Post on 02-Feb-2023
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN GABUS (Channa striata) BERDASARKAN REGION DNA MITOKONDRIA CYTOCHROME
OXIDASE SUBUNIT I (COI) PADA DAERAH SUNGELEBAK, KABUPATEN LAMONGAN, JAWA TIMUR
SKRIPSI
Oleh:
AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA
NIM. 175080500111036
PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG 2021
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN GABUS (Channa striata) BERDASARKAN REGION DNA MITOKONDRIA CYTOCHROME
OXIDASE SUBUNIT I (COI) PADA DAERAH SUNGELEBAK, KABUPATEN LAMONGAN, JAWA TIMUR
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Meraih Gelar Sarjana Perikanan
di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Brawijaya
Oleh:
AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA
NIM. 175080500111036
PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG 2021
SKRIPSI
ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN GABUS (Channa striata) BERDASARKAN REGION DNA MITOKONDRIA CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) PADA
DAERAH SUNGELEBAK, KABUPATEN LAMONGAN, JAWA TIMUR
Oleh:
AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA NIM. 175080501111014
Telah dipertahankan didepan penguji pada tanggal 28 Juni 2020
dan dinyatakan telah memenuhi syarat
Dosen Pembimbing 1
Menyetujui, Dosen Pembimbing 2
Wahyu Endra Kusuma, S.Pi, MP, D.Sc. NIP. 19820826 200912 1 002 Tanggal:
Fani Fariedah, S.Pi., M.P. NIP. 2012088203082001 Tanggal:
Mengetahui: Ketua Jurusan
Manajemen Sumberdaya Perairan
Dr. Ir. M. Firdaus, MP. NIP. 19680919 200501 1 001 Tanggal:
DocuSign Envelope ID: 56C488EA-D004-4603-82D9-E4485C70F2B7
7/14/2021
7/14/20217/14/2021
DocuSign Envelope ID: 04048439-2D72-4697-9C95-9E924457735D
i
PERNYATAAN ORISINALITAS
Dengan ini Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama : Akhsan Fikrillah Paricahya
NIM : 175080500111036
Judul Skripsi : Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa striata)
Berdasarkan Region DNA Mitokondria Cytochrome Oxidase
Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak, Kabupaten
Lamongan, Jawa Timur
Menyatakan dengan sebenarnya bahwa penulisan skripsi ini berdasarkan hasil
penelitian, pemikiran dan pemaparan asli dari saya sendiri, baik untuk naskah,
tabel, gambar maupun ilustrasi lainnya yang tercantum sebagai bagian dari
Skripsi. Jika terdapat karya / pendapat / penelitian dari orang lain, maka saya
telah mencantumkan sumber yang jelas dalam daftar pustaka.
Demikian pernyataan ini saya buat, apabila di kemudian hari terdapat
penyimpangan dan ketidakbenaran dalam pernyataan ini, maka saya bersedia
menerima sanksi akademik sesuai dengan peraturan yang berlaku di Universitas
Brawijaya, Malang.
Demikian pernyataan ini saya buat dalam keadaan sadar tanpa adanya paksaan
dari pihak manapun.
Malang, 30 Juni 2021
Akhsan Fikrillah Paricahya
NIM.175080500111036
ii
IDENTITAS TIM PENGUJI
Judul : Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa striata)
Berdasarkan Region DNA Mitokondria Cytochrome
Oxydase Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak,
Kabupaten Lamongan, Jawa Timur
Nama Mahasiswa : Akhsan Fikrillah Paricahya
NIM : 175080500111036
Program Studi : Budidaya Perairan
PENGUJI PEMBIMBING:
Pembimbing 1 : Wahyu Endra Kusuma, S.Pi., MP., D.Sc.
Pembimbing 2 : Fani Fariedah, S.Pi., MP.
PENGUJI BUKAN PEMBIMBING
Dosen Penguji 1 : Dr. Ir. Abdul Rahem Faqih, M.Si.
Dosen Penguji 2 : Yuni Widyawati, S.Pi., MP.
Tanggal Ujian : 28 Juni 2021
iii
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulisan laporan skripsi dengan judul “Analisis Keragaman Genetik Ikan
Gabus (Channa striata) Berdasarkan Region DNA Mitokondria Cytochrome
Oxidase Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak, Kabupaten Lamongan, Jawa
Timur” ini merupakan produk dari dukungan berbagai pihak. Penulis
mengucapkan banyak terimakasih kepada berbagai pihak yang telah membantu
penulis dalam merampungkan laporan skripsi ini baik dari dukungan spiritual,
mental, materil dan sebagainya. Terimakasih tersebut penulis tujukan di
antaranya kepada:
1. Allah هلالج لج yang telah memberikan nikmat serta karunianya kepada penulis
sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan skripsi ini sebagai salah
satu syarat kelulusan studi penulis di Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan Universitas Brawijaya.
2. Keluarga (terlebih orang tua), kerabat dan lingkungan (terutama lingkaran
terdekat) penulis yang telah turut andil dalam mendidik, mendewasakan
serta mendukung penulis hingga titik ini dalam berbagai aspek termasuk
aspek karir dan pendidikan penulis.
3. Bapak Wahyu Endra Kusuma, S.Pi, MP, D.Sc selaku dosen pembimbing
pertama penulis dan Ibu Fani Fariedah, S.Pi., M.P selaku dosen
pembimbing kedua yang telah membimbing serta mengarahkan penulis
dalam menyusun dan menyelesaikan laporan skripsi ini.
4. Guru serta tenaga pengajar baik formal dan non-formal yang telah
memberikan pengajaran terbaik pada penulis baik dalam akademik
maupun non-akademik.
iv
5. Teman-teman dan kakak tingkat dalam tim genetika yang telah mengajari
serta membuat ataupun berbagi cerita dan pengalaman berharga.
v
RINGKASAN
AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA. Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus
(Channa striata) Berdasarkan Region DNA Mitokondria Cytochrome Oxydase
Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur (di
bawah bimbingan Wahyu Endra Kusuma dan Fani Fariedah)
Ikan dari keluarga Channidae terutama ikan gabus (Channa striata) tersebar luas dari Asia Tenggara hingga Asia Selatan sehingga memungkinkan terjadinya perbedaan secara genetik yang tinggi. Perbedaan tersebut bisa jadi dikarenakan isolasi populasi secara geografis dan ikan dari keluarga Channidae di Indonesia terdistribusi secara alami di Paparan Sunda. Populasi C. striata di Daerah Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo di Kabupaten Lamongan, Jawa Timur pernah dilaporkan sebagai populasi unggul dari segi kandungan protein albumin dibanding populasi lainnya pada suatu penelitian. Bengawan Solo merupakan sungai terpanjang di Jawa sehingga diasumsikan dapat menggambarkan keragaman biota air tawar di sekitar alirannya. Target evaluasi kajian genetika ini adalah Cytochrome Oxydase sub-unit I (COI) pada DNA mitokondria (mtDNA). Keunggulan mtDNA adalah tidak terpengaruh oleh persilangan, sangat sedikit intron, laju mutasi tinggi dan lainnya. Situs COI dalam mtDNA memiliki kelebihan bersifat lestari dan sedikit mengalami delesi maupun insersi. Analisa keragaman genetik dapat menunjukkan kemampuan suatu populasi menghadapi ancaman seperti penyakit, parasit, predasi dan perubahan lingkungan. Urgensi kegiatan domestikasi dan budidaya beserta efektif tidaknya untuk mendapat hasil terbaik akan sangat terbantu dengan mengetahui kondisi populasi.
Keragaman genetik diuji berdasarkan indeks keragaman dan diferensiasi genetik, indeks keragaman akan menganalisa kondisi intrapopulasi sementara diferensisi genetik menguji interpopulasi. Indeks keragaman menunjukkan beberapa analisa seperti jumlah haplotipe (h), keragaman haplotipe (Hd) dan keragaman nukleotida (π). Pengujian keragaman genetik suatu spesies dapat dikaji dengan spesies berbeda secara taksonomi seperti C. striata dengan Channa gachua/ Channa limbata. Data pembanding merupakan populasi C. gachua/ C. limbata yang ditemukan di daerah Malang, Kediri, Mojokerto, Jawa Tengah, Jawa Barat, Pulau Bali dan Sumatra. Uji tersebut menunjukkan hasil indeks keragaman populasi C. striata di Kabupaten Lamongan adalah h = 3, Hd = 0,644 dan π = 0,00296. Populasi Lamongan dinyatakan memiliki keragaman genetik mendekati rendah dengan indikasi pasca mengalami penurunan kualitas dan mulai berekspansi. Diferensiasi genetik populasi Kabupaten Lamongan dengan populasi lain terendah adalah 0.92533 (dengan populasi Jawa Barat) hingga tertinggi 0.98820 (dengan populasi Mojokerto) sehingga angka tersebut merupakan angka spesiasi spesies C. striata dengan C. gachua atau C. limbata
di penelitian ini. Upaya domestikasi yang dapat diambil adalah pemijahan secara inter-populasi.
Kata Kunci: Indeks Keragaman, Paparan Sunda, Populasi, Regional Ekologis,
Spesies
vi
SUMMARY
AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA. Genetic Diversity Analysis of Striped
Snakehead (Channa striata) Based on Mitochondrial DNA‟s Region Cytochrome
Oxydase Subunit I (COI) in Sungelebak, Lamongan Regency, East Java (under
the guidance of Wahyu Endra Kusuma and Fani Fariedah)
Channidae familys member especially striped snakehead fish (Channa
striata) is got wide distribution from Southeast Asia to South Asia and that is the reasonable thing occur differentiation of their genetics significantly. It can be occur because isolated condition among their populations geographicaly and from Indonesian archipelago, Channidae is naturally only distributed in Sundaland Region. Channidae population in Indonesian Archipelago that not from Sundaland Region is introduction population like population from Lesser Sunda Islands, Wallacea and Sahul Shelf Region. C. striata population from Bengawan Solo Watersheds in Lamongan Regency, East Java once reported has a better characteristic of population in terms of albumin protein in that research. Bengawan Solo is the longest river on Java Island and assumed can represent and describe biodiversity around it. Evaluation target in this genetic study is Cytochrome Oxydase sub-unit I (COI) from mitochondrial DNA (mtDNA). Advantages of using mtDNA is the mtDNA isn‟t affected by mating combination, lack of introns, high mutation rate etc. COI region from mtDNA has advantages in its characteristics as conserve and slightly got deletion nor insertion. Genetic diversity analyzing study can showing a populations ability agains threats as deseases, parasites, predation and environmental changes. The urgency of domestication and aquaculture with its point of effectivity to get the best results will be helped a lot by knowing populations condition.
Genetic diversity in this study based on diversity index and genetic differentiation, diversity index will analyzing condition of intrapopulation then genetic differentiation will analyzing condition of interpopulation. Diversity index will show several analyzed value as the number of haplotype (h), haplotype diversity (Hd) and nucleotide diversity (π).Genetic diversity study can be apply between a population to the other that identified to a different species taxonomicaly as C. striata population to Channa gachua/ Channa limbata population. Comparative data in this study is C. gachua/ C. limbata found from
several region as Malang, Kediri, Mojokerto, Central Java, West Java, Bali Island and Sumatra. Result from this study to diversity index of C. striata population in Lamongan Regency is h = 3, Hd = 0,644 and π = 0,00296. Genetic diversity of Lamongan population is near to be low and it means this population indicated to have quality decreased then now they‟re expanding. Genetic differentiation this population with the other populations in comparative data is from the lowest 0.92533 (with West Java population) up to the higest 0.98820 (with Mojokerto population) then that values be the speciation on species values between C. striata and C. gachua or C. limbata in this study. Domestication on Lamongan population can be start with cross-breeding with the other population. Key Words: Diversity Index, Ecoregion, Population, Species, Sundaland
vii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur atas kehadirat Allah Ta‟ala dan tidak lupa shalawat serta
salam penulis haturkan kepada junjungan umat Islam di seluruh dunia, Nabi
Muhammad Sholaullohu ‟Alaihi Was-Salam. Penyusunan dan penyelesaian
laporan skripsi ini tak lepas dari nikmat serta karunia Allah Ta‟ala, laporan
berjudul “Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa striata) Berdasarkan
Region DNA Mitokondria Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Daerah
Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur” telah
penulis selesaikan sebaik mungkin.
Mengingat tujuan disusunnya laporan skripsi ini untuk referensi kajian
genetika terutama dalam hal keragaman genetik pada ikan C. striata di aliran
Sungai Bengawan Solo, penulis berharap data serta informasi yang penulis
usahakan dalam laporan ini dapat dimanfaatkan di kemudian hari dengan
sebaik-baiknya. Pembuatan laporan ini juga dilakukan oleh penulis dengan
kesadaran bahwasannya di dalam laporan memungkinkan terdapat kesalahan
tutur kata, informasi, penulisan dan lain sebagainya yang berasal dari
kekurangan penulis pribadi hingga waktu laporan diselesaikan maka penulis
meminta maaf dan kemakluman pembaca. Akhir kata penulis ucapkan terima
kasih atas kesempatan dan kebijaksanaan pembaca.
Malang, 17 Februari 2021
Akhsan Fikrillah Paricahya NIM. 175080500111036
viii
DAFTAR ISI
Halaman
PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................................................. i
IDENTITAS TIM PENGUJI ......................................................................................ii
UCAPAN TERIMA KASIH .....................................................................................iii
RINGKASAN ...........................................................................................................v
SUMMARY ..............................................................................................................vi
KATA PENGANTAR .............................................................................................vii
DAFTAR ISI ..........................................................................................................viii
DAFTAR TABEL .....................................................................................................x
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................xi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................xii
BAB I. PENDAHULUAN .........................................................................................1
1.1 Latar Belakang ..........................................................................................1 1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................3 1.3 Tujuan Penelitian ......................................................................................3 1.4 Manfaat .....................................................................................................4
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................5
2.1 Biologi Ikan Gabus (C. Striata) .................................................................5 2.1.1 Klasifikasi dan Morfologi ...............................................................5 2.1.2 Habitat dan Penyebaran Ikan C. striata .......................................7 2.1.3 Siklus Reproduksi Ikan C. striata ..................................................7
2.2 Keragaman Genetik ..................................................................................8 2.3 Analisa Keragaman Genetik .....................................................................9
2.3.1 DNA Mitokondria ...........................................................................9 2.3.2 Metode Analisa ...........................................................................11
BAB III. METODE PENELITIAN ...........................................................................13
3.1 Tempat, Waktu dan Jadwal Pelaksanaan ..............................................13 3.2 Materi Penelitian .....................................................................................13
3.2.1 Alat Penelitian .............................................................................13 3.2.2 Bahan Penelitian .........................................................................14
3.3 Metode Penelitian ...................................................................................14 3.4 Teknik Pengambilan Data .......................................................................15 3.5 Prosedur Penelitian .................................................................................15
ix
3.5.1 Pengambilan Sampel ..................................................................15 3.5.2 Preparasi Spesimen ....................................................................17 3.5.3 DNA Sequencing ........................................................................22 3.5.4 Analisis Data ...............................................................................22
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................24
4.1 Koleksi Spesimen ...................................................................................24 4.2 Hasil Ekstraksi dan Amplifikasi ...............................................................27 4.3 Hasil Sekuensing ....................................................................................29 4.4 Komponen Basa Nukleotida ...................................................................32 4.5 Analisis Indeks Keragaman ....................................................................33
4.5.1 Analisis Indeks Keragaman Populasi Lamongan .......................34 4.5.2 Analisis Indeks Keragaman Seluruh Populasi ...........................36
4.6 Struktur Populasi atau Diferensiasi Genetik ...........................................39
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................................43
5.1 Kesimpulan .............................................................................................43 5.2 Saran .......................................................................................................43
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................45
GLOSARIUM .........................................................................................................49
LAMPIRAN ............................................................................................................52
x
DAFTAR TABEL
Tabel .......................................................................................................... Halaman
Tabel 1. Komoposisi Basa Nukleotida pada Seluruh Populasi ............................ 33 Tabel 2. Indeks Keragaman pada Seluruh Populasi ............................................ 35 Tabel 3. Anggota Dalam Grup Haplotipe pada Seluruh Populasi ....................... 36 Tabel 4. Diferensiasi Genetik pada Seluruh Populasi .......................................... 39
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
Gambar 1. Morfologi Ikan Channa striata. ............................................................. 6 Gambar 2. Struktur mtDNA yang Terdiri dari 37 Penyandi .................................. 10 Gambar 3. Skema Proses Ekstraksi Secara Garis Besar ................................... 18 Gambar 4. Skema Proses Amplifikasi Secara Garis Besar ................................. 20 Gambar 5. Skema Proses Elektroforesis Secara Garis Besar ............................ 21 Gambar 6. Ikan C. striata Dengan Tag CSL 06 ................................................... 25 Gambar 7. Foto Ikan Channa limbata dari Semenanjung Malaysia. ................... 26 Gambar 8. Foto Lokasi Perairan Sekitar Kawasan Sungelebak, Lamongan ...... 26 Gambar 9. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Ikan C. striata Lamongan ........... 27 Gambar 10. Contoh Hasil Visualisasi Elektroforesis. ........................................... 28 Gambar 11. Data Chromatogram yang Dibuka pada Aplikasi Chromas ............. 29 Gambar 12. Contoh Hasil BLAST pada Sampel CSL_01 .................................... 31 Gambar 13. Pembagian Paparan Sunda Berdasarkan Regional Ekologis ......... 41
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
Lampiran 1. Fungsi Alat dan Bahan ..................................................................... 52 Lampiran 2. Diagram Alur Kegiatan ..................................................................... 54 Lampiran 3. Dokumentasi Spesimen yang Digunakan ........................................ 55 Lampiran 4. Data Set yang Digunakan ............................................................... 60 Lampiran 5. Detail Sampel sebagai Data Primer dan Sekunder ........................ 78 Lampiran 6. Prosedur Pengolahan Data Analisa Keragaman Genetik .............. 80 Lampiran 7. Hasil BLAST Sampel Kabupaten Lamongan ................................... 91 Lampiran 8. Dokumentasi Hasil Elektroforesis .................................................... 95 Lampiran 9. Tabel dan Grafik Penjelasan Data Hasil .......................................... 97
1
BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Ikan gabus (Channa striata) merupakan ikan lokal yang menurut Djumanto
et al. (2020), merupakan ikan dengan nilai komersial penting di Jawa. Ikan C.
striata memiliki nilai ekonomis tinggi serta kandungan gizi yang tinggi pula,
terlebih kandungan protein albumin di dalamnya. Potensi ikan C. striata yang
tinggi ini perlu diikuti oleh studi-studi pendukung terkait ikan C. striata untuk
kemudian dapat dikembangkan lebih maksimal di kemudian hari. Penelitian
terkait ikan C. striata sendiri sangat minim di Indonesia, begitu pula praktik
budidayanya. Ikan C. striata di Kabupaten Lamongan berdasarkan penelitian
Fuadi et al. (2017), lebih unggul dari segi kadar kandungan protein albumin-nya
ketika dibandingkan dengan populasi lain di Jawa Timur. Lokasi pengambilan
sampel pada penelitian tersebut di Kabupaten Lamongan masuk dalam Daerah
Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo.
Sungai Bengawan Solo merupakan sungai yang terkenal di Pulau Jawa,
sebagaimana menurut Astirin dan Setyawan (2000), Bengawan Solo merupakan
sungai terpanjang di Pulau Jawa sehingga secara otomatis merupakan salah
satu sungai prioritas di Pulau Jawa. Panjang keseluruhan Bengawan Solo
diperkirakan adalah 600 km yang bermuara di Daerah Ujungpangkah, Kabupaten
Gresik, Jawa Timur. Luas DAS Bengawan Solo yang setidaknya melintasi dua
provinsi di Pulau Jawa (Jawa Timur dan Jawa Tengah) ini menurut Utomo et al.
(2017), diperkirakan adalah 16.000 km2 sehingga dapat merepresentasikan
sebagian besar keragaman hayati ikan air tawar sungai di kawasan sekitarnya
dengan ekosistem sejenis. Ancaman dan permasalahan pada populasi ikan lokal
DAS (termasuk ikan C. striata) secara umum menurut Prianto et al. (2015),
2
adalah degradasi lingkungan, hilang atau berubahnya habitat dan eksploitasi
berlebihan terhadap sumber daya baik ikan maupun unsur lainnya. Hal tersebut
ditambahkan oleh Syafei dan Sudinno (2018), bahwa dengan ancaman dari
kehadiran ikan-ikan asing (introduksi), kekayaan biodiversitas dapat sangat
terganggu dan rusak terlebih pada kawasan di negara bergelar mega-
biodiversitas seperti Indonesia, sebagaimana Brazil dan China juga merasakan
dampak buruk dari spesies asing di perairan mereka. Permasalahan kondisi DAS
tersebut dapat berubah seiring berjalannya waktu, begitu juga dengan kondisi
populasi C. striata di Kabupaten Lamongan, Jawa Timur sehingga perlu
dilakukan kajian untuk dilakukan evaluasi.
Kajian yang dapat dipakai untuk upaya evaluasi kondisi populasi, terlebih
untuk dasar mengembangkan komoditas ikan C. striata di daerah tersebut adalah
kajian genetika, sebagaimana menurut Utomo et al. (2021), bahwa kajian
genetika dapat digunakan untuk mengetahui polimorfisme ikan C. striata.
Pengujian genetik umumnya menggunakan marka molekuler dengan target atau
situs tertentu, dan menurut Herdiana et al. (2017), Cytochrome Oxydase sub unit
I (COI) pada DNA mitokondria (mtDNA) adalah situs paling sering digunakan
pada kajian genetika populasi karena berbagai keunggulannya, terutama dalam
mengevaluasi suatu populasi. Informasi-informasi terkait genetik sangat berguna
untuk dijadikan dasar mencari populasi unggul dalam budidaya di kemudian hari.
Keterangan seperti polimorfisme pada ikan C. striata sendiri menurut Utomo et
al. (2021), dapat digunakan dalam mengidentifikasi kondisi suatu populasi (misal
keragaman genetik) dan sebagai dasar dalam budidaya, contohnya adalah
sebagai dasar upaya seleksi induk dan domestikasi.
Urgensi kegiatan budidaya dan efektivitas upaya domestikasi suatu
populasi (termasuk populasi C. striata di Kabupaten Lamongan, Jawa Timur)
dengan data keragaman genetik sebagaimana menurut Amos dan Harwood
3
(1998), sangat memungkinkan untuk ditunjang karena data keragaman genetik
dapat memberikan informasi terkait kemampuan adaptasi serta kemungkinan
spesiasi populasi-populasi terkait. Kondisi kesehatan populasi menggunakan
keragaman genetik dapat dilihat terutama dari keragaman haplotipe (Hd) dan
keragaman nukleotida (π). Kondisi kesehatan suatu populasi tersebut juga dapat
dikaitkan dengan kesiapan atau kemampuan suatu populasi menghadapi
masalah seperti penyakit, parasit, predator serta perubahan lingkungan.
Berangkat dari latar belakang tersebutlah penelitian skripsi berjudul “Analisis
Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa striata) Berdasarkan Region DNA
Mitokondria Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak,
Kabupaten Lamongan, Jawa Timur” penting untuk dilakukan.
1.2 Rumusan Masalah
Berangkat dari latar belakang di atas bahwa ikan C. striata di Kabupaten
Lamongan, Jawa Timur berhadapan dengan permasalahan DAS Bengawan Solo
yang begitu kompleks, maka analisa genetik penting untuk dilakukan. Analisa
genetik dapat mengevaluasi kondisi di lapang dan dapat dijadikan dasar untuk
pengembangan komoditas C. striata dalam upaya domestikasi dan budidaya
berkelanjutan di kemudian hari. Penelitian ini untuk menganalisa dan
mengevaluasi bagaimana kondisi genetik populasi ikan C. striata, khususnya
pada Daerah Sungelebak, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur saat ini.
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini berfokus pada analisa genetika populasi.
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa kondisi populasi berdasarkan
keragaman genetik melalui indeks keragaman ikan C. striata di Daerah
Sungelebak, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur guna mengevaluasi kondisi
4
populasi tersebut.
1.4 Manfaat
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif yang dapat menunjukkan data
keragaman genetik sampel ikan C. striata. Data tersebut kemudian dapat
dijadikan dasar dalam pengembangan potensi ikan gabus di Indonesia untuk
menemukan populasi unggul dan sebagainya.
5
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Biologi Ikan Gabus (C. Striata)
Ikan gabus (C. Striata) merupakan ikan yang telah diteliti dari tahun ke
tahun dengan berbagai tujuan penelitian. Berbagai sumber pustaka telah
mencoba untuk menjelaskan ikan gabus termasuk aspek-aspek biologi seperti
klasifikasi hingga reproduksi ikan C. striata. Tinjauan pustaka terkait biologi ikan
C. striata dapat dilihat sebagai berikut.
2.1.1 Klasifikasi dan Morfologi
Ikan C. striata sebagai spesies utama dalam penelitian ini menurut
Haryanto (2019), diklasifikasikan sebagai berikut:
Kingdom : Animalia
Filum : Chordata
Subfilum : Vertebrata
Superkelas : Piesces
Kelas : Osteochthyes
Superordo : Teleostei
Ordo : Perciformes
Subordo : Channoidae
Famili : Channidae
Genus : Channa
Species : Channa striata
6
Sumber: Requieron et al., 2012 Gambar 1. Morfologi Ikan Channa striata. (a) Spesimen Jantan; (b) Spesimen
Betina; (c) Sirip Caudal (cf); (d) Sirip Dorsal (df) dan Sirip Pektoral (pc f); (e) Sirip Anal; (f) Kepala Samping; (g) Kepala Bawah; serta (h) Sirip Pektoral (pc f) dan Sirip Pelvic atau Ventral (pv f)
Ikan C. striata sendiri secara morfologi memiliki bentuk tubuh yang khas
dan menurut Kusmini et al. (2016), ikan ini dikenal dengan bentuk tubuh yang
memanjang atau silindris dengan kepala seperti ular. Bentuk tubuh khas tersebut
membuat ikan ini juga dikenal sebagai ikan berkepala ular (snakehead fish).
Warna ikan C. striata sendiri cenderung gelap dari warna coklat hingga hitam
sebagaimana menurut Aidah et al. (2020), warna tersebut dipadukan dengan
warna putih pada bagian perut ikan ini. Ikan C. striata merupakan ikan karnivora
dan tergolong predator sehingga design mulut ikan C. striata sangat efektif untuk
berburu dengan mulut besar dengan dilengkapi gigi canine untuk mengoyak
daging ikan. Ikan C. striata sebagai predator membutuhkan gerakan cepat untuk
mengejar mangsa sehingga selain bentuk badan memanjang, ikan C. striata juga
di-design dengan sirip lumayan lebar, sirip dorsal memanjangdengan sirip caudal
7
dan sirip pektoral membundar lebar. Ikan ini juga merupakan ikan dengan daya
tahan lebih pada lingkungan yang kurang mendukung seperti dengan adanya
alat pernafasan tambahan untuk mengantisipasi lingkungan berkadar oksigen
terlarut rendah. Pernafasan tambahan ini dinamakan diventikula yang
memungkinkan ikan C. striata mengambil oksigen dari udara langsung. Ukuran
ikan C. striata yang mencapai 100 cm pada penelitian Djumanto et aI. (2020),
sangat sulit ditemui, umumnya ikan ini didapati pada ukuran 23 hingga 65 cm.
Ukuran ini bervariatif tergantung musim, pada musim hujan data menunjukkan
ukuran ikan C. striata yang lebih besar dibanding musim kemarau.
2.1.2 Habitat dan Penyebaran Ikan C. striata
Ikan C. striata merupakan ikan dengan kemampuan bertahan hidup yang
tinggi sehingga penyebaran ikan ini sangat luas di penjuru Asia. Ikan C. striata
mampu mendiami berbagai tempat dengan kondisi perairan yang berbeda-beda
pula dan menurut Djumanto et al. (2020), ikan ini dapat ditemui di cekungan
sungai, danau hingga rawa. Beberapa sumber mengatakan bahwa ikan C. striata
juga dapat bertahan pada salinitas payau, hal ini khusus terjadi pada spesies C.
striata. Persebaran ikan C. striata menurut Kombong dan Arisuryanti (2018),
terdistribusi terutama di Asia Barat yaitu Pakistan, Bangladesh dan India, Asia
Timur yaitu Cina Selatan dan Korea Selatan, dan Asia Tenggara yaitu Indonesia,
Kamboja, Myanmar, Filipina, Vietnam, Thailand dan Malaysia. Ikan C. striata di
Indonesia sendiri dapat ditemukan di paparan sunda.
2.1.3 Siklus Reproduksi Ikan C. striata
Ukuran ikan C. striata jantan dan betina tidak terlalu signifikan, pada musim
hujan ikan ini akan memijah sebagaimana pernyataan Djumanto et al. (2020),
bahwa ikan ini memiliki beberapa faktor untuk memijah. Secara garis besar faktor
8
tersebut dibagi menjadi dua yaitu faktor internal dan eksternal. Faktor internal
tersebut berupa produksi hormon, usia, tingkat kematangn gonad dan lain
sebagainya. Faktor eksternal sendiri yang paling mempengaruhi adalah musim
sebagaimana ikan-ikan asia pada umumnya di mana musim hujan adalah musim
bagi banyak spesies ikan untuk memijah dan masuk pada poin „spawning
habitat‟. Faktor eksternal lainnya adalah kondisi perairan, ketersediaan makanan,
ketersediaan pasangan dan lainnya.
2.2 Keragaman Genetik
Keragaman genetik merupakan tingkat paling dasar dalam hirarki
biodiversitas sebagaimana menurut Yusron (2005), kajian biodiversitas meliputi
banyak hal termasuk keragaman habitat, komunitas, populasi hingga ke genetik.
Genetik sebagaimana yang diketahui merupakan unsur penting dalam kehidupan
dan berperan besar dalam penurunan sifat sehingga keragaman genetik dapat
menjadi dasar untuk mengkaji tingkatan-tingkatan biodiversitas di atasnya
bahkan hingga pada pengkajian ekosistem.
Keragaman genetik khususnya pada ikan dipengaruhi oleh beberapa hal.
Keragaman genetik pada ikan dapat berubah sebagaimana menurut Kantun dan
Mallawa (2016), keragaman genetik cenderung meningkat dengan adanya
mutasi dan imigrasi sedangkan cenderung menurun karena seleksi alam dan
penghanyutan genetik (genetic drift). Keragaman genetik yang tinggi memiliki
peluang hidup yang tinggi pula. Genetic drift merupakan penyimpangan pada
tingkat genotipe yang menurut Avarre et al. 2018, dapat menimbulkan kondisi
defisiensi genetik (kekurangan genetik) dan perubahan fluktuasi genetik dalam
suatu populasi. Dampak tersebut akan mengancam variasi genetik dari alel-alel
penting dan alel-alel langka karena dapat menghilangkan gen-gen penting dan
langka didalamnya serta merusak gene pool. Genetic drift dapat terjadi karena
9
inbreeding maupun dari kejadian-kejadian lain yang dapat menurunkan kualitas
populasi pada tingkat genotipe.
2.3 Analisa Keragaman Genetik
Analisa keragaman genetik dapat dilakukan dengan menggunakan region
pada DNA mitokondria/ mtDNA tepatnya pada region Cytochrome Oxydase sub
unit I (COI). Metode analisa yang dapat digunakan salah satunya adalah DNA
barcoding menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan kemudian
dilakukan squencing. Tinjauan pustaka terkait analisa keragaman genetik dapat
dilihat sebagai berikut.
2.3.1 DNA Mitokondria
DNA mitokondria atau yang disebut juga sebagai mtDNA adalah rantai
DNA yang terletak pada mitokondria, menurut Nugroho dan Dwi (2018), jumlah
DNA pada mitokondria bervariasi dan berbeda sifat dengan DNA nukleus seperti
ukuran, jumlah gen dan bentuk. DNA mitokondria sendiri memiliki laju mutasi 10
hingga 17 kali lebih tinggi dibanding DNA nukleus serta jumlah copy DNA
mitokondria hingga 1000 copy pada tiap sel sedang DNA nukleus hanya memiliki
dua copy. Keberadaan dari DNA mitokondria sendiri bersifat otonom dan terlepas
dari kegiatan DNA nukleus. Hal ini ditambahkan oleh Muthiadin et al. (2018),
bahwa genom DNA mitokondria berbentuk sirkular dengan 13 gen penyandi
protein, 22 gen tRNA dan 2 gen rRNA. DNA mitokondria telah lumrah digunakan
dalam identifikasi hewan dengan beberapa kelebihan seperti pewarisan bersifat
maternal, berlaju mutasi tinggi, sedikit intron, diwariskan secara haploid serta
proses replikasi dilakukan terus-menerus.
10
Sumber: Doublet, 2010
Gambar 2. Struktur mtDNA yang Terdiri dari 13 Gen Penyandi Protein, 22 Gen tRNA dan 2 Gen rRNA
Cytochrome Oxydase sub unit I (COI)
Situs atau region Cytochrome Oxidase sub unit I (COI) merupakan salah
satu dari 13 gen penyandi protein dalam DNA mitokondria. Situs COI menurut
Bucklin, et al. (2003), COI umum digunakan dalam analisa intraspesies maupun
interspesies sebagai penanda genetik pada studi populasi. COI memiliki laju
mutasi tinggi dan dapat memperlihatkan perbedaan antar populasi hingga antar
individu intraspesies. COI sendiri sebagaimana pendapat Tindi et al. (2017),
bahwa COI memiliki sifat conserve (lestari) dan sedikit sekali mengalami insersi
maupun delesi. COI juga memiliki kelebihan lain sebagaimana dinyatakan oleh
Arisuryani et al. (2020), bahwa COI tidak memiliki intron serta hanya diturunkan
dari ibu (maternal inharitace) sehingga tidak ada kemungkinan pengaruh
persilangan interspesies. Sifat maternal inharitace pada mtDNA (otomatis juga
pada COI) tetap berlaku walaupun mitokondria sperma jantan masuk ke dalam
ovum sebagaimana menurut Nuryanto dan Solihin (2006), mitokondria jantan
tersebut akan segera hilang dan tidak dapat dilacak karena mekanisme fertilisasi
11
yang berlaku di tubuh betina.
2.3.2 Metode Analisa
Metode analisa secara biologi molekuler dewasa ini telah berkembang
pesat. Penggunaan biologi molekuler dalam genetika populasi khususnya untuk
melihat keragaman genetik suatu populasi dapat dilakukan dengan bantuan
metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dan dilanjutkan dengan DNA
squencing. Penjelasan terkait metode-metode tersebut dapat dilihat di poin-poin
di bawah ini.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) menurut Pertiwi et al. (2015),
merupakan metode untuk memperbanyak DNA suatu organisme. PCR sendiri
telah sering dipergunakan dalam usaha pengidentifikasian melalui molekuler.
PCR untuk identifikasi baik menggunakan DNA fingerprinting maupun DNA
barcoding dewasa ini telah umum. PCR dalam pengaplikasiannya menurut
Sasmito et al. (2014), memiliki beberapa hal yang perlu diperhatikan.
Keberhasilan PCR ditentukan dari beberapa hal di antaranya adalah bahan-
bahan deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), oligonukleotida primer, DNA
template (cetakan), komposisi larutan buffer, jumlah siklus reaksi, enzim yang
digunakan, steril dari kontaminasi dan lain sebagainya.
DNA Squencing
Sekuensing DNA merupakan proses pengurutan basa DNA dan menurut
Tasma (2015), salah satu metode sekuensing adalah metode Sanger (Sanger
dideoxy sequencing) di mana metode ini memerlukan DNA template dan primer
spesifik untuk reaksi sekuensing. Panjang sekuens yang terbentuk berkisar
antara 1.000 hingga 1.200 pasang basa (bp) dan tidak dapat untuk mencapai
12
angka 2.000 bp. Pemeriksaan dengan metode ini menurut Triyani, et al. (2016),
menggunakan alat big dye terminator. Penilaian hasil kemudian dilanjutkan
dengan menggunakan perangkat lunak.
13
BAB III. METODE PENELITIAN
3.1 Tempat, Waktu dan Jadwal Pelaksanaan
Penelitian untuk Skripsi dilaksanakan di Laboratorium Hidrobiologi Divisi
Sumberdaya Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan dan Laboratorium
Ekologi dan Diversitas Hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Brawijaya, Malang pada bulan November 2020 hingga bulan Februari
2021.
3.2 Materi Penelitian
Penelitian ini memerlukan beberapa alat dan bahan dalam prosesnya
sehingga memenuhi standart laboratorium serta standart pengujian biologi
molekuler. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini sebagian besar
juga dilengkapi dengan protokol khusus dalam penggunaannya.
3.2.1 Alat Penelitian
Peralatan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah spindown, section
set, gelas ukur, cool box, mikropipet, bunsen, freezer, vortex, thermal cycler,
cetakan gel, electroforesis machine, power supplay, UV transilluminator, rak
tube, electrical balance, centrifuge, erlenmeyer, microwave, incubator, dan
laptop. Setiap peralatan tersebut memiliki fungsi khusus dalam penelitian ini
dimana penggunaannya sesuai dengan teknik manual dalam pengujian genetika.
Fungsi dari peralatan-peralatan tersebut dapat dilihat pada bagian lampiran
dalam laporan ini.
14
3.2.2 Bahan Penelitian
Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah TNESU8 buffer, micro
tube (1.5 ml dan 0.2 ml), NaCL 5M, PCR tube, akuades steril, mikro tip,
proteinase-K, phenol:cloroform (1:1), cloroform:isoamyl alchohol (1:1), ethanol 70
%, ethanol 96-99 %, agarose, TE buffer, TAE 1x, GoTaq PCR mix, fish primer
F1R1 dan F2R2, ddH2O, DNA ladder (1kb), template DNA Uji, loading dye, dan
Ethidium Bromide (EtBr). Setiap bahan-bahan tersebut memiliki fungsi khusus
dalam penelitian ini dimana penggunaannya sesuai dengan teknik manual dalam
pengujian genetika. Fungsi dari bahan-bahan tersebut dapat dilihat pada bagian
lampiran dalam laporan ini.
3.3 Metode Penelitian
Metode penelitian secara umum dibagi dua yaitu penelitian deskriptif dan
penelitian eksperimental. Penelitian keragaman genetik dalam laporan ini
merupakan penelitian deskriptif. Penelitian deskriptif sendiri merupakan
penelitian yang menurut Hamdi dan Bahruddin (2015), merupakan penelitian
dengan metode khusus untuk menggambarkan fenomena-fenomena dalam
lingkup luas terhadap ruang dan waktu. Penelitian tersebut juga dapat
mendeskripsikan suatu keadaan atau beberapa keadaan dalam tahap-tahap
perkembangan keadaan tersebut. Produk yang diincar dari penelitian deskriptif
adalah deskripsi, gambaran sistematis, faktual dan akurat mengenai fakta-fakta,
sifat dan atau hubungan di antara fenomena-fenomena yang sedang diteliti.
Penelitian genetika populasi terkait keragaman genetik dapat menggambarkan
keragaman genotipe suatu populasi pada suatu daerah hingga dapat dijadikan
sebagai dasar pembuatan analisa pola distribusi suatu spesies maupun sejarah
persebaran spesies tersebut.
15
3.4 Teknik Pengambilan Data
Data dalam penelitian dikategorikan sebagai data primer dan sekunder
yang menurut Amrin (2016), data primer dikumpulkan langsung oleh peneliti
sendiri. Hal ini berbeda dengan data sekunder yang menurut Harto (2015)
merupakan data dari selain pengumpulan pribadi peneliti seperti bahan-bahan
pustaka dan lain sebagainya. Data primer dalam penelitian ini berupa hasil
observasi lokasi/habitat pengambilan dan hasil analisa genetik spesimen ikan C.
striata yang didapatkan di DAS Bengawan Solo daerah Kabupaten Lamongan.
Data sekunder pada penelitian ini sendiri berupa bahan-bahan pustaka
penunjang penelitian dan informasi yang dikumpulkan dari berbagai narasumber
di lapangan.
3.5 Prosedur Penelitian
Penelitian saintek memerlukan protokol-protokol khusus untuk dijalankan.
penelitian genetika memiliki protokol khusus yang harus dilakukan dengan benar
supaya tidak terjadi kesalahan data baik karena kerusakan sampel, kontaminasi
hingga analisa. Prosedur penelitian pada penelitian keragaman genetik ini dapat
dilihat sebagai berikut.
3.5.1 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel ikan C. striata dilakukan dengan mencari pasar yang
berdekatan dengan lokasi dari habitat ikan C. striata itu sendiri. Pasar di sekitar
lokasi yang terindikasi memiliki sebaran populasi ikan C. striata di Kabupaten
Lamongan adalah Pasar Sungelebak Lamongan. Aliran sungai yang melintasi
habitat ikan tersebut merupakan DAS Bengawan Solo. Keterangan dari penjual
ikan C. striata di pasar tersebut digali untuk mengetahui lokasi penangkapan dan
ikan ini kemudian dianalisa secara visual metode penangkapannya.
16
Salah satu habitat ikan tersebut yang dimaksudkan berada di sekitar Pasar
Sungelebak Lamongan dengan alamat lengkap Jl. Raya Pasar Sungelebak
Karanggeneng Lamongan, Simo, Pucangro, Kalitengah, Kabupaten Lamongan,
Jawa Timur. Lokasi ini memiliki titik koordinat 7.039605884339526 Lintang Utara,
112.34919835786717 Bujur Timur dengan metode sampling yaitu random
sampling dengan cara mencari ikan C. striata sedapat mungkin walaupun juga
diusahakan memiliki kriteria layak dijadikan sampel secara kasat mata. Ikan C.
striata diperkirakan layak dijadikan sampel dalam penelitian ini adalah ikan
dengan ukuran lebih dari sama dengan 15 cm agar mempermudah pengambilan
jaringan tubuh serta memiliki kondisi fisik yang bagus dengan ditandai oleh sirip
dan badan utuh, jikalau ada luka dipastikan bukan luka fatal terutama pada sisi
kiri ikan agar mempermudah identifikasi melalui hasil dokumentasi. Kriteria ikan
layak juga meliputi kesegaran ikan, ikan hidup akan lebih diutamakan dari pada
ikan mati dan jikalau ikan telah mati dipastikan ikan masih dalam kondisi baik.
Penangkapan ikan C. striata umumnya menggunakan jaring, pancing, alat jebak,
tombak dan lain sebagainya sementara pada proses pencarian sampel,
penangkapan ikan C. striata dengan cara dijaring ataupun dipancing lebih
diprioritaskan karena bentuk fisik ikan C. striata yang lebih minim akan
kerusakan.
Ketika mendapatkan sampel yang telah mati, sampel spesimen disimpan di
tempat dengan suhu yang terus dikontrol agar kualitas spesimen ikan terjaga
hingga ke laboratorium untuk diproses ke tahap selanjutnya. Ikan C. striata yang
didapatkan masih hidup sebisa mungkin dijaga tetap hidup (tidak sekarat atau
bahkan mati) hingga ke tempat spesimen diproses untuk tahap selanjutnya, akan
lebih baik jika diupayakan spesimen tidak stress. Ikan hidup kemudian dimatikan
dengan cara direndam menggunakan air es untuk memperlambat metabolisme
17
ikan hingga mati kurang lebih selama 30 menit. Ikan yang tidak mati dengan
perlakuan tersebut dapat ditusuk di bagian kepala lalu dirusak bagian otaknya
dengan mempertimbangkan spesimen tetap baik untuk didokumentasikan di
kemudian waktu.
3.5.2 Preparasi Spesimen
Sampel yang telah selesai didokumentasikan kemudian diambil
jaringannya untuk kemudian diuji secara genetik menggunakan PCR. Jaringan
digunting dengan mengutamakan sampel masih dapat didokumentasikan secara
utuh di kemudian hari sehingga bagian pengguntingan ditentukan pada bagian
kanan dan dalam hal ini adalah sirip pektoral dan daging (otot) pada tubuh
bagian belakang (punggung atas dekat caudal peduncle). Pemotongan bagian
tubuh tepatnya pada alat gerak akan mempermudah proses ekstraksi karena
mudah dihancurkan. Jaringan digunting menggunakan gunting bedah yang telah
dipastikan steril melalui perendaman alkohol 70 % dan pembakaran dengan
bunsen, gunting kemudian direndam kembali dengan alkohol 70 %. Jaringan
yang telah diambil kemudian diletakkan pada microtube 1,5 berisi alkohol 96 %.
Sampel diberi penanda dan diletakkan pada freezer untuk menjaga kualitas DNA
pada jaringan sebelum dilanjut pada proses uji PCR. Proses dalam PCR sendiri
memiliki beberapa langkah dengan prosedur sebagai berikut. Protokol yang
digunakan menyesuaikan protokol teknik manual Promega Kit.
Pengambilan jaringan otot maupun jaringan alat gerak untuk diekstraksi
dimaksudkan karena di daerah tersebut umum diambil untuk target mendapatkan
mitokondria. Pernyataan tersebut sejalan dengan pernyataan Marwayana (2015),
bahwa jaringan otot memiliki kebutuhan energy yang besar. Jaringan otot
merupakan jaringan yang bergerak aktif sehingga keberadaan mitokondria
18
sangat diperlukan pada jaringan ini. Peran mitokondria sebagai penyokong
energi dalam sel sangat berperan penting yang dalam hal ini dengan adanya
mitokondria juga secara otomatis DNA mitokondria juga ada pada otot dan alat
gerak lainnya.
Ekstraksi
Proses ekstraksi pada jaringan yang telah diambil sebelumnya dilakukan
untuk memisahkan DNA dengan unsur lain dalam jaringan tersebut. Pemisahan
DNA tersebut dalam hal ini adalah DNA dari mitokondria. Proses ekstraksi dapat
dilakukan dengan cara yang berbeda tergantung laboratorium dan peneliti terkait
namun secara umum dapat dilihat pada skema di gambar 3 berikut.
Gambar 3. Skema Proses Ekstraksi Secara Garis Besar
Gambaran proses Ekstraksi pada gambar 3 menggambarkan secara umum
proses ekstraksi yang terbagi menjadi beberapa tahapan yaitu penghancuran/
lisis, eliminasi/ purifikasi, presipitasi DNA dan hidrasi DNA. Detail prosedur
ekstraksi dalam protokol teknik manual Promega kit yang digunakan dalam
penelitian ini adalah sebagai berikut.
Persiapan awal dilakukan dengan pencampuran 500 μl Nuclei Lysis
Solution dan 120 μl EDTA ke dalam sebuah wadah lalu didinginkan 5 hingga 10
menit, warna campuran wajarnya akan menjadi buram. Jaringan spesimen
19
kemudian dipotong lebih kecil lagi dan dipindah ke tube baru dan ditambahkan
600 μl campuran larutan sebelumnya. 17,5 μl Proteinase-K kemudian
ditambahkan lalu sampel di-vortex dan diinkubasi selama 12 jam pada suhu 55
C. Pasca inkubasi, sampel didiamkan dalam suhu ruang 5 hingga 10 menit
kemudian ditambahkan Protein Precipitation Solution sebanyak 200 μl, di-vortex
selama 20 detik dan didinginkan dalam lemari es selama 5 menit. Sampel di-
sentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 14.500 rpm kemudian diambil
bagian supernatan dan diletakkan pada tube baru menggunakan mikropipet.
Sampel berupa supernatan ditambahkan dengan Isopropanol 600 μl lalu di-
rotamix manual dengan cara pembolak-balikan secara horizontal sebelum di-
sentrifugasi selama satu menit dengan kecepatan 14.500 rpm. Supernatan
dibuang berlahan hingga tersisa bagian pellet saja lalu ditambahkan 600 μl
Ethanol 70 % dan di-rotamix manual kembali. Sampel di-sentrifugasi selama 1
menit dengan kecepatan 14.5000 rpm kembali kemudian supernatan dibuang
berlahan dan menyisakan bagian pelet lalu pelet dikering anginkan dengan cara
membalikkan tube selama 10 hingga 15 menit. Sampel berupa pelet
ditambahkan 100 μl rehydration solution dan di-inkubasi selama 1 jam pada suhu
65 C dan tube di-tapping secara berkala agar larutan tercampur sempurna.
Tahap terakhir adalam mendiamkan sampel pada suhu ruang 5 hingga 10 menit
dan sampel DNA disimpan pada suhu 2 hingga 8 C.
Amplifikasi
Proses amplifikasi ditujukan untuk menggandakan jumlah DNA sehingga
dapat dianalisa. Penggandaan DNA ini menggunakan bantuan alat Thermal
cycler dengan pengaturan yang disesuaikan. Sampel yang berbeda dapat
memiliki pengaturan yang berbeda pada malat tersebut namun secara umum
tahapan ampliofikasi adalah sebagaimana skema pada gambar 4.
20
Gambar 4. Skema Proses Amplifikasi Secara Garis Besar
Gambaran proses amplifikasi pada gambar 4 menggambarkan secara
umum proses amplifikasi yang terbagi menjadi beberapa tahapan yaitu
pembuatan PCR mix, inisiasi, denaturasi-annealing-elongasi, dan elongasi akhir/
final elongation. Suhu dalam proses denaturasi ditargetkan pada 98 °C, pada
anealing 55 °C, dan pada elongasi 72 °C. Suhu inisiasi dan elongasi akhir
memiliki tahapan dalam menaikkan ataupun menurunkan suhu secara bertahap
agar PCR mix yang diujikan tidak mengalami thermal shock dan rusak. Inisiasi
berlahan menaikkan suhu ke suhu denaturasi sedangkan elongasi akhir
menurunkan suhu dari suhu elongasi. Amplifikasi dalam protokol teknik manual
Promega kit yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut.
PCR mix merupakan campuran dari beberapa bahan/larutan yang dalam
hal ini pada protokol teknik manual Promega kit adalah 15 μl Gotaq-Green
Master Mix, 1 μl Primer F, 1 μl Primer R, ddH2O 11 μl, dan 2 μl DNA template.
Total jumlah PCR mix adalah 30 μl yang kemudian dimasukkan tube 0,2 ml dan
di-vortex serta di-spindown. Sampel tersebut kemudian dimasukkan dalam mesin
thermalcycler dan mesin dijalankan sesuai dengan pengaturan program yang
diinginkan. Hasil kemudian dapat diproses menggunakan mesin elektroforesis
untuk memvisualisasikan hasil PCR sebelum kemudian di-sekuensing untuk lebih
detailnya.
21
Elektroforesis
Proses elektroforesis merupakan proses pengujian kualitatif dari amplikon
untuk dipastikan sebelum amplikondi-sekuensing. Hasil visualisasi menggunakan
alat UV transiluminator akan menunjukkan kualitas DNA yang teramplifikasi.
Tahapan elektroforesis secara garis besar sama seperti skema pada gambar 5
namun dengan beberapa opsi berbeda pada larutan dan konsentrasi agar.
Gambar 5. Skema Proses Elektroforesis Secara Garis Besar
Gambaran proses elektroforesis pada gambar 5 menggambarkan secara
umum proses elektroforesis yang terbagi menjadi beberapa tahapan yaitu
pembuatan gel agarosa, pencetakkan gel, penuangan amplikon pada gel,
pengaliran listrik, perendaman dengan pewarna dan visualisasi hasil.
Elektroforesis dalam protokol teknik manual Promega kit yang digunakan dalam
penelitian ini adalah sebagai berikut.
Agarose 0,525 gr dengan konsentrasi 1,5 % dipersiapkan dan ditambahkan
dengan 35 ml TBE 1x sebagai pelarutnya. Agarose dipanaskan dalam microwave
selama 2 menit lalu didiamkan pada suhu ruang hingga keadaan dapat dikatakan
hangat kuku dan ditambahkan 1,5 μl EtBr. Agarose dituang dalam cetakan dan
ditunggu sekitar 15 menit hingga memadat. Sampel dituang pada sumuran yang
telah didata agar tidak tertukar sesuai dengan letak sampel sebanyak 3 μl lalu
22
ditambahkan marker dan elektroforesis dijalankan selama 30 menit. Hasil
kemudian dapat dibaca pada mesin UV transiluminator dan didokumentasikan.
3.5.3 DNA Sequencing
Proses DNA sequencing atau Sekuensing dilakukan oleh pihak profesional
dan dalam penelitian ini merupakan pihak PT Genetika Science Indonesia.
Sampel DNA yang telah disiapkan dikirimkan ke instansi tersebut kemudian
dilanjutkan ke 1st BASE DNA Squencing Service di Singapura. Sekuensing
ditujukan untuk mengetahui urutan basa nukleotida dan dalam penelitian ini
metode yang diambil merupakan metode Dye-terminator sequence dengan
teknik Sanger. Teknik tersebut menurut Blazej et al. (2006), dikenal dengan
kemampuannya untuk menghasilkan bacaan sekuens yang panjang dan spesifik.
Proses sekuensing kemudian akan menjadi data chromatogram yang dapat
diolah dengan aplikasi-aplikasi khusus.
3.5.4 Analisis Data
Analisa berupa chromatogram terdiri atas potongan forward dan reverse
sebagai hasil dari pemotongan oleh primer. Editing dilakukan untuk merapikan
data hasil sekuensing menggunakan program Chromas v.2.6.6., hal ini dilakukan
karena pada hasil sekuensing sering ditemukan noise atau bagian yang sulit
dibaca karena bertumpuk dan lainnya. Asumsi pemotongan noise adalah pada
non-coding region sehingga tidak terlalu banyak dan tidak menghilangkan
informasi genetik penting dengan perkiraan maksimal pemotongan adalah 20 bp.
Bagian noise jika tidak dihapus memiliki potensi membuat data konsensus yang
kurang baik seperti penambahan nilai keragaman karena berubahnya susunan
basa nukleotida hasil pembacaan penumpukan dari aplikasi. Kedua hasil
sekuensing kemudian diproses pada program UGENE v.1.31.1. untuk digabung
23
dan dicocokkan lalu dibentuk konsensus dan disimpan dalam format berkas
FASTA file.
Editing kedua dilakukan pada file FASTA menggunakan Microsoft Word
lalu digabungkan data sekuensing lainnya dari pengunduhan di GenBank. Data
sekuens dan data pembanding kemudian disejajarkan pada program MESQUITE
v.3.5.1. untuk menyamakan jumlah basa antar sekuens. Indeks keragaman
genetik atau genetic diversity dapat berupa haplotype diversity dan nucleotide
diversity dengan menggunakan program DnaSP v.6.12.01. Pairwise Fst
menggambarkan struktur populasi yang meliputi diferensiasi populasi dan aliran
gen dengan bantuan program Arlequin v.3.5.2.2.
24
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Koleksi Spesimen
Spesimen ikan gabus (Channa striata) diambil pada daerah perairan
sekitar Jl. Raya Pasar Sungelebak Karanggeneng Lamongan, Simo, Pucangro,
Kalitengah, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur oleh pencari ikan dari Pasar
Sungelebak, Kabupaten Lamongan. Lokasi ini memiliki titik koordinat
7.039605884339526 Lintang Utara, 112.34919835786717 Bujur Timur.
Persebaran ikan C. striata sendiri pada kawasan Kepulauan Indonesia secara
alami hanya tersebar pada Paparan Sunda meliputi Pulau Kalimantan, Pulau
Sumatera dan Pulau Jawa (Rahayu et al., 2021). Persebaran lain di Indonesia
diindikasi sebagai persebaran tidak alami (introduksi) sebagaimana dilaporkan
oleh Alviodinasyari et al. (2019) bahwa C. striata tersebar juga pada Pulau Bali
(Sunda Kecil), Sulawesi dan Kepulauan Maluku.
Ikan C. striata yang tersebar juga di Kabupaten Lamongan sendiri
berdasarkan penelitian Fuadi et al. (2017), pada Kecamatan Maduran, Kab.
Lamongan dibandingkan dengan ikan dalam spesies yang sama pada
Kecamatan Yosowilangun, Lumajang lebih unggul dari segi kadar kandungan
protein albumin-nya. Jarak tempat pengambilan sampel pada penelitian ini
dengan tempat pengambilan sampel pada penelitian tersebut (Kec. Sungelebak
ke Kec. Maduran) sekitar 10 km dan masih termasuk Daerah Aliran Sungai
(DAS) Bengawan Solo. Sampel ikan yang diindikasi sebagai C. striata pada
lapang didapatkan sebanyak 18 individu lalu dipilih 10 individu terbaik secara
morfologi untuk kemudian dilakukan uji genetik. Jumlah sampel yang dianalisa
untuk mengetahui indeks keragaman suatu populasi juga dilakukan oleh Arifin
25
dan Kurniasih (2007), dengan jumlah 5 hingga 10 individu tiap populasi dan
dianggap telah mampu mewakili suatu data populasi tersebut. Jumlah sampel 5
individu atau lebih pada suatu populasi untuk penelitian genetika populasi
menurut Goodal-Coopestake et al. (2012), merupakan standart yang baik untuk
menghindari adanya bias pada analisa. Keseluruhan spesimen yang diuji genetik
telah didokumentasikan dan dapat dilihat pada lampiran 3. Salah satu
dokumentasi sampel dapat dilihat pada gambar 6.
Sumber: Dokumentasi Pribadi Gambar 6. Ikan C. striata Dengan Tag CSL 06 yang Merupakan Salah Satu
Sampel dari 10 Sampel Uji pada Penelitian Ini
Umumnya, keluarga Channidae yang dapat ditemukan di pulau Jawa
secara alami ada 2 spesies yaitu ikan C. striata dan ikan kocolan (Channa
gachua atau Channa limbata). Untuk bentuk tubuh sebagaimana keluarga
Channidae maka tidak jauh berbeda walaupun ada, namun hal paling menonjol
sebagaimana menurut Ilmi dan Arisuryanti (2018), adalah ukuran C. gachua atau
C. limbata yang tidak dapat melebihi 28 cm sedangkan C. striata dapat mencapai
100 cm. Ikan C. gachua atau C. limbata ini memiliki warna tubuh yang menarik
untuk ikan hias dengan ujung berwarna kekuningan hingga kemerahan pada sirip
dorsal, caudal dan anal. Terkadang di sela sirip-sirip tersebut terdapat warna biru
sehingga sangat mudah dibedakan dengan ikan C. striata. Ciri-ciri pada tubuh
kedua spesies tersebut juga sangat berbeda dari corak hingga pewarnaannya.
26
Mata pada species C. gachua atau C. limbata sering ditemui berwarna
kemerahan sedangkan pada C. striata umumnya tidak, sementara pada bagian
tubuh posterior ikan C. striata berwarna putih cerah dan pada C. gachua atau C.
limbata tidak. Habitat ikan C. gachua atau C. limbata juga terbatas pada sungai
air tawar sedangkan ikan C. striata memiliki toleransi salinitas pada daerah
estuari. Foto ikan C. limbata dapat dilihat pada gambar 7 sebagai bahan
perbandingan dengan C. striata. Gambar perairan di sekitar wilayah pengambilan
sampel C. striata dapat dilihat pada gambar 8 dan peta lokasi pada gambar 9.
Sumber: Aqmal-naser dan Ahmad, 2021
Gambar 7. Foto Ikan Channa limbata dari Semenanjung Malaysia. Warna sirip hingga mata species C. limbata sangat berbeda dengan C. striata, begitu pula dengan corak tubuh serta ukuran ikan C. limbata
Sumber: Dokumentasi Pribadi
Gambar 8. Foto Lokasi Perairan Sekitar Kawasan Jl. Raya Pasar Sungelebak
Karanggeneng Lamongan, Simo, Pucangro, Kalitengah, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur
27
Sumber: Google Maps, 2021
Gambar 9. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Ikan C. striata di Perairan Sekitar Jl. Raya Pasar Sungelebak Karanggeneng Lamongan, Simo, Pucangro, Kalitengah, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur
Lokasi pengambilan ikan C. striata diindikasi selain dari kawasan
penyebarannya, juga dari ciri-ciri habitat tempat tinggal ikan tersebut. Kawasan
terindikasi memiliki populasi ikan C. striata dikunjungi sebagaimana detail lokasi
yang telah disinggung sebelumnya. Perairan di sekitar kawasan tersebut memiliki
hubungan dengan Daerah Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo sehingga
merupakan anak sungai dari DAS Bengawan Solo. Perairan di kawasan tersebut
cenderung keruh dan dekat dengan persawahan dengan beberapa spesies lain
hasil observasi dan keterangan warga sekitar yaitu ikan betok (Anabas
testudineus), ikan wader cakul (Barbodes binotatus) dan ikan sili (Macrognathus
aculeatus).
4.2 Hasil Ekstraksi dan Amplifikasi
Jaringan diekstraksi lalu diamplifikasi dengan mesin thermal cycler
menggunakan primer universal F2 R2. Penggunaan primer jenis ini pada ikan C.
striata sejalan dengan penggunaan pada ikan yang sama oleh Arisuryani et al.
(2020), dimana penelitian tersebut menyasar situs Cytochrome Oxydase sub unit
I (COI) pada ikan C. striata dari daerah Kalimantan Tengah. Hasil amplifikasi
28
kemudian diuji kualitasnya dengan elektroforesis dan divisualisasikan. Hasil
visualisasi memperlihatkan bahwa sampel telah siap dikirim ke PT Genetika
Science untuk dilakukan sekuensing. Gambar contoh hasil visualisasi
elektroforesis dengan UV transiluminator dapat dilihat pada gambar 10 dan
dokumentasi selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 8.
Sumber: Dokumentasi Pribadi
Gambar 10. Contoh Hasil Visualisasi Elektroforesis pada Penelitian Ini. Kotak merah menunjukkan hasil jumlah pasang basa kurang lebih 671 hingga 681 bp; Kotak hitam menunjukkan area spesifik sampel; Kotak dan garis kuning menunjukkan area marker.
Prinsip kerja dari elektroforesis sendiri terfokus pada kekentalan gel
seperti pendapat Harahap (2018), kekentalan gel mempengaruhi laju molekul.
Hasil dari elektroforesis dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, selain dari gel
sebagai medium pemisah, faktor lainnya yaitu sampel, larutan penyangga dan
medan listrik yang digunakan. Sampel yang digunakan memiliki beberapa hal
untuk diperhatikan yaitu muatan, ukuran dan bentuk molekul dari sampel
tersebut. Larutan pengangga sendiri juga perlu diperhatikan masalah keterkaitan
ion penyangga ketika berinteraksi dengan senyawa yang diujikan serta pH dipilih
harus sesuai berdasarkan jenis campuran sampelnya. Medan listrik terlalu tinggi
akan mengakibatkan penguapan larutan dan denaturasi pada sampel, medan
listrik terlalu rendah akan memperlambat laju molekul saat proses elektroforesis.
29
4.3 Hasil Sekuensing
Dalam penelitian ini, chromatogram diolah terlebih dahulu menggunakan
aplikasi Chromas v.2.6.6. untuk salah satunya menghilangkan tumpukan data
pada chromatogram yang umum disebut sebagai „noise‟. Panjang basa awal
hasil sequencing 10 sampel CSL memiliki panjang 671 bp hingga 681 bp dengan
hasil sekuens forward 678 bp hingga 681 bp dan sekuens reverse 671 bp hingga
676 bp. Contoh noise dalam laporan ini dapat dilihat pada gambar 11 dengan
contoh tumpukan serta area yang dihapus pada sekuens CSL nomor 4.
Gambar 11. Data Chromatogram yang Dibuka pada Aplikasi Chromas v.2.6.6.,
Kotak Merah Adalah Contoh Tumpukan Noise pada Sekuens Sampel CSL Nomor 4 dan Kotak Hitam Adalah Area yang Dihapus
Data sekuens utama penelitian ini adalah C. striata dari Kabupaten
Lamongan dengan tag CSL berjumlah 10 individu sedangkan data sekuens
pembanding adalah C. gachua atau C. limbata dari Malang (MLG) berjumlah 5
individu; Kediri (KDR) berjumlah 6 individu; Mojokerto (MJT) berjumlah 7 individu;
Jawa Tengah (JWT) berjumlah 7 individu; Jawa Barat (JWB) berjumlah 7
individu; Pulau Bali (PBL) berjumlah 7 individu; dan Sumatra (SMT) berjumlah 3
individu. Data pembanding MLG berasal dari penelitian Kholil (2019), KDR
berasal dari penelitian Lutfitasari (2020), MJT dari penelitian Hamurdana (2020)
dan JWT, JWB, PBL dan SMT berasal dari GenBank. Detail data dipakai dapat
dilihat pada lampiran 5 dan prosedur kerja dari setiap aplikasi pada lampiran 6.
30
Penggunaan spesies teridentifikasi C. gachua memiliki kemungkinan
kesalahan identifikasi pada seluruh data dengan lokasi pengambilan sampel dari
Asia Tenggara, sekuens C. gachua terlebih pada GenBank untuk spesimen yang
ditemukan di Asia Tenggara termasuk di Indonesia memiliki kemungkinan
kesalahan identifikasi dengan C. limbata (dalam laporan ini berkaitan dengan
penggunaan data pembanding). Kesalahan identifikasi sangat umum ditemukan
di GenBank sebagaimana menurut Conte-Grand et al. (2017), bahwa begitu
banyak atau tinggi jarak perbedaan sekuens-sekuens khususnya pada
Channidae di GenBank yang kompleks secara intraspesifik. Perbedaan tersebut
karena secara intraspesifik terlebih ditambah dengan distribusi yang sangat luas
maka dapat dikatakan bahwa ada kemungkinan kesalahan identifikasi dan salah
satunya kemungkinan tersebut ada pada C. gachua di bagian Timur Indoburman
(termasuk di Indonesia). Identifikasi tersebut kemungkinan seharusnya mengarah
pada C. limbata yang telah terpisah secara allopatrik dengan pemisah populasi
dari kedua spesies tersebut terletak di Negara Myanmar (Indoburman) sehingga
pada Asia Selatan merupakan populasi dari C. gachua, sedangkan pada Asia
Tenggara merupakan populasi C. limbata. Kesalahan identifikasi antara kedua
spesies tersebut secara morfologi sangat wajar dikarenakan perbedaan
morfologinya sangat terbatas, termasuk spesies kompleks dan kajian hanya
terbatas pada spesimen yang ada sehingga pada penelitian ini C. gachua dan C.
limbata dianggap dalam satu spesies karena semua berasal dari Indonesia.
Hasil konsensus juga dapat digunakan sebagai bahan identifikasi dengan
menggunakan fitur BLAST pada web NCBI. Konsensus seluruh sampel dari
Kabupaten Lamongan memiliki „percent identitiy‟ atau disingkat „Per. Ident‟ pada
tabel hasil BLAST yang mencapai 99,69% hingga 100% dan merujuk pada
spesies C. striata. Pencocokan tersebut didasarkan pada sekuens-sekuens yang
31
telah terdaftar di GenBank sehingga sampel dari Kabupaten Lamongan dapat
dikatakan secara genetik merupakan spesies C. striata walaupun kemungkinan
kesalahan identifikasi pada spesies kompleks C. striata dengan alasan serupa
pada kasus C. gachua dan C. limbata juga terjadi. Permasalahan identifikasi
tersebut pada GenBank untuk kasus C. striata dalam penelitian Conte-Grand et
al. (2017), menyatakan bahwa masih diperlukan banyak detail morfologi disertai
analisis genetik untuk menyelesaikannya. Contoh hasil BLAST dapat dilihat pada
gambar 12.
Gambar 12. Contoh Hasil BLAST pada Sampel CSL_01 dari Kabupaten Lamongan yang Mencapai 99,85% untuk Percent Identity-nya yang Ditandai Kotak Merah
Nilai percent identity hasil BLAST pada seluruh sampel Kabupaten
Lamongan secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 7. Tertinggi merupakan
sampel CSL_06 yang mencapai 100%, disusul CSL_01 dan CSL_09 yaitu
99,85% dan sampel lainnya adalah 99,69%. Seluruh sampel merujuk pada
spesies C. striata saja dengan presentase yang tinggi. Percent identity pada
kajian genetika menurut Pearson (2014), umum digunakan para peneliti untuk
menggambarkan kemungkinan sekuens-sekuens homolog dari sampel FASTA
yang diujikan. Fitur percent identity memiliki rumus penyederhanaan sekuens
untuk dikatakan homolog yaitu 30%. Ketika struktur sekuens tertentu telah
teridentifikasi pada 30% sekuens di GenBank maka dinyatakan homolog.
Kelemahan fitur ini adalah tidak dapat mengidentifikasi kelompok sekuens langka
32
dan umum, kurang sensitif serta tidak dapat menunjukkan pergantian asam-
amino yang lestari. Fitur lain yang dapat dipakai adalah E-values dan bit score.
Bagaimanapun, percent identity dapat memberi ukuran yang berguna untuk jarak
evolusi dalam bentuk presentase homolog.
4.4 Komponen Basa Nukleotida
Tiap data kemudian diberikan penamaan grup dimana populasi CSL adalah
grup 1, MLG grup 2, KDR grup 3, MJT grup 4, JWT grup 5, JWT grup 6, PBL
grup 7, dan SMT grup 8. Data utama berupa populasi CSL menunjukkan
presentase basa nukleotida Sitosin (C) sebanyak 28,96%, Timin (T) sebanyak
29,80%, Adenin (A) sebanyak 23,98%, dan Guanin (G) sebanyak 17,26%
sehingga perbandingan pasangan A+T lebih dominan dengan presentase
53,78% dibanding pasangan G+C yaitu 46,22%. Kondisi genetik populasi dengan
pasangan A+T lebih dominan juga terjadi di semua populasi pembanding dengan
pesentase melebihi 50%. Dominasi presentase A+T menurut Wibowo (2016),
umum ditemui pada sekuens dari DNA mitokondria. Komposisi basa nukleotida
pada COI menurut Kombong dan Arisuryanti (2018), lebih beragam dibandingkan
pada 16S dikarenakan laju evolusi yang lebih tinggi sementara 16S rRNA lebih
lestari. Hal tersebut menjadikan COI lebih sensitif untuk kajian intraspesifik dan di
sisi lain dapat digunakan untuk kajian interspesifik sebagaimana pernyataan
Nuryanto dan Solihin (2006), bahwa laju mutasi COI juga lebih tinggi dibanding
16S dan 12S rRNA sehingga dapat lebih efektif mengidentifikasi perbedaan
genetik antar populasi bahkan antar individu pada hampir di semua filum kecuali
pada filum Cnidaria. Ikatan A+T dan G+C juga berbeda yang menurut Irmawati
(2016), Ikatan A+T memiliki dua ikatan hidrogen sementara ikatan G+C memiliki
tiga ikatan hidrogen. Perbedaan jumlah ikatan hidrogen di antara basa nukleotida
menyebabkan ikatan A+T lebih lemah dibanding G+C sehingga komposisi A+T
33
lebih mudah untuk bermutasi. Analisa komposisi nukleotida dapat membuktikan
keunggulan COI dibanding situs lain pada mtDNA. Komposisi basa nukleotida
tiap populasi dapat dilihat pada tabel 1 dan penjelasan singkat dapat dilihat di
lampiran 9.
Tabel 1. Komoposisi Basa Nukleotida pada Seluruh Populasi
Grup Lokasi Jumlah individu
Basa Nukleotida (%)
C T A G
1 Lamongan (CSL) 10 28,96% 29,80% 23,98% 17,26% 2 Malang (MLG) 5 28,59% 30,15% 23,47% 17,79% 3 Kediri (KDR) 6 28,86% 29,88% 23,39% 17,87% 4 Mojokerto (MJT) 7 28,70% 30,04% 23,47% 17,79% 5 Jawa Tengah (JWT) 7 28,79% 29,86% 23,55% 17,79% 6 Jawa Barat (JWB) 7 28,86% 29,75% 23,58% 17,81% 7 Pulau Bali (PBL) 7 28,97% 29,65% 23,49% 17,90% 8 Sumatra (SMT) 3 29,71% 29,17% 24,49% 16,63%
Keterangan: Basa Citosin (C), Basa Timin (T), Basa Adenin (A), dan Basa
Guanin (G)
4.5 Analisis Indeks Keragaman
Analisis keragaman dilakukan dengan melihat hasil perhitungan indeks
keragaman berupa jumlah haplotipe yang disimbolkan dengan „h‟, keragaman
haplotipe disimbolkan „Hd‟ dan keragaman nukleotida disimbolkan „π‟. Angka-
angka tersebut diperoleh dari pengolahan lanjutan data chromatogram pada
aplikasi DNAsp v.6.12.1. pada semua populasi. Populasi utama maupun populasi
pembanding akan dikategorikan dan diperkirakan penyebab kondisi keragaman
genetiknya (interpretasi hasil). Keragaman genetik merupakan studi yang
menurut Amos dan Harwood (1998), merupakan tempat bergantungnya adaptasi
serta spesiasi suatu populasi. Keragaman yang tinggi dianggap merupakan
kondisi sehat, memiliki kemampuan baik untuk menanggapi penyakit, parasit,
predator serta perubahan lingkungan. Keragaman yang rendah sebaliknya,
dianggap membatasi suatu populasi menanggapi ancaman dalam jangka waktu
pendek maupun panjang. Salah satu faktor paling diperhatikan adalah
34
fragmentasi habitat suatu populasi yang dapat memperkecil ukuran populasi dan
penghambatan aliran gen. Dalam kondisi ekstrim, suatu populasi secara berkala
mengecil hingga membuat populasi tersebut sangat dirugikan dalam ukuran
sangat kecil, umum disebut sebagai bottleneck effect. Keragaman genetik pada
akhirnya diharapkan dapat menjelaskan kondisi suatu spesies atau populasi
dalam hal keseimbangan kondisi antara menguntungkan atau merugikan bagi
species ataupun populasi tersebut.
4.5.1 Analisis Indeks Keragaman Populasi Lamongan
Populasi CSL memiliki 3 grup Haplotipe dengan keragaman haplotipe
mencapai 0,644 dan keragaman nukleotida 0,00296. Keragaman haplotipe
sendiri memiliki standart deviasi dan dalam hal ini senilai 0,152 sedang untuk
keragaman nukleotida senilai 0,00064. Keragaman genetik berdasarkan
haplotipe dan nukleotida menurut Grant and Bowen (1998), memiliki empat
kategori dimana keragaman haplotipe dianggap tinggi jika lebih dari sama
dengan 0,5 dan keragaman nukleotida lebih dari sama dengan 0,5% atau setara
dengan 0,005. Kategori pertama jika kedua nilai terbilang rendah maka
dimungkinkan baru saja terjadi founder effect maupun bottleneck effect karena
keadaan wilayah secara periodik atau juga karena adanya struktur metapopulasi
di wilayah tersebut. Kategori kedua jika keragaman haplotipe tinggi dan
nukleotida rendah maka dimungkinkan populasi tersebut sedang dalam keadaan
baru berkembang atau ekspansi setelah mengalami kondisi keragaman genetik
rendah, pada kategori ini perkembangan populasi tergolong cepat dan terjadi
banyak mutasi-mutasi baru. Kategori ketiga jika keragaman nukleotida tinggi dan
haplotipe rendah, populasi tersebut sedang bercabang-cabang pada haplotipe,
dimungkinkan populasi tersebut sedang dalam keadaan stabil setelah terisolasi
maupun terjadi bottleneck effect. Kategori keempat memiliki nilai keragaman
35
tinggi baik haplotipe maupun nukleotida, hal ini dimungkinkan populasi tersebut
telah stabil setelah terjadi allopatrik atau populasi stabil bersekala besar yang
mengalami sejarah evolusi panjang.
Populasi CSL merupakan populasi dengan keragaman genetik kategori
kedua dimana keragaman haplotipe melebihi 0,5 (tinggi) namun keragaman
nukleotida dibawah 0,005 (rendah). Hal tersebut menunjukkan adanya
kemungkinan penurunan kualitas populasi akibat genetic drift. Populasi tersebut
diindikasi sedang bertumbuh setelah mengalami penurunan kualitas dengan
beberapa kemungkinan penyebab. Populasi CSL kemungkinan mengalami
penurunan kualitas populasi dikarenakan kawasan penangkapan berupa anak
sungai kecil yang memiliki banyak percabangan sehingga dapat terjadi founder
effect (keterbatasan indukan karena pemecahan populasi) pada populasi CSL.
Dengan kemungkinan tersebut, populasi CSL dapat dikatakan sebagai populasi
baru yang terpecah dari populasi utama, populasi utama dalam hal ini
diperkirakan adalah populasi di sungai utama DAS Bengawan Solo.
Kemungkinan lainnya setelah keadaan geografis penyebab terpecahnya populasi
utama sehingga muncul populasi CSL tersebut adalah status beberapa sampel
populasi CSL yang diambil kemungkinan masih dalam satu garis keturunan.
Status tersebut dimaksudkan untuk beberapa spesimen di antara sampel
populasi CSL tersebut kemungkinan merupakan anakan dari induk yang sama
karena ukuran tubuh sampel satu sama lain tidak jauh berbeda terutama pada
sampel dalam grup haplotipe 1 dan 2, detail anggota grup pada tiap grup
haplotipe dapat dilihat di tabel 3.
Tabel 2. Indeks Keragaman pada Seluruh Populasi
Grup Lokasi Jumlah bp
n h Hd π
1 Lamongan (CSL) 653 10 3 0,644 0,00296 2 Malang (MLG) 652 5 2 0,400 0,00245 3 Kediri (KDR) 652 6 3 0,733 0,00225
36
Grup Lokasi Jumlah bp
n h Hd π
4 Mojokerto (MJT) 652 7 2 0,286 0,00131 5 Jawa Tengah
(JWT) 631 7 4 0,857 0,02430
6 Jawa Barat (JWB) 652 7 5 0,905 0,03002 7 Pulau Bali (PBL) 652 7 3 0,667 0,01972 8 Sumatra (SMT) 611 3 3 1,000 0,04037
Keterangan: jumlah individu (n), jumlah haplotipe (h), keragaman haplotipe (Hd), dan keragaman nukleotida (π)
Tabel 3. Anggota Dalam Grup Haplotipe pada Seluruh Populasi No Haplotipe Jumlah Anggota dalam Haplotipe
1 Hap_1 3 CSL_01, CSL_08, CSL_09 2 Hap_2 6 CSL_02, CSL_03, CSL_04, CSL_05, CSL_07,
CSL_10 3 Hap_3 1 CSL_06 4 Hap_4 4 MLG_01, MLG_03, MLG_04, MLG_05 5 Hap_5 1 MLG_02 6 Hap_6 4 KDR_01, KDR_02, KDR_03, MJT_02 7 Hap_7 1 KDR_04 8 Hap_8 2 KDR_05, KDR_06 9 Hap_9 6 MJT_01, MJT_03, MJT_04, MJT_05, MJT_06,
MJT_07 10 Hap_10 2 JWT_01, JWT_02 11 Hap_11 1 JWT_03 12 Hap_12 2 JWT_04, JWT_06 13 Hap_13 2 JWT_05, JWT_07 14 Hap_14 2 JWB_01, JWB_02 15 Hap_15 1 JWB_03 16 Hap_16 1 JWB_04 17 Hap_17 1 JWB_05 18 Hap_18 2 JWB_06, JWB_07 19 Hap_19 4 PBL_01, PBL_02, PBL_03, PBL_04 20 Hap_20 1 PBL_05 21 Hap_21 2 PBL_06, PBL_07 22 Hap_22 1 SMT_01 23 Hap_23 1 SMT_02 24 Hap_24 1 SMT_03
4.5.2 Analisis Indeks Keragaman Seluruh Populasi
Populasi CSL yang masuk pada kategori kedua sama halnya dengan salah
satu populasi pembanding yaitu populasi KDR. Populasi JWT, JWB, PBL dan
SMT ada pada kategori keempat yang artinya populasi-populasi tersebut memiliki
keragaman genetik tinggi. Populasi lainnya yaitu MLG dan MJT masuk dalam
kategori pertama yang artinya memiliki keragaman genetik rendah. Populasi-
37
populasi yang masuk dalam kategori kedua dan keempat memiliki jumlah grup
haplotipe di atas 2 sedangkan populasi-populasi kategori pertama memiliki
jumlah haplotipe 2 dengan jumlah sampel sekuens 3 hingga 10 tiap populasi.
Jumlah haplotipe secara keseluruhan dari kedelapan grup adalah 24 grup
dengan jumlah keseluruhan sampel sekuens 52 individu. Jumlah pasangan basa
yang digunakan dari 611 hingga 653 bp. Keterangan lengkap dapat dilihat pada
tabel 2 dengan rincian anggota haplotipe pada tabel 3 dan penjelasan singkat
dapat dilihat di lampiran 9.
Populasi pada kategori pertama memiliki keragaman haplotipe tertinggi 0,4
dengan keragaman nukleotida tertinggi 0,00245 yaitu populasi MLG. Populasi-
populasi ini memiliki keragaman yang rendah dengan kemungkinan karena pada
populasi-populasi tersebut telah terjadi founder effect, bottleneck effect ataupun
baru saja terisolasi dikarenakan adanya perubahan lingkungan karena
pembangunan maupun aktifitas manusia lainnya. Untuk populasi MJT
diperkirakan merupakan pecahan populasi dari populasi KDR sebagaimana
dapat dilihat pada anggota haplotipe ke-6 dimana KDR_01-03 dari DAS Brantas,
Ngadiluwih, Kediri merupakan anggota grup haplotipe yang sama dengan
MJT_02 dari DAS Brantas, Kec. Ngoro, Mojokerto, Jawa Timur. Populasi KDR
lebih stabil dibandingkan populasi MJT sehingga diperkirakan populasi utama
adalah populasi KDR bukan MJT. Jarak antara lokasi kedua populasi tersebut
sekitar 106 km dan dimungkinkan populasi MJT baru saja terisolasi.
Populasi pada kategori kedua memiliki keragaman haplotipe tertinggi
0,733 (populasi KDR) dan keragaman nukleotida 0,00296 (populasi CSL).
Populasi KDR walaupun lebih stabil dari MJT, namun masih dalam kategori baru
terlepas dari keadaan bottleneck effect dan atau faktor lainnya sehingga sedang
dalam proses ekspansi populasi. Kondisi ini bila memang terjadi hal-hal tersebut
bisa jadi sangat lama untuk populasi KDR maupun CSL menjadi populasi yang
38
stabil dan masuk dalam kategori keempat.
Populasi pada kategori keempat memiliki keragaman haplotipe tertinggi
1,0 (populasi SMT) dengan keragaman nukleotida tertinggi 0,04037 yaitu
populasi SMT. Populasi SMT berasal dari 2 lokasi di pulau Sumatra yang
memiliki pemisah geografis berupa laut karena berupa pulau sehingga sangat
dimungkinkan populasi SMT sangat tinggi keragaman genetiknya. Perbedaan
wilayah tersebut sangat berpengaruh pada analisa keragaman genetik, namun
pada sampel yang memiliki wilayah sama pada populasi SMT juga didapati
perbedaan pada haplotipenya sehingga ada kemungkinan keragaman di tempat
tersebut yaitu Danau Laut Tawar, Kab. Aceh Utara, Aceh untuk SMT_01 hingga
SMT_02 memang tinggi namun diperlukan data lebih banyak untuk
memastikannya. Sampel SMT_03 dari Pulau Lingga, Kab. Lingga, Kepulauan
Riau sendiri dapat dinyatakan telah terpisah secara allopatrik. Populasi JWT
diambil dari 2 lokasi sementara populasi JWB dambil dari 6 lokasi sehingga
dimungkinkan hal tersebut menjadi penyebab keragaman populasi JWB lebih
tinggi dibanding keragaman populasi JWT karena aliran gen dimungkinkan sulit
terjadi karena pemisahan secara allopatrik sehingga muncul sub populasi
regional. Populasi PBL diambil dari 2 lokasi berbeda di Pulau Bali, Pulau Bali
sendiri merupakan wilayah Sunda Kecil yang bukan merupakan penyebaran ikan
dari keluarga Channidae secara alami sebagaimana pendapat Alviodinasyari et
al. (2019), bahwa persebaran ikan Channidae di Pulau Bali, Pulau Sulawesi dan
Kepulauan Maluku adalah hasil introduksi. Keragaman genetik yang tinggi di
populasi PBL ini merupakan tanda bahwa populasi tersebut telah stabil dan
diperkirakan introduksi spesies Channidae ke kawasan tersebut telah terjadi
sejak lama karena faktor kesengajaan maupun tidak di antara kedua pulau
tersebut. Persebaran ini kuat kaitannya dengan kegiatan manusia karena ikan
tersebut tidak dimungkinkan melakukan emigrasi melewati laut.
39
4.6 Struktur Populasi atau Diferensiasi Genetik
Hasil analisa Pairwise Fst tertinggi ada pada pasangan populasi Grup 1
yaitu CSL dengan seluruh grup. Nilai terendah diferensiasi populasi CSL dengan
populasi pembanding mulai dari 0.92533 (CSL-JWB) hingga tertinggi 0.98820
(CSL-MJT) dikarenakan spesies populasi CSL berbeda dengan seluruh populasi
pembanding yaitu Channa striata dengan pembanding Channa gachua atau C.
limbata sehingga tidak memungkinkan adanya pertukaran gen di antara populasi
CSL dengan lainnya walau masih dalam satu ekoregional seperti populasi CSL
dengan MJT. Kawasan Lamongan dan Mojokerto berdasarkan ekoregional
menurut Chua et al. (2019), tergabung dalam Central-East Java Ecoregion
(CEJ). Hal tersebut juga mengindikasikan spesiasi yang terjadi di antara kedua
spesies tersebut berdasarkan grup-grup pada laporan ini pada diferensiasi
genetiknya adalah di atas angka 0.92533. Hal tersebut dikarenakan nilai Fst
berpasangan untuk genetik tidaklah tentu sebagaimana pendapat Hutchison dan
Templeton (1999), kemutlakan Fst tidak layak dipakai karena umumnya di alam
suatu populasi tidak dalam keadaan setimbang bahkan untuk melihat hanyutan
gen maupun aliran gen antar populasi walaupun nilai Fst tetap menggambarkan
perbedaan gen populasi satu ke lainnya. Nilai Fst semakin tinggi maka semakin
kecil kemungkinan aliran gen terhubung bahkan dapat terjadi spesiasi di antara
keduanya sebagaimana hasil pengujian populasi CSL pada laporan ini.
Diferensiasi genetik pada seluruh populasi dapat dilihat pada tabel 4 .
Tabel 4. Diferensiasi Genetik pada Seluruh Populasi Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 Grup 5 Grup 6 Grup 7 Grup 8
Grup 1 0.00000
Grup 2 0.98571 0.00000
Grup 3 0.98624 0.45406 0.00000
Grup 4 0.98820 0.63345 0.68065 0.00000
40
Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 Grup 5 Grup 6 Grup 7 Grup 8
Grup 5 0.93813 0.46015 0.46042 0.52721 0.00000
Grup 6 0.92533 0.58050 0.59309 0.62198 0.29789 0.00000
Grup 7 0.94760 0.38702 0.37191 0.48936 0.26132 0.41148 0.00000
Grup 8 0.94673 0.73422 0.75481 0.78643 0.51312 0.43713 0.56747 0.00000
Populasi dengan perbedaan paling rendah pada pengujian ini merupakan
populasi JWT dengan JWB (0.29789) dan dengan PBL (0.26132). Secara
ekoregional, populasi JWT ada pada regional CEJ sementara populasi JWB
terbagi menjadi dua ekoregional yaitu Southern Sumatra-Western Java (SWJ)
pada sampel di sekitar Purwakarta dan Indian Ocean Slope of Sumatra and Java
(ISJ) sementara populasi PBL merupakan ekoregional pada Sunda Kecil yang
merupakan daerah introduksi. Populasi dengan nilai Fst berpasangan rendah
memiliki kemungkinan terjadinya aliran gen tinggi dimana ada kemungkinan ikan
Channa gachua pada ekoregional CEJ, SWJ maupun ISJ memiliki akses untuk
bertukar gen karena adanya perubahan ekologis dari aktivitas manusia sehingga
terjadi pertemuan dua subspecies dan terjadi perkawinan. Kemungkinan lain
seperti adanya upaya restocking, perdagangan dan lain sebagainya juga ada.
Hubungan dekat populasi JWT dengan PBL bisa jadi karena populasi PBL
berasal dari populasi JWT yang diintroduksi di wilayah tersebut.
Pembagian regional ekologis pada Chua et al. (2019), merupakan
pembagian ekologis berdasar daerah air tawar yang termasuk dalam proyek
Freshwater Ecoregions of the World. Pembagian regional ekologis tersebut
didasarkan oleh kajian-kajian ekologi spesies air tawar di masa lampau dan jejak
evolusi yang dipengaruhi oleh batas-batas hidrologis. Penggunaan pembagian
tersebut pada kajian genetika seperti pada penelitian ini akan membantu melihat
kemungkinan yang terjadi antar populasi. Pembagian regional ekologis di
Paparan Sunda dapat dilihat pada gambar 13.
41
Sumber: Chua et al., 2019
Gambar 13. Pembagian Paparan Sunda Berdasarkan Regional Ekologis Menjadi 13 Bagian. Aceh (ACH), Borneo Highlands (BHL), Central and East Java (CEJ), Eastern Borneo (EBR), Indian Ocean Slope of Sumatra and Java (ISJ), Kapuas (KPS), Malay Peninsula Eastern Slope (MPE), Northeastern Borneo (NEB), Northwestern Borneo (NWB), Southern Central Sumatra (SCS), Southeastern Borneo (SEB), Southern Sumatra-Western Java (SWJ), Northern Central Sumatra-Western Malaysia (SWM)
Perbedaan regional ekologis pada suatu populasi ke populasi lainnya
dapat menjadi mekanisme isolasi dan jika berlangsung dalam waktu lama dapat
menyebabkan spesiasi sebagaimana pendapat Fatmawati dan Muzzazinah
(2019), bahwa mekanisme isolasi dapat menyebabkan spesiasi hingga
munculnya perbedaan morfologis. Isolasi geografis dalam hal ini sejalan dengan
prinsip pembagian regional ekologis, dapat menyebabkan spesiasi allopatrik
(spesiasi akibat perbedaan geografis). Penyebab isolasi geografis dapat memicu
spesiasi adalah karena adanya pemberhentian aliran gen sehingga jarak genetik
subpopulasi ke populasi asalnya semakin jauh. Spesiasi juga mengakibatkan
42
ketika dua populasi yang terpecah dalam waktu lama tidak lagi dapat kawin
secara alami ketika bertemu. Mekanisme yang sama juga dapat menyebabkan
meningkatnya endemisme suatu wilayah.
43
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari penelitian keragaman genetik ikan gabus (Channa striata)
di Daerah Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo, Kabupaten Lamongan, Jawa
Timur adalah sebagai berikut. Populasi C. striata Lamongan (CSL) memiliki 3
grup Haplotipe dengan keragaman haplotipe mencapai 0,644 (tinggi) dan
keragaman nukleotida 0,00296 (rendah). Keragaman haplotipe sendiri memiliki
standart deviasi dan dalam hal ini senilai 0,152 sedang untuk keragaman
nukleotida senilai 0,00064. Nilai keragaman tersebut masuk kategori kedua yang
mengindikasikan kemungkinan populasi CSL sebelumnya telah melngalami
penurunan kualitas populasi dan saat ini sedang dalam proses perkembangan
atau ekspansi.
5.2 Saran
Saran dari penelitian ini berdasarkan proses serta hasil penulis adalah
sebagai berikut:
1. Populasi C. striata di daerah Sungelebak, Kabupaten Lamongan memiliki
keragaman genetik yang mendekati rendah. Penelitian lebih lanjut perlu
dilakukan untuk memastikan status asli keragaman tersebut dengan
metode yang mungkin lebih efektif dari metode dalam penelitian ini. Hasil
analisa keragaman tersebut menjadikan populasi ini lebih baik disilangkan
dengan populasi lain dalam upaya domestikasinya untuk meningkatkan
keragaman genetik guna mencari kombinasi sifat unggul dari komoditas
C. striata. Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan mengguakan region DNA
yang berbeda seperti menggunakan 16S rRNA pada mtDNA dan lain-lain.
44
2. Kajian genetika dengan sampel yang lebih banyak untuk membandingkan
diferensiasi C. striata dengan C. gachua/ C. limbata akan sangat berguna
untuk membedakan kedua spesies tersebut secara genetik terlebih jika
dilengkapi dengan analisa lain seperti morfologi dan morfometrik setiap
sampelnya untuk dikembangkan dalam kepentingan identifikasi dengan
standart baik.
3. Perlu adanya penelitian genetika terhadap populasi yang ada di Indonesia
baik spesies dalam penelitian ini maupun lainnya terutama pada ikan-ikan
endemik. Kajian terhadap ikan-ikan indigenous sendiri juga diperlukan
karena tidak menutup kemungkinan adanya spesiasi-spesiasi antara
spesies teridentifikasi hari ini.
4. Penelitian terhadap ikan C. striata pada seluruh kawasan Paparan Sunda
maupun daerah introduksi juga penting baik secara genetik atau secara
biologi molekuler secara umum sebagai dasar percepatan upaya
domestikasi.
5. Kegiatan-kegiatan evaluasi biodiversitas di Indonesia baik dari ekologi
hingga keragaman genetika suatu sub-populasi diharapkan dapat
diperbanyak dan percepat terlebih jika dapat menjadi pertimbangan
pembangunan baik dalam akuakultur maupun di luar akuakultur.
45
DAFTAR PUSTAKA
Aidah, S. (2020). Ensiklopedi Sukses Beternak Ikan Gabus. Yogyakarta: KBM Indonesia.
Alviodinasyari, R., Pribadi, E. S., & Soejoedono, R. D. (2019). Kadar protein terlarut dalam albumin ikan gabus (Channa striata dan Channa micropeltes) asal Bogor. Jurnal Veteriner, 20(3), 436-444.
Amos, W., & Harwood, J. (1998). Factors affecting levels of genetic diversity in natural populations. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences, 353(1366), 177-186.
Amrin, A. (2016). Data mining dengan regresi linier berganda untuk peramalan tingkat inflasi. Jurnal Techno Nusa Mandiri, 13(1), 74-79.
Aqmal-naser, Mohamad dan Ahmad, A. (2021). Preliminary checklist of freshwater fishes of Ulu Paip Eco-Park Forest, Kedah, Peninsular Malaysia. Malaysian Applied Biology Journal, 50(1).
Arifin, Otong Zenal; Kurniasih, Titin. (2016). Variasi genetik tiga populasi ikan nila (Oreochromis niloticus) berdasarkan polimorfisme mt-DNA. Jurnal Riset Akuakultur 2(1): 67-75.
Arisuryanti, T., Firdaus, N. U. N., & Hakim, L. (2020). Genetic characterization of striped snakehead (Channa striata Bloch, 1793) from Arut River, Central Kalimantan inferred from COI mitochondrial gene. AIP Conference Proceedings, 2260 (1).
Astirin, O. P., & Setyawan, A. D. (2000). Plankton biodiversity at Jabung Swamp, Lamongan and Tuban Districts. Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 1(2).
Avarre, J. C., Pouyaud, L., Kadarusman, K., Carman, O., & Junior, M. Z. (2018). Portrait of hatchery management profile on rainbow fish Melanotaenia boesemani (Allen & Cross, 1980) cultivation in Jakarta Area. Torani Journal of Fisheries and Marine Science, 81-92.
Blazej, R. G., Kumaresan, P., & Mathies, R. A. (2006). Microfabricated bioprocessor for integrated nanoliter-scale Sanger DNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(19), 7240-7245.
Bucklin, A., Frost, B., Bradford-Grieve, J., Allen, L., & Copley, N. (2003). Molecular systematic and phylogenetic assessment of 34 calanoid copepod species of the Calanidae and Clausocalanidae. Marine Biology, 142(2), 333-343.
Chua, K. W., Tan, H. H., & Yeo, D. C. (2019). Loss of endemic fish species drives impacts on functional richness, redundancy and vulnerability in freshwater ecoregions of Sundaland. Biological Conservation, 234, 72-81.
Conte-Grand, C., Britz, R., Dahanukar, N., Raghavan, R., Pethiyagoda, R., Tan, H. H., ... & Rüber, L. (2017). Barcoding snakeheads (Teleostei, Channidae) revisited: Discovering greater species diversity and resolving perpetuated taxonomic confusions. PLoS One, 12(9), e0184017.
Djumanto, Setyobudi, E., Simanjuntak, C. P., & Rahardjo, M. F. (2020).
46
Estimating the spawning and growth of striped snakehead Channa striata Bloch, 1793 in Lake Rawa Pening Indonesia. Scientific Reports, 10(1), 1-
11.
Doublet, V. (2010). Structure et Evolution du Génome Mitochondrial des Oniscidea (Crustacea, Isopoda). Doctoral dissertation, Université de Poitiers.
Fatmawati, D. A., & Muzzazinah, M. (2019). Persebaran Varanus salvator berkaitan dengan isolasi geografinya. Prosiding SNPS (Seminar Nasional Pendidikan Sains) (pp. 24-29).
Fuadi, M., Santoso, H., & Syauqi, A. (2017). Uji kandungan albumin ikan gabus (Channa striata) dalam perbedaan lingkungan air. Biosaintropis (Bioscience-Tropic), 3(1), 23-30.
Goodall-Copestake, W. P., G.A. Tarling and E. J. Murphy. (2012). On the comparison of population-level estimates of haplotype and nucleotide diversity: a case study using the gene cox1 in animals. Heredity.109: 50–56.
Grant, W. A. S., & Bowen, B. W. (1998). Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation. Journal of heredity, 89(5), 415-426.
Hamdi, A. S., & Bahruddin, E. (2015). Metode penelitian kuantitatif aplikasi dalam pendidikan. Deepublish.
Hamurdana, F. G. (2020). Analisis keragaman genetik ikan gabus (Channa gachua) berdasarkan DNA mitokondria region Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada daerah aliran Sungai Brantas Kecamatan Pacet dan Kecamatan Ngoro, Kabupaten Mojokerto. Universitas Brawijaya.
Harahap, M. R. (2018). Elektroforesis: Analisis elektronika terhadap biokimia genetika. CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, 2(1).
Harto, B. (2015). Analisis tingkat kepuasan pelanggan dengan pendekatan fuzzy servqual dalam upaya peningkatan kualitas pelayanan (studi kasus di bengkel resmi bajaj padang). Jurnal TeknoIf, 3(1).
Haryanto, H. (2019). Budidaya Ikan Gabus dan Keampuhannya. Yogyakarta: Laksana.
Herdiana, L., Kamal, M. M., Butet, N. A., & Affandi, R. (2017). Keragaman morfometrik dan genetik Gen COI belut sawah (Monopterus albus) asal empat populasi di Jawa Barat. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia, 22(3), 180-190.
Hutchison, D. W., & Templeton, A. R. (1999). Correlation of pairwise genetic and geographic distance measures: inferring the relative influences of gene flow and drift on the distribution of genetic variability. Evolution, 53(6), 1898-1914.
Ilmi, W., & Arisuryanti, T. (2018). Composition of mitochondrial DNA 16S nucleotide of dwarf snakehead (Channa gachua Hamilton, 1822) from Keji River, Magelang, Central Java. Journal of Tropical Biodiversity and Biotechnology, 3(2), 57-61.
Irmawati. 2016. Genetika Populasi Ikan. Penerbit Andi. Yogyakarta. 224 hlm.
47
Kantun, W. dan A. Mallawa. (2016). Biologi Tuna Madidihang (Thunnus albacares). Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. 226 hlm.
Kholil, K. N. A. (2019). Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa gachua) Berdasarkan DNA Mitokondria Region Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Perairan Hulu Sungai Brantas di Malang. Universitas Brawijaya.
Kombong, C. B. S., & Arisuryanti, T. (2018). The 16S and COI Mitochondrial DNA Nucleotide Composition of Stripped Snakehead (Channa striata, Bloch, 1793) from Lake Sentani, Jayapura, Papua. Jurnal Perikanan Universitas Gadjah Mada, 20(2), 57-62.
Kusmini, I. I., R. Gustiano, V. A. Prakoso, dan M. H. F. Ath-thar. (2016). Budidaya Ikan Gabus. Bogor: Penebar Swadaya.
Lutfitasari, M. A. (2020). Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa gachua) Berdasarkan DNA Mitokondria Region Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) di Sungai Brantas, Kecamatan Ngadiluwih, Kecamatan Mojo dan Kecamatan Kraas, Kabupaten Kediri. Universitas Brawijaya.
Marwayana, O. N. (2015). Ekstraksi asam Deoksiribonukleat (DNA) dari sampel jaringan otot. Jurnal oseana, 11(2), 1-9.
Muthiadin, C., Aziz, I. R., & Darojat, A. Z. (2018). DNA mitokondria untuk identifikasi ikan yang kaya spesies. Prosiding Seminar Nasional Biologi (Vol. 4, No. 1).
Nugroho, E. D., & Rahayu, D. A. (2018). Pengantar Bioteknologi:(Teori dan Aplikasi). Jakarta: Deepublish. 429 hlm.
Nuryanto, A., & Solihin, D. D. (2006). Variasi sekuens gen mitokondrial sitokrom C oksidase I dari siput lola (Trochus niloticus). Majalah Ilmiah Biologi BIOSFERA: A Scientific Journal, 23(1), 31-37.
Pearson, W. R. (2014). BLAST and FASTA similarity searching for multiple sequence alignment. Multiple sequence alignment methods (pp. 75-101). Humana Press, Totowa, NJ.
Pertiwi, N. P. D., & Watiniasih, N. L. (2013). Optimasi amplifikasi DNA menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) pada ikan karang anggota famili pseudochromidae (dottyback) untuk identifikasi spesies secara molekular. Jurnal Biologi Udayana, 19(2).
Prianto, E., Puspasari, R., Kartamihardja, E. S., Zulfia, N., Rachmawati, P., & Oktaviani, D. (2015). Kajian kebijakan konservasi sumber daya ikan di Paparan Sunda. Prosiding Nasional Ikan ke, 8, 29-40.
Rahayu, G. K., Solihin, D. D., & Butet, N. A. (2021). Population diversity of striped snakehead, Channa striata (Bloch, 1793) from Bekasi, West Java and Barito Kuala, South Kalimantan using Cytochrome B gene. Jurnal Iktiologi Indonesia, 21(1), 61-73.
Requieron, E. A., Torres, M. A. J., & Demayo, C. G. (2012). Applications of relative warp analysis in describing of scale shape morphology between sexes of the snakehead fish Channa striata. International Journal of Biological, Ecological and Environmental Sciences, 1(6), 205-209.
Sasmito, D. E. K., Kurniawan, R., & Muhimmah, I. (2014). Karakteristik primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk sekuensing DNA: mini
48
review. Seminar Nasional Informatika Medis (SNIMed) (No. 5, pp. 93-102).
Syafei, L. S., & Sudinno, D. (2018). Ikan asing invasif, tantangan keberlanjutan biodiversitas perairan. Jurnal Penyuluhan Perikanan dan Kelautan, 12(3), 149-165.
Tasma, I. M. 2015. Pemanfaatan teknologi sekuensing genom untuk mempercepat program pemuliaan tanaman. J. Litbang. 34 (4): 159-168.
Tindi, M., Mamangkey, N. G. F., & Wullur, S. (2017). DNA barcode dan analisis filogenetik molekuler beberapa jenis bivalvia asal perairan Sulawesi Utara berdasarkan gen COI. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis, 5(2), 32-38.
Triyani, Y., Nafsi, N., Yuniarti, L., Sekarwana, N., Sutedja, E., Gurnida, D. A., ... & Alisjahbana, B. (2018). Rancangan primer spesifik gen Macrophage Mannose Receptor (MMR) untuk Polymerase Chain Reaction (PCR) dan sekuensing Deoxyribo Nucleic Acid (DNA). Indonesian Journal of Clinical Pathology and Medical Laboratory, 22(2), 158-162.
Utomo, A. D., Adjie, S., Muflikah, N., & Wibowo, A. (2017). Distribusi jenis ikan dan kualitas perairan di Bengawan Solo. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia, 12(2), 89-103.
Utomo, A. H. P., Pramono, T. B., Soedibya, H. T., Sukardi, P., & Syakuri, H. (2021). Analisis Polimorfisme DNA Ikan Gabus (Channa striata) Berbeda Ukuran Menggunakan Teknik RAPD. Sainteks, 17(2), 133-143.
Wibowo, A. (2016). Keragaman Genetik Ikan Semah (Tor tambroides Bleker 1854) di Sungai Manna, Bengkulu dan Sungai Semanka, Lampung. BAWAL Widya Riset Perikanan Tangkap, 4(2), 105-112.
Yusron, E. (2005). Pemanfaatan keragaman genetik dalam pengelolaan sumberdaya hayati laut. Oseana, 30(2), 29-34.
49
GLOSARIUM
A
Adenin : Jenis basa nukleotida dari golongan purin
Albumin : Protein utama dalam darah untuk proses osmosis
Allopatrik : Spesiasi karena perbedaan geografis
Amplifikasi DNA : Penggandaan untai DNA dengan metode PCR
B
Bottleneck effect : Terjadinya pengurangan ukuran populasi disebabkan
presentase kematian ataupun ketidak mampuan
reproduksi pada anggota suatu populasi
C
Channidae : Keluarga ikan gabus (snakehead) dalam taksonomi
Citosin/ Sitosin : Jenis basa nukleotida dari golongan pirimidin
Cytochrome
Oxidase
: Situs pengkode protein khusus pada mtDNA
D
Daerah Aliran
Sungai
: Garis bayang yang memisahkan suatu aliran dengan
aliran lainnya
Delesi : Hilangnya bagian DNA karena tidak terduplikasi atau
hilang ketika replikasi berlangsung
Diferensiasi
Genetik
: Nilai perbedaan genetik antara populasi satu dengan
lainnya
DNA Mitokondria : Materi genetik DNA pada mitokondria
E
Ekologi : Interaksi mahluk hidup dengan mahluk hidp lain maupun
dengan lingkungannya
Ekstraksi DNA : Proses pemisahan DNA dari unsur lain dalam jaringan
Elektroforesis : Analisis kimiawi berdasar pergerakan sel dalam medan
listrik dikarenakan muatan sel tersebut
Evolusi : Perubahan mahluk hidup secara alami yang terjadi
dalam waktu lama
F
Founder effect : Kejadian terbentuknya populasi baru dengan ukuran
keragaman populasi kecil
50
G
Guanin : Jenis basa nukleotida dari golonga purin
H
Haplotipe : Rangkaian polimorfisme pada individu
I
Ikhtiogeografis : Ilmu tentang penyebaran geografis ikan, termasuk
sejarah dan latar belakang penyebaran
Indeks
Keragaman
: Evaluasi keragaman genetik pada suatu populasi
Insersi : Penyisipan basa nukleotida pada gen
Inkubasi DNA : Manipulasi lingkungan untuk mengeluarkan DNA dari
jaringan (proses lisis pada isolasi DNA)
Intron : Urutan nukleotida dalam gen yang tidak terpakai (non-
coding region)
J
Jarak Evolusi : Evaluasi perbedaan genetik dengan kriteria least
square, minimum evolution, neighbor joining, dan
distance measure.
L
Laju Mutasi/
Evolusi
: Banyaknya peluang kejadian mutasi spesifik yang terjadi
dalam satu satuan waktu tertentu
M
Mitokondria : Organel penghasil energi pada sebagian besar mahluk
hidup eukariotik
Mutasi : Perubahan struktur materi genetik yang dapat
diwariskan secara genetis
N
Nukleotida : Materi genetik yang memiliki struktur punggung berupa
gugus fosfat
P
Populasi : Kumpulan individu sejenis pada tempat yang sama dan
51
dapat kawin antara satu sama lain
R
Regional
Ekologis
: Pembagian suatu wilayah berdasarkan sejarah geografi
maupun ekologinya
S
Sekuens :
Sifat Lestari : Kecil kemungkinan terjadi mutasi baik delesi maupun
insersi
Spesiasi : Proses terjadinya pemecahan suatu spesies menjadi
spesies berbeda berdasar taksonomi
T
Taksonomi : Ilmu yang mempelajari terkait penggolongan atau
sistematika mahluk hidup
Timin : Jenis basa nukleotida dari golongan pirimidin
52
LAMPIRAN
Lampiran 1. Fungsi Alat dan Bahan
No Nama Alat Fungsi
1. Spindown Untuk menghomogenkan larutan 2. Section Set Untuk membantu mempermudah preparasi
sampel 3. Gelas Ukur Untuk mengukur volume TAE buffer 4. Cool Box Untuk wadah sampel di lemari pendingin/ freezer 5. Mikropipet Untuk mengambil larutan dengan skala yang
telah ditentukan 6. Bunsen Untuk membantu dalam fiksasi alat 7. Freezer Untuk menyimpan reagen dan sampel dalam
kondisi suhu rendah 8. Vortex Untuk menghomogenkan reagen dengan sampel 9. Thermal Cycler Untuk pengujian virus pada tahap amplifikasi/
PCR 10. Cetakan Gel Untuk mencetak agar/ gel agarose 11. Electroforesis
Machine Untuk alat pemisahan molekul
12. Power Supplay Untuk sumber medan listrik pada proses elektroforesis dan PCR
13. UV Transilluminator Untuk membatu pembacaan hasil elektroforesis 14. Rak Tube Untuk tempat meletakkan tube 15. Electrical Balance Untuk menimbang bahan dalam bentuk bubuk 16 Centrifuge Untuk alat memisahkan residu dan supernatant
pada sampel yang diuji 17. Erlenmeyer Untuk wadah pembuatan gel agarose/agar 18. Microwave Untuk memanaskan/ menghomogenkan bubuk
gel agarose/ agar
19. Incubator Untuk alat inkubasi sampel 20. Laptop Untuk membantu proses analisa hasil
No Nama Bahan Fungsi
1. TNESU8 Buffer Sebagai pelisis kandungan pada sampel 2. Micro Tube (1.5 ml
dan 0.2 ml) Sebagai tempat reagen dan sampel yang akan diuji
3. NaCL 5M Sebagai bahan pembantu osmolaritas sel 4. PCR Tube Sebagai wadah sampel PCR 5. Akuades Steril Sebagai pelarut 6. Mikro Tip Sebagai bahan pembantu mikropipet mengambil
larutan 7. Proteinase-K Sebagai pendegradasi protein dalam sel 8. Phenol:Cloroform
(1:1) Sebagai pengendap protein lain yang tidak diinginkan
9. Cloroform:Isoamyl Sebagai pengikat makro molekul selain DNA
53
Alchohol (1:1) 10. Ethanol 70 % Sebagai larutan peluruh dan presipitasi 11. Ethanol 96-99 % Sebagai larutan peluruh dan presipitasi 12. Agarose Sebagai media cetakan dalam proses
elektroforesis 13. TE Buffer Sebagai larutan penyangga pH DNA 14. TAE 1x Sebagai pelarut agarose dan larutan dalam
elektroforesis 15. GoTaq PCR Mix Sebagai larutan yang digunakan dalam
amplifikasi 16 Primer Fish F1R1
dan F2R2 Sebagai pembaca situs target untuk diamplifikasi
17. ddH2O Sebagai pelarut pada proses PCR 18. DNA Ladder (1kb) Sebagai marker DNA 19. Template DNA Uji Sebagai template objek yang akan diamplifikasi 20. 21.
Loading Dye Ethidium Bromide (EtBr)
Sebagai pewarna dan pemberat pada amplikon Sebagai penanda yang dapat berpendar ketika terpapar UV
54
Lampiran 2. Diagram Alur Kegiatan
Sampling pada daerah yang dituju dan
memastikan (identifikasi) sampel didapat
sesuai target atau bukan.
Dokumentasi sampel yang didapat dengan
jelas sehingga dapat diidentifikasi melalui
foto oleh orang lain di kemudian waktu.
Preparasi sampel yang didapat dengan
mengambil sedikit bagian tubuh sampel
untuk kemudian diproses lebih lanjut.
Ekstraksi sampel yang didapat dengan
beberapa tahapan yang telah dijelaskan
dalam laporan ini sebelumnya.
Amplifikasi DNA yang didapat dengan
beberapa tahapan yang telah dijelaskan
dalam laporan ini sebelumnya.
Uji Kualitatif (Elektroforesis) hasil
amplifikasi yang didapat dengan beberapa
tahapan yang telah dijelaskan dalam
laporan ini sebelumnya.
Sekuensing hasil amplifikasi yang didapat
dengan mengirimkan amplikon ke PT
Genetika Science.
Analisis Data hasil sekuensing dengan
bantuan beberapa aplikasi untuk
mendapatkan index keragaman dan
diferensiasi genetik.
Interpretasi hasil analisis data oleh
mahasiswa bersangkutan.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
55
Lampiran 3. Dokumentasi Spesimen yang Digunakan
-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 01
-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 02
60
Lampiran 4. Data Set yang Digunakan
>CSL_01
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGAAATTGACTTGTTCCTCTTATG
ATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGAT
TGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCCGG
GGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCCCA
CGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGTGT
GTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAAAC
CCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCCTATTTGTATGGGCTATTTTAATT
ACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACAA
TGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTGG
AGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_02
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT
GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG
ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC
GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC
CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT
GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA
ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA
TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA
ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG
GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_03
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT
GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG
ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC
GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC
CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT
GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA
ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA
61
TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA
ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG
GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_04
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT
GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG
ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC
GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC
CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT
GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA
ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA
TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA
ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG
GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_05
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT
GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG
ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC
GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC
CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT
GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA
ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA
TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA
ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG
GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_06
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATGATTGGAGGCTTCGGAAATTGACTTGTTCCTCTTAT
GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG
ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC
GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC
CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT
GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA
ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCCTATTTGTATGGGCTATTTTAA
62
TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA
ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG
GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_07
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT
GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG
ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC
GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC
CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT
GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA
ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA
TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA
ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG
GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_08
CCCTTTATCTAGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACGA
TCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCAT
GGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGAAATTGACTTGTTCCTCTTATGA
TTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGATT
GCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCCGGG
GCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGTGTG
TCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAAACC
CCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCCTATTTGTATGGGCTATTTTAATTA
CAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACAAT
GCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTGG
AGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_09
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGAAATTGACTTGTTCCTCTTATG
ATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGAT
TGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCCGG
GGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCCCA
CGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGTGT
GTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAAAC
CCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCCTATTTGTATGGGCTATTTTAATT
63
ACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACAA
TGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTGG
AGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>CSL_10
CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA
GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG
ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA
TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT
GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG
ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC
GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC
CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT
GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA
ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA
TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA
ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG
GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT
>MLG_01
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATTTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MLG_02
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCATTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTGTTAATATAAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
64
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA
GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MLG_03
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATTTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MLG_04
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATTTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MLG_05
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATTTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
65
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>KDR_01
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>KDR_02
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>KDR_03
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
66
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>KDR_04
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTTCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTGTTAATATAAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA
GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>KDR_05
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTGTCAATATAAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA
GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>KDR_06
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTGTCAATATAAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
67
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA
GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MJT_01
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MJT_02
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MJT_03
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
68
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MJT_04
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MJT_05
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MJT_06
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
69
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>MJT_07
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG
GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC
>JWT_01
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCACGAATGAATAATATAAGTTTTTGACT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGTGTCT
CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGAG
GAGACCCAGTTCTTTACCAGCATTTA
>JWT_02
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCACGAATGAATAATATAAGTTTTTGACT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGTGTCT
CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC
70
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGAG
GAGACCCAGTTCTTTACCAGCATTTA
>JWT_03
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATGAATAATATAAGTTTTTGACT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTGGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGTGTCT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGAG
GAGACCCAATTCTTTACCAGCATTTA
>JWT_04
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCAATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTCCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGCACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTTACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA
>JWT_05
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCAATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGCACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
71
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTTACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA
>JWT_06
TTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAGCCTTCTAATTCGAGCTGAGCT
TAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGACCAGATTTATAATGTGATCGTA
ACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCATAGTTATGCCAATAATAATCGG
AGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGATTGGGGCCCCTGACATAGCC
TTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCTCCTCCCTCCCTCTTTCCTCCT
CCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGGGCCGGCACAGGCTGAACAGT
CTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCACGCAGGAGCATCCGTGGATCT
CGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGCGCAATCA
ACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCTCCCGCCATCTCCCAATACCAG
ACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCACTGCCATTCTCCTCCTCCTCTC
TTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATACTACTTACAGACCGAAACTTA
AACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAAC
ATTTA
>JWT_07
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCAATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGCACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTTACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA
>JWB_01
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGCGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATAAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTATTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCCCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTCT
CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATCACAACTATCATTAATATGAAACCC
CCCGCCATCTCCCAATATCAAACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCA
72
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACGAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAGCACTTA
>JWB_02
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGCGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATAAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTATTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCCCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTCT
CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATCACAACTATCATTAATATGAAACCC
CCCGCCATCTCCCAATATCAAACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACGAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAGCACTTA
>JWB_03
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGCGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATAAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTATTAGCCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCCCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTCT
CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATCACAACTATCATTAATATGAAACCC
CCCGCCATCTCCCAATATCAAACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACGAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAGCACTTA
>JWB_04
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAACCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATCTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGGCTAATTCCTCTTATG
ATTGGGGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAATATAAGTTTTTGAC
TCCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGG
GGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCA
CGCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGGC
CTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACC
TCCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
73
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTGGCCGCCGGCATCACAAT
ACTATTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAGCATTTA
>JWB_05
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGGGCTCTTTTAGGCAACGA
CCAGATCTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCA
TAGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGGCTAATTCCTCTTATG
ATTGGGGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAATATAAGTTTTTGAC
TCCTCCCTCCCTCTTTCCTTCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGG
GGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCC
ACGCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGG
TCTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAAC
CTCCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAAT
CACTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTGGCCGCCGGCATCACA
ATACTATTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGG
GAGGAGACCCAATTCTTTACCAGCATTTA
>JWB_06
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACATGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGGCTAATTCCTCTTATGA
TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATGAACAATATGAGTTTTTGACT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTTTCTTTACATCTTGCAGGTGTCT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC
TGCCATTCTCCTCCTTCTCTCTTTACCAGTCCTAGCTGCCGGCATCACGATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGAG
GAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA
>JWB_07
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACATGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGGCTAATTCCTCTTATGA
TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATGAACAATATGAGTTTTTGACT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTTTCTTTACATCTTGCAGGTGTCT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC
CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC
74
TGCCATTCTCCTCCTTCTCTCTTTACCAGTCCTAGCTGCCGGCATCACGATA
CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGAG
GAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA
>PBL_01
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAACATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA
GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTA
>PBL_02
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAACATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA
GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTA
>PBL_03
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAACATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
75
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA
GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTA
>PBL_04
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA
TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC
GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAACATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA
GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTA
>PBL_05
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTACAATGTCATCGTGACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATACCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTCATTCCTCTTATGA
TTGGAGCCCCTGACATAGCCTTCCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
ACTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTGACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCTGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTCTGAGCCATTTTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA
>PBL_06
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTACAATGTCATCGTGACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATACCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTCATTCCTCTTATGA
TTGGAGCCCCTGACATAGCCTTCCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
ACTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCTGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTCTGAGCCATTTTAATCA
76
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA
>PBL_07
CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG
CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC
CAGATTTACAATGTCATCGTGACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT
AGTTATACCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTCATTCCTCTTATGA
TTGGAGCCCCTGACATAGCCTTCCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT
ACTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG
GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC
GCAGGAGCATCTGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGGTTT
CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT
CCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTCTGAGCCATTTTAATCA
CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT
ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGA
GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA
>SMT_01
CAGCCCTGAGCCTACTTATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCCGGCGCTCTTT
TAGGCAACGACCAGATTTATAATGTAATCGTAACAGCCCACGCCTTCGTAAT
GATCTTTTTCATAGTCATGCCCATAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAA
TTCCTCTTATGATCGGTGCCCCTGACATAGCCTTTCCTCGCATAAATAACAT
GAGTTTTTGGCTCCTTCCTCCTTCTTTTCTCCTTCTACTAACCTCTTCCGTTG
TAGAAGCCGGGGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGTA
ACCTGGCCCACGCAGGAGCATCCGTGGACCTTGCCATCTTCTCTTTACACC
TAGCAGGTGTCTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACAATCATT
AATATAAAACCTCCCGCCATCTCCCAATACCAAACACCTCTATTCGTTTGAG
CCATTCTAATCACTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTGCCAGTCCTAGCTGC
CGGCATCACAATACTACTAACAGACCGAAATTTAAACACAACTTTCTTTGACC
CGGCTGGGGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAACACTTATTCTGATTCTTTGG
C
>SMT_02
CAGCCCTGAGCCTACTTATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCCGGCGCTCTTT
TAGGCAACGACCAGATTTATAATGTAATCGTAACAGCCCACGCCTTCGTAAT
GATCTTTTTCATAGTCATGCCCATAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAA
TTCCTCTTATGATCGGTGCCCCTGACATAGCCTTTCCTCGCATAAATAACAT
GAGTTTTTGGCTCCTTCCTCCTTCTTTTCTCCTTCTACTAACCTCTTCCGTTTT
AGAAGCCGGGGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGTA
ACCTGGCCCACGCAGGAGCATCCGTGGACCTTGCCATCTTCTCTTTACACC
TAGCAGGTGTCTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACAATCATT
AATATAAAACCTCCCGCCATCTCCCAATACCAAACACCTCTATTCGTTTGAG
CCATTCTAATCACTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTGCCAGTCCTAGCTGC
77
CGGCATCACAATACTACTAACAGACCGAAATTTAAACACAACTTTCTTTGACC
CGGCTGGGGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAACACTTATTCTGATTCTTTGG
C
>SMT_03
GGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAGCCTACTGATTCGAGC
TGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGACCAGATTTATAATGTC
ATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCATAGTTATGCCCATAAT
AATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGATTGGTGCCCCTGAC
ATAGCCTTTCCCCGAATAAATAATATGAGTTTTTGGCTCCTCCCTCCCTCTTT
CCTCCTTTTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGGGCCGGAACAGGCTG
AACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCACGCAGGAGCATCCGT
GGATCTCGCCATCTTTTCTTTGCATCTTGCAGGTGTCTCCTCAATTTTAGGC
GCAATCAACTTTATCACAACTATCATTAATATAAAACCTCCCGCCATCTCCCA
GTATCAAACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCACTGCCATTCTCCTCC
TCCTCTCTTTGCCAGTCCTAGCCGCTGGCATCACAATACTACTAACAGACCG
AAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGAGGAGACCCAATTCTT
TACCAACATTTATTC
78
Lampiran 5. Detail Sampel sebagai Data Primer dan Sekunder
A. Detail Lokasi
No. Teridentifikasi Sebagai/
Tag Lokasi Pengambilan
Jumlah Ind/
Total
1.1 Channa striata/ CSL_01-10
DAS Bengawan Solo, Sungelebak, Kec. Karanggeneng, Kab. Lamongan, Jawa Timur
10/10
2.1 Channa gachua/ MLG_01 DAS Brantas, Kedungrejo, Kec. Pakis, Kab. Malang, Jawa Timur
1/5
2.2 Channa gachua/ MLG_02 DAS Brantas, Torongrejo, Kec. Junrejo, Batu, Jawa Timur
1/5
2.3 Channa gachua/ MLG_03 DAS Brantas, Semanding, Kec. Dau, Kab. Malang, Jawa Timur
1/5
2.4 Channa gachua/ MLG_04 DAS Brantas, Punten, Kec. Bumiaji, Batu, Jawa Timur
1/5
2.5 Channa gachua/ MLG_05 DAS Brantas, Cinde, Kec. Bumiaji, Batu, Jawa Timur
1/5
3.1 Channa gachua/ KDR_01-
03 DAS Brantas, Ngadiluwih, Kediri 3/6
3.2 Channa gachua/ KDR_04 DAS Brantas, Mojo, Kediri 1/6
3.3 Channa gachua/ KDR_05-06
DAS Brantas, Kras, Kediri 2/6
4.1 Channa gachua/ MJT_01-03
DAS Brantas, Kec. Ngoro, Mojokerto, Jawa Timur
3/7
4.2 Channa gachua/ MJT_04-07
DAS Brantas, Kec. Pacet, Mojokerto, Jawa Timur
4/7
5.1 Channa gachua/ JWT_01-03
Kali Longkrang, Kab. Tegal, Jawa Tengah
3/7
5.2 Channa gachua/ JWT_04-07
Sungai Samin, Kab. Karang Anyar, Jawa Tengah
4/7
6.1 Channa gachua/ JWB_01 Sungai Ci Baruay, Kab. Tasikmalaya, Jawa Barat
1/7
6.2 Channa gachua/ JWB_02-03
Sungai Ci Galugur, Kab. Tasikmalaya, Jawa Barat
2/7
6.3 Channa gachua/ JWB_04 Sungai Ci Asem, Kab. Purwakarta, Jawa Barat
1/7
6.4 Channa gachua/ JWB_05 Sungai Ci Nantke, Kab. Purwakarta, Jawa Barat
1/7
6.5 Channa gachua/ JWB_06 Sungai Cisiih, Kab. Pandeglang, Banten
1/7
6.6 Channa gachua/ JWB_07 Sungai Cijalarang, Kab. Pandeglang, Banten
1/7
7.1 Channa gachua/ PBL_01-04
Sungai Tukad Mawa, Kab. Tabanan, Bali
4/7
7.2 Channa gachua/ PBL_05-07
Sungai Bendung Bekel, Kab. Jembrana, Bali
3/7
8.1 Channa gachua/ SMT_01-02
Danau Laut Tawar, Kab. Aceh Utara, Aceh
2/3
8.2 Channa limbata/ SMT_03 Pulau Lingga, Kab. Lingga, 1/3
79
Kepulauan Riau
B. Detail Sumber Data
Tag Sumber Jumlah Specimen Code
Assesion Number
Kutipan Publikasi
CSL_01-10
Data Pribadi 10 - - -
MLG_01-05
Publikasi Skripsi
5 - - Kholil, 2019
KDR_01-06
Publikasi Skripsi
6 - - Lutfitasari, 2020
MJT_01-07
Publikasi Skripsi
7 - - Hamurdana, 2020
JWT_01-03
GenBank 3 BIF0893 BIF0891 BIF0888
MG699751.1 MG699750.1 MG699749.1
-
JWT_04-07
GenBank 4 BIF1837 BIF1835 BIF1841 BIF1836
MG699782.1 MG699781.1 MG699774.1 MG699773.1
-
JWB_01 GenBank 1 BIF0629 MG699748.1 -
JWB_02-03
GenBank 2 BIF0594 BIF0595
MG699745.1 MG699737.1
-
JWB_04 GenBank 1 BIF0500 MG699747.1 -
JWB_05 GenBank 1 BIF0448 MG699742.1 -
JWB_06 GenBank 1 BIF1525 KU692412.1 -
JWB_07 GenBank 1 BIF1545 KT960758.1 -
PBL_01-04
GenBank 4 BIF2956 BIF2955 BIF2958 BIF2957
MG699784.1 MG699779.1 MG699765.1 MG699763.1
-
PBL_05-07
GenBank 3 BIF2509 BIF2508 BIF2510
MG699689.1 MG699766.1 MG699760.1
-
SMT_01-02
GenBank 2 L1 L7
HM345938.1 HM345939.1
-
SMT_03 GenBank 1 IL15-0265
LC190132.1 -
80
Lampiran 6. Prosedur Pengolahan Data Analisa Keragaman Genetik
A. Chromas v.2.6.6
Buka aplikasi lalu pilih menu „File‟, kemudian pilih „Open‟ atau dapat
menggunakan shortcut keyboard „Ctrl + O‟.
Pilih file dengan format „.ab1‟ atau „chromatogram‟ yang akan diolah.
Hapus noise (bagian bertumpuk) pada data di bagian depan supaya tidak
mengganggu data yang akan diolah. Jumlah basa yang dihapus diusahakan
tidak melebihi 20 bp karena ditakutkan mengenai coding region dari data
tersebut. Klik pada bagian akhir sekitar basa nukleotida yang ingin
dihapuskan lalu klik menu „Edit‟ kemudian pilih „Delete Upstream‟ atau dapat
menggunakan shortcut keyboard „Ctrl + Shift + L‟.
81
Hapus pembatas sesuai dengan komplementer primer yang digunakan
dengan memasukkan 6 urutan basa tersebut pada kolom pencarian setelah
menampilkannya dengan shortcut keyboard „Ctrl + F‟. Klik tombol „Next‟
hingga paling akhir dengan ciri berhenti pada urutan basa sekitar 650 bp.
Klik menu „Edit‟ kemudian pilih „Delete Downstream‟ atau dapat
menggunakan shortcut keyboard „Ctrl + Shift + R‟.
Setelah editing selesai, klik menu „File‟ dan klik „Save As‟ dengan format file
„.fa‟ atau „FA File‟. Kemudian keluar atau lanjutkan pada file berikutnya
dengan mengulangi prosedur aplikasi ini dari awal.
B. UGENE v.1.31.1
Buka aplikasi lalu pilih menu „File‟, kemudian pilih „Open‟ atau dapat
menggunakan shortcut keyboard „Ctrl + O‟.
Pilih file dengan format „.ab1‟ hasil aplikasi Chromas sebelumnya, baik file
forward maupun reverse-nya yang akan diolah sekaligus.
82
Klik menu „Tools‟, lanjutkan ke „Sanger Data Analysis‟ kemudian pilih „Read
De Novo Assembly (with CAP3)‟.
Pada jendela „Contig Assembly with CAP3‟, klik „add‟ dan pilih dua file yang
sama seperti sebelumnya lalu klik „run‟.
Setelah terbentuk konsensus, klik „contig... (sesuai tulisan)‟ kemudian klik
kanan dan lanjutkan pada menu „export‟ dan klik „Export Selected
Sequence(s)‟.
83
Pilih format „FASTA‟, dapat berupa „FA File‟ (.fa) untuk menyimpan.
Kemudian keluar atau lanjutkan pada file berikutnya dengan mengulangi
prosedur aplikasi ini dari awal.
C. Data Set Primer
Berkas hasil UGENE dalam format FASTA dibuka dengan Note Pad
kemudian disalin ke Microsoft Word.
Data ditata dengan kondisi tidak ada „Space‟ maupun „Enter‟ di antara basa
nukleotida dalam satu sampel sekuens. Setiap sekuens diawali dengan
nama sekuens dengan tanda „>‟ terlebih dahulu sebagaimana bisa dilihat di
gambar. Masukkan semua data Fasta dalam satu file.
D. Data Set Sekunder dari Gen Bank
Akses web NCBI dengan alamat „https://www.ncbi.nlm.nih.gov/‟ kemudian
ubah pengaturan pencarian „All Database‟ ke „Nucleotide‟.
Masukkan keyword seperti nama species, daerah dan situs DNA yang
digunakan kemudian pilih data paling sesuai.
84
Salin bentuk FASTA pada hasil tersebut dan gabungkan dengan data set
primer. Sesuaikan dengan format penulisan sebelumnya.
E. Identifikasi dengan BLAST
Dari NCBI, masuk ke menu BLAST
Pilih BLAST pada Nukleotide
Masukkan file konsensus lalu klik BLAST
85
F. MESQUITE v.3.5.1
Membuka aplikasi, buka data set berupa plain text pada menu „File‟ atau
shortcut keyboard „Ctrl + O‟. Pilih „FASTA (DNA/RNA)‟ lalu klik „OK‟.
Sekuens kemudian ditata dengan menu „move tool‟ (gambar tangan
berpanah kanan kiri paling bawah sebelah kanan). Setelah tertata atau
tersejajarkan, sekuens lebihan dapat dihapus.
86
File kemudian disimpan dalam bentuk FASTA dengan fitur „Export‟ pada
menu „File‟.
Pastikan mengaktifkan opsi „Include Gaps‟.
G. DNAsp v.6.12.01
Jalankan aplikasi lalu buka hasil dari Mesquite berupa FASTA/ NEXUS pada
menu „File‟ atau shortcut keyboard „Ctrl + O‟.
Ubah „Nucleotide Sequence Format‟ seperti berikut untuk analisa khusus
sampel serupa pada penelitian ini. Fitur dapat diakses pada menu „Data‟ lalu
dilanjutkan „Format‟.
87
Ubah „Genetic Code‟ menjadi diperuntukkan untuk „mtDNA Mammals‟ lalu
buat grup pada „Define Sequnce Set‟. Klik „Update All Entries‟ jika grouping
telah selesai.
Hasil dapat dilihat pada menu „Overview‟ dilanjutkan ke „Polymorphism Data‟
lalu simpan hasil tiap grup pada menu „File‟ dilanjutkan „Save Current Data‟
dengan format file berupa „Arlequin (.arq)‟.
88
H. Arlequin v.3.5.2
Jalankan aplikasi kemudian klik menu „Open Project‟ dan pilih hasil aplikasi
sebelumnya dalam format „Arlequin (.arq)‟.
89
Edit angka pada „Genetic Structure‟ dengan angka sesuai nomor grup (bisa
mulai langsung dari satu hingga sekian).
Pada menu setting, ubah „Population Comparisons‟ sesuai gambar dibawah
dan begitu pula dengan „Molecular Diversity indices‟ selama menggunakan
model penelitian serupa penelitian ini. Jika sudah maka dapat diklik „Start‟
dan ditunggu hasilnya pada dokumen tempat hasil aplikasi sebelumnya.
90
Hasil dapat dilihat dengan membuka file dalam format „.XML‟ menggunakan
fitur Note Pad pada komputer. Gunakan shortcut keyboard „Ctrl+F‟ untuk
mencari data Fst pada hasil tersebut.
91
Lampiran 7. Hasil BLAST Sampel Kabupaten Lamongan
- Channa striata Lamongan nomor 1 (CSL_01)
- Channa striata Lamongan nomor 2 (CSL_02)
- Channa striata Lamongan nomor 3 (CSL_03)
92
- Channa striata Lamongan nomor 4 (CSL_04)
- Channa striata Lamongan nomor 5 (CSL_05)
- Channa striata Lamongan nomor 6 (CSL_06)
93
- Channa striata Lamongan nomor 7 (CSL_07)
- Channa striata Lamongan nomor 8 (CSL_08)
- Channa striata Lamongan nomor 9 (CSL_09)
95
Lampiran 8. Dokumentasi Hasil Elektroforesis
- Hasil Elektroforesis tanggal 2 November 2020
- Hasil Elektroforesis tanggal 6 November 2020
- Hasil Elektroforesis tanggal 11 November 2020
97
Lampiran 9. Tabel dan Grafik Penjelasan Data Hasil
-Jumlah individu spesimen atau n dan grup haplotipe atau h yang terbentuk
Warna biru menunjukkan jumlah individu sedangkan warna kuning
menunjukkan jumlah grup haplotipe yang terbentuk. Pembacaan data grafik di
atas seperti pada populasi CSL artinya dari 10 individu kemudian terbentuk 3
grup haplotipe; Populasi MLG dari 5 individu terbentuk 2 grup haplotipe; Populasi
KDR dari 6 individu terbentuk 3 grup haplotipe dan seterusnya.
-Keragaman Haplotipe atau Hd pada Seluruh Populasi
Grafik pada sisi kanan menunjukkan nilai keragaman haplotipe, sama
seperti pada tabel sebelah kiri. Keragaman haplotipe menurut Grant and Bowen
(1998) akan dikategorikan tinggi jika lebih dari sama dengan 0,5. Berdasarkan
data yang didapat maka keragaman haplotipe rendah hanya terjadi pada
populasi MLG dan MJT, selain kedua populasi tersebut (populasi sisanya)
memiliki keragaman haplotipe tinggi.
98
-Keragaman Nukleotida atau π pada Seluruh Populasi
Grafik pada sisi kanan menunjukkan nilai keragaman nukleotida, sama
seperti pada tabel sebelah kiri. Keragaman nukleotida menurut Grant and Bowen
(1998) akan dikategorikan tinggi jika lebih dari sama dengan 0,005. Berdasarkan
data yang didapat maka keragaman nukleotida rendah terjadi pada 4 populasi di
Jawa Timur yaitu CSL, MLG, KDR dan MJT sementara populasi sisanya
dikategorikan tinggi.
-Kuadran Keragaman Genetik
Kuadran keragaman genetik ini merujuk pada pendapat Grant and Bowen
(1998) untuk mempermudah pembacaan data keragaman genetik. Kuadran
pertama diindikasikan populasi baru mengalami penurunan kualitas seperti bottle
neck effect maupun fouder effect dengan kondisi keragaman haplotipe dan
nukleotide sama-sama rendah seperti pada populasi MLG dan MJT. Kuadran
kedua mengindikasikan populasi pasca mengalami penurunan populasi mulai
berekspansi yang ditandai dengan kenaikan nilai keragaman haplotipe hingga ke
kategori tinggi seperti pada populasi CSL dan KDR. Kuadran ketiga
mengindikasikan populasi dalam proses ekspansi mulai mencapai titik stabil
99
dengan ditandai oleh keragaman nukleotida naik ke kategori tinggi walaupun
kemudian keragaman haplotipe kembali turun ke kategori rendah. Kuadran
keempat mengindikasikan suatu populasi selain telah stabil juga telah mengalami
sejarah evolusi yang panjang sehingga memiliki keragaman genetik paling baik
dengan ditandai oleh kedua parameter keragaman (keragaman haplotipe dan
nukleotida) sama-sama tinggi seperti pada populasi JWT, JWB, PBL dan SMT.
-Komposisi Timin:Adenin serta Citosin:Guanin Seluruh Populasi
Komposisi basa nukleotida menunjukkan dominasi basa tertentu atau
pasangan basa tertentu pada suatu populasi. Detail presentase basa dapat
dilihat pada Tabel 1 di laporan ini. Berdasarkan prinsip basa komplemen yaitu
Timin berpasangan dengan Adenin sedangkan Citosin berpasangan dengan
Guanin maka dominasi Timin+Adenin lebih kuat dengan 53% di setiap populasi
sedangkan Citosin+Guanin lebih lemah dengan 46% di setiap populasi. Adapun
perbedaan angka pada presentase di tiap populasi, namun perbedaan itu lebih
kecil dari 1%. Dominasi Timin+Adenin yang terjadi merupakan ciri khas umum
pada sekuens-sekuens dari region Cytochrome oxidase subunit I (COI).