Nama : Nurul Fitria Asisten : Rian pratiwi (G34070045)

Nrp : G34080066 Lida puspaningtyas (G34070062)

Kelompok : 16 Yulita Fitrianna (G34062968)

ISOLASI (ELUSI) FRAGMEN DNA PLASMID DARI GEL AGAROSE

Pendahuluan

Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Fragmen DNA yang tidak tercampur dengan fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa tahap. Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR, yang dilanjutkan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose yang mengandung fragment tersebut. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada membran Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat.

Metode

Pertama, gel agarose yang terdapat fragmen DNA dipotong-potong dalam cawan petri. Buatlah corong dari membran nilon hybond N, membran dibasahi 50ul dengan buffer elusi. Masukkan potongan-potongan DNA kedalam corong yang dipasang di tabung effendof baru, lalu masukkan 150ul buffer elusi. Setelah itu sentrifugasi 14000 rpm selama 2 menit. Tambahkan 100ul buffer elusi,kemudian disentrifugasi lagi 14000 rpm selama 5 menit. Setelah di sentrifugasi, ambil 500ul filtrat dan tambahkan 0,1 volume NaOAC. Tambahkan juga 2-3 volume ETOH 100%, kemudian di freezer selama 30 menit. Sentrifugasi 14000 rpm selama 10-15 menit dengan suhu 40c. Setelah disentrifugasi, pelet diambil dan ditambahkan dengan ETOH 70%. Disentrifugasi kembali 14000 rpm selama 5 menit. Setelah itu dikeringkan, dan ditambahkan ddH2O 10 ul.

Hasil pengamatan

Elusi atas Elusi bawah

Pembahasan

Teknik elusi atau disebut juga teknik preparasi gel elektroforesis merupakan tekni isolasi fragmen DNA plasmid dari gel agarosa. Tujuan dilakukannya teknik elusi adalah untuk mengisolasi fragmen tunggal DNA yang diinginkan misalnya dalam sebuah penelitian dikatakan teknik ini digunakan untuk mengisolasi protein spesifik dalam intestin suatu organisme (Fitriyah 2006). Fragmen DNA yang diisolasi dengan teknik ini dalam praktikum yang dilakukan yaitu fragmen DNA yang didapat dari hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi pada praktikum sebelumnya. Pada praktikum ini tidak digunakan perangkat kit, tetapi menggunakan metode yang sederhana, keuntungan dari metode ini adalah murah, prosedurnya lain tetapi memiliki kemiripan. Senyawa yang digunakan dalam praktikum ini yaitu berupa larutan penyangga elusi yang terdiri dari Tris pH 7.5, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), H2O atau TE. Fungsi dari larutan penyangga elusi ini yaitu untuk menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbangan sel agar tidak lisis (Lodish et al 1995). SDS merupakan suatu detergen fungsinya yaitu membantu proses pelisisan sel dengan cara melarutkan fosfolipid pada membran sel dan mendenaturasi protein sehingga membran sel akan mengalami kerusakan (Brown 1991).

Fungsi membran nilon hybond N adalah untuk menyaring DNA dari gel agarosa. Hasil pengamatan dapat dilihat bahwa banyak sumur yang berhasil. Gambar elusi atas menunjukkan vektor, sedangkan elusi bawah menunjukkan hasil insert. Kemungkinan tidak berhasilnya isolasi diakibatkan oleh beberapa hal misalnya gel agarosa yang dipotong dari hasil restriksi sebelumnya tidak mengandung fragmen DNA yang hendak diisolasi. Pemotongan tidak pada tempat yang tepat yang mengandung DNA. Saat pencacahan terjadi kontaminasi, dan kemungkinan lain adalah karena ukuran DNA yang sangat kecil juga tidak terihat hilang saat proses isolasi dilakukan, misal saat penyaringan dengan nylon hybond DNA tidak tersaring.

Simpulan

Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa praktikum ini cukup berhasil. Kesalahan diakibatkan oleh praktikan yang kurang teliti dalam melakukan tahapan-tahapan percobaan yang mana dituntut bekerja dengan ketelitian tinggi serta steril. Karena bekerja dengan sesuatu yang berukuran mikro.

Daftar Pustaka

Brown, T.A. 1991. Pengantar Cloning Gen. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.

Fitriyah Juliani. 2006. Isolasi protein spesifik intestine cacing Mecistocirrus digitatus dewasa dengan teknik elusi. [Skripsi]. Surabaya: UNAIR Press

Lodish H et al.. 1995. Molecular Cell Biology. New York: Scientific American Books