BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan

rancangan true experimental-post test only control group design yang bertujuan

untuk mengetahui efek dari fitoestrogen yang terdapat pada susu kedelai yang

diberikan sejak umur satu bulan terhadap fungsi dari sistem reproduksi tikus

jantan (Rattus nevergicus strain Wistar) yang dilihat dari histopatologi vesika

seminalis.

4.2 Populasi dan Sampel Penelitian

4.2.1 Populasi

Populasi penelitian ini adalah tikus Rattus norvegicus strain Wistar yang

memenuhi kriteria sehat, jantan dengan umur yang sama satu bulan dan berat

sekitar 100 gram, setiap tikus diberi tempat yang cukup untuk menghindari

kematian maupun sakit.

4.2.2 Sampel

Tikus strain Wistar dibagi menjadi empat grup. Dengan satu sebagai

kontrol negatif dan ketiga lainnya diberi susu kedelai dengan dosis yang berbeda

4.2.3 Perkiraan Banyak Sampel

Total banyak sampel yang dipakai dihitung dengan rumus:

(t-1) (r-1) ≥ 15

(4-1) (r-1) ≥ 15

3 (r-1) ≥ 15

3r-3 ≥ 15

3r ≥ 15+3

24

25

r ≥ 18/3

r ≥ 6

Keterangan: t = perlakuan

r = pengulangan

Eksperimen ini memiliki empat kelompok, jadi sampel yang diperlukan

berjumlah dua puluh empat. Berarti setiap kelompok perlakuan memerlukan

sedikitnya enam tikus.

4.2.4 Karakteristik Sampel

Karakteristik sampel berupa tikus (wistar rats), kelamin jantan, berumur

satu bulan, berat tubuh 100 gram, sehat dengan indikasi bergerak aktif, bulu

bersih dan mata jernih, belum mendapatkan obat-obatan.

4.2.5 Kriteria Ekslusif

Tikus yang tidak makan dan minum ketika eksperimen, tikus yang

kondisinya memburuk, sakit pada waktu eksperimen dan mati.

4.3 Identifikasi Variabel

4.3.1 Variabel Tergantung

Variabel tergantung pada studi ini adalah histopatologi vesika seminalis

tikus Wistar yang diberi diet susu kedelai.

4.3.2 Variabel Bebas

Variabel bebas pada peneltian ini adalah susu kedelai dengan berbagai

konsentrasi.

4.4 Lokasi Dan Waktu Penelitian

4.4.1 Lokasi

Penelitian ini dikerjakan di laboratorium Farmakologi Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya.

26

4.4.2 Waktu

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Oktober 2013 sampai Januari 2014.

4.5 Instrumen Penelitian

4.5.1 Susu Kedelai

Alat yang dibutuhkan membuat susu kedelai yaitu alat timbangan,

tabung erlenmeyer, corong, dan batang pengaduk. Dan bahan yang dibutuhkan

yaitu bubuk susu kedelai, dan air aquades. Pemberian susu kedelai

menggunakan alat sonde.

4.5.2 Diet Normal

Alat yang dibutuhkan yaitu alat timbangan, analytic weights

measurement device, wadah/tempat makanan. Bahan yang dibutuhkan yaitu

tepung terigu, dedak jagung, dan air secukupnya.

4.5.3 Pembedahan dan Persiapan Slide Histopatologis

Alat yang dibutuhkan yaitu wadah plastik dengan penutupnya, pisau

operasi, kapas, gunting, pinset, mikroskop, mikrotom, dan kamera. Dan bahan

yang diperlukan yaitu kloroform, balok parafin, formalin 10%.

4.5.4 Pemeliharaan Tikus

Alat pengukur berat Sartorius, kandang tikus, penutup kandang,

sekam/serbuk kayu, botol minuman.

4.6 Definisi Operational

1. Fitoestrogen merupakan substansi dari tumbuhan yang memiliki sifat

mimikri estrogen.

2. Susu kedelai yang digunakan pada pada penelitian ini adalah susu

kedelai bubuk “unisoy”.

27

3. Tikus strain wistar yang digunakan pada penelitian ini, disediakan oleh

laboratorium farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,

4. Tikus dewasa adalah tikus yang telah mencapai usia 3 bulan.

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Persiapan Susu Kedelai

Susu kedelai dibuat dengan menggunakan mencampur susu kedelai

bubuk dengan air secukupnya. Perbandingan antara susu kedelai dan air yaitu 1

gram berbanding 2 ml air aquades.

4.7.2 Persiapan Tikus Wistar

Selama proses adaptasi, semua kelompok tikus diberi diet normal.

Masing-masing tikus mendapatkan 40 gram dari campuran bahan dedak jagung

dan dan diberikan secara ad libitum. Semua tikus mendapatkan sinar matahari

yang cukup selama 12 jam dan berada pada kegelapan selama 12 jam. Mereka

dipertahankan dalam kondisi ini pada laboratorium selama 7 hari sebelum

percobaan dilakukan.

4.7.3 Pemberian Susu Kedelai

Pemberian susu kedelai dilakukan per oral. 3 dosis berbeda diberikan

kepada 3 kelompok tikus. Awalnya tikus akan diberi diet standar sehingga

beratnya bertambah, selama masa adaptasi yang dilakukan selama satu minggu.

Kemudian pengambilan sampel akan dilakukan dengan teknik randomisasi,

sehingga setiap tikus akan mempunyai kesempatan yang sama dalam

mendapatkan dosis susu kedelai. Setelah itu, tikus akan dibagi menjadi 4

kelompok.

Kelompok 1 – Akan diberikan diet normal.

Kelompok 2 – Akan diberikan diet normal dan susu bubuk kedelai dengan 16

mg/kgBB.

28

Kelompok 3 – Akan diberikan diet normal dan susu bubuk kedelai dengan 32

mg/kgBB.

Kelompok 4 – Akan diberikan diet normal dan susu bubuk kedelai dengan 64

mg/kgBB.

4.7.4 Pembedahan Tikus Wistar

Prosedur ini dikerjakan dengan bantuan dari analis laboratorium

Farmakologi. Tikus yang akan dibedah diberikan anestesi terlebih dahulu dengan

menggunakan eter. Pemberian eter dilakukan secara inhalasi pada tangki

tertutup. Tikus yang telah di anastesi kemudian ditempatkan pada meja bedah

dan di fiksasi. Sebelum pembedahan, dilakukan pemeriksaan bagian luar terlebih

dahulu. Setelah itu mengidentifikasi letak buli-buli tikus. Dua kelenjar yang

terdapat pada bagian kanan dan kiri buli-buli adalah vesika seminaris. Bentuk

dari vesika seminalis seperti sayap. Vesika seminalis kemudian diambil dengan

dipotong dengan menggunakan gunting bedah, dengan cara dipisahkan dari buli-

buli. Vesika seminalis yang sudah dipisahkan dihitung beratnya. Setelah itu

dimasukkan pada tabung yang berisi formalin 10% untuk mencegah autolisis

jaringan dan pembusukan.

4.7.5 Pembuatan Slide Histopatologi Tikus Wistar

Setelah fiksasi, spesimen dipotong kecil supaya dapat diolah menjadi

bagian mikroskopis tipis dengan cara dehydration, clearing, dan embedding.

Dehydration merupakan proses merendam spesimen dalam alkohol untuk

menghilangkan air dan formalin, sementara clearing dilakukan untuk

membersihkan spesimen dari alkohol. Langkah terakhir yaitu embedding, dengan

landasan menggunakan balok parafin supaya terbentuk matriks yang

memungkinkan pemotongan yang tipis. Langkah selanjutnya menggunakan

mikrotom untuk memotong jaringan menjadi bagian yang sangat tipis. Kemudian

29

dilakukan pengecatan hematoksilin dan eosin setelah itu spesimen dapat diamati

di mikroskop. Kemudian di ambil gambar mikroskopis menggunakan kamera.

4.8 Alur Penelitian

Random Sampling

Kelompok 2

Diet Normal + Susu

Kedelai 16 mg/kg

Kelompok 4

Diet Normal + Susu Kedelai

64 mg/kg

Kelompok 3

Diet Normal + Susu

Kedelai 32 mg/kg

Kelompok 1

Diet Normal

Observasi setelah 3 bulan

Histopatologi Vesika Seminalis

Analisis data

24 Tikus Wistar

Dissection Vesika seminalis

30

4.9 Pengolahan Dan Analisis Data

Spesimen dibuat dalam bentuk sediaan preparat histo – PA dari vesica

seminalis, yang dilakukan pengecatan HE, dan dilakukan pemeriksaan

abnormalitas kelenjar vesika seminalis, sel Leydig, germ cell dan sperma. Data

yang didapatkan pada penelitian akan dianalisis dengan berbagai cara. Pertama,

tes homogenitas varian dilakukan untuk mengetahui apakah data ini homogen

atau tidak. Kedua, untuk mengetahui perbedaan di setiap intervensi, dilakukan

tes one way ANOVA digunakan dengan menggunakan software SPSS

(Statistical Product and Service Solution). Dalam hubungannya dengan ANOVA,

post-hoc analysis (Turkey’s range test) dilakukan untuk melihat perbandingan

dari setiap intervensi. Langkah ketiga menggunakan uji korelasi untuk

mengetahui apakah ada kekuatan yang signifikan dari hubungan antara

peningkatan konsentrasi dari susu kedelai dengan kondisi abnormalitas

histopatologi vesika seminalis dan sperma pada tikus Wistar. Dan yang terakhir

simple linear regression dihitung untuk memprediksi nilai variabel tergantung dari

variabel bebas. Selain itu, pengujian hipotesis dilakukan dengan cara mencari

nilai confidence level dan p value.