Makalah Fitokimia

MAKALAH FITOKIMIA

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS, KROMATOGRAFI KERTAS, DAN

KROMATOGRAFI KOLOM

Anti Pebrianti Mentari 260110110054

Annisa Noor Insany 260110110088

Indah Khairunnisa H. 260110110144

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

SUMEDANG

2014

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT karena atas rahmat dan

ridho-Nya kami dapat menyelesaikan makalah ini. Makalah ini disusun untuk

melengkapi tugas mata kuliah Fitokimia dan diharapkan dapat menambah

pengetahuan bagi penulis dan pembacanya.

Terima kasih bagi seluruh pihak yang telah membantu dalam penyusunan

makalah ini, serta terima kasih kepada seluruh dosen yang telah membantu kami

untuk memahami ilmu Fitokimia dan ilmu farmasi secara umum, sehingga

makalah ini dapat terselesaikan dengan baik.

Kami menyadari bahwa makalah ini masih belum sempurna, oleh karena

itu kami mengharapkan saran-saran yang dapat membantu dalam penyempurnaan

makalah ini. Semoga makalah ini dapat memberi manfaat bagi seluruh penuntut

ilmu dan bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Fitokimia.

Atas perhatiannya, kami ucapkan terima kasih.

Jatinangor, Desember 2014

Tim Penulis

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Pengertian Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa

menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan.

Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat

sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk

memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan

hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat

berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang

diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan

isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang

disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis

seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi-pereaksi

yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai

Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat

dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan

sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang

ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil

dari 1,0.

Teknik Kromatografi Lapis Tipis

1. Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil

dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran ratarata

partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka

semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.Penjerap yang

paling sering digunakan adalah silica dan serbuk selulosa, sementara

mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi.

2. Fase Gerak (1)

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan

mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang

paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi

campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga

pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk

dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:

a. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT

merupakan teknik yang sensitif.

b. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf

terletak antara 0,2 - 0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

c. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,

polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti

juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar

seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzena akan

meningkatkan harga Rf secara signifikan.

d. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran

pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan

perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia

masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan

asam.

3. Aplikasi (Penotolan) Sampel (1)

Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling

sedikit 0,5 μl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl,

maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan

pengeringan antar totolan.

4. Pengembangan

Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan

sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan

uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel

dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak

dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel. Bejana

kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak

sedikit mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai

ketinggian lempeng yang telah ditentukan). Untuk melakukan penjenuhan fase

gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah

mencapai ujung dari kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak

telah jenuh.

5. Deteksi Bercak

Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia

yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu

pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara

fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan cara

pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar

ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat

bercak akan terlihat jelas.

Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :

a. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan

bereaksi secara kimia dengan solut yang mengandung gugus fungsional

tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang dipanaskan

terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan

intensitas warna bercak.

b. Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang

gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak

yang gelap atau bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang

berfluorosensi seragam. Lempeng yag diperdagangkan dapat dibeli dalam

bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fluorosen yang tidak

larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar

fluorosensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen

fluorosensi setelah dilakukan pengembangan.

c. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu

dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak

sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan.

d. Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.

e. Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu

instrument yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari

permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar

tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai

puncak (peak) dalam pencatatan (recorder)

6. Perhitungan Nilai Rf

Perbandingan jarak bercak dan jarak tempuh eluen

Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus:

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka menyatakan nilai Rf

yang baik yang menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar

antara 0,2-0,8.

7. Alternatif Prosedur KLT

Adanya variasi prosedur pengembangan KLT dilakukan untuk meningkatkan

resolusi, sensitifitas, kecepatan, reprodusibilitas dan selektifitas. Beberapa

pengembangan ini meliputi KLT 2 dimensi, pengembangan kontinyu dan

pengembangan gradien. KLT 2 dimensi atau KLT 2 arah ini bertujuan untuk

meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai

karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama

sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, sistem 2 fase gerak yang

sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran

sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai

tingkat polaritas yang berbeda.

Pengembangan kontinyu dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak secara

terus menerus pada lempeng KLT melalui suatu wadah (biasanya alas tangki)

melalui suatu lapisan dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung lapisan.

