ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN GABUS (Channa striata) BERDASARKAN REGION DNA MITOKONDRIA CYTOCHROME

OXIDASE SUBUNIT I (COI) PADA DAERAH SUNGELEBAK, KABUPATEN LAMONGAN, JAWA TIMUR

SKRIPSI

Oleh:

AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA

NIM. 175080500111036

PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG 2021

ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN GABUS (Channa striata) BERDASARKAN REGION DNA MITOKONDRIA CYTOCHROME

OXIDASE SUBUNIT I (COI) PADA DAERAH SUNGELEBAK, KABUPATEN LAMONGAN, JAWA TIMUR

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Meraih Gelar Sarjana Perikanan

di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Universitas Brawijaya

Oleh:

AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA

NIM. 175080500111036

PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG 2021

SKRIPSI

ANALISIS KERAGAMAN GENETIK IKAN GABUS (Channa striata) BERDASARKAN REGION DNA MITOKONDRIA CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) PADA

DAERAH SUNGELEBAK, KABUPATEN LAMONGAN, JAWA TIMUR

Oleh:

AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA NIM. 175080501111014

Telah dipertahankan didepan penguji pada tanggal 28 Juni 2020

dan dinyatakan telah memenuhi syarat

Dosen Pembimbing 1

Menyetujui, Dosen Pembimbing 2

Wahyu Endra Kusuma, S.Pi, MP, D.Sc. NIP. 19820826 200912 1 002 Tanggal:

Fani Fariedah, S.Pi., M.P. NIP. 2012088203082001 Tanggal:

Mengetahui: Ketua Jurusan

Manajemen Sumberdaya Perairan

Dr. Ir. M. Firdaus, MP. NIP. 19680919 200501 1 001 Tanggal:

DocuSign Envelope ID: 56C488EA-D004-4603-82D9-E4485C70F2B7

7/14/2021

7/14/20217/14/2021

DocuSign Envelope ID: 04048439-2D72-4697-9C95-9E924457735D

i

PERNYATAAN ORISINALITAS

Dengan ini Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama : Akhsan Fikrillah Paricahya

NIM : 175080500111036

Judul Skripsi : Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa striata)

Berdasarkan Region DNA Mitokondria Cytochrome Oxidase

Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak, Kabupaten

Lamongan, Jawa Timur

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa penulisan skripsi ini berdasarkan hasil

penelitian, pemikiran dan pemaparan asli dari saya sendiri, baik untuk naskah,

tabel, gambar maupun ilustrasi lainnya yang tercantum sebagai bagian dari

Skripsi. Jika terdapat karya / pendapat / penelitian dari orang lain, maka saya

telah mencantumkan sumber yang jelas dalam daftar pustaka.

Demikian pernyataan ini saya buat, apabila di kemudian hari terdapat

penyimpangan dan ketidakbenaran dalam pernyataan ini, maka saya bersedia

menerima sanksi akademik sesuai dengan peraturan yang berlaku di Universitas

Brawijaya, Malang.

Demikian pernyataan ini saya buat dalam keadaan sadar tanpa adanya paksaan

dari pihak manapun.

Malang, 30 Juni 2021

Akhsan Fikrillah Paricahya

NIM.175080500111036

ii

IDENTITAS TIM PENGUJI

Judul : Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa striata)

Berdasarkan Region DNA Mitokondria Cytochrome

Oxydase Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak,

Kabupaten Lamongan, Jawa Timur

Nama Mahasiswa : Akhsan Fikrillah Paricahya

NIM : 175080500111036

Program Studi : Budidaya Perairan

PENGUJI PEMBIMBING:

Pembimbing 1 : Wahyu Endra Kusuma, S.Pi., MP., D.Sc.

Pembimbing 2 : Fani Fariedah, S.Pi., MP.

PENGUJI BUKAN PEMBIMBING

Dosen Penguji 1 : Dr. Ir. Abdul Rahem Faqih, M.Si.

Dosen Penguji 2 : Yuni Widyawati, S.Pi., MP.

Tanggal Ujian : 28 Juni 2021

iii

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulisan laporan skripsi dengan judul “Analisis Keragaman Genetik Ikan

Gabus (Channa striata) Berdasarkan Region DNA Mitokondria Cytochrome

Oxidase Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak, Kabupaten Lamongan, Jawa

Timur” ini merupakan produk dari dukungan berbagai pihak. Penulis

mengucapkan banyak terimakasih kepada berbagai pihak yang telah membantu

penulis dalam merampungkan laporan skripsi ini baik dari dukungan spiritual,

mental, materil dan sebagainya. Terimakasih tersebut penulis tujukan di

antaranya kepada:

1. Allah هلالج لج yang telah memberikan nikmat serta karunianya kepada penulis

sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan skripsi ini sebagai salah

satu syarat kelulusan studi penulis di Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan Universitas Brawijaya.

2. Keluarga (terlebih orang tua), kerabat dan lingkungan (terutama lingkaran

terdekat) penulis yang telah turut andil dalam mendidik, mendewasakan

serta mendukung penulis hingga titik ini dalam berbagai aspek termasuk

aspek karir dan pendidikan penulis.

3. Bapak Wahyu Endra Kusuma, S.Pi, MP, D.Sc selaku dosen pembimbing

pertama penulis dan Ibu Fani Fariedah, S.Pi., M.P selaku dosen

pembimbing kedua yang telah membimbing serta mengarahkan penulis

dalam menyusun dan menyelesaikan laporan skripsi ini.

4. Guru serta tenaga pengajar baik formal dan non-formal yang telah

memberikan pengajaran terbaik pada penulis baik dalam akademik

maupun non-akademik.

iv

5. Teman-teman dan kakak tingkat dalam tim genetika yang telah mengajari

serta membuat ataupun berbagi cerita dan pengalaman berharga.

v

RINGKASAN

AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA. Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus

(Channa striata) Berdasarkan Region DNA Mitokondria Cytochrome Oxydase

Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur (di

bawah bimbingan Wahyu Endra Kusuma dan Fani Fariedah)

Ikan dari keluarga Channidae terutama ikan gabus (Channa striata) tersebar luas dari Asia Tenggara hingga Asia Selatan sehingga memungkinkan terjadinya perbedaan secara genetik yang tinggi. Perbedaan tersebut bisa jadi dikarenakan isolasi populasi secara geografis dan ikan dari keluarga Channidae di Indonesia terdistribusi secara alami di Paparan Sunda. Populasi C. striata di Daerah Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo di Kabupaten Lamongan, Jawa Timur pernah dilaporkan sebagai populasi unggul dari segi kandungan protein albumin dibanding populasi lainnya pada suatu penelitian. Bengawan Solo merupakan sungai terpanjang di Jawa sehingga diasumsikan dapat menggambarkan keragaman biota air tawar di sekitar alirannya. Target evaluasi kajian genetika ini adalah Cytochrome Oxydase sub-unit I (COI) pada DNA mitokondria (mtDNA). Keunggulan mtDNA adalah tidak terpengaruh oleh persilangan, sangat sedikit intron, laju mutasi tinggi dan lainnya. Situs COI dalam mtDNA memiliki kelebihan bersifat lestari dan sedikit mengalami delesi maupun insersi. Analisa keragaman genetik dapat menunjukkan kemampuan suatu populasi menghadapi ancaman seperti penyakit, parasit, predasi dan perubahan lingkungan. Urgensi kegiatan domestikasi dan budidaya beserta efektif tidaknya untuk mendapat hasil terbaik akan sangat terbantu dengan mengetahui kondisi populasi.

Keragaman genetik diuji berdasarkan indeks keragaman dan diferensiasi genetik, indeks keragaman akan menganalisa kondisi intrapopulasi sementara diferensisi genetik menguji interpopulasi. Indeks keragaman menunjukkan beberapa analisa seperti jumlah haplotipe (h), keragaman haplotipe (Hd) dan keragaman nukleotida (π). Pengujian keragaman genetik suatu spesies dapat dikaji dengan spesies berbeda secara taksonomi seperti C. striata dengan Channa gachua/ Channa limbata. Data pembanding merupakan populasi C. gachua/ C. limbata yang ditemukan di daerah Malang, Kediri, Mojokerto, Jawa Tengah, Jawa Barat, Pulau Bali dan Sumatra. Uji tersebut menunjukkan hasil indeks keragaman populasi C. striata di Kabupaten Lamongan adalah h = 3, Hd = 0,644 dan π = 0,00296. Populasi Lamongan dinyatakan memiliki keragaman genetik mendekati rendah dengan indikasi pasca mengalami penurunan kualitas dan mulai berekspansi. Diferensiasi genetik populasi Kabupaten Lamongan dengan populasi lain terendah adalah 0.92533 (dengan populasi Jawa Barat) hingga tertinggi 0.98820 (dengan populasi Mojokerto) sehingga angka tersebut merupakan angka spesiasi spesies C. striata dengan C. gachua atau C. limbata

di penelitian ini. Upaya domestikasi yang dapat diambil adalah pemijahan secara inter-populasi.

Kata Kunci: Indeks Keragaman, Paparan Sunda, Populasi, Regional Ekologis,

Spesies

vi

SUMMARY

AKHSAN FIKRILLAH PARICAHYA. Genetic Diversity Analysis of Striped

Snakehead (Channa striata) Based on Mitochondrial DNA‟s Region Cytochrome

Oxydase Subunit I (COI) in Sungelebak, Lamongan Regency, East Java (under

the guidance of Wahyu Endra Kusuma and Fani Fariedah)

Channidae familys member especially striped snakehead fish (Channa

striata) is got wide distribution from Southeast Asia to South Asia and that is the reasonable thing occur differentiation of their genetics significantly. It can be occur because isolated condition among their populations geographicaly and from Indonesian archipelago, Channidae is naturally only distributed in Sundaland Region. Channidae population in Indonesian Archipelago that not from Sundaland Region is introduction population like population from Lesser Sunda Islands, Wallacea and Sahul Shelf Region. C. striata population from Bengawan Solo Watersheds in Lamongan Regency, East Java once reported has a better characteristic of population in terms of albumin protein in that research. Bengawan Solo is the longest river on Java Island and assumed can represent and describe biodiversity around it. Evaluation target in this genetic study is Cytochrome Oxydase sub-unit I (COI) from mitochondrial DNA (mtDNA). Advantages of using mtDNA is the mtDNA isn‟t affected by mating combination, lack of introns, high mutation rate etc. COI region from mtDNA has advantages in its characteristics as conserve and slightly got deletion nor insertion. Genetic diversity analyzing study can showing a populations ability agains threats as deseases, parasites, predation and environmental changes. The urgency of domestication and aquaculture with its point of effectivity to get the best results will be helped a lot by knowing populations condition.

Genetic diversity in this study based on diversity index and genetic differentiation, diversity index will analyzing condition of intrapopulation then genetic differentiation will analyzing condition of interpopulation. Diversity index will show several analyzed value as the number of haplotype (h), haplotype diversity (Hd) and nucleotide diversity (π).Genetic diversity study can be apply between a population to the other that identified to a different species taxonomicaly as C. striata population to Channa gachua/ Channa limbata population. Comparative data in this study is C. gachua/ C. limbata found from

several region as Malang, Kediri, Mojokerto, Central Java, West Java, Bali Island and Sumatra. Result from this study to diversity index of C. striata population in Lamongan Regency is h = 3, Hd = 0,644 and π = 0,00296. Genetic diversity of Lamongan population is near to be low and it means this population indicated to have quality decreased then now they‟re expanding. Genetic differentiation this population with the other populations in comparative data is from the lowest 0.92533 (with West Java population) up to the higest 0.98820 (with Mojokerto population) then that values be the speciation on species values between C. striata and C. gachua or C. limbata in this study. Domestication on Lamongan population can be start with cross-breeding with the other population. Key Words: Diversity Index, Ecoregion, Population, Species, Sundaland

vii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur atas kehadirat Allah Ta‟ala dan tidak lupa shalawat serta

salam penulis haturkan kepada junjungan umat Islam di seluruh dunia, Nabi

Muhammad Sholaullohu ‟Alaihi Was-Salam. Penyusunan dan penyelesaian

laporan skripsi ini tak lepas dari nikmat serta karunia Allah Ta‟ala, laporan

berjudul “Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa striata) Berdasarkan

Region DNA Mitokondria Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Daerah

Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur” telah

penulis selesaikan sebaik mungkin.

Mengingat tujuan disusunnya laporan skripsi ini untuk referensi kajian

genetika terutama dalam hal keragaman genetik pada ikan C. striata di aliran

Sungai Bengawan Solo, penulis berharap data serta informasi yang penulis

usahakan dalam laporan ini dapat dimanfaatkan di kemudian hari dengan

sebaik-baiknya. Pembuatan laporan ini juga dilakukan oleh penulis dengan

kesadaran bahwasannya di dalam laporan memungkinkan terdapat kesalahan

tutur kata, informasi, penulisan dan lain sebagainya yang berasal dari

kekurangan penulis pribadi hingga waktu laporan diselesaikan maka penulis

meminta maaf dan kemakluman pembaca. Akhir kata penulis ucapkan terima

kasih atas kesempatan dan kebijaksanaan pembaca.

Malang, 17 Februari 2021

Akhsan Fikrillah Paricahya NIM. 175080500111036

viii

DAFTAR ISI

Halaman

PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................................................. i

IDENTITAS TIM PENGUJI ......................................................................................ii

UCAPAN TERIMA KASIH .....................................................................................iii

RINGKASAN ...........................................................................................................v

SUMMARY ..............................................................................................................vi

KATA PENGANTAR .............................................................................................vii

DAFTAR ISI ..........................................................................................................viii

DAFTAR TABEL .....................................................................................................x

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................xi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................xii

BAB I. PENDAHULUAN .........................................................................................1

1.1 Latar Belakang ..........................................................................................1 1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................3 1.3 Tujuan Penelitian ......................................................................................3 1.4 Manfaat .....................................................................................................4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................5

2.1 Biologi Ikan Gabus (C. Striata) .................................................................5 2.1.1 Klasifikasi dan Morfologi ...............................................................5 2.1.2 Habitat dan Penyebaran Ikan C. striata .......................................7 2.1.3 Siklus Reproduksi Ikan C. striata ..................................................7

2.2 Keragaman Genetik ..................................................................................8 2.3 Analisa Keragaman Genetik .....................................................................9

2.3.1 DNA Mitokondria ...........................................................................9 2.3.2 Metode Analisa ...........................................................................11

BAB III. METODE PENELITIAN ...........................................................................13

3.1 Tempat, Waktu dan Jadwal Pelaksanaan ..............................................13 3.2 Materi Penelitian .....................................................................................13

3.2.1 Alat Penelitian .............................................................................13 3.2.2 Bahan Penelitian .........................................................................14

3.3 Metode Penelitian ...................................................................................14 3.4 Teknik Pengambilan Data .......................................................................15 3.5 Prosedur Penelitian .................................................................................15

ix

3.5.1 Pengambilan Sampel ..................................................................15 3.5.2 Preparasi Spesimen ....................................................................17 3.5.3 DNA Sequencing ........................................................................22 3.5.4 Analisis Data ...............................................................................22

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................24

4.1 Koleksi Spesimen ...................................................................................24 4.2 Hasil Ekstraksi dan Amplifikasi ...............................................................27 4.3 Hasil Sekuensing ....................................................................................29 4.4 Komponen Basa Nukleotida ...................................................................32 4.5 Analisis Indeks Keragaman ....................................................................33

4.5.1 Analisis Indeks Keragaman Populasi Lamongan .......................34 4.5.2 Analisis Indeks Keragaman Seluruh Populasi ...........................36

4.6 Struktur Populasi atau Diferensiasi Genetik ...........................................39

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................................43

5.1 Kesimpulan .............................................................................................43 5.2 Saran .......................................................................................................43

DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................45

GLOSARIUM .........................................................................................................49

LAMPIRAN ............................................................................................................52

x

DAFTAR TABEL

Tabel .......................................................................................................... Halaman

Tabel 1. Komoposisi Basa Nukleotida pada Seluruh Populasi ............................ 33 Tabel 2. Indeks Keragaman pada Seluruh Populasi ............................................ 35 Tabel 3. Anggota Dalam Grup Haplotipe pada Seluruh Populasi ....................... 36 Tabel 4. Diferensiasi Genetik pada Seluruh Populasi .......................................... 39

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

Gambar 1. Morfologi Ikan Channa striata. ............................................................. 6 Gambar 2. Struktur mtDNA yang Terdiri dari 37 Penyandi .................................. 10 Gambar 3. Skema Proses Ekstraksi Secara Garis Besar ................................... 18 Gambar 4. Skema Proses Amplifikasi Secara Garis Besar ................................. 20 Gambar 5. Skema Proses Elektroforesis Secara Garis Besar ............................ 21 Gambar 6. Ikan C. striata Dengan Tag CSL 06 ................................................... 25 Gambar 7. Foto Ikan Channa limbata dari Semenanjung Malaysia. ................... 26 Gambar 8. Foto Lokasi Perairan Sekitar Kawasan Sungelebak, Lamongan ...... 26 Gambar 9. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Ikan C. striata Lamongan ........... 27 Gambar 10. Contoh Hasil Visualisasi Elektroforesis. ........................................... 28 Gambar 11. Data Chromatogram yang Dibuka pada Aplikasi Chromas ............. 29 Gambar 12. Contoh Hasil BLAST pada Sampel CSL_01 .................................... 31 Gambar 13. Pembagian Paparan Sunda Berdasarkan Regional Ekologis ......... 41

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

Lampiran 1. Fungsi Alat dan Bahan ..................................................................... 52 Lampiran 2. Diagram Alur Kegiatan ..................................................................... 54 Lampiran 3. Dokumentasi Spesimen yang Digunakan ........................................ 55 Lampiran 4. Data Set yang Digunakan ............................................................... 60 Lampiran 5. Detail Sampel sebagai Data Primer dan Sekunder ........................ 78 Lampiran 6. Prosedur Pengolahan Data Analisa Keragaman Genetik .............. 80 Lampiran 7. Hasil BLAST Sampel Kabupaten Lamongan ................................... 91 Lampiran 8. Dokumentasi Hasil Elektroforesis .................................................... 95 Lampiran 9. Tabel dan Grafik Penjelasan Data Hasil .......................................... 97

1

BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Ikan gabus (Channa striata) merupakan ikan lokal yang menurut Djumanto

et al. (2020), merupakan ikan dengan nilai komersial penting di Jawa. Ikan C.

striata memiliki nilai ekonomis tinggi serta kandungan gizi yang tinggi pula,

terlebih kandungan protein albumin di dalamnya. Potensi ikan C. striata yang

tinggi ini perlu diikuti oleh studi-studi pendukung terkait ikan C. striata untuk

kemudian dapat dikembangkan lebih maksimal di kemudian hari. Penelitian

terkait ikan C. striata sendiri sangat minim di Indonesia, begitu pula praktik

budidayanya. Ikan C. striata di Kabupaten Lamongan berdasarkan penelitian

Fuadi et al. (2017), lebih unggul dari segi kadar kandungan protein albumin-nya

ketika dibandingkan dengan populasi lain di Jawa Timur. Lokasi pengambilan

sampel pada penelitian tersebut di Kabupaten Lamongan masuk dalam Daerah

Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo.

