27

Teknologi Indonesia LIPI Press 2010

SINTESIS SENYAWA ANALOG UK-3A DAN PENGARUHNYA TERHADAP BIOAKTIVITAS IN-VITRO

ANTI KANKER LEUKEMIA P-388

Husniati1), Muhammad Hanafi 2) Baristand Industri Bandar Lampung1),

Pusat Penelitian Kimia LIPIPuspiptek, Serpong2), e-mail: husniati.eni@gmail.com

ABSTRAK

Senyawa analog UK-3A baru yang didefi nisikan sebagai 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida berhasil disintesis dari reaksi amidasi asam karboksilat aromatik dan amina primer dengan menambahkan aktivator DCC (N,N-disikloheksilkarbodiimida), katalisator DMAP (4-dimetil amino piridin), dan kloroform sebagai pelarut sebanyak 5 mL. Reaksi berlangsung dalam alat dean-stark dengan pengadukan tetap pada suhu 60C selama 24 jam. Melalui reaksi tersebut diperoleh rendemen sebanyak 93%. Struktur senyawa ini diidentifi kasi menggunakan UV, FT-IR, 1H-NMR, dan 13C-NMR. Bioaktivitas senyawa diuji secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5-difeniltetrazolium bromide. Hasil bioassay menunjukkan bahwa senyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan sel kanker dengan aktivitas lebih tinggi dari pada senyawa induk yang ditunjukkan dari nilai IC50 (inhibitory concentration). Analog UK-3A mempunyai IC50=7,5g/mL sedangkan UK-3A induk =38g/mL.

Kata kunci: UK-3A, analog UK-3A, Antikanker, P-388.

ABSTRACT

The novel compound of analog UK-3A defi ned as 2-hydroxy-N-octylbenzamide was successfully synthesized by the amidation reaction of aromatic carboxylic acids and primary amine by adding the activator of DCC (N, N-dicyclohexylcarbodiimide), catalyst DMAP (4-dimethyl amino pyridine), and chloroform as a solvent (5 mL). The reaction held in the dean-stark device with continue stirring at 60C for 24 hours. Result shows yield as much as 93%. The structure was identifi ed using UV, FT-IR, 1H-NMR, and 13C-NMR. Bioactivity of the compound was tested in vitro against murine leukemia cancer cells P-388 by using the MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. The result of bioassay showed that this analog compound can inhibit the growth of cancer cell Murine leukemia P-388 with a higher activity than UK-3A indicated by the value of IC

50 (inhibitory concentration). IC

50 of

analog UK-3A was found 7,5 g/mL whereas IC50

for UK-3A was 38 g/mL.

Keywords: UK-3A, analog UK-3A, anticancer, P-388.

PENDAHULUANUK-3A telah diisolasi dari Streptomyces sp.

517-02 sebagai komponen minor.[1,2,3] Senyawa UK-3A ini memiliki aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap pertumbuhan jamur, bakteri, dan sel kanker.[2,3,4-7] Aktivitas antikanker dari senyawa antibiotika UK-3A telah terbukti memiliki daya sitotoksik terhadap pertumbuhan

sel kanker Murine leukemia P388 di mana nilai IC50 sebesar 38 g/mL secara in-vitro.

[4,5] Senyawa UK-3A memiliki kemiripan struktur dengan senyawa Antimisin A3 yang telah dikenal sebagai antibiotika dan bekerja sebagai inhibitor rantai respirasi mitokondria sehingga tidak terjadi konversi energi untuk kelangsungan hidupnya.[8] Kedua struktur ditunjukkan pada Gambar 1.

Teknologi Indonesia 33 (1) 2010: 2731

Off print request to: Husniati & Muhammad Hanafi

28

Jurnal Teknologi Indonesia 33 (1) 2010

UK-2A: R=OMeUK-2A: R=H

Anti misin A3

N

O H O

HN

O

O

O

O

O

O

O H O

HN

O

O

O

O

O

O

N H

H O

R

Gambar 1. Struktur molekul UK-3A dan kemiripan struktur terhadap antimisin A3

Sintesis senyawa UK-3A memerlukan be-berapa bahan baku dengan rute reaksi yang cukup panjang sehingga memerlukan pembiayaan yang kurang ekonomis.[9] Untuk memperoleh senyawa analog UK-3A dilakukan suatu rancangan dalam struktur UK-3A dengan cara teknik modifi kasi gugus fungsi.

