PEMERIKSAAN

“Vibrio cholerae”Disusun untuk memenuhi tugas Mata Kuliah Laboratorium

Epidemiologi

Dosen pengampu : drg. Yunita Dyah Puspita Santik

Disusun Oleh :

KELOMPOK 8

1. Luluk Listiarini Riza (6411411198)

2. Ellya Ma’unah (6411411199)

3. Charisna Neilal Muna (6411411201)

4. Sundari Sukoco (6411411210)

5. Hamid Rifki Baharun (6411411257)

Rombel 01

JURUSAN ILMU KESEHATAN MASYARAKAT

FAKULTAS ILMU KEOLAHRAGAAN

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2014

Pemeriksaan Vibrio cholerae

Gambar Bakteri Vibrio Cholerae

Vibrio cholerae merupakan salah satu spesies dari

genus Vibrio yang merupakan famili Vibrionaceae. Genus

Vibrio terdiri lebih dari 30 spesiesyang biasanya

ditemukan pada lingkungan perairan. Vibrio yang

pathogen terhadap manusia adalah Vibrio cholerae,

Vibrio parahaemolyticus dan Vibrio vulnificus. Vibrio

cholerae merupakan penyebab penyakit Cholera yaitu

infeksi saluran usus yang bersifat akut dan disebabkan

oleh bakteri Vibrio cholerae. Bakteri ini masuk kedalam

tubuh host secara per oral umumnya melalui makanan atau

minuman yang tercemar. Cholera dapat menular sebagai

penyakit yang bersifat epidemik.

1. Tujuan

Prosedur ini digunakan untuk melakukan Pengujian

Vibrio cholerae pada produk perikanan dan produk makanan

yang berkaitan dengan hasil – hasil perikanan.

2. Acuan

Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-2332.4-2006

3. Media dan Reagensia :

a.Alkaline Peptone water (APW)

b.Alkaline Peptone salt (APS)

c.Decarboxylase basal medium dengan penambahan suplemen

arginine, lysine dan ornithine secara individual

d.Kliger Iron Agar ( KIA)

e.Motility Test Medium (MTM), semisolid

f.MRV-VP Broth

g.Purple Broth Base (PBB) dengan penambahan suplemen

sucrose, lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose

secara individual

h.Of medium semisolid dengan penambahan suplemen glucose,

sucrose, lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose

secara individual

i.Triple Sugar Iron (TSI) agar

j.Thiosulfate-citrat-Bile-Salt-Sucrose (TCBS) agar

k.Trypticase (tryptic) Soy Broth (TSB)

l.Trypticase (tryptic) Soy Agar (TSA)

m.Tryptone Broth and Tryptone salt Broths (T1N0, T1N1, T1N3,

T1N6, T1N8, T1N10)

n.Urea Broth

o.Pereaksi Kovacs

p.Mineral atau parafin oil steril

q.O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine) disk, 10 µg

dan 150 µg

r.ONPG disk

s.Pereaksi oksidase

t.HCL 1 N

u.Physiological saline 0,85%

v.Phospate-buffered Saline (PBS)

w.NaCl 2 % dan 3 %

x.Larutan NaOH 1 N

y.Pereaksi VP

z.Pereaksi pewarnaan gram

aa. Baku pembanding Vibrio cholerae

bb. Anti serum Poly hikojima inaba – ogawa

4. Peralatan

a. Blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau

stomacher beserta plastik steril.

b. Cawan petri ukuran 15 mm x 100 mm

c. Tabung reaksi ukuran 16 mm x 125 mm dan 13 mm x

100 mm

d. Tabung bertutup ukuran 16 mm x 150 mm

e. Timbangan analitik dengan ketelitian 0,01 g dan

0,0001 g

f. Inkubator 36 °C ± 1 °C

g. Waterbath 42 °C ± 0,2 °C

h. Autoclave 121 °C.

i. Jarum inokulasi dan jarum ose

j. Bunsen

k. pH meter

l. Peralatan sterilisasi filter

m. Oven

n. Pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

o. Mikroskop

p. Hot plate dilengkapi dengan magnetic stirer.

q. Alat pengocok (Voltex mixer )

No Nama Alat Gambar

1. Tabung reaksi

2.Rak tabung

reaksi

3. Kaca preparat

4.Pipet

5. Inkubator

6. Jarum ose

7. Mikroskop

5. Kondisi Pengujian

Selama melakukan pengujian, terapkan teknis aseptis

dan lakukan pengujian diruang atau laminar air flow yang

terkontrol. Media TCBS agar yang digunakan harus

dalam keadaan kering.

