LAPORAN AKHIR PENELITIAN - e-riset.litbang.kemkes.go.id. Laporan-20… · LAPORAN AKHIR PENELITIAN...

i

LAPORAN AKHIR PENELITIAN

Studi Marker Protein Prediktor Diabetes Melitus pada Individu

dengan Pre-Diabetes

Disusun oleh:

dr. Asri Werdhasari, M.Biomed dan Tim

PUSAT PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN

BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN

BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

2017

ii

SURAT KEPUTUSAN (SK) PEMBENTUKAN TIM

PELAKSANA PENELITIAN

vii

SUSUNAN TIM PENELITI

No Nama Keahlian/

Kesarjanaan

Kedudukan dalam

Tim Uraian Tugas

1. 1 dr. Asri Werdha

Sari, M. Biomed Biomed Ketua Penelitian

Bertanggung jawab pada

keseluruhan penelitian

(Bertanggung jawab atas

perencanaan, pelaksanaan,

kualitas dan evaluasi serta

laporan penelitian)

2. 2 drh. Win

Winarno,M.Kes. Dr hewan Peneliti

Bertanggung jawab pada

reviu internal pelaporan dan

diseminasi hasil penelitian

3. drh. Uly Alfi

Nikmah, M.Biomed. Biomed Peneliti

Bertanggung jawab atas

pengajuan etik, bahan

penelitian, membantu

penyelenggaraan pertemuan

koordinasi

penelitian/pelatihan,

pembuatan protokol,

penyusunan

RAB/RPD/RPK, pengajuan

etik, analisis data dan

pembuatan laporan

4. 3 dr. Frans Dany Dokter umum Peneliti


penelusuran jurnal,

pembuatan

protokol,pemisahan plasma

dan buffy coat, ekstraksi

DNA, pemeriksaan variasi

genetik (polimorfisme) dan

analisis hasil pemeriksaan

5. 4 drh. Risqa Novita,

M.KM. Dokter hewan Peneliti

Bertanggung jawab

penghubung administrasi,

penyelenggaraan pertemuan

koordinasi

penelitian/pelatihan,

membantu pengajuan bahan

penelitian dan pembuatan

laporan

6. 5 Holy Arif Wibowo,

S.Si Biologi Peneliti


ekstraksi DNA,

pemeriksaan variasi genetik

(polymorfism) dan analisis

hasil pemeriksaan

viii

7. drh. Putri Reno Intan Dokter hewan Peneliti


pemisahan buffycoat,

ekstraksi DNA dan

pemeriksaan protein

8. Rosa Adelina, M.Si,

Apt Biomedik Peneliti



ekstraksi DNA dan

pemeriksaan protein

9. Sehatman, S.Si,

M.Sc Biomedik Peneliti



ekstraksi DNA dan

pemeriksaan protein

10. Dwi Febriyana, S.Si Biologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan

pemeriksaan laboratorium

11. 1 Daryanto, S.Kom Sarjana

Komputer IT


manajemen data dan

spesimen

12. 1 Driya Shintia Dewi

Adianti, S.Biotech Bioteknologi Pembantu Peneliti

Membantu pelaksanaan


13. 1 Wika

Sumartyaningsih,

S.Biotech

Bioteknologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan


14. 1 Tati Febrianti, S.Si Biologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan


15. 1 Primarasprabu IT Pembantu Peneliti Membantu dalam

manajemen sampel

16. 1 Anggi Aris Faisal Analis

kesehatan Pembantu Peneliti

Membantu dalam

manajemen sampel

17. 2 Kristina

Retnoningtyas

Palupi, S.Si

Biologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan


18. 2 Rulina Novianti,

S.Si

Analis




19. Juwita Kurniawati,

Amd. Ak.

Analis




20. Adit Prasetyo Analis




21. 2 Fri Handayani, Amd. SE Administrator Melaksanakan administrasi

keuangan

22. 2 Yuswanto SE Administrator Melaksanakan administrasi

keuangan

ix

PERSETUJUAN ETIK

xi

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas selesainya penyusunan laporan

penelitian Studi Marker Protein Prediktor Diabetes Melitus pada Individu dengan

Pre Diabetes tahun 2017. Terima kasih tim peneliti haturkan pada Kepala

Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan (PBTDK) dan seluruh

jajarannya sehingga penelitian ini dapat dibiayai melalui DIPA PBTDK tahun

2017. Terima kasih pula kepada tim Panitia Pembina Ilmiah PBTDK yang telah

memberi arahan substansial, kepada tim Komisi Etik Penelitian Badan Litbangkes

yang telah mengeluarkan Persetujuan Etik dan kepada ibu Dr. Efriwati, M.Si yang

telah mereviu dan memberi masukan membangun sehingga tersusunlah laporan

penelitian ini. Terima kasih kepada seluruh tim peneliti dan tenaga honor yang

ikut membantu dengan segenap daya upaya menyelesaikan penelitian ini dan

kepada seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi masukan kepada program

penanggulangan penyakit tidak menular. Marker genetik dan protein yang

ditemukan secara statistik bermakna pada populasi penelitian, dapat dilakukan

eksplorasi lebih lanjut untuk dapat diterapkan sebagai salah satu mekanisme untuk

mendeteksi faktor risiko secara dini sebelum munculnya gejala.

Tim peneliti berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi masyarakat

dalam upaya pencegahan penyakit tidak menular, terutama diabetes melitus. Suatu

penyakit yang merupakan faktor risiko bagi munculnya penyakit lainnya.

Tim Peneliti

xii

RINGKASAN EKSEKUTIF

Diabetes mellitus tipe-2 (DM) merupakan faktor risiko dari penyakit tidak

menular lainnya, seperti kardiovaskuler, gagal ginjal dan lain-lain.Secara ekonomi,

DM menjadi penyakit yang mahal, karena prevalensi serta progresivitasnya yang

meningkat. Kondisi sebelum DM, yang ditandai dengan peningkatan kadar gula

darah puasa (GDPT) atau peningkatan kadar gula darah setelah pembebanan

glukosa (TGT) disebut pre-DM. Pre-DM ini telah menimbulkan adanya gangguan

metabolisme dan komplikasi. Hal ini telah menjadi beban bagi individu maupun

masyarakat dan pemerintah. Sehingga pencegahan pre-DM menjadi DM dan

mengembalikan kondisi pre-DM menjadi kembali normal sangatlah penting

dilakukan.

Salah satu cara yang sedang dikembangkan untuk pencegahan hal tersebut

adalah dengan penggunaan marker untuk deteksi dini pre-DM dan DM. Marker

tersebut diharapkan dapat digunakan sebagai prediktor pre-DM dan DM,

sehingga dapat menurunkan angka kejadian pre-DM dan DM. Single nucleotide

polymorphisms (SNPs) merupakan variasi sekuen DNA yang dapat dihubungkan

dengan kerentanan seseorang terhadap suatu penyakit seperti DM.

Penelitian ini ingin mengetahui hubungan variasi gen dan kadar protein

terkait terhadap kejadian DM dan pre DM pada suatu populasi, yaitu populasi .

yang sama dengan studi kohor untuk faktor risiko penyakit tidak menular (FR-

PTM). Dimana studi kohor FR-PTM ini merupakan studi berbasis masyarakat

yang dilakukan Badan Litbangkes sejak tahun 2011 untuk mengamati penyakit

stroke, jantung koroner (PJK), DM dan hipertensi. Data dasar berupa hasil

wawancara berisi riwayat, gejala penyakit, perilaku dan frekuensi diet, serta hasil

pemeriksaan fisik berupa antropometri, tekanan darah, elektrokardiografi, rontgen

dada dan neurologi sudah terkumpul dalam studi kohor FR-PTM sebelumnya.

Penelitian ini, berupa marker genetik DM diharapkan dapat melengkapi data studi

tersebut.

Biomarker yang dianalisis dalam studi ini adalah single nucleotide

polymorphisms (SNPs) pada 8 gen yaitu gen UCP2 rs660339, DUSP9/MKP4

rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin (RETN) rs3745367, IGF2BP2

xiii

rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ rs6773957 dan KLF14 rs972283.

Selain itu, penelitian ini dilengkapi dengan pengamatan ekspresi variasi biomarker

genetik gen-gen tersebut berupa pengukuran kadar protein resistin, insulin,

c-peptide dan adiponektin.

Hasil penelitian menunjukkan alel gen DUSP9/MKP4, RETN, ADIPOQ

dan KLF14 mutan meningkatkan risiko timbulnya DM yang lebih tinggi

dibandingkan alel asal. Gen IGF2BP2, UCP2 dan KCNQ1 alel asal justru

meningkatkan risiko menjadi DM dibandingkan alel mutannya. Sementara itu,

ketidakseimbangan hukum Hardy-Weinberg dijumpai pada semua gen. Dengan

demikian, sebagian alel mutan dan alel asal menjadi faktor risiko timbulnya DM

dan terindikasi sudah berevolusi.

Gangguan kadar protein sudah dijumpai pada individu prediabetes, yaitu

protein adiponektin, resistin dan insulin. Kadar protein c-peptide paling rendah

dijumpai pada kelompok DM. Perubahan ekspresi sebagian protein yang paling

mencolok pada kelompok prediabetes dapat digunakan sebagai penanda genetik.

Biomarker tersebut dapat dikembangkan lebih lanjut sebagai prediktor dini

prediabetes.

xiv

ABSTRACT

Prevalence of type 2 diabetes mellitus (DM) continues to increase in

worldwide, including Indonesia based on Riskesdas 2007 and 2013 data. A

number of studies indicate genetic marker variations being determinants of blood

sugar metabolism impairment and some developed countries have started using

such biomarker screening as early detection or prevention. This research was

conducted to identifythose biomarkers and use them as DM predictor, hopefully

decreasingits incidence rate. This study used a cohort sample population in Bogor,

West Java. The biomarkers analyzed in this study were single nucleotide

polymorphisms (SNPs) on UCP2 rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8

rs13266634, Resistin (RETN) rs3745367, IGF2BP2 rs16860234, KCNQ1

rs2237892, ADIPOQ rs6773957 and KLF14 rs972283 gene. Protein level of

resistin, insulin, c-peptide and adiponectin were also measured to complement the

findings on these genetic biomarker variation expression. RETN, DUSP9/MKP4,

IGF2BP2, ADIPOQ and KLF14 mutant gene alleles increased risk of developing

DM, at least compared to their normal counterparts. Meanwhile, Hardy-

Weinberg's inequilibriumwas found in all genes. Impaired protein levels are found

particularly in prediabetes individuals, except the lowest levels of c-peptide found

in the DM group. Thus, some mutant alleles became risk factors for DM and

seemed to evolve. However, the protein expression changes were most prominent

in the prediabetes group.Hence,thosebiomarker genetic markers can also be

further developed as prediabetes early predictors.