Pengembangan gradien dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak

yang berbeda-beda. Tujuan utama system ini adalah untuk mengubah polaritas

fase gerak. Meskipun demikian untuk memperoleh komposisi fase gerak yang

reprodusibel sangatlah sulit.

Penggunaan Kromatografi Lapis Tipis

Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan banyaknya komponen

dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi,

menentukan efektivitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk

kromatografi kolom, serta memantau kromatografi kolom, melakukan

screening sampel untuk obat.

Analisa kualitatif dengan KLT dapat dilakukan untuk uji identifikasi senyawa

baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf.

Analisis kuantitatif dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak langsung

pada lengpeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik

densitometri dan cara berikutnya adalah dengan mengerok bercak lalu

menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak dengan metode

analisis yang lain, misalnya dengan metode spektrofotometri. Dan untuk

analisis preparatif, sampel yang ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan

yang besar lalu dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang nondekstruktif.

Bercak yang mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerok dan

dilakukan analisis lanjutan. Saat ini metode KLT semakin berkembang dengan

hadirnya KLT-KT (Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi), dimana cara ini

lebih efisien dan dengan menghasilkan analisa yang lebih baik dibandingkan

KLT biasa.

KROMATOGRAFI KERTAS

Pengertian Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas adalah suatu metode pemisahan campuran dari

substansinya menjadi komponen- komponennya berdasarkan distribusi suatu

senyawa pada dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fasa diam dalam

kromatografi berupa air yang terikat pada selulosa kertas sedangkan fasa geraknya

berupa pelarut organik non polar (pelarut yang sesuai).

Selulosa merupakan polimer dari gula sedehana yaitu glukosa. Rantai

polimer dari selulosa memiliki gugus hidroksil (-OH) disekeliling strukturnya.

Karena memiliki gugus -OH maka selulosa dapat berinteraksi dengan air oleh

karena itu pada fase diam bersifat sedikit polar. Didalam kertas selulosa

mengandung air yang berasal dari pembuatan kertas dan dari atmosfer. Dibawah

ini adalah struktur dari selulosa.

Bila digunakan fasa diam yang lain, maka biasanya kertas akan

dikeringkan, kemudian menggunakan fasa diam seperti glikol, formamide, dan

alkohol. Pelarut (eluen) yang digunakan bisa berupa pelarut murni, atau campuran

pelarut antara alkohol, asam-asam, ester, fenol dan amina.

Pemisahan pada kromatografi kertas terjadi kerena perbedaan kelarutan

zat-zat dalam pelarut serta perbedaan penyerapan (adsorbsi) kertas terhadap zat-

zat yang akan dipisahkan. Zat yang lebih larut dalam pelarut dan kurang

teradsorbsi pada kertas akan bergerak lebih cepat. Sedangkan zat yang kurang

larut dalam pelarut dan lebih teradsorbsi pada kertas akan tertinggal atau bergerak

lebih lama.

Kromatografi kertas merupakan bentuk kromatografi yang paling

sedehana mudah dan murah. Jenis kromatografi ini banyak digunakan untuk

identifikasi kualitatif maupun untuk analisis kuantitatif. Penemu kromatografi

kertas adalah Martri, Consden dan Gordon.

Teknik Kromatografi Kertas

1. Teknik menaik (ascending), pada teknik menaik ini rembesan fasa gerak

bergerak ke atas karena efek kapiler.

2. Teknik menurun (descending), pada teknik menurun ini rembesan fasa

bergerak ke bawah yang dikarenakan efek kapiler yang juga dibantu oleh

efek gravitasi sehingga rembesan berjalan lebih cepat.

Metode Kromatografi Kertas

1. Tahap penotolan cuplikan

Mula-mula menyiapkan kertas kromatografi dengan ukuran tertentu. Kertas

yang digunakan memiliki susunan serat kertas membentuk medium berpori yang

bertindak sebagai tempat untuk mengalirnya fase bergerak. Lalu membuat garis

awal dengan jarak 2-3 cm dengan salah satu ujung kertas dengan menggunakan

pensil. Selanjutnya totolkan larutan cuplikan dengan menggunakan mikropipet

atau pipa kapiler pada garis awal tadi, kemudian keringkan. Misalkan Kita ingin

mengetahui tinta mana yang digunakan untuk menulis pesan. Dalam diagram pena

diberi label 1, 2 dan 3 dan tinta pesan sebagai M.

