputus pleh aktifitas ligasi.

5. Kesimpulan

a. Terisolasi bakteri kompeten yang berhasil ditransformasi dengan plasmid p-

GEMT yang diindikasikan dengan tumbuhnya koloni bakteri pada medium

ber-ampicillin

b. Terisolasi bakteri kompeten yang berhasil ditransformasi dengan plasmid p-

GEMT terligasi yang diindikasikan dengan tumbuhnya koloni bakteri

berwarna putih pada medium ber-ampicillin

6. Daftar Pustaka

Alberts, Bruce, et al. 2002. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science

Cohen, Stanley, Annie Chang dan Leslie Hsu. 1972. Nonchromosomal Antibiotic Resistance in

Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA. Proceedings

of the National Academy of Sciences 69 (8): 2110–4

MERCK. 2010. Dorland’s Medical Dictionary.

http://www.mercksource.com/pp/us/cns/cns_hl_dorlands_split.jsp?pg=/ppdocs/

us/common/dorlands/dorland/eight/000110198.htm. 071010 : 5.51AM