Patrick, 2001, mendefi nisikan senyawa ana log, yaitu senyawa yang dibuat berdasarkan senyawa induk yang telah ditemukan mempunyai aktivitas biologi. Ada dua alasan penting disintesisnya senyawa analog ini, pertama, sebagai studi identifi kasi gugus fungsi yang penting dalam menjelaskan mekanisme pengikatan senyawa induk dengan targetnya. Kedua, mempunyai keuntungan dalam pengembangan obat bahwa aktivitas senyawa induk dapat diperbaiki dan mengurangi munculnya efek samping. Sintesis senyawa analog mempunyai tahapan reaksi semi-nimal mungkin dan menggunakan bermacam-macam reaktan sehingga sebanyak mungkin senyawa analog berbeda dapat disintesis.[10]

Hasil sintesis senyawa analog dari modifi kasi gugus aktif diharapkan mempunyai aktivitas bio-logi serupa, lebih rendah, atau lebih tinggi dari senyawa induk.[9,10] Peranan gugus aktif hidroksil, amida, dan dilakton cincin sembilan dalam UK-3A mempunyai pengaruh terhadap daya sitotoksik sel kanker P-388.

Beberapa penelitian telah memberikan hasil uji dari pengaruh gugus aktif -OH dan CONH[4,5,11] dan dilakton cincin sembilan terhadap aktivitas anti kanker. Bila dilakton cincin sembilan terhidrolisis oleh asam/basa menghasilkan senyawa seperti pada Gambar 2, yaitu 3-hidroksipikoliin serin metil ester (A) dan ester lakton cincin lima (B). Kedua senyawa A dan B tidak mempunyai aktivitas antikanker terutama P388 yang sebelumnya ada pada senyawa induk, UK-3A.[12] Suatu senyawa

tidak memperlihatkan aktivitas biologisnya pada konsentrasi di atas 100 g/mL.[6]

Gambar 2. Struktur hidrolisis molekul UK-3A, 3-hidroksipikoliin serin metil ester (A) dan ester lakton cincin lima (B).

Aktivitas senyawa A dilakton cincin terbuka dapat ditingkatkan dengan cara esterifi kasi senya-wa asam karboksilat seperti PSMOE (3-hidroksi pikolinin serin metil oktil ester) memberikan nilai IC50 sel kanker P-388 adalah 15,4 g/ml lebih tinggi dari aktivitas antikanker UK-3A.[12]

Pada makalah ini akan dilaporkan hasil sintesis senyawa analog UK-3A dan uji bioaktivitasnya. Sintesis senyawa analog dilakukan dengan cara menghilangkan gugus dilakton rantai terbuka sehingga senyawa analog baru menjadi lebih sederhana karena hanya merupakan satu reaksi amidasi. Senyawa analog baru tetap memper-tahankan gugus-gugus aktif OH (hidroksil) dan CONH (amida).

BAHAN DAN METODE Bahan baku sintesis: 0,276 g asam salisilat (E. Merck); 0,364 mL oktilamin (E. Merck); 0,454 g DCC (N,N-disikloheksil karbodiimida) (Sigma); 0,269 g DMAP (N,N-4-dimetil amino piridin) (Sigma) dan 5mL pelarut kloroform (E. Merck).

Bahan proses pemurnian: fi ltrat yang diperoleh diekstraksi dengan 25 mL CHCl3 (teknis) kemudian dilewatkan dalam kolom kromatografi silika gel (E. Merck) menggunakan eluen 4:1 n-heksana: etil asetat (teknis).