2. Tahap pengembangan

Pada tahap ini ujung kertas kromatografi dekat garis awal yang telah berisi

totolan cuplikan dicelupkan ke dalam pelarut (pelarut untuk contoh ini misalnya

etanol) yang terdapat di dalam bejana kromatografi. Pencelupan diusahakan tidak

merendam totolan cuplikan atau garis awal. Kemudian bejananya ditutup.

Biarkan pelarut merembes melewati totolan cuplikan. Komponen-komponen

cuplikan akan terbawa oleh rembesan cuplikan. Perbedaan kelarutan komponen-

komponen cuplikan dalam pelarut akan mengakibatkan kecepatan bergerak

komponen-komponen dalam kertas juga berbeda. Perbedaan kecepatan bergerak

komponen-komponen ini lebih umum disebut migrasi deferensial. Pemisahan

komponen-komponen ini terjadi karena migrasi deferensial. Hasil pemisahan akan

nampak sebagai noda-noda berwarna pada kertas dengan jarak yang berbeda-beda

dari garis awal. Noda-noda ini selanjutnya disebut sebagai kromatogram.

Perembesan pelarut dihentikan setelah pelarut hampir mencapai ujung kertas.

Pekerjaan selanjutnya adalah memberi tanda batas gerakan pelarut, dan kemudian

kertas diangkat dari cairan pengelusi untuk seterusnya dikeringkan.

3. Tahap identifikasi atau penampakan noda.

Menghitung nilai Rf

Rf (rate of flow) menyatakan derajad retensi suatu komponen dalam fase

diam. Karena itu Rf juga disebut faktor refensi. Rf adalah jarak tempuh relatif

terhadap pelarut. Harga Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona relatif terhadap

garis depan pengembang. Kromatografi yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona

dicirikan dengan nilai-nilai Rf.

Pengukuran ini dilakukan dengan mengukur jarak dari titik

pemberangkatan (pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan

pusat rapatan tyiap zona. Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun

ascending. Nilai Rf akan menunjukkan identitas suatu zat yang dicari.

Setiap komponen mempunyai harga Rf sendiri-sendiri. Dengan

menggunakan zat baku noda dapat diidentifikasikan.

Bila noda tidak berwarna, langkah pertama yang harus diambil adalah

menampakkan noda tersebut. Penampakan noda dapat dilakukan dengan cara:

1. Menyemprot kertas dengan pereaksi penimbul warna ditizon, ninhidrin,

kalium kromat, amonium sulfida dan lain-lain.

2. Menyinari sinar dengan sinar ultra violoet.

3. Mendedahkan kertas pada uap iodium.

Kemudian langkah selanjutnya adalah menentukan harga Rf masisng-masing dari

noda, seperti yang telah disebutkan diatas.

Kromatografi Kertas Dua Arah

Kromatografi kertas dua arah digunakan dalam menyelesaikan masalah

pemisahan substansi yang memiliki nilai yang sangat serupa. Pada prosesnya

menggunakan dua pelarut yang berbeda.

Misalnya kita menggunakan zat warna sebagai sampel. Prosedur yang

harus dilakukan adalah:

1. Tahap pertama

Mula-mula titik tunggal campuran ditempatkan pada salah satu ujung garis dasar.

Kemudian masukkan kedalam pelarut seperti yang sebelumnya hingga pelarut

mendekati ke atas kertas.

2. Tahap kedua

Pada kromatogram, posisi depan pelarut ditandai dengan pensil sebelum

kertas mengering, diberi lebel sebagai SF1. Kemudian masukkan kedalam pelarut

yang pertama, dihasilkan titik sentral besar dalam kromatogram yaitu sebagian

biru dan sebagian hijau. Dua pewarna dalam campuran memiliki nilai yang sudah

hampir sama.

