2.4 Metode Ekstraksi

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian

tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif

terdapat di dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda demikian pula

ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu dalam

mengekstraksinya.

Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen kimia yang

terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan

massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai terjadi pada

lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut.

1. Jenis-jenis ekstraksi (Dirjen POM, 1986)

Jenis ekstraksi bahan alam yang sering dilakukan adalah ekstraksi secara

panas dengan cara refluks dan penyulingan uap air dan ekstraksi secara dingin

dengan cara maserasi, perkolasi dan alat soxhlet.

2. Cara-cara ekstraksi (Harbone, 1987; Dirjen POM, 1986)

a. Ekstraksi secara soxhletasi

Ekstraksi dengan cara ini pada dasarnya ekstraksi secara

berkesinambungan. Cairan penyari dipanaskan sampai mendidih. Uap

penyari akan naik melalui pipa samping, kemudian diembunkan lagi oleh

pendingin tegak. Cairan penyari turun untuk menyari zat aktif dalam

simplisia. Selanjutnya bila cairan penyari mencapai sifon, maka seluruh cairan

akan turun ke labu alas bulat dan terjadi proses sirkulasi. Demikian

seterusnya sampai zat aktif yang terdapat dalam simplisia tersari

seluruhnya yang ditandai jernihnya cairan yang lewat pada tabung sifon.

b. Ekstraksi secara perkolasi

Perkolasi dilakukan dengan cara dibasahkan 10 bagian simplisia

dengan derajat halus yang cocok, menggunakan 2,5 bagian sampai 5 bagian

cairan penyari dimasukkan dalam bejana tertutup sekurang-kurangnya 3 jam.

Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, ditambahkan

cairan penyari. Perkolator ditutup dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran

dibuka dengan kecepatan 1 ml permenit, sehingga simplisia tetap terendam.

Filtrat dipindahkan ke dalam bejana, ditutup dan dibiarkan selama 2 hari pada

tempat terlindung dari cahaya.

c. Ekstraksi secara maserasi

Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia

dengan derajat yang cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan

penyari 75 bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya

sambil diaduk sekali-kali setiap hari lalu diperas dan ampasnya dimaserasi

kembali dengan cairan penyari. Penyarian diakhiri setelah pelarut tidak

berwarna lagi, lalu dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan pada

tempat yang tidak bercahaya, setelah dua hari lalu endapan dipisahkan.

d. Ekstraksi secara refluks

Ekstraksi dengan cara ini pada dasarnya adalah ekstraksi

berkesinambungan. Bahan yang akan diekstraksi direndam dengan cairan

penyari dalam labu alas bulat yang dilengkapi dengan alat pendingin tegak,

lalu dipanaskan sampai mendidih. Cairan penyari akan menguap, uap

tersebut akan diembunkan dengan pendingin tegak dan akan kembali

menyari zat aktif dalam simplisia tersebut, demikian seterusnya. Ekstraksi

ini biasanya dilakukan 3 kali dan setiap kali diekstraksi selama 4 jam.

e. Ekstraksi secara penyulingan

Penyulingan dapat dipertimbangkan untuk menyari serbuk simplisia

yang mengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih yang tinggi

pada tekanan udara normal, yang pada pemanasan biasanya terjadi kerusakan

zat aktifnya. Untuk mencegah hal tersebut, maka penyari dilakukan

dengan penyulingan.

2.5 Kromatografi Lapis(an) Tipis (KLT)

Thin Layer Chromatography (TLC)

Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar.

Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada

gelas/kaca, plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase)

berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadang- kadang

juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan

membentangkan /meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas

plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.

2.5.1 Fase diam

Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena

strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa

diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk

kromatografi kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase

diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran (diameter) dalam mesh atau

j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi kolom).

Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran:

a. Silika gel

Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam

perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40µm. Makin kecil

diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian

mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari

300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat

mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran:

Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum,

(CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan

pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai

pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.

Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini

sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa

dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah-

kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau

Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 ,ג nm).

- Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika

gel N.

- Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator

- flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan

preparative

b. Alumina

Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam

yang beraktifitas tinggi. Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH

9), ada juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang bersifat asam (pH

4). Juga digunakan CaSO4 sebagai pengikat yang dapat menurunkan bebasaan

pada tinggkat tertentu. Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau

tanpa pengikat dan bahan indicator. Pemberian namapun identik dengan silika

gel dengan code G.H.P.F.

c. Selulosa

Menggunakan selulosa sebagai fase diam maka mekanisme pemisahannya

sama seperti mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas. Perbedaannya

hanya serat selulosenya pada TLC/KLT lebih pendek dari pada serat selulosa

kromatografi kertas. Panjang serat bervariasi 2-20 µ. Serat lebih pendek

menyebabkan difusi rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit

(lebih kecil). Selulosa untuk TLC terdapat dim bentuk selulosa serat asli

(contohnya MN 300) dan selulosa mikrokristal (contohnya Avicel). Fase diam

selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat polar.

2.5.2 FASE GERAK

Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik

(tabel 1). Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja atau pun

campuran.

Bila mana fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air

maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat

penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan

polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar

akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase

gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh

fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.

Tabel 1 : Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fase gerak

(deret eluotropik)

non polar

Polar

P

a

Parafin cair

Petroleum eter

Sikloheksana

Karbon tetraklorida

Benzena

Toluena

Klorofor

m

Dietileter

Etilasetat

Aseton

n-propanol

etanol

asetonitril

methanol

air

a. Pembuatan plat (lempeng) silica gel

30 Gram phase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual

dengan merk dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau

pelarut lain sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran

20X20 cm, dalam waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat

perata Stahl-Desaga untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan

ketebalan dapat diatur 0,25-2,0 mm. Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan

mencelupkan ke dalam bubur adsorbent. Setelah lapisan bubur ini mengering

diruangan kemudian dipanaskan di dalam oven pada 100-120°C selama 60 menit,

dengan tujuan semua air akan enguap. Proses pengeringan atau penghilangan air

disebut proses mengaktifkan plat kromatografi (fase diam), selanjutnya didalam rak

penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam exicator. Sehingga pada waktu

penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air) dari udara. Dengan demikian

mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang ditahan fase diam adalah

mekanisme absorption.

Tabel 2: Perbandingan berat fase diam dan cairan untuk pembuatan plat.

Fase diam Cairan PerbandinganFase diam : cairan =

1. Silika gel G atau GF Air 30:60-652. Silika gel H Air 30:80-903. Alumina G Air 30:404. Alumina H Air 30:80-905. Kiselgur Air 30:60-656. Serbuk selulosa MN Air 1:57. Serbuk poliamida Kloroform: metanol

= 2:3

1:9

Plat TLC yang siap pakai tersedia dipasaran, diantaranya dengan ukuran 20X20

diatas lembaran gelas, aluminium, plastik. Plat-plat ini dapat dipotong sesuai dengan

luas plat yang diperlukan. Untuk lembaran plastik tidak dapat dipanaskan pada waktu

pengamatan bercak/spot.

b. Penyiapan dan penotolan sampel

Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik

dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila

tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif

sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan

sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan.

Pada umumnya ditotolkan 1-20 µl larutan yang mengandung 50-100 µg sample tiap

bercak untuk kromatografi absorbsi dan 5-2Qµg sample untuk kromatografi partisi.

Penotolan dapat dilakukan dengan gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan

pipet mikro. Untuk keperluan kuantitatif digunakan quantitative microsyringe.

Kepada plat TLC konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample

ditotolkan sebagai bercak bulat atau garis, 1,5-2,0 cm dari tepi bawah. Untuk

memudahkan penotolan dibuat garis lemah dengan pensil, disebut garis awal. Pada

garis awal ini biasanya ditotolkan bercak-bercak dengan garis tengah 3-6 mm, bercak-

bercak tadi diusahakan diameternya seragam. Penotolan bercak pada plat TLC

dapat dilakukan berulang-ulang dan haras berhati-hati dijaga plat tidak rusak.

Penotolan sample yang terlalu banyak (over loaded) menyebabkan bercak hasil

pengembangan berbentuk tidak bulat (asimetri) dan perubahan harga Rf. Bila totolan

sample sample telah kering maka plat siap untuk dielusi / dikembangkan.

