KARAKTERISASI BAKERI Escherichia coli DAN COLIFORM

A. TUJUAN1. Mendeskripsikan karakteristik pertumbuhan (kultural) bakteri Coliform dan Escherichia coli dalam media selektif dan Diferensial2. Mendeskripsikan karakteristik fisiologis bakteri Coliform dan Escherichia coli

B. DASAR TEORISeiring dengan perkembangan kehidupan di bumi. Air merupakan salah satu elemen dasar yang dibutuhkan oleh semua makhluk hidup. Kelangsungan hidup manusia sebagian besar membutuhkan air seperti: mandi, mencuci, minum dan lain-lain. Sehingga sifat-sifat dan bakteri toksik yang ada pada badan air perlu dihilangkan. Karena apabila zat-zat atau bakteri-bakteri yang ada dalam badan air terakumulasi di dalam tubuh, dapat berbahaya bagi kesehatan makhluk hidup terutama manusia. Salah satu parameter dalam air adalah jumlah bakteri yang terdapat dalam air tersebut, karena apabila bakteri-bakteri tersebut tumbuh dan berkembang dalam tubuh manusia dapat bersifat patogen. Dari sekian banyak jenis bakteri yang terdapat dalam air, salah satunya adalah jenis bakteri Bakteri Coliform, yaitu bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal-lah yang merupakan bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Bakteri coliform dibedakan menjadi 2 tipe, yaitu faecal coliform (Koliform fekal) dan non-faecal coliform (Koliform non-fekal). E. coli adalah bagian dari faecal coliform . Keberadaan E. coli dalam air dapat menjadi indikator adanya pencemaran air oleh tinja. Adapun contoh dari bakteri non-fecal coliform adalah dari genus Enterobacter aerogenes. Oleh karena itu, dalam praktikum ini akan dipelajari tentang karakteristik bakteri Coliform dari genus Escherichia, Enterobacter, dan Citrobacter.

1. Karakteristik Biakan MikroorganismeKetika dibiakkan pada berbagai medium, mikroorganisme akan memperlihatkan perbedaan pertumbuhannya secara makroskopik. Perbedaan tersebut dinamakan karakteristik biakan (cultural), yang digunakan sebagai dasar pemisahan mikroorganisme ke dalam kelompok taksonomi. Karakteristik biakan untuk semua bakteri yang sudah diketahui terdapat dalam Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Semua diidentifikasi berdasarkan pembiakan bakteri dalam kaldu agar miring dan lempeng agar, kaldu nutrisi cair dan nutrisi gelatin. Pola pertumbuhan pada setiap medium tersebut digambarkan dan menunjukkan pola pertumbuhan yang khas.a. Kaldu Agar MiringMerupakan satu garis goresan inokulasi pada permukaan agar miring, hasilnya dievaluasi dengan cara melihat: Banyaknya pertumbuhan: jumlah koloni yang tumbuh Pigmentasi koloni Konsistensi Bentuk kolonib. Kaldu Lempeng AgarMemperlihatkan pertumbuhan koloni isolat, dievaluasi dengan cara melihat: Ukuran Pigmentasi Bentuk: bulat, tak beraturan, serupa akar dan lainnya. Tepi koloni: rata, bergerigi, berlekuk, serupa benang dan lainnya. Ketinggian permukaan: rata, cembung, dan lainnya.

c. Biakan dalam Kaldu NutrisiMemperlihatkan distribusi pertumbuhan, dievaluasi dengan melihat medium: Seragam sedikit keruh mengendap Bergerombol - menggumpald. Nutrisi GelatinMedium padat ini dapat berubah menjadi cair akibat pengaruh enzim gelatinase, pencairan terjadi dalam berbagai pola: Crateriform - Napiform Infundibuliform - Saccate Stratiform (Anonim, 2010)

2. Karakteristik Coliforma. Karakteristik Escherichia coli Domain: BacteriaKingdom: EubacteriaPhylum: ProteobacteriaClass: GammaproteobacteriaOrder: EnterobacterialesFamily: EnterobacteriaceaeGenus: EscherichiaSpecies: E. coli (Migula, 1895)Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2m, diameter 0,7m, lebar 0,4-0,7m dan bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Smith-Keary, 1988 ; Jawetz et al., 1995). Penampakan bakteri E. coli dapat dilihat pada gambar 1.

Gambar 1. E. Coli (Smith-Keary, 1988)E. coli adalah anggota flora normal usus. E. coli berperan penting dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu, asam-asam empedu dan penyerapan zat-zat makanan. E. coli termasuk ke dalam bakteri heterotrof yang memperoleh makanan berupa zat oganik dari lingkungannya karena tidak dapat menyusun sendiri zat organik yang dibutuhkannya. Zat organik diperoleh dari sisa organisme lain. Bakteri ini menguraikan zat organik dalam makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2, H2O, energi, dan mineral. Di dalam lingkungan, bakteri pembusuk ini berfungsi sebagai pengurai dan penyedia nutrisi bagi tumbuhan(Ganiswarna, 1995).E. coli menjadi patogen jika jumlah bakteri ini dalam saluran pencernaan meningkat atau berada di luar usus. E. coli menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan beberapa kasus diare. E. coli berasosiasi dengan enteropatogenik menghasilkan enterotoksin pada sel epitel (Jawetz et al., 1995). Manifestasi klinik infeksi oleh E. coli bergantung pada tempat infeksi dan tidak dapat dibedakan dengan gejala infeksi yang disebabkan oleh bakteri lain (Jawetz et al., 1995).

b. Karakteristik Genus EnterobacterKingdom: BacteriaPhylum: ProteobacteriaClass: GammaproteobacteriaOrder: EnterobacterialesFamily: EnterobacteriaceaeGenus: Enterobacter (Hormaeche & Edwards, 1960).Karakteristik bakteri dari genus Enterobacter yang merupakan keluarga dari Enterobacteriacae ini adalah merupakan kelompok gram negatif, fakultatif anaerob, dan berbentuk batang. Enterobacter merupakan bagian dari flora normal usus. Selain itu, mereka juga ada di hampir semua habitat. Beberapa spesies Enterobacter, misalnya Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Enterobacter gergoviae dan sebelumnya Enterobacter sakazakii (sekarang Chronobacter spp.) dapat menyebabkan infeksi pada manusia. Enterobacter dapat menyebabkan berbagai penyakit. Adanya Infeksi dengan bakteri ini mengakibatkan, keracunan darah (sepsis), radang saluran pernapasan bagian bawah, radang kulit dan jaringan (parenchymae) dari organ, infeksi saluran kemih, radang dari endocardium (endokarditis) atau radang mata (Anonim, 2009)c. Karakteristik Genus CitrobacterKingdom: BacteriaPhylum: ProteobacteriaClass: GammaproteobacteriaOrder: EnterobacterialesFamily: EnterobacteriaceaeGenus: Citrobacter (Werkman and Gillen, 1932).Citrobacter adalah genus dari bakteri Gram-negatif coliform dalam keluarga Enterobacteriaceae. Spesies C. amalonaticus, C. koseri, dan C. freundii dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tunggal. Spesies Citrobacter dibedakan oleh kemampuan mereka yang dapat mengubah triptofan untuk indol, memfermentasi laktosa, dan menggunakan malonat. Citrobacter menunjukkan kemampuan untuk mengakumulasi uranium dengan membangun kompleks fosfat. Bakteri ini dapat ditemukan di tanah, air limbah air, dan di usus manusia.

3. Media Selektif dan DiferensialMedia selektif digunakan untuk mengisolasi kelompok khusus bakteri. Media ini dilengkapi bahan kimia untuk menghambat pertumbuhan satu tipe bakteri dan menyebabkan pertumbuhan yang lainnya, sehingga memberi kemudahan untuk mengisolasi bakteri yang diinginkan. Media differensial digunakan untuk membedakan kelompok mikroorganisme dari sifat morfologi dan biokimianya. Media ini dilengkapi campuran bahan kimia, setelah inokulasi dan inkubasi, menghasilkan perubahan karakteristik pada penampakan pertumbuhan bakteri dan atau pada medium sekitar koloni, yang menyebabkan perbedaan.Yang termasuk ke dalam media selektif dan differensial diantaranya:a. Agar Garam MannitolMengandung konsentrasi garam tinggi (7,5% NaCl), yang dapat menghambat pertumbuhan kebanyakan bakteri, kecuali Staphylococcus. Media ini juga mengadakan fungsi differensial karena mengandung karbohidrat mannitol, dimana beberapa Staphylococcus dapat melakukan fermentasi. Phenol red (pH indikator) digunakan untuk mendeteksi adanya asam hasil fermentasi manitol. Staphylococcus ini memperlihatkan suatu zona berwarna kuning di sekeliling pertumbuhannya. Staphylococcus yang tidak melakukan fermentasi tidak akan menghasilkan perubahan warna.b. Agar DarahDarah dimasukkan ke dalam medium untuk memperkaya unsur dalam pembiakan mikroorganisme terpilih seperti Streptococcus sp. Darah juga akan memperlihatkan sifat hemolysis yang dimiliki Streptococcus. Diantara sifatnya:1) Gamma hemolisis: tidak terjadi lisis sel darah merah, tidak adanya perubahan medium di sekitar koloni.2) Alpha hemolisis: terjadi lisis sel darah merah dengan reduksi hemoglobin menjadi metahemoglobin menghasilkan lingkaran kehijauan sekitar pertumbuhan bakteri.3) Beta hemolisis: terjadi lisis sel darah merah dilengkapi kerusakan dan penggunaan hemoglobin oleh mikroorganisme menghasilkan zona bening sekeliling koloni.c. Agar Mac ConkeyMenghambat pengaruh kristal ungu terhadap pertumbuhan bakteri Gram positif, selanjutnya bakteri Gram-negatif dapat diisolasi. Medium dilengkapi dengan karbohidrat (laktosa), garam empedu, dan neutral red sebagai pH indikator yang mampu membedakan bakteri enterik sebagai dasar kemampuannya untuk memfermentasi laktosa. Pada dasarnya bakteri enterik dipisahkan ke dalam dua kelompok:1) Coliform basil menghasilkan asam dari fermentasi laktosa. Bakteri memperlihatkan warna merah pada permukaannya. E. coli menghasilkan kuantitas asam lebih banyak dibandingkan spesies coliform yang lain. Jika ini terjadi, medium di sekitar pertumbuhan juga akan berubah menjadi merah. Pengaruh asam terjadi karena pengendapan garam empedu yang diikuti penyerapan pewarna neutral red.2) Bakteri coliform penyebab disentri, tifoid, dan paratifoid tidak memfermentasi laktosa, maka tidak menghasilkan asam. Koloni kelihatan tidak berwarna dan seringkali transparand. Agar Eosin-Methylene Blue (EMB agar)Laktosa dan zat pewarna eosin serta metilen biru mampu membedakanantara enterik yang memfermentasi laktosa dengan yang nonfermenter. Pada media ini, koloni E. coli teridentifikasi sebagai warna biru kehitaman dengan kilat hijau logam/metalik yang disebabkan besarnya kuantitas asam yang dihasilkan dan pengendapan zat pewarna di atas permukaan pertumbuhan. Bakteri coliform lain seperti Enterobacter aerogenes akan terlihat tebal, mukoid, dan koloni berwarna pink di atas medium ini. Untuk bakteri enterik nonfermenter laktosa akan membentuk koloni tidak berwarna di atas medium yang berwarna ungu (merah lembayung). Medium ini juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif, sedangkan bakteri Gram-negatif tumbuh lebih baik.e. Agar Darah TeluritUntuk menggisolasi Corynebacterium digunakan agar darah telurit (Mc Leod), sebagai medium selektif. Setelah inkubasi selama 24 jam koloni bakteri terlihat berwarna abu-abu tua kehitaman. Selanjutnya untuk biakan murni Corynebacterium digunakan media perbenihan Loeffler dalam tabung.f. Agar Tioglikolat/Tarrozi (Perbenihan Anaerob)Perbenihan tioglikolat, mengandung asam tioglikolat yang dapat mengikat oksigen sehingga tercapai suasana anaerob dalam perbenihan. Perbenihan Tarrozi, kaya akan enzim peroksidase sehingga zat toksik (H2O2) yang dihasilkan Clostridium tetani berubah menjadi tidak toksik (H2O dan O2) dan kuman dapat tumbuh terus dalam perbenihan.g. Agar TCBS dan Agar MonsurAgar TCBS (Thiosulfat Citrat Bile Sucrose) dan Agar Monsur (mengandung telurit gelatin agar atau kaldu agar alkalis yang mengandung Na-tourokolat), digunakan untuk mengisolasi genus Vibrio. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada temperatur 37oC di atas media berwarna hijau kehitaman koloni akan terlihat bundar berwarna kuning muda, transculent dan permukaannya rata.h. Agar Coklat atau Thayer-MartinMedium agar coklat (Thayer-Martin) merupakan media terpilih untuk genus Neisseria. Untuk pertumbuhannya diperlukan suasana anaerob (fakultatif) dengan sedikit gas CO2 dan tidak boleh kekeringan, sehingga pembiakan yang cocok digunakan dalam eksikator yang diberi kapas basah pada bagian bawah petri yang berisi biakan.i. Medium Agar Lowenstein-JensenMedium agar padat tersebut banyak digunakan untuk perbenihan genus Mycobacterium, bakteri ini dapat tumbuh walaupun dalam waktu relatif lama, kecuali jenis atipik golongan rapid growers dapat tumbuh dalam 3-7 hari (Anonim, 2010).

4. Identifikasi BakteriIdentifikasi bakteri dapat diketahui dengan menanamkan sampel bakteri dalam media seperti media gula-gula dan penanaman dalam uji biokimia IMViC. Uji IMViC ini merupakan singkatan dari uji Indol, Metil Red, Voges Proskauer, dan Citrate.a. Uji IndolBakteri yang tergolong dalam grup fekal dapat memecah asam amino triptofan dan menghasilkan suatu senyawa berbau busuk yang disebut indol. Bakteri yang telah ditumbuhkan dalam medium yang mengandung triptofan, kemudian diberi 3-5 tetes pereaksi Kovacs yang mengandung amil alkohol atau diberi kristal asam oksalat. Adanya indol akan menyebabkan amil alkohol berubah warnanya menjadi merah tua dan warna dari yang diberi kristal asam oksalat akan menjadi merah muda. Uji yang menggunakan penunjuk amil alkohol disebut metode Kovacs, sedangkan yang menggunakan penunjuk asam oksalat disebut metode Gnezda. b. Uji Metil RedUji ini bertujan untuk mengetahui adanya pembentukan asam dengan pH di bawah 4. Metil Red adalah suatu indikator yang akan menunjukan warna merah bila pH ada di bawah 4. Hasil uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah, sedangkan warna kuning menunjukan hasil negatif. Pada uji ini sebelumnya ditambahkan reagen MR (0,4% dalam alcohol 96%) kedalamnya untuk dapat mengetahui reaksi warna.c. Uji Voges-Proskauer Pada reaksi ini akan diselidiki apakah bakteri yang akan diuji dapat membentuk Acethyl Methyl Carbinol atau tidak. Untuk melihat hasil positif maka ke dalam medium yang telah ditanami ditambahkan KOH setelah dihomogenkan kemudian ditambahkan dengan -naphtol. Dalam hal ini akan terbentuk diacethil. Diacetyl ini dengan sisa-sisa guanidine akan membentuk warna merah kecoklatan yang berupa cincin dipermukaan tabung sebagai hasil positif, bila tidak terjadi apa-apa maka hasil uji VP adalah negatif.d. Uji SitratDengan manggunakan medium citrate menurut Simmon, merupakan medium padat yang terdiri dari mono ammonium fosfat, Na citrate, NaCl, air , agar-agar, dan indikator Bromtymol Blue. Pada uji ini medium yang tadinya berwarna hijau kebiruan, bila bereaksi positif maka akan berubah menjadi berwarna biru terang. Bila rekasi negatif, maka akan tetap berwarna hijau kebiruaan. Selain dari reaksi biokimia, bakteri juga dapat diidentifikasi dengan mengamati pergerakannya atau motilitasnya. Motilitas bakteri ini dibagi dalam empat kelompok yaitu, aerob (organisme yang membutuhkan oksigen), anaerob (tumbuh tanpa oksigen molekular), anaerob fakultatif (tumbuh pada keadaan aerob dan anaerob), dan mikroaerofil tumbuh terbaik bila ada sedikit oksigen di atmosfer). Motilitas bakteri ini dapat diamati dengan menumbuhkan bakteri pada semi solid agar (Pelczar, 1986).

C. ALAT DAN BAHANAlat:1. Cawan petri2. Mikroskop 3. LupBahan:Biakan bakteri:1. Bakteri Escherichia coli2. Bakteri EnterobacterMedia:1. EMB (Eosin Methylen Blue) Agar 2. Mac Conkey Agar3. Endo Agar4. Media SIM5. Media TSIA6. Media Simmons CitratBahan kimia:1. Larutan H2O2 (Hydrogen Peroxida)2. Reagen KOH 10%3. Reagen nafthol4. Reagen Kovac5. Alkohol

D. PROSEDUR KERJA1. Amati karakteristik koloni masing-masing bakteri dari genus Escherichia, Enterobacter, Citrtobacter, dan Klebsiella yang telah ditumbuhkan pada media EMB Agar, Mac Conkey Agar dan Endo Agar2. Deskripsikan karakteristik koloni bakteri yang tumbuh. Gunakan pensil berwarna untuk mengoptimalkan visualisasi gambar koloni3. Lakukan uji fisiologis dari masing-masing bakteri pada media uji yang sudah disiapkan di tabung reaksi dengan menumbuhkan bakteri menggunakan bantuan os4. Lakukan inokulasi secara aseptik dan inkubasi selama 24 jam5. Catat hasil uji fisiologis dari masing-masing genus bakteri dan masukkan pada tabel hasil pengamatan6. Rangkumlah hasil pengamatan dengan baik untuk dapat menyimpulkan perbedaan yang jelas tentang karakteristik bakteri Coliform.

E. HASIL PENGAMATAN Tabel 1. Differensiasi Makroskopis Bakteri Coliform (Enterobacter sp. dan Citrobacter) dan Escherichia coli pada berbagai mediaBakteriMedia EMBMedia Mc ConkeyMedia Endo Agar

Enterobacter sp. Warna koloni dark purple dengan warna hijau muda disekitar dan bintik merah tua Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex Warna koloni pink pucat Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex Warna koloni pink tua dengan center dark purple Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex

Citrobacter sp. Warna koloni ungu Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex Warna koloni pink Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex Warna koloni pink pucat Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex

Esscherichia coli Warna koloni hijau tua dengan hijau metalik (berpendar) Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex Warna koloni pink tua Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex Warna koloni merah Bentuk bulat Tepian rata Elevasi konvex

Tabel 2. Uji Fermentasi Karbohidrat, Uji Motilitas, Uji Katalase, Serta Uji Biokimia (Imvic) Bakteri Coliform Dan Escherichia Coli BakteriUji Fermentasi Karbohidrat (Media TSIA)Uji Motilitas (Media SIM)Uji KatalaseUji IMViC

SlantDeepGasH2SIndolMRVPCitrat

Enterobacter sp.AcidAcid+-++++++-+

Citrobacter sp.AcidAcid+-+++++--

Esscherichia coliAcidAcid+-++++--

F. PEMBAHASAN

1. Makroskopis Bakteri Escherichia Coli Dan Bakteri Coliforma. Pada Media EMB AgarEMB agar (Eosin Methylen Blue) merupakan media selektif yang terdiri dari garam empedu (bile salt) dan pewarna eosin dan methylen blue. Fungsi dari media EMB Agar yakni untuk menghambat bakteri gram positif sehingga diharapkan mikroba yang muncul dari media ini hanyalah bakteri gram negatif. Selain itu, media ini digunakan untuk mengetahui perbedaan bakteri yang dapat menfermentasi laktosa dengan yang tidak dapat menfermentasikan laktosa. Ciri khas dari bakteri yang dapat menfermentasikan laktosa yakni koloninya berwarna dari gelap hingga gelap dengan hijau metalik (Alexander, 2001).Pada bakteri bergenus Enterobacter, saat dikultur di media EMB Agar memiliki karakteristik antara lain koloni berbentuk bulat, berwarna ungu gelap dengan tengah warna hijau gelap, tepi rata, dan elevasi convex. Warna koloni ini sesuai dengan referensi ,adanya warna ungu gelap pada koloni genus Enterobacter dikarenakan genus Enterobacter dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media EMB Agar. Warna ungu gelap juga mengindikatorkan bahwa bakteri genus Enterobacter memiliki pH asam. Hal ini dikarenakan semakin gelap warna koloni pada media berarti semakin asam perubahan pada Eosin dan methylen blue di media EMB.Bakteri bergenus Citrobacter saat dikultur di media EMB Agar memiliki karakteristik antara lain koloni berbentuk bulat, berwarna ungu, tepi rata, dan elevasi convex. Adanya warna ungu pada koloni genus Citrobacter dikarenakan genus Citrobacter dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media EMB Agar. Warna ungu mengindikatorkan bahwa bakteri genus Citrobacter memiliki pH asam. Namun jika kita bandingkan dengan genus Enterobacter, Enterobacter mengasilkan asam lebih besar dibandingkan Citrobacter karena warna ungu yang ditunjukkan Enterobacter lebih gelap daripada Citrobacter.Bakteri Escherichia coli saat dikultur di media EMB Agar memiliki karakteristik antara lain koloni berbentuk bulat, berwarna hijau metalik, tepi rata, dan elevasi convex. Adanya warna hijau metalik pada koloni E. coli dikarenakan E. coli dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media EMB Agar. Warna hijau metalik merupakan indicator penting dari karakteristik makroskopis E.coli.b. Pada media Mac Conkey AgarMedia Mac Conkey Agar terdiri dari garam empedu dan kristal violet. Media Mac Conkey Agar berguna untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan dengan harapan bakteri yang dapat memfermentasikan laktosa-lah yang dapat tumbuh. Ciri khas dari koloni E. coli pada media ini adalah menampakkan warna pink atau merah sedangkan pada koloni genus Enterobacter berwarna merah. Untuk bakteri gram positif dan bakteri non fermentasi laktosa, koloninya tidak berwarna. (Alexander,2001).Karakteristik bakteri Enterobacter saat dikultur di media Mac Conkey Agar antara lain berbentuk bulat, berwarna pink susu, tepi rata, dan memiliki elevasi convex. Adanya pink susu pada koloni genus Enterobacter dikarenakan genus Enterobacter dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media media Mac Conkey. Menurut Mahon (2011), koloni Enterobacter pada medium Mac Conkey Agar, akan berwarna pink. Bakteri Citrobacter saat dikultur di media Mac Conkey Agar memiliki karakteristik antara lain berbentuk bulat, koloni berwarna pink, tepi rata, elevasi convex. Adanya warna pink pada koloni Citrobacter dikarenakan Citrobacter dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media Mac Conkey. Bakteri E. coli saat dikultur di media Mac Conkey Agar memiliki karakteristik antara lain berbentuk bulat, koloni berwarna pink gelap, tepi rata, elevasi convex. Adanya warna pink gelap pada koloni E. coli dikarenakan genus E. coli dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media Mac Conkey Agar. c. Pada media Endo AgarMedia Endo Agar terdiri dari dye basic fuchsin yang berguna sebagai penghambat bakteri gram positif dan membedakan bakteri yang dapat memfermentasikan laktosa dan yang tidak bisa menfermentasikan laktosa. Bakteri yang dapat menfermentasikan laktosa, koloninya akan berwarna pink sampai merah dan berpendar metalik seperti E. coli (Alexander, 2001). Bakteri Enterobacter saat dikultur di media Endo Agar memiliki karakteristik antara lain berbentuk bulat, koloni berwarna pink tua dengan tengah ungu, tepi rata, elevasi convex. Adanya warna pink tua dengan tengah ungu pada koloni genus Enterobacter dikarenakan genus Enterobacter dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media Endo Agar. Bakteri Citrobacter saat dikultur di media Endo agar memiliki karakteristik antara lain berebentuk bulat, koloni berwarna pink susu, tepi rata, elevasi convex. Adanya warna pink susu pada koloni genus Citrobacter dikarenakan genus Citrobacter dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media Endo Agar. Karakteristik bakteri Escherichia coli saat dikultur di media Endo Agar antara lain koloni berbentuk bulat, berwarna merah, tepi rata, dan elevasi convex. Menurut Biovendor laboratory Medicine, warna koloni E. coli pada media Endo Agar adalah merah muda sampai merah mawar dengan hijau metalik yang berpendar. Adanya warna merah pada koloni genus Escherichia coli dikarenakan genus Escherichia coli dapat menfermentasikan laktosa yang terdapat dalam media Endo Agar.

2. Uji Gula dan Uji Biokimia pada Escherichia coli, Enterobacter, dan CitrobacterSelain mengembangkan perbedaan dalam karakteristik makroskopis, setiap bakteri juga mengembangkan perbedaan dalam aktifitas fisiologisnya. Hal tersebut terkait dengan mekanisme bakteri dalam memetabolisme substrat untuk pertumbuhannya. Karakterister fisiologis bakteri tersebut juga digunakan dalam mengidentifikasi bakteri. Salah satunya yaitu dengan menggunakan uji gula-gula dengan menggunakan media TSIA dan uji biokimia. Pada uji TSIA, langkah pertama yang dilakukan adalah bakteri distreak terlebih dahulu di atas permukaan media TSIA dan pada kedalaman tertentu kemudian bakteri ditanamkan pada media TSIA. Setelah 24 jam inkubasi, baru dapat dilihat bagaimana pertumbuhan koloni dari bakteri yang ditanam. Uji biokimia yang dilakukan dalam praktikum ini adalah uji Indole, Methyl Red, Voges-Proskeur, Citrate atau disingkat IMViC (Adams dan Moss 2008). Disamping melakukan uji IMViC, dilakukan pula uji katalase yang digunakan untuk menguji kemampuan mikroorganisme dalam menghasilkan enzim katalase atau enzim peroksidase yang dapat menguraikan H2O2 menjadi air dan oksigen. Uji ini dilakukan pada gelas obyek dengan memberi satu tetes larutan H2O2 lalu diberi satu ose biakan bakteri Escherichia coli, Enterobacter, dan Citrobacter lalu diaduk. Dan juga dilakukan uji motilitas untuk melihat pergerakkan bakteri. Hasil uji motilitas dinyatakan positif bila terlihat adanya pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media. Berikut adalah pembahasan mengenai bakteri E.coli, Enterobacter, dan Citrobacter pada uji TSIA, Uji IMViC, Uji Katalase, dan Uji Motilitas.a. EnterobacterHasil Uji Katalase, pada bakteri Enterobacter adalah positif, ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang sangat banyak yang mengindikasikan adanya reaksi penguraian hidrogen peroksida oleh enzim katalase yang dihasilkan oleh mikroorganisme (Cappuccino & Sherman, 2005) dalam hal ini yaitu Enterobacter. Enzim katalase yang dihasilkan Enterobacter paling besar diantara Citrobacter dan E. coli.Pengujian fisiologis TSIA yaitu dengan menggunakan media TSIA menunjukkan bahwa Enterobacter menghasilkan gas yang ditandai dengan pecahnya media pada dasar tabung reaksi. Pada bagian slant dan deep, terlihat media pertumbuhan berwana kuning. Adanya gas dan warna kuning menunjukkan bahwa media pertumbuhan bersifat acid karena pertumbuhan Enterobacter. Untuk uji H2S menunjukkan hasil yang negatif, yang ditandai dengan tidak adanya titik-titik kehitaman pada medium.Pada Uji Motilitas, media untuk melihat pembentukan indol yaitu media SIM (Sulfite Indole Motility) agar yang bersifat semi-padat (semisolid) dapat digunakan untuk melihat pergerakan bakteri (motilitas) dengan cara menusukkan biakan Enterobacter secara tegak dengan menggunakan ose lurus. Jika bakteri bergerak, akan terlihat pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media.Pada Uji Indol, koloni Enterobacter yang sebelumnya telah diinokulasikan satu ose ke dalam media SIM broth, kemudian diinkubasi selama 24 jam 2 jam dengan suhu 35 0C 1 0C. Enterobacter menunjukkan hasil uji positif ditandai dengan terbentuknya cincin merah pada lapisan bagian atas media ketika diberi penambahan 5-10 tetes reagen Kovac. Namun menurut literatur, hasil Uji Indol Enterobacter seharusnya menunjukkan hasil negatif dimana ditandai dengan terbentuknya cincin kuning. Bakteri Enterobacter tidak mampu menghasilkan senyawa indol yang berbau busuk. Karena tidak mampu mengasilkan senyawa indol maka amil alkohol pada reagen Kovac tidak dapat berubah warna menjadi merah tua. Adanya perbedaan hasil antara hasil pengamatan dengan literatur kemungkinan dikarenakan biakan Enterobacter terkontaminasi dengan bakteri lain.Pada Uji Voges Proskauer (VP) digunakan media MR-VP dengan inkubasi selama 48 jam 2 jam pada suhu 350C 10C. Untuk menganalisis hasil uji VP, koloni Enterobacter yang telah ditumbuhkan dalam tabung reaksi ditambahkan Reagen Barrit sebanyak 5-10 tetes yang terdiri dari larutan A yaitu reagen -naphtol, dan larutan B yaitu reagen KOH 10%. Penambahan -naphtol dan KOH dapat mendeteksi terbentuknya asetoin (Acethyl-Methyl Carbinol) yaitu senyawa prekursor 2,3-Butanadiol. Koloni Enterobacter menunjukkan hasil negatif yaitu warna berubah menjadi kuning. Akan tetapi, berdasarkan literatur, untuk Uji VP pada bakteri Enterobacter seharusnya menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan berubahnya warna media menjadi merah karena hasil akhir fermentasi dari bakteri Enterobacter adalah acethyl-methyl carbinol (asetoin) yang dapat membentuk warna merah pada media ketika ditambahkan reagen Barrit. Perbedaan hasil yang ditunjukkan pada praktikum dengan literatur kemungkinan terjadi karena beberapa faktor, diantaranya Reagen Barrit yang digunakan mungkin sudah kadaluarsa, dan bisa juga karena isolat telah terkontaminasi.Uji Methyl Red (MR) digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran atau fermentasi butanadiol. Untuk uji Methyl Red (MR), biakan Enterobacter diinokulasikan pada media MR-VP Broth dari uji VP, kemudian diinkubasikan kembali selama 48 jam 2 jam pada suhu 350C 10C. Koloni yang sudah tumbuh dianalisis hasilnya dengan menambahkan 5 tetes indikator Methyl Red. Hasil yang ditunjukkan adalah positif dengan terbentuknya warna merah. Namun, berdasarkan literatur untuk uji MR pada bakteri Enterobacter seharusnya menunjukkan hasil negative yang ditandai dengan terbentuknya warna kuning. Hal ini dapat terjadi karena beberapa faktor, diantaranya indikator Methyl Red yang digunakan sudah tidak layak pakai, mungkin juga karena isolat telah terkontaminasi. Bakteri Enterobacter memproduksi sedikit asam ketika memfermentasi glukosa dalam media MR-VP. Karena itulah, seharusnya bakteri Enterobacter menunjukkan hasil negative karena tidak mampu menurunkan pH medium hingga mencapai 5,0. Berikut di bawah ini adalah reaksi dari bakteri Enterobacter pada uji Methyl Red:

Glucose + H2O E.aerogenes Acids Lactic Acetic + Acetyl-Methyl Carbinol + Ethanol + H2O + CO2 (pH= 6,5)

Pada Uji Sitrat atau Citrat (C), 1 ose dari biakan Enterobacter digoreskan ke permukaan media Simmon Citrat agar yang berwarna hijau. Setelah itu, diinkubasi selama 96 jam 2 jam dengan suhu 350C 10C. Bakteri Enterobacter menunjukkan hasil positif dengan adanya pertumbuhan pada permukaan media Simmon Citrat dan berubahnya warna media Simmon Citrat dari warna hijau menjadi berwarna biru. Hasil tersebut menunjukkan bahwa sitrat yang terkandung dalam media merupakan satu-satunya sumber karbon dan energi bagi bakteri Enterobacter.Reaksi yang terjadi: Citrat Citrat permease Oxalacetic acidPiruvate + CO2 +excess SodiumNa2CO3 CITRASE Alkaline pH

Berikut di bawah ini menunjukkan perbandingan hasil uji IMViC bakteri Enterobacter antara hasil praktikum dengan literatur:Tabel 3. Tabel Perbedaan Hasil Uji IMVIC Bakteri Enterobacter antara Hasil Praktikum dengan Literatur.Tipe OrganismeIndolMRVPCitrat

Enterobacter sp. (pada percobaan)++-+

Enterobacter sp. (literatur)--++

b. Escherichia coliE. coli dapat dibedakan dengan Enterobacteriaceae lainnya berdasarkan uji gula-gula dan uji biokimia. Pada hasil pengamatan, E.coli dalam media TSIA baik slant maupun deep (bult) menghasilkan warna kuning yang menunjukkan bahwa sifat bakteri tersebut mampu memfermentasi sukrosa atau laktosa atau bahkan keduanya. Di samping itu, terlihat pula media TSIA terangkat, hal ini dikarenakan adanya pembentukan gas seperti gas H2 dan CO2 dari hasil fermentasi tersebut. Namun tidak ditemui endapan hitam di bagian deep, hal ini menunjukkan bahwa tidak ada pembentukan H2S. Kriteria reaksi yang diperlihatkan dari uji media TSIA dapat dilihat pada Tabel 4.Tabel 4. Reaksi yang dapat dilihat pada TSIA (Lay, 1994) Selanjutnya pada media SIM, dari hasil pengamatan menunjukan bakteri E.coli merupakan bakteri motil. Untuk Uji Katalase, bakteri E.coli menunjukan hasil positif, namun bila dibandingkan dengan Enterobacter dan Ctrobacter menghasilkan gelembung gas oksigen paling sedikit. Pada Uji Indol E.coli menghasilkan cincin berwarna merah, yang artinya Uji Indol positif, cincin berwarna merah ini dikarenakan adanya enzim triptopanase. Bakteri fekal (E.coli) memecah asam amino tryptophan dan menghasilkan senyawa indol yang kemudian berikatan dengan amil alkohol dalam reagen Kovacs (Fardiaz, 1993). Dalam metabolismenya banyak bakteri yang menggunakan tryptophan sebagai sumber energi. Indol adalah produk sisa dengan bau fecal (Lay 1994).Pada Uji Methyl Red dari hasil pengamatan menunjukan bahwa bakteri E.coli memperlihatkan hasil positif. Uji Methyl Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri menfermentasi glukosa dan menghasilkan berbagai produk bersifat asam sehingga dapat menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5,0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH Methyl Red dapat menunjukan adanya perubahan pH menjadi asam. Uji ini sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan termasuk E. coli. Menurut Lay (1994), Methyl Red berwarna merah pada lingkungan pH 4,4 dan berwarna kuning pada lingkungan pH 6,2. Hasil Uji Voges-Proskauer menunjukan reaksi negatif pada bakteri E.coli. Tabung yang terdapat media MR-VP tidak memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagen. Hal ini membuktikan bahwa E. coli tidak membentuk asetil metil karbinol (asetoin) suatu senyawa pemuka (prekursor) dalam sintesis 2,3-butanadiol. Pada Uji Sitrat, bakteri E.coli menunjukan hasil negatif, karena media tetap berwarna hijau, hal ini menandakan bakteri E.coli tidak menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Berdasarkan literatur yang terlihat pada Tabel 5, maka semua uji IMVIC untuk bakteri E.coli yang diamati telah sesuai.Tabel 5. Hasil uji IMVIC pada famili Enterobacteriaceae (Adams dan Moss, 2008)BakteriIndoleMethyle RedVoges ProskauerCitrate

E. coli++--

Salmonella typhimurium-+-+

Citrobacter freundii-+-+

Klebsiella pneumonia--++

Enterobacter aerogenes--++

c. CitrobacterCitrobacter adalah genusbakteri gram negatif dan termasuk bakteri coliform. Bakteri ini dapat ditemukan hampir di mana-mana, diantaranya ditanah, air,air limbah, dll. Mereka juga dapat ditemukan diusus manusia. Citrobacter dapat menyebabkan infeksi padasaluran kemihdanmeningitis pada bayi. Pada praktikum kali ini dilakukan beberapa uji fisiologis pada Citrobacter diantaranya:1) Uji TSIAUji TSIA adalah suatu uji yang dilakukan untuk mengetahui apakah suatu bakteri dapat menghasilkan senyawa asam (acid) atau basah (alkalin), mengetahui apakah suatu bakteri dapat menghasilkan H2S serta menghasilkan gas. Setelah dilakukan uji TSIA pada bakteri Citrobacter, permukaan deep dan slant terlihat berwarna kuning (acid). Hal ini menunjukkan bahwa bakteri Cirobacter menghasilkan senyawa asam. Ditemukan juga adanya retakan-retakan akibat produksi gas yang dihasilkan oleh Citrobacter, yang menunjukkan hasil positif dalam menghasilkan gas. Akan tetapi, bakteri Citrobacter tidak menghasilkan H2S karena pada media TSIA tidak dijumpai adanya bintik-bintik hitam (negatif).2) Uji KatalaseDalam praktikum, bakteri Citrobacter menunjukkan reaksi positif. Hal ini dapat dilihat oleh adanya gelembung-gelembung oksigen karena adanya pemecahan hidogen peroksida (H2O2) oleh enzim katalase yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri. Citrobacter menghasilkan gas O2 lebih banyak dari E. coli tapi lebih sedikit dibandingkan dengan Enterobacter.Komponen hidrogen peroksida (H2O2) ini merupakan salah satu hasil respirasi bakteri aerob. Hasil respirasi tersebut (H2O2) justru dapat menghambat pertumbuhan Citrobacter karena bersifat toksik bagi bakteri itu sendiri. Oleh karena itu, komponen ini harus di pecah agar tidak bersifat toksik lagi. H2O2 diuraikan dengan enzim katalase dengan reaksi sebagai berikut:2H2O2 2H2O+ O23) Uji IndolUji Indol (Triptofan) adalah salah satu uji fisiologi yang bertujuan untuk mengidentifikasi kandungan Indol pada suatu biakan, uji positif (+) ditandai dengan terbentuknya lapisan seperti cincin yang berwarna merah pada lapisan atas media. Adanya bentukan cincin warna merah disebabkan karena degradasi liktofal menjadi indol setelah diberi Reagen Kovac. Pada hasil pengamatan, terlihat dibagian atas permukaan media terbentuk lapisan seperti cincin yang berwarna merah. Hal ini menunjukan bahwa bakteri Citrobacter bernilai positif untuk Uji Indol. Akan tetapi menurut literature seharusnya hasil Uji Indol pada Citrobacter bernilai negatif karena tidak mampu menghasilkan senyawa indol. 4) Uji MotilitasUji Motilitas bertujuan untuk mengetahui pergerakan suatu mikroba. Bergeraknya mikroba dikarenakan adanya flagel yang bergerak. Pergerakan mikroba dapat diamati dari hasil tusukan mikroba yang ada pada tabung berisi media. Tusukan biasanya terlihat lebih keruh dan terlihat bentuk garis-garis seperti akar. Ini menandakan bahwa mikroba tersebut motil atau dapat bergerak.Pada bakteri Citrobacter terlihat adanya bekas tusukan berupa garis panjang seperti akar pada tabung berisi media SIM dan warna bekas tusukan tersebut keruh. Hal ini menunjukan bahwa bakteri Citrobacter motil (positif).5) Uji Sitrat (Citrat)Uji Sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat digunakan medium sitrat-koser berupa medium cair atau sitrat-simon berupa medium padat, yaitu merupakan medium sintetik dengan Na-sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan Brom Thymol Blue sebagai indikator pH, sedangkan medium sitrat koser tidak mengandung indikator. Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka asam akan dihilangkan dari medium biakan sehingga meningkatkan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru.Sedangkan pada medium sitrat koser adanya kemampuan menggunakan sitrat ditunjukan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan (Asepwandi, 2010). Pada pengamatan yang dilakukan, tidak ditemukan adanya perubahan warna. Warna media masih hijau. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri Citrobacter negatif terhadap uji Sitrat dan tidak meningkatkan pH, serta bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Akan tetapi, berdasarkan literatur, seharusnya Citrobacter menunjukkan hasil positif pada uji sitrat, dapat meningkatkan pH media dan memiliki enzim sitrat permiase. 6) Uji MRUji MR adalah uji yang digunakan untuk menunjukkan adanya oksidasi glukosa menjadi asam pada suatu mikroba. Warna merah menunjukkan hasil uji positif, sedangkan warna kuning uji negatif. Sejumlah besar bakteri gram negatif penghuni usus dapat dikenali berdasarkan produk akhir yang dihasilkan bila memfermentasi glukosa dalam medium MR-VP. Selama memfermentasi, bakteri yang mengasilkan asam yang banyak akan menurunkan pH medium hingga mencapai pH 5 yang menyebabkan indikator merah metil yang diteteskan menjadi berwarna merah.Pada bakteri Citrobacter terlihat media berubah warna menjadi merah (positif), ini menunjukkan adanya oksidasi glukosa menjadi asam oleh bakteri Citrobacter.7) Uji VPUji VP adalah uji yang digunakan untuk mengetahui adanya kandungan asetoin pada suatu mikroba. Berubahnya warna media menjadi warna merah muda menunjukan dalam biakan tersebut mengandung asetoin. Dimulai dengan pembentukan 2,3-butanadiol atau reaksi Voges-Proskauer positif. Reagen Barrit (-naftol dan KOH) dapat mendeteksi adanya asetoin (asetil-metil karbinol) yaitu prekursor 2,3-butanadiol. Asetoin dan 2,3-butanadiol hampir selalu terdapat bersama-sama.Pada bakteri Citrobacter, setelah diberi perlakuan diatas warna media menjadi kuning, hal ini menujukan bahwa Citrobacter tidak menghasilkan asetoin.