Sungai Bengawan Solo merupakan sungai yang terkenal di Pulau Jawa,

sebagaimana menurut Astirin dan Setyawan (2000), Bengawan Solo merupakan

sungai terpanjang di Pulau Jawa sehingga secara otomatis merupakan salah

satu sungai prioritas di Pulau Jawa. Panjang keseluruhan Bengawan Solo

diperkirakan adalah 600 km yang bermuara di Daerah Ujungpangkah, Kabupaten

Gresik, Jawa Timur. Luas DAS Bengawan Solo yang setidaknya melintasi dua

provinsi di Pulau Jawa (Jawa Timur dan Jawa Tengah) ini menurut Utomo et al.

(2017), diperkirakan adalah 16.000 km2 sehingga dapat merepresentasikan

sebagian besar keragaman hayati ikan air tawar sungai di kawasan sekitarnya

dengan ekosistem sejenis. Ancaman dan permasalahan pada populasi ikan lokal

DAS (termasuk ikan C. striata) secara umum menurut Prianto et al. (2015),

2

adalah degradasi lingkungan, hilang atau berubahnya habitat dan eksploitasi

berlebihan terhadap sumber daya baik ikan maupun unsur lainnya. Hal tersebut

ditambahkan oleh Syafei dan Sudinno (2018), bahwa dengan ancaman dari

kehadiran ikan-ikan asing (introduksi), kekayaan biodiversitas dapat sangat

terganggu dan rusak terlebih pada kawasan di negara bergelar mega-

biodiversitas seperti Indonesia, sebagaimana Brazil dan China juga merasakan

dampak buruk dari spesies asing di perairan mereka. Permasalahan kondisi DAS

tersebut dapat berubah seiring berjalannya waktu, begitu juga dengan kondisi

populasi C. striata di Kabupaten Lamongan, Jawa Timur sehingga perlu

dilakukan kajian untuk dilakukan evaluasi.

Kajian yang dapat dipakai untuk upaya evaluasi kondisi populasi, terlebih

untuk dasar mengembangkan komoditas ikan C. striata di daerah tersebut adalah

kajian genetika, sebagaimana menurut Utomo et al. (2021), bahwa kajian

genetika dapat digunakan untuk mengetahui polimorfisme ikan C. striata.

Pengujian genetik umumnya menggunakan marka molekuler dengan target atau

situs tertentu, dan menurut Herdiana et al. (2017), Cytochrome Oxydase sub unit

I (COI) pada DNA mitokondria (mtDNA) adalah situs paling sering digunakan

pada kajian genetika populasi karena berbagai keunggulannya, terutama dalam

mengevaluasi suatu populasi. Informasi-informasi terkait genetik sangat berguna

untuk dijadikan dasar mencari populasi unggul dalam budidaya di kemudian hari.

Keterangan seperti polimorfisme pada ikan C. striata sendiri menurut Utomo et

al. (2021), dapat digunakan dalam mengidentifikasi kondisi suatu populasi (misal

keragaman genetik) dan sebagai dasar dalam budidaya, contohnya adalah

sebagai dasar upaya seleksi induk dan domestikasi.

Urgensi kegiatan budidaya dan efektivitas upaya domestikasi suatu

populasi (termasuk populasi C. striata di Kabupaten Lamongan, Jawa Timur)

dengan data keragaman genetik sebagaimana menurut Amos dan Harwood

3

(1998), sangat memungkinkan untuk ditunjang karena data keragaman genetik

dapat memberikan informasi terkait kemampuan adaptasi serta kemungkinan

spesiasi populasi-populasi terkait. Kondisi kesehatan populasi menggunakan

keragaman genetik dapat dilihat terutama dari keragaman haplotipe (Hd) dan

keragaman nukleotida (π). Kondisi kesehatan suatu populasi tersebut juga dapat

dikaitkan dengan kesiapan atau kemampuan suatu populasi menghadapi

masalah seperti penyakit, parasit, predator serta perubahan lingkungan.

Berangkat dari latar belakang tersebutlah penelitian skripsi berjudul “Analisis

Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa striata) Berdasarkan Region DNA

Mitokondria Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Daerah Sungelebak,

Kabupaten Lamongan, Jawa Timur” penting untuk dilakukan.

1.2 Rumusan Masalah

Berangkat dari latar belakang di atas bahwa ikan C. striata di Kabupaten

Lamongan, Jawa Timur berhadapan dengan permasalahan DAS Bengawan Solo

yang begitu kompleks, maka analisa genetik penting untuk dilakukan. Analisa

genetik dapat mengevaluasi kondisi di lapang dan dapat dijadikan dasar untuk

pengembangan komoditas C. striata dalam upaya domestikasi dan budidaya

berkelanjutan di kemudian hari. Penelitian ini untuk menganalisa dan

mengevaluasi bagaimana kondisi genetik populasi ikan C. striata, khususnya

pada Daerah Sungelebak, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur saat ini.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini berfokus pada analisa genetika populasi.

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa kondisi populasi berdasarkan

keragaman genetik melalui indeks keragaman ikan C. striata di Daerah

Sungelebak, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur guna mengevaluasi kondisi

4

populasi tersebut.

1.4 Manfaat

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif yang dapat menunjukkan data

keragaman genetik sampel ikan C. striata. Data tersebut kemudian dapat

dijadikan dasar dalam pengembangan potensi ikan gabus di Indonesia untuk

menemukan populasi unggul dan sebagainya.

5

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Biologi Ikan Gabus (C. Striata)

Ikan gabus (C. Striata) merupakan ikan yang telah diteliti dari tahun ke

tahun dengan berbagai tujuan penelitian. Berbagai sumber pustaka telah

mencoba untuk menjelaskan ikan gabus termasuk aspek-aspek biologi seperti

klasifikasi hingga reproduksi ikan C. striata. Tinjauan pustaka terkait biologi ikan

C. striata dapat dilihat sebagai berikut.

2.1.1 Klasifikasi dan Morfologi

Ikan C. striata sebagai spesies utama dalam penelitian ini menurut

Haryanto (2019), diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

Subfilum : Vertebrata

Superkelas : Piesces

Kelas : Osteochthyes

Superordo : Teleostei

Ordo : Perciformes

Subordo : Channoidae

Famili : Channidae

Genus : Channa

Species : Channa striata

6

Sumber: Requieron et al., 2012 Gambar 1. Morfologi Ikan Channa striata. (a) Spesimen Jantan; (b) Spesimen

Betina; (c) Sirip Caudal (cf); (d) Sirip Dorsal (df) dan Sirip Pektoral (pc f); (e) Sirip Anal; (f) Kepala Samping; (g) Kepala Bawah; serta (h) Sirip Pektoral (pc f) dan Sirip Pelvic atau Ventral (pv f)

Ikan C. striata sendiri secara morfologi memiliki bentuk tubuh yang khas

dan menurut Kusmini et al. (2016), ikan ini dikenal dengan bentuk tubuh yang

memanjang atau silindris dengan kepala seperti ular. Bentuk tubuh khas tersebut

membuat ikan ini juga dikenal sebagai ikan berkepala ular (snakehead fish).

Warna ikan C. striata sendiri cenderung gelap dari warna coklat hingga hitam

sebagaimana menurut Aidah et al. (2020), warna tersebut dipadukan dengan

warna putih pada bagian perut ikan ini. Ikan C. striata merupakan ikan karnivora

dan tergolong predator sehingga design mulut ikan C. striata sangat efektif untuk

berburu dengan mulut besar dengan dilengkapi gigi canine untuk mengoyak

daging ikan. Ikan C. striata sebagai predator membutuhkan gerakan cepat untuk

mengejar mangsa sehingga selain bentuk badan memanjang, ikan C. striata juga

di-design dengan sirip lumayan lebar, sirip dorsal memanjangdengan sirip caudal

7

dan sirip pektoral membundar lebar. Ikan ini juga merupakan ikan dengan daya

tahan lebih pada lingkungan yang kurang mendukung seperti dengan adanya

alat pernafasan tambahan untuk mengantisipasi lingkungan berkadar oksigen

terlarut rendah. Pernafasan tambahan ini dinamakan diventikula yang

memungkinkan ikan C. striata mengambil oksigen dari udara langsung. Ukuran

ikan C. striata yang mencapai 100 cm pada penelitian Djumanto et aI. (2020),

sangat sulit ditemui, umumnya ikan ini didapati pada ukuran 23 hingga 65 cm.

Ukuran ini bervariatif tergantung musim, pada musim hujan data menunjukkan

ukuran ikan C. striata yang lebih besar dibanding musim kemarau.

2.1.2 Habitat dan Penyebaran Ikan C. striata

Ikan C. striata merupakan ikan dengan kemampuan bertahan hidup yang

tinggi sehingga penyebaran ikan ini sangat luas di penjuru Asia. Ikan C. striata

mampu mendiami berbagai tempat dengan kondisi perairan yang berbeda-beda

pula dan menurut Djumanto et al. (2020), ikan ini dapat ditemui di cekungan

sungai, danau hingga rawa. Beberapa sumber mengatakan bahwa ikan C. striata

juga dapat bertahan pada salinitas payau, hal ini khusus terjadi pada spesies C.

striata. Persebaran ikan C. striata menurut Kombong dan Arisuryanti (2018),

terdistribusi terutama di Asia Barat yaitu Pakistan, Bangladesh dan India, Asia

Timur yaitu Cina Selatan dan Korea Selatan, dan Asia Tenggara yaitu Indonesia,

Kamboja, Myanmar, Filipina, Vietnam, Thailand dan Malaysia. Ikan C. striata di

Indonesia sendiri dapat ditemukan di paparan sunda.

2.1.3 Siklus Reproduksi Ikan C. striata

Ukuran ikan C. striata jantan dan betina tidak terlalu signifikan, pada musim

hujan ikan ini akan memijah sebagaimana pernyataan Djumanto et al. (2020),

bahwa ikan ini memiliki beberapa faktor untuk memijah. Secara garis besar faktor

8

tersebut dibagi menjadi dua yaitu faktor internal dan eksternal. Faktor internal

tersebut berupa produksi hormon, usia, tingkat kematangn gonad dan lain

sebagainya. Faktor eksternal sendiri yang paling mempengaruhi adalah musim

sebagaimana ikan-ikan asia pada umumnya di mana musim hujan adalah musim

bagi banyak spesies ikan untuk memijah dan masuk pada poin „spawning

habitat‟. Faktor eksternal lainnya adalah kondisi perairan, ketersediaan makanan,

ketersediaan pasangan dan lainnya.

2.2 Keragaman Genetik

Keragaman genetik merupakan tingkat paling dasar dalam hirarki

biodiversitas sebagaimana menurut Yusron (2005), kajian biodiversitas meliputi

banyak hal termasuk keragaman habitat, komunitas, populasi hingga ke genetik.

Genetik sebagaimana yang diketahui merupakan unsur penting dalam kehidupan

dan berperan besar dalam penurunan sifat sehingga keragaman genetik dapat

menjadi dasar untuk mengkaji tingkatan-tingkatan biodiversitas di atasnya

bahkan hingga pada pengkajian ekosistem.

Keragaman genetik khususnya pada ikan dipengaruhi oleh beberapa hal.

Keragaman genetik pada ikan dapat berubah sebagaimana menurut Kantun dan

Mallawa (2016), keragaman genetik cenderung meningkat dengan adanya

mutasi dan imigrasi sedangkan cenderung menurun karena seleksi alam dan

penghanyutan genetik (genetic drift). Keragaman genetik yang tinggi memiliki

peluang hidup yang tinggi pula. Genetic drift merupakan penyimpangan pada

tingkat genotipe yang menurut Avarre et al. 2018, dapat menimbulkan kondisi

defisiensi genetik (kekurangan genetik) dan perubahan fluktuasi genetik dalam

suatu populasi. Dampak tersebut akan mengancam variasi genetik dari alel-alel

penting dan alel-alel langka karena dapat menghilangkan gen-gen penting dan

langka didalamnya serta merusak gene pool. Genetic drift dapat terjadi karena

9

inbreeding maupun dari kejadian-kejadian lain yang dapat menurunkan kualitas

populasi pada tingkat genotipe.

2.3 Analisa Keragaman Genetik

Analisa keragaman genetik dapat dilakukan dengan menggunakan region

pada DNA mitokondria/ mtDNA tepatnya pada region Cytochrome Oxydase sub

unit I (COI). Metode analisa yang dapat digunakan salah satunya adalah DNA

barcoding menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan kemudian

dilakukan squencing. Tinjauan pustaka terkait analisa keragaman genetik dapat

dilihat sebagai berikut.

2.3.1 DNA Mitokondria

DNA mitokondria atau yang disebut juga sebagai mtDNA adalah rantai

DNA yang terletak pada mitokondria, menurut Nugroho dan Dwi (2018), jumlah

DNA pada mitokondria bervariasi dan berbeda sifat dengan DNA nukleus seperti

ukuran, jumlah gen dan bentuk. DNA mitokondria sendiri memiliki laju mutasi 10

hingga 17 kali lebih tinggi dibanding DNA nukleus serta jumlah copy DNA

mitokondria hingga 1000 copy pada tiap sel sedang DNA nukleus hanya memiliki

dua copy. Keberadaan dari DNA mitokondria sendiri bersifat otonom dan terlepas

dari kegiatan DNA nukleus. Hal ini ditambahkan oleh Muthiadin et al. (2018),

bahwa genom DNA mitokondria berbentuk sirkular dengan 13 gen penyandi

protein, 22 gen tRNA dan 2 gen rRNA. DNA mitokondria telah lumrah digunakan

dalam identifikasi hewan dengan beberapa kelebihan seperti pewarisan bersifat

maternal, berlaju mutasi tinggi, sedikit intron, diwariskan secara haploid serta

proses replikasi dilakukan terus-menerus.

10

Sumber: Doublet, 2010

Gambar 2. Struktur mtDNA yang Terdiri dari 13 Gen Penyandi Protein, 22 Gen tRNA dan 2 Gen rRNA

Cytochrome Oxydase sub unit I (COI)

Situs atau region Cytochrome Oxidase sub unit I (COI) merupakan salah

satu dari 13 gen penyandi protein dalam DNA mitokondria. Situs COI menurut

Bucklin, et al. (2003), COI umum digunakan dalam analisa intraspesies maupun

interspesies sebagai penanda genetik pada studi populasi. COI memiliki laju

mutasi tinggi dan dapat memperlihatkan perbedaan antar populasi hingga antar

individu intraspesies. COI sendiri sebagaimana pendapat Tindi et al. (2017),

bahwa COI memiliki sifat conserve (lestari) dan sedikit sekali mengalami insersi

maupun delesi. COI juga memiliki kelebihan lain sebagaimana dinyatakan oleh

Arisuryani et al. (2020), bahwa COI tidak memiliki intron serta hanya diturunkan

dari ibu (maternal inharitace) sehingga tidak ada kemungkinan pengaruh

persilangan interspesies. Sifat maternal inharitace pada mtDNA (otomatis juga

pada COI) tetap berlaku walaupun mitokondria sperma jantan masuk ke dalam

ovum sebagaimana menurut Nuryanto dan Solihin (2006), mitokondria jantan

tersebut akan segera hilang dan tidak dapat dilacak karena mekanisme fertilisasi

11

yang berlaku di tubuh betina.

2.3.2 Metode Analisa

Metode analisa secara biologi molekuler dewasa ini telah berkembang

pesat. Penggunaan biologi molekuler dalam genetika populasi khususnya untuk

melihat keragaman genetik suatu populasi dapat dilakukan dengan bantuan

metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dan dilanjutkan dengan DNA

squencing. Penjelasan terkait metode-metode tersebut dapat dilihat di poin-poin

di bawah ini.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) menurut Pertiwi et al. (2015),

merupakan metode untuk memperbanyak DNA suatu organisme. PCR sendiri

telah sering dipergunakan dalam usaha pengidentifikasian melalui molekuler.

PCR untuk identifikasi baik menggunakan DNA fingerprinting maupun DNA

barcoding dewasa ini telah umum. PCR dalam pengaplikasiannya menurut

Sasmito et al. (2014), memiliki beberapa hal yang perlu diperhatikan.

Keberhasilan PCR ditentukan dari beberapa hal di antaranya adalah bahan-

bahan deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), oligonukleotida primer, DNA

template (cetakan), komposisi larutan buffer, jumlah siklus reaksi, enzim yang

digunakan, steril dari kontaminasi dan lain sebagainya.