2.5.3 Pengembangan (Elusi)

Hampir semua TLC dikembangkan dengan cara menaik dalam bejana (chamber)

pengembang dari gelas. Di dalam bejana ini dimasukkan fase gerak hingga

kedalaman 0,5 cm, pada dinding sebelah dalam bejana ditempelkan kertas saring

setinggi 20 cm yang ujung bawahnya tercelup fase diam. Fase diam akan

merambat keatas membasahi kertas saring, dengan demikian ruangan dalam

bejana tertutup ini akan lebih cepat dijenuhi dengan uap pelarut. Setelah ruangan

dalam bejana jenuh dengan uap fase gerak (terjadi kesetimbangan), plat TLC

dimasukkan dimulai pengembangan atau elusi. Bercak sample pada garis awal jangan

sampai tercelup dalam fase gerak. Fase gerak akan merambat naik membawa

komponen sample. Kecepatan merambat tiap- tiap komponen berbeda tergantung

kekuatan persaingan ikatan hydrogen yang organik adalah asam sulfat dalam

metanol, selanjutnya bercak dipanaskan didalam oven, sebaiknya digunakan oven

yang ada jendela kacanya sehingga cepat atau merambat lebih cepat. Sebaliknya kalau

ikatan hidrogennya lebih kuat dengan fase diam, komponen akan lebih lama

tertahan fase diam atau merambat lambat. Pengembangan dihentikan pada saat

fase gerak mencapai jarak tertentu, biasanya 1 cm sebelum ujung akhir plat. Batas

dicapainya fase gerak segera ditandai dengan pensil sebagai garis akhir. Lebih baik

batas akhir ini dibuat dahulu sebelum pengembangan, bila pelarut mencapai garis

akhir, plat segera diangkat dan dikeluarkan dari bejana.

Cara-cara pengembangan yang lain adalah :

1. Pengembangan berulang

Yaitu plat yang baru saja dielusi dikeringkan kemudian dielusi kembali dengan

fase gerak yang sama.

2. Pengembangan dua dimensi

Yaitu plat dikembangkan seperti biasa, setelah itu dikeringkan dan pelat

diputar 90° kemudian dikembangkan dengan fase gerak berbeda (pemisahan

flavone "Harbone")

Pengembangan sirkular

3. Contoh cara pengembangan ini adalah pada kromatotorn, sebenarnya termasuk

kromatografi planar juga. Perbedaan dengan KLT adalah cara

pengembangannya yaitu kromatotorn dikembangkan dengan cara

dipusingkan pada kecepatan tertentu. Sampel ditotolkan pada daerah dekat

sumbu putar, kemudian sambil dipusingkan fase gerak diteteskan dan diatur

kecepatannya, fase gerak ini akan keluar menetes dibagian tepi pelat yang

dipusing tersebut.

2.5.4 Pengamatan (mendeteksi) bercak / visualisasi

Cara mengamati bercak pada TLC dapat digolongkan menjadi dua :

Pertama dengan cara merusakkan / mereaksikan komponen/senyawa yang ada bercak

itu dan Kedua tanpa merusakkan komponen / senyawa. Cara pertama dengan

menyemprotkan pereaksi penanda. Banyak pereaksi-pereaksi yang digunakan

dapat dilihat dalam literature dan dijual dipasaran (niaga). Contoh pereaksi

semprot yang umum untuk senyawadapat diikuti perubahan bercak selama

pemanasan menjadi bercak warna hitam. Pada dasarnya adalah reaksi oksidasi pada

senyawa organic oleh asam sulfat. Pereaksi lain adalah dengan disemprot dengan

larutan lodium dan paling mudah adalah dengan memasukkan plat kedalam bejana

yang berisi uap lodium (kristal lodium diletakkan dalam bejana, tidak merusak 75%

senyawa). Contoh pereaksi semprot dan penggunaannya dapat dilihat pada tabel 3.

Cara ke dua, yang tidak merusak komponen/ senyawa di bercak. Untuk

senyawa berwarna atau berpendar dibawah lampu UV (berfluoresensi) tidak

ada masalah menggunakan silika tanpa tambahan zat berpendar. Sedang

untuk senyawa yang tidak berpendar dibawah lampu UV digunakan fase diam

dengan tambahan zat berpendar.

