Rôle du monoxyde d'azote dans la résistance à l'insuline ...

GENEVIÈVE PILON

RÔLE DU MONOXYDE D'AZOTE DANS LA RÉSISTANCE À L'INSULINE ASSOCIÉE À

L'INFLAMMATION

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en physiologie-endocrinologie pour l' obtention du grade de Philosophiœ I)octor (Ph]).)

© Geneviève Pilon, 2008

F ACUL TÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LA V AL

QUÉBEC

2008

Résumé

La résistance à l' insuline du muscle squelettique se situe au niveau des étapes subséquentes

à la liaison de l' hormone à son récepteur. L'origine de la résis'tance à l' insuline n est pas

identifiée avec précision, bien que l'on sache qu'une association de plusieurs facteurs en

soit responsable. Parmi ces facteurs de risque, nous avons identifié la synthase inductible

du monoxyde d' azote (NO). Cette enzyme (iN OS) a la particularité de produire de fortes

concentrations de NO e'n réponse à divers stimuli inflammatoires. Les études présentées

dans cette thèse perniettent de mieux comprendre l' implication de cette enzyme dans la

résistance à l' insuline ainsi que les mécanismes d'action via lesquels le NO inhibe 1 action

de l' insuline.

Dans la première étude, nous avons confirmé dans un modèle cellulaire de muscles la

capacité de iNOS à causer un défaut du transport du glucose en réponse à l'insuline. Nous

avons toutefois également observé que les adipocytes ne développaient pas ce défaut suite à

l' induction de l' enzyme. Dans une seconde étude, nous avons cherché à comprendre le

mécanisme par lequel la production de NO pouvait être reliée à la résistance à l' insuline.

Nous avons montré que la génération d'un oxydant découlant de la synthèse de NO, le

peroxynitrite (ONOO-), causait la nitration de tyrosine de la molécule IRS-l et ainsi

interfère dans la cascade des étapes de signalisation de l' insuline. Dans une troisième étude,

nous avons démontré que l'incubation de muscles in vitro causait des altérations dans la

captation de glucose via l' induction de iNOS causée par le procédé d' incubation.

Finalement, dans une quatrième étude, nous proposons un mécanisme d'inhibition de iNOS

pouvant être mis à profit dans la recherche de cibles thérapeutiques contre la résistance à

l' insuline. Nous avons démontré que l'activati.on de la kinase sensible à l'AMP (AMPK)

réduisait l' induction de iNOS, tant au niveau cellulaire (myocytes, adipocytes et

macrophages) que dans les muscles et le tissu adipeux de rats traités à la lipopolysaccharide

(LPS). L' ensemble de nos études précise l'implication de iNOS dans la résistance à

l' insuline associée à l'inflammation et oriente la recherche vers de nouvelles pistes et un

certain nombre d'applications thérapeutiques.

Avant-Propos

Chapitre 1 : Ce manuscrit a été publié dans la revue Hormone and Metabolic Research. Pilon, G. ; Penfornis, P.; Marette, A. Nitric Oxide Production by Adipocytes: A Role in the Pathogenesis of Insulin Resistance? Horm Metab Res 2000; 32: 480-484 © Georg Thierne Verlag Stuttgart. New York Pour cette étude, j ' ai effectué la majorité des expériences en collaboration avec Patrice Penfornis. De plus, j ' ai rédigé le premier jet de l ' article.

Chapitre 2 : Ce manuscrit est en préparation. Pour cette étude, j ' ai effectué la majorité des

expériences. De plus, j ' ai rédigé le premier jet de l ' article. Il est à noter que Patrice

Dallaire, Mylène Perreault et Sonia Kapur ont aussi aidé aux expérimentations.

Chapitre 3 : Ce manuscrit est en préparation. Pour cette étude, j ' ai effectué la majorité des expériences avec l ' aide de Kathleen Lemieux. De plus, j ' ai rédigé le premier jet de l ' article.

Chapitre 4 : Ce manuscrit a été publié dans la revue Journal of Biological Chemistry (2004

May 14;279(20):20767-74). Pour cette étude, j ' ai effectué la grande majorité des

expériences avec l ' aide de Patrice Dallaire. De plus, j ' ai rédigé le premier j et de l ' article.

IV

Reinerciements

Je tiens à remercier le Dr André Marette pour sa disponibilité, son amitié et la confiance

qu' il m ' a toujours accordée. André fut un directeur de recherche extraordinaire. Je tiens à le

remercier par-dessus tout de m'avoir transmis son amour de la science. Mille fois merci !