DNA Squencing

Sekuensing DNA merupakan proses pengurutan basa DNA dan menurut

Tasma (2015), salah satu metode sekuensing adalah metode Sanger (Sanger

dideoxy sequencing) di mana metode ini memerlukan DNA template dan primer

spesifik untuk reaksi sekuensing. Panjang sekuens yang terbentuk berkisar

antara 1.000 hingga 1.200 pasang basa (bp) dan tidak dapat untuk mencapai

12

angka 2.000 bp. Pemeriksaan dengan metode ini menurut Triyani, et al. (2016),

menggunakan alat big dye terminator. Penilaian hasil kemudian dilanjutkan

dengan menggunakan perangkat lunak.

13

BAB III. METODE PENELITIAN

3.1 Tempat, Waktu dan Jadwal Pelaksanaan

Penelitian untuk Skripsi dilaksanakan di Laboratorium Hidrobiologi Divisi

Sumberdaya Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan dan Laboratorium

Ekologi dan Diversitas Hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Brawijaya, Malang pada bulan November 2020 hingga bulan Februari

2021.

3.2 Materi Penelitian

Penelitian ini memerlukan beberapa alat dan bahan dalam prosesnya

sehingga memenuhi standart laboratorium serta standart pengujian biologi

molekuler. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini sebagian besar

juga dilengkapi dengan protokol khusus dalam penggunaannya.

3.2.1 Alat Penelitian

Peralatan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah spindown, section

set, gelas ukur, cool box, mikropipet, bunsen, freezer, vortex, thermal cycler,

cetakan gel, electroforesis machine, power supplay, UV transilluminator, rak

tube, electrical balance, centrifuge, erlenmeyer, microwave, incubator, dan

laptop. Setiap peralatan tersebut memiliki fungsi khusus dalam penelitian ini

dimana penggunaannya sesuai dengan teknik manual dalam pengujian genetika.

Fungsi dari peralatan-peralatan tersebut dapat dilihat pada bagian lampiran

dalam laporan ini.

14

3.2.2 Bahan Penelitian

Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah TNESU8 buffer, micro

tube (1.5 ml dan 0.2 ml), NaCL 5M, PCR tube, akuades steril, mikro tip,

proteinase-K, phenol:cloroform (1:1), cloroform:isoamyl alchohol (1:1), ethanol 70

%, ethanol 96-99 %, agarose, TE buffer, TAE 1x, GoTaq PCR mix, fish primer

F1R1 dan F2R2, ddH2O, DNA ladder (1kb), template DNA Uji, loading dye, dan

Ethidium Bromide (EtBr). Setiap bahan-bahan tersebut memiliki fungsi khusus

dalam penelitian ini dimana penggunaannya sesuai dengan teknik manual dalam

pengujian genetika. Fungsi dari bahan-bahan tersebut dapat dilihat pada bagian

lampiran dalam laporan ini.

3.3 Metode Penelitian

Metode penelitian secara umum dibagi dua yaitu penelitian deskriptif dan

penelitian eksperimental. Penelitian keragaman genetik dalam laporan ini

merupakan penelitian deskriptif. Penelitian deskriptif sendiri merupakan

penelitian yang menurut Hamdi dan Bahruddin (2015), merupakan penelitian

dengan metode khusus untuk menggambarkan fenomena-fenomena dalam

lingkup luas terhadap ruang dan waktu. Penelitian tersebut juga dapat

mendeskripsikan suatu keadaan atau beberapa keadaan dalam tahap-tahap

perkembangan keadaan tersebut. Produk yang diincar dari penelitian deskriptif

adalah deskripsi, gambaran sistematis, faktual dan akurat mengenai fakta-fakta,

sifat dan atau hubungan di antara fenomena-fenomena yang sedang diteliti.

Penelitian genetika populasi terkait keragaman genetik dapat menggambarkan

keragaman genotipe suatu populasi pada suatu daerah hingga dapat dijadikan

sebagai dasar pembuatan analisa pola distribusi suatu spesies maupun sejarah

persebaran spesies tersebut.

15

3.4 Teknik Pengambilan Data

Data dalam penelitian dikategorikan sebagai data primer dan sekunder

yang menurut Amrin (2016), data primer dikumpulkan langsung oleh peneliti

sendiri. Hal ini berbeda dengan data sekunder yang menurut Harto (2015)

merupakan data dari selain pengumpulan pribadi peneliti seperti bahan-bahan

pustaka dan lain sebagainya. Data primer dalam penelitian ini berupa hasil

observasi lokasi/habitat pengambilan dan hasil analisa genetik spesimen ikan C.

striata yang didapatkan di DAS Bengawan Solo daerah Kabupaten Lamongan.

Data sekunder pada penelitian ini sendiri berupa bahan-bahan pustaka

penunjang penelitian dan informasi yang dikumpulkan dari berbagai narasumber

di lapangan.

3.5 Prosedur Penelitian

Penelitian saintek memerlukan protokol-protokol khusus untuk dijalankan.

penelitian genetika memiliki protokol khusus yang harus dilakukan dengan benar

supaya tidak terjadi kesalahan data baik karena kerusakan sampel, kontaminasi

hingga analisa. Prosedur penelitian pada penelitian keragaman genetik ini dapat

dilihat sebagai berikut.

3.5.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel ikan C. striata dilakukan dengan mencari pasar yang

berdekatan dengan lokasi dari habitat ikan C. striata itu sendiri. Pasar di sekitar

lokasi yang terindikasi memiliki sebaran populasi ikan C. striata di Kabupaten

Lamongan adalah Pasar Sungelebak Lamongan. Aliran sungai yang melintasi

habitat ikan tersebut merupakan DAS Bengawan Solo. Keterangan dari penjual

ikan C. striata di pasar tersebut digali untuk mengetahui lokasi penangkapan dan

ikan ini kemudian dianalisa secara visual metode penangkapannya.

16

Salah satu habitat ikan tersebut yang dimaksudkan berada di sekitar Pasar

Sungelebak Lamongan dengan alamat lengkap Jl. Raya Pasar Sungelebak

Karanggeneng Lamongan, Simo, Pucangro, Kalitengah, Kabupaten Lamongan,

Jawa Timur. Lokasi ini memiliki titik koordinat 7.039605884339526 Lintang Utara,

112.34919835786717 Bujur Timur dengan metode sampling yaitu random

sampling dengan cara mencari ikan C. striata sedapat mungkin walaupun juga

diusahakan memiliki kriteria layak dijadikan sampel secara kasat mata. Ikan C.

striata diperkirakan layak dijadikan sampel dalam penelitian ini adalah ikan

dengan ukuran lebih dari sama dengan 15 cm agar mempermudah pengambilan

jaringan tubuh serta memiliki kondisi fisik yang bagus dengan ditandai oleh sirip

dan badan utuh, jikalau ada luka dipastikan bukan luka fatal terutama pada sisi

kiri ikan agar mempermudah identifikasi melalui hasil dokumentasi. Kriteria ikan

layak juga meliputi kesegaran ikan, ikan hidup akan lebih diutamakan dari pada

ikan mati dan jikalau ikan telah mati dipastikan ikan masih dalam kondisi baik.

Penangkapan ikan C. striata umumnya menggunakan jaring, pancing, alat jebak,

tombak dan lain sebagainya sementara pada proses pencarian sampel,

penangkapan ikan C. striata dengan cara dijaring ataupun dipancing lebih

diprioritaskan karena bentuk fisik ikan C. striata yang lebih minim akan

kerusakan.

Ketika mendapatkan sampel yang telah mati, sampel spesimen disimpan di

tempat dengan suhu yang terus dikontrol agar kualitas spesimen ikan terjaga

hingga ke laboratorium untuk diproses ke tahap selanjutnya. Ikan C. striata yang

didapatkan masih hidup sebisa mungkin dijaga tetap hidup (tidak sekarat atau

bahkan mati) hingga ke tempat spesimen diproses untuk tahap selanjutnya, akan

lebih baik jika diupayakan spesimen tidak stress. Ikan hidup kemudian dimatikan

dengan cara direndam menggunakan air es untuk memperlambat metabolisme

17

ikan hingga mati kurang lebih selama 30 menit. Ikan yang tidak mati dengan

perlakuan tersebut dapat ditusuk di bagian kepala lalu dirusak bagian otaknya

dengan mempertimbangkan spesimen tetap baik untuk didokumentasikan di

kemudian waktu.

3.5.2 Preparasi Spesimen

Sampel yang telah selesai didokumentasikan kemudian diambil

jaringannya untuk kemudian diuji secara genetik menggunakan PCR. Jaringan

digunting dengan mengutamakan sampel masih dapat didokumentasikan secara

utuh di kemudian hari sehingga bagian pengguntingan ditentukan pada bagian

kanan dan dalam hal ini adalah sirip pektoral dan daging (otot) pada tubuh

bagian belakang (punggung atas dekat caudal peduncle). Pemotongan bagian

tubuh tepatnya pada alat gerak akan mempermudah proses ekstraksi karena

mudah dihancurkan. Jaringan digunting menggunakan gunting bedah yang telah

dipastikan steril melalui perendaman alkohol 70 % dan pembakaran dengan

bunsen, gunting kemudian direndam kembali dengan alkohol 70 %. Jaringan

yang telah diambil kemudian diletakkan pada microtube 1,5 berisi alkohol 96 %.

Sampel diberi penanda dan diletakkan pada freezer untuk menjaga kualitas DNA

pada jaringan sebelum dilanjut pada proses uji PCR. Proses dalam PCR sendiri

memiliki beberapa langkah dengan prosedur sebagai berikut. Protokol yang

digunakan menyesuaikan protokol teknik manual Promega Kit.

Pengambilan jaringan otot maupun jaringan alat gerak untuk diekstraksi

dimaksudkan karena di daerah tersebut umum diambil untuk target mendapatkan

mitokondria. Pernyataan tersebut sejalan dengan pernyataan Marwayana (2015),

bahwa jaringan otot memiliki kebutuhan energy yang besar. Jaringan otot

merupakan jaringan yang bergerak aktif sehingga keberadaan mitokondria

18

sangat diperlukan pada jaringan ini. Peran mitokondria sebagai penyokong

energi dalam sel sangat berperan penting yang dalam hal ini dengan adanya

mitokondria juga secara otomatis DNA mitokondria juga ada pada otot dan alat

gerak lainnya.

Ekstraksi

Proses ekstraksi pada jaringan yang telah diambil sebelumnya dilakukan

untuk memisahkan DNA dengan unsur lain dalam jaringan tersebut. Pemisahan

DNA tersebut dalam hal ini adalah DNA dari mitokondria. Proses ekstraksi dapat

dilakukan dengan cara yang berbeda tergantung laboratorium dan peneliti terkait

namun secara umum dapat dilihat pada skema di gambar 3 berikut.

Gambar 3. Skema Proses Ekstraksi Secara Garis Besar

Gambaran proses Ekstraksi pada gambar 3 menggambarkan secara umum

proses ekstraksi yang terbagi menjadi beberapa tahapan yaitu penghancuran/

lisis, eliminasi/ purifikasi, presipitasi DNA dan hidrasi DNA. Detail prosedur

ekstraksi dalam protokol teknik manual Promega kit yang digunakan dalam

penelitian ini adalah sebagai berikut.

Persiapan awal dilakukan dengan pencampuran 500 μl Nuclei Lysis

Solution dan 120 μl EDTA ke dalam sebuah wadah lalu didinginkan 5 hingga 10

menit, warna campuran wajarnya akan menjadi buram. Jaringan spesimen

19

kemudian dipotong lebih kecil lagi dan dipindah ke tube baru dan ditambahkan

600 μl campuran larutan sebelumnya. 17,5 μl Proteinase-K kemudian

ditambahkan lalu sampel di-vortex dan diinkubasi selama 12 jam pada suhu 55

C. Pasca inkubasi, sampel didiamkan dalam suhu ruang 5 hingga 10 menit

kemudian ditambahkan Protein Precipitation Solution sebanyak 200 μl, di-vortex

selama 20 detik dan didinginkan dalam lemari es selama 5 menit. Sampel di-

sentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 14.500 rpm kemudian diambil

bagian supernatan dan diletakkan pada tube baru menggunakan mikropipet.

Sampel berupa supernatan ditambahkan dengan Isopropanol 600 μl lalu di-

rotamix manual dengan cara pembolak-balikan secara horizontal sebelum di-

sentrifugasi selama satu menit dengan kecepatan 14.500 rpm. Supernatan

dibuang berlahan hingga tersisa bagian pellet saja lalu ditambahkan 600 μl

Ethanol 70 % dan di-rotamix manual kembali. Sampel di-sentrifugasi selama 1

menit dengan kecepatan 14.5000 rpm kembali kemudian supernatan dibuang

berlahan dan menyisakan bagian pelet lalu pelet dikering anginkan dengan cara

membalikkan tube selama 10 hingga 15 menit. Sampel berupa pelet

ditambahkan 100 μl rehydration solution dan di-inkubasi selama 1 jam pada suhu

65 C dan tube di-tapping secara berkala agar larutan tercampur sempurna.

Tahap terakhir adalam mendiamkan sampel pada suhu ruang 5 hingga 10 menit

dan sampel DNA disimpan pada suhu 2 hingga 8 C.

Amplifikasi

Proses amplifikasi ditujukan untuk menggandakan jumlah DNA sehingga

dapat dianalisa. Penggandaan DNA ini menggunakan bantuan alat Thermal

cycler dengan pengaturan yang disesuaikan. Sampel yang berbeda dapat

memiliki pengaturan yang berbeda pada malat tersebut namun secara umum

tahapan ampliofikasi adalah sebagaimana skema pada gambar 4.

20

Gambar 4. Skema Proses Amplifikasi Secara Garis Besar

Gambaran proses amplifikasi pada gambar 4 menggambarkan secara

umum proses amplifikasi yang terbagi menjadi beberapa tahapan yaitu

pembuatan PCR mix, inisiasi, denaturasi-annealing-elongasi, dan elongasi akhir/

final elongation. Suhu dalam proses denaturasi ditargetkan pada 98 °C, pada

anealing 55 °C, dan pada elongasi 72 °C. Suhu inisiasi dan elongasi akhir

memiliki tahapan dalam menaikkan ataupun menurunkan suhu secara bertahap

agar PCR mix yang diujikan tidak mengalami thermal shock dan rusak. Inisiasi

berlahan menaikkan suhu ke suhu denaturasi sedangkan elongasi akhir

menurunkan suhu dari suhu elongasi. Amplifikasi dalam protokol teknik manual

Promega kit yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut.

PCR mix merupakan campuran dari beberapa bahan/larutan yang dalam

hal ini pada protokol teknik manual Promega kit adalah 15 μl Gotaq-Green

Master Mix, 1 μl Primer F, 1 μl Primer R, ddH2O 11 μl, dan 2 μl DNA template.

Total jumlah PCR mix adalah 30 μl yang kemudian dimasukkan tube 0,2 ml dan

di-vortex serta di-spindown. Sampel tersebut kemudian dimasukkan dalam mesin

thermalcycler dan mesin dijalankan sesuai dengan pengaturan program yang

diinginkan. Hasil kemudian dapat diproses menggunakan mesin elektroforesis

untuk memvisualisasikan hasil PCR sebelum kemudian di-sekuensing untuk lebih

detailnya.

21

Elektroforesis

Proses elektroforesis merupakan proses pengujian kualitatif dari amplikon

untuk dipastikan sebelum amplikondi-sekuensing. Hasil visualisasi menggunakan

alat UV transiluminator akan menunjukkan kualitas DNA yang teramplifikasi.

Tahapan elektroforesis secara garis besar sama seperti skema pada gambar 5

namun dengan beberapa opsi berbeda pada larutan dan konsentrasi agar.

Gambar 5. Skema Proses Elektroforesis Secara Garis Besar

Gambaran proses elektroforesis pada gambar 5 menggambarkan secara

umum proses elektroforesis yang terbagi menjadi beberapa tahapan yaitu

pembuatan gel agarosa, pencetakkan gel, penuangan amplikon pada gel,

pengaliran listrik, perendaman dengan pewarna dan visualisasi hasil.

Elektroforesis dalam protokol teknik manual Promega kit yang digunakan dalam

penelitian ini adalah sebagai berikut.

Agarose 0,525 gr dengan konsentrasi 1,5 % dipersiapkan dan ditambahkan

dengan 35 ml TBE 1x sebagai pelarutnya. Agarose dipanaskan dalam microwave

selama 2 menit lalu didiamkan pada suhu ruang hingga keadaan dapat dikatakan

hangat kuku dan ditambahkan 1,5 μl EtBr. Agarose dituang dalam cetakan dan

ditunggu sekitar 15 menit hingga memadat. Sampel dituang pada sumuran yang

telah didata agar tidak tertukar sesuai dengan letak sampel sebanyak 3 μl lalu

22

ditambahkan marker dan elektroforesis dijalankan selama 30 menit. Hasil

kemudian dapat dibaca pada mesin UV transiluminator dan didokumentasikan.

3.5.3 DNA Sequencing

Proses DNA sequencing atau Sekuensing dilakukan oleh pihak profesional

dan dalam penelitian ini merupakan pihak PT Genetika Science Indonesia.

Sampel DNA yang telah disiapkan dikirimkan ke instansi tersebut kemudian

dilanjutkan ke 1st BASE DNA Squencing Service di Singapura. Sekuensing

ditujukan untuk mengetahui urutan basa nukleotida dan dalam penelitian ini

metode yang diambil merupakan metode Dye-terminator sequence dengan

teknik Sanger. Teknik tersebut menurut Blazej et al. (2006), dikenal dengan

kemampuannya untuk menghasilkan bacaan sekuens yang panjang dan spesifik.

Proses sekuensing kemudian akan menjadi data chromatogram yang dapat

diolah dengan aplikasi-aplikasi khusus.

3.5.4 Analisis Data

Analisa berupa chromatogram terdiri atas potongan forward dan reverse

sebagai hasil dari pemotongan oleh primer. Editing dilakukan untuk merapikan

data hasil sekuensing menggunakan program Chromas v.2.6.6., hal ini dilakukan

karena pada hasil sekuensing sering ditemukan noise atau bagian yang sulit

dibaca karena bertumpuk dan lainnya. Asumsi pemotongan noise adalah pada

non-coding region sehingga tidak terlalu banyak dan tidak menghilangkan

informasi genetik penting dengan perkiraan maksimal pemotongan adalah 20 bp.

Bagian noise jika tidak dihapus memiliki potensi membuat data konsensus yang

kurang baik seperti penambahan nilai keragaman karena berubahnya susunan

basa nukleotida hasil pembacaan penumpukan dari aplikasi. Kedua hasil

sekuensing kemudian diproses pada program UGENE v.1.31.1. untuk digabung

23

dan dicocokkan lalu dibentuk konsensus dan disimpan dalam format berkas

FASTA file.

Editing kedua dilakukan pada file FASTA menggunakan Microsoft Word

lalu digabungkan data sekuensing lainnya dari pengunduhan di GenBank. Data

sekuens dan data pembanding kemudian disejajarkan pada program MESQUITE

v.3.5.1. untuk menyamakan jumlah basa antar sekuens. Indeks keragaman

genetik atau genetic diversity dapat berupa haplotype diversity dan nucleotide

diversity dengan menggunakan program DnaSP v.6.12.01. Pairwise Fst

menggambarkan struktur populasi yang meliputi diferensiasi populasi dan aliran

gen dengan bantuan program Arlequin v.3.5.2.2.

24

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Koleksi Spesimen

Spesimen ikan gabus (Channa striata) diambil pada daerah perairan

sekitar Jl. Raya Pasar Sungelebak Karanggeneng Lamongan, Simo, Pucangro,

Kalitengah, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur oleh pencari ikan dari Pasar

Sungelebak, Kabupaten Lamongan. Lokasi ini memiliki titik koordinat

7.039605884339526 Lintang Utara, 112.34919835786717 Bujur Timur.

Persebaran ikan C. striata sendiri pada kawasan Kepulauan Indonesia secara

alami hanya tersebar pada Paparan Sunda meliputi Pulau Kalimantan, Pulau

Sumatera dan Pulau Jawa (Rahayu et al., 2021). Persebaran lain di Indonesia

diindikasi sebagai persebaran tidak alami (introduksi) sebagaimana dilaporkan

oleh Alviodinasyari et al. (2019) bahwa C. striata tersebar juga pada Pulau Bali

(Sunda Kecil), Sulawesi dan Kepulauan Maluku.

Ikan C. striata yang tersebar juga di Kabupaten Lamongan sendiri

berdasarkan penelitian Fuadi et al. (2017), pada Kecamatan Maduran, Kab.

Lamongan dibandingkan dengan ikan dalam spesies yang sama pada

Kecamatan Yosowilangun, Lumajang lebih unggul dari segi kadar kandungan

protein albumin-nya. Jarak tempat pengambilan sampel pada penelitian ini

dengan tempat pengambilan sampel pada penelitian tersebut (Kec. Sungelebak

ke Kec. Maduran) sekitar 10 km dan masih termasuk Daerah Aliran Sungai

(DAS) Bengawan Solo. Sampel ikan yang diindikasi sebagai C. striata pada

lapang didapatkan sebanyak 18 individu lalu dipilih 10 individu terbaik secara

morfologi untuk kemudian dilakukan uji genetik. Jumlah sampel yang dianalisa

untuk mengetahui indeks keragaman suatu populasi juga dilakukan oleh Arifin

25

dan Kurniasih (2007), dengan jumlah 5 hingga 10 individu tiap populasi dan

dianggap telah mampu mewakili suatu data populasi tersebut. Jumlah sampel 5

individu atau lebih pada suatu populasi untuk penelitian genetika populasi

menurut Goodal-Coopestake et al. (2012), merupakan standart yang baik untuk

menghindari adanya bias pada analisa. Keseluruhan spesimen yang diuji genetik

telah didokumentasikan dan dapat dilihat pada lampiran 3. Salah satu

dokumentasi sampel dapat dilihat pada gambar 6.

Sumber: Dokumentasi Pribadi Gambar 6. Ikan C. striata Dengan Tag CSL 06 yang Merupakan Salah Satu

Sampel dari 10 Sampel Uji pada Penelitian Ini

Umumnya, keluarga Channidae yang dapat ditemukan di pulau Jawa

secara alami ada 2 spesies yaitu ikan C. striata dan ikan kocolan (Channa

gachua atau Channa limbata). Untuk bentuk tubuh sebagaimana keluarga

Channidae maka tidak jauh berbeda walaupun ada, namun hal paling menonjol

sebagaimana menurut Ilmi dan Arisuryanti (2018), adalah ukuran C. gachua atau

C. limbata yang tidak dapat melebihi 28 cm sedangkan C. striata dapat mencapai

100 cm. Ikan C. gachua atau C. limbata ini memiliki warna tubuh yang menarik

untuk ikan hias dengan ujung berwarna kekuningan hingga kemerahan pada sirip

dorsal, caudal dan anal. Terkadang di sela sirip-sirip tersebut terdapat warna biru

sehingga sangat mudah dibedakan dengan ikan C. striata. Ciri-ciri pada tubuh

kedua spesies tersebut juga sangat berbeda dari corak hingga pewarnaannya.

26

Mata pada species C. gachua atau C. limbata sering ditemui berwarna

kemerahan sedangkan pada C. striata umumnya tidak, sementara pada bagian

tubuh posterior ikan C. striata berwarna putih cerah dan pada C. gachua atau C.

limbata tidak. Habitat ikan C. gachua atau C. limbata juga terbatas pada sungai

air tawar sedangkan ikan C. striata memiliki toleransi salinitas pada daerah

estuari. Foto ikan C. limbata dapat dilihat pada gambar 7 sebagai bahan

perbandingan dengan C. striata. Gambar perairan di sekitar wilayah pengambilan

sampel C. striata dapat dilihat pada gambar 8 dan peta lokasi pada gambar 9.

Sumber: Aqmal-naser dan Ahmad, 2021

Gambar 7. Foto Ikan Channa limbata dari Semenanjung Malaysia. Warna sirip hingga mata species C. limbata sangat berbeda dengan C. striata, begitu pula dengan corak tubuh serta ukuran ikan C. limbata

Sumber: Dokumentasi Pribadi

Gambar 8. Foto Lokasi Perairan Sekitar Kawasan Jl. Raya Pasar Sungelebak

Karanggeneng Lamongan, Simo, Pucangro, Kalitengah, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur

27

Sumber: Google Maps, 2021

Gambar 9. Peta Lokasi Pengambilan Sampel Ikan C. striata di Perairan Sekitar Jl. Raya Pasar Sungelebak Karanggeneng Lamongan, Simo, Pucangro, Kalitengah, Kabupaten Lamongan, Jawa Timur

Lokasi pengambilan ikan C. striata diindikasi selain dari kawasan

penyebarannya, juga dari ciri-ciri habitat tempat tinggal ikan tersebut. Kawasan

terindikasi memiliki populasi ikan C. striata dikunjungi sebagaimana detail lokasi

yang telah disinggung sebelumnya. Perairan di sekitar kawasan tersebut memiliki

hubungan dengan Daerah Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo sehingga

merupakan anak sungai dari DAS Bengawan Solo. Perairan di kawasan tersebut

cenderung keruh dan dekat dengan persawahan dengan beberapa spesies lain

hasil observasi dan keterangan warga sekitar yaitu ikan betok (Anabas

testudineus), ikan wader cakul (Barbodes binotatus) dan ikan sili (Macrognathus

aculeatus).

4.2 Hasil Ekstraksi dan Amplifikasi

Jaringan diekstraksi lalu diamplifikasi dengan mesin thermal cycler

menggunakan primer universal F2 R2. Penggunaan primer jenis ini pada ikan C.

striata sejalan dengan penggunaan pada ikan yang sama oleh Arisuryani et al.

(2020), dimana penelitian tersebut menyasar situs Cytochrome Oxydase sub unit

I (COI) pada ikan C. striata dari daerah Kalimantan Tengah. Hasil amplifikasi

28

kemudian diuji kualitasnya dengan elektroforesis dan divisualisasikan. Hasil

visualisasi memperlihatkan bahwa sampel telah siap dikirim ke PT Genetika

Science untuk dilakukan sekuensing. Gambar contoh hasil visualisasi

elektroforesis dengan UV transiluminator dapat dilihat pada gambar 10 dan

dokumentasi selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 8.

Sumber: Dokumentasi Pribadi

Gambar 10. Contoh Hasil Visualisasi Elektroforesis pada Penelitian Ini. Kotak merah menunjukkan hasil jumlah pasang basa kurang lebih 671 hingga 681 bp; Kotak hitam menunjukkan area spesifik sampel; Kotak dan garis kuning menunjukkan area marker.

Prinsip kerja dari elektroforesis sendiri terfokus pada kekentalan gel

seperti pendapat Harahap (2018), kekentalan gel mempengaruhi laju molekul.

Hasil dari elektroforesis dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, selain dari gel

sebagai medium pemisah, faktor lainnya yaitu sampel, larutan penyangga dan

medan listrik yang digunakan. Sampel yang digunakan memiliki beberapa hal

untuk diperhatikan yaitu muatan, ukuran dan bentuk molekul dari sampel

tersebut. Larutan pengangga sendiri juga perlu diperhatikan masalah keterkaitan

ion penyangga ketika berinteraksi dengan senyawa yang diujikan serta pH dipilih

harus sesuai berdasarkan jenis campuran sampelnya. Medan listrik terlalu tinggi

akan mengakibatkan penguapan larutan dan denaturasi pada sampel, medan

listrik terlalu rendah akan memperlambat laju molekul saat proses elektroforesis.

29

4.3 Hasil Sekuensing

Dalam penelitian ini, chromatogram diolah terlebih dahulu menggunakan

aplikasi Chromas v.2.6.6. untuk salah satunya menghilangkan tumpukan data

pada chromatogram yang umum disebut sebagai „noise‟. Panjang basa awal

hasil sequencing 10 sampel CSL memiliki panjang 671 bp hingga 681 bp dengan

hasil sekuens forward 678 bp hingga 681 bp dan sekuens reverse 671 bp hingga

676 bp. Contoh noise dalam laporan ini dapat dilihat pada gambar 11 dengan

contoh tumpukan serta area yang dihapus pada sekuens CSL nomor 4.

Gambar 11. Data Chromatogram yang Dibuka pada Aplikasi Chromas v.2.6.6.,

Kotak Merah Adalah Contoh Tumpukan Noise pada Sekuens Sampel CSL Nomor 4 dan Kotak Hitam Adalah Area yang Dihapus

Data sekuens utama penelitian ini adalah C. striata dari Kabupaten

Lamongan dengan tag CSL berjumlah 10 individu sedangkan data sekuens

pembanding adalah C. gachua atau C. limbata dari Malang (MLG) berjumlah 5

individu; Kediri (KDR) berjumlah 6 individu; Mojokerto (MJT) berjumlah 7 individu;

Jawa Tengah (JWT) berjumlah 7 individu; Jawa Barat (JWB) berjumlah 7

individu; Pulau Bali (PBL) berjumlah 7 individu; dan Sumatra (SMT) berjumlah 3

individu. Data pembanding MLG berasal dari penelitian Kholil (2019), KDR

berasal dari penelitian Lutfitasari (2020), MJT dari penelitian Hamurdana (2020)

dan JWT, JWB, PBL dan SMT berasal dari GenBank. Detail data dipakai dapat

dilihat pada lampiran 5 dan prosedur kerja dari setiap aplikasi pada lampiran 6.

30

Penggunaan spesies teridentifikasi C. gachua memiliki kemungkinan

kesalahan identifikasi pada seluruh data dengan lokasi pengambilan sampel dari

Asia Tenggara, sekuens C. gachua terlebih pada GenBank untuk spesimen yang

ditemukan di Asia Tenggara termasuk di Indonesia memiliki kemungkinan

kesalahan identifikasi dengan C. limbata (dalam laporan ini berkaitan dengan

penggunaan data pembanding). Kesalahan identifikasi sangat umum ditemukan

di GenBank sebagaimana menurut Conte-Grand et al. (2017), bahwa begitu

banyak atau tinggi jarak perbedaan sekuens-sekuens khususnya pada

Channidae di GenBank yang kompleks secara intraspesifik. Perbedaan tersebut

karena secara intraspesifik terlebih ditambah dengan distribusi yang sangat luas

maka dapat dikatakan bahwa ada kemungkinan kesalahan identifikasi dan salah

satunya kemungkinan tersebut ada pada C. gachua di bagian Timur Indoburman

(termasuk di Indonesia). Identifikasi tersebut kemungkinan seharusnya mengarah

pada C. limbata yang telah terpisah secara allopatrik dengan pemisah populasi

dari kedua spesies tersebut terletak di Negara Myanmar (Indoburman) sehingga

pada Asia Selatan merupakan populasi dari C. gachua, sedangkan pada Asia

Tenggara merupakan populasi C. limbata. Kesalahan identifikasi antara kedua

spesies tersebut secara morfologi sangat wajar dikarenakan perbedaan

morfologinya sangat terbatas, termasuk spesies kompleks dan kajian hanya

terbatas pada spesimen yang ada sehingga pada penelitian ini C. gachua dan C.

limbata dianggap dalam satu spesies karena semua berasal dari Indonesia.

Hasil konsensus juga dapat digunakan sebagai bahan identifikasi dengan

menggunakan fitur BLAST pada web NCBI. Konsensus seluruh sampel dari

Kabupaten Lamongan memiliki „percent identitiy‟ atau disingkat „Per. Ident‟ pada

tabel hasil BLAST yang mencapai 99,69% hingga 100% dan merujuk pada

spesies C. striata. Pencocokan tersebut didasarkan pada sekuens-sekuens yang

31

telah terdaftar di GenBank sehingga sampel dari Kabupaten Lamongan dapat

dikatakan secara genetik merupakan spesies C. striata walaupun kemungkinan

kesalahan identifikasi pada spesies kompleks C. striata dengan alasan serupa

pada kasus C. gachua dan C. limbata juga terjadi. Permasalahan identifikasi

tersebut pada GenBank untuk kasus C. striata dalam penelitian Conte-Grand et

al. (2017), menyatakan bahwa masih diperlukan banyak detail morfologi disertai

analisis genetik untuk menyelesaikannya. Contoh hasil BLAST dapat dilihat pada

gambar 12.

Gambar 12. Contoh Hasil BLAST pada Sampel CSL_01 dari Kabupaten Lamongan yang Mencapai 99,85% untuk Percent Identity-nya yang Ditandai Kotak Merah

Nilai percent identity hasil BLAST pada seluruh sampel Kabupaten

Lamongan secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 7. Tertinggi merupakan

sampel CSL_06 yang mencapai 100%, disusul CSL_01 dan CSL_09 yaitu

99,85% dan sampel lainnya adalah 99,69%. Seluruh sampel merujuk pada

spesies C. striata saja dengan presentase yang tinggi. Percent identity pada

kajian genetika menurut Pearson (2014), umum digunakan para peneliti untuk

menggambarkan kemungkinan sekuens-sekuens homolog dari sampel FASTA

yang diujikan. Fitur percent identity memiliki rumus penyederhanaan sekuens

untuk dikatakan homolog yaitu 30%. Ketika struktur sekuens tertentu telah

teridentifikasi pada 30% sekuens di GenBank maka dinyatakan homolog.

Kelemahan fitur ini adalah tidak dapat mengidentifikasi kelompok sekuens langka

32

dan umum, kurang sensitif serta tidak dapat menunjukkan pergantian asam-

amino yang lestari. Fitur lain yang dapat dipakai adalah E-values dan bit score.

Bagaimanapun, percent identity dapat memberi ukuran yang berguna untuk jarak

evolusi dalam bentuk presentase homolog.

4.4 Komponen Basa Nukleotida

Tiap data kemudian diberikan penamaan grup dimana populasi CSL adalah

grup 1, MLG grup 2, KDR grup 3, MJT grup 4, JWT grup 5, JWT grup 6, PBL

grup 7, dan SMT grup 8. Data utama berupa populasi CSL menunjukkan

presentase basa nukleotida Sitosin (C) sebanyak 28,96%, Timin (T) sebanyak

29,80%, Adenin (A) sebanyak 23,98%, dan Guanin (G) sebanyak 17,26%

sehingga perbandingan pasangan A+T lebih dominan dengan presentase

53,78% dibanding pasangan G+C yaitu 46,22%. Kondisi genetik populasi dengan

pasangan A+T lebih dominan juga terjadi di semua populasi pembanding dengan

pesentase melebihi 50%. Dominasi presentase A+T menurut Wibowo (2016),

umum ditemui pada sekuens dari DNA mitokondria. Komposisi basa nukleotida

pada COI menurut Kombong dan Arisuryanti (2018), lebih beragam dibandingkan

pada 16S dikarenakan laju evolusi yang lebih tinggi sementara 16S rRNA lebih

lestari. Hal tersebut menjadikan COI lebih sensitif untuk kajian intraspesifik dan di

sisi lain dapat digunakan untuk kajian interspesifik sebagaimana pernyataan

Nuryanto dan Solihin (2006), bahwa laju mutasi COI juga lebih tinggi dibanding

16S dan 12S rRNA sehingga dapat lebih efektif mengidentifikasi perbedaan

genetik antar populasi bahkan antar individu pada hampir di semua filum kecuali

pada filum Cnidaria. Ikatan A+T dan G+C juga berbeda yang menurut Irmawati

(2016), Ikatan A+T memiliki dua ikatan hidrogen sementara ikatan G+C memiliki

tiga ikatan hidrogen. Perbedaan jumlah ikatan hidrogen di antara basa nukleotida

menyebabkan ikatan A+T lebih lemah dibanding G+C sehingga komposisi A+T

33

lebih mudah untuk bermutasi. Analisa komposisi nukleotida dapat membuktikan

keunggulan COI dibanding situs lain pada mtDNA. Komposisi basa nukleotida

tiap populasi dapat dilihat pada tabel 1 dan penjelasan singkat dapat dilihat di

lampiran 9.

Tabel 1. Komoposisi Basa Nukleotida pada Seluruh Populasi

Grup Lokasi Jumlah individu

Basa Nukleotida (%)

C T A G

1 Lamongan (CSL) 10 28,96% 29,80% 23,98% 17,26% 2 Malang (MLG) 5 28,59% 30,15% 23,47% 17,79% 3 Kediri (KDR) 6 28,86% 29,88% 23,39% 17,87% 4 Mojokerto (MJT) 7 28,70% 30,04% 23,47% 17,79% 5 Jawa Tengah (JWT) 7 28,79% 29,86% 23,55% 17,79% 6 Jawa Barat (JWB) 7 28,86% 29,75% 23,58% 17,81% 7 Pulau Bali (PBL) 7 28,97% 29,65% 23,49% 17,90% 8 Sumatra (SMT) 3 29,71% 29,17% 24,49% 16,63%

Keterangan: Basa Citosin (C), Basa Timin (T), Basa Adenin (A), dan Basa

Guanin (G)

4.5 Analisis Indeks Keragaman

Analisis keragaman dilakukan dengan melihat hasil perhitungan indeks

keragaman berupa jumlah haplotipe yang disimbolkan dengan „h‟, keragaman

haplotipe disimbolkan „Hd‟ dan keragaman nukleotida disimbolkan „π‟. Angka-

angka tersebut diperoleh dari pengolahan lanjutan data chromatogram pada

aplikasi DNAsp v.6.12.1. pada semua populasi. Populasi utama maupun populasi

pembanding akan dikategorikan dan diperkirakan penyebab kondisi keragaman

genetiknya (interpretasi hasil). Keragaman genetik merupakan studi yang

menurut Amos dan Harwood (1998), merupakan tempat bergantungnya adaptasi

serta spesiasi suatu populasi. Keragaman yang tinggi dianggap merupakan

kondisi sehat, memiliki kemampuan baik untuk menanggapi penyakit, parasit,

predator serta perubahan lingkungan. Keragaman yang rendah sebaliknya,

dianggap membatasi suatu populasi menanggapi ancaman dalam jangka waktu

pendek maupun panjang. Salah satu faktor paling diperhatikan adalah

34

fragmentasi habitat suatu populasi yang dapat memperkecil ukuran populasi dan

penghambatan aliran gen. Dalam kondisi ekstrim, suatu populasi secara berkala

mengecil hingga membuat populasi tersebut sangat dirugikan dalam ukuran

sangat kecil, umum disebut sebagai bottleneck effect. Keragaman genetik pada

akhirnya diharapkan dapat menjelaskan kondisi suatu spesies atau populasi

dalam hal keseimbangan kondisi antara menguntungkan atau merugikan bagi

species ataupun populasi tersebut.

4.5.1 Analisis Indeks Keragaman Populasi Lamongan

Populasi CSL memiliki 3 grup Haplotipe dengan keragaman haplotipe

mencapai 0,644 dan keragaman nukleotida 0,00296. Keragaman haplotipe

sendiri memiliki standart deviasi dan dalam hal ini senilai 0,152 sedang untuk

keragaman nukleotida senilai 0,00064. Keragaman genetik berdasarkan

haplotipe dan nukleotida menurut Grant and Bowen (1998), memiliki empat

kategori dimana keragaman haplotipe dianggap tinggi jika lebih dari sama

dengan 0,5 dan keragaman nukleotida lebih dari sama dengan 0,5% atau setara

dengan 0,005. Kategori pertama jika kedua nilai terbilang rendah maka

dimungkinkan baru saja terjadi founder effect maupun bottleneck effect karena

keadaan wilayah secara periodik atau juga karena adanya struktur metapopulasi

di wilayah tersebut. Kategori kedua jika keragaman haplotipe tinggi dan

nukleotida rendah maka dimungkinkan populasi tersebut sedang dalam keadaan

baru berkembang atau ekspansi setelah mengalami kondisi keragaman genetik

rendah, pada kategori ini perkembangan populasi tergolong cepat dan terjadi

banyak mutasi-mutasi baru. Kategori ketiga jika keragaman nukleotida tinggi dan

haplotipe rendah, populasi tersebut sedang bercabang-cabang pada haplotipe,

dimungkinkan populasi tersebut sedang dalam keadaan stabil setelah terisolasi

maupun terjadi bottleneck effect. Kategori keempat memiliki nilai keragaman

35

tinggi baik haplotipe maupun nukleotida, hal ini dimungkinkan populasi tersebut

telah stabil setelah terjadi allopatrik atau populasi stabil bersekala besar yang

mengalami sejarah evolusi panjang.

Populasi CSL merupakan populasi dengan keragaman genetik kategori

kedua dimana keragaman haplotipe melebihi 0,5 (tinggi) namun keragaman

nukleotida dibawah 0,005 (rendah). Hal tersebut menunjukkan adanya

kemungkinan penurunan kualitas populasi akibat genetic drift. Populasi tersebut

diindikasi sedang bertumbuh setelah mengalami penurunan kualitas dengan

beberapa kemungkinan penyebab. Populasi CSL kemungkinan mengalami

penurunan kualitas populasi dikarenakan kawasan penangkapan berupa anak

sungai kecil yang memiliki banyak percabangan sehingga dapat terjadi founder

effect (keterbatasan indukan karena pemecahan populasi) pada populasi CSL.

Dengan kemungkinan tersebut, populasi CSL dapat dikatakan sebagai populasi

baru yang terpecah dari populasi utama, populasi utama dalam hal ini

diperkirakan adalah populasi di sungai utama DAS Bengawan Solo.

Kemungkinan lainnya setelah keadaan geografis penyebab terpecahnya populasi

utama sehingga muncul populasi CSL tersebut adalah status beberapa sampel

populasi CSL yang diambil kemungkinan masih dalam satu garis keturunan.

Status tersebut dimaksudkan untuk beberapa spesimen di antara sampel

populasi CSL tersebut kemungkinan merupakan anakan dari induk yang sama

karena ukuran tubuh sampel satu sama lain tidak jauh berbeda terutama pada

sampel dalam grup haplotipe 1 dan 2, detail anggota grup pada tiap grup

haplotipe dapat dilihat di tabel 3.

Tabel 2. Indeks Keragaman pada Seluruh Populasi

Grup Lokasi Jumlah bp

n h Hd π

1 Lamongan (CSL) 653 10 3 0,644 0,00296 2 Malang (MLG) 652 5 2 0,400 0,00245 3 Kediri (KDR) 652 6 3 0,733 0,00225

36

Grup Lokasi Jumlah bp

n h Hd π

4 Mojokerto (MJT) 652 7 2 0,286 0,00131 5 Jawa Tengah

(JWT) 631 7 4 0,857 0,02430

6 Jawa Barat (JWB) 652 7 5 0,905 0,03002 7 Pulau Bali (PBL) 652 7 3 0,667 0,01972 8 Sumatra (SMT) 611 3 3 1,000 0,04037

Keterangan: jumlah individu (n), jumlah haplotipe (h), keragaman haplotipe (Hd), dan keragaman nukleotida (π)

Tabel 3. Anggota Dalam Grup Haplotipe pada Seluruh Populasi No Haplotipe Jumlah Anggota dalam Haplotipe

1 Hap_1 3 CSL_01, CSL_08, CSL_09 2 Hap_2 6 CSL_02, CSL_03, CSL_04, CSL_05, CSL_07,

CSL_10 3 Hap_3 1 CSL_06 4 Hap_4 4 MLG_01, MLG_03, MLG_04, MLG_05 5 Hap_5 1 MLG_02 6 Hap_6 4 KDR_01, KDR_02, KDR_03, MJT_02 7 Hap_7 1 KDR_04 8 Hap_8 2 KDR_05, KDR_06 9 Hap_9 6 MJT_01, MJT_03, MJT_04, MJT_05, MJT_06,

MJT_07 10 Hap_10 2 JWT_01, JWT_02 11 Hap_11 1 JWT_03 12 Hap_12 2 JWT_04, JWT_06 13 Hap_13 2 JWT_05, JWT_07 14 Hap_14 2 JWB_01, JWB_02 15 Hap_15 1 JWB_03 16 Hap_16 1 JWB_04 17 Hap_17 1 JWB_05 18 Hap_18 2 JWB_06, JWB_07 19 Hap_19 4 PBL_01, PBL_02, PBL_03, PBL_04 20 Hap_20 1 PBL_05 21 Hap_21 2 PBL_06, PBL_07 22 Hap_22 1 SMT_01 23 Hap_23 1 SMT_02 24 Hap_24 1 SMT_03

4.5.2 Analisis Indeks Keragaman Seluruh Populasi

Populasi CSL yang masuk pada kategori kedua sama halnya dengan salah

satu populasi pembanding yaitu populasi KDR. Populasi JWT, JWB, PBL dan

SMT ada pada kategori keempat yang artinya populasi-populasi tersebut memiliki

keragaman genetik tinggi. Populasi lainnya yaitu MLG dan MJT masuk dalam

kategori pertama yang artinya memiliki keragaman genetik rendah. Populasi-

37

populasi yang masuk dalam kategori kedua dan keempat memiliki jumlah grup

haplotipe di atas 2 sedangkan populasi-populasi kategori pertama memiliki

jumlah haplotipe 2 dengan jumlah sampel sekuens 3 hingga 10 tiap populasi.

Jumlah haplotipe secara keseluruhan dari kedelapan grup adalah 24 grup

dengan jumlah keseluruhan sampel sekuens 52 individu. Jumlah pasangan basa

yang digunakan dari 611 hingga 653 bp. Keterangan lengkap dapat dilihat pada

tabel 2 dengan rincian anggota haplotipe pada tabel 3 dan penjelasan singkat

dapat dilihat di lampiran 9.

Populasi pada kategori pertama memiliki keragaman haplotipe tertinggi 0,4

dengan keragaman nukleotida tertinggi 0,00245 yaitu populasi MLG. Populasi-

populasi ini memiliki keragaman yang rendah dengan kemungkinan karena pada

populasi-populasi tersebut telah terjadi founder effect, bottleneck effect ataupun

baru saja terisolasi dikarenakan adanya perubahan lingkungan karena

pembangunan maupun aktifitas manusia lainnya. Untuk populasi MJT

diperkirakan merupakan pecahan populasi dari populasi KDR sebagaimana

dapat dilihat pada anggota haplotipe ke-6 dimana KDR_01-03 dari DAS Brantas,

Ngadiluwih, Kediri merupakan anggota grup haplotipe yang sama dengan

MJT_02 dari DAS Brantas, Kec. Ngoro, Mojokerto, Jawa Timur. Populasi KDR

lebih stabil dibandingkan populasi MJT sehingga diperkirakan populasi utama

adalah populasi KDR bukan MJT. Jarak antara lokasi kedua populasi tersebut

sekitar 106 km dan dimungkinkan populasi MJT baru saja terisolasi.

Populasi pada kategori kedua memiliki keragaman haplotipe tertinggi

0,733 (populasi KDR) dan keragaman nukleotida 0,00296 (populasi CSL).

Populasi KDR walaupun lebih stabil dari MJT, namun masih dalam kategori baru

terlepas dari keadaan bottleneck effect dan atau faktor lainnya sehingga sedang

dalam proses ekspansi populasi. Kondisi ini bila memang terjadi hal-hal tersebut

bisa jadi sangat lama untuk populasi KDR maupun CSL menjadi populasi yang

38

stabil dan masuk dalam kategori keempat.

Populasi pada kategori keempat memiliki keragaman haplotipe tertinggi

1,0 (populasi SMT) dengan keragaman nukleotida tertinggi 0,04037 yaitu

populasi SMT. Populasi SMT berasal dari 2 lokasi di pulau Sumatra yang

memiliki pemisah geografis berupa laut karena berupa pulau sehingga sangat

dimungkinkan populasi SMT sangat tinggi keragaman genetiknya. Perbedaan

wilayah tersebut sangat berpengaruh pada analisa keragaman genetik, namun

pada sampel yang memiliki wilayah sama pada populasi SMT juga didapati

perbedaan pada haplotipenya sehingga ada kemungkinan keragaman di tempat

tersebut yaitu Danau Laut Tawar, Kab. Aceh Utara, Aceh untuk SMT_01 hingga

SMT_02 memang tinggi namun diperlukan data lebih banyak untuk

memastikannya. Sampel SMT_03 dari Pulau Lingga, Kab. Lingga, Kepulauan

Riau sendiri dapat dinyatakan telah terpisah secara allopatrik. Populasi JWT

diambil dari 2 lokasi sementara populasi JWB dambil dari 6 lokasi sehingga

dimungkinkan hal tersebut menjadi penyebab keragaman populasi JWB lebih

tinggi dibanding keragaman populasi JWT karena aliran gen dimungkinkan sulit

terjadi karena pemisahan secara allopatrik sehingga muncul sub populasi

regional. Populasi PBL diambil dari 2 lokasi berbeda di Pulau Bali, Pulau Bali

sendiri merupakan wilayah Sunda Kecil yang bukan merupakan penyebaran ikan

dari keluarga Channidae secara alami sebagaimana pendapat Alviodinasyari et

al. (2019), bahwa persebaran ikan Channidae di Pulau Bali, Pulau Sulawesi dan

Kepulauan Maluku adalah hasil introduksi. Keragaman genetik yang tinggi di

populasi PBL ini merupakan tanda bahwa populasi tersebut telah stabil dan

diperkirakan introduksi spesies Channidae ke kawasan tersebut telah terjadi

sejak lama karena faktor kesengajaan maupun tidak di antara kedua pulau

tersebut. Persebaran ini kuat kaitannya dengan kegiatan manusia karena ikan

tersebut tidak dimungkinkan melakukan emigrasi melewati laut.

39

4.6 Struktur Populasi atau Diferensiasi Genetik

Hasil analisa Pairwise Fst tertinggi ada pada pasangan populasi Grup 1

yaitu CSL dengan seluruh grup. Nilai terendah diferensiasi populasi CSL dengan

populasi pembanding mulai dari 0.92533 (CSL-JWB) hingga tertinggi 0.98820

(CSL-MJT) dikarenakan spesies populasi CSL berbeda dengan seluruh populasi

pembanding yaitu Channa striata dengan pembanding Channa gachua atau C.

limbata sehingga tidak memungkinkan adanya pertukaran gen di antara populasi

CSL dengan lainnya walau masih dalam satu ekoregional seperti populasi CSL

dengan MJT. Kawasan Lamongan dan Mojokerto berdasarkan ekoregional

menurut Chua et al. (2019), tergabung dalam Central-East Java Ecoregion

(CEJ). Hal tersebut juga mengindikasikan spesiasi yang terjadi di antara kedua

spesies tersebut berdasarkan grup-grup pada laporan ini pada diferensiasi

genetiknya adalah di atas angka 0.92533. Hal tersebut dikarenakan nilai Fst

berpasangan untuk genetik tidaklah tentu sebagaimana pendapat Hutchison dan

Templeton (1999), kemutlakan Fst tidak layak dipakai karena umumnya di alam

suatu populasi tidak dalam keadaan setimbang bahkan untuk melihat hanyutan

gen maupun aliran gen antar populasi walaupun nilai Fst tetap menggambarkan

perbedaan gen populasi satu ke lainnya. Nilai Fst semakin tinggi maka semakin

kecil kemungkinan aliran gen terhubung bahkan dapat terjadi spesiasi di antara

keduanya sebagaimana hasil pengujian populasi CSL pada laporan ini.

Diferensiasi genetik pada seluruh populasi dapat dilihat pada tabel 4 .

Tabel 4. Diferensiasi Genetik pada Seluruh Populasi Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 Grup 5 Grup 6 Grup 7 Grup 8

Grup 1 0.00000

Grup 2 0.98571 0.00000

Grup 3 0.98624 0.45406 0.00000

Grup 4 0.98820 0.63345 0.68065 0.00000

40

Grup 1 Grup 2 Grup 3 Grup 4 Grup 5 Grup 6 Grup 7 Grup 8

Grup 5 0.93813 0.46015 0.46042 0.52721 0.00000

Grup 6 0.92533 0.58050 0.59309 0.62198 0.29789 0.00000

Grup 7 0.94760 0.38702 0.37191 0.48936 0.26132 0.41148 0.00000

Grup 8 0.94673 0.73422 0.75481 0.78643 0.51312 0.43713 0.56747 0.00000

Populasi dengan perbedaan paling rendah pada pengujian ini merupakan

populasi JWT dengan JWB (0.29789) dan dengan PBL (0.26132). Secara

ekoregional, populasi JWT ada pada regional CEJ sementara populasi JWB

terbagi menjadi dua ekoregional yaitu Southern Sumatra-Western Java (SWJ)

pada sampel di sekitar Purwakarta dan Indian Ocean Slope of Sumatra and Java

(ISJ) sementara populasi PBL merupakan ekoregional pada Sunda Kecil yang

merupakan daerah introduksi. Populasi dengan nilai Fst berpasangan rendah

memiliki kemungkinan terjadinya aliran gen tinggi dimana ada kemungkinan ikan

Channa gachua pada ekoregional CEJ, SWJ maupun ISJ memiliki akses untuk

bertukar gen karena adanya perubahan ekologis dari aktivitas manusia sehingga

terjadi pertemuan dua subspecies dan terjadi perkawinan. Kemungkinan lain

seperti adanya upaya restocking, perdagangan dan lain sebagainya juga ada.

Hubungan dekat populasi JWT dengan PBL bisa jadi karena populasi PBL

berasal dari populasi JWT yang diintroduksi di wilayah tersebut.

Pembagian regional ekologis pada Chua et al. (2019), merupakan

pembagian ekologis berdasar daerah air tawar yang termasuk dalam proyek

Freshwater Ecoregions of the World. Pembagian regional ekologis tersebut

didasarkan oleh kajian-kajian ekologi spesies air tawar di masa lampau dan jejak

evolusi yang dipengaruhi oleh batas-batas hidrologis. Penggunaan pembagian

tersebut pada kajian genetika seperti pada penelitian ini akan membantu melihat

kemungkinan yang terjadi antar populasi. Pembagian regional ekologis di

Paparan Sunda dapat dilihat pada gambar 13.

41

Sumber: Chua et al., 2019

Gambar 13. Pembagian Paparan Sunda Berdasarkan Regional Ekologis Menjadi 13 Bagian. Aceh (ACH), Borneo Highlands (BHL), Central and East Java (CEJ), Eastern Borneo (EBR), Indian Ocean Slope of Sumatra and Java (ISJ), Kapuas (KPS), Malay Peninsula Eastern Slope (MPE), Northeastern Borneo (NEB), Northwestern Borneo (NWB), Southern Central Sumatra (SCS), Southeastern Borneo (SEB), Southern Sumatra-Western Java (SWJ), Northern Central Sumatra-Western Malaysia (SWM)

Perbedaan regional ekologis pada suatu populasi ke populasi lainnya

dapat menjadi mekanisme isolasi dan jika berlangsung dalam waktu lama dapat

menyebabkan spesiasi sebagaimana pendapat Fatmawati dan Muzzazinah

(2019), bahwa mekanisme isolasi dapat menyebabkan spesiasi hingga

munculnya perbedaan morfologis. Isolasi geografis dalam hal ini sejalan dengan

prinsip pembagian regional ekologis, dapat menyebabkan spesiasi allopatrik

(spesiasi akibat perbedaan geografis). Penyebab isolasi geografis dapat memicu

spesiasi adalah karena adanya pemberhentian aliran gen sehingga jarak genetik

subpopulasi ke populasi asalnya semakin jauh. Spesiasi juga mengakibatkan

42

ketika dua populasi yang terpecah dalam waktu lama tidak lagi dapat kawin

secara alami ketika bertemu. Mekanisme yang sama juga dapat menyebabkan

meningkatnya endemisme suatu wilayah.

43

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Kesimpulan dari penelitian keragaman genetik ikan gabus (Channa striata)

di Daerah Aliran Sungai (DAS) Bengawan Solo, Kabupaten Lamongan, Jawa

Timur adalah sebagai berikut. Populasi C. striata Lamongan (CSL) memiliki 3

grup Haplotipe dengan keragaman haplotipe mencapai 0,644 (tinggi) dan

keragaman nukleotida 0,00296 (rendah). Keragaman haplotipe sendiri memiliki

standart deviasi dan dalam hal ini senilai 0,152 sedang untuk keragaman

nukleotida senilai 0,00064. Nilai keragaman tersebut masuk kategori kedua yang

mengindikasikan kemungkinan populasi CSL sebelumnya telah melngalami

penurunan kualitas populasi dan saat ini sedang dalam proses perkembangan

atau ekspansi.

5.2 Saran

Saran dari penelitian ini berdasarkan proses serta hasil penulis adalah

sebagai berikut:

1. Populasi C. striata di daerah Sungelebak, Kabupaten Lamongan memiliki

keragaman genetik yang mendekati rendah. Penelitian lebih lanjut perlu

dilakukan untuk memastikan status asli keragaman tersebut dengan

metode yang mungkin lebih efektif dari metode dalam penelitian ini. Hasil

analisa keragaman tersebut menjadikan populasi ini lebih baik disilangkan

dengan populasi lain dalam upaya domestikasinya untuk meningkatkan

keragaman genetik guna mencari kombinasi sifat unggul dari komoditas

C. striata. Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan mengguakan region DNA

yang berbeda seperti menggunakan 16S rRNA pada mtDNA dan lain-lain.

44

2. Kajian genetika dengan sampel yang lebih banyak untuk membandingkan

diferensiasi C. striata dengan C. gachua/ C. limbata akan sangat berguna

untuk membedakan kedua spesies tersebut secara genetik terlebih jika

dilengkapi dengan analisa lain seperti morfologi dan morfometrik setiap

sampelnya untuk dikembangkan dalam kepentingan identifikasi dengan

standart baik.

3. Perlu adanya penelitian genetika terhadap populasi yang ada di Indonesia

baik spesies dalam penelitian ini maupun lainnya terutama pada ikan-ikan

endemik. Kajian terhadap ikan-ikan indigenous sendiri juga diperlukan

karena tidak menutup kemungkinan adanya spesiasi-spesiasi antara

spesies teridentifikasi hari ini.

4. Penelitian terhadap ikan C. striata pada seluruh kawasan Paparan Sunda

maupun daerah introduksi juga penting baik secara genetik atau secara

biologi molekuler secara umum sebagai dasar percepatan upaya

domestikasi.

5. Kegiatan-kegiatan evaluasi biodiversitas di Indonesia baik dari ekologi

hingga keragaman genetika suatu sub-populasi diharapkan dapat

diperbanyak dan percepat terlebih jika dapat menjadi pertimbangan

pembangunan baik dalam akuakultur maupun di luar akuakultur.

45

DAFTAR PUSTAKA

Aidah, S. (2020). Ensiklopedi Sukses Beternak Ikan Gabus. Yogyakarta: KBM Indonesia.

Alviodinasyari, R., Pribadi, E. S., & Soejoedono, R. D. (2019). Kadar protein terlarut dalam albumin ikan gabus (Channa striata dan Channa micropeltes) asal Bogor. Jurnal Veteriner, 20(3), 436-444.

Amos, W., & Harwood, J. (1998). Factors affecting levels of genetic diversity in natural populations. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences, 353(1366), 177-186.

Amrin, A. (2016). Data mining dengan regresi linier berganda untuk peramalan tingkat inflasi. Jurnal Techno Nusa Mandiri, 13(1), 74-79.

Aqmal-naser, Mohamad dan Ahmad, A. (2021). Preliminary checklist of freshwater fishes of Ulu Paip Eco-Park Forest, Kedah, Peninsular Malaysia. Malaysian Applied Biology Journal, 50(1).

Arifin, Otong Zenal; Kurniasih, Titin. (2016). Variasi genetik tiga populasi ikan nila (Oreochromis niloticus) berdasarkan polimorfisme mt-DNA. Jurnal Riset Akuakultur 2(1): 67-75.

Arisuryanti, T., Firdaus, N. U. N., & Hakim, L. (2020). Genetic characterization of striped snakehead (Channa striata Bloch, 1793) from Arut River, Central Kalimantan inferred from COI mitochondrial gene. AIP Conference Proceedings, 2260 (1).

Astirin, O. P., & Setyawan, A. D. (2000). Plankton biodiversity at Jabung Swamp, Lamongan and Tuban Districts. Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 1(2).

Avarre, J. C., Pouyaud, L., Kadarusman, K., Carman, O., & Junior, M. Z. (2018). Portrait of hatchery management profile on rainbow fish Melanotaenia boesemani (Allen & Cross, 1980) cultivation in Jakarta Area. Torani Journal of Fisheries and Marine Science, 81-92.

Blazej, R. G., Kumaresan, P., & Mathies, R. A. (2006). Microfabricated bioprocessor for integrated nanoliter-scale Sanger DNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(19), 7240-7245.

Bucklin, A., Frost, B., Bradford-Grieve, J., Allen, L., & Copley, N. (2003). Molecular systematic and phylogenetic assessment of 34 calanoid copepod species of the Calanidae and Clausocalanidae. Marine Biology, 142(2), 333-343.

Chua, K. W., Tan, H. H., & Yeo, D. C. (2019). Loss of endemic fish species drives impacts on functional richness, redundancy and vulnerability in freshwater ecoregions of Sundaland. Biological Conservation, 234, 72-81.

Conte-Grand, C., Britz, R., Dahanukar, N., Raghavan, R., Pethiyagoda, R., Tan, H. H., ... & Rüber, L. (2017). Barcoding snakeheads (Teleostei, Channidae) revisited: Discovering greater species diversity and resolving perpetuated taxonomic confusions. PLoS One, 12(9), e0184017.

Djumanto, Setyobudi, E., Simanjuntak, C. P., & Rahardjo, M. F. (2020).

46

Estimating the spawning and growth of striped snakehead Channa striata Bloch, 1793 in Lake Rawa Pening Indonesia. Scientific Reports, 10(1), 1-

11.

Doublet, V. (2010). Structure et Evolution du Génome Mitochondrial des Oniscidea (Crustacea, Isopoda). Doctoral dissertation, Université de Poitiers.

Fatmawati, D. A., & Muzzazinah, M. (2019). Persebaran Varanus salvator berkaitan dengan isolasi geografinya. Prosiding SNPS (Seminar Nasional Pendidikan Sains) (pp. 24-29).

Fuadi, M., Santoso, H., & Syauqi, A. (2017). Uji kandungan albumin ikan gabus (Channa striata) dalam perbedaan lingkungan air. Biosaintropis (Bioscience-Tropic), 3(1), 23-30.

Goodall-Copestake, W. P., G.A. Tarling and E. J. Murphy. (2012). On the comparison of population-level estimates of haplotype and nucleotide diversity: a case study using the gene cox1 in animals. Heredity.109: 50–56.

Grant, W. A. S., & Bowen, B. W. (1998). Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes: insights from sardines and anchovies and lessons for conservation. Journal of heredity, 89(5), 415-426.

Hamdi, A. S., & Bahruddin, E. (2015). Metode penelitian kuantitatif aplikasi dalam pendidikan. Deepublish.

Hamurdana, F. G. (2020). Analisis keragaman genetik ikan gabus (Channa gachua) berdasarkan DNA mitokondria region Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada daerah aliran Sungai Brantas Kecamatan Pacet dan Kecamatan Ngoro, Kabupaten Mojokerto. Universitas Brawijaya.

Harahap, M. R. (2018). Elektroforesis: Analisis elektronika terhadap biokimia genetika. CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, 2(1).

Harto, B. (2015). Analisis tingkat kepuasan pelanggan dengan pendekatan fuzzy servqual dalam upaya peningkatan kualitas pelayanan (studi kasus di bengkel resmi bajaj padang). Jurnal TeknoIf, 3(1).

Haryanto, H. (2019). Budidaya Ikan Gabus dan Keampuhannya. Yogyakarta: Laksana.

Herdiana, L., Kamal, M. M., Butet, N. A., & Affandi, R. (2017). Keragaman morfometrik dan genetik Gen COI belut sawah (Monopterus albus) asal empat populasi di Jawa Barat. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia, 22(3), 180-190.

Hutchison, D. W., & Templeton, A. R. (1999). Correlation of pairwise genetic and geographic distance measures: inferring the relative influences of gene flow and drift on the distribution of genetic variability. Evolution, 53(6), 1898-1914.

Ilmi, W., & Arisuryanti, T. (2018). Composition of mitochondrial DNA 16S nucleotide of dwarf snakehead (Channa gachua Hamilton, 1822) from Keji River, Magelang, Central Java. Journal of Tropical Biodiversity and Biotechnology, 3(2), 57-61.

Irmawati. 2016. Genetika Populasi Ikan. Penerbit Andi. Yogyakarta. 224 hlm.

47

Kantun, W. dan A. Mallawa. (2016). Biologi Tuna Madidihang (Thunnus albacares). Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. 226 hlm.

Kholil, K. N. A. (2019). Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa gachua) Berdasarkan DNA Mitokondria Region Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Perairan Hulu Sungai Brantas di Malang. Universitas Brawijaya.

Kombong, C. B. S., & Arisuryanti, T. (2018). The 16S and COI Mitochondrial DNA Nucleotide Composition of Stripped Snakehead (Channa striata, Bloch, 1793) from Lake Sentani, Jayapura, Papua. Jurnal Perikanan Universitas Gadjah Mada, 20(2), 57-62.

Kusmini, I. I., R. Gustiano, V. A. Prakoso, dan M. H. F. Ath-thar. (2016). Budidaya Ikan Gabus. Bogor: Penebar Swadaya.

Lutfitasari, M. A. (2020). Analisis Keragaman Genetik Ikan Gabus (Channa gachua) Berdasarkan DNA Mitokondria Region Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) di Sungai Brantas, Kecamatan Ngadiluwih, Kecamatan Mojo dan Kecamatan Kraas, Kabupaten Kediri. Universitas Brawijaya.

Marwayana, O. N. (2015). Ekstraksi asam Deoksiribonukleat (DNA) dari sampel jaringan otot. Jurnal oseana, 11(2), 1-9.

Muthiadin, C., Aziz, I. R., & Darojat, A. Z. (2018). DNA mitokondria untuk identifikasi ikan yang kaya spesies. Prosiding Seminar Nasional Biologi (Vol. 4, No. 1).

Nugroho, E. D., & Rahayu, D. A. (2018). Pengantar Bioteknologi:(Teori dan Aplikasi). Jakarta: Deepublish. 429 hlm.

Nuryanto, A., & Solihin, D. D. (2006). Variasi sekuens gen mitokondrial sitokrom C oksidase I dari siput lola (Trochus niloticus). Majalah Ilmiah Biologi BIOSFERA: A Scientific Journal, 23(1), 31-37.

Pearson, W. R. (2014). BLAST and FASTA similarity searching for multiple sequence alignment. Multiple sequence alignment methods (pp. 75-101). Humana Press, Totowa, NJ.

Pertiwi, N. P. D., & Watiniasih, N. L. (2013). Optimasi amplifikasi DNA menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) pada ikan karang anggota famili pseudochromidae (dottyback) untuk identifikasi spesies secara molekular. Jurnal Biologi Udayana, 19(2).

Prianto, E., Puspasari, R., Kartamihardja, E. S., Zulfia, N., Rachmawati, P., & Oktaviani, D. (2015). Kajian kebijakan konservasi sumber daya ikan di Paparan Sunda. Prosiding Nasional Ikan ke, 8, 29-40.

Rahayu, G. K., Solihin, D. D., & Butet, N. A. (2021). Population diversity of striped snakehead, Channa striata (Bloch, 1793) from Bekasi, West Java and Barito Kuala, South Kalimantan using Cytochrome B gene. Jurnal Iktiologi Indonesia, 21(1), 61-73.

Requieron, E. A., Torres, M. A. J., & Demayo, C. G. (2012). Applications of relative warp analysis in describing of scale shape morphology between sexes of the snakehead fish Channa striata. International Journal of Biological, Ecological and Environmental Sciences, 1(6), 205-209.

Sasmito, D. E. K., Kurniawan, R., & Muhimmah, I. (2014). Karakteristik primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk sekuensing DNA: mini

48

review. Seminar Nasional Informatika Medis (SNIMed) (No. 5, pp. 93-102).

Syafei, L. S., & Sudinno, D. (2018). Ikan asing invasif, tantangan keberlanjutan biodiversitas perairan. Jurnal Penyuluhan Perikanan dan Kelautan, 12(3), 149-165.

Tasma, I. M. 2015. Pemanfaatan teknologi sekuensing genom untuk mempercepat program pemuliaan tanaman. J. Litbang. 34 (4): 159-168.

Tindi, M., Mamangkey, N. G. F., & Wullur, S. (2017). DNA barcode dan analisis filogenetik molekuler beberapa jenis bivalvia asal perairan Sulawesi Utara berdasarkan gen COI. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis, 5(2), 32-38.

Triyani, Y., Nafsi, N., Yuniarti, L., Sekarwana, N., Sutedja, E., Gurnida, D. A., ... & Alisjahbana, B. (2018). Rancangan primer spesifik gen Macrophage Mannose Receptor (MMR) untuk Polymerase Chain Reaction (PCR) dan sekuensing Deoxyribo Nucleic Acid (DNA). Indonesian Journal of Clinical Pathology and Medical Laboratory, 22(2), 158-162.

Utomo, A. D., Adjie, S., Muflikah, N., & Wibowo, A. (2017). Distribusi jenis ikan dan kualitas perairan di Bengawan Solo. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia, 12(2), 89-103.

Utomo, A. H. P., Pramono, T. B., Soedibya, H. T., Sukardi, P., & Syakuri, H. (2021). Analisis Polimorfisme DNA Ikan Gabus (Channa striata) Berbeda Ukuran Menggunakan Teknik RAPD. Sainteks, 17(2), 133-143.

Wibowo, A. (2016). Keragaman Genetik Ikan Semah (Tor tambroides Bleker 1854) di Sungai Manna, Bengkulu dan Sungai Semanka, Lampung. BAWAL Widya Riset Perikanan Tangkap, 4(2), 105-112.

Yusron, E. (2005). Pemanfaatan keragaman genetik dalam pengelolaan sumberdaya hayati laut. Oseana, 30(2), 29-34.

49

GLOSARIUM

A

Adenin : Jenis basa nukleotida dari golongan purin

Albumin : Protein utama dalam darah untuk proses osmosis

Allopatrik : Spesiasi karena perbedaan geografis

Amplifikasi DNA : Penggandaan untai DNA dengan metode PCR

B

Bottleneck effect : Terjadinya pengurangan ukuran populasi disebabkan

presentase kematian ataupun ketidak mampuan

reproduksi pada anggota suatu populasi

C

Channidae : Keluarga ikan gabus (snakehead) dalam taksonomi

Citosin/ Sitosin : Jenis basa nukleotida dari golongan pirimidin

Cytochrome

Oxidase

: Situs pengkode protein khusus pada mtDNA

D

Daerah Aliran

Sungai

: Garis bayang yang memisahkan suatu aliran dengan

aliran lainnya

Delesi : Hilangnya bagian DNA karena tidak terduplikasi atau

hilang ketika replikasi berlangsung

Diferensiasi

Genetik

: Nilai perbedaan genetik antara populasi satu dengan

lainnya

DNA Mitokondria : Materi genetik DNA pada mitokondria

E

Ekologi : Interaksi mahluk hidup dengan mahluk hidp lain maupun

dengan lingkungannya

Ekstraksi DNA : Proses pemisahan DNA dari unsur lain dalam jaringan

Elektroforesis : Analisis kimiawi berdasar pergerakan sel dalam medan

listrik dikarenakan muatan sel tersebut

Evolusi : Perubahan mahluk hidup secara alami yang terjadi

dalam waktu lama

F

Founder effect : Kejadian terbentuknya populasi baru dengan ukuran

keragaman populasi kecil

50

G

Guanin : Jenis basa nukleotida dari golonga purin

H

Haplotipe : Rangkaian polimorfisme pada individu

I

Ikhtiogeografis : Ilmu tentang penyebaran geografis ikan, termasuk

sejarah dan latar belakang penyebaran

Indeks

Keragaman

: Evaluasi keragaman genetik pada suatu populasi

Insersi : Penyisipan basa nukleotida pada gen

Inkubasi DNA : Manipulasi lingkungan untuk mengeluarkan DNA dari

jaringan (proses lisis pada isolasi DNA)

Intron : Urutan nukleotida dalam gen yang tidak terpakai (non-

coding region)

J

Jarak Evolusi : Evaluasi perbedaan genetik dengan kriteria least

square, minimum evolution, neighbor joining, dan

distance measure.

L

Laju Mutasi/

Evolusi

: Banyaknya peluang kejadian mutasi spesifik yang terjadi

dalam satu satuan waktu tertentu

M

Mitokondria : Organel penghasil energi pada sebagian besar mahluk

hidup eukariotik

Mutasi : Perubahan struktur materi genetik yang dapat

diwariskan secara genetis

N

Nukleotida : Materi genetik yang memiliki struktur punggung berupa

gugus fosfat

P

Populasi : Kumpulan individu sejenis pada tempat yang sama dan

51

dapat kawin antara satu sama lain

R

Regional

Ekologis

: Pembagian suatu wilayah berdasarkan sejarah geografi

maupun ekologinya

S

Sekuens :

Sifat Lestari : Kecil kemungkinan terjadi mutasi baik delesi maupun

insersi

Spesiasi : Proses terjadinya pemecahan suatu spesies menjadi

spesies berbeda berdasar taksonomi

T

Taksonomi : Ilmu yang mempelajari terkait penggolongan atau

sistematika mahluk hidup

Timin : Jenis basa nukleotida dari golongan pirimidin

52

LAMPIRAN

Lampiran 1. Fungsi Alat dan Bahan

No Nama Alat Fungsi

1. Spindown Untuk menghomogenkan larutan 2. Section Set Untuk membantu mempermudah preparasi

sampel 3. Gelas Ukur Untuk mengukur volume TAE buffer 4. Cool Box Untuk wadah sampel di lemari pendingin/ freezer 5. Mikropipet Untuk mengambil larutan dengan skala yang

telah ditentukan 6. Bunsen Untuk membantu dalam fiksasi alat 7. Freezer Untuk menyimpan reagen dan sampel dalam

kondisi suhu rendah 8. Vortex Untuk menghomogenkan reagen dengan sampel 9. Thermal Cycler Untuk pengujian virus pada tahap amplifikasi/

PCR 10. Cetakan Gel Untuk mencetak agar/ gel agarose 11. Electroforesis

Machine Untuk alat pemisahan molekul

12. Power Supplay Untuk sumber medan listrik pada proses elektroforesis dan PCR

13. UV Transilluminator Untuk membatu pembacaan hasil elektroforesis 14. Rak Tube Untuk tempat meletakkan tube 15. Electrical Balance Untuk menimbang bahan dalam bentuk bubuk 16 Centrifuge Untuk alat memisahkan residu dan supernatant

pada sampel yang diuji 17. Erlenmeyer Untuk wadah pembuatan gel agarose/agar 18. Microwave Untuk memanaskan/ menghomogenkan bubuk

gel agarose/ agar

19. Incubator Untuk alat inkubasi sampel 20. Laptop Untuk membantu proses analisa hasil

No Nama Bahan Fungsi

1. TNESU8 Buffer Sebagai pelisis kandungan pada sampel 2. Micro Tube (1.5 ml

dan 0.2 ml) Sebagai tempat reagen dan sampel yang akan diuji

3. NaCL 5M Sebagai bahan pembantu osmolaritas sel 4. PCR Tube Sebagai wadah sampel PCR 5. Akuades Steril Sebagai pelarut 6. Mikro Tip Sebagai bahan pembantu mikropipet mengambil

larutan 7. Proteinase-K Sebagai pendegradasi protein dalam sel 8. Phenol:Cloroform

(1:1) Sebagai pengendap protein lain yang tidak diinginkan

9. Cloroform:Isoamyl Sebagai pengikat makro molekul selain DNA

53

Alchohol (1:1) 10. Ethanol 70 % Sebagai larutan peluruh dan presipitasi 11. Ethanol 96-99 % Sebagai larutan peluruh dan presipitasi 12. Agarose Sebagai media cetakan dalam proses

elektroforesis 13. TE Buffer Sebagai larutan penyangga pH DNA 14. TAE 1x Sebagai pelarut agarose dan larutan dalam

elektroforesis 15. GoTaq PCR Mix Sebagai larutan yang digunakan dalam

amplifikasi 16 Primer Fish F1R1

dan F2R2 Sebagai pembaca situs target untuk diamplifikasi

17. ddH2O Sebagai pelarut pada proses PCR 18. DNA Ladder (1kb) Sebagai marker DNA 19. Template DNA Uji Sebagai template objek yang akan diamplifikasi 20. 21.

Loading Dye Ethidium Bromide (EtBr)

Sebagai pewarna dan pemberat pada amplikon Sebagai penanda yang dapat berpendar ketika terpapar UV

54

Lampiran 2. Diagram Alur Kegiatan

Sampling pada daerah yang dituju dan

memastikan (identifikasi) sampel didapat

sesuai target atau bukan.

Dokumentasi sampel yang didapat dengan

jelas sehingga dapat diidentifikasi melalui

foto oleh orang lain di kemudian waktu.

Preparasi sampel yang didapat dengan

mengambil sedikit bagian tubuh sampel

untuk kemudian diproses lebih lanjut.

Ekstraksi sampel yang didapat dengan

beberapa tahapan yang telah dijelaskan

dalam laporan ini sebelumnya.

Amplifikasi DNA yang didapat dengan

beberapa tahapan yang telah dijelaskan

dalam laporan ini sebelumnya.

Uji Kualitatif (Elektroforesis) hasil

amplifikasi yang didapat dengan beberapa

tahapan yang telah dijelaskan dalam

laporan ini sebelumnya.

Sekuensing hasil amplifikasi yang didapat

dengan mengirimkan amplikon ke PT

Genetika Science.

Analisis Data hasil sekuensing dengan

bantuan beberapa aplikasi untuk

mendapatkan index keragaman dan

diferensiasi genetik.

Interpretasi hasil analisis data oleh

mahasiswa bersangkutan.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

55

Lampiran 3. Dokumentasi Spesimen yang Digunakan

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 01

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 02

56

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 03

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 04

57

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 05

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 06

58

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 07

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 08

59

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 09

-Channa striata Lamongan (CSL) nomor 10

60

Lampiran 4. Data Set yang Digunakan

>CSL_01

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGAAATTGACTTGTTCCTCTTATG

ATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGAT

TGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCCGG

GGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCCCA

CGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGTGT

GTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAAAC

CCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCCTATTTGTATGGGCTATTTTAATT

ACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACAA

TGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTGG

AGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_02

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT

GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG

ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC

GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC

CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT

GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA

ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA

TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA

ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG

GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_03

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT

GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG

ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC

GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC

CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT

GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA

ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA

61

TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA

ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG

GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_04

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT

GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG

ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC

GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC

CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT

GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA

ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA

TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA

ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG

GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_05

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT

GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG

ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC

GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC

CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT

GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA

ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA

TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA

ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG

GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_06

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATGATTGGAGGCTTCGGAAATTGACTTGTTCCTCTTAT

GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG

ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC

GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC

CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT

GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA

ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCCTATTTGTATGGGCTATTTTAA

62

TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA

ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG

GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_07

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT

GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG

ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC

GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC

CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT

GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA

ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA

TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA

ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG

GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_08

CCCTTTATCTAGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACGA

TCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCAT

GGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGAAATTGACTTGTTCCTCTTATGA

TTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGATT

GCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCCGGG

GCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGTGTG

TCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAAACC

CCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCCTATTTGTATGGGCTATTTTAATTA

CAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACAAT

GCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTGG

AGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_09

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGAAATTGACTTGTTCCTCTTATG

ATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGAT

TGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCCGG

GGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCCCA

CGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGTGT

GTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAAAC

CCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCCTATTTGTATGGGCTATTTTAATT

63

ACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACAA

TGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTGG

AGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>CSL_10

CCCTTTATCTCGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTCA

GCCTTTTAATTCGAGCAGAACTAAGCCAACCTGGCGCTCTCCTCGGAGACG

ATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCACACGCCTTTGTAATAATCTTTTTCA

TGGTTATGCCAATAATAATTGGAGGCTTCGGGAATTGACTTGTTCCTCTTAT

GATTGGTGCCCCCGACATGGCCTTCCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTG

ATTGCTCCCCCCATCATTCCTCCTTTTACTAGCCTCTTCTGCTGTAGAAGCC

GGGGCCGGAACCGGATGAACAGTTTACCCACCCCTAGCCAGCAACTTAGCC

CACGCAGGGGCCTCCGTCGACCTAACCATTTTCTCCCTACACCTAGCTGGT

GTGTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTATTACTACTATTATTAACATAAA

ACCCCCTGCTATTTCTCAATATCAAACCCCCTTATTTGTATGGGCTATTTTAA

TTACAGCCGTACTACTTCTTCTTTCCCTCCCAGTATTAGCTGCAGGCATTACA

ATGCTACTCACAGACCGAAATCTCAACACCACCTTCTTCGACCCTGCTGGTG

GAGGGGACCCTATTCTTTATCAACACTTAT

>MLG_01

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATTTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MLG_02

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCATTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTGTTAATATAAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

64

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA

GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MLG_03

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATTTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MLG_04

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATTTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MLG_05

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATTTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

65

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>KDR_01

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>KDR_02

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>KDR_03

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

66

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>KDR_04

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTTCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTGTTAATATAAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA

GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>KDR_05

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTGTCAATATAAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA

GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>KDR_06

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTGTCAATATAAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

67

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA

GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MJT_01

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MJT_02

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MJT_03

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

68

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MJT_04

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MJT_05

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MJT_06

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

69

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>MJT_07

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTTGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATAAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGAG

GAGATCCAATTCTTTACCAACATTTATTC

>JWT_01

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCACGAATGAATAATATAAGTTTTTGACT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGTGTCT

CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGAG

GAGACCCAGTTCTTTACCAGCATTTA

>JWT_02

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCACGAATGAATAATATAAGTTTTTGACT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGTGTCT

CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC

70

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGAG

GAGACCCAGTTCTTTACCAGCATTTA

>JWT_03

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATGAATAATATAAGTTTTTGACT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTGGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGTGTCT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGAG

GAGACCCAATTCTTTACCAGCATTTA

>JWT_04

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCAATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTCCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGCACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTTACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA

>JWT_05

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCAATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGCACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

71

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTTACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA

>JWT_06

TTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAGCCTTCTAATTCGAGCTGAGCT

TAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGACCAGATTTATAATGTGATCGTA

ACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCATAGTTATGCCAATAATAATCGG

AGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGATTGGGGCCCCTGACATAGCC

TTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCTCCTCCCTCCCTCTTTCCTCCT

CCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGGGCCGGCACAGGCTGAACAGT

CTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCACGCAGGAGCATCCGTGGATCT

CGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGCGCAATCA

ACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCTCCCGCCATCTCCCAATACCAG

ACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCACTGCCATTCTCCTCCTCCTCTC

TTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAATACTACTTACAGACCGAAACTTA

AACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAAC

ATTTA

>JWT_07

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCAATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGCACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTTACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA

>JWB_01

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGCGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATAAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTATTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCCCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTCT

CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATCACAACTATCATTAATATGAAACCC

CCCGCCATCTCCCAATATCAAACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCA

72

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACGAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAGCACTTA

>JWB_02

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGCGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATAAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTATTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCCCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTCT

CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATCACAACTATCATTAATATGAAACCC

CCCGCCATCTCCCAATATCAAACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACGAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAGCACTTA

>JWB_03

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGAATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGCGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATAAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTATTAGCCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCCCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTGCATCTTGCAGGTGTCT

CCTCAATTTTAGGTGCAATCAACTTTATCACAACTATCATTAATATGAAACCC

CCCGCCATCTCCCAATATCAAACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACGAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAGCACTTA

>JWB_04

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAACCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATCTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGGCTAATTCCTCTTATG

ATTGGGGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAATATAAGTTTTTGAC

TCCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGG

GGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCA

CGCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGGC

CTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACC

TCCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

73

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTGGCCGCCGGCATCACAAT

ACTATTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAGCATTTA

>JWB_05

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGGGCTCTTTTAGGCAACGA

CCAGATCTATAATGTCATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCA

TAGTTATGCCCATAATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGGCTAATTCCTCTTATG

ATTGGGGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAATATAAGTTTTTGAC

TCCTCCCTCCCTCTTTCCTTCTTCTACTAACTTCCTCCGTTGTAGAAGCTGG

GGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCC

ACGCAGGAGCATCCGTGGATCTAGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGG

TCTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAAC

CTCCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAAT

CACTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTGGCCGCCGGCATCACA

ATACTATTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGG

GAGGAGACCCAATTCTTTACCAGCATTTA

>JWB_06

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACATGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGGCTAATTCCTCTTATGA

TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATGAACAATATGAGTTTTTGACT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTTTCTTTACATCTTGCAGGTGTCT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC

TGCCATTCTCCTCCTTCTCTCTTTACCAGTCCTAGCTGCCGGCATCACGATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGAG

GAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA

>JWB_07

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGTCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTCATCGTAACAGCACATGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGGCTAATTCCTCTTATGA

TTGGAGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATGAACAATATGAGTTTTTGACT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTTTCTTTACATCTTGCAGGTGTCT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACTATTATTAATATGAAACCTC

CCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTTTGGGCCATTCTAATCAC

74

TGCCATTCTCCTCCTTCTCTCTTTACCAGTCCTAGCTGCCGGCATCACGATA

CTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCAGCTGGGGGAG

GAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA

>PBL_01

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAACATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA

GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTA

>PBL_02

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAACATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA

GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTA

>PBL_03

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAACATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

75

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA

GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTA

>PBL_04

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTTCTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTATAATGTGATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATGCCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGA

TTGGGGCCCCTGACATAGCCTTTCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

CCTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTGCTAACCTCTTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCCTAGCTAGCAACTTAGCCCAC

GCAGGAGCATCCGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACATCTTGCAGGTGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAACATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATACCAGACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGCGGA

GGAGATCCAATTCTTTACCAACATTTA

>PBL_05

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTACAATGTCATCGTGACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATACCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTCATTCCTCTTATGA

TTGGAGCCCCTGACATAGCCTTCCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

ACTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTGACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCTGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTCTGAGCCATTTTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA

>PBL_06

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTACAATGTCATCGTGACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATACCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTCATTCCTCTTATGA

TTGGAGCCCCTGACATAGCCTTCCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

ACTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCTGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTCTGAGCCATTTTAATCA

76

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA

>PBL_07

CCTTTATCTTGTATTTGGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAG

CCTACTAATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGAC

CAGATTTACAATGTCATCGTGACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCAT

AGTTATACCCATAATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTCATTCCTCTTATGA

TTGGAGCCCCTGACATAGCCTTCCCCCGAATGAATAATATGAGTTTTTGGCT

ACTCCCTCCCTCTTTCCTCCTTCTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGG

GCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCGCCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCAC

GCAGGAGCATCTGTGGATCTCGCCATCTTCTCTTTACACCTTGCAGGGGTTT

CCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATCACAACTATTATTAATATGAAACCT

CCCGCCATCTCCCAATATCAGACACCTCTATTCGTCTGAGCCATTTTAATCA

CTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTACCAGTCCTAGCCGCCGGCATCACAAT

ACTACTAACAGACCGAAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGGGGA

GGAGACCCAATTCTTTACCAACATTTA

>SMT_01

CAGCCCTGAGCCTACTTATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCCGGCGCTCTTT

TAGGCAACGACCAGATTTATAATGTAATCGTAACAGCCCACGCCTTCGTAAT

GATCTTTTTCATAGTCATGCCCATAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAA

TTCCTCTTATGATCGGTGCCCCTGACATAGCCTTTCCTCGCATAAATAACAT

GAGTTTTTGGCTCCTTCCTCCTTCTTTTCTCCTTCTACTAACCTCTTCCGTTG

TAGAAGCCGGGGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGTA

ACCTGGCCCACGCAGGAGCATCCGTGGACCTTGCCATCTTCTCTTTACACC

TAGCAGGTGTCTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACAATCATT

AATATAAAACCTCCCGCCATCTCCCAATACCAAACACCTCTATTCGTTTGAG

CCATTCTAATCACTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTGCCAGTCCTAGCTGC

CGGCATCACAATACTACTAACAGACCGAAATTTAAACACAACTTTCTTTGACC

CGGCTGGGGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAACACTTATTCTGATTCTTTGG

C

>SMT_02

CAGCCCTGAGCCTACTTATTCGAGCTGAGCTTAGCCAACCCGGCGCTCTTT

TAGGCAACGACCAGATTTATAATGTAATCGTAACAGCCCACGCCTTCGTAAT

GATCTTTTTCATAGTCATGCCCATAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAA

TTCCTCTTATGATCGGTGCCCCTGACATAGCCTTTCCTCGCATAAATAACAT

GAGTTTTTGGCTCCTTCCTCCTTCTTTTCTCCTTCTACTAACCTCTTCCGTTTT

AGAAGCCGGGGCCGGGACAGGCTGAACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGTA

ACCTGGCCCACGCAGGAGCATCCGTGGACCTTGCCATCTTCTCTTTACACC

TAGCAGGTGTCTCCTCAATTTTAGGCGCAATCAACTTTATTACAACAATCATT

AATATAAAACCTCCCGCCATCTCCCAATACCAAACACCTCTATTCGTTTGAG

CCATTCTAATCACTGCCATTCTCCTCCTCCTCTCTTTGCCAGTCCTAGCTGC

77

CGGCATCACAATACTACTAACAGACCGAAATTTAAACACAACTTTCTTTGACC

CGGCTGGGGGAGGAGACCCAATTCTTTACCAACACTTATTCTGATTCTTTGG

C

>SMT_03

GGTGCTTGGGCCGGGATAGTGGGCACAGCCCTAAGCCTACTGATTCGAGC

TGAGCTTAGCCAACCTGGTGCTCTTTTAGGCAACGACCAGATTTATAATGTC

ATCGTAACAGCACACGCCTTCGTAATGATCTTTTTCATAGTTATGCCCATAAT

AATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTTATGATTGGTGCCCCTGAC

ATAGCCTTTCCCCGAATAAATAATATGAGTTTTTGGCTCCTCCCTCCCTCTTT

CCTCCTTTTACTAACCTCCTCCGTTGTAGAAGCTGGGGCCGGAACAGGCTG

AACAGTCTACCCACCCTTAGCTAGCAACCTAGCCCACGCAGGAGCATCCGT

GGATCTCGCCATCTTTTCTTTGCATCTTGCAGGTGTCTCCTCAATTTTAGGC

GCAATCAACTTTATCACAACTATCATTAATATAAAACCTCCCGCCATCTCCCA

GTATCAAACACCTCTATTCGTTTGAGCCATTCTAATCACTGCCATTCTCCTCC

TCCTCTCTTTGCCAGTCCTAGCCGCTGGCATCACAATACTACTAACAGACCG

AAACTTAAACACAACTTTCTTTGACCCGGCTGGTGGAGGAGACCCAATTCTT

TACCAACATTTATTC

78

Lampiran 5. Detail Sampel sebagai Data Primer dan Sekunder

A. Detail Lokasi

No. Teridentifikasi Sebagai/

Tag Lokasi Pengambilan

Jumlah Ind/

Total

1.1 Channa striata/ CSL_01-10

DAS Bengawan Solo, Sungelebak, Kec. Karanggeneng, Kab. Lamongan, Jawa Timur

10/10

2.1 Channa gachua/ MLG_01 DAS Brantas, Kedungrejo, Kec. Pakis, Kab. Malang, Jawa Timur

1/5

2.2 Channa gachua/ MLG_02 DAS Brantas, Torongrejo, Kec. Junrejo, Batu, Jawa Timur

1/5

2.3 Channa gachua/ MLG_03 DAS Brantas, Semanding, Kec. Dau, Kab. Malang, Jawa Timur

1/5

2.4 Channa gachua/ MLG_04 DAS Brantas, Punten, Kec. Bumiaji, Batu, Jawa Timur

1/5

2.5 Channa gachua/ MLG_05 DAS Brantas, Cinde, Kec. Bumiaji, Batu, Jawa Timur

1/5

3.1 Channa gachua/ KDR_01-

03 DAS Brantas, Ngadiluwih, Kediri 3/6

3.2 Channa gachua/ KDR_04 DAS Brantas, Mojo, Kediri 1/6

3.3 Channa gachua/ KDR_05-06

DAS Brantas, Kras, Kediri 2/6

4.1 Channa gachua/ MJT_01-03

DAS Brantas, Kec. Ngoro, Mojokerto, Jawa Timur

3/7

4.2 Channa gachua/ MJT_04-07

DAS Brantas, Kec. Pacet, Mojokerto, Jawa Timur

4/7

5.1 Channa gachua/ JWT_01-03

Kali Longkrang, Kab. Tegal, Jawa Tengah

3/7

5.2 Channa gachua/ JWT_04-07

Sungai Samin, Kab. Karang Anyar, Jawa Tengah

4/7

6.1 Channa gachua/ JWB_01 Sungai Ci Baruay, Kab. Tasikmalaya, Jawa Barat

1/7

6.2 Channa gachua/ JWB_02-03

Sungai Ci Galugur, Kab. Tasikmalaya, Jawa Barat

2/7

6.3 Channa gachua/ JWB_04 Sungai Ci Asem, Kab. Purwakarta, Jawa Barat

1/7

6.4 Channa gachua/ JWB_05 Sungai Ci Nantke, Kab. Purwakarta, Jawa Barat

1/7

6.5 Channa gachua/ JWB_06 Sungai Cisiih, Kab. Pandeglang, Banten

1/7

6.6 Channa gachua/ JWB_07 Sungai Cijalarang, Kab. Pandeglang, Banten

1/7

7.1 Channa gachua/ PBL_01-04

Sungai Tukad Mawa, Kab. Tabanan, Bali

4/7

7.2 Channa gachua/ PBL_05-07

Sungai Bendung Bekel, Kab. Jembrana, Bali

3/7

8.1 Channa gachua/ SMT_01-02

Danau Laut Tawar, Kab. Aceh Utara, Aceh

2/3

8.2 Channa limbata/ SMT_03 Pulau Lingga, Kab. Lingga, 1/3

79

Kepulauan Riau

B. Detail Sumber Data

Tag Sumber Jumlah Specimen Code

Assesion Number

Kutipan Publikasi

CSL_01-10

Data Pribadi 10 - - -

MLG_01-05

Publikasi Skripsi

5 - - Kholil, 2019

KDR_01-06

Publikasi Skripsi

6 - - Lutfitasari, 2020

MJT_01-07

Publikasi Skripsi

7 - - Hamurdana, 2020

JWT_01-03

GenBank 3 BIF0893 BIF0891 BIF0888

MG699751.1 MG699750.1 MG699749.1

-

JWT_04-07

GenBank 4 BIF1837 BIF1835 BIF1841 BIF1836

MG699782.1 MG699781.1 MG699774.1 MG699773.1

-

JWB_01 GenBank 1 BIF0629 MG699748.1 -

JWB_02-03

GenBank 2 BIF0594 BIF0595

MG699745.1 MG699737.1

-

JWB_04 GenBank 1 BIF0500 MG699747.1 -

JWB_05 GenBank 1 BIF0448 MG699742.1 -

JWB_06 GenBank 1 BIF1525 KU692412.1 -

JWB_07 GenBank 1 BIF1545 KT960758.1 -

PBL_01-04

GenBank 4 BIF2956 BIF2955 BIF2958 BIF2957

MG699784.1 MG699779.1 MG699765.1 MG699763.1

-

PBL_05-07

GenBank 3 BIF2509 BIF2508 BIF2510

MG699689.1 MG699766.1 MG699760.1

-

SMT_01-02

GenBank 2 L1 L7

HM345938.1 HM345939.1

-

SMT_03 GenBank 1 IL15-0265

LC190132.1 -

80

Lampiran 6. Prosedur Pengolahan Data Analisa Keragaman Genetik

A. Chromas v.2.6.6

Buka aplikasi lalu pilih menu „File‟, kemudian pilih „Open‟ atau dapat

menggunakan shortcut keyboard „Ctrl + O‟.

Pilih file dengan format „.ab1‟ atau „chromatogram‟ yang akan diolah.

Hapus noise (bagian bertumpuk) pada data di bagian depan supaya tidak

mengganggu data yang akan diolah. Jumlah basa yang dihapus diusahakan

tidak melebihi 20 bp karena ditakutkan mengenai coding region dari data

tersebut. Klik pada bagian akhir sekitar basa nukleotida yang ingin

dihapuskan lalu klik menu „Edit‟ kemudian pilih „Delete Upstream‟ atau dapat

menggunakan shortcut keyboard „Ctrl + Shift + L‟.

81

Hapus pembatas sesuai dengan komplementer primer yang digunakan

dengan memasukkan 6 urutan basa tersebut pada kolom pencarian setelah

menampilkannya dengan shortcut keyboard „Ctrl + F‟. Klik tombol „Next‟

hingga paling akhir dengan ciri berhenti pada urutan basa sekitar 650 bp.

Klik menu „Edit‟ kemudian pilih „Delete Downstream‟ atau dapat

menggunakan shortcut keyboard „Ctrl + Shift + R‟.

Setelah editing selesai, klik menu „File‟ dan klik „Save As‟ dengan format file

„.fa‟ atau „FA File‟. Kemudian keluar atau lanjutkan pada file berikutnya

dengan mengulangi prosedur aplikasi ini dari awal.

B. UGENE v.1.31.1

Buka aplikasi lalu pilih menu „File‟, kemudian pilih „Open‟ atau dapat

menggunakan shortcut keyboard „Ctrl + O‟.

Pilih file dengan format „.ab1‟ hasil aplikasi Chromas sebelumnya, baik file

forward maupun reverse-nya yang akan diolah sekaligus.

82

Klik menu „Tools‟, lanjutkan ke „Sanger Data Analysis‟ kemudian pilih „Read

De Novo Assembly (with CAP3)‟.

Pada jendela „Contig Assembly with CAP3‟, klik „add‟ dan pilih dua file yang

sama seperti sebelumnya lalu klik „run‟.

Setelah terbentuk konsensus, klik „contig... (sesuai tulisan)‟ kemudian klik

kanan dan lanjutkan pada menu „export‟ dan klik „Export Selected

Sequence(s)‟.

83

Pilih format „FASTA‟, dapat berupa „FA File‟ (.fa) untuk menyimpan.

Kemudian keluar atau lanjutkan pada file berikutnya dengan mengulangi

prosedur aplikasi ini dari awal.

C. Data Set Primer

Berkas hasil UGENE dalam format FASTA dibuka dengan Note Pad

kemudian disalin ke Microsoft Word.

Data ditata dengan kondisi tidak ada „Space‟ maupun „Enter‟ di antara basa

nukleotida dalam satu sampel sekuens. Setiap sekuens diawali dengan

nama sekuens dengan tanda „>‟ terlebih dahulu sebagaimana bisa dilihat di

gambar. Masukkan semua data Fasta dalam satu file.

D. Data Set Sekunder dari Gen Bank

Akses web NCBI dengan alamat „https://www.ncbi.nlm.nih.gov/‟ kemudian

ubah pengaturan pencarian „All Database‟ ke „Nucleotide‟.

Masukkan keyword seperti nama species, daerah dan situs DNA yang

digunakan kemudian pilih data paling sesuai.

84

Salin bentuk FASTA pada hasil tersebut dan gabungkan dengan data set

primer. Sesuaikan dengan format penulisan sebelumnya.

E. Identifikasi dengan BLAST

Dari NCBI, masuk ke menu BLAST

Pilih BLAST pada Nukleotide

Masukkan file konsensus lalu klik BLAST

85

F. MESQUITE v.3.5.1

Membuka aplikasi, buka data set berupa plain text pada menu „File‟ atau

shortcut keyboard „Ctrl + O‟. Pilih „FASTA (DNA/RNA)‟ lalu klik „OK‟.

Sekuens kemudian ditata dengan menu „move tool‟ (gambar tangan

berpanah kanan kiri paling bawah sebelah kanan). Setelah tertata atau

tersejajarkan, sekuens lebihan dapat dihapus.

86

File kemudian disimpan dalam bentuk FASTA dengan fitur „Export‟ pada

menu „File‟.

Pastikan mengaktifkan opsi „Include Gaps‟.

G. DNAsp v.6.12.01

Jalankan aplikasi lalu buka hasil dari Mesquite berupa FASTA/ NEXUS pada

menu „File‟ atau shortcut keyboard „Ctrl + O‟.

Ubah „Nucleotide Sequence Format‟ seperti berikut untuk analisa khusus

sampel serupa pada penelitian ini. Fitur dapat diakses pada menu „Data‟ lalu

dilanjutkan „Format‟.

87

Ubah „Genetic Code‟ menjadi diperuntukkan untuk „mtDNA Mammals‟ lalu

buat grup pada „Define Sequnce Set‟. Klik „Update All Entries‟ jika grouping

telah selesai.

Hasil dapat dilihat pada menu „Overview‟ dilanjutkan ke „Polymorphism Data‟

lalu simpan hasil tiap grup pada menu „File‟ dilanjutkan „Save Current Data‟

dengan format file berupa „Arlequin (.arq)‟.

88

H. Arlequin v.3.5.2

Jalankan aplikasi kemudian klik menu „Open Project‟ dan pilih hasil aplikasi

sebelumnya dalam format „Arlequin (.arq)‟.

89

Edit angka pada „Genetic Structure‟ dengan angka sesuai nomor grup (bisa

mulai langsung dari satu hingga sekian).

Pada menu setting, ubah „Population Comparisons‟ sesuai gambar dibawah

dan begitu pula dengan „Molecular Diversity indices‟ selama menggunakan

model penelitian serupa penelitian ini. Jika sudah maka dapat diklik „Start‟

dan ditunggu hasilnya pada dokumen tempat hasil aplikasi sebelumnya.

90

Hasil dapat dilihat dengan membuka file dalam format „.XML‟ menggunakan

fitur Note Pad pada komputer. Gunakan shortcut keyboard „Ctrl+F‟ untuk

mencari data Fst pada hasil tersebut.

91

Lampiran 7. Hasil BLAST Sampel Kabupaten Lamongan

- Channa striata Lamongan nomor 1 (CSL_01)

- Channa striata Lamongan nomor 2 (CSL_02)

- Channa striata Lamongan nomor 3 (CSL_03)

92

- Channa striata Lamongan nomor 4 (CSL_04)

- Channa striata Lamongan nomor 5 (CSL_05)

- Channa striata Lamongan nomor 6 (CSL_06)

93

- Channa striata Lamongan nomor 7 (CSL_07)

- Channa striata Lamongan nomor 8 (CSL_08)

- Channa striata Lamongan nomor 9 (CSL_09)

94

- Channa striata Lamongan nomor 10 (CSL_10)

95

Lampiran 8. Dokumentasi Hasil Elektroforesis

- Hasil Elektroforesis tanggal 2 November 2020

- Hasil Elektroforesis tanggal 6 November 2020

- Hasil Elektroforesis tanggal 11 November 2020

96

- Hasil Elektroforesis tanggal 24 November 2020

97

Lampiran 9. Tabel dan Grafik Penjelasan Data Hasil

-Jumlah individu spesimen atau n dan grup haplotipe atau h yang terbentuk

Warna biru menunjukkan jumlah individu sedangkan warna kuning

menunjukkan jumlah grup haplotipe yang terbentuk. Pembacaan data grafik di

atas seperti pada populasi CSL artinya dari 10 individu kemudian terbentuk 3

grup haplotipe; Populasi MLG dari 5 individu terbentuk 2 grup haplotipe; Populasi

KDR dari 6 individu terbentuk 3 grup haplotipe dan seterusnya.

-Keragaman Haplotipe atau Hd pada Seluruh Populasi

Grafik pada sisi kanan menunjukkan nilai keragaman haplotipe, sama

seperti pada tabel sebelah kiri. Keragaman haplotipe menurut Grant and Bowen

(1998) akan dikategorikan tinggi jika lebih dari sama dengan 0,5. Berdasarkan

data yang didapat maka keragaman haplotipe rendah hanya terjadi pada

populasi MLG dan MJT, selain kedua populasi tersebut (populasi sisanya)

memiliki keragaman haplotipe tinggi.

98

-Keragaman Nukleotida atau π pada Seluruh Populasi

Grafik pada sisi kanan menunjukkan nilai keragaman nukleotida, sama

seperti pada tabel sebelah kiri. Keragaman nukleotida menurut Grant and Bowen

(1998) akan dikategorikan tinggi jika lebih dari sama dengan 0,005. Berdasarkan

data yang didapat maka keragaman nukleotida rendah terjadi pada 4 populasi di

Jawa Timur yaitu CSL, MLG, KDR dan MJT sementara populasi sisanya

dikategorikan tinggi.

-Kuadran Keragaman Genetik

Kuadran keragaman genetik ini merujuk pada pendapat Grant and Bowen

(1998) untuk mempermudah pembacaan data keragaman genetik. Kuadran

pertama diindikasikan populasi baru mengalami penurunan kualitas seperti bottle

neck effect maupun fouder effect dengan kondisi keragaman haplotipe dan

nukleotide sama-sama rendah seperti pada populasi MLG dan MJT. Kuadran

kedua mengindikasikan populasi pasca mengalami penurunan populasi mulai

berekspansi yang ditandai dengan kenaikan nilai keragaman haplotipe hingga ke

kategori tinggi seperti pada populasi CSL dan KDR. Kuadran ketiga

mengindikasikan populasi dalam proses ekspansi mulai mencapai titik stabil

99

dengan ditandai oleh keragaman nukleotida naik ke kategori tinggi walaupun

kemudian keragaman haplotipe kembali turun ke kategori rendah. Kuadran

keempat mengindikasikan suatu populasi selain telah stabil juga telah mengalami

sejarah evolusi yang panjang sehingga memiliki keragaman genetik paling baik

dengan ditandai oleh kedua parameter keragaman (keragaman haplotipe dan

nukleotida) sama-sama tinggi seperti pada populasi JWT, JWB, PBL dan SMT.

-Komposisi Timin:Adenin serta Citosin:Guanin Seluruh Populasi

Komposisi basa nukleotida menunjukkan dominasi basa tertentu atau

pasangan basa tertentu pada suatu populasi. Detail presentase basa dapat

dilihat pada Tabel 1 di laporan ini. Berdasarkan prinsip basa komplemen yaitu

Timin berpasangan dengan Adenin sedangkan Citosin berpasangan dengan

Guanin maka dominasi Timin+Adenin lebih kuat dengan 53% di setiap populasi

sedangkan Citosin+Guanin lebih lemah dengan 46% di setiap populasi. Adapun

perbedaan angka pada presentase di tiap populasi, namun perbedaan itu lebih

kecil dari 1%. Dominasi Timin+Adenin yang terjadi merupakan ciri khas umum

pada sekuens-sekuens dari region Cytochrome oxidase subunit I (COI).