Hani Susianti

PDS PATKLIN MALANG

Advancing Urinalysis and Its Standardization with Urine

Flowcytometry

• Penelitian oleh The George Institute for Global Health (2015): setiap tahun> dua jutaorang di dunia meninggal (bisadicegah)

• Jumlah terbesar dari kematianyang dapat dicegah ini terjadi di: Cina, India, Indonesia, Pakistan

• Skrining urinalisis di Jepangmembantu mengurangi kasusCKD

1. PENDAHULUAN

( Liyanage et al,The Lancet, vol 385, 2015 )

Standardisasi urinalisis:

• Pra-analitik

• Analitik

• Pasca-analitik

(Iseki, JMAJ 54(1): 27–30, 2011)

• Pra-analitik

Pengumpulan sampel, transportasi,

penyimpanan )

• Analitik

(reagen, instrumen, QC, kalibrasi,

maintenance, staff competency)

• Pasca-analitik

(reporting , interpretasi)

STANDARDISASI : QUALITY CONTROL URINALISIS

TAHAP PRA-ANALITIK:PERUBAHAN URINE TANPA PENGAWET

TAHAP ANALITIK

1. MAKROSKOPIS

volume, warna, bau, kejernihan

2. KIMIA

3. MIKROSKOPIS

4. KULTUR

BERAT JENIS

Prinsip : pengukuran konsentrasi ion di urin (polielektrolit)Menilai kemampuan ginjal dalam mengkonsentrasikan urin

Prinsip Pemeriksaan

Perkembangan Pemeriksaan

Perlu diperhatikan

BJ cenderung meningkat : - Proteinuria (100-500 mg/dl), ketoasidosis

BJ cenderung menurun : - Glukosa > 1000 mg/dl, urea yang berlebihan

Pembacaan scr visual : BJ ditambah 0,005 jika PH urin ≥ 7

Refraktometer pada autonalyser urine

Berdasar reaksi ion H dengan tes strip

(berisi Methyl red, phenolphtalein dan bromthymol

blue)

Perhatikan

Manfaat

Prinsip

Membantu menilai kemampuan tubulus ginjal

mempertahankan kadar ion hidrogen secara

normal

( PH urin normal : 4,6 sampai 8)

PEMERIKSAAN PH

PH meningkat : urine yang dibiarkan lama,

hilangnya karbon dioksida & pertumbuhan bakteri

dalam urine

PH menurun : urin yang berlebihan pada tes strip

membawa bufer asam pada tes protein ke tes PH

Protein

Prinsip : Indikator (tetrabromphenol blue) + albumin perubahan warna (protein error of indicator)

Prinsip Pemeriksaan

Perkembangan Pemeriksaan

Perlu diperhatikan

Positif palsu : urin mengandung pus dan eritrosit, kontaminasi dg sekret vagina, menstruasi, mucus atau cairan sperma, bufer urin yang alkali, penggunaan obat tertentu

Negatif palsu : urin sangat encer

Rasio albumin/kreatinin (ACR) dan protein/kreatinin (PCR) urin dalam 1 dipstik pemeriksaan urin rutin

• Metode oksidasi glukosa spesifik & peroksidase•Glukosuria : kadar glukosa darah > 160-180 mg/dl

Kadar glukosa darah, laju filtrasi glomerular, kecepatan reabsorbsi tubular dan aliran urin

Positif palsu : deterjenNegatif palsu : sodium flourida, asam askorbat dan keton dalam jumlah banyak, urin yang dibiarkan terlalu lama & BJ yang tinggi

PRINSIP DIPENGARUHI PERHATIKAN

Pemeriksaan Glukosa

KETON

Prinsip : asam asetoasetat + senyawa nitroprusid warna ungu

Prinsip Pemeriksaan

Perlu diperhatikan

Manfaat

Pemeriksaan keton urin pada DM membantu diagnosis awal ketoasidosis dan koma diabetikBenda keton yang terdapat pada keadaan ketonuria : aseton, asam β hidroksibutirat & asam asetoasetat

Positif palsu : adanya phenilketon, captopril, grup sulfhydril dllKeadaan asidosis : penilaian keadaan ketosis terlalu rendah asidosis akan membentuk asam β hidroksibutiratNegatif palsu : urin dibiarkan terlalu lama