Merci au Dr Claude H Côté. Claude fut présent tout au long de mes années d' études. Grâce

à ses encouragements, ses conseils tant scientifiques que personnels mes dernières années

d'apprentissage furent encore plus riches. Je veux également remercier les autres membres

de mon jury de thèse, soit Dr. Pascale Mauriège et Dr. André Carpentier.

Merci à tous mes collègues du laboratoire qui ont pris une place immense dans ma vie

durant toutes ces années. Ma reconnaissance va tout particulièrement à Bruno Marcotte qui

m'a beaucoup appris. Merci à Phillip James White pour sa générosité et à mes amis Marie

Julie Dubois et Frédéric Tremblay avec qui j ' ai développé une amitié qui débordera, j ' en

suis certaine, ces années d'études.

Un merci bien particulier à ma famille. À mes grandes sœurs qui m'ont toujours

encouragée. À ma mère, pour sa patience et sa persévérance, sans lesquelles je n' aurais

jamais étudié aussi longtemps. Merci à mon père qui a toujours voulu le meilleur pour moi

et m'a touj ours incitée à aller plus loin.

Merci enfin aux organismes subventionnaires qui ont rendu mes études possibles: le Fonds

FCAR-FRSQ-Santé, les Instituts de Recherche en Santé du Canada et Diabète Québec.

À mes parents et mes sœurs

Table des matières

Résumé ................................................................................................................................... ii Avant-Propos .................................................................... .................................................... iii Liste des abréviations ..................................................... ...................................................... vii Introduction ........................................................................................................................... 11

1. Diabète de type 2 .................................. ........................................................................ Il 2. Rôles et mécanismes d ' action de l ' insuline .................................................................. 12

2.1 L' insuline ................................................................................................................ 12 2.2 Le récepteur de l ' insuline (IR) ............... : ................................................................ 13 2.3 Les substrats du récepteur à l' insuline (IRS) .......................................................... 14 2.4 La phosphatidylinosito13-kinase (PI 3-Kinase) ..................................................... 15 2.5 L'AktIPKB ....................................................................................... ....................... 18 2.6 Les PKC atypiques .................................................................................................. 20 2.7 Les transporteurs de glucose: GLUT ............................................................. ......... 21 2.8 La résistance à l'insuline ......................................................................................... 26 2.9 Autres facteurs adipocytaires importants dans la sensibilité à l'insuline ................ 33

3. L' AMPK ....................................................................................................................... 37 3.1 La structure de l' AMPK ......................................................................................... 3 7 3.2 L' activation de l' AMPK .................................................. : ...................................... 39 3.3 Les modulateurs physiologiques ............................................................................. 41 3.4 Les modulateurs chimiques .......................................................................... .......... 43 3.5 Rôles de l 'AMPK ........................................................ ............................................. 45

4. Le monoxyde d' azote .................................................................................................... 50 4.1 La famille des NOS ................................................................................................. 51 4.2 La structure des NOS ............... ~ .............................................................................. 52 4.3 eNOS ....................................................................................................................... 53 4.4 nNOS ....................................................................................................................... 55 4.5 MtNOS .................................................................................................................... 57 4.6 iNOS ....................................................................................................................... 58 4.7 La résistance à l'insuline induite par la S-nitrosylation .......................................... 67 4.8 Le ONOO- ............................................................................................................... 68 4.9 L'origine du O2- •••••••.••••••••••••••••••••.••••••••••.••.••••...•••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••• 69 4.10 La nitrotyrosination ............................................................................................... 69

5. Buts de l'étude .................................................................................................................. 73 Chapitre 1. La production de monoxyde d'azote par les adipocytes : un rôle dans la pathogenèse de la résistance à l' insuline? ........................................................................... 74 Chapitre 2. L ' induction de iNOS cause la résistance à l'insuline par un mécanisme dépendant du peroxynitritre par la nitration d' IRS-1 dans le muscle squelettique ............... 92 Chapitre 3. Une incubation prolongée du muscle épitrocléaris cause l'induction de iNOS et des altérations du transport de glucose ............................................................................... 116 Chapitre 4. L ' inhibition de la synthase de NO inductible par les activateurs de la kinase activée par l'AMP (AMPK): un nouveau mécanisme anti-inflammatoire ......................... 137 Conclusion .......................................................................................................................... 165 Bibliographie ...................................................................................................................... 178

Liste des abréviations

ACC: ADP: AGEs: AMP: AMPK: API: . ATF2 : ATP: BAEC:

Acetyl-CoA Carboxylase Adenosine diphosphate Advanced glycation end products Adenosine monophsphate Kinase dépendante de l ' AMP Acti vator protein 1 Activating transcription factor 2 Adénosine triphosphate Bovine aorta endothelial cells

