ACARA II

DASAR – DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

A. TUJUAN

1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat

yang dibutuhkan oleh suatu media untuk pertumbuhan

mikroba.

2. Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi.

3. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara

aseptik.

4. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman

mikroba.

5. Mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk

pengecatan/pewarnaan bakteri.

6. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam.

B. TINJAUAN PUSTAKA

Studi dari mikrobiologi bergantung pada kemammpuan

mikroorganisme untuk tumbuh dan bertahan hidup di

laboratorium, dan ini dapat terjadi jika mikroorganisme

tersebut hidup di media yang tepat. Sebuah media kultur

adalah media yang berbentuk padat atau cair yang

digunakan untuk pertumbuhan, perpindahan, dan

perkembangbiakan mikroorganisme. Agar efektif, sebuah

media harus mengandung segala nutrisi yang dibutuhkan

mikroorganisme untuk tumbuh (Willey, Sherwood, dan

Woolverton, 2008).

Kebanyakan dari bakteri heterotrof dan jamur,

seperti pada oercobaan dalam laboratorium sehari-hari,

tumbuh pada media kompleks yang tersusun dari nutrisi

termasuk ekstrak khamir, daging, atau tumbuhan atau

sumber lain. Dalam media kompleks, energi, nitrogen, dan

sulfur dibutuhkan mikroorganisme untuk tumbuh. Jika media

kompleks berbentuk cairan maka disebut media Nutrient Broth.

Sedangkan ketika ditambah agar, maka disebut media Nutrient

Agar (Tortora, Funke, dan Case, 2010).

Agar merupakan ekstrak polisakarida yang berasal

dari alga, digunakan untuk mengeraskan kultur media cair.

Agar akan tetap dalam bentuk cair sebelum didinginkan

pada suhu di bawah 45⁰C. Agar bersifat tembus cahaya,

memungkinkan koloni menempel pada media solid, dan

memudahkan kita untuk melakukan pengamatan (Tortora,

Funke, dan Case, 2010).

Tabung reaksi dan cawan petri adalah tempat menanam

mikroorganisme. Dalam keadaan cair, media padat dapat

ditempatkan dalam tabung reaksi atau agar juga bisa

ditempatkan dalam tabung reaksi. Dan ketika media nya

padat ditempatkan dalam cawan petri (Cappucino dan

Sherman, 2011).

Kultur murni bakteri dapat dipersiapkan dalam

beberapa cara, yaitu:

Streak Plate Method, pada teknik ini, sel mikroba

diletakkan di pinggir cawan petri bermedua agar

dengan jarum ose, dan kemudian digoreskan pada

permukaan dalam satu model tertentu. Setelah itu,

dilakukan penggoresan dalam bentuk dan corak yang

lain dalam beberapa sektor. Cara ini untuk

mendapatkan koloni yang terpisah.

Spread Plate Method, merupakan campuran berisi 30-

300 mikroba dalam volume kecil dituang ke tenah

media agar dalam cawan petri dan disebar di

permukaan. Mikroba ini akan berkembang menjadi

koloni terpisah.

Pour Plate Method, metode ini digunakan untuk

bakteri, archae dan jamur. Suatu sample mikroba

dalam volume kecil dicapur dengan cairan agar yang

bersuhu 45⁰C. Kemudian ditunag ke cawan petri.

Mikroba kemudian akan memadat pada agar untuk

membentuk suatu koloni (Willey, Sheerwood, dan

Woolverton, 2008).

C. DASAR TEORI

Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang di media

yang tepat dengan nutrisi-nutrisi yang cukup. Media

tersebut dibagi menjadi dua, yaitu media padat dan media

cair. Media tersebut harus sama dengan lingkungan

hidupnya di alam dan memiliki cukup nutrisi yang

dibutuhkan oleh mikroba sehingga mikroba dapat

berkembang. Mikroorganisme membutuhkan ekstrak khamir,

daging, atau tumbuhan yang mengandung protein untuk

pertumbuhannya.

Hanya sedikit mikroorganisme yang dapat mengolah

langsung protein dikarenakan protein merupakan salah satu

molekul besar. Asam atau enzim yang terdapat dalam

mikroorganisme dapat merombak protein ke rantai asam

amino yang lebih sederhana yaitu pepton. Kemudia bakteri

akan mencerna pepton tersebut. Media Nutrient Broth

merupakan media berbentuk cair. Sedangkan Nutrien Agar

adalah media berbentuk padat karena adanya penambahan

agar.

Untuk memadatkan kultur media cair diperlukan agar

yang mengandung ekstrak polisakarida yang berasal dari

alga. Media agar berbeda debgab gelatin. Pada media agar,

kemampuan bakteria untuk mendegradasi sangat kecil

sehingga tidak akan rusak pada temperatur yang tinggi.

Agar akan mulai mengeras pada suhu di bawah 45⁰C, dan

akan berbentuk cair ketika suhunya di atas 45⁰C.

Pada suhu yang terlalu tinggi, nutrisi yang

terkandung dalam agar akan mengalami kerusakan. Untuk

mengatasinya dapat dilakukan dengan menambah nutrisi pada

suhu yang rendah sebelum agar mengeras. Jika agar

dipanaskan pada suhu di atas 45⁰C, maka agar akan berubah

wujud menjadi cair.