Keywords: diabetes mellitus, kohort, single nucleotide polymorphisms (SNPs),

Hardy-Weinberg, protein, Bogor

xv

ABSTRAK

Peningkatan prevalensi diabetes melitus (DM) tipe 2 terus terjadi di seluruh

dunia, termasuk di Indonesia. Berdasarkan data Riskesdas terjadi peningkatan dari

1,1% (tahun 2007) menjadi 2,1% (tahun 2013). Sejumlah studi menunjukkan

adanya variasi penanda genetik yang menjadi determinan timbulnya gangguan

metabolisme gula darah. Penelitian ini dilakukan untuk identifikasi biomarker

timbulnya DM dan digunakan sebagai prediktor DM untuk menurunkan angka

kejadian DM. Studi ini menggunakan populasi sampel studi kohor faktor risiko

Penyakit Tidak Menular (FR-PTM) di Bogor, Jawa Barat. Biomarker yang

dianalisis adalah single nucleotide polymorphisms (SNPs) pada gen UCP2

rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin (RETN)

rs3745367, IGF2BP2 rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ rs6773957 dan

KLF14 rs972283. Selain itu pengukuran kadar protein resistin, insulin, c-peptide

dan adiponektin dilakukan untuk melengkapi temuan adanya ekspresi variasi

biomarker genetik gen-gen tersebut. Alel mutan gen RETN rs3745367,

DUSP9/MKP4 rs5945326, ADIPOQ rs6773957 dan KLF14 rs972283

meningkatkan risiko timbulnya DM yang lebih tinggi dibandingkan alel normal.

Namun sebaliknya, gen IGF2BP2 rs16860234, UCP2 rs660339 dan KCNQ1

rs2237892 alel asal justru meningkatkan risiko menjadi DM yang lebih tinggi

dibandingkan alel mutan. Ketidakseimbangan hukum Hardy-Weinberg dijumpai

pada semua gen. Gangguan kadar protein adiponektin, resistin dan insulin sudah

dijumpai pada individu prediabetes. Dengan demikian, sebagian alel mutan atau

bahkan alel asal dapat menjadi faktor risiko timbulnya DM dan terindikasi

berevolusi. Namun, perubahan ekspresi sebagian protein paling mencolok pada

kelompok prediabetes sehingga penanda genetik biomarker tersebut dapat juga

dikembangkan lebih lanjut sebagai prediktor dini prediabetes.

Kata kunci: diabetes melitus, kohort, single nucleotide polymorphisms (SNPs),

Hardy-Weinberg, protein, Bogor

xvi

DAFTAR ISI

SUSUNAN TIM PENELITI ................................................................................. vii

PERSETUJUAN ETIK .......................................................................................... ix

KATA PENGANTAR ........................................................................................... xi

RINGKASAN EKSEKUTIF ................................................................................ xii

ABSTRACT ........................................................................................................... xiv

ABSTRAK ............................................................................................................. xv

DAFTAR ISI ........................................................................................................ xvi

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xviii

PENDAHULUAN ................................................................................................... 1

I.1. Latar Belakang ............................................................................................... 1

1.2. Perumusan Masalah ...................................................................................... 2

I.3. Tujuan Penelitian ........................................................................................... 2

I.3.1. Tujuan Umum ......................................................................................... 2

I.3.2. Tujuan Khusus ........................................................................................ 2

I.4. Manfaat dan Luaran Penelitian ...................................................................... 2

TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................................... 3

METODE PENELITIAN ......................................................................................... 8

III.1. Kerangka Teori............................................................................................ 8

III.2. Kerangka Konsep ........................................................................................ 8

III.3. Desain dan Jenis Penelitian ......................................................................... 9

III.4. Tempat dan Waktu ...................................................................................... 9

III.5. Populasi dan Sampel ................................................................................... 9

III.5.1. Populasi ................................................................................................ 9

III.5.2. Sampel ................................................................................................ 10

III.5.3. Kriteria Inklusi dan Eksklusi .............................................................. 10

III.5.4. Estimasi Besar Sampel, Cara Pemilihan dan Penarikan Sampel ....... 10

III.5.5. Variabel .............................................................................................. 10

III.5.6. Definisi Operasional........................................................................... 11

III.6. Alur Penelitian .......................................................................................... 11

III.7. Bahan dan Prosedur Kerja ......................................................................... 11

III.7.1. Bahan dan alat .................................................................................... 11

III.7.2. Prosedur kerja..................................................................................... 12

xvii

III.8. Manajemen dan Analisis Data .................................................................. 20

III.9. Pertimbangan Etik Penelitian .................................................................... 21

III.10. Pertimbangan Izin Penelitian .................................................................. 21

HASIL PENELITIAN ............................................................................................ 22

PEMBAHASAN .................................................................................................... 49

KESIMPULAN & SARAN ................................................................................... 54

VI.1. Kesimpulan ............................................................................................... 54

VI.2. Saran ......................................................................................................... 55

UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................................. 56

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 57

LAMPIRAN ........................................................................................................... 59

xviii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen

UCP2 rs660339. ...................................................................................... 40


KCNQ1 rs2237892. ................................................................................ 40


RETN rs3745367. ................................................................................... 41


DUSP9/MKP4 rs5945326. ..................................................................... 41


SLC30A8 rs13266634. ........................................................................... 41


IGF2BP2 rs16860234. ............................................................................ 42


ADIPOQ rs6773957. .............................................................................. 42


KLF14 rs972283. .................................................................................... 42

Tabel 9. Larutan Standar Kadar C-peptide. .......................................................... 43

Tabel 10. Hasil Pemeriksaan Protein. ................................................................... 44

Tabel 11. Larutan Standar Adinponektin. ............................................................. 45

Tabel 12. Hasil Pemeriksaan Kadar Adiponektin dalam Plasma Darah

Responden. ............................................................................................ 45

Tabel 13. Larutan Standar Insulin. ........................................................................ 46

Tabel 14. Hasil Pemeriksaan Insulin. .................................................................... 47

Tabel 15. Larutan Standar Resistin. ...................................................................... 47

Tabel 16. Hasil Pemeriksaan Protein Resistin. ..................................................... 48

xix

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2 rs660339 pada

responden DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor tahun

2016. .................................................................................................... 23

Gambar 2. Distribusi alel a/a, a/g dan g/g pada gen ucp2 rs660339 pada responden

normal, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor, 2016. ............ 23

Gambar 3. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2 rs660339 pada

responden dengan pre DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota

Bogor, 2016. ........................................................................................ 24

Gambar 4. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1 rs2237892 pada

responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

............................................................................................................. 25


responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun

2016. .................................................................................................... 25


responden dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor

tahun 2016. .......................................................................................... 26

Gambar 7. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN rs3745367 pada


............................................................................................................. 27


responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun

2016. .................................................................................................... 27


responden dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor

tahun 2016. .......................................................................................... 28

Gambar 10. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4

rs5945326 pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota

Bogor tahun 2016. ............................................................................... 29


rs5945326 pada responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota

Bogor tahun 2016. ............................................................................... 29


rs5945326 pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM,

kota Bogor tahun 2016. ....................................................................... 30

Gambar 13. Distribusi genotipeC/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634

pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun

2016. .................................................................................................... 31

xx

Gambar 14. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634

pada responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor

tahun 2016. .......................................................................................... 31

Gambar 15. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634

pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor

tahun 2016. .......................................................................................... 32

Gambar 16. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2

rs16860234 pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota

Bogor tahun 2016. ............................................................................... 33


rs16860234 pada responden normal, studi kohor faktor risiko PTM,

kota Bogor tahun 2016. ....................................................................... 33


rs16860234 pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM,

kota Bogor tahun 2016. ....................................................................... 34

Gambar 19. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden DM, studi

kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016. .............................. 35

Gambar 20. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden normal, studi


Gambar 21. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden pre DM, studi


Gambar 22. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden DM,

studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016. ..................... 37

Gambar 23. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden normal,


Gambar 24. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden pre DM,


Gambar 25. Kurva Standar C-peptide. .................................................................. 44

Gambar 26. Kurva Standar Adiponektin. .............................................................. 45

Gambar 27. Kurva standar Insulin. ....................................................................... 46

Gambar 28. Kurva Standar Resistin ...................................................................... 47

xxi

DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN

PTM : Penyakit Tidak Menular

DM : Diabetes Mellitus

Pre DM : Kondisi gangguan metabolisme sebelum masuk pada

kondisi DM

TGT : Toleransi Glukosa Terganggu

GDPT : Glukosa Darah Puasa Terganggu

SNP : Single Nucleotide Polymorphisms

RT PCR : Real Time Polimerase Chain Reaction

Isolated IFG : Isolated Impaired Fasting Glucose; keadaan ketika

kadar glukosa darah puasa di atas normal tetapi tidak

cukup tinggi untuk memenuhi kriteria DM (GDP = 100-

125 mg/dL) tetapi kadar glukosa darah 2 jam pasca

pembebanan masih dalam kisaran normal (OGTT < 140

mg/dL)

Isolated IGT : Isolated Impaired Glucose Tolerance; keadaan ketika

kadar glukosa darah 2 jam pasca pembebanan di atas

normal tetapi tidak cukup tinggi untuk memenuhi

kriteria DM (OGTT = 140-199 mg/dL) tetapi kadar

glukosa darah puasa masih dalam kisaran normal (GDP

< 100 mg/dL

1

BAB I

PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang

Diabetes Melitus (DM) tipe 2 merupakan ibu dari beberapa penyakit

degeneratif lainnya, sehingga merupakan masalah kesehatan yang serius. Kondisi

gangguan metabolisme tubuh yang ditandai dengan kenaikan kadar gula darah

melebihi nilai ambang, dikenal dengan prediabetes. Pada kondisi ini risiko

terhadap penyakit kardiovaskuler dan kematian total juga meningkat hampir dua

kali lipat, karena dikaitkan dengan adanya komplikasi mikrovaskular.