Bahan uji sitotoksik: Reagen MTT [3-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-2,5-difenil tetra zolium bromida]; Fetal Bovine Serum (FBS); penisilin; streptomisin; Kultur sel kanker Murine leukemia

29

Husniati dan Muhammad Hanafi : Sintesis Senyawa Analog ...

P388; DMSO (dimetil sulfoksida); PBS (phos-phoric buffer solution); cis-platin; SDS (sodium dodesil sulfat).

Alat

Identifikasi kromofor menggunakan alat UV dengan kisaran panjang gelombang, = 200-400 nm dengan konsentrasi 1000 ppm dalam pelarut metanol. Analisis gugus fungsi menggunakan FT-IR. Serapan sampel padatan yang digerus bersama KBr kemudian dibentuk menjadi cakram tipis dan serapannya diukur pada daerah infra merah dengan panjang gelombang, = 15,4-2,5 m (650-4000 cm-1). Konfi rmasi struktur lebih lanjut ditentukan dengan 1H-NMR dan 13C-NMR.

Metode

Sintesis:Bahan baku dari 0,276 g asam salisilat (E.

Merck); 0,364 mL oktilamin (E. Merck); 0,454 g DCC (N,N-disikloheksil karbodiimida) (Wako); 0,269 g DMAP (N,N-4-dimetil amino piridin) dan 5mL pelarut kloroform direaksikan selama 24 jam pada suhu 60C dalam alat dean-stark berukuran 200mL sambil dilakukan pengadukan secara terus-menerus menggunakan pengaduk magnet dan hot plate stirrer.

Reaksi pembentukan senyawa 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida disertakan dengan pembentukan produk samping DCU (disikloheksil urea). Kele-bihan DCC dihilangkan dengan penambahan air sedangkan DCU dipisahkan melalui penyaringan. Kemudian fi ltrat diekstraksi dengan 25mL kloro-form. Air yang terbawa dalam pelarut organik dihilangkan dengan penambahan magnesium sulfat anhidrat hingga jenuh. Sampel dikeringkan dari pelarutnya dengan penguapan menggunakan evaporator vakum pada 50C. Sampel dimasuk-kan ke dalam kolom kromatografi yang berisi silika gel dan dielusi dengan gradien konsentrasi n-heksan:etil asetat mulai dari 100% hingga 50% n-heksan.

Fraksi yang menunjukkan spot tunggal (fraksi murni) dari produk yang diinginkan selanjutnya dikarakterisasi secara kualitatif menggunakan KLT (E. Merck) dan diamati menggunakan lampu UV pada = 254 dan 360 nm. Identifi kasi struktur molekulnya juga dianalisis menggunakan

instrumentasi UV, FT-IR, NMR. Aktivitas biologi senyawa sintesis diuji menggunakan sel kanker Murine leukemia P 388 secara in vitro.[13]

Uji Bioaktivitas antikanker secara invitro

Kultur sel kanker Murine leukemia P388 sejumlah 3 x 103 sel/mL disuspensikan ke dalam media RPMI 1640 yang telah mengandung FBS (Fetal Bovine Serum), penisilin dan streptomisin. Sel pada hari pertama diinokulasikan ke dalam microplate 96 well plate dan diinkubasi dalam inkubator CO2. Hari kedua dilakukan penam-bahan sampel yang dilarutkan dalam pelarut DMSO (dimetil sulfoksida). Sampel dengan konsentrasi beragam diencerkan dengan penam-bahan PBS (phosphoric buffer solution) dengan pH (7,307,65) ditambahkan ke dalam sel dalam microplate lalu dikocok dan disimpan kembali dalam inkubator CO2. Kontrol negatif terhadap aktivitas antikanker digunakan pelarut DMSO sedangkan kontrol positif digunakan senyawa standar cis-platin. Setelah 48 jam, ke dalam sel ditambahkan reagen MTT dan diinkubasi selama 4 jam untuk selanjutnya ditambahkan SDS dan dikocok dengan baik. Inkubasi sel dilanjutkan kembali selama 24 jam. Perubahan warna dari MTT kuning menjadi formazan ungu di dalam mitokondria sel yang masih hidup dapat dikuantifi kasi pada panjang gelombang =550 nm dengan spektrofotometer. Nilai IC50 dilihat dari grafi k hubungan antara konsentrasi senyawa bahan uji (g/mL) dengan intensitas larutan dari viabilitas sel. (14)

HASIL DAN PEMBAHASAN1. Sintesis senyawa Analog 2-Hidroksi-

N-oktilbenzamidaMekanisme reaksi sintetis senyawa analog 2-

Hidroksi-N-oktilbenzamida mengikuti mengikuti persamaan reaksi yang ditunjukkan pada Gambar 3.