Hal ini berbeda dengan gelatin yang dapat mencair

pada suhu 37⁰C. Pada suhu ruangan, agar akan tetap

menjadi padat sehingga mikroba yang telah ditanam dapat

tumbuh dan koloni dapat menempel pada media agar. Karena

agar bersifat bening dan tembus cahaya, maka pengamatan

dapat dilakukan dengan mudah.

Untuk memindahkan kultur murni bakteri, dapat

dilakukan dengan beberapa metode, antara lain Streak

Plate Method atau metode gores, Spread Plate Method atau

metode sebar/tebar, dan Pour Plate Method atau metode

tabur.

Metode streak dilakukan agar koloni mikroorganisme

yang terisolasi dapat terpisah dan menjadi koloni

tunggal. Untuk membuat koloni tunggal digunakan jarum ose

untuk membuat goresan di permukaan media padat yang sudah

terbagi dalam kuadran-kuadran.

Metode spread dilakukan dengan pengenceran biakan

kultur. Hal ini bertujuan untuk memisahkan koloni.

Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga

akhirnya mengandung 30-300 koloni dari satu pengenceran.

Metode pour dilakukan dengan mencampurkan kultur

murni mikroba dengan media agar yang bersuhu 45⁰C-50⁰C

lalu di pindah ke cawan petri dan sedikit digoyang.

Sebelum melakukan percobaan, alat-alat yang akan

digunakan harus terbebas dari segala bentuk kehidupan.

Untuk itu perlu dilakukan proses sterilisasi. Sterilisasi

merupakan usaha untuk dapat membebaskan alat-alat atau

bahan dari segala bentuk kehidupan.

Ada beberapa cara untuk melakukan proses

sterilisasi, antara lain sterilisasi dengan menggunakan

panas, yang terdiri dari panas kering, pemijaran, panas

lembab, dan panas basah. Sterilisasi dengan menggunakan

panas basah dapat membunuh mikroorganisme karena panas

basah dapat menyebabkan denaturasi protein pada bakteri

sehingga bakteri mati. Alat yang digunakan untuk

pemanasan basah yaitu autoklaf.

Sterilisasi dengan menggunakan radiasi sinar UV

dapat mengurangi mikroba di udara. Selain itu sterilisasi

juga dapat dilakukan dengan proses penyaringan. Lubang

saringan yang digunakan sebesar 0,22 μm. Tetapi

penyaringan ini tidak bisa dilakukan pad abahan dengan

vokume yang lebih besar dari 500 mL karena jika volume

bahan melebihi 500 mL dapat menyebabkan proses

sterilisasi dengan penyaringan menjadi lebih tidak

efektif.

Sterilisasi secara kimiawi dilakukan dengan

menggunakan bahan kimia, seperti etanol 70% dan fenol.

Alat-alat kecil yang berbahan dasar kaca dicelupkan ke

dalam etanol 70% atau fenol kemudian dikeringkan dengan

cara diangin-anginkan.

D. SKEMA KERJA

1. Media dan Cara Pembuatan Media

Alat dan Bahan :

- Media Nutrien Agar (NA) (Oxoid)

- Media Nutrien Broth (NB) (Oxoid)

- Aqua Dest

- Cawan Petri

- Tabung reaksi

- Batang pengaduk, pipet volume, erlenmeyer,

penangas/elemen pemanas

Skema Kerja :

Media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) ditimbang sesuai prosedur

di kemasan. (Catatan : 50 mL media NA di buat untuk

setiap kelompok kecil praktikum dan 50 mL media NB untuk

satu golongan praktikum). Media ditimbang teliti dan

cepat kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati

kedalam erlenmeyer.

Aquadest ditambahkan dan diaduk sampai merata dengan

batang pengaduk.

Media dipanaskan dengan hati-hati menggunakan

penangas/elemen pemanas samapai media tercampur homogen

(ditunjukkan dengan warna kuning).

Sebelum diautoklaf, media NA dituang dengan volum

tertentu dengan pipet volume : 5 mL kedalam tabung reaksi

untuk NA miring, 10 mL kedalam tabung reaksi untuk NA

tegak, 15 mL untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan

4b (metode isolasi pourplate), sisanya utuk NA daam cawan

petri untuk percobaan 6 (pengenalan mikroba alam).

Tabung reaksi reaksi ditutup dengan penutup tabung tapi

jangan terlalu rapat.

Sebelum diautoklaf, NB dituang kedalam tabung reaksi

untuk 6 kelompok praktikum dalam satu golongan, masing-

masing tabung reaksi berisi 8 mL. Tabung reaksi ditutup

dengan kapas atau penutup tabung tapi jangan terlalu

rapat.