Menurut data Riset Kesehatan Dasar (RKD) 2013 terdapat peningkatan

prevalensi DM dibandingkan dengan data sebelumnya (RKD 2007). Pada tahun

2007 prevalensi DM di area perkotaan Indonesia dari 5,7% dan menjadi 6,8%

pada tahun 2013 pada seluruh wilayah Indonesia.

Faktor risiko DM tipe 2 terutama disebabkan oleh pola hidup yang kurang

sehat serta riwayat DM dalam keluarga, sehingga dimungkinkan erat kaitannya

dengan faktor genetik. Oleh karena itu, upaya pencegahan perlu dilakukan sedini

mungkin dengan perubahan gaya hidup atau pengendalian faktor risiko yang

sudah ada.

Beberapa studi di negara maju sudah mempertimbangkan penggunaan

biomarker sebagai salah satu upaya skrining pencegahan awal penyakit metabolik,

mulai dari penanda genetik sampai protein. Penanda genetik yang digunakan

antara lain adanya Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), yang merupakan

variasi sekuen DNA yang dapat dihubungkan dengan kerentanan seseorang

terhadap suatu penyakit, antara lain DM tipe-2. Namun, hasil sejumlah penelitian

menunjukkan adanya variasi marker tersebut yang dapat disebabkan perbedaan

etnis atau gaya hidup yang menyertainya.

2

1.2 Perumusan Masalah

Hasil penelitian SNPs pada berbagai etnis / daerah menunjukkan hasil yang

berbeda terhadap risiko kejadian DM. Perbedaan variasi alel pada SNPs dapat

dijadikan sebagai prediktor DM yang khas untuk populasi Indonesia. Hasil

penelitian ini diharapkan dapat menganalisis kandidat 8 gen SNPs yang diperiksa

dengan membandingkan SNPs yang dimiliki antar kelompok individu dengan

kriteria kadar glukosa darah normal, prediabetes dan DM.

I.3 Tujuan Penelitian

I.3.1. Tujuan Umum:

Menentukan marker genetik yang berpotensi sebagai prediksi kejadian DM.

I.3.2 Tujuan Khusus:

1. Menentukan prevalensi variasi genetik gen-gen pengkode faktor resiko

DM pada populasi studi kohor faktor risiko PTM.

2. Mendapatkan besaran asosiasi polimorfisme gen-gen tersebut terhadap

kejadian penyakit DM pada populasi studi kohor faktor risiko PTM.

3. Melengkapi data studi kohor faktor risiko PTM dari faktor risiko

genomik dan identifikasi protein penanda DM / pre DM.

I.4. Manfaat dan Luaran Penelitian

1. Dapat memberikan gambaran epidemiologi genetik yang berbasis

masyarakat di Kecamatan Bogor Tengah, Kota Bogor.

2. Data yang diperoleh dapat digunakan sebagai masukan untuk

merancang program pencegahan dan pengendalian PTM, khususnya

DM dengan mempertimbangkan aspek genomik.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Diabetes melitus (DM) tipe 2 merupakan ibu dari beberapa penyakit

degeneratif lainnya, sehingga merupakan masalah kesehatan yang serius. Menurut

Konsensus Pengendalian dan Pencegahan DM tipe 2 di Indonesia tahun 2011,

kriteria DM apabila:

1. Terdapat gejala klasik DM, yaitu polifagia (banyak makan), polidipsi (banyak

minum) dan poliuria (banyak buang air kecil) dan kadar glukosa plasma > 126

mg/dL, atau

2. Kadar glukosa plasma pada TTGO (tes toleransi glukosa oral dengan

pembebanan glukosa 75 g) > 200 mg/dL

Kondisi gangguan metabolisme tubuh yang ditandai dengan kenaikan kadar

gula darah melebihi nilai normal namun belum mencapai tahap DM, dikenal

dengan prediabetes. Prediabetes meliputi Impaired Fasting Glucose (IFG) atau

Gula Darah Puasa Terganggu (GDPT)dan Impaired Glucose Tolerance (IGT) atau

Toleransi Glukosa Terganggu (TGT). Kriteria TGT yaitu kadar gula darah puasa

100-125 mg/dL dan 2 jam setelah pembebanan glukosa 140 – 199 mg/dL (ADA,

2011). Sedangkan prediabetes eksklusif meliputi Isolated Impaired Glucose

Tolerance/Isolated IGT atau TGT tersendiri dan Isolated Impaired Fasting

Glucose/Isolated IFG atau GDPT tersendiri, dengan kriteria:

1. Isolated IGT atau TGT tersendiri, yaitu glukosa plasma 2 jam setelah

pembebanan antara 140-199 mg/dL dan GDPT

4

prevalensi TGT sebesar 19,4%. Diperkirakan terdapat 314 juta orang dengan

prediabetes diseluruh dunia dan akan meningkat menjadi 418 juta pada tahun

2025 (Manaf,2013).

Kondisi risiko terhadap penyakit kardiovaskuler dan kematian total juga

meningkat hampir dua kali lipat karena dikaitkan dengan adanya komplikasi

mikrovaskular. Komplikasi baik prediabetes maupun DM berawal dari kerusakan

mikro maupun makrovaskular, sehinggaakan menampilkan komplikasi yang

multiple danyang menjadi penyebab kematian tersering adalah penyakit

kardiovaskular (Manaf 2013).

Faktor risiko DM tipe 2 terutama disebabkan oleh pola hidup yang kurang

sehat serta riwayat DM dalam keluarga, sehingga dimungkinkan erat kaitannya

dengan faktor genetik. Prediabetes juga merupakan faktor risiko yang kuat

terhadap DM.Prediabetes dapat berkembang menjadi DM, hipertensi, penyakit

jantung koroner, stroke dll. Siraj MAT (2010) dalam reviu artikel memperlihatkan

kira-kira sepertiga TGT menjadi DM, konversi diestimasi 5,8% pertahun.

Menurut hasil penelitian Zyriak dkk. (2013), individu dengan prediabetes secara

signifikan berhubungan dengan DM tipe 2. Sekitar 5-10% individu prediabetes

yang tidak tertangani akan berkembang menjadi diabetes atau menjadi normal

kembali (Zyriak, 2013).

Komplikasi tersebut merupakan beban bagi individu maupun masyarakat

dan pemerintah, maka dari itu pencegahan dari prediabetes menjadi DM sangat

penting.Karena itu, upaya pencegahan perlu dilakukan sedini mungkin dengan

perubahan gaya hidup atau pengendalian faktor risiko yang sudah ada.

Salah satu cara yang sedang dikembangkan untuk pencegahan tersebut

adalah penggunaan marker yang dapat dipercaya untuk deteksi dini DM. Marker

tersebut diharapkan dapat digunakan sebagai prediktor DM sehingga dapat

menurunkan angka kejadian prediabetes dan DM.

Salah satu penemuan dalam Human Genome Project adalah Single

Nucleotide Polymorphisms (SNPs). SNPs merupakan alel minor dengan

keberadaannya lebih dari 1%. Apabila SNPs terjadi pada gene coding regions bisa

mengakibatkan synonymous (tidak menyebabkan perubahan asam amino) atau

non synonymous. Akan tetapi pada penelitian beberapa tahun terakhir SNP

5

synonymous mendorong terjadinya evolusi yang mendorong terjadinya suatu

penyakit (Komar, 2009). SNP synonymous dapat mengubah struktur, fungsi dan

ekspresi protein. Polimorfisme synonymous dapat menyebabkan splicing RNA,

stabilitas dan struktur protein dapat rusak. Perubahan ini dapat menyebabkan efek

signifikan pada fungsi protein dan perubahan respon seluler. Sebagian besar SNPs

merupakan non coding region yang merupakan dasar variasi genetik pada manusia

dan mengacu pada perbedaan basa tunggal antar individu (Kwook, 2003).

Zachavora dkk. mendapatkan SNPs +45 T/G dan +276 G/T dari gen

adiponektin sebagai prediktor untuk konversi TGT menjadi DM.Pada individu

dengan DM akan mempunyai nilai adiponektin dalam darah yang rendah.

Hipoadiponektinemia berhubungan dengan resistensi insulin dan disfungsi

endotelium vaskuler, dan menyebabkan peningkatan stres oksidatif yang menjadi

penyebab penting aterosklerosis dan berlanjut pada kejadian penyakit

kardiovaskuler. Gen pengkode protein adiponektin adalah ADIPOQ, berlokasi di

kromosom 3q27. Gen ADIPOQ bervariasi pada posisi 11377 (11377 C>G) dan

diidentifikasi sebagai lokus yang rentan untuk sindrom metabolisme, DM dan

penyakit kardiovaskuler. Variasi tipe ADIPOQ telah diteliti berhubungan dengan

risiko kardiovaskular. Pada penelitian di Malaysia oleh Lau CH, et al. bahwa

SNP+1212A>G (rs6773957) berhubungan bermakna dengan penurunan kadar

adiponektin. Peningkatan kadar protein yang berhubungan dengan DM tipe 2

adalah Leptin dan Interleukin-6.

Lau CH, et al. (2009) juga melaporkan bahwa gen resistin (RETN) pada

+299(G>A) (rs3745367) berhubungan bermakna dengan hiperresistinemia.

Resistin menekan diferensiasi adiposit yang diduga berakibat penumpukan

ektopik asam lemak dan lipotoksisitas terhadap jaringan non-adiposit. Pada Studi

potong lintang di Singapura oleh Tan JT, et al. (2009) sebanyak 3734 responden

usia 18-69 tahun (2520 ras Tiongkok, 693 ras Melayu dan 521 ras India),

polimorfisme gen KCNQ1 (Rs 2237892, 2237892 dan 2283228) bermakna pada

ras Melayu. Hal ini sejalan dengan penelitian Genome Wide Association Study

(GWAS) oleh Saif-Ali R, et al. (2011) di Malaysia yang menggunakan 411

responden berusia 30-70 tahun (234 responden dengan DM dan 177 responden

normal).