BH4 : Tertrahudrobiopterine BMI : Body mass index CaMKK : Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase CEACAM-1 : Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule cGMP : Cyclic guanidine monophosphate ChREBP : Carbohydrate response element binding prote in CPT -1 : Camityl plamitotransférase-1 CRP : C-reactive protein DAG : Diacylglycerol DNA-PK: DNA-dependent protein kinase EDL : Extensor digitorium longus EDRF : Endothelium-derived relaxing factor ERK : Extracellular signal-regulated kinase F AD : Flavine adenine nucleotide F AD : Flavine adénine dinucléotide FF A : Free fatty acid FMN: Flavine mononucleotide FOXO-l : Forkhead box class 0-1 G6Pase: GAPDH: GDE: GEF: Ghrelin: GLUT: GM3 : Grb10 : GSK3: GTP: HMG-Coa: HNF4: IFN: IGF: IKK:

G 1 ucose-6-phosphatase Glyceraldhéhyde phosphate déshydrogénase Glycogen-debranching enzyme GLUT 4 enhancer factor Growth hormone releasing peptide Transporteur de glucose Gangliosides Growth-factor-receptor-bound protein 10 Glycogen Synthase Kinase-3 Guanosine triphosphate 3-Hydroxy-3-methyl glutaryl-Coenzyme A Hepatic nuclear factor 4 alpha Interféron F acteur de croissance de l'insuline Kinase de iKB

IL-I et IL-6 : ILK: IR: IRAK: IRF : IRS: iKB : JAKISTAT: JIPI : JNK: KSRP: LDL: L-NAME: LPA: LPS: MAPK: MEF2: mTOR: NADH: NAPIIO: NEMO: NFKB NMDAR: NO: N02 :

N03 :

NOS: NRFl: O2- :

ONOO- : PCI: PDK: PDZ: PECAM: PEPCK: PH: PI3K: PIKfyve: PIP3 : PKA: PKB/AKT: PKC: PPAR: PPRE: PTEN: PTP: RNS:

Interleukines-l et 6 Integrin-linked kinase Récepteur de l' insuline IL-l receptor-associated kinase Interferon response factor Substrat du récepteur à l' insuline inhibiteur de NFKB Janus kinase-signal transducer and activator of transcription JNK-interacting protein-l c-Jun NH(2)-terminal kinase KR-type splicing regulatory protein lipoprotéine de faible densité NG-nitro-L-arginine methyl ester Lysophosphatidic acid Lipopolysaccharide Mitogen activated protein kinase Myocyte enhancer factor 2 Mammalian Target of Rapamycine ~-nicotinamide adenine dinucleotide phopshate NOS-associated protein-ll 0 kDa . Nuclear factor kappa B essential modulator Nuclear factor kappa B N -methy 1-D-aspartate receptor Monoxyde d'azote Nitrite Nitrate

. Monoxyde d'az9te synthase N uclear respiratory factor 1 Superxoxyde Peroxynitrite Plasma glycoprotein-l Kinase dépendante des phosphoinositides PSD/Discs-large/ZO-l Platelet endothelial cell adhesion molecule Phosphoenolpyruvate carboxylase Pleckstrin homology do main Phosphatidylinositol 3-kinase Phosphoinositide kinase for five position containing a Fyve finger Phosphoinositols (3,4,5) triphosphates Protéine kinase A Protéine kinase B Protéine kinase C Peroxisome proliferator activated receptor PP AR response element Phosphatase and tensin homologue Phosphotyrosine binding domain Reactive nitrogen species

Vll1

IX

ROS: Reactive oxygen species SH2 domain : Src homology domain SHIP2 : SHP-I : siRNA: SNFI: SNP: SOCS: SREBPlc: STAT: TAKI: TLR: TNFa: TORC2:

Tubules-T: ZMP: ZTP:

SH2 domain-containing inositol phosphatase Src homology domain 2-containing tyrosine phosphatase Small interfering RNA Sucrose non-fermenting 1 Sodium nitroprusside Supressors of cutokine signlaing . Sterol-regulatory element binding pro teins 1 c Signal transducer and activator of transcription Transforming growth factor-beta-activated kinase T 0 ll-like receptors Tumor necrosis factor a cAMP response element-binding protein (CREB) coactivator transducer of regulated CREB activity 2 Tubules transversaux 5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside monophosphate 5 -amino-4-imidazo lecarboxamide ri boside triphosphate

Liste des figures

Introduction Figure 1. Éléments de signalisation activés via le récepteur de l' insuline 25

Chapitre 1 Figure 1: iNOS' expression in white and brown adipose tissues 88 Figure 2: Effect of the iNOS inhibitor 1400W on NO production and glucose uptake in cytokines/LPS-treated 3T3-L1 white and T37i brown adi pocytes 89 Figure 3: Proposed role for adipose iNOS induction in skeletal muscle insulin resistance in obesity and inflammation 90