Seluruh media dalam tabung reaksi dengan autoklaf selama

15 menit, tekanan 1 atm dengan suhu 121C

Setalah diautoklaf : media NA 10 mL dalam tabung reaksi

diletakkan tegak pada rak tabung dan dibiarkan memadat,

media NA 5 mL diinkubasi miring dan dibiarkan memadat

(untuk pecobaan 6 : pengenalan mikoba di alam). Media NA

15 mL dibiarkan samai suhu 45-50C (untuk percobaan 4b :

metode isolasi pourplate)

Media NB didalam tabung reaksi dibiarkan dingin

2. Teknik – Teknik Pemindahan Kultur Mikroba

Alat dan Bahan :

- Media NA miring dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

- Media NA tegak dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

- Media nutrien cair atau NB dalam tabung reaksi (hasil

percobaan 1)

- Jarum ose

- Jarum inokulasi

- Kultur murni bakteri

- Lampu bunsen

- Vortex mixer

Skema Kerja :

Disiapkan media NA dan NB dari hasil percobaan 1 ( media

NA miring, media NA tegak dan media NB cair )

Longgarkan tutup dari masing-masing tabung reaksi yang

berisi media

Pegang tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri

E. Coli di tangan kiri

Jarum ose di pegang di tangan kanan dan di bakar di atas

nyala lampu bunsen hingga kawat memijar

Ose di pegang menggunakan ibu jari dan jari telunjuk,

gunakan jari kelingking untuk membuka semua tabung reaksi

Panaskan mulut tabung reaksi, masukkan jarum ose dan

ambil 1 ose biakan bakteri

Panaskan kembali mulut tabung dan tutup tabung reaksi

kembali

Ambil tabung reaksi yang akan diinokulasi dengan tangan

kiri, dengan cara yang sama buka tutup tabung reaksi dan

panaskan mulut tabung

Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi

dengan cara goresan zigzag pada permukaan NA miring

Panaskan mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi

kembali, kemudian panaskan ose

Beri label dan tanggal percobaan, nama bakteri, teknik

pemindahan, dan nama kelompok

Lakukan dengan cara yang sama untuk media nutrien cair

menggunakan jarum ose dan media agar tegak secara tusukan

tegak lurus menggunakan jarum inokulasi

Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan diamati

pertumbuhannya

3. Teknik-Teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba

a. Spread PlateMethod (Cara Tebar/Sebar)

Alat dan Bahan :

- Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky

- Pipet volume, lampu bunsen

- Media NA dalam cawan petri

- Kultur murni bakteri

- Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)

Skema Kerja :

Pengenceran - dibuat dari kultur murni bakteri

dengan larutan pengencer.

Tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri

diambil, dibuka, dan dibakar bagian leher tabungnya.

0,1 mL kultur bakteri secara aseptis dipindahkan ke

permukaan media NA dalam cawan petri

Spreader yang telah di celupkan ke alkohol dibakar dan

dibiarkan dingin

Kultur bakteri disebarkan/ditebarkan dengan spreader

secara merata dan dibiarkan sampai permukaan agak

mengering

Setelah permukaan agak mengerng, diinubasikan secara

terbalik selama 24 jam pada suhu kamar dan diamati

pertumbuhannya

Pertumbuhan dari tiap-tiap pegenceran dibandingkan dan

dibandingkan dengan hasil teknik spreadplate pada percobaan

2 (sterilisasi secara filtrasi)

b. Pour PlateMethod (Cara Tabur)

Alat dan Bahan :

- Media NA dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

- Cawan petri steril

- Kultur murni bakteri

- Pipet volume, lampu bunsen

Skema Kerja :

Media NA dalam tabung reaksi didinginkan sampai suhu

45-50C (ciri: terasa hangat dikulit/tidak “kemranyas”)

Tutup tabung yang berisi kultur bakteri murni dibuka dan

dibakar bagian leher botolnya

1 mL kultur bakteri dipindahkan kedalam tabung reaksi

yang mengandug NA secara aseptis

Leher tabung dipanaskan di atas bunsen dan tuangkan NA

yang telah mengandung kultur murni bakteri kedalam cawan

petri

Goyangkan secara perlahan untuk mencampur kultur bakteri

dengan NA sampai homogen

Setelah agar memadat, diinkubasi terbalik pada suhu kamar

selama 24 jam. Dan di amati pertumbuhannya

c. Streak Plate Method (Cara Gores)

Alat dan Bahan :

Skema Kerja :

Jarum ose dipanaskan hingga memijar di atas bunsen,

kemudian didinginkan

Setelah dngin, digoreskan pada permukaan media agar dalam

cawan petri

Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada

permukaan medi agar dimulai pada satu ujung

Ose dipijarkan terlebih dahulu dan biarkan dingin sebelum

menggoreskan ose pada kuadran berikutnya

Diinkubasi secara terbalik pada suhu kamar 24 jam dan di

amati pertumbuhannya

4. Pembuatan Pulasan Bakteri

Alat dan Bahan :

- Gelas Benda

- Jarum Ose

- Lampu Bunsen

- Label Preparat

- Aqua Dest Steril

- Kultur Murni Baktei

- Penjepit gelas Benda

Skema Kerja :

Labellah gelas benda yang kering dan bersih,sterilkan

jarum ose dengan memijarkan pada nyala bunsen dan

dinginkan

Untuk kultur yang berbentuk cair, ambillah 1 ose penuh

dan letakkan ditengah-tengah gelas benda dan ratakan

seluas 1 cm2

Untuk kultur yang di dalam medium padat, ambillah jarum

ose satu bagian kecil kultur dan letakkan ditengah gelas

benda yang sebelumnya diberi aquades steril dan ratakan

Dibiarkan kering dengan mengangin-anginkan gelas benda

Pulasan bakteri difiksasi dengan melewatkan diatas nyala

bunsen

Pulasan bakteri siap diwarnai

5. Pengenalan Mikrobia Di alam

Alat dan Bahan :

- Media NA dalam cawan petri

- Aquades steril

- Cotton bud

- Spidol

Skema kerja :

Bagi cawan NA kedalam 4 bagian

Basahi cotton bud dengan air, usap permukaan lantai

( bagian 1 ) dan diinokulasikan pada cawan petri

Pada bagian ke-2, ke-3, ke-4 cawan petri, basahi cotton

bud yang lain dan diinokulasikan pada tempat-tempat

sekitar ( ketiak, telapak kaki, dan rambut ) yang mungkin

terdapat mikroba

Diinkubasi secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam

pada suhu kamar mandi dan amati pertumbuhan mikrobanya

E. HASIL PENGAMATAN

1. NB steril

media

Ket : media berwarna jernih

dan tidak keruh

2. NB tidak steril

media

Ket : media berwarna

keruh

3. NA tegak

Ket: struktur dan morfologi

bakteri villous :

bentuk pendek, tebal,

dan permukaannya

seperti rambut.

4. NA miring

mikroba

media

media

Ket : Bentuknya Effuse

pertumbuhan tipis

biasanya merata

5. Pour plate

Ket : bakteri tumbuh di

semua media diantaranya

bagian tengah,

6. 15 mL Spread plate

Ket: koloni bakteri bulat

cukup besar dan

tersebar merata.

7. 15 mL Spread plate

Ket: koloni bakteri bulat

kecil dan tersebar

merata pada media dan

sebagian media tertutup

selaput bakteri.

8. 15 mL media NA Spread

plate

Ket : koloni bakteri

berbentuk bulat halus.

Tersebar pada media.

mikroba

media

mikroba

mikrob

media

mikroba

media

media

mikroba

Dan media tidak tertup

selaput bakteri.

9. 15 mL media NA Spread

plate

Ket : koloni terpisah,

berbentuk bulat tipis.

Ukuran koloni bakteri

lebih kecil dan

penyebarannya lebih

rapat.

10. 15 mL Spread plate

Ket : koloni bakteri

berbentuk bulat sedang

dan tersebar

dipermukaan media.

11. 15 mL Spread plate

Ket : koloni terpisah,

bakteri tidak begitu

berbentuk.pertumbuhan

bakteri paling banyak

terlihat ditengah.

12. Streak plate

Ket : koloni bakteri

pada kuadran 1 lebih banyak

dari kuadran 2 dan 3.

Media

Mikroba

mikrobamedia

mikroba

media

media

13. 20 mL Mikroba di alam

Ket : pada kuadran

ranmbut dan ketiak

bentuk koloni tidak

terlihat jelas, hanya

terlihat sedikit

bentuk bulat kecil.

Pada kuadran lantai

koloni terbentuk

cukup banyak dan

menumpuk pada bagian

tertentu. Pada

kuadran kaki terdapat

serabut tipis yang

tidak begitu jelas.

F. PEMBAHASAN

1. Media dan Cara Pembuatan Media

Tujuan dari praktikum ini adalah mempelajari cara pembuatan

media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media unruk

pertumbuhan mikroba. Media adalah suatu bahan yang mengandung

campuran nutrisi, vitamin, dan lain-lain yang digunakan untuk

menumbuhkan mikroba, isolasi, pengujian sifat-sifat fisiologi

bakteri, dan pembiakan bakteri yang sedang dikembangkan.

Media yang digunakan untuk penanaman mikroba harus baik

yaitu harus steril dan tidak mengandung kontaminan yang akan

mengkontaminasi mikroba yang hendak ditanam, suhu media harus

sesuai dengan lingkungan hidup mikroba, derajat keasamanan

atau pH netral atau sedikit basa. Media dibagi menjadi dua

jenis berdasarkan komposisi kimianya yaitu media sintetik dan

media non sintetik (kompleks). Media sintetik adalah media

yang struktur kimianya diketahui dengan pasti yang biasa

Mikroba di

Mikroba di

Mikroba di

mikroba di rambut

media

mikro

digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan mikroba

sedangkan media non sintetik adalah media yang susunan

kimianya tidak dapat diketahui dengan pasti dan digunakan

untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroba.

Pada praktikum ini dibuat dua macam media, yaitu media

semisolid Nutrien Agar (NA) dan media cair Nutrien Broth).

Media NA disebut semisolid karena berbentuk padat yang bisa

dicairkan.

Dalam pembuatan media perlu diperhatikan label petunjuk yang

terdapat pada kemasan media. Untuk membuat media NA sebanyak

satu liter diperlukan 28 gram NA. Maka perhitungan untuk

pembuatan media NA sebanyak 100 mL adalah :

Setelah media NA ditimbang sebanyak 2,8 gram dimasukkan ke

dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 mL aquades dan diaduk

dengan stirrer sambil dipanaskan. Kecepatan stirrer perlu

disesuaikan dengan ukuran erlenmeyer yang digunakan. Jika

erlenmeyer yang digunakan berukuran tidak terlalu besar

kecepatan stirrer tidak terlalu cepat agar media tidak meluap

dan tumpah yang akan mengurangi media yang dibutuhkan. Media

ditunggu sampai warnanya berubah dari kuning keruh menjadi

kuning jernih. Media NA dibagi menjadi beberapa volume dan

dimasukkan ke dalam tabung reaksi, 10 mL untuk NA tegak, 5 mL

untuk NA miring, dan 15 mL untuk NA yang digunakan untuk pour

plate, dan sisanya dibiarkan di dalam erlenmeyer untuk

percobaan selanjutnya.