Tabel 3 : Macam pereaksi warna / penanda dan penggunaannya

No. Pereaksi warna Jenis senyawa Warna

1. Anilina ftalat Gula mereduksi Berbagai warna2. Anisaldehida dalam H2SO4

dan asam asetat

Karbohidrat Berbagai warna

3. Stibium triklorida dalam

kloroform

Steroid, glikosida steroid.

Lipid alifatik, vit. A dll.

Berbagai warna

4. Hijau brom kresol Asam karboksilat Bercak kuning pada

dasar hijau5. 2,4-Dinitrofenilhidrazin Aldehida dan keton Bercak kuning

sampai merah6. Deagendorf Alkaloid dan basa organic Jingga

7. Besi III klorida Fenol Berbagai warna8. Flourescein;Br2 Senyawa tak jenuh Bercak kuning pada

dasar merah jambu

9. Ninhidrin Asam amino, gulaamino,

asamfosfatida

Biru

2.6 Metode identifikasi senyawa Xanton

Xanton merupakan derivat difenil-γ-pyron, yang memiliki nama IUPAC 9H-Xantin-

9-on. Xanton merupakan senyawa polifenol yang memiliki hubungan dekat dengan flavonoid

(hostettman et al. In antus et al., 1995). Distribusi xanton terdapat pada tumbuhan tinggi,

tumbuhan paku, jamur dan tumbuhan lumut. Sebagian besar xanton ditemukan pada

tumhuhan tinggi yang dapat diisolasi dari empat jenis suku, yaitu Guttiferae, Moraceae,

Polygalaceae dan Gentianaceae.

Struktur zanton tersusun atas C6-C1-C6. Karena pada hidroksinya, xanton menunjukan

kaitan biogenesis dengan flavonoid. Atas dasar tersebut jalur biosintesisnya xanton sangat

terkait denagn jalur biosintesis flavonoid.

Xanton merupakan turunan dari benzofenon. Diperkirakan neoflavonoid merupaka

prazat dari benzofenon dan benzofenon merupakan prazat dari xanton. Xanton terbentuk dua

cara yang berlainan, yaitu dengan menambahkan dua satuan C ke prazat C6-C3 atau

menambahkan tiga satuan ke turunan asam benzoat.

Kemungkinan jalur biosintesis xanton yang berasal dari suku Gentianaceae

dipostulatkan oleh Inouye & Nakamura (1971). Jalur biosintesis tersebut berasal dari jalur

sikimat dan malonat dengan benzofenon sebagai intermedietnya.

Studi pada suku Moraceae dan polygalaceae menunjukan keterbatasan

penyebarannya hanya pada beberapa jenis saja. Kebanyakan xanton terdistribusi luas pada

tumbuhan tinggi dan tumbuhan paku dalam bentuk tetra-oksigenasi xanton-C-glukosida,

sebagai contoh adalah mangiferin. Tetapi untuk O-glikosida dari jenis xanton tersebut dapat

ditemukan juga.

Xanton dilaporkan memiliki berbagai efek farmakologi di dalam tubuh. Difurananton

merupakan hepatotoksik dan karsinogenik yang kuat, seperti aflatoksin. Xanton yang

ditemukan pada suku Guttiferae dilaporkan memiliki aktivitas antileukimia dan memilki

aktivitas terhadap sistem saraf pusat. Xanton pada suku Gentianaceae memiliki aktivitas

antibakteri dan berpengaruh pada sistem saraf pusat. Aglikon xanton yang ditemukan pada

Canscora decussata (suatu tumbuhan yang digunakan pada sistem pengobatan Indian)

memiliki aktivitas antituberkulosis secara in vitro terhadap Mycobacterium tuberculosis H37.

Xanton-C-glukosida mangiferin memiliki efek stimulasi terhadap sistem saraf pusat. Xanton

jenis gentisin dari akar Gentiana Iutea dan glukosida-C-mangiferin berasal dari akar

Mangifera indica memiliki aktivitas sebagai antitumor dan inhibitor monoamin oksidase.

Beberapa xanton memiliki aktivitas antifungi, antiinflamasi dan menginhibisi agregasi

platelet. Xanton yang ditemukan pada kulit buah manggis dilaporkan memiliki aktivitas HIV

I prot8ease dan menghambat cAMP fosfodiesterase.