Chapitre 2 . Figure 1: Effect of aminoguanidine on iNOS induced insulin resistance in muscle 110 Figure 2: iNOS disruption protects mice against insulin resistance induced by LP S treatment 111 Figure 3: Effect of ONOO- and iNOS induction on basal and insulin stimulated glucose transport in L6 muscle cells 112 Figure 4: Effect of iNOS and ONOO- on IRS-1 associated PI 3-kinase activity in L6 myocytes 113 Figure 5: Effect ofONOO- and iNOS induction on IRS-1 tyrosine nitration and phosphorylation 114

Chapitre 3 Figure 1: Long-terrn incubation of muscle modulates NOS expression 132 Figure 2: Time course ofiNOS and GLUT1 induction 133 Figure 3: iNOS induction causes insulin resistance in incubated muscle 134 Figure 4: NO donor increases GLUT1 expression in L6 muscle cells 135

Chapitre 4 Figure 1: Effects of AMPK activators on NO production and iNOS expression in L6 myocytes 159 Figure 2: Effects of cytokines/LPS and AMPK activators on IRS-1 associated PI 3-kinase activity in L6 myocytes 160 Figure 3: Effects of AMPK activators on NO production and iNOS expression in 3T3-L1 adipocytes and macrophages 161 Figure 4: Effect of AICAR and metforrnin on iNOS in skeletal muscle and adipose tissue in vivo 162 Figure 5: siRNA-mediated reduction in AMPK expression reverses the inhibitory effects of AMPK activators on iNOS expression and activity 163

Introduction

Le diabète est une affection chronique résultant de l'incapacité du corps à produire

suffisamment d'insuline ou à lui répondre comme il se doit. L'insuline sécrétée par le

pancréas permet l'utilisation ou l' entreposage du glucose en circulation. Sans insuline, ou

sans son signal, les celhiles du corps -principalement celles des muscles, des tissus

adipeux et du foie - ne répondent plus adéquatement aux besoins de l'organisme causant

une augmentation du glucose en circulation. Une glycémie toujours élevée provoque la

dysfonction et la défaillance de divers organes comme les reins, les yeux, les nerfs, le cœur

et les vaisseaux sanguins.

Les études de cette thèse visent à mieux comprendre la résistance du muscle à l' insuline

observée dans le diabète de type 2.

1. Diabète de type 2

Le diabète de type 2 fait habituellement son apparition après l'âge de 40 ans et s' attaque

principalement aux gens présentant un surplus de poids. En perdant du poids, en faisant de

l'exercice ou en prenant des médicaments, beaucoup de patients surmontent la résistance à

l'insuline. Certains doivent toutefois finalement s'en remettre à des injections quotidiennes

d'insuline.

La maladie se développe souvent de la façon suivante: un état d' insulinorésistance est

d' abord observé. Même si l'insuline peut se fixer nonnalement à son .récepteur, certains

mécanismes empêchent l'insuline de transporter le glucose en circulation à l'intérieur des

cellules. Les personnes touchées produisent alors des quantités variables, voir normales ou

élevées, d'insuline. Au début, ces quantités suffisent pour surmonter cette résistance.

À la longue, le pancréas devient incapable de produire suffisamment d'insuline pour

surmonter la résistance. Ce deuxième stade entraînera donc une élévation anormale de la

glycémie après un repas: c'est ce qu'on appelle l'hyperglycémie postprandiale. Le cycle de

12

. l'hyperglycémie finit par entraver encore davantage le fonctionnement des cellules bêta du

pancréas, ce qui interrompt complètement la production d'insuline et provoque l'apparition

du diabète, comme en témoigne l'hypergly cémie à jeun ; une glycémie qui demeure élevée

durant presque toute la période où la personne diabétique est à jeun.

2. Rôles et mécanismes d'action de l'insuline

2.1 L'insuline

L' insuline est une petite hormone de 51 acides aminés produite par les cellules p du

pancréas ayant un rôle décisif sur le transport du glucose et son métabolisme, la synthèse

protéique et la régulation de plusieurs gènes. Ces effets sont régulés par un système

complexe de signalisation intracellulaire impliquant une cascade d' événements de

phosphory lation à partir de son récepteur - ci -après identifié par IR.

À la suite de la prise alimentaire, la quantité de glucose en circulation augmente et

provoque la production d' insuline par les cellules fJ du pancréas. Plus précisément, le

glucose métabolisé augmentera la quantité" d'ATP disponible, élevant ainsi le rapport

ATP/ADP. Ce rapport modifié occasