Kapas-BtKapas biasa

Teknologi DNA Rekombinan

1

Tomat-BtTahan hama

Tomat biasaTidak tahan hama

►Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt tahan terhadap serangan hamakarena menghasilkan toksin yang dapat membunuh hamanya.

►Toksin pada kapas-Bt dan tomat-Bt disandikan oleh gen yang berasaldari bakteri Bacillus thuringiensis (Bt = Bacillus thuringiensis)

Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt = tanaman transgenik

2

Organisme transgenik: organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya.

Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika

Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA Rekombinan : kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan. (Proses: rekombinasi; Hasil: rekombinan)

Teknologi DNA Rekombinan meliputi: - Teknik untuk mengisolasi DNA.- Teknik untuk memotong DNA.- Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.- Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga

DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan.

3

Teknologi DNA Rekombinan berdasarkan mekanisme yang ada pada bakteri:

4

- menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda.

- merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sellainnya. Mekanisme seksual pada bakteri ini tidakbersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak atau zuriat).Lihat konjugasi !

Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan:bakteri mempunyai mekanisme seksual:

DNA dapat masuk ke dalam sel bakteri melalui 3 cara: 1. Konjugasi2. Transformasi3. Transduksi

5

DNA sel resipienDNA sel donor

Pili seks

Sel donor(sel jantan)

Sel resipien(sel betina)

1. Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakterilainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel.

2. Transformasi : pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan disekelilingnya.

DNA asing Kromosom bakteri(DNA bakteri)

6

3. Transduksi : cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan fage.

DNA yang masuk ke dalam sel bakteri：a. dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNA

rekombinan atau kromosom rekombinan.

7

Kromosom bakteri

DNA fage

Sel Bakteri

Kromosom bakteriDNA asingKromosomrekombinan

By Aris Tjb. tidak dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri

Perangkat utama yang digunakan pada pembentukan DNA rekombinan:•plasmid •enzim restriksi•DNA ligase•bakteri

8

Plasmid:

Terdapat pada bakteriDNA selain kromosomBerbentuk sirkulerUmumnya berukuran kecil (lebih kecil dari ukuran kromosom bakteri)Jenis, jumlah, dan ukurannya bervariasi antar sel dan antar jenis bakteri

Enzim Restriksi untuk memotong DNA: Contoh: Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari E.coli. Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A padasekuens GAATTC.

9

Setiap enzim restriksi (endonuklease restriksi) mengenalsekuen pemotongan yang khas dan memotong DNA padasitus pemotongan yang khas.

Nama Enzim Sekuens Pengenal Organisme asalEcoRI G↓AATTC Escherichia coliHindIII A↓AGCTT Haemophilus influenzaeHhaI GCG↓C Haemophilus haemolyticusTaqI T↓CGA Thermus aquaticusBsuRI GG↓CC Bacillus subtilisBalI TGG↓CCA Brevibacterium albidumNotI GC↓GGCCGC Nocardia otidiscaviarumBamHI G↓GATCC Bacillus amyloliquefaciensSmaI CCC↓GGG Serratia marcescens

9

Enzim DNA ligase untuk menyambung DNA

10

12

Menggunakan enzim restriksi dan DNA ligase: Jackson, Simon & Berg (1972) berhasil membuat DNA rekombinan.

Bagaimana menyisipkan, memperbanyak dan mengekspresikan informasi genetik dengan menggunakan

teknologi DNA rekombinan?Isolasi

gen

Bakteri

Bakterirekombinan Perbanyakan sel bakteri

Klon bakteri rekombinan

Copy gen

Protein untuk melarutkan gumpalan darahdalam terapi serangan jantung

Protein untukmembuat salju

Gen untuk mengubah bakteri agar dapat membersihkan limbah

Plasmid

Gen di-sisipkanpadatanaman

13

Sel berisi gen yang diinginkan

Penyisipan genKromosombakteri Gen yang diinginkan

Memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri

Copy protein

Isolasi Plasmid

Plasmid rekombinan

Fungsi Plasmid pada pembentukan DNA rekombinan:a. digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen

atau mengklonkan fragmen DNA ataumengubah sifat bakteri.

b. untuk memperbanyak gen (copy gene) yangtelah disisipkan dengan bantuan

sel bakteri

Bagaimana menyimpan seluruh informasi genetik dari suatu organisme??Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan. Isolasi gen menggunakan pendekatan “shotgun” dapat menghasilkan ribuanpotongan DNA (fragmen DNA)Potongan disimpan untuk sementara waktu di dalam pustaka plasmid ataupustaka fage

15

Fragmen DNA yang lebih besar bergerak lebih lambat, fragmen yang lebih kecilbergerak lebih cepat.

(+)

Bagaimana mendeteksi DNA atau fragmen DNA? Teknik Elektroforesis digunakanuntuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan ukurannya.

16

Sumberlistrik

Campuran molekul DNA dengan berbagai ukuran

Gel

Ｍｏｌｅｋｕｌ berukurbesar

Ｍｏｌｅｋｕｌ berukurkecil

Agrobacterium

Plasmid TiT-DNA

Kromosombakteri

T-DNA

Kromosomtanaman

Bagaimana membuat dan menyisipkan DNA rekombinan pada tanaman: Bakteri Agrobacterium tumefaciens untukmenyisipkan gen ke dalam genom tanaman. Prinsip:

Agrobacterium tumefaciens strain liar (galur alami) memilikiplasmid Ti. Pada plasmid Ti terdapat T-DNA yang mengandunggen penyebab tumor.

Pada waktu menginfeksi tanaman, Agrobacterium tumefaciensmenyisipkan T-DNA ke dalam kromosom sel tanaman sehinggasel-sel tanaman yang terinfeksi membentuk tumor.

17

Agrobacterium

DNA mengandunggen yang diinginkan

Penyisipan gen

Plasmid-Ti

Situs restriksiT-DNA Plasmid-Ti rekombinan

Introduksi kedalam seltumbuhan

T-DNA membawagen baru padakromosom tumbuhan

Regenerasitanaman

Tanaman dengan sifat baru

18

Gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam sel tanaman dengancara menitipkannya (menyisipkan) pada T-DNA. Agrobacterium yang digunakan untuk menginfeksi sel tanamanadalah Agrobacterium yang sudah tidak patogen

ManfaatTeknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat di bidang ilmupengetahuan maupun di bidang terapan.Contoh: A. Bidang Kesehatan:A1. Insulin manusia telah diproduksi secara massal

menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkanuntuk mengobati penyakit diabetis. Merek dagang: HumulinR

A3. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksimenggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobatikelainan pertumbuhan (misal: cebol).

A2. Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksivirus hepatitis. Telah diproduksi secara komersialmenggunakan S.cereviciae dalam skala industri

19

A4. Therapi gen untuk penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit keturunan (genetic disorders) dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan gen (misal: kanker)

20

Klon gen (alel normal)

Penyisipan normalgen pada vektor

DNA rekombinan

Vektor retrovirus

Infeksi sel bone marrow

DNA rekombinan menyisip ke kromosom

Injeksi sel ke pasien

Sel Bone marrow mengandung stem sel yang mampu miningkatkan semua sel-sel darah dan sistem imun

Sel bone marrowdari pasien

B1. Bakteri Ice- (ice minus): bakteri yang telahdirekayasa sehingga tidak membeku pada suhurendah.

Digunakan (disemprotkan) pada tanaman agar tanaman tidak membeku di musim dingin.

Telah diperdagangkan dengan merek FrostbanR.

B. Bidang Pertanian:

B2. mikroba pendegradasi limbah.B3. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat BtB4. Tanaman tahan herbisida.

21

Tanaman Penambahannutrisi Keuntungan

Rice Provitamin Vitamin Asupplement

Tomato Flavonoid Antioxidant

Sugar beet Fructants Low calori

Rice Iron Ironsupplement

B 5. Peningkatan nilai nutrisi

22

Bioteknologi Kelautan

• Penggunaan hormon pertumbuhan untuk meningkatkanukuran ikan

23

Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi dengan menggunakan analisis Sidik Jari DNAmisalnya: kasus perkosaan

C. Bidang Hukum:

•pola pita DNA pada darah pelaku ke 2sama dengan pola pita yang diperolehdari tempat kejadian- orang ke 2 adalah pelaku kajahatannya

24

Pen

anda

(mar

ker)

Ters

angk

a 1

vagi

na k

orba

n

Ters

angk

a 2

Pen

anda

(mar

ker )

Hubungan keluarga berdasarkan DNA Fingerprint

-DNA mitokondria diwariskan melalui ibu Bagaimana mencari siapa ibu kita?

Perbedaan pada urutan DNA dapat diketahui dengan teknik RFLP(restriction fragment length polymorfism)

- untuk menentukan keturunan, -perbedaan antar satu organisme dengan yang lain.

Pemotongan dengan enzim restriksi

DNA yang berasal dari kromosom

Ｍｏｌｅｋｕｌberukuran

besar

Ｍｏｌｅｋｕｌberukuran

kecil

D. Bidang pengembangan ilmu pengetahuan:

D1. Membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia(penyakit genetik) misalnya kanker payudara, Huntington’s disease.

Huntington’s disease disebabkan oleh gen dominan • Gejala sakit mulai terlihat setelah usia pertengahan • Gejalanya antara lain: kemunduran mental, gerakan tubuh tak

terkontrol, kesulitan bicara. Biasanya meninggal 10 – 20 tahunsetelah timbul gejala.

D2. Kemajuan Teknologi DNA telah mendorong para ilmuwan(konsorsium ilmuwan internasional) untuk mewujudkan proyekgenom manusia dan genom organisme lainnya

25

Teknologi DNA Rekombinan juga mengandung resiko.

Penyebaran pollen berpotensi menyebarkan gen yang diintroduksidalam tanaman transgenik ke dalam tumbuhan lainnya

22