Senyawa analog 2-Hidroksi-N-oktilbenza-mida telah disintesis secara optimal mengguna-kan bahan baku asam karboksilat aromatik dan amina primer, aktifator DCC, katalis DMAP dan pelarut kloroform secara bersamaan direaksikan selama 24 jam pada suhu 600C dalam alat dean-stark sambil dilakukan pengadukan secara terus-menerus. Reaksi pembentukan senyawa

30

Jurnal Teknologi Indonesia 33 (1) 2010

disertakan dengan pembentukan produk samping DCU (disikloheksil urea) yang dapat dihilangkan melalui penyaringan.

N

N

N

N

O H O

O

H

C

N

N

C 6H 11

C 6H 11

O H O

OC

N

N H

C 6H 11

C 6H 11

D CC

....

O H O

O

O H O

O

N

N

H

C

N H

N H

C 6H 11

O

C 6H 11

O H O

O H O

HN

2-h idroksi-N -oktil-benzam ida

D C U

A sam salis ila t

H 2N

DM A P

N

N

H

O ktilam in

N

N

D M A P

Gambar 3. Mekanisme reaksi pembentukan.

Penggunaan secara bersamaan katalis dan aktifator memberikan rendemen produk lebih tinggi dan reaksi berlangsung pada suhu tidak terlalu tinggi.[15] Melalui reaksi tersebut dihasil-kan rendemen sebanyak 93% dengan spesifi kasi senyawa berbentuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 43-450C.

Untuk analisis produk dilakukan identifi kasi adanya kromofor dalam struktur molekulnya menggunakan UV. Kurva absorbsi memberikan serapan maksimal pada titik tertinggi kurva dengan max= 246, 298,5 dan 324nm. Absorbsi tersebut terjadi karena transisi * ditandai munculnya tiga puncak berasal dari sistem aromatik.

Analisis produk untuk penentuan gugus fungsi dilakukan menggunakan FT-IR. Hasil analisis ditunjukkan seperti pada Tabel 1.

Berdasarkan penafsiran spektrum IR maka senyawa yang telah terbentuk ditemukannya gugus fungsi C=O dan NH amida, C-H alifatik, C-H aromatik, dan O-H.

Tabel 1. Daftar daerah spektrum gugus fungsi se-nyawa

Ikatan Daerah absorbsi ( cm-1)C=O N-H dan O-HC-H alifati kC-H arilC=C aril

16413344

2850-29543223

1442-1583

Konfi rmasi lebih lanjut terhadap struktur molekul untuk produk yang diperoleh mengguna-kan analisis spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR. Hal ini dilakukan untuk mengatasi problema penentuan struktur suatu senyawa hanya melalui informasi gugus fungsi saja. Informasi pengukur-an dari spektrum 1H-NMR dapat memberikan deskripsi mengenai bagian hidrokarbon molekul dari nilai pergeseran kimia yang menunjukkan proton untuk masing-masing lingkungan kimia, konstanta kopling (J), dan jumlah proton dari hasil integrasinya. Pengukuran dari spektrum 13C-NMR dapat diketahui jenis karbon primer, sekunder, tersier dan kuartener (-CH3, -CH2-, CH-, -C-, O-C, C=O, -CONH-, dan lain-lain) (16). Lihat Gambar 4. Data pergeseran kimia pada Tabel 2.

Tabel 2. Data pergeseran kimia (, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR senyawa (CDCl3, 500 MHz)

C/H

Pergeseran Kimia (, ppm)

1H-NMR(m*,J dalam Hz)

13C-NMR

1-CON-2

3-C-OH456712

3-78

NH

--

12,43 (1H, s)6,81(1H, m)7,36(1H, m) 6,96(1H, m)7,37(1H, m) 3,42 (2H, q)1,60 (2H, m)

1,27 (10H, m)0,87 (3H, t, 7,35)6,48(1H, d, 4,75)

170,10114,56161,00118,67134,20118,75125,4739,4031,9029,3714,21

-

m*=multiplisitas, J = konstanta kopling

2. Bioaktivitas antikanker

Uji bioaktivitas senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker seperti terlihat pada Tabel 3.

31

Husniati dan Muhammad Hanafi : Sintesis Senyawa Analog ...

O H O

HN1

23

4

5

6

7

1 '

2 '

3 '

4 '

5 '

6 '

7 '

O-H

N-H

Proton Aromatik 2

3-78

1

C-OH-CON-

C-Aromatik C-Alkil

Gambar 4. Spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR

Tabel 3. Hasil uji senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker Murine leukemia P388

No. SenyawaIC50 (g/

mL)

123

2-Hidroksi-N-okti lbenzamida cis-plati n UK-3A

7,51238

Berdasarkan tabel di atas, senyawa analog 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida mempunyai aktivitas antikanker leukemia P388 lebih tinggi jika dibandingkan dengan senyawa induk, UK-3A. Keuntungan senyawa analog yang disintesis ini diperoleh berdasarkan modifi kasi struktur molekul senyawa UK-3A induk dengan satu tahap reaksi amida dan mempunyai aktivitas biologi lebih unggul. Aktivitas anti kanker ditun-jukkan oleh nilai IC50 yang lebih rendah karena

IC50 adalah nilai penghambatan pertumbuhan sel kanker sebesar 50%.

Aktivitas senyawa ditunjukkan dari struktur molekul salisilat/fenol. Gugus fenol yang ada pada senyawa analog diperkirakan mempunyai peranan penting dalam aktivitas. Gugus OH pada senyawa diduga mempunyai interaksi pengikatan senyawa pada sisi pengikatan (binding site) sel target melalui ikatan hidrogen yang terlibat antara dua molekul yang bekerja sebagai donor dan akseptor. Donor ikatan hidrogen adalah proton dari fenol yang menempel pada atom oksigen yang bersifat elektronegatif dan sebagai akseptornya adalah gugus-gugus OH yang ada pada sel target/reseptor.[10]

Pengaruh gugus hidrokarbon netral dari senyawa ini yang memiliki gugus alkil mempu-nyai kemampuan untuk cocok/tepat ke dalam kantong hidropobik (hydrophobic pocket) dengan interaksi van der Waals Interaksi tersebut penting untuk pengikatan molekul obat dengan binding site sel.[10]

KESIMPULANSenyawa analog UK-3A, 2-hidroksi-N-

oktilbenzamida, disintesis dari asam salisilat dan oktilamina dengan rute reaksi lebih sederhana dan diperoleh rendemen sebanyak 93%.

Spesifi kasi senyawa analog tersebut berben-tuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 43-450C.

Aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker Murine Leukemia P388 memberikan hasil uji IC50=7,5 g/mL. Senyawa analog UK-3A tersebut mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker Murine Leukemia P388 lebih tinggi dibandingkan senyawa induk, UK-3A dengan IC50=38 g/mL.

UCAPAN TERIMA KASIHTerima kasih atas bantuan dana penelitian

kepada Badan Penelitian dan Pengembangan Industri dan Pusat Pendidikan dan Pelatihan Departemen Perindustrian.

DAFTAR PUSTAKA[1] Ueki, M., Hanafi , M., Shibata, K., and Tani-

guchi, M. 1996. UK-3A a novel antifungal

32

Jurnal Teknologi Indonesia 33 (1) 2010

antibiotics from Streptomyces sp. 51702, fermentation, isolation, and biological prop-erties, J. Antibiotic, 49: 639644.

[2] Taniguchi, M., Shibata, K., Abe, K., Kodama, R., and Uotani, K. 1995. Jpn. Patent, 7-233165.

[3] 3. Ueki, M., Hanafi , M., Shibata, K., and Taniguchi, M. 1996. UK-2A, B, C and D novel antifungal antibiotics from Strepto-myces sp. 51702, structure elucidation. J. Antibiotics, 49: 12261231.

[4] Hanafi , M., Shibata, K., Ueki, M., and Tani-guchi, M. 1996. UK-2A, B, C, and D: a novel antifungal antibiotics from Streptomy-ces sp. 51702: II. Structural elucidation, J. Antibiotics, 49 (12): 12261226.

[5] Ueki, M., Kusumoto, A., Hanafi , M., Shiba-ta, K., Tanaka, T., and Taniguchi, M. 1997a. UK-3A a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 51702, fermentation, iso-lation, structure elucidation and biological properties, J. Antibiotic, 50 (7): 551555.

[6] Ueki, M. and Taniguchi, M. 1997b. The mode of action of UK-2A and UK-3A novel antifungal from Streptomyces sp. 51702, J. Antibiotic, 50 (12): 10521057.

[7] Shimono, M., Kamei, N., Shibata, T., Ino-guchi, K., Itoh, N., Ikari, T., and Senda, H. 1998. Total synthesis of the antifungal dilactones UK-2A and UK3A: The deter-mination of their relative and absolute con-fi gurations, analog synhesis and antifungal activities. Tetrahedron, 54:1274512774

[8] Shiomi, K., Hatae, K., Hatano, H., Mat-sumono, A., Takahashi, Y., Lin Jiang, C., Tomoda, H., Kobayashi, S., Tanaka, H., and Omura, S. 2005. A new antibiotic, antimycin A9, produced by Streptomyces sp. K01-0031. J. Antibiot., 58 (1): 7478.

[9] Usuki Y., Adachi N., Fujita K., Ichimura A., Iio H., and Taniguchi, M. 2006. Structure Activity Relationship Studies on UK-2A, a Novel Antifungal Antiniotic from Strepto-myces sp. 517-02. Part 5: Roles of the 9-Mem-bered Dilactone-Ring Moiety in Respiratory Inhibition. J. Bioorganic and Medicinial Chemistry Letter, 16: 33193322.

[10] Hanafi , M. 1995. Studies of novel anti-biotics metabolites from Streptomyces sp. 51702. Thesis Departemen of Chemistry Faculty of Science. Osaka City University. Osaka.

[11] Patrick, G. 2001. Instant notes in medicinal chemistry, BIOS Scientifi c Publisher.

[12] Hanafi , M dan Thelma, A. B. 1998. Sintesis senyawa analog antibiotika UK-3, pengaruh gugus hidroksi terhadap aktivitas biologi. Prosiding Seminar Nasional II Kimia dalam Pembangunan, Holiday Inn. Yogyakarta.

[13] Hanafi , M., Anita, Y., dan Putra, A. M. J. 2008. Sintesis pengaruh lipofilisitas pada analog UK-3A terhadap aktivitas antikanker leukemia P-388. Seminar IPT. LIPI. Serpong

[14] Husniati, 2008. Sintesis senyawa analog UK-3A: 3-hidroksi-N-oktilpikolinamida, 2-hi-droksi-N-fenil-benzamida, 3-hidroksi-N-fenil-pikolinamida, dan 2-hidroksi-N-oktilbenzamida, dan uji bioaktivitas secara in-vitro terhadap sel kanker murine leukemia P-388, Tesis, Magister Sains Ilmu Kimia, Program Pascasarjana U.I, Depok.

[15] Sahidin., 2005. Cytotoxic properties of oligostilbenoids from the tree barks of hopea dryobalanoides, J. Naturforsch, 60: 723727.

[16] Akitt, J. W. 1983. An introduction to the fourier transform-multinuclear era, 2nd ed., Chapman & Hall Ltd., New York, USA.