Laporan Praktikum Proyek Genetika Molekuler Mikroba
Percobaan 04
Transformasi
Nama : Ridwan Muhamad Rifai
NIM : 10408040
Tgl. Percobaan : 30 September 2010
Tgl. Pengumpulan : 7 Oktober 2010
Kelompok : 6
Asisten : Rahma
Program Studi Mikrobiologi
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati
Institut Teknologi Bandung
2010
1. Tujuan
a. Mengisolasi bakteri yang berhasil mengalami transformasi plasmid p-GEMT
b. Mengisolasi bakteri yang berhasil mengalami transformasi plasmid p-GEMT
yang telah diligasi
2. Metode
Transformasi dilihat dari namanya berarti perubahan. Perubahan yang dimaksudkan
di sini adalah perbahan karakteristik suatu bakteri karena dimasukki oleh suatu
materi genetik yang disebut plasmid yang menambah/mengubah kemampuan
metabolisme bakteri terhadap suatu substrat. Transformasi terjadi secara alami di
alam namun juga dapat dilakukan secara artifisisal. Tidak semua sel bakteri dapat
mengalami transformasi. Sel yang siap melakukan transformasi disebut sel
kompeten.(MERCK, 2010)
Sel kompeten dapat dibuat dari kultur Escherichia coli murni yang diterapi dengan
metode CaCl. Bila sel didinginkan dalam kation bivalen semisal Ca2+ membuat
membran sel permeabel terhadap plasmid DNA. Sel kemudian diinkubasi dalam es
selama beberapa lama agar terjaga kekompetenannya dan ketika akan
ditransformasikan maka diberi heat-shock pada 42oC sehingga plasmid dapat masuk.
(Alberts, 2002)
Plasmid yang digunakan adalah p-GEMT yang memiliki fragmen DNA resisten
ampicillin sehingga bila transformasi berhasil maka sel bakteri akan resisten dan
dapat hidup dalam medium ber-ampicillin. Sedangkan bila transformasi gagal maka
tak akan ada bakteri yang dapat tumbuh dalam medium berampicillin.
Selain itu ada satu jenis plasmid lagi yang digunakan yaitu p-GEMT namun telah
diligasi oleh suatu fragmen DNA dengan panjang 750 kb (lih. Percobaan 3 : Purifikasi
DNA dan Ligasi). Proses ligasi fragmen DNA ini menyebabkan gen lacZ putus
sehingga enzim β-galactosidase tak dapat diekspresikan. Enzim ini menghidrolisis X-
gal, suatu modifikasi dari galaktosa, menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-kloro-3-
hidroksiindol. Selanjutnya 5-bromo-4-kloro-3-hidroksiindol ini akan teroksidasi dan
berubah menjadi 5,5’-dibromo-4,4’-dikloro-indigo. Berikut adalah pemetaan dari
plasmid p-GEMT.
Untuk mendeteksi proses transformasi p-GEMT terligasi ini tidak cukup dengan
melihat keresistennan bakteri dalam medium ber-ampicillin. Dilakukan blue-white
screening untuk menentukan apakah proses transformasi berhasil. Telah diketahui
bahwa enzim β-galactosidase tak dapat diekspresikan pada plasmid yang terligasi
sehingga substrat X-gal pada medium tak dapat dihidrolisis menjadi galaktosa dan 5-
bromo-4-kloro-3-hidroksiindol. Otomatis tak dapat dihasulkan pula 5,5’-dibromo-
4,4’-dikloro-indigo yang berwarna biru. Karena itu, sel bakteri yang berhasil
ditransformasi oleh plasmid p-GEMT terligasi akan berwarna putih karena tak
menghasilkan 5,5’-dibromo-4,4’-dikloro-indigo. Sedangkan bila transformasi plasmid
p-GEMT terligasi gagal maka koloni bakteri akan tetap berwarna biru. (Cohen, 1972)
3. Hasil Pengamatan
Berikut adalah foto hasil pengamatan koloni bakteri kompeten
Hasil Pengamatan KeteranganTgl. Praktikum: 30.09.2010Tgl. Pengamatan: 01.10.2010Sampel: bakteri kontrol positif hasil transformasiMedium : agar LB dengan ampicillinSuhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang)Ket.: Ditumbuhi koloni berwarna putih dan membentuk koloni cukup besar.
