SKRINING FITOKIMIA Skrining fitokimia merupakan penelitian pendahuluan yang bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman, yang biasanya punya aktivitas biologi, secara tepat dan teliti.

Karena tujuannya untuk mengetahui golongan senyawa apa saja yang terkandung dalam sampel, maka untuk ekstraksi awal harus digunakan pelarut yang dapat melarutkan senyawa-senyawa yang bersifat, polar, semipolar, maupun nonpolar.

• Pelarut yang digunakan untuk melakukan ekstraksi awal adalah etanol 80% atau metanol 80%. Kedua pelarut tersebut bersifat polar sehingga dapat melarutkan senyawa baik yang bersifat polar, semipolar, maupun nonpolar.

Preparasi ekstrak utk skrining

• Masukkan 100 g simplisia kering kdlm erlenmeyrer 500 ml

• Tambahkan etanol 80% atau metanol 80%• Panaskan diatas w.b. selama 1 jam, utk

mencegah penguapan tutup dg kapas• Dinginkan pd suhu kamar dan saring kdlm labu

erlenmeyer 500 ml• Tekan simplisia dg beker sampai etanol atau

metanol habis, catat volume yg diperoleh. Volume ini digunakan utk ekivalensi dg berat simplisia

Skrining utk gol alkaloid

• 1. 1. Preparasi sampel• 1. Ekstrak sebanyak 0,3 gram ditambah 5

ml HCl 2N, dipanaskan di atas penangas air selama 2 -3 menit, sambil diaduk.

• 2. Setelah dingin ditambah 0,3 gram NaCl, diaduk rata kemudian disaring.

• 3. Filtrat ditambah 5 ml HCl 2N. Filtrat dibagi tiga bagian dan disebut sebagai larutan IA, IB, dan IC.

1.2. Reaksi pengendapan

1. Larutan IA ditambah pereaksi Mayer, larutan IB ditambah dengan pereaksi Wagner dan larutan IC dipakai sebagai blanko.

2. Adanya kekeruhan atau endapan menunjukkan adanya alkaloid

Ada beberapa macam pereaksi pengendapan utk alkaloid. Krn sensivitas yg berbeda-beda, disimpulkan ada alkaloid bila positif thd 2 pereaksi. Idealnya, positif thd 4 – 5 pereaksi

.

Macam-macam pereaksi pengendapan alkaloid

• Bouchardat• Dragendorf• Mayer• Wagner• Valser• Ecolle• Gold chloride• Hager• Kraut• Marme• Platinum chloride

Senyawa yg memberikan positif palsu thd pereaksi alkaloid

• Protein• Glikosida dan karbohidrat tertentu• Betain• Kholin• Purin• Tanin• Garam-garam amoniak• Amin yg termetilasi• Derivat pyron : yangoin, kawain, dihidrokawain,

methysticin• Seny orgnk yg memiliki gugus karbonil yg terkonjugasi

atau gugus fungsi lakton

1.3. Kromatografi lapis tipis1. Larutan IC ditambah NH4OH 28% sampai

larutan menjadi basa, kemudian diekstraksi dengan 5 ml kloroform bebas air, lalu disaring

2. Filtrat diuapkan sampai kering, kemudian dilarutkan dalam metanol dan siap untuk pemeriksaan dengan KLT

• Fase diam : Kiesel gel GF 254• Fase gerak : Etil asetat - metanol - air (100 :

16,5 :13,5)• Pada praktikum ini perband. eluen (6 : 4 : 2)• Penampak noda: Pereaksi Dragendorf3. Jika timbul warna jingga menunjukkan adanya

alkaloid dalam ekstrak.

Skrining utk gol glikosida saponin

• 2.1. Uji buih• 1. Ekstrak sebanyak 0,3 gram dimasukkan

tabung reaksi, kemudian ditambah air suling 10 ml, dikocok kuat-kuat selama kira-kira 30 detik.

• 2. Tes buih positif mengandung saponin bila terjadi buih yang stabil selama lebih dari 30 menit dengan tinggi 3 cm di atas permukaan cairan.

2.2. Reaksi warna• 0,3 gram ekstrak dilarutkan dalam 15 ml etanol,

lalu dibagi menjadi tiga bagian masing-masing 5 ml, disebut sebagai larutan IIA, IIB, dan IIC

Uji Liebermann-Burchard

1. Larutan IIA digunakan sebagai blanko, larutan IIB sebanyak 5 ml ditambah 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat, lalu dikocok perlahan dan diamati terjadinya perubahan warna.