3. Tahap ketiga

Menunggu kertas kering sepenuhnya, dan kemudian memutar kertas

sampai 900 dan kemudian mengembangkan kromatografi lagi di dalam suatu

pelarut yang berbeda. Bintik-bintik akan bergerak dengan jumlah yang berbeda,

hal ini menyebabkan terjadinya perbedaan nilai . Jika kita ingin mengidentifikasi

titik-titik dalam campuran maka kita harus menghitung nilai nya untuk disetiap

tempat, dan kemudian membandingkannya dengan nilai-nilai yang telah diukur

untuk senyawa yang dikenal dengan kondisi yang sama persis. Apabila kita

mengidentifikasinya dengan zat pembanding pada kromatogram yang sama

seperti yang dilakukan diawal dengan pena, maka kita tidak bisa

mengidentifikasinya. Karena campuran yang dipisahkan pada contoh ini terpisah

menjadi empat tempat yang berbeda.

Prosesnya terlihat pada gambar dibawah ini.

Aplikasi Kromatografi Kertas dalam Kehidupan Sehari-hari

Aplikasi teknik pemisahan kromatografi kertas dalam kehidupan sehari-hari

adalah:

1. Menentukan komponen yang terkandung dalam uang logam.

Cara kerjanya adalah pertama-tama uang logam warna kuning dan putih dicuci

dan disikat, kemudian ditambahkan dengan HCl pekat sebagai pelarut pemisah

komponen uang logam. Selanjutnya cuplikan dari tetesan tersebut ditotolkan di

kertas kromatografi bersama dengan cuplikan HCl pekat, cuplikan CuSO4, dan

cuplikan NiSO4. Fase diam pada percobaan ini adalah lapisan pelarut yang

teradsorbsi pada permukaan kertas berupa kertas kromatografi dan fase geraknya

adalah bagian dari pelarut yang berfungsi menggerakkan eluen berupa campuran

n-butanol, asam asetat glasial, dan air (untuk uang logam putih) dan campuran n-

butanol, etanol, dan amoniak 2M (untuk uang logam kuning). Pada percobaan ini,

kromatografi kertas dilakukan secara ascending diamana pelarut yang terdapat

dibawah akan bergerak keatas pada kertas yang tercelup di dalamnya. Penjenuhan

dengan uap pelarut bertujuan untuk mempercepat terjadinya elusi atau pergerakan

komponen-komponen sampel pada media kertas kromatografi.

Maka hasil akhirnya adalah untuk uang logam warna kuning cuplikan dari

uang logam tersebut memiliki nilai Rf yang hampir sama dengan cuplikan CuSO4

sehingga dapat disimpulkan bahwa logam tersebut bahan penyusunnya adalah

tembaga. Sedangkan untuk uang logam putih tidak memiliki nilai R f yang sama

dengan CuSO4 maupun dengan NiSO4. Karena memang logam putih ini terbuat

dari aluminium maka tidak terdeteksi pada percobaan ini.

1. Menguji apakah bahan pewarna yang digunakan dalam makanan aman atu

tidak untuk dikonsumsi.

2. Menguji tinta yang digunakan pada pemalsuan dokumen, seperti surat

perjanjian, cek dan giro.

3. Menguji apakah terdapat obat terlarang dalam urin manusia.

4. Memeriksa apakah pestisida yang terdapat dalam sayuran atau bahan-

bahan masih dalam batas aman atau tidak.

5. Mengetahui kandungan asam amino tertentu dari campuran asam amino.

6. Dapat mengidentifikasikan keberadaan suatu unsur.

Misalnya ingin mengidentifikasi logam Ag, Pb dalam larutan pengembang asam

asetat. Caranya yaitu:

Mula-mula kertas kromatografi disiapkan, dan ditarik batas pensil kira-kira 2 cm

dari pinggir kertas. Lalu kertas dibagi menjadi empat kolom dan di beri nomor

pada tiap kolomnya. Pada kolom 1 dan 3 ditetesi dengan larutan cuplikan A dan

B, kolom 2 dan 4 dengan larutan baku Ag dan Pb (II). Sementara itu larutan

pengembang disiapkan yang berisi 12,5 ml larutan asam asetat dan air. Masukkan

kertas kromatografi kedalam larutan pengembang kemudian ditutup. Selanjutnya

kertas diambil dari dalam larutan bila kertas mencapai ¾ larutan pengembang.

Kemudian pada kertas diberi tanda batas dengan menggunakan pensil dan

kemudian kertas dikeringkan. Kemudian setiap kolom digunting dan

disemprotkan dengan pereaksi pengenal. Larutan Ag dengan dikromat

menghasilkan warna merah dan Pb (II) dengan KI menghasilkan warna kuning.