Tgl. Praktikum: 30.09.2010Tgl. Pengamatan: 01.10.2010Sampel: bakteri kontrol negatif hasil transformasiMedium : agar LB dengan ampicillinSuhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang)Ket.: Ditumbuhi koloni berwarna putih
Tgl. Praktikum: 30.09.2010Tgl. Pengamatan: 01.10.2010Sampel: bakteri hasil transformasiMedium : agar LB dengan ampicillinSuhu Inkubasi: 25oC (suhu ruang)Ket.: Ditumbuhi satu koloni berwarna putih (lingkaran kuning) dan koloni satu koloni berwarna biru (lingkaran merah).
Foto diambil sekitar 10-12 jam setelah inkubasiuntuk memastikan ampicillin bekerja
efektif
4. Pembahasan
Untuk mengamati transformasi dilakukan tiga macam perlakuan yaitu :
a. Bakteri kompeten (kontrol negatif)
b. Bakteri kompeten + p-GEMT (kontrol positif)
c. Bakteri kompeten + p-GEMT terligasi
Dari hasil pengamatan terlihat bahwa semua medium perlakuan ditumbuhi oleh
bakteri. Berikut adalah pembahasannya.
Pada kontrol negatif, terlihat ada koloni bakteri walau sedikit dan berkumpul di
tengah. Seharusnya tak ada koloni bakteri pada perlakuan ini karena bakteri
kompeten yang ditambahkan tidak memiliki kemampuan untuk bertahan dari
ampicillin dan tak memiliki plasmid resisten ampicillin. Pertumbuhan bakteri akan
terhambat dan dalam 10-12 jam seharusnya belum nampak adanya koloni.
Diasumsikan bahwa koloni yang muncul itu adalah kontaminan karena hanya muncul
membujur dari tepi ke bagian tengah.
Pada kontrol positif terlihat banyak koloni bakteri. Memang seharusnya tumbuh
koloni pada perlakuan ini namun dengan kondisi cawan petri yang terbakar dan
menimbulkan lubang di atasnya maka asumsi bahwa koloni yang tumbuh benar-
benar bakteri kompeten yang tertransformasi terbantahkan. Ada juga kemungkinan
kontaminan. Namun bagaimanapun pertumbuhan koloni mengindikasikan bakteri
yang resisten terhadap antibiotik yang dimungkinkan juga dengan proses
transformasi plasmid p-GEMT ke dalam bakteri kompeten.
Pada hasil ligasi terdapat dua koloni, satu berwarna biru dan satu lagi berwarna
putih. Warna biru mengindikasikan transformasi berhasil namun ligasi tak berhasil
karena 5,5’-dibromo-4,4’-dikloro-indigo dihasilkan yang berujung pada tidak
terputusnya lacZ karena ligasi. Warna putih mengindikasikan transformasi dan ligasi
keduanya berhasil. Warna putih menunjukkan bahwa 5,5’-dibromo-4,4’-dikloro-
indigo tidak dihasilkan yang berarti gen lacZ terputus pleh aktifitas ligasi.
5. Kesimpulan
a. Terisolasi bakteri kompeten yang berhasil ditransformasi dengan plasmid p-
GEMT yang diindikasikan dengan tumbuhnya koloni bakteri pada medium
ber-ampicillin
b. Terisolasi bakteri kompeten yang berhasil ditransformasi dengan plasmid p-
GEMT terligasi yang diindikasikan dengan tumbuhnya koloni bakteri
berwarna putih pada medium ber-ampicillin
6. Daftar Pustaka
Alberts, Bruce, et al. 2002. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science
Cohen, Stanley, Annie Chang dan Leslie Hsu. 1972. Nonchromosomal Antibiotic Resistance in
Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA. Proceedings
of the National Academy of Sciences 69 (8): 2110–4
MERCK. 2010. Dorland’s Medical Dictionary.
http://www.mercksource.com/pp/us/cns/cns_hl_dorlands_split.jsp?pg=/ppdocs/
us/common/dorlands/dorland/eight/000110198.htm. 071010 : 5.51AM
Top Related