Mendeteksi Gen dan Kromosom Manusia dengan Teknik DNA RekombinanOrlando102012430Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Krida WacanaJalan Arjuna Utara No. 6 Jakarta Barat 11510Email : orlando_fx1@yahoo.com

AbstrakTujuan dari penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui bagaimana terjadinya DNA rekombinan untuk memecahkan skenario kasus. Penulisan makalah ini menggunakan metode tinjauan pustaka. Pemeriksaan dimulai dari PCR dengan memperbanyak DNA terlebih dahulu. Pemeriksaan kemudian dilanjutkan dengan memeriksa DNA melalui teknik southern blot yang dimulai dari memotong DNA dengan enzim restriksi (ECOR1). Dengan semua teknik tersebut DNA dapat dibandingkan dan diisolasi baik yang normal maupun yang rusak agar dapat diterapi dengan DNA rekombinan. Kata kunci: ECOR1, Bloting, PCR, DNA Rekombinan

PendahuluanKita tahu bahwa tubuh manusia tersusun atas sel. Sel sel akan membentuk adanya sebuah jaringan. Jaringan- jaringan tersebut akan membentuk sebuah sistem yang disebut organ dan kumpulan organ inilah yang ada dalam tubuh manusia. Setiap sel akan bekerja untuk membentuk organ-organ tubuh manusia. Di dalam setiap sel makhluk hidup, terdapat sebuah inti yang memuat serangkaian kimia asam Nuklead Deuksiribo (DNA). Setiap sel pada satu makhluk hidup, memiliki salinan DNA yang sama. DNA pada setiap makhluk hidup disimpan dalam suatu wadah yang disebut kromosom. Tiap kromosom menyimpan DNA yang mempunyai tugas khusus untuk mengatur bentuk fisik tubuh. Pada era sekarang ini teknologi biomolekuler atau yang biasa disebut biomol sering digunakan untuk mengobati penyakit tertentu dengan teknik rekayasa genetika maupun dengan teknik lainnya. Dalam melakukan teknik ini diperlukan bahan-bahan tertentu yang salah satu bahan utamanya adalah enzim, karena enzim memiliki berbagai macam fungsi tertentu.Pada makalah ini saya akan membahas cara untuk mengenali gen abnormal dan gen normal pada manusia melaui teknologi biomolekuler. Teknologi biomolekuler yang akan dilakukan yaitu melalui teknik rekayasa genetika . Dan akan dijelaskan lebih lanjut mengenai DNA rekombinan , PCR , enzim retriksi , dan metode southern blotting.

PembahasanIdentifikasi Istilah Dari skenario yang didapat , penulis mengidentifikasi beberapa istilah yang tidak di mengerti yaitu :1. Enzim retriksi : enzim bakteri yang mengenali memotong sekuens nukleotida di dalam molekul DNA berantai ganda12. Kodon awalmerupakan kodon pertama yang diterjemahkan pada saat translasi atau disebut juga kodon inisiasi (AUG yang menyandikan metionin)3. Kodon akhirmerupakan salah satu dari tiga kodon, yaitu UAG, UAA atau UGA.Kodon akhir disebut juga kodon terminal yang tidak menyandikan asam amino. Kodon akhir menyebabkan proses translasi berakhir dengan bantuan faktor pelepasan untuk melepas ribosom.Rekayasa genetikaRekayasa genetika adalah tindakan sengaja untuk memodifikasi DNA (substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas pewarisan sifat). Dalam arti luas, Tettamanzi melukiskannya sebagai bentuk-bentuk manipulasi dan pergantian tatanan gen dari organisme hidup.2 Bahan genetik DNA mengandung informasi keturunan yang dimiliki oleh makhluk hidup. Bahan genetik DNA berupa pita ganda yang berbentuk spiral (double helix). Beberapa peristiwa penting yang sudah berhasil dan masih giat dilakukan adaalah sebagai berikut.1. Rekayasa genetika dalam bidang kedokteranRekayasa genetika dibidang kedokteran telah mencapai kemajuan yang cukup pesat. Peristiwa yang masih dilakukan adalah pembuatan insulin manusia oleh bakteri2. Rekayasa Genetika dalam bidang farmasiKeuntungan rekayasa genetika dalam bidang ini adalah dalam usaha pembuatan protein yang sangat diperlukan untuk kesehatan, misalnya pencangkokan gen. Hasil hasil farmasi yang diperoleh melalui pencangkokan gen itu berupa senyawa senyawa yang dengan dosis kecil saja sudah dapat memperlihatkan pengaruhnya. Misalnya, senyawa tersebut berpengaruh pada fator tumbuh, protein pengatur, penyembuhan luka.3. Rekayasa genetika dalam bidang pertanianTeknik rekayasa genetika juga telah dikembangkan dalam bidang pertanian. Keuntungan rekayasa genetika dalam bidang ini adalaha sebagai berikut.a. Mengganti pemakaian pupuk nitrogenPupuk nitrogen yang mahal harganya dapat diagantikan oleh penggunaan bakteri yang dapat melakukan fiksasi nitrogen secara alami. Bakteri tersebut dapat berinteraksi dengan akar tumbuhan sehingga dihasilkan bintil bintil pada akar. Salah satu jenis bakteri yang dapat bersimbiosis dengan akar untuk menambat nitrogen adalah Rhizobium sp.b. Pembuatan bibit unggul hasil mutasi.3 Teknik DNA rekombinan

Seiring berkembanganya ilmu bioteknologi di bidang kedokteran, maka teknik diagnosis dengan molekul dan DNA semakin berkembang. Pengobatan dengan rekayasa DNA juga sering dilakukan guna mendapatkan hasil yang maksimal. Teknik rekombinan DNA ini umumnya dilakukan pada rekayasa genetika dan untuk menganailisis DNA melalui metode southern blotting.4Untuk memahami bagaimana gen dari satu individu berbeda dengan individu lainnya dan bagaimanakah caranya untuk memanfaatkan perbedaan ini untuk mendiagnosis penyakit, sekiranya diperlukan pemahaman dasar bagaimanakah teknik dari DNA rekombinan.5 Teknik umum DNA rekombinan ini akan diringkas dalam ilustrasi berikut:

Gambar 1. Proses Rekombinan DNA.4Dari ilustrasi (gambar 1) dapat dilihat bahwa DNA yang dikehendaki disisipkan ke dalam plasmid setelah dimasukan ke dalam plasmid DNA rekombinan ini dimasukan kedalam inang dan dibiarkan berkembang biak. Proses menyisipkan DNA ke plasmid ini membutuhkan peran enzim yaitu enzim ligase (untuk menyambung) dan enzim restriksi. Enzim restrisksi untuk memotong baik DNA yang dikehendaki ataupun tempat dari plasmid tersebut. Maka kegunaan enzim ini dalam berbagai reakaya genetika sangat besar.Adapula langkah dalam menentukannya, dimana dalam langkah pertama dalam menentukan variasi individual dalam gen meliputi isolasi gen (atau fragmen DNA) yang mengandung urutan yang berubah-ubah dan memperoleh jumlah gen yang akurat untuk penelitian. Untuk mencapai tujuan tersebut, digunakan teknik untuk memperoleh salinan gen atau fragmen DNA yaitu dengan menggunakan enzim restriksi yang digunakan untuk membuat DNA rekombinan. Sebelum mengenal bagaimanakah enzim restriksi digunakan, terlebih dahulu kita akan mengenal jenis enzim restriksi.5DNA SequencingInformasi genetik pada suatu makhluk hidup tersimpan pada DNA-nya. Untuk mengetahui informasi genetik tersebut digunakan teknik DNA Sequencing, yaitu metode yang digunakan untuk menentukan urutan basa nukleotida (adenine, guanine, cytosine dan thymine) pada molekul DNA. DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu.6PCRReaksi rantai polimerase (PCR polymerase chain reaction) merupakan suatu metode untuk membuat salinan seg,men spesifik dari suatu DNA. Metode ini jauh lebih cepat daripada pengklonan gen dengan DNA plasmid atau DNA faga dan seluruhnya dilakukan in vitro. Materi awal untuk PCR adalah suatu larutan DNA untai ganda yang mengandung urutan nukleotida yang ditargetkan untuk disalin. Saintis menambahkan jenis DNA polimerase yang resisten panas ( yang mengkatalisasi reaksi ), suatu pasokan yang terdiri dari keempat nukleotida ( untuk disusun menjadi DNA baru) , dan primer. Primer ini dibutuhkan agar DNA polimerase dapat memulai sintesis DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ini merupakan molekul DNA untai-tunggal sintetik yang pendek, primer ini komplementer terhadap ujung-ujung DNA target sehingga menentukan segmen DNA tertentu yng akan diperkuat. Untuk mempersiapkan DNA yang lebih banyak, PCR dapat diikuti dengan pengklonan DNA dalam sel.6Proses PCR :-DNA dipanaskan secara singkat untuk memisahkan untainya dan kemudian didinginkan untuk membiarkan primer berikatan dengan ujung-ujung urutan target melalui ikatan hydrogen , satu primer pada setiap untai.-kemudian DNA polymerase menambahkan nukleotida pada ujung 3 primer , dengan menggunakan untai DNA yang lebih panjang sebagai cetakannya.-dalam waktu kira-kira 5 menit urutan DNA target (yang panjangnya bisa mencapai ratusan basa) telah digandakan.-larutan ini kemudian dipanaskan lagi, memulai siklus pemisahan yang lain, pegikatan primer, dan sintesis DNA . Siklus ini berulang-ulang hingga kira-kira 20 siklus- hampir semua molekul DNA yang dihasilkan akan terdiri atas urutan target yang tepat6

Enzim RestriksiEnzim restriksi endonuklease adalah enzim bakteri yang mengenali memotong sekuens nukleotida di dalam molekul DNA berantai ganda. Enzim ini memotong DNA menjadi fragmen panjang yang bervariasi, bergantung pada berapa banyak situs yang dikenali enzim tersebut berada di dalam molekul DNA. Sebagian besar enzim yang digunakan untuk pengklonan biasanya mampu mengenali sekuens pasangan basa sepanjang 4-8 nukleotida dan melakukan pemotongan dalam nukleotida tersebut.4 . Gambar 2. Potongan Enzim Restiksi.4

Potongan ini biasa dilakukan pada urutan tertentu yang khas dan berbeda-beda setiap enzimnya. Akan tetapi sebagian besar urutan yang dikenali oleh enzim restriksi ini adalah palindrom, yaitu kedua untai DNA yang memiliki urutan yang sama apabila dibaca dalam arah 5 ke 3. Hasil potongan ezim ini pun berbeda beda. Maka enzim restriksi ini dapat dibedakan menjadi 2 sesuai dengan fragmen yang dihasilkan. Bila fragmen tersebut dengan ujung kohesif disebut sticky end dan bila ujungnya tumpul disebut dengan blunt end.4,7 Potongan ini dapat dilihat dalam gambar 5. Pada gambar tersebut dapat dilihat potongan sticky end tidak rata sedangkan untuk blunt end memiliki potongan yang rata. Akan tetapi yang sering digunaka dalam penelitian adalah enzim ECO-R1 yaitu sticky end. Eco R-1 ini juga mudah didapatkan karena berasal dari bakteri e-coli.

Southern BlottingSouthern blott merupakan proses perpindahan fragmenDNAyang terpisah secaraelektroforesisdari gel ke membran. Prinsipnya adalahkapilaritas, dimana bufer yang merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA darigelke membran.Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran.Membran yang digunakan pada proses blot southern adalah membrannitroselulosa. Blot Southern merupakan sebuahmetodeyang sering digunakan dalam bidangbiologi molekuleruntuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA. Metode ini mengkombinasikanelektroforesisgel agarosa untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya dan kemudian ditransfer kemembranfilter untuk selanjutnya dilakukanhibridisasidenganprobe. Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen DNA spesifik, diperlukan suatu pelacak (probe).DNA dipisahkan terlebih dahulu dengan elektroforesis.Probe yang dilabel akanhibridisasipada pita-pita DNA untuk mengetahui apakah DNA tersebut mengandung gen yang diinginkan.Blot Southern mendeteksi DNA rantai tunggal dengan menggunakan DNA sebagai pelacak. Selain Blot Southern, metode lain yang mirip dan dikembangkan dari Blot Southern adalahBlot Western,Blot Northern, danBlot Southwesternyang memiliki prinsip yang sama, namun molekul yang akan dideteksi dan pelacak yang digunakan berbeda.Kegunaan dari Blot Southern adalah untuk menganalisis keberadaanmutanyang ada pada suatu organisme dan dapat diketahui ukuran dari gen yang menjadi mutan padaorganismetersebut. Tahap awal darimetodeBlot Southern adalah pendigestianDNAdenganenzim restriksiendonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukuran denganelektroforesisagarosa. Setelah DNA terpisah, dilakukan pemindahan DNA ke membran nitroselulosa, tahap ini disebut dengan tahap blotting.Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari gel agarosa.Pada teknik blotting dengan menggunakanvakum, membran diletakkan pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk memastikan terjadikontakantara gel dengan membran.Proses transfer berlangsung dengan memanfaatkan dayakapilaritas.setalah DNA ditransfer ke gel, membran nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi (60oC-100oC) kemudian membran diberi radiasi UV agar terbentuk ikatankovalendan permanen antara pita-pita DNA dengan membran.Lalu, membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabelradioaktif, tetapi dapat juga digunakan label nonradioaktif yang dapat berpendar. Probe yang digunakan adalah DNA utas tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi.Probe diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada pada membran.Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di membran.Pola hibridisasi kemudian dideteksi denganvisualisasipada filmX-raymelalui autoradiografi.8KesimpulanPemeriksaan kromosom dan DNA dengan teknik rekombinasi DNA dapat membantu untuk mendiagnosis penyakit dan juga mengetahui status gen. Pemeriksaan ini dilakukan dalam tahap tertentu yang dimulai dari pemotongan DNA menggunakn enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan adalah ECO-R1 yang berasal dari bakteri e-coli dengan ciri pemotongan sticky end dengan urutan basa nitrogen yang sama yaitu GAATC. Melalui teknik rekombinasi gen dapat mengetahui terjadinya mutasi protein pada tingkat gen sehingga dapat kita kenali gen tersebut normal atau abnormal.

Daftar Pustaka1. Stansfield W, Cano R, Colome J. Schaums: Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga; 2006.h.73.2. Chang W , OFM Cap.Biotika. Yogyakarta : Kanisius; 2009. h. 2.3. Karmana O. Cerdas Belajar Biologi. Jakarta: Penerbit Grafindo; 2006. h. 246 9.4. Stansfield W, Cano R, Colome J. Schaums: Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga; 2006.h.735. Junqueira LC, Carneiro J, Kelley RO. Histologi Dasar. Ed.8. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC, 1997.h.360-16. A Campbell, Jane B , Reece ,Lawrence G , Mitchell. Biology jilid 1 edisi 5. Jakarta : Erlangga ; 2002.h. 396-420.7. Marks DB, Marks AD, Smith CM. Biokimia kedokteran dasar: Sebuah pendekatan klinis. Jakarta: EGC; 2000.h.235-48.8. Blot Southern. Diunduh dari www.wikipedia.org , 20 Desember 2012