Media NA digunakan untuk melihat morfologi bakteri dan

sebagai sumber makanan mikroba yang ditanam. NA tegak

bertujuan untuk mengetahui arah pertumbuhan bakteri. NA miring

dilakukan dengan 2 macam goresan sesuai dengan keperluan. Jika

akan mengamati bentuk koloni bakteri dilakukan penggoresan

lurus pada NA miring, jika untuk stok bakteri digoreskan

secara zig-zag karena mempunyai permukaan yang besar. Media NA

mengandung ekstrak daging, pepton dan gelling agent

(Tortora,2010).

Untuk membuat media NB sebanyak satu liter diperlukan media

NB sebanyak 13 gram. Maka perhitungan untuk membuat media

sebanyak 50 mL adalah : . Setelah

ditimbang sebanyak 0,65 gram dimasukkan kedalam erlenmeyer dan

ditambah aquades sebanyak 50 mL diaduk menggunakan stirrer

sampai homogen. Media NB dibagi dengan volume 8 mL sebanyak 6

tabung yang akan dibagi 2 tabung setiap meja praktikum.

Media NB mengandung eksrak yeast atau daging, pepton, dan

sodium klorida (Tortora, 2010) biasa digunakan untuk mengamati

pergerakan mikroba. Berdasarkan kebutuhan oksigen

perherakan bakteri dibagi menjadi tiga :

1. Aerob : bakteri yang membutuhkan oksigen, berada

di permukaan media

2. Fakultatif : bakteri yang pada kondisi tertentu

membutuhkan oksigen, dan pada kondisi lainnya tidak

membutuhkan oksigen, pergerakan bakteri bisa terletak di

tengah media, atas, atau bawah tergantung dengan kondisi.

3. Anaerob : bakteri yang tidak membutuhkan oksigen,

pergerakan bakteri terletak di dasar media

Setelah semua media sudah siap dan tercampur secara

homogen, media siap untuk disterilkan. Pada praktikum proses

mensterilkan menggunakan autoklaf. Semua media dalam tabung

reaksi dan erlenmeyer disusun di dalam autoklaf. Prinsip kerja

autoklaf adalah pemanasan menggunakan uap air panas bertekanan

untuk mematikan mikroba pada alat dan media yang akan

digunakan. Autoklaf dilakukan selama 15 menit dengan suhu

121ºC dan tekanan 1 atm. Tabung reaksi yang dimasukkan ke

dalam autoklaf tidak boleh tertutup rapat agar uap panas yang

dihasilkan oleh autoklaf dapat masuk ke dalam tabung untuk

membunuh kontaminan dan mencegah pecahnya tabung reaksi akibat

tekanan yang terlalu tinggi.

2. Sterilisasi

Tujuan praktikum adalah untuk mengenal macam-macam teknik

sterilisasi. Dalam percobaan dilakukan dua macam sterilisasi

yaitu menggunakan panas dan sterilisasi menggunakan bahan

kimia. Sterilisasi panas dilakukan menggunakan autoklaf, uap

air bertekanan dapat mengghasilkan suhu cukup tinggi yang

dapat mematikan mikroba sehingga media dan peralatan menjadi

steril. Panas yang dihasilkan dapat merusak protein enzim dan

membrane sel mikroba sehingga terdenaturasi.

Selain autoklaf sterilisasi panas yang lainnya adalah

dengan pemijaran di atas bunsen. Alat-alat yang disterilkan

dengan cara ini adalah jarum ose, jarum inokulasi, jarum

enten, dan alat-alat lain yang terbuat dari kawat besi.

Prinsip kerja dengan cara ini adalah dengan memijarkan jarum

dari ujung sampai pangkal hingga kawat berpijar berwarna

merah. Hal ini dilakukan sebelum dan sesudah menggunakan alat

yang bertujuan untuk memperkecil terkontaminasinya media yang

steril. Selain alat- alat jarum bunsen juga digunakan

mensterilkan ujung tabung reaksi yang berisi media dan kultur

mikroba serta lingkar ujung cawan petri.

Sterilisasi dengan bahan kimia dilakukan dengan menggunakan

etanol/ alcohol 70% . Prinsip kerja sterilisasi dengan cara

ini adalah membasahi atau menyemprotkan ke alat-alat yang

ingin di sterilkan. Selain alat kerja, etanol juga dilakukan

untuk mensterilkan wilayah kerja dan tangan praktikan sebelum

melakukan percobaan.

3. Teknik Pemindahan Mikroba Secara Aseptis

Tujuan dari praktikum ini adalah mempelajari cara-cara

pemindahan mikroba secara aseptis. Teknik ini dilakukan untuk

meminimalisir adamua mikroorganisme lain selain mikroba yang

akan di kultur. Media yang digunakan yaitu media NA tegak, NA

miring, dan NB. Perlakuan aseptis pada saat pemindahan mikroba

meliputi beberapa hal. Jarum ose dan inokulasi dipijarkan di

atas lampu bunsen sebelum dan sesudah digunakan. Semua

kegiatan yang dikerjakan di area maksimal 20 cm dari lampu

bunsen yang disebut area steril.