6

Studi kasus kontrol menggunakan 620 sampel kontrol (254 ras Melayu, 204

ras Tiongkok, 162 ras India) dan 1107 responden DM yang mempunyai hasil

negatif untuk antibodi terhadap glutamic acid decarboxylase, terdapat asosiasi

kuat pada rs7651090, rs16860234 dan rs6777038 gen IGF2BP2 pada ras

Tiongkok. Gen IGF2BP2 diduga mengatur fungsi sel beta pankreas. Sementara

pada ras Melayu hanya rs16860234 yang bermakna (Saleem SD, 2012).

Penelitian polimorfisme gen yang berhubungan dengan DM pernah

dilakukan oleh kolaborasi peneliti dari Eijkman, Jakarta dan Universitas Udayana,

Bali di Bali. Penentuan Bali sebagai pilot project dengan alasan masyarakat Bali

cenderung tertutup, kebanyakan orang menikah dengan sesama suku Bali. Pada

pemeriksaan polimorfisme pada gen Uncoupling protein 2 (UCP2), tim peneliti

melaporkan bahwa polimorfisme gen UCP2 Ala55Val (C544T) berhubungan

dengan DM di Legian, Kuta, Bali (n=287) (Saraswati MR, 2012). Subjek yang

berada pada perkotaan dan memiliki polimorfisme pada gen UCP2G(âˆ‟866)A

and Ala55Val juga mempunyai body mass index (BMI) yang lebih tinggi

dibandingkan dengan subjek yang memiliki genotip yang sama namun berada

pada pedesA/An. Penelitian ini menunjukkan adanya kerentanan seseorang

terhadap kejadian DM dan obesitas jika individu tersebut melakukan gaya hidup

perkotaan (Oktavianthi, 2012). Peneliti mengakui penelitian ini belum sempurna

dan baru merupakan pilot project karena baru terbatas pada Bali dan dengan

jumlah sampel yang masih sedikit 603 responden (278 urban dan 325 rural).

Berbagai penelitian melaporkan bahwa variasi genetik ini berhubungan

dengan variasi etnik dan jenis kelamin. Skrining dilakukan berdasarkan penelitian

sebelumnya yang menyatakan bahwa variasi genetik berhubungan dengan variasi

etnik dan jenis kelamin (Gainer JV, et.al. 2001 & Palmer BR, et.al. 2003), maka

untuk populasi masyarakat Indonesia perlu dilakukan skrining terlebih dahulu.

Dengan mengetahui variasi genetik pada populasi di Indonesia, efektifitas kontrol

faktor-faktor risiko DM diharapkan dapat diprediksi. Data ini akan menjadi

masukan yang bermanfaat dalam merancang strategi yang tepat pada program

pencegahan dan pengendalian PTM, khususnya DM. Dengan demikian biaya

pengobatan dan kontrol faktor-faktor risiko DM dapat ditangani dengan lebih baik,

sehingga angka morbiditas dan mortalitasnya dapat ditekan.

7

Penelitian ini ingin diketahui bagaimana marker prediktor DM pada

populasi studi kohor FR-PTM.Penelitian ini bertujuan mencari besarnya

hubungan antara faktor penyakit DMyang tidak dapat diubah yaitu faktor genetik,

dalam hal ini adalah polimorfisme gen yang berkaitan dengan kejadian DM,

dengan kejadian penyakit DM. Penelitian ini juga bertujuan mendapatkan besaran

asosiasi polimorfisme gen-gen tersebut terhadap kejadian penyakit DM. Untuk itu,

karena DM merupakan penyakit yang sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan,

seperti gaya hidup berupa aktifitas fisik, pola makan, riwayat merokok dan minum

alkohol, maka data-data tersebut diperlukan untuk dapat mengukur besaran

asosiasi pengaruh gen terhadap kejadian DM. Munculnya penyakit atau faktor

risiko lain yang mempunyai pencetus yang sama juga sangat berpengaruh

terhadap prediksi kejadian DM, antara lain obesitas, terutama obesitas sentral,

hipertensi dan dislipidemia.

Studi kohor FR-PTM merupakan studi kohor prospektif untuk melihat

faktor-faktor risiko PTM (stroke, PJK, DM, hipertensi) berbasis masyarakat yang

dilakukan di Kota Bogor Tengah dan telah dimulai sejak tahun 2011 dengan

responden yang akan terus diikuti sampai dengan tahun 2019. Data yang

dikumpulkan berupa demografi, riwayat penyakit, faktor risiko perilaku,

kebiasaan makan, riwayat penyakit keluarga, pemeriksaan antropometri, tekanan

darah, elektrokardiografi, saraf, rontgen torak dan laboratorium (gula darah,

kolesterol total, LDL, HDL dan trigliserida) setiap dua tahun sekali. Jumlah

responden sebanyak sekitar 5000 responden dibagi menjadi 2 tahap (baseline data

tahap 1 dimulai tahun 2011 sebanyak 2100 responden dan tahap 2 tahun 2012

sebanyak 2900 responden). Sehingga penelitian ini dibagi dalam 2 tahap

pengambilan sampel, yaitu tahap 1 tahun 2015 yang dihadiri 1173 responden dan

tahap 2 pada tahun 2016 dihadiri oleh 2172 responden.

Hasil uji multinomial regresi logistik pada penelitian Variasi Marker

Genetik Prediktor DM tahun 2015 menunjukkan bahwa individu dengan alel

homozigot mutan A/A untuk SNP rs972283 pada gen KLF14 dan rs3745367

dalam gen RETN (resistin), serta genotipe G/G pada rs5945326 gen

DUSP9/MKP4 memiliki kecenderungan untuk menjadi DM sekitar 2 kali lipat

dibandingkan dengan individu alel homozigot asal.

8

BAB III

METODE PENELITIAN

III.1. Kerangka Teori

Keterangan: Karakteristik individu dan gaya hidup akan memicu faktor risiko

penyakit. Penelitian akan dilakukan dengan memeriksa gen-gen

pemicu dan yang berhubungan dengan DM.

III. 2. Kerangka Konsep

Keterangan: Individu normal dan prediabetes diantaranya mempunyai genetik

yang rentan terhadap DM, menjadi faktor resiko genetik. Faktor

risiko lain seperti umur, jenis kelamin, merokok, aktifitas fisik,

asupan makanan, sosial ekonomi, obesitas, hipertensi dan

dislipidemia, tidak dianalisis dalam penelitian ini karena sudah

diteliti oleh studi kohor PTM. Namun data penelitian ini akan

dihubungkan dengan data studi kohor PTM terutama yang terkait

dengan DM dan data genomik dan marker protein ini akan

Gen KCNQ1, IGF2BP2,

DUSP9/MKP4 Gangguan sekresi insulin

Gen UCP2, KLF14

Karakteristik individu Lifestyle

Jenis kelamin, usia,

TB/BB, Pekerjaan, Genetik Kurang olah raga, pola makan

tinggi kalori dan lemak

Gen RETN, SLC30A8

Obesitas DM

Resistensi insulin

Hipoadiponektinemia

Gen ADIPOQ

Gangguan metabolisme pada

jaringan adiposa

Gen Leptin Pengaturan rasa lapar

Pre-DM

Studi Kohor PTM:

- Identifikasi PTM dan faktor risiko PTM

- Data demografi, riwayat penyakit, pemeriksaan fisik,

EKG, rontgen & laboratorium

Studi Marker Genetik Prediktor

DM PBTDK:

- Pemeriksaan gen petanda DM

- Pemeriksaan protein penanda DM

Normal

DM

Output:

data faktor

risiko PTM

9

melengkapi dan memperkaya data studi kohor faktor risiko PTM

Badan Litbangkes.

III.3 Desain dan Jenis Penelitian

Penelitian ini dirancang menggunakan desain potong lintang non

eksperimental pada responden studi kohor PTM. Penelitian berbasis laboratorium

biologi molekular.

III.4 Tempat dan Waktu

Pemeriksaan menggunakan bahan biologis tersimpan (BBT) di

Laboratorium Penelitian Penyakit Infeksi (PPI) P3BTDK, Jakarta yang

merupakan sampel Studi Kohor FR-PTM.

III.5 Populasi dan Sampel

III.5.1. Populasi

Populasi penelitian ini adalah semua responden studi kohor faktor risiko

PTM (laki-laki dan perempuan umur 25 – 65 tahun).

Penelitian studi kohor PTM telah berjalan sejak tahun 2011 dengan

pengambilan sampel secara 2 tahap. Tahap pertama 2100 responden (direkrut

tahun 2011, kemudian diikuti kesehatannya dan dilakukan pemeriksaan

kesehatan pada tahun 2013 dan 2015). Tahap kedua 2900 responden (direkrut

tahun 2012, kemudian diikuti kesehatannya dan dilakukan pemeriksaan

kesehatan pada tahun 2014 dan 2016). Namun karena ada beberapa responden

drop out karena pindah domisili atau menolak dilakukan pemeriksaan

kesehatan), maka jumlah responden studi kohor PTM yang dilakukan

pemeriksaan kesehatan pada tahun 2015 berkurang menjadi 1173 responden

dan 2016 sebanyak 2172 responden.

Pemeriksaan marker genetik pada penelitian studi Variasi marker genetik

prediktor DM (tahap I) diambil dari responden studi kohor PTM tahap ke-1

tahun 2015 dan Studi Marker Protein Prediktor DM Pada Individu Dengan Pre-

Diabetes diambil dari responden studi kohor PTM tahap ke-2 tahun 2016.

10

III.5.2 Sampel

Responden studi kohor PTM yang menderita diabetes atau pre diabetes

dan kontrol normal (responden dengan kadar gula darah normal) yang dipilih

secara acak sesuai presentase jumlah diabetes dan pre diabetes.