Setelah warna tampak, jarak perpindahan dari tiap komponen diukur dan dihitung

nilai Rf. Dari data yang telah diperoleh kita gunakan asam oksalat sebagai pelarut.

Dan diperoleh masing- masing untuk kelarutan cuplikan A dan B, serta logam Ag

dan Pb.

KROMATOGRAFI PREPARATIF

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi

berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-

komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh karena daya

serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak

dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan

pemisahan.

KLT Preparatif dapat digunkaan untuk memisahkan bahan dalam jumlah

gram, namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. Seperti

halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan fase diam dan fase

gerak. Dimana fase diamnya adalah sebuah plat dengan ukuran ketebalan

bervariasi. Untuk jumlah sampel 10-100 mg, dapat dipisahkan dengan

mengunakan KLT Preparatif dengan adsorben silika gel atau aluminium oksida,

dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1 mm, jika tebalnya di dua kalikan, maka

banyaknya sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%, seperti halnya KLT

biasa, adsorben yang paling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika

gel.

Sebelum ditotolkan pada plat KLT Preparatif, sampel dilarutkan terlebih

dahulu dalam sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah

menguap, misalnya n-heksana, diklorometana atu etil asetat. Karena jika pelarut

yang digunakan tidak mudah menguap, maka akan terjadi pelebaran pita.

Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5-10%. Sampel yang ditotolkan harus

berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga

bergantung pada lebarnya pita.

Setelah plat KLT Preparatif dielusi, pita yang kedudukannya telah

diketahui dikerok dari plat. Selanjutnya senyawa harus diekstraksi dari adsorben

dengan pelarut yang sesuai (5 ml pelarut untuk 1 gram adsorben). Diupayakan

untuk menggunakan pelarut yang paling nonpolar yang mungkin. Harus

diperhatikan bahwa makin lama senyawa kontak dengan adsorben, maka makin

besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian. Selanjutnya ekstrak

yang diperoleh disaring menggunakan corong berkaca masir atau menggunakan

membran.

Kelebihan dari penggunaan KLT Preparatif adalah biaya yang digunakan

murah dan memakai peralatan paling dasar. Sementara kekurangannya antara

lain : adanya kemungkinan senyawa yang diambil dari plat adalah senyawa

beracun, waktu yang diperlukan dalam proses pemisahan cukup panjang ,adanya

pencemar setelah proses ekstraksi senyawa dari adsorben dan biasanya rendemen

yang diperoleh berkurang dari 40%-50% dari bahan awal.

KROMATOGRAFI KOLOM

1. Pengertian

Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk

pemurnian senyawa dari campuran dengan memakai kolom. Kromatografi

kolom termasuk kromatografi cairan, adalah metoda pemisahan yang cukup

baik untuk sampel lebih dari 1 gram.

2. Prinsip

Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap

dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam

sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir

kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat

sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan

turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan

penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa

tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus

sehingga terjadi pemisahan dalam kolom.

3. Mekanisme

Biasanya sampel dihomogenkan dengan fase diam sehingga merupakan

serbuk kering, diatas lapisan ini dapat diletakkan pasir untuk menjaga tidak

terjadinya kerusakan waktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan sampel.

Fase diam dan sampel ini berada di dalam kolom yang biasanya dibuat dari

gelas, logam ataupun plastik. Selama elusi fase gerak dialirkan dari atas,

mengalir karena gaya gravitasi atau ditekan dan juga disedot dari arah bawa.

Komponen sampel akan terpisah selama bergerak dibawa fase gerak didalam

kolom (fase diam). Komponen yang paling tidak tertahan oleh fase diam akan

keluar lebih dahulu dan diikuti oleh komponen lain. Semuanya ditampung

sebagai fraksi, volume tiap fraksi tergantung besarnya sampel (kolom).

4. Tahapan Kerja

a. Kolom kromatografi

Kolom biasanya berbentuk seperti buret untuk titrasi, ukurannya beragam.

Perbandingan panjang kolom sekurang-kurangnya 10 kalinya diameternya,

perbandingan ini tergantung mudah tidaknya komponen dipisahkan.