Bakteri yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah

bakteria Escherichia coli. Bakteri ini bersifat aerob fakultatis,

memiliki gram negative, dan berbentuk basil.

Pemindahan bakteri murni ke media NB dilakukan dengan

mencelupkan jarum ose yang berisi kultur bakteri murni ke

tabung reaksi yang berisi media NB. Tujuan pemindahan ini

untuk mengetahui pergerakan dan sifat bakteri menurut

kebutuhan oksigennya. Hasil yang diperoleh dalam praktikum

kali ini adalah bakteri tumbuh di permukaan dan tengah pada

media NB yang tidak steril dilihat dari kekeruhan media

setelah inkubasi ±18 jam yang menandakan bahwa bakteri yang di

amati merupakan bakteri fakultatif. Sedangkan untuk media NB

steril tidak begitu terlihat pertumbuhan yang terjadi.

Pemindahan kultur bakteri murni pada media NA tegak

dilakukan dengan cara menusukkan jarum inokuasi ada media NA

tegak dari atas ke bawah. Penusukan jarum inokulasi tidak

dilakukan dampai dasar tabung reaksi untuk mencegah

pertumbuhan bakteri hanya di dasar tabung dan akan susah

diamati. Hasil dari percobaan yaitu koloni bakteri berbentuk

Villous, yaitu berbentuk pendek tebal dan permukaan seperti

rambut.

Pemindahan kultur bakteri pada media miring dilakukan

dengan cara menggoreskan jarum ose ang berisi kultur bakteri

ke media NA miring secara zig-zag. Hasil percobaan adalah

effuse yaitu pertumbuhan tipis dan biasanya merata.

4. Teknik Isolasi dan Penanaman Mikroba

Tujuan praktikum ini adalah untuk mempelajari teknik

isolasi dan penanaman mikroba. Dalam praktikum ini mengenal

adanya tiga teknik isolasi yaitu spread plate, pour plate, dan streak

plate.

1. Spread Plate

Spread plate adalah metode penanaman bakteri dengan

cara disebarkan secara merata pada permukaan media untuk

mendapatkan koloni dengan kisaran 30-300 koloni. Pada

percobaan kali ini dilakukan percobaan dengan cara

mengencerkan bakteri murni 10-1 sampai 10-6. Pengenceran

bakteri menggunakan Buffered Pepton Water (BPW) yang

merupakan larutan buffer yang dapat mempertahankan pH,

tidak menggunakan aquadest karena pH dapat berubah,

selain itu BPW mengandung pepton sebagai nutrisi yang

diperlukan oleh bakteri. Pengenceran dilakukan agar

koloni bakteri terpisah sehingga dapat diamati dengan

mudah dan dapat dilihat perbedaan antara yang pekat

dengan koloni yang tidak pekat. Cara pengenceran yaitu

dengan mengencerkan 1 mL kultur bakteri murni, kemudian

ditambahkan 9 mL BPW akan didapat 10-1. Kemudian diambil 1

mL kultur hasil pengenceran pertama dan ditambahkan

dengan 9 mL BPW yang lain untuk mendapatkan 10-2, begitu

seterusnya hingga didapat pengenceran 10-6.

Selama melakukan pengenceran dan penanaman bakteri

dilakukan secara aseptis. Berdasarkan data pengamatan

selama percobaan terdapat pertumbuhan mikroba yang tidak

sama untuk semua cawan petri. Pada cawan petri dengan

pengenceran 10-1 dan 10-2 terjadi kesalahan kerja, bakteri

yang dituang pada media sebanyak 1 mL yang seharusnya

hanya 0,1 mL, akibatnya pertumbuhan bakteri menjadi

sangat banyak dan tebal serta koloni berbentuk bulat

sedang yang tersebar di permukaan media. Pada pengenceran

10-2 sebagian besar permukaan media seperti tertutup

selaput yang tersusun dari bakteri. Sebagian kecil media

menunjukkan adanya koloni bakteri terpisah yang berbentuk

bulat dengan ukuran yang tidak terlalu kecil/ sedang.

Pada cawan petri dengan pengenceran 10-3 koloni

terpisah bakteri cukup terbentuk ditandai dengan adanya

koloni bakteri yang berbentuk bulat kecil yang banyak dan

tersebar merata di permukaan media. Begitu juga dengan

cawan petri pengenceran 10-4 koloni terpisah yang

terbentuk cukup banyak ditandai dengan terbentuk koloni

bakteri yang berbentuk bulat tipis. Ukuran koloni bakteri

lebih kecil dan penyebaraanya lebih rapat dibandingkan

dengan pengenceran 10-3.

Pada cawan petri pengenceran 10-5 koloni bakteri

terbentuk bulat sedang dan tersebar di permukaan media.

Bagian yang banyak ditumbuhi koloni bakteri adalah bagian

tepi dari media di cawan petri. Pada cawan petri dengan

pengenceran 10-6 koloni terpisah bakteri tidak begitu

terbentuk. Pertumbuhan bakteri paling banyak terlihat di

bagian tengah media yang membentuk selaput bulat. Bagian

tepi terdapat koloni bakteri yang terpisah berbentuk

bulat cukup besar.