6. Pengambilan contoh

a.Ikan Jaringan daging, saluran pencernaan dan

insang.

b.Crustacea Jika memungkinkan seluruh tubuh atau

hanya bagian tengah termasuk insang dan saluran

pencernaan.

c.Kekerangan Daging kerang termasuk cairan dalam

cangkang.

7. Prosedur

7.1 Persiapan contoh

a. Produk perikanan selain kekerangan.

Timbang secara aseptis 25 g sesuai butir

7.2.2.1 dan 7.2.2.2., kemudian tambahkan 225 ml

larutan Alkaline Pepton Water, Homogenasi selama 2

menit – 3 menit. Homogenat ini merupakan larutan

dengan pengenceran 1 : 10.

b. Produk kekerangan

Timbang secara aseptis 50 g sesuai butir

7.2.2.3., kemudian tambahkan 450 ml larutan

Alkaline Pepton Water, Homogenasi selama 2 menit – 3

menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan

pengenceran 1 : 10.

7.2 Isolasi Vibrio cholerae

a.Tanpa mengocok tabung

Ambil 1 ose dari setiap tabung yang positif

(keruh) pada setiap pengenceran sedalam 1 cm

dari permukaan cairan dan goreskan kedalam TCBS

agar. Inkubasikan TCBS agar pada suhu 36 oC ± 1oC selama 18 jam – 24 jam.

b.Amati keberadaan Vibrio cholerae pada TCBS agar.

Koloni Vibrio cholerae besar, permukaan halus. Agak

datar, bagian tengah uram dan bagian pinggir

terang, berwarna kuning (sukrosa positif).

Gambar Koloni Vibrio cholerae pada media TCBS

7.3 Pemurnian

Secara hati – hati ambil 3 koloni terduga atau

lebih dari setiap TCBS agar, goreskan kedalam T1N1

agar atau TSA + 1,5 % NaCl (Total Mengandung NaCl

2 %). Inkubasikan selama 18 jam – 24 jam pada

suhu 36 oC ± 1 oC.

Gambar Media TSA slant

7.4 Uji biokimia pendahuluan

a.Uji Oksidase

Goreskan 1 ose dari T1N1 agar atau TSA + NaCl

1,5 % atau medium lain yang tidak

memfermentasikan karbohidrat kedalam cawan

petri yang berisi TSA agar. Inkubasikan pada

suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam.

Teteskan 2 – 3 tetes pereaksi oksidase pada

koloni bakteri dan amati reaksinya. Reaksi

positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna

biru tua pada koloni. Uji oksidase dapat

dilakukan dengan menggunakan kertas oksidase

dengan cara menggoreskan koloni dari T1N1 agar

atau TSA + NaCl 1,5 % keatas permukaan  kertas

oksidase menggunakan tusuk gigi (jangan

menggunakan ose yang terbuat dari nikel atau

krom). Reaksi positif ditunjukkan dengan

terbentuknya warna biru tua secara cepat.

b.Uji sensitifitas terhadap 0/129 vibriostat

Goreskan 1 ose dengan cepat dari T1N1 agar atau

TSA + NaCl 1,5 % kedalam cawan Petri yang

berisi TSA dengan rapat. Letakkan disk 0/129 10

µg dan 150 µg pada goresan yang paling rapat

dan inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18

jam – 24 jam. Amati pertumbuhan disekitar disk .

Reaksi sensitif ditunjukkan dengan terbentuknya

zona disekitar disk (S), sedangkan reaksi

resisten ditandai dengan adanya pertumbuhan

disekeliling disk (R). Vibrio cholerae sensitive

terhadap  0/129 µg dan 150 µg.

Gambar Uji sensitifitas

c.Triple Sugar Iron (TSI) Agar dan Kligger Iron Agar

(KIA)

Inokulasikan koloni dari T1N1 agar atau TSA +

NaCl 1,5 % dengan cara menggoreskan agar miring

dan menusuk agar tegak media TSI agar dan KIA.

Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam

– 24 jam. Vibrio cholerae menghasilkan asam (warna

kuning) pada agar miring, asam (warna kuning)

pada agar tegak dan tidak mengasilkan gas serta

H2S. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar

miring yang berbeda dapat dilihat pada tabel 1.

