DNA rekombinan

Teknologi DNA rekombinan

• pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang

• Teknologi DNA rekombinan ---- Rekayasa Genetika

Rekayasa Genetika: Aplikasi tehnologi DNA rekombinan

VEKTOR : PLASMID

• bereplikasi diri ( self replicating )• utas ganda : d s• molekul DNA sirkulator• di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk

ekstrakromosomal• copy number ( Jumlah kopi per sel ):

high copy number 10 – 100 kopi / sellow copy number 1 – 4 kopi / selmedium copy number diantaranya

• Ukuran : 1 s/d 500 kb

VEKTOR

• Spektrum inang :- broad hostrangeà dapat bereplikasi pada sejumlah spesies

bakteri- narrow hostrangeàhanya dapat bereplikasi pada spesies khusus

• Beberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning :1. Ukuran kecil2. Mempunyai situs-situs pengenalan ER yang unik (tunggal ),

tempat insert disisipkan / diklon.3. Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi

4. sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert. 5. Plasmid cloning vector harus di-genetically• Contoh : pBR 322, pUC 19

Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom

1. Beda struktur tersier :DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC )DNA kromosom/genom : linier

2. Sifat denaturasi- dengan alkali, pemanasan- DNA plasmid lebih mudah renaturasi

3. Ultrasentrifugasi :CsCl gradien àDNA plasmid berada di bawah

4. Mobilitas di elektroforesis gel agaroseDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanyaCsCl / EtBr : DNA linier (kromosom)

ISOLASI DNA

1.Penghancuran dinding sel : - mekanik- enzimatis

2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat- Triton X – 100

3. Membersihkan debris sel- sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven organik Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ; atau

proteinase-K4. Presipitasi

- + alkohol àsentrifugasi gradien CsCl ; elektro-- + alcohol + NH4 asetat

Enzim Restriksi

Restriction Enzymes = enzim restriksi

• Diperoleh dari bakteri sbg mekanisme pertahanan terhadap infeksi virus DNA

• Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan DNA

• Telah diketahui ada 3,139 enzyme

Enzyme Site Recognition =situs pengenalan enzim restriksi• Setiap enzim mendigesti (memotong) DNA pada

sekuens spesifik = situs restriksi (restriction site)

• Enzim mengenali 4- atau 6- pasangan basa, dengan sekuens palindromik (eg GAATTC)

Penyambungan gugus 3’OH dan DNA insert. Ligasi lebih mudah pada ujung – ujung sticky ( dengan ERsama / isoschizomer / isocaudomer).

-

Arus listrik yang membawa DNA bermuatan negatif ke elektroda muatan (warnamerah) positif melalui suatu gel agaros. Gel agarose memisahkan fragmen DNAberdasarkan ukuran