Bilirubin + diazonium salt kompleks berwarna coklat sampai merah(Bilirubinuria : bila bilirubin plasma > 2 mg/dl)

Perhatikan

Manfaat

Prinsip

Menilai kerusakan parenkim hati,

gangguan ekskresi bilirubin

PEMERIKSAAN BILIRUBIN

Negatif palsu : vitamin C , asam salisilat, sampel yang terpapar sinar matahari Positif palsu : rifampisin dan piridium

Urobilinogen + diazonium salt warna merahUrobilinogen dibentuk bakteri usus dari bilirubin terkonjugasi

•Hasil tes positif : urobilinogen padakadar abnormal dalam sirkulasi karena kerusakan/disfungsi hati

Positif palsu : warna urin merah oranye, urin asam & adanya senyawa azo GantrisinNegatif palsu : terdapat formalin, urin yang dibiarkan terlalu lama urobilinogen tidak stabil jika terpapar cahaya dan udara

Urobilinogen

PRINSIP MANFAAT PERHATIKAN

DARAH

Heme akan mengkatalisis oxidized chromogen warna hijau(Prinsip : reaksi peroksidase, deteksi kadar hb 0,015 – 0,062 mg/dl)Tes positif : jml eritrosit abnormal (hematuria), hemoglobinuria atau mioglobinuria

Prinsip Pemeriksaan

Perlu diperhatikan

Manfaat

Penyebab hematuria: renal, postrenal, ekstra renal

Negatif palsu : urin tidak dikocok baik saat preparasi ,

adanya formalin

Positif palsu : urin terkontaminasi deterjen/pemutih

(hipokhlorit ), mikrobal peroksidase krn ISK

LEKOSIT ESTERASE

Prinsip : esterase di leukosit akan memecah indoxyl ester bereaksi dengan diazonium salt membentuk warna violet

(mendeteksi kadar hemoglobin 0,015 – 0,062 mg/dl urin)

Prinsip Pemeriksaan

Perlu diperhatikan

Manfaat

Mendeteksi leukosit esterase yang dihasilkan sel granulosit(Leukosit yang utuh/lisis dapat terdeteksi dengan tes ini)

Positif palsu : formaldehid, imipenam, meropenam, asam clavulanic , nitrofurantoin, bilirubin urin yang positif Negatif palsu : protein urin > 500 mg/dl, glukosa > 2 g/dl, penggunaan obat cefalexin dan gentamisin dosis tinggi

Reaksi nitrit + tetrahidrobenzoquinoline warna merah jambu

• Hasil positif : terdapat bakteri yg mereduksi nitrat nitrit

• Sebagian besar enterobactericeae mengubah nitrat menjadi nitrit, tidak semua bakteri di kandung kemih mengubah nitrat nitrit

Positif palsu : kontaminasi sampel, proliferasi bakteri krn sampel lama, sampel berwarna merahNegatif palsu : bakteri yang tidak mengubah nitrat menjadi nitrit, vitamin C, urobilinogen atau PH rendah (< 6)

Nitrit

PRINSIP MANFAAT PERHATIKAN

Hal yang perlu diperhatikan pada pemeriksaan dipstik

• Volume, waktu reaksi & pembacaan harus tepat

• Cahaya ruangan pembacaan

• Kemampuan staf berbeda utk membaca

• Warna intrinsik urin

• Kesalahan pelaporan hasil

• Sampel urin diperiksa kurang dari 1 jam

• Perbedaan nilai pada dipstik

URINE PARTICLES OF NEPHROLOGICAL IMPORTANCE

17

PEMERIKSAAN ERITROSIT

• Eritrosit berbentuk bikonkaf, Ø ± 7 mm, warna agak kekuningan

• Nilai normal <3/LPB

• Bentuk eritrosit : normal (eumorfik) atau dismorfik (autoanalyzer membantumembedakan)

• Eritrosit dismorfik kemungkinan terjadi pada kelainan glomerular (glomerulonefritis) terjadi destruksi eritrosit saat melewati struktur glomerular yang abnormal

• Bentuk : bulat, padat dan bergranula• Jumlah normal : kurang dari 5/LPB• Kelainan morfologi lekosit : Sel Gliter• Leukosit yang berbentuk clumping,

kemungkinan infeksi akut (pielonefritis, sistitis, atau urethritis), dalam pelaporanpenting disebutkan

• Leukosit akan menuju ke area peradangan, karena bersifat ameboiddapat menembus daerah yang berdekatan dengan tempat peradangan

PEMERIKSAAN LEUKOSIT

• Terdiri : sel tubuler, sel transisional & sel skuamus

• Sel tubuler : dari ginjal, > leukosit , inti besar berbentuk oval atau bulat.

Jumlah (>15 per 10 LPB) : ggn renal / trauma tubular, sindroma nefrotik (oval fat bodies)

• Sel transisional : dari ureter , kandung kemih, inti besar, ukuran sel lebih kecil dari sel skuamus.

SEL EPITEL

• Sel epitel skuamus : dari kulit atau uretra distal, vagina, perineum dan preputium

Diameter 30-50 μm, bentuk persegi/ bulat dg inti ditepi

Jumlah sangat meningkat kontaminasi dari kulit

• Silinder terbentuk di tubulus kontartus distal

• Faktor pendukung terbentuknya adalah aliran urin yang lambat, kadar garam yang tinggi, PH yang rendah, dan terjadinya denaturasi/presipitasi protein

• Silinder hialin terutama terbentuk dari mukoprotein ( protein Tamm Horsfall ) yang disekresi oleh sel tubulus dapat timbul pada orang yang sehat

PEMERIKSAAN SILINDER

• Silinder granular dan silinder lilin diperkirakan terbentuk dari sel tubulus renal yang berada dalam silinder yang mengalami degenerasi

• Silinder eritrosit : nampak pada glomerulonefritis.

• Silinder leukosit : nampak pada pyelonefritis akut

• Adanya bermacam-macam silinder kerusakan & dilatasi tubulus (tahap akhir penyakit ginjal kronik)

• Bakteri sering terdapat di dalam sampel urin krn adanya flora normal di vagina atau meatus eksternal urethra dan juga kemampuan bakteri untuk berkembang dengan cepat.

• Diagnosis bakteriuria ditegakkan dengan kultur.

• Adanya bermacam-macam jenis bakteri kemungkinan menunjukkan adanya kontaminasi, kecuali pada sampel pasien yang dipasang kateter

PEMERIKSAAN BAKTERI

Pemeriksaan Jamur (mikroskopis)

• Adanya jamur di urin kemungkinan suatu kontaminasi atau benar-benar suatu infeksi jamur.

• Jamur kadang sulit dibedakan dengan eritrosit dan kristal, namun jamur cenderung membentuk suatu budding

• Jamur yang sering adalah jenis kandida, yang kemungkinan membentuk kolonisasi di kandung kencing, urethra atau vagina.

• Kristal yang sering nampak pada orang sehat adalah kalsium oksalat, tripel phosphat dan amorf phosphat.

• Kristal yang jarang nampak adalah sistin, tirosin dan leusin

PEMERIKSAAN KRISTAL (MIKROSKOPIS)

1. Persiapan sampel

NCCLS : 12 ml urin disentrifugasi 450g (5 menit), buang

supernatan, sisakan 0,4 ml

JCCLS : 10 ml urin disentrifugasi 500g (5 menit), buang

supernatan, sisakan 0,2 ml

2. Unsur sedimen dalam supernatan setelah sentrifugasi

500g (5 menit) : bakteri 43%, eritrosit 28%, leukosit 18%, silinder 16% dan

epitel 3% (Ishii, 2005)

HAL PENTING PADA PEMERIKSAAN URINE

PERLU STANDARDISASI

PERBEDAAN PRESISI AUTOANALYZER (UF-1000)DAN MIKROSKOPIS MANUAL

Xiang et al, Clin. Lab. 2012;58:1-5

PEMERIKSAAN SEDIMEN URIN DENGAN

AUTOANALISER

Kelemahan pemeriksaan mikroskopis : Presisi kurang (variasi hasil pemeriksaan antar

pemeriksa)Membutuhkan waktu cukup banyak

Pemeriksaan secara mikroskopik masih diperlukan, khususnyauntuk mengevaluasi sel dan silinder yang terdapat di urin

CONVENTIONAL vs AUTOMATED

No CONVENTIONAL AUTOMATED (UF 500i)

1 Minimum 10 ml samples Minimum 4 ml samples

2 Needs a centrifuge No centrifuge needed

3 Needs decanting No decanting needed

4 Observer findings variance No variance in findings

5 No quality control Quality control available

30

• Format pelaporan berisi nilai normal (standard internasional : /uL) dan metodepemeriksaan

• Prosedur tertulis untuk melaporkan, mengevaluasi, dan mengoreksi kesalahan harusada.

• Laporan hasil mudah untuk ditafsirkan

STANDARDISASI PASCA ANALITIK

Pelaporan Hasil

AUTOANALYZER : Urine Flowcytometry

Laser Diode

Collimating Lens

Condenser

Lens

Condenser

Lens

Condenser

Lens

Flow cell

Photo Multiplier

Photo

Diode

Photo

Diode

Pin

Hole

Beam

Stopper

Dichroic

Mirror

Spectrum

Filter

Side Fluorescent

Light System

Side Scattered

Light System

Forward Scattered

Light System

Material genetik

Kompleksitas

Ukuran

Analysis ParameterRBCWBC

ECCASTBACT

Research Parameters X’TALYLCSRC

PATH.CASTMUCUSSPERMCond

• Pengenalan laser biru : meningkatkan kemampuan skrining bakteri

• Parameter diagnostik tambahan : casts and epithelial

• Pemeriksaan kimia UC-3500: menawarkan hingga 11 parameter strip uji

(termasuk albumin dan kreatinin dan lima parameter, dan membedakan

warna abnormal antara RBC dan hemoglobin)

Urine Flowcytometry

Staining in Surface Channel(UF-Fluorocell SF)

Following material is stained by the Lipid Bilayer MembranePorous Protein Agglutinate ( CASTs )

HYALINE CASTLipid Bilayer Membrane

THE POWER OF BLUE RESULTS

Nucleic acid specific

staining

Point 1Minute holes are made in the cell membrane while maintaining the morphology of the cells.

Point 2The dye enters the cell through these minute holes.

Point 3The nucleic acids are specifically stained. Screened on the basis of the stainability of

components containing nucleic acids

Cell membrane

DNA

36

THE POWER OF BLUE RESULTS

Deteksi ISK dengan Urine Flow cytometry analyzers

• Berdasarkan deteksi leukosit dan bakteri.

• Mengurangi jumlah sampel yang perlu dikultur (28% to 60%)

• Mengurangi resep antibiotikempiris yang tidak perlu

• Membantu membedakankemungkinan bakteri gram positifatau gram negatif

FLOWCYTOMETRY METHOD ON URINALYSIS : Scattergram B1

• Can be used to estimate gram type of bacteria

• Based on angle 30˚

• Can reduce inappropriate antibiotic using

Low Angle Pattern High Angle Pattern Board Angle Pattern

Gram negative bacteria Gram positive bacteria Mixed, or

Unclassified clearly

39

41

UTI STUDIES USING URINE FLOWCYTOMETRY

SIMPULAN

• Standarisasi urinalisis meliputi pra-analitik, analitik dan pasca-analitik

• Pemeriksaan kimia urine perlu memperhatikan manfaat, positif palsudan negatif palsu

• Pemeriksaan sedimen urine perlu melaporkan eritrosit dismorfik/ eumorfik, jenis epitel (sel tubulus), jenis silinder

• Flowcytometry urine autoanlyzer membantu standardisasipemeriksaan urine pada tahap pra-analitik, analitik dan pasca-analitik

• Flowcytometry urine autoanlyzer membantu memperkirakan ISK

TerimaKasih

Resume of essential differences between

BLD/RBC, LE/WBC, NIT/BACT and PRO/CAST

44

Blood v RBC Leucocyte esterase v WBC

Nitrite v Bacteria Protein v Cast

Blood RBC LE WBC Nit Bact Pro Cast

Different compounds are measured

Hemo globin

Intact RBC

LE which is released by PMN-WBC

All intact WBCs

Produced by gram negative bacteria

Gram negative and gram positive

Most sensitive to albumine

Comprised of different protein

Sensitivity 5-20 RBC/uL

1 RBC /ul

5-15 WBC/uL

1 WBC/uL

Depend on dietary nitrate and time of chemical conversion to occur

5 bacteria/uL

low levels of albumin not detected

1 cast/uL