Reaksi Vibrio cholera: TSI (Asam/Asam=A/A) dan

KIA (Alkaline/Asam=K/A)

(Asam=kuning & Alkaline=merah)

Tabel 1. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media

agar yang berbeda

Bakteri KIA TSI

Agar

Miring

Agar

Tegak

Agar

Miring

Agar

Tegak

v. cholerae K AA (K

jarang)A

v. mimicus K AK (A

jarang)A

v.

parahaemolyti

K A K A

cus

v.

alginolytusK A A A

v. vulnificusK atau

AA

K (A

jarang)A

a.hidrophillaK atau

AA K atau A A

p.shigoleidesK atau

AA K atau A A

d.Uji ONPG

Untuk uji ONPG gunakan kultur dari TSI atau

media lain yang mengandung lactose. Inokulasikan 1

ose kultur dari TSI kedalam tabung yang berisi

0,5 ml larutan psysiological saline. Masukkan disk ONPG

lalu inkubasikan pada suhu  36 oC ± 1 oC selama

20 menit  sampai dengan 1 jam. Reaksi positif

ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning

pada media dalam tabung.

Reaksi ONPG negatif (kiri) dan Positif (kanan)

e.Uji Oksidatif – fermentatif ( OF )

Inokulasikan 2 tabung kedalam media OF yang

telah ditambahkan glukosa 1 % dengan kultur

dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % tambahkan

mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm kedalam

salah satu tabung. Inkubasikan pada suhu 36 oC

± 1 oC selama 1 hari – 2 hari. Reaksi oksidatif

ditunjukkan dengan terbentuknya warna kunimg

(reaksi asam) pada tabung yang tidak

ditambahkan dengan mineral oil, sedangkan

reaksi fermentative ditunjukkan dengan

terbentuknya warna kuning pada tabung yang

ditambahkan mineral oil. Asam mengubah media

dari warna hijau menjadi kuning.

Uji OF: 2 tabung kiri positif (kuning) dan 2

tabung kanan negatif (hijau)

f.Pewarnaan gram

Lanjutan pengujian apabila pada uji biokimia

pendahuluan diatas ditemukan reaksi Vibrio cholerae

. Kultur diambil  agar miring atau TSA miring +

NaCl 1,5 % yang telah diinkubasi selama 24 jam.

Bakteri Vibrio cholerae termasuk gram – negatif,

berbentuk batang pendek atau koma.

7.5 Uji Biokimia Lanjutan

Lanjutkan pengujian apabila pada uji biokimia

pendahuluan diatas ditemukan reaksi  Vibrio cholerae

yang khas. Goreskan kembali kultur dari T1N1 agar

atau TSA + NaCl 1,5 % ke TSA dan TSB. Inkubasikan

pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam.

a. Uji Hidrolisis Urea.

Inokulasikan 1 ose dari TSA + NaCl 1,5 %

kedalam media urea. Inkubasikan pada suhu 36 oC

± 1 oC selama 18 jam. Reaksi positif

ditunjukkan dengan perubahan warna media dari

orange menjadi merah muda. Vibrio cholerae tidak

mempunyai kemampuan dalam menghidrolisis urea

(reaksi negatif).

Urea broth (negatif)

b. Uji Arginin dihydrolase, Lysin dekarboksilase dan

ornithin dekarboksilase.

Inokulasikan kultur dari TSA + NaCl 1,5 %

kedalam tabung media dasar dekarboksilase yang

masing – masing mengandung arginin, Lysine,

ornithin serta kedalam 1 tabung kontrol media

dasar dekarboksilase yang tidak mengandung asam

amino. Tambahkan masing – masing tabung dengan

mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm.

Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 4

hari. Lakukan pengamatan setiap hari. Reaksi

dekarboksilase terhadap asam amino menghasilkan pH

alkaline dan mengubah media menjadi ungu cerah

(reaksi positif). Sedangkan reaksi fermentasi

glucose menghasilkan asam dan mengubah media

menjadi warna kuning (reaksi negatif). Tabung

control yang tidak mengandung asam amino

berubah menjadi kuning Vibrio cholerae menghasilkan

reaksi arginin dihydrolase negative, Lysine dan

ornithin positif dan orithin decarboxylase

positif.