G. KESIMPULANDari hasil percobaan dan hasil pengamatan pada praktikum yang telah dilakukan dapat diperoleh beberapa kesimpulan, yaitu :1. Enterobacter, Eischercia coli, dan Citrobacter dapat dibedakan dari spesies lain dalam famili Enterobacteriaceae melalui karakteristik maksroskopis koloni pada media selektif dan media differensial, serta melalui uji fisiologis. Uji fisiologis digunakan untuk mengetahui kegiatan langsung maupun tidak langsung produk kegiatan enzimatik bakteri, antara lain : Uji TSIA, Uji Katalase, Uji Indol, Uji MR-VP, dan Uji Sitrat (Citrat).2. Baik E. coli, Enterobacter, dan Citrobacter sama-sama memiliki elevasi convex, tepi rata, dan bentuk bulat. Namun ketiga bakteri tersebut menunjukkan perbedaan warna pada media selektif-diferensial EMB, Mac Conkey Agar, dan Endo Agar.3. Pada praktikum kali ini, Uji IMViC bakteri E. coli, Enterobacter, dan Citrobacter menunjukkan hasil positif pada Uji Indol, dan Methyl-Red. Baik E.coli dan Citrobacter menunjukkan hasil negatif pada Uji Voges Proskeur dan Uji Sitrat (Citrate). Enterobacter juga menunjukkan hasil negatif pada Uji Voges Proskeur namun menunjukkan hasil positif pada Uji Sitrat.4. Hasil uji IMViC pada E. coli telah sesuai dengan literatur yang ada, namun pada Enterobacter dan Citrobcater menunjukkan beberapa perbedaan dengan literatur. 5. Pada Uji TSIA, E. coli, Enterobacter, dan Citrobacter menunjukkan warna kuning pada bagian slant dan deep (Acid). Baik E. coli, Enterobacter maupun Citrobacter menunjukkan hasil positif pada Uji Motilitas. Dan pada Uji Katalase, menunjukkan bahwa Enterobacter menghasilkan gelembung gas O2 paling banyak, diikuti oleh Citrobacter, dan yang menghasilkan gas O2 paling sedikit adalah E.coli.DAFTAR PUSTAKAAdam, M. R. and M.O. Moss. 2008. Food Microbiology Third Edition. UK: The Royal Society of Chemistry Ombrigde.Alexander, Steve. K.2001. Microbiology a Photographic Atlas for The Laboratory. Canada: Benjamin Cummngs an Imprint of Addison Wesley Longman.Cappucino dan Sherman. 2005. Microbiology: Laboratory Manual. California: The Benjamin Cummings Publishing Company, Inc.Dwidjoseputro, D. 1981. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: DjambatanFardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.Ganiswarna S. G. 1995. Farmakologi dan Terapi, ed. 4. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas IndonesiaJawetz, E., et al. 1995. Mikrobiologi Kedokteran, ed. 20. San Francisco: University of CaliforniaLay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Rajawali Press.Pelzar, Michael J. dkk. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.Schlegel, Hans G. 1994. Mikrobiologi umum (Terjemahan). Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.Smith-Keary P. F. 1988. Genetic Elements in Escherichia coli, Macmillan Molecular biology series. London, p. 1-9, 49-54Citrobacter diakses dari http://en.wikipedia.org/wiki/Citrobacter tanggal 29 Maret 2013Enterobacter diakses dari http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacter tanggal 29 Maret 2013.Anonim. 2010. Klasifikasi dan Identifikasi Bakteri diakses dari file.upi.edu/Direktori/.../BAB__7_klasifikasi_bakteri.pdf. tanggal 28 Maret 2013.Kusuma, S. A. F. Escherichia coli diakses dari pustaka.unpad.ac.id/wp.../09/pustaka_unpad_Escherichia-coli.pdf: Makalah, Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran tanggal 28 Maret 2013.Uji IMViC diakses dari http://rodiahmikrobiologi.blogspot.com/2012/uji-imvic/.html?m=1/ pada tanggal 25 Maret 2013Bab IV diakses dari http://repository.upi.edu/operator/upload/s_bio_0706531_bab_iv.pdf tanggal 29 Maret 2013Uji IMViC dikases dari http://rodiahmikrobiologi.blogspot.com/2012/01/uji-imvic.html tanggal 28 Maret 2013.Aktivitas Enzimatik Bakteri diakses dari http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab9:aktivitas-enzimatik-bakteri. tanggal 28 Maret 2013.Uji Katalase diakses dari http://dunia-mikro.blogspot.com/2008/08/uji-katalase.html tanggal 28 Maret 2013.