2. Terjadinya warna hijau biru menunjukkan adanya saponin steroid, warna merah ungu menunjukkan adanya saponin triterpenoid dan warna kuning muda munjukkan adanya sapogenin jenuh.

Uji Salkowski

1. Larutan IIA digunakan sebagai blanko, larutan IIC sebanyak 5 ml ditambah 1 - 2 ml H2SO4 pekat melalui dinding tabung reaksi.

2. Adanya steroid tak jenuh ditandai dengan timbulnya cincin warna merah.

2.3. Identifikasi sapogenin steroid/triterpenoid

1. Ekstrak sebanyak 0,5 gram ditambah 5 ml HCl 2 N, didihkan dan tutup dengan corong berisi kapas basah selama 2 jam untuk menghidrolisis saponin.

2. Setelah dingin, netralkan dengan ammonia, kemudian ekstraksi dengan 3 ml n-heksana sebanyak 3 kali, lalu uapkan sampai tinggal 0,5 ml, totolkan pada pelat KLT.

Fase diam : Kiesel Gel GF 254

Fase gerak : n-heksana – etil asetat (4 : 1)

Penampak noda: - Anisaldehida asam sulfat

- Antimon klorida

3. Adanya sapogenin ditunjukkan dengan terjadinya warna :

- merah ungu (ungu) atau kuning utk

anisaldehida asam sulfat

- merah muda utk antimon klorida

2.4. Identifikasi terpenoid/steroid bebas secara KLT

1. Sedikit ekstrak ditambah beberapa tetes n-heksana, diaduk sampai larut, totolkan pada fase diam.

2. Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan :• Fase diam : Kiesel gel GF 254• Fase gerak : n-heksana - etil asetat (4 : 1)• Penampak noda : Anisaldehida asam sulfat

Skrining utk gol flavonoid

3.1. Preparasi sampel

1. 0,3 gram ekstrak dikocok dengan 3 ml n-heksana berkali-kali sampai ekstrak n-heksana tidak berwarna.

2. Residu dilarutkan dalam etanol dan dibagi menjadi 4 bagian, masing-masing disebut sebagai larutan IIIA, IIIB, IIIC, dan IIID.

3.2. Reaksi warna

Uji Bate-Smith dan Metcalf

1. Larutan IIIA sebagai blanko, larutan IIIB ditambah 0,5 ml HCl pekat dan diamati perubahan warna yang terjadi, kemudian dipanaskan di atas penangas air dan diamati lagi perubahan warna yang terjadi.

2. Bila perlahan-lahan menjadi warna merah terang atau ungu menunjukkan adanya senyawa leukoantosianin (dibandingkan dengan blanko).

• Uji Wilstater

1. Larutan IIIA sebagai blanko, larutan IIIC ditambah 0,5 ml HCl pekat dan 4 potong magnesium.

2. Diamati warna yang terjadi, diencerkan dengan air suling, kemudian ditambah 1 ml butanol.

3. Diamati warna yang terjadi di setiap lapisan. Perubahan warna merah jingga menunjukkan adanya flavon, merah pucat menunjukkan adanya flavonol, merah tua menunjukkan adanya flavanon.

3.2. Kromatografi lapis tipis

1. Larutan IIID ditotolkan pada fase diam.

2. Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan :

Fase diam : lapisan tipis selulosa

(diganti Kiesel Gel GF 254)

Fase gerak : butanol- asam asetat glasial-air

(4 : 1 : 5)

Penampak noda : - pereaksi sitrat borat atau

- uap amonia

3. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan timbulnya noda berwarna kuning intensif.

4. Noda kuning yang ditimbulkan oleh uap ammonia akan hilang secara perlahan ketika amonianya menguap meninggalkan noda.

5 Sedangkan noda kuning yang ditimbulkan oleh pereaksi sitrat-borat sifatnya permanen.

Fase gerak tsb. biasa disebut BAW (Butanol, Acetic acid, Water). BAW dibuat dengan cara mencampur ketiga komponen tsb. dengan perbandingan B : A : W = 4 : 1 : 5, maka akan terjadi 2 lapisan. Lapisan atas diambil dan dipakai sebagai fase gerak untuk mengeluasi senyawa gol. flavonoid.

Skrining utk gol. polifenol & tanin

4.1. Preparasi sampel

1. 0,3 gram ekstrak ditambah 10 ml akuades panas, diaduk dan dibiarkan sampai temperatur kamar, lalu tambahkan 3 – 4 tetes 10% NaCl, diaduk, dan disaring.

2. Filtrat dibagi menjadi tiga bagian masing-masing + 4 ml dan disebut sebagai larutan IVA, IVB, dan IVC.

4.2. Uji gelatin1. Larutan IVA digunakan sebagai blanko, larutan

IVB ditambah dengan sedikit larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%.