Berdasarkan pengamatan selama percobaan, koloni

terpisah yang paling terbentuk pada media dengan

pengenceran 10-3 dan 10-4.

2. Streak plate

Prinsip isolasi dengan streak plate adalah

pemindahan kultu bakteri dengan menggoreskan ose pada

media dengan tujuan mendapatkan kultur bakteri yang

terpisah sehingga dapat mengkultur biakkan murni. Pertama

cawan petri dibagi menjadi tiga kuadran, satu kuadran di

atas berbentuk setengah lingkaran dan dua kuadran di

bawah berbentuk sepermpat lingkaran. Menggoreskan kultur

bakteri secara zig-zag dan bertahap. Tahap yang pertama

di goreskan pada kuadran I, tahap kedua di goreskan pada

kuadran II dengan sebelumnya disentuhkan pada bagian

kahir kuadran I, tahap ketiga di goreskan pada kuadran II

dengan sebelumnya digpreskan pada bagian akhir kuadran

II. Setelah di inkubasi selama ±18 jam bakteri sudah

mulai tumbuh di media. Koloni bakteri pada kuadran I

lebih banyak dari kuadran II dan III dan kuadran II lebih

banyak dari kuadran III. Didapatan koloni yang terpisah

pada bagian kuadran II dan III.

3. Pour Plate

Pour plate adalah metode isolasi kultur bakteri

dengan menuangkan 1 mL kultur bakteru murni ke media NA

yang sudah didinginkan hingga suhu 45-50ºC yang belum

memadat kemudian di homogenkan menggunakan vortex dan

dituang ke wadah cawan petri sambil digoyangkan untu

menghomogenkan kultur media. Tujuan metode ini adalah

untuk mengetahui sifat gerak bakteri yang pengaruhi oleh

kebutuhan oksigen bakteri yang akan dikulturkan.

Pada saat praktikum terdapat kesalahan pada metode

kerja kultur bakteri yang dicampurka pada media NA tidak

dihomogenkan menggunakan votex melainkan langsung dituang

dan digoyang-goyangkan pada cawan petri saja. Setelah

diinkubasikan ±18 jam bakteri tumbuh di seluruh media NA

pada cawan petri, bagian atas permukaan, tengah, dan

dasar media. Hal ini menunjukan sifat bakteri E. coli yang

dikulturkan bersifat anaerob fakultatif karena bakteri

tumbuh di bagian permukaan, tengah media, dasar media.

5. Mengenal Mikroba di Alam

Pada percobaan ini ingin membuktikan keberadaaan

mikroba di alam sekitar. Cawan petri dibagi menjadi 4

kuadran. Masing-masing kuadran akan dibiakkan mikroba

dari tempat yang berbeda. Kuadran I diambil dari kaki

salah satu praktikan, kuadran II diambil dari lantai

ruang laboratorium, kuadran III diambil dari rambut salah

satu praktikan, dan kuadran IV diambil dari ketiak salah

satu praktikan. Pengambilan mikroba diambil menggunakan

cotton bud yang telah disterilkan kemudian dicelupkan di

aquadest steril dan digoreskan di tempat yang ingin

diambil mikrobanya. Setelah mengambil bakteri dari

beberapa tempat, cotton bud di goreskan di media NA di cawan

petri dan di inkubasikan di suhu ruangan dalam keadaan

terbalik. Setelah di inkubasi selama ±18 jam terlihat

bentuk-bentuk koloni bakteri yang berbeda di tiap

kuadrannya. Pada kuadran III dan IV bentuk koloni tidak

terlihat jelas, hanya terlihat sedikit bentuk bulat kecil

pada kuadran III. Pada kuadran II bentuk koloni terlihat

jelas karena koloni yang terbentuk cukup banyak menumpuk

pada satu bagian tertentu. Pada kuadran I terlihat bentuk

koloni berserabut tipis yang tidak begitu jelas.

G. KESIMPULAN

1. Cara pembuatan media adalah dengan menimbang bahan

baku media kemudian dilarutkan dengan pelarutnya dan

dihomogenkan menggunakan hot plate magnetic stirer.

Setelah media homogen, media dibagi dalam beberapa

wadah (tabung reaksi, cawan petri) dan di autoclaf

supaya steril. Sedangkan syarat media yang baik

adalah:

i. Sesuai dengan lingkungan hidupnya (susunan

makanan, harus mengandung air, sumber karbon)

ii. pH netral, ada pula yang alkali

iii. Temperatur sesuai dan steril

iv. Mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan

mikroba (sumber energi, sumber karbon, ion

inorganik esensial, dan vitamin)

2. Secara umum, teknik sterilisasi dibagi menjadi 3,

yaitu:

i. Mekanis: pemijaran, sterilisasi uap basah,

sterilisasi kering

ii. Kimiawi: menggunakan alkohol

iii. Radiasi: menggunakan sinar UV

3. Cara kerja aseptis adalah cara kerja dalam rangka

meminimalkan kontaminan yang ikut masuk ke dalam

media penanaman. Aseptis yang dimaksud berarti tidak

semua mikroba akan mati, hanya mikroba yang menjadi

objek penelitianlah yang hidup, sedangkan molekul

lain akan diminamalkan. Pemindahan mikroba,

penanaman mikroba, dan kegiatan lain yang

berhubungan dengan mikroba dilakukan dekat sumber

panas.

4. Teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba:

i. Spread plate : dengan cara tebar/sebar

ii. Streak plate : dengan cara gores

iii. Pour plate : dengan cara tabur

5. Teknik pembuatan pulasan bakteri untuk

pengecatan/pewarnaan bakteri dilakukan dengan

meletakkan mikroba di atas gelas benda kemudian

dipanaskan di atas lampu bunsen hingga kering dan

tidak boleh sampai gosong, dan mikroba siap untuk

dicat/diwarna.

6. Lingkungan alam sekitar tidak akan terlepas dari

mikroorganisme, misalnya pada lantai, ketiak,

rambut, dan kaki manusia.

H. DAFTAR PUSTAKA

Cappucino J.G. and Sherman, Natalie., 2011, Microbiology a

Laboratory Manual, 9th ed.,

Pearson Education, San Fransisco, pp. xvi, 1-3, 7-9, 13-

17, 23-25.

Tortora, J.G., Funke, B.R. and Case, C.L., 2010, Microbiology

and Introduction, 10th ed.,

Pearson Education, San Fransisco, pp. 163-165.

Willey, J.M., Sherwood, L.M., and Woolverton C.J., 2008,

Prescott, Harley, and Klein’s

Microbiology, 7th ed., McGraw-Hill, New York, pp. 114-115.

Slonczewski, J.L., Foster, J.W., and Gillen, K.M., 2009,

Microbiology an Envolving

Science, 2th ed., WW Norton & Comany, Inc., Canada, pp. 171-

173.

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap P.V., and Clark, D.P.,

2009, Biology of

Microorganisms, 12th ed., Pearson Education, San Fransisco,

pp. 780-783

Willey, J.M., Sherwood, L.M., and Woolverton C.J., 2008,

Prescott’s

Microbiology, 9th ed., McGraw-Hill, New York, pp. 155-160

Yogyakarta, 11 Maret 2015

Praktikan,

Biata Munika Monica Praditya P.A.

Eva Husein Patricia Dian A.

I. MENJAWAB PERTANYAAN DISKUSI

1. Fungsi agar pada media pertumbuhan adalah sebagai

tempat pertumbuhan mikroorganisme. Agar pada media

mempunyai sumber nutrien seperti, sumber karbon,

mineral, vitamin, dan gas. Nutrien tersebut

berfungsi agar mikroba yang dikembangkan mendapat

energi yang cukup. Agar digunakan untuk memadatkan

media. Agar tidak mengalami peruraian oleh bakteri,

sehingga tidak mengganggu hasil pengamatan.

2. Cawan petri harus diinkubasikan secara terbalik

karena jika saat diinkubasikan cawan petri tidak

dibalik dan terbentuk uap air di bagian atas dalam

cawan petri maka uap air kemungkinan akan menetes ke

bagian atas media. Menetesnya uap air ke atas media

dapat menyebabkan terganggunya perkembangan mikroba

dan menyebabkan mikroba menjadi terkontaminasi

karena dapat membuat koloni bakteri yang terbentuk

menjadi tersebar sehingga dapat mempengaruhi hasil

pengamatan.

3. Prinsip dan tujuan teknik isolasi mikroba secara:

i. Streak plate, yaitu metode penanaman mikroba

secara goresan pada media agar (NA) dalam cawan

petri. Tujuannya supaya mendapatkan koloni

tunggal yang didapat dengan cara penggoresan

mikroba dalam beberapa sektor yang terpisah.

ii. Spread plate, yaitu suatu metode penanaman

mikroba dengan cara menyebarkan mikroba yang

sudah diencerkan di atas media agar (NA) dalam

cawan petri. Tujuannya untuk mendapatkan koloni

tunggal.

iii. Pour plate, yaitu suatu metode penanaman

mikroba dengan cara memasukkan mikroba ke dalam

media agar yang masih cair yang kemudian

dipadatkan dalam cawan petri. Tujuannya adalah

untuk melihat sifat pergerakkan bakteri menurut

kebutuhan oksigennya.

4. Kultur murni atau biakan murni adalah biakan mikroba

pada suatu media yang terdiri dari satu spesies

mikroba, tanpa adanya kontaminan dari mikroba lain.

5. Teknik penggoresan yang benar pada streak plate

method agar supaya didapat koloni yang terpisah

adalah dengan membagi media dalam tiga kuadran.

Goresan pertama dibuat rapat. Goresan kedua harus

menyentuh goresan pertama dengan arah giresan yang

berbeda dan lebih renggang dari goresan yang

sebelumnya, dan goresan ketida harus lebih renggang

lagi dari goresan sebelumnya. Setiap kali akan

berpindah kuadran, jarum ose yang akan digunakan

harus dipijar terlebih dahulu. Hal ini dilakukan

agar mendapatkan hasil yang aseptis berupa mikroba

tunggal.

6. Fiksasi dilakukan sebelum pengecatan bakteri. Tujuan

dilakukan fiksasi adalah untuk mencegah

mengkerutnya globula-globula protein sel, merubah

afinitas cat, mencegah terjadinya otolisis sel,

dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak

menyebabkan perubahan-perubahan bentuk dan

strukturnya, melekatkan bakteri di atas gelas benda

dan membuat sel-sel lenih kuat/keras.