Perbandingan berat sampel dan fase gerak (1 : 30) biasanya cukup

memadai untuk pemisahan yang mudah, perbandingan dapat ditingkatkan

hingga (1:50) untuk komponen yang susah dipisahkan.

b. Fase diam

Ukuran partikel fase diam bisanya lebih besar dari ukuran partikel fase

diam untuk KLT, ukuran yang digunakan antara 63-250|iim. Ukuran

partikel lebih kecil 63 jam fase gerak akan mengalir lebih lambat, sehingga

perlu ditekan atau dihubungkan dengan pipa hisap. Silika gel (SiOi) adalah

fase diam yang serba guna, banyak digunakan. Pada pembuatannya silika

gel perlu diaktifkan panaskan pada 150-160°C selama 3-4 jam. Fase diam

lain adalah alumina.

c. Pemilihan Fase gerak (pelarut=solven = eluen)

Pemilihan fase gerak sangat menentukan berhasil tidaknya pemisahan.

Untuk menentukan fase gerak yang akan digunakan, dilakukan

pendekatan:

1. Penelusuran literature/pustaka.

2. Mencoba dengan KLT.

Cara ini dikerjakan dengan memilih fase diam KLT sejenis dengan fase

diam kolom yang akan digunakan. Biasanya dicoba dikembangkan dengan

fase gerak non polar kemudian diikuti dengan fase gerak yang lebih polar.

d. Membuat kolom (packing)

Pengemasan kolom dapat dilakukan dengan cara basah atau cara kering.

Cara basah lebih mudah untuk memperoleh packing yang memberikan

pemisahan yang baik. Sedangkan cara kering umumnya dilakukan untuk

alumina.

Cara basah

Kedalam ujung kolom kromatografi (tempat keluarnya fase diam)

diatas keran diletakkan gelas wool, tidak perlu ditekan kuat. Diatasnya

ditaburkan pasir sehingga membentuk lapisan tebal + 1 cm. Selanjutnya

dimasukkan petroleumeter sambil mencoba kecepatan menetes fase gerak

dengan memutar keran. Di dalam beker gelas dibuat bubur fase diam

dengan petroleum eter. Dengan bantuan batang pengaduk bubur

dimasukkan kedalam kolom berisi petroleum eter. Sambil diketuk-ketuk

butir-butir fase diam akan turun dan tersusun rapi didalam kolom. Bila

kolom penuh dengan petroleum eter keran dibuka untuk menurunkan

permukaannya dan petroleum eter yang keluar dapat digunakan

lagi untuk membuat bubur fase diam. Packing dihentikan sampai panjang

kolom yang dikehendaki. Selapis pasir diletakkan pada packing kolom

untuk melindungi kolom. Kolom dijaga untuk tidak kering, maka diatas

lapisan pasir haras selalu ada selapis fase gerak. Pada proses packing ini

dinding luar kolom gelas disemprot dengan aseton. Penyemprotan

dimaksudkan untuk mendinginkan kolom sehingga menghambat

terbentuknya gelembung udara. Adapun untuk kolom yang diameternya

kecil fase diam kering dapat ditaburkan sedikit demi sedikit kedalam

kolom yang berisi petroleum eter. Kolom ini digunakan setelah disimpan

semalam.

Cara kering

Selapis pasir diletakkan didasar kolom, kemudian fase gerak

dimasukkan lapis demi lapis sampil ditekan dengan karet atau alat penekan

lain. Selain ditekan dapat juga dibantu dengan dihisap, sehingga dihasilkan

packing fase diam yang mampat. Diatas fase diam diletakkan kertas saring

dan diatasnya lagi selapis pasir. Pada posisi keran terbuka fase gerak

dituangkan dan dibiarkan mengalir keluar. Packing kolom disimpan

dengan mempertahankan selapis fase gerak berada diatas lapisan pasir.

e. Penyiapan Sampel

Sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai,

kemudian dituangkan hati-hati diatas packing kolom. Fase gerak

dikeluarkan tetes demi tetes, diatur kecepatan menetesnya (tergantung

besar-kecilnya kolom) dan dijaga kolom tetap terendam, untuk itu

ditambah fase gerak perlahan-lahan dan dijaga tidak merusak packing

kolom. Fase gerak yang keluar ditampung sebagai fraksi. Volume fraksi

tergantung berat sampel dan pemisahan yang nampak pada kolom saat

proses awal elusi ini. Makin kecil volume fraksi, akan diperoleh

pemisahan yang lebih baik, namun akan dikumpulkan banyak fraksi.

Untuk 10 gram sampel biasanya dikumpulkan fraksi dengan volume a 150

ml.

Cara meletakkan sampel pada kolom yang lebih baik adalah

dengan mencampur dengan fase diam. Satu bagian sampel dilarutkan

dalam pelarut yang sesuai, biasanya pelarut yang digunakan adalah pelarut

yang digunakan untuk pembuatan ekstrak. Larutan ekstrak ini kemudian

dicampur dengan 2,0-3.0 bagian fase diam, dengan hati-hati campuran ini

dikeringkan didalam rotary evaporator hingga diperoleh serbuk ekstrak

kering. Serbuk ini ditaburkan diatas packing kolom dan ditutup dengan

selapis pasir. Selanjutnya sampel siap dielusi.

f. Elusi (pengembangan)

Fase gerak (cairan =pelarut pengembang)

Fase gerak dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit

demi sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakkan diatas kolom

sehingga fase gerak mengalir dengan sendirinya. Cara yang praktis adalah

dengan memasukkan kedalam corong pisah, ujung corong pisah

dimasukkan kedalam corong pisah, ujung corong pisah dimasukkan ke

dalam kolom dan ujung lain tertutup, sedangkan keran terbuka. Fase gerak

akan keluar dengan sendirinya sesuai dengan keluarnya fase gerak dari

kolom.

Dibedakan dua jenis cara elusi:

>> Elusi gradien (bertahap) yaitu selama proses elusi menggunakan fase

gerak dengan polaritas tetap.

>> Elusi isokratik yaitu selama proses elusi menggunakan fase gerak

berubah-ubah polaritasnya. Untuk membuat polaritas berubah-ubah

maka komposisi fase gerak berubah. Pada umumnya dimulai fase gerak

non polar kemudian berubah ke pelarut polar. Perubahan ini dapat

diprogramkan sesuai dengan pemisahan yang diinginkan.

Elusi dihentikan jika sudah tidak ada lagi sampel yang dapat dibawa keluar

lagi oleh fasa gerak, bila digunakan elusi gradient sidah sampai pada fase

gerak yang paling polar.

g. Komponen yang dipisahkan

Kromatografi kolom yang konvensional tidak dilengkapi detektor, namun

sekarang dapat digunakan dengan mengalirkan eluate (efluen) pada detector

untuk mendeteksi komponen. Yang umum digunakan dan mudah dikerjakan

adalah dengan memonitor fraksi dengan KLT. Fraksi yang mempunyai profil

bercak KLT yang mirip digabungkan. Selanjutnya gabungan ini dapat

dianalisis lebih lanjut.

Kromatografi Kolom Vakum

1. Pengertian Kromatografi Kolom Vakum

Kromatografi kolom vakum (KKV) adalah kromatografi yang dilakukan

untuk memisahkan senyawa dengan menggunakan silika gel sebagai adsorben dan

berbagai perbandingan pelarut (elusi gradien) dan menggunakan pompa vakum

untuk memudahkan penarikan eluen.

Kromatografi kolom vakum sama dengan kromatografi cair vakum.

Karena kromatografi cair vakum merupakan salah satu jenis dari kromatografi

kolom. Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran

larutan dengan perbandingan pelarut dan kerapatan dengan menggunakan bahan

kolom. Kromatografi kolom lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian

senyawa.

Kromatografi kolom vakum/kromatografi cair vakum merupakan

kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum, fase gerak

digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom

kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan

maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap

yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi.

Walaupun KKV/KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari pada

kromatografi lapis tipis (KLT), KKV/KCV tetap ekonomis dalam sisi biaya.

Kromatografi cair vakum (KCV) pertama kali diperkenalkan oleh para

ilmuwan dari Australia untuk mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan untuk

separasi menggunakan kolom kromatografi klasik. Pada dasarnya metode ini

adalah kromatografi lapis tipis preparatif yang berbentuk kolom. Aliran fase gerak

dalam metode ini diaktifkan dengan bantuan kondisi vakum. Kromatografi cair

vakum pada awalnya digunakan untuk separasi senyawaan steroid dan produk-

produk natural dari laut. Kromatografi cair vakum terdiri dari suatu corong

Buchner yang memiliki kaca masir. Corong Buchner ini diiisi dengan fase diam

yang tingkat kehalusannya seperti yang umumnya dipakai dalam kromatografi

lapis tipis (70-230 mesh). Corong Buchner yang berisi fase diam ini

digunakan dalam kondisi vakum/bertekanan, yang berakibat pada kemampuan

yang dihasilkan olehkromatografi cair vakum akan sama dengan kromatografi

gravitasi namundiperlukan waktu yang lebih singkat. Cara asli yang

diperkenalkan oleh Coll menggunakan corong Buchner kaca masir

atau kolom pendek, sedangkan Targett menggunakan kolom yang lebih panjang

untukmeningkatkan daya pisah.

Gambar 1. Kromatografi Kolom Vakum

2. Prinsip Kromatografi Kolom Vakum

Prinsip kerja dari kromatografi kolom vakum adalah adsorpsi atau serapan,

sedangkan pemisahannya didasarkan pada senyawa-senyawa yang akan

dipisahkan terdistribusi di antara fasa diam dan fasa gerak dalam perbandingan

yang berbeda-beda. Dimana mekanisme adsorpsinya yaitu mengadsorbsi ion-ion

dan molekul-molekul senyawa pada fase diam dan pemisahannnya berdasarkan

kelarutan senyawa dengan eluen yang digunakan.

3. Keuntungan dan Kerugian Kromatografi Kolom Vakum

Kromatografi kolom vakum mempunyai keuntungan:

1. Mempunyai biaya ekonomis

2. Adanya aliran fase gerak lebih cepat

3. Pengerjaannnya sederhana

4. Cuplikan yang dipisahkan lebih banyak

Kerugian kromatografi kolom vakum:

1. Membutuhkan waktu yang cukup lama

2. Sampel yang digunakan banyak jika dibandingkan dengan KLT dan

terbatas jika dibandingkan dengan kromatografi konvensional

4. Perbedaan Kromatografi Kolom Vakum dengan Kromatografi Kolom

Konvensional

Adapun perbedaan kromatografi kolom vakum dengan kromatografi

kolom konvensional yaitu:

1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan

kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase

gerak lebih lambat (10-100µl/menit)

2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih

ideal jika digabung dengan spectrometer massa

3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

missal sampel klinis

5. Pelarut

Pelarut yang digunakan dalam kromatografi cair vakum adalah pelarut yang

kepolarannya paling rendah sampai pelarut yang kepolarannya tinggi. Dimana

Elusi diawali dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolaran

ditingkatkan perlahan-lahan (polaritas meningkat) dengan harapan bahwa

komponen kimianya terelusi secara berurutan berdasarkan tingkat kepolarannya.

Oleh karena itu, Kromatografi Cair Vakum menggunakan tekanan yang rendah

untuk meningkatkan lajua aliran fase gerak. Kolom dihisap perlahan-lahan ke

dalam wadah penampung fraksi sampai kering dengan cara memvakumkannya.

Urutan pelarut yang digunakan adalah sebagai berikut:

Fraksi Pelarut Komposisi Volume (ml)

1 Heksana 100 100

2 Heksana-etil asetat 50:50 100

3 Etil asetat 100 100

4 Etil asetat-metanol 75:25 100



7 Metanol 100 100

Atau digunakan urutan pelarut sebagai berikut :

Fraksi Pelarut Komposisi Volume (ml)

1 Heksana 100 100





6 Etil asetat 100 100

7 Metanol 100 100

6. Jenis-jenis Kromatografi Kolom Vakum

Jenis-jenis kromatografi kolom vakum yaitu:

A. Suction Colomn

Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan

absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan

dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen

kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.

B. Rapid-Sigel

Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan

absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan

dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi

komponenkimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.

C. Press Colomn

Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerakdengan

cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara

yang ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan

peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi.

DAFTAR PUSTAKA

Day, R.A dan Underwood. 1981. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Keempat. Jakarta: Erlangga.

Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar: Yogyakarta.

Rahman, Abdul., dkk., 2008, Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar: Yogyakarta.

Soebagio, dkk. 2002. Kimia Analitik II. Malang: FMIPA Universitas Negeri Malang

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung.

Makalah Fitokimia

Documents

Transcript of Makalah Fitokimia