2. Jika terjadi endapan putih menunjukkan adanya tanin.

4.3. Uji ferriklorida1. Sebagian larutan IVC diberi beberapa tetes

larutan FeCl3, kemudian diamati terjadinya perubahan warna.

2. Jika terjadi warna hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.

3. Jika pada penambahan gelatin dan NaCl tidak timbul endapan tetapi setelah ditambahkan dengan larutan FeCl3 terjadi perubahan warna menjadi hijau biru hingga hitam, menunjukkan adanya senyawa polifenol.

FeCl3 positif, uji gelatin positif tanin (+)

FeCl3 positif, uji gelatin negatif

polifenol (+)

FeCl3 negatif polifenol (-), tannin (-)

4.4. Kromatografi lapis tipis

Sebagian lar. IVC digunakan utk pemeriksaan dengan KLT.

Fase diam : Kiesel gel GF 254

Fase gerak : Kloroform - Etil asetat – Asam

formiat ( 0,5 : 9 : 0,5 )

Penampak noda : Pereaksi FeCl3

Jika timbul warna hitam menunjukkan adanya polifenol dalam sampel.

Skrining utk gol. antrakinon5.1. Reaksi warnaUji Borntrager1. Ekstrak sebanyak 0,3 gram diekstraksi dengan

10 ml akuades, saring, lalu filtrat diekstraksi dengan 5 ml benzena dalam corong pisah. (Benzena diganti dg. toluena)

2. Ekstraksi dilakukan sebanyak dua kali. Kemudian fase benzena dikumpulkan dan dibagi menjadi dua bagian, disebut sebagai larutan VA dan VB.

3. Larutan VA sebagai blanko. larutan VB ditambah amonia dan dikocok.

4. Warna merah menunjukkan adanya senyawa antrakinon.

Uji modifikasi Borntrager

1. Ekstrak sebanyak 0,3 gram ditambah dengan 5 ml KOH 0,5 N dan 1 ml H2O2 encer.

2. Dipanaskan dan disaring, filtrat ditambah asam asetat glasial, kemudian diekstraksi dengan benzena (benzena diganti dg. toluena)

3. Fase benzena diambil dan dibagi menjadi dua sebagai larutan VIA dan VIB.

4. Larutan VIA sebagai blanko, larutan VIB ditambah amonia. Warna merah atau merah muda pada lapisan alkalis menunjukkan adanya antrakinon.

5.2. Kromatografi lapis tipis

1. Sampel ditotolkan pada fase diam. Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan :

Fase diam : Kiesel gel GF 254

Fase gerak : benzena - etil asetat - asam

asetat glasial (75 : 24 : 1)

Dalam praktikum benzena diganti dg. toluena

Penampak noda : larutan 10% KOH dalam metanol.

2. Timbulnya noda berwarna kuning, kuning coklat, merah ungu atau hijau ungu menunjukkan adanya senyawa antrakinon.

Glikosida sianohidrin

adalah : Seny nitril atau organik sianida yg terdistribusi luas pada tanaman. Struktur umumnya sbb :

O – – glikosil l R - C - CN l R’Pd hidsrolisis enzimatik tdk diperoleh aglikon,

tetapi asam sianida. Proses ini dikatalisis oleh 2 mcm enzim yi : glikosidase dan oksinitrilase. Pembentukan asam sianida terjadi bila tanaman terluka/jaringan pecah, tapi asam sianida tdk akan terbentuk bila pd tanaman tdk tdpt kedua enzim diatas

O – – glikosil OH O

l l ll

R - C - CN -----> R - C – CN -----> R - C – R’ + HCN

l l

R’ R’

Scr mdh pembentukan asam sianida bisa diketahui sbb :

1. Patah-patahkan simplisia segar, masukkan kdlm tabung reaksi bertutup

2. Masukkan kertas saring yg telah dicelupkan kdlm asam pikrat yg sdh dibasakan

3. Warna kuning akan berubah menjadi merah bila terdapat asam sianida

Skrining utk gol.Glikosida Sianohidrin

Reaksi Warna Tes Grignard 2-5 gram serbuk ditambah air secukpnya,

kemudian ditambahkan 1 mL CHCl3. kemudian ditutupi gabus dengan diselipi kertas pikrat. Kertas pikrat tidak boleh menyentuh cairan kemudian dipanaskan pada suhu 35o – 40o C atau didiamkan selam 3 jam kemudian diamati perubahan warna pada kertas pikrat.

Positif bila terjadi bayangan merah pada kertas pikrat.