III.5.3. Kriteria Inklusi dan Eksklusi

III.5.3.1. Kriteria Inklusi

Sampel responden studi kohor PTM yang tersimpan.

III.5.3.2. Kriteria Eksklusi

- Sampel rusak/ tidak mencukupi kadar/volumenya

- Tidak tersedia data kesmas (data gula darah/ riwayat DM)

III.5.4 Estimasi Besar Sampel, Cara Pemilihan dan Penarikan Sampel

Pemeriksaan genotyping pada seluruh sampel DM dan pre DM, serta

sebagian sampel normal sebagai kontrol, dengan jumlah seimbang. Karena

berdasarkan pemeriksaan gula darah didapatkan presentase DM sekitar 10%

dari jumlah populasi dan pre DM sekitar 30%, maka diambil kontrol normal

sebanyak 40% dari populasi. Sehingga dilakukan pemeriksaan genotyping pada

seluruh sampel DM dan pre DM, serta 40% dari sampel normal yang dipilih

secara acak. Total sebanyak 1475 sampel untuk pemeriksaan polimorfisme

pada gen UCP2 rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8 rs13266634,

Resistin (RETN) rs3745367, IGF2BP2 rs16860234 dan KCNQ1 rs2237892.

Pemeriksaan protein resistin, insulin, c-peptide dan adiponektin

dilakukan pada sebagian sampel DM, pre DM dan normal, diambil secara acak

dengan total sampel 744 plasma.

III.5.5 Variabel

Variabel bebas/independen: individu normal, pre diabetes dan DM

Variable terikat/dependen:

- Marker genetik, yaitu: adanya SNP pada gen UCP2 rs660339,

DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin (RETN)

11

rs3745367, IGF2BP2 rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ

rs6773957 dan KLF14 rs972283.

- Marker protein, yaitu: kadar protein resistin, insulin, c-peptide dan

adiponektin

III.5.6 Definisi Operasional

Definisi operasional yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

Diabetes

melitus

Kadar glukosa setelah 2 jam beban glukosa >200 mg/dL atau

pernah diagnosis DM

Prediabetes Yang tergolong TGT (Kadar glukosa plasma 2 jam setelah beban

antara 140 – 199 mg/dL) dan GDPT (Kadar glukosa plasma

puasa antara 100 – 125 mg/dL dan 2 jam beban glukosa

12

pemeriksaan kadar protein menggunakan kit elisa dari Sygma, pembacaan

menggunakan elisa reader dan berbagai bahan habis pakai.

III.7.2. Prosedur kerja

III.7.2.1. Pengambilan sampel

Sampel berupa Bahan Biologi Tersimpan (BBT) dari sampel studi

kohor FR-PTM yang telah diambil tahun 2016 dan diolah menjadi

buffycoat, DNA dan plasma, serta telah disimpan di biorepository

laboratorium penelitian penyakit infeksi Badan Litbangkes.

III. 7.2.2. Pengukuran kadar dan kemurnian DNA

Sampel DNA didapatkan dari biorepository Puslitbang Biomedis dan

Teknologi Dasar Kesehatan. Masing-masing sampel DNA yang akan

diperiksa, diambil 2µL untuk diukur konsentrasi dan kemurniannya dengan

alat kalkulator DNA NanoVue spectrofotometer (GE, USA). Tahapan

pemeriksaan ini dilakukan sebelum pemeriksaan polimorfisme gen. Tujuan

pemeriksaan untuk melakukan pengecekan terhadap kemurnian dan

konsentrasi DNA. Tahapan ini penting untuk melihat kemurnian DNA

terhadap kontaminan hasil ekstraksi. Selain itu, untuk mendapatkan hasil

konsentrasi dari DNA untuk menentukan pengenceran terhadap DNA untuk

pemeriksaan polimorfisme gen.

III.7.2.3. Persiapan Sampel

Sampel yang akan diperiksa harus diencerkan dulu konsentrasi

DNAnya sehingga dalam kisaran 1-10 ng/µl. Pengenceran dilakukan dengan

menambahkan nuclease free water dan menyamakan konsentrasi menjadi 5

ng/µl. Sampel yang memiliki konsentrasi DNA rendah (

13

III.7.2.4. Pemeriksaan Variasi Genetik (Polimorfisme)

Sebelum dilakukan pemeriksaan sampel dilakukan optimasi sampel

terlebih dahulu dengan mengambil beberapa sampel untuk diperiksa. Hal ini

dilakukan untuk menghindari hasil pemeriksaan yang buruk dan tidak

terbaca.

Pemeriksaan polimorfisme gen-gen yang dituju dilakukan dengan

menggunakan metode SNP TaqMan genotyping assay (Applied Biosystem,

USA). Dalam assay tersebut DNA responden akan direaksikan dengan

sepasang primer yang meliputi titik dimana nukleotida bermutasi, sepanjang

sekitar 100 basa. Di dalam reaksi SNP genotyping tersebut juga terkandung

dua (2) tipe probe, dimana keduanya mempunyai ikatan reporter

fluorochrome yang berbeda dan akan terikat pada target yang spesifik untuk

masing-masing probe; satu probe akan terikat pada alel asli (alel wild type)

dan probe lainnya pada alel yang telah bermutasi (alel mutan). Reaksi SNP

genotyping akan berjalan dalam mesin real time PCR, dengan menggunakan

enzim DNA polymerase dan suplai dNTPs. Hasil reaksi tersebut akan

berupa grafik yang akan menunjukkan type gen berdasarkan titik mutasi

nukleotida yang telah ditentukan untuk masing-masing gen. Sampel yang

digunakan adalah DNA hasil ekstraksi dengan konsentrasi 5 ng/ul sehingga

digunakan 10ng tiap reaksi dengan paduan master mix dan SNP genotyping

assay sesuai instruksi manual dari produk.

Analisa hasil reaksi SNP genotyping assay akan dilakukan dengan

memanfaatkan perangkat lunak dalam mesin real time PCR (Applied

Biosystem, USA) dan Taqman Genotyper.

Persiapan bahan

Master mix

Taqman genotyping assay master mix 12,5µl

Taqman genotyping SNP 1,25µl

RT PCR grade water 9,25µl

Sampel

Sampel yang telah diencerkan dengan nuclease free water 2 µl

Total volume persampel 25µl

14

Prosedur pemeriksaan :

Masukkan master mix terlebih dahulu 24,8µl ke dalam mikroplate 96

well 0,1 ml, kemudian sampel 0,2µl

Hindari terbentuknya bubble saat memasukkan master mix maupun

sampel

Atur alat sesuai ketentuan dalam kit

Baca hasil

Gen-gen yang akan diperiksa adalah sebagai berikut:

No. Gen Fungsi

1. ADIPOQ Mengatur produksi hormone adiponektin yang menginisiasi

pembakaran lemak dan proses penggunaan glukosa yang

berperan pada penurunan lemak dan peningkatan sensitivitas

insulin. Diperkirakan berkaitan dengan resistensi insulin dan

disfungsi endotel

SNP+1212A>G (rs6773957).

2. KLF14 Master regulator ekspresi gen pada jaringan adipose

rs972283

3. Uncoupling

protein 2

(UCP2) gene

Peran UCP berhubungan degan metabolisme energi dan

obesitas. UCP1 terekspresi di jaringan lemak coklat, UCP2 di

sistem limfe dan pankreas, berkaitan dgn pengaturan sekresi

insulin. UCP3 di otot rangka, berkaitan dgn metabolisme lipid.

rs660339

4. DUSP9/MKP4 Dual specificity Phosphatase atau mitogen-activatedprotein

kinase phosphatase-4, berfungsi sebagai negative regulator pada

pathway insulin-stimulated

rs5945326

5. SLC30A8 Solute carrier family 30 (zinc transporter) member 8,

merupakan gen yang mengkode transporter zink yang

berhubungan dengan sekresi insulin pada manusia

rs13266634

6. Resistin

(RETN)

Mengkode hormon (adipokin) resistin yang dihasilkan jaringan

lemak putih. Resistin menekan diferensiasi adiposit yang diduga

15

berakibat penumpukan ektopik asam lemak dan lipotoksisitas

terhadap jaringan non-adiposit.

SNP+299(G>A) (rs3745367).

7. IGF2BP2 gen ini diduga mengatur fungsi sel beta (IGF2BP2 and obesity

interaction analysis for type 2 diabetes mellitus in Chinese Han

population, Wu HH et al. 2014).

Ras Melayu: rs16860234

8. KCNQ1. Mengkode subunit α kanal kalium, yang terutama terekspresi di

jantung, tetapi juga terekspresi di organ lain seperti pankreas.

Melayu: rs2283228 dan rs2237892 (C>T)

III.7.2.5. Pemeriksaan Protein

Pemeriksaan protein dilakukan pada plasma responden dengan pre

diabetes dengan normal dan DM sebagai kontrol. Pemeriksaan protein

dilakukan dengan metode elisa menggunakan kit komersial dari Sigma

Aldrich berdasarkan petunjuk dari produsen dan hasil optimasi. Protein

yang diperiksa: Adiponektin, resistin, c-peptide, insulin.

Petunjuk penyimpanan, isi komponen kit dan pengenceran buffer

sama pada semua protein. Berikut ini contoh metode pengenceran buffer

yang diambil dari kit pemeriksaan protein insulin.

Keterangan produk:

Kit ELISA Insulin manusia untuk serum, plasma dan supernatan

sel kultur. Nomor Produk : RAB 0327. Lot No : 0313E0259.

Penyimpanan :

Kit disimpan pada freezer -20ºC. Masa aktif 1 tahun. Hindarkan

dari pengulangan thawing. Standar harus di simpan pada suhu -20ºC atau

70ºC (disarankan -70ºC ). Microplate strips atau reagen yang sudah

terbuka bisa disimpan sampai dengan 1 bulan pada suhu 2-8ºC. Taruh

kembali wells yang tidak terpakai pada kemasan yang bersih dan kering

dan tutup rekat sepanjang tepinya.

16

Komponen :

1. Human Insulin Antibody-coated ELISA Plate (Item A) – RAB0327A-

EA; 96wells (12 stripsx8 wells) coated with anti-Human Insulin.

2. 20x Wash Buffer (Item B) – RAB WASH4

3. Lyophilized Human Insulin Protein Standar (Item C) – RAB0327C-

1VL

4. Biotinylated Human Insulin DeteC/Tion Antibody (Item F) –

RAB0327D-1VL

5. HRP-Streptavidin (Item G) – RABHRP5

6. ELISA Colorimetric TMB Reagent (HRP Substrate, Item H) –

RABTMB3

7. ELISA Stop Solution (Item l) – RABSTOP3

8. ELISA 1x Assay/Sample Diluent Buffer A (Item D1) – RABELADA-

30ML

9. ELISA 5x Assay/Sample Diluent Buffer B (Item E1) – RABELADB-

15ML

Susun peta sampel di mikroplate yang akan digunakan untuk reaksi.

Sampel dan reagen yang akan digunakan sebaiknya ditempatkan pada

suhu ruang (18-250C). Letakkan reagen pada es selama persiapan reagen.

Biarkan plate pada suhu ruang sebelum membuka penutupnya (Persiapan,

langkah 1).

Pengenceran buffer untuk sampel/cairan assay (Persiapan, langkah2):

Assay/sampe buffer diluent B (item E1) harus diencerkan 5 kali dengan

air distillasi sebelum digunakan.

Pengenceran buffer untuk sampel / cairan assay (Persiapan, langkah 3):

Pengenceran buffer sampel A (item D1) digunakan untuk

pengenceran dari serum atau sampel plasma. Persiapan untuk dilusi

sampel. Sampel yang akan diuji memiliki konsentrasi yang berbeda-

beda. Saran pengenceran untuk serum/plasma normal adalah 2 – 10 kali

(Insulin), 20-200 kali (Resistin), dan 20.000 kali (Adiponektin). Untuk

pemeriksaan protein C-peptide, encerkan sampel dengan buffer sampel A

dan biotinylated C-peptidesebanyak 4 kali pengenceran dengan

17

menambahkan 2,5 µL biotinylated C-peptide yang telah diencerkan 10

kali, 185 µL buffer A dan 62,5 µL sampel.

Keterangan : level protein bisa bervariasi antara sampel yang berbeda.

Faktor pengenceran optimal dari tiap sampel harus

ditentukan oleh peneliti.

Hasil optimasi pengenceran sampel:

- Protein Insulin: Plasma tidak diencerkan.

- Protein Adiponektin: Pengenceran plasma dilakukan sebanyak 20000

kali. Urutan langkah yang dilakukan adalah: tambahkan 2 µl plasma

ke dalam tube dengan 398 µl larutan Human Acrp 30 antibody coated

elisa plate untuk menyiapkan pengenceran sampel sebanyak 200 kali.

Campur perlahan dan ambil 2 µl dari sampel yang sudah diencerkan

sebanyak 200 kali tersebut. Masukkan juga 198 µl larutan Human

Acrp 30 antibody coated elisa plate untuk mengencerkan sampel

menjadi 20000 kali.

- Protein Resistin: Pengenceran plasma dilakukan sebanyak 200 kali.

Urutan langkah yang dilakukan adalah: tambahkan 1 µl plasma ke

dalam tube antibody coated elisa plate dengan 198 µl larutan buffer A

untuk menyiapkan pengenceran sampel sebanyak 200 kali.

- Protein C-peptide: Plasma tidak diencerkan. Sebanyak 62,5 µL sampel

plasma ditambahkan 2,5 µL biotinylated C-peptide yang telah

diencerkan 10 kali dan 185 µL Buffer A.

Pengenceran masing- masing reagen yang akan digunakan, yaitu

Wash buffer,Enzyme conjugate, Biotnylated DeteC/Tion Antibody, dan

HRP- Streptavidin concentrate.

Penyiapan bahan standar (Persiapan, langkah 4):

Lakukan pemutaran (sentrifugasi) sebanyak satu buah vial item C,

tambahkan 400µl cairan assay A (untuk sampel serum/plasma) atau 1x

cairan assay B (untuk supernatan sel kultur) ke dalam vial item C untuk

membuat 1400 µlU/ml standar. Larutkan bubuk seluruhnya dan lakukan

pencampuran secara lembut. Tambahkan 150 µl standar insulin (1400

µlU/ml) dari vial item C, ke dalam tabung dengan 550 µl cairan assay A

18

atau 1x cairan assay B untuk mempersiapkan larutan standar. Pipet

sebanyak 300 µl cairan assay A atau 1x cairan assay B ke dalam tiap

tabung. Gunakan larutan standar sebanyak 300 µl untuk memproduksi

seri pengenceran/larutan (seperti pada gambar. Campur setiap tube

keseluruhan sebelum berpindah. Cairan assay A atau 1x cairan assay B

bertindak sebagai standar nol (0 µlU/ml).

Persiapan deteksi antibody Biotinylates (Persiapan, langkah 5) :

Lakukan pemutaran vial deteksi antibodi (ITEMF) sebelum

digunakan. Tambahkan 100 µl fari 1x cairan buffer B (Item E1) ke dalam

vial untu persiapan cairan konsentrat deteksi antibodi. Pipet dengan

menarik dan lepas untuk mencampur secara lembut (konsentrat dapat di

simpan pada suhu 4ºC selama 5 hari). Konsentrat deteksi antibodi harus

diencerkan 80 kali dengan 1x cairan Buffer B (Item E1) dan digunakan

pada prosedur, langkah 4.

Pengenceran HRP-Streptavidin konsentrat (persiapan, langkah 6) :

Lakukan pemutaran vial konsentrat HRP-Streptavidin dan campur

secara lembut menggunakan pipet sebelum digunakan, karena lapisan

endapan bisa terbentuk saat penyimpanan. Konsentrat HRP-Streptavidin

harus diencerkan 500 kali dengan 1x cairan buffer B (item E1).

Sebagai contoh : lakukan pemutaran vial (Item G) dan campur

dengan pipet secara lembut. Tambahkan 30 µl konsentrat HRP-

Streptavidin ke dalam tabung dengan 15 ml 1x cairan Assay B untuk

mempersiapkan pengenceran sebanyak 500 kali larutan HRP-

19

Streptavidin (jangan menyimpan larutan untuk digunakan keseokan

harinya). Campurlah dengan merata.

Prosedur Kerja:

1. Susun peta sampel pada masing- masing mikroplate

2. Pipet sebanyak 25 μL dari insulin standar, kontrol, dan sera dalam

masing- masing well

3. Tambahkan 100 μL dari “ Working Insulin Enzyme Conjugate” 1X

pada masing- masing well

4. Di canpurkan selama 10 detik

5. Inkubasi selama 60 menit pada suhu ruang (18-260C).

6. Buang cairan dari semua well dan cuci sebanyak 3 kali dengan

300μL dengan menggunakan 1x Wash Buffer.

7. Tambahkan 100 μL TMB Substrat pada masing- masing well

8. Inkubasi selama 15 Menit pada suhu ruang

9. Tambahkan 50 μL “Stop Solution” pada masing- masing well dan

dihomogenkan

10. Baca Absorban di Elisa Reader pada panjang gelombang 450 nm.

Typical Data

Sensitifitas :

Minimun dosis untuk deteksi human insulin yang ditentukan adalah

4 µlU/ml.

Dosis minimum yang dapat di deteksi didefinisikan sebagai

konsentrasi analit yang menghasilkan absorbansi yaitu 2 standar deviasi

yang lebih tinggi dari pada blanko (cairan buffer).

20

Recovery (perbaikan) :

Perbaikan ditentukan dengan mengacu pada level dari human

insulin yang bervariasi pada type sampel seperti pada daftar berikut.

Rata-rata perbaikan sebagai berikut :

Linearitas

Spesifisitas :

Kit ELISA ini tidak menunjukan reaktifitas silang dengan cytokine

yang sudah diuji yaitu : Human BDNF, BLC, ENA-78, IL-1 alpha, IL-1

beta, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12p70, IL-

12p40,IL13,IL-15, I-309, IP-10, G-CSF, GM-CSF, IFN-gamma, Leptin

(OB), MCP-1, MCP-2, MCP-3, MDC, MIP-1 alpha, MIP-1 beta, MIP-1

delta, PARC, PDGF, RANTES, SCF, TARC, TGF-beta, TIMP-1, TNF-

alpha, TNF-beta, TPO, VEGF.

III.8. Manajemen dan Analisis Data

Data identitas, demografi dan riwayat penyakit serta hasil pemeriksaan

laboratorium akan didapatkan dari studi kohor PTM. Analisa data akan dilakukan

dengan mengunakan perangkat lunak SPSS dan Taqman Genotyper. Analisis

Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan odds ratio menggunakan software

online dari www.oege.org. Tingkat kemaknaan () ditentukan pada nilai

probabilitas (p) kurang dari 5%.

http://www.oege.org/

21

III.9. Pertimbangan Etik Penelitian

Data sosiodemografi dan spesimen darah diperoleh dari data dan spesimen

responden studi Kohor PTM, Badan Litbangkes. Dalam studi Kohor PTM,

responden telah dimintakan persetujuan setelah penjelasan dan di dalamnya telah

menyebutkan kesedeiaan diambil darah dan dilakukan pemeriksaan faktor risiko

genomik PTM, termasuk DM.

Persetujuan etik didapatkan dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan Badan

Litbangkes No. LB.02.01/2/KE.235/2017tanggal 19 Juni 2017.

III.10. Pertimbangan Izin Penelitian

Tidak memerlukan izin penelitian khusus karena merupakan penelitian

laboratorium dan dikerjakan di laboratorium PPI, P3BTDK dengan sampel studi

Kohor PTM tahun 2016.

22

BAB IV

HASIL PENELITIAN

Spesimen darah yang diterima dari Studi kohort faktor risiko PTM sebanyak

2173 dan diproses menjadi plasma dan buffycoat. Spesimen buffycoat yang

terkumpul dilakukan ekstraksi DNA untuk dilakukan tahap pemeriksaan

selanjutnya. DNA dan buffycoat disimpan di repository Puslitbang Biomedis dan

Teknologi Dasar Kesehatan. Penelitian ini dilakukan terhadap spesimen tersimpan

dari responden yang menderita DM, pre DM dan sampel normal sebagai kontrol.

Pemeriksaan genotyping dilakukan pada seluruh responden dengan DM, pre

DM dan sebagian responden dengan gula darah normal yang dipilih secara acak,

sehingga berjumlah 1475 sampel. Namun tidak seluruh sampel menampilkan hasil

genotyping, sehingga jumlah data yang dianalisis pada tiap gen berbeda-beda.

Jumlah sampel DM sebanyak 199, pre DM 633 dan normal sebanyak 643 sampel.

Pemeriksaan protein resistin, insulin, c-peptide dan adiponektin dilakukan pada

sampel DM, pre DM dan kontrol normal dengan jumlah sampel DM sebanyak 88,

pre DM 280 dan normal sebanyak 376 sampel, total sampel 744 plasma.

Hasil Ekstraksi DNA

Nilai rerata konsentrasi DNA hasil ekstraksi adalah 213 ng/ul dan

kemurniannya 1,85. Hasil konsentrasi ini dijadikan rujukan untuk melakukan

pengenceran hingga 10 ng/ul untuk melakukan pemeriksaan SNP genotyping.

Nilai konsentrasi dan kemurnian tertuang dalam Lampiran 1.

Polimorfisme Gen UCP2 rs660339

Gen UCP2, yaitu salah satu gen yang berperan dalam metabolisme energi

dan terjadinya obesitas. UCP2 terekspresi di sistem limfe dan pankreas, berkaitan

dengan pengaturan sekresi insulin. Dijumpai polimorfisme G>A pada rs660339.

23

Gambar 1. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2 rs660339 pada responden DM,

Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor tahun 2016.

Gambar 1 menyajikan distribusi alel homozygot wildtype dan mutan serta

heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada kasus DM. Proporsi genotipe Gen

UCP2 dengan polimorfisme G>A pada responden DM terbesar adalah A/G

45,50%, dikuti G/G 36%, lalu A/A (mutan) 18,5%. Frequensi alel A adalah 41,3%

dan G 58,7%. Tidak ada perbedaan bermakna antara ketiga genotipe dengan p

value 0,413.

Gambar 2. Distribusi alel a/a, a/g dan g/g pada gen ucp2 rs660339 pada responden normal,

Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor, 2016.

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

24

Gambar 2 menyajikan distribusi alel homozygot wildtype dan mutan serta

heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada populasi normal. Terlihat proporsi

genotipe A/A paling sedikit, sebanyak 19%, G/G33,5% dan heterozygot A/G

paling banyak pada kelompok normal, yaitu sebesar 47,5%. Frekuensi alel A

42,8% dan alel G 57,2%. Tidak ada perbedaan bermakna antara ketiga genotipe

dengan p value sebesar 0,449.

Gambar 3. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2 rs660339 pada responden

dengan pre DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor, 2016.

Gambar 3 menyajikan distribusi alel homozygot wild dan mutan serta

heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada populasi pre DM. Proporsi homozygot

A/A paling sedikit sebesar 14,3%, heterozygot A/G 38,8%, sedangkan homozygot

G/G terbesar, yaitu 46,9%. Frekuensi alel A 33,7% dan G 66,3%. Nilai p value

0,008, menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara ketiga kelompok alel

tersebut pada kelompok pre DM.

Polimorfisme Gen KCNQ1 rs2237892

Gen KCNQ1 yang diduga mengatur fungsi sel beta pankreas mempengaruhi

produksi insulin. Dijumpai polimorfisme C>T pada rs2237892. Frekuensi

polimorfisme pada gen KCNQ1 rs2237892 pada kelompok DM disajikan dalam

Gambar 4.

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

25

Gambar 4. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1 rs2237892 pada responden

DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Tampak dalam Gambar 4 frekuensi homozygot T/T paling sedikit, yaitu

10,1%, diikuti heterozygot C/T 32,3% dan yang paling banyak adalah homozygot

C/C (wildtype) pada kelompok DM, lebih dari separuh populasi yaitu 57,6%.

Frekuensi alel C 73,7% dan T 26,3%. Dengan nilai p sebesar 0,036 menunjukkan

terdapat perbedaan bermakna proporsi genotipe pada kelompok DM.


normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Keterangan:

Biru : T/T

Hijau : C/T

Merah : C/C

Keterangan:

Biru : T/T

Hijau : C/T

Merah : C/C

26


heterozygot pada rs2237892 Gen KCNQ1 pada responden normal. Terlihat

proporsi homozygot mutan T/T paling sedikit yaitu 15,6%, diikuti C/C 37,3% dan

heterozygot C/T paling banyak pada kelompok normal, yaitu 47,1%. Frekuensi

alel C 60,8% dan T 39,2%. Nilai p sebesar 0,6 menunjukkan tidak ada perbedaan

bermakna proporsi ketiga genotipe pada kelompok normal.


heterozygot pada rs2237892 Gen KCNQ1 pada reponden dengan pre DM.

Terlihat proporsi homozygot mutan T/T paling sedikit, yaitu 16,3%, diikuti C/T

sebesar 32,4% dan homozygot C/C paling banyak pada kelompok pre DM, yaitu

51,3%. Frekuensi alel C 67,5% dan T 32,5%. Nilai p pada kelompok ini sebesar

0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara ketiga genotipe.


dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Polimorfisme Gen RETN rs3745367

Gen RETN, yaitu gen yang mengkode resistin, suatu sitokin atau faktor

sekretorik yang spesifik dihasilkan jaringan adiposa. Resistin diduga berperan

pada timbulnya obesitas dan diabetes melitus tipe 2. Dijumpai polimorfisme G>A

pada rs3745367. Frekuensi polimorfisme gen RETN rs3745367 pada penderita

DM disajikan dalam Gambar 7.

Keterangan:

Biru : T/T

Hijau : C/T

Merah : C/C

27

Gambar 7. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN rs3745367 pada responden

DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Apabila dilihat proporsinya pada penderita DM, maka terlihat frekuensi

terbesar penderita DM pada studi ini adalah mempunyai genotipe A/G, yaitu

47,2%, diikuti G/G sebesar 40,7% dan terkecil genotipe A/A, yaitu 12,1%.

Frekuansi alel A pada kelompok DM sebesar 35,7% dan G 64,3%. Nilai p sebesar

0,681. Tidak terdapat perbedaan bermakna antara ketiga genotipe pada kelompok

DM. Sedangkan pada kelompok normal dan pre DM ditampilkan pada Gambar 8

dan 9.


normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

28

Gambar 8 menunjukkan proporsi terbesar pasangan alel pada Gen RETN

rs3745367 pada responden normal adalah heterozygot A/G yaitu sebesar 55%,

sekitar separuh responden normal. Diikuti genotipe homozygot G/G sebesar

38,2% dan A/A terkecil yaitu 6,8%. Terdapat perbedaan bermakna antara ketiga

genotipe pada kelompok normal, dengan nilai p 0,0. Frekuensi alel A pada

kelompok normal sebesar 34,3% dan G sebesar 65,7%. Gambar 9 menyajikan

distribusi alel pada responden pre DM.

Gambar 9 menunjukkan proporsi terbesar pada kelompok pre DM adalah

heterozygot A/G, yaitu hampir separuh dari responden 54,5%. Diikuti G/G

sebesar 35,3% dan A/A 10,3%. Gambaran ini hampir sama dengan kelompok

normal, namun terdapat pola kecenderungan proporsi genotipe A/A semakin kecil

pada kelompok normal dan paling besar pada kelompok DM. Frekuensi alel A

37,5% dan G 62,5%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaanyang bermakna

antara ketiga genotipe pada responden pre DM.


dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Polimorfisme gen DUSP9/MKP4 rs5945326

Salah satu gen yang berperan sebagai regulator negatif pada jalur stimulasi

penghasil insulin, yaitu gen DUSP9/MKP4. Terdapat polimorfisme A>G pada

rs5945326. Frekuensi pasangan alel pada rs5945326 gen DUSP9/MKP4 pada

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

29

kelompok DM disajikan dalam Gambar 10. Sedangkan pada kelompok normal

disajikan dalam Gambar 11.

Gambar 10. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4 rs5945326 pada


Pada Gambar 10 terlihat proporsi terbesar pada kelompok DM adalah

genotipeG/G yaitu 48,7% hampir separuh responden. Diikuti A/A 37% dan A/G

14,3%. Frekuensi alel A 44,2% dan G 55,8%. Nilai p sebesar 0,0 menunjukkan

terdapat perbedaan bermakna antara kelompok genotipe pada responden DM.


responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

30

Gambar 11 menyajikan distribusi alel pada Gen DUSP9/MKP4 rs5945326

pada responden normal. Proporsi terbesar adalah genotipe G/G, yaitu 57,7% lebih

dari separuh responden. Diikuti A/G 33% dan A/A 29%. Nilai p 0,0 menunjukkan

terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini pada responden normal.

Frekuensi alel A 35,6% dan G 64,4%.


responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Gambar 12 menyajikan distribusi genotipe DUSP9/MKP4 rs5945326 pada

responden pre DM. Terlihat proporsi terbesar adalah genotipe G/G, yaitu 53,1%

lebih dari separuh responden. Diikuti A/A 30,2% dan A/G 16,8%. Nilai p 0,0

menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini pada

responden pre DM. Frekuensi alel A 38,5% dan G 61,5%.

Polimorfisme Gen SLC30A8 rs13266634

Gen SLC30A8, yaitu transporter ion seng (Zn) yanng merupakan solute

carrier family 30 member 8, merupakan gen yang mengkode transporter Zn yang

berhubungan dengan sekresi insulin pada manusia. Dijumpai polimorfisme C>T

pada rs13266634. Distribusi genotipe gen SLC30A8 rs13266634 pada kelompok

DM disajikan dalam Gambar 13, sedangkan pada kelompok normal disajikan

dalam Gambar 14. Terlihat genotipe terbesar pada kelompok DM adalah C/T,

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

31

yaitu 40,7%. Diikuti C/C 31,9% dan T/T 27,4%. Nilai p 0,03 menunjukkan

terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini pada responden DM.

Frekuensi alel C 52,2% dan T 47,8%.

Gambar 13. Distribusi genotipeC/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634 pada


Terlihat pada Gambar 14 bahwa genotipe terbesar pada kelompok normal

pada gen SLC30A8 rs13266634 adalah C/C, yaitu 37,6%. Diikuti C/T 33,7% dan

T/T 28,7%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara ketiga

genotipe ini pada responden normal. Frekuensi alel C 54,5% dan T 45,5%.

Gambar 14. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634 pada

responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Keterangan:

Biru : T/T

Hijau : C/T

Merah : C/C

Keterangan:

Biru : T/T

Hijau : C/T

Merah : C/C

32

Gambar 15 menyajikan variasi genotipe SLC30A8 rs13266634 pada

kelompok responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada

kelompok pre DM adalah C/C, yaitu 39,2%. Diikuti C/T 36,8% dan T/T 24,1%.

Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok

genotipe ini pada responden pre DM. Frekuensi alel C 57,5% dan T 42,5%.

Gambar 15. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634 pada


Polimorfisme Gen IGF2BP2 rs16860234

Gen IGF2BP2 yang diduga mengatur fungsi sel beta pankreas

mempengaruhi produksi insulin. Dijumpai polimorfisme A>C pada rs16860234.

Distribusi genotipe pada gen IGF2BP2 rs16860234 disajikan dalam Gambar 16

untuk kelompok DM, Gambar 17 pada kelompok normal dan Gambar 18 pada

kelompok pre DM.

Keterangan:

Biru : T/T

Hijau : C/T

Merah : C/C

33

Gambar 16. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2 rs16860234 pada


Gambar 16 menyajikan variasi gen IGF2BP2 rs16860234 pada kelompok

responden dengan DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok DM

adalah A/C, yaitu 47,6%. Diikuti A/A 41,9% dan C/C 10,5%. Nilai p 0,429

menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok genotipe

ini pada responden DM. Frekuensi alel A 65,7% dan C34,4%.


responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016

Keterangan:

Biru : C/C

Hijau : AC

Merah : A/A

Keterangan:

Biru : C/C

Hijau : AC

Merah : A/A

34

Gambar 17 menyajikan variasi genotipe IGF2BP2 rs16860234pada

kelompok responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok

normal adalah A/C, yaitu 49,7%. Diikuti A/A 44,2% dan C/C 6,1%. Nilai p 0,449

menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok genotipe

ini pada responden DM. Frekuensi alel A 69,0% dan C 31,0%.



Gambar 18 menyajikan variasi genotipe IGF2BP2 rs16860234pada

kelompok responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada

kelompok pre DM adalah A/C, yaitu 38,9%. Diikuti A/A 52,4% dan C/C 8,6%.

Nilai p 0,430 menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada ketiga

kelompok genotipe ini pada responden pre DM. Frekuensi alel A 71,9% dan C

28,1%.

Polimorfisme Gen KLF14 rs972283

Gen KLF14, yaitu salah satu gen yang berperan sebagai master regulator

ekspresi gen pada jaringan adipose pada rs972283 dijumpai polimorfisme A>G.

distribusi genotipe pada gen KLF14 rs972283 di kelompok responden dengan DM

disajikan dalam Gambar 19.

Keterangan:

Biru : C/C

Hijau : AC

Merah : A/A

35

Gambar 19. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden DM, studi kohor faktor

risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Gambar 19 menyajikan variasi genotipe KLF14 rs972283 pada kelompok

responden DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok DM adalah

A/G, yaitu 43,2%, hampir separuh responden DM. Diikuti G/G37,9% dan

A/A18,9%. Nilai p 0,136 menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada

ketiga kelompok genotipe ini pada responden DM. Frekuensi alel A 40,5% dan

G59,5%.

Gambar 20. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden normal, studi kohor faktor

risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

36


responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok normal

adalah A/G, yaitu 53,3%, lebih dari separuh responden normal. Diikuti G/G

35,9% dan A/A 10,6%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna

pada ketiga kelompok genotipe ini pada responden normal. Frekuensi alel A

37,4% dan G 62,6%.


responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok pre

DM adalah G/G, yaitu 65,1%. Diikuti A/G 20,6% dan A/A14,3%. Nilai p 0,0

menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok genotipe ini

pada responden pre DM. Frekuensi alel A 24,6% dan G75,4%.

Gambar 21. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden pre DM, studi kohor

faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Polimorfisme Gen ADIPOQ rs6773957

Gen ADIPOQ, mengatur produksi hormon adiponektin yang menginisiasi

pembakaran lemak dan proses penggunaan glukosa yang berperan pada penurunan

lemak dan peningkatan sensitivitas insulin. Diperkirakan berkaitan dengan

resistensi insulin dan disfungsi endotel. Dijumpai polimorfisme A>G pada

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

37

rs6773957. Distribusi genotipe pada gen ADIPOQ rs6773957 disajikan dalam

Gambar 22 untuk responden DM, Gambar 23 untuk responden normal dan

Gambar 24 untuk responden pre DM.

Gambar 22. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden DM, studi kohor

faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Gambar 22 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957 pada

kelompok responden DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok DM

adalah A/A, yaitu 38,4%. Diikuti A/G 33,8% dan A/A 27,8%. Nilai p 0,0


pada responden DM. Frekuensi alel A 55,3% dan G 44,7%.

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

38

Gambar 23. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden normal, studi

kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Gambar 23 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957 pada

kelompok responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok

normal adalah A/A, yaitu 56,3%, lebih dari separuh responden normal. Diikuti

A/G 25,4% dan G/G18,3%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan

bermakna pada ketiga kelompok genotipe ini pada responden normal. Frekuensi

alel A 69% dan G 31%.

Keterangan:

Biru : G/G

Hijau : A/G

Merah : A/A

39

Gambar 24. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden pre DM, studi

kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.

Gambar 24 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957pada kelompok

responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok pre

DM adalah A/A, yaitu 56%. Diikuti A/G 28,3% dan G/G15,7%. Nilai p 0,0


pada responden pre DM. Frekuensi alel A 70,2% dan G 29,8%.

Analisis Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan Odds Ratio

Analisis Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan odds ratio menggunakan

software online dari www.oege.org. Seluruh gen yang diperiksa pada populasi

Studi Kohor Faktor Risiko PTM tidak dalam kesetimbangan HWE. Dimana nilai

p pada rs660339 dan rs16860234 sebesar 0,001-0,005; pada rs2237892,

rs3745367, rs5945326, rs6773957, rs972283 dan rs13266634 p

40

Tabel 1. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen UCP2

rs660339.

Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds

Ratio95% CI Chi sq p Test

Odds

Ratio95% CI Chi sq p

Het vs

Common

Hz

0,88 0,62-1,25 0,49 >0,05

Het vs

Common

Hz

0,58 0,46-0,74 18,65 0,05

Rare Hz vs

Het0,95 0,71-1,28 0,10 >0,05

Rare Hz vs

Common

Hz

0,91 0,58-1,42 0,19 >0,05

Rare Hz vs

Common

Hz

0,54 0,39-0,75 13,78

41

Tabel 3. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen RETN rs3745367.



Odds


Het vs

Common

Hz

0,80 0,58-1,12 1,64 >0,05

Het vs

Common

Hz

1,07 0,84-1,36 0,29 >0,05

Het vs

Common

Hz

0,99 0,79-1,23 0,01 >0,05

Rare Hz vs

Het2,07 1,21-3,54 7,37 0,005-0,01

Rare Hz vs

Het1,54 1,02-2,32 4,25 0,01-0,05

Rare Hz vs

Het1,67 1,14-2,44 7,13 0,005-0,01

Rare Hz vs

Common

Hz

1,67 0,97-2,87 3,44 >0,05

Rare Hz vs

Common

Hz

1,64 1,07-2,51 5,30 0,01-0,05

Rare Hz vs

Common

Hz

1,65 1,12-2,44 6,40 0,01-0,05

Normal vs DM SNP374 Normal vs PreDM SNP374 Normal vs (PreDM+DM) SNP374

Hasil analisis OR gen DUSP9/MKP4 rs5945326 menunjukkan genotipe

mutan G/G berisiko 1,5x lebih besar daripada genotipe A/A untuk menjadi DM,

dengan p yang bermakna. Hal ini disajikan dalam Tabel 4.


DUSP9/MKP4 rs5945326.



Odds


Het vs

Common

Hz

1,25 0,78-2,01 0,87 >0,05

Het vs

Common

Hz

1,37 0,99-1,9 3,72 >0,05

Het vs

Common

Hz

1,34 0,99-1,81 3,69 >0,05

Rare Hz vs

Het1,21 0,74-1,99 0,58 >0,05

Rare Hz vs

Het0,82 0,58-1,17 1,17 >0,05

Rare Hz vs

Het0,92 0,66-1,27 0,27 >0,05

Rare Hz vs

Common

Hz

1,52 1,08-2,14 5,73 0,01-0,05

Rare Hz vs

Common

Hz

1,13 0,88-1,46 0,91 >0,05

Rare Hz vs

Common

Hz

1,23 0,98-1,55 3,13 >0,05

Normal vs DM SNP594 Normal vs PreDM SNP594 Normal vs (PreDM+DM) SNP594

Hasil analisis OR genotipeSLC30A8 rs13266634terhadap kejadian DM

maupun pre DM menunjukkan tidak ada yang bermakna, dengan nilai p >0,05 dan

95%CI melewati angka 1. Hal ini disajikan dalam Tabel 5.

Tabel 5. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen SLC30A8

rs13266634.



Odds


Het vs

Common

Hz

1,44 0,99-2,08 3,72 >0,05

Het vs

Common

Hz

1,05 0,81-1,37 0,15 >0,05

Het vs

Common

LAPORAN AKHIR PENELITIAN - e-riset.litbang.kemkes.go.id. Laporan-20… · LAPORAN AKHIR PENELITIAN...

Documents

Transcript of LAPORAN AKHIR PENELITIAN - e-riset.litbang.kemkes.go.id. Laporan-20… · LAPORAN AKHIR PENELITIAN...