Dari Kiri ke Kanan: Arginine(-), Lysine(+),

Ornithin(+), Sucrose(+), Lactose(-),

Arabinose(-), Mannose(-) , Mannitol(+)

c. Uji Toleransi terhadap garam

Inokulasikan kultur dari TSB kedalam 3 tabung

yang masing – masing mengandung tryptone broth

1 % yang ditambahkan NaCl 0 % ; 1 % dan 3 %

(T1N0,T1N3). Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC

selama 18 jam – 24 jam. Reaksi positif ditandai

dengan terjadinya keruhan yang menunjukkan

pertumbuhan. Vibrio cholerae dalam media T1N0

dan T1N3 (table 2).

d. Uji pertumbuhan pada suhu 42 oC

Inokulasikan 1 ose dari TSB yang telah

diinkubasikan selama 24 jam kedalam TSB yang

telah dihangatkan dalam waterbath 42 oC.

Inkubasikan pada suhu 42 oC dalam waterbath

selama 24 jam. Reaksi positif ditandai dengan

terjadinya kekeruhan yang menunjukkan adanya

pertumbuhan. Vibrio cholerae mengasilkan reaksi

variable.

e. Uji voges-proskauer

Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam

MRV – VP broth inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1oC selama 2 hari. Pindahkan 1 ml dari setiap

MRV – VP broth yang menunjukkan pertumbuhan

kedalam tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm

steril. Tambahkan 0,6 ml larutan alphanaphtol

dan 0,2 ml KOH 40 % lalu kocok. Tambahkan

sedikit kristal keratin untuk mempercepat

reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam.

Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya

warna merah muda sampai warna merah mirah

delima (ruby) pada media Vibrio cholerae

menghasilkan reaksi variable.

f. Uji Fermentasi karbohidarat

Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam

masing – masing satu tabung purple broth base yang

mengandung sucrose, lactose, D-mannitol, mannose,

arabinosa atau cellobiose. Tambahkan masing – masing

tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm

– 2 cm. inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC

selama 4 hari – 5 hari  dan lakukan pengamatan

setia hari. Reaksi positif fermentasi

karbohidrat menghasilkan asam dan mengubah

media menjadi kuning ( table 2).

7.6 Uji Serologi

Ambil 1 ose kultur dari T1N1 agar atau TSA+ NaCl

1,5 % yang telah diinkubasikan selama 16 jam – 24

jam dan letakkan diatas gelas preparat. Tetesi

dengan larutan saline 0,85 % dan emulsikan.

Letakkan 1 tetes antiserum poly hikojima inaba – ogawa

disamping suspensi koloni.

Campurkan antiserum sedikit demi sedikit dengan

suspensi koloni sampai tercampur sempurna.

Lakukan kontrol dengan menggunakan larutan saline

dan antiserum.

Goyangkan  campuran tersebut  kekiri dan kekanan

dan amati reaksi penggumpalan pada latar belakang

yang gelap sebagai berikut :

Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan

kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada

larutan control.

Negatif apabila tidak terjadi penggumpulan baik

pada larutan kultur maupun larutan control.

8. Interpretasi Hasil

No Jenis Uji Interpretasi Hasil

1 Morfologi Gram – negatif, bentuk batangatau koma

2 TSI Agar miring: asam (kuning)Agar tegak: asam (kuning)

3Oksidatif /fermentatif (mediaOF)

Oksidatif positif danfermentatif positif

4 Oksidase Positif

5 ArgininDehidrolase Negatif

6 LysineDecarboxylase Positif

7 VP Variabel

8 Pertumbuhan padasuhu 42oC Positif

9 Halophilik T1N0; positif; T1N3; positif,T1N6; negatif

10 Fermentasi Sucrose Positif

11 FermentasiArabinose Negatif

12 ONPG Positif

13 Sensitifitasterhadap 0/129

Sensitif (S) terhadap 10 µgdan 150 µg

9. Pelaporan Hasil

Laporkan ada atau tidak Vibrio cholerae berdasarkan uji

biokimia dan serologi.

DAFTAR PUSTAKA

Brooks GF dkk. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. EGC

Chin J.2006. Manual Pemberantasan Penyakit Menular. Edisi17. Infomedika

Shulman ST dkk. 1994. Dasar Biologis & Klinis Penyakit Infeksi.Edisi 4. Gadjah Mada University Press

Staff pengajar FK UI. 1993. Mikrobiologi Kedokteran.Binarupa Aksara

http://elib.fk.uwks.ac.id/asset/archieve/jurnal/Vol%20Edisi%20Khusus%20Desember%202010/CHOLERA.pdf

http://www.cdc.gov/cholera/pdf/laboratory-methods-for-the-diagnosis-of-vibrio-cholerae-chapter-6.pdf

http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3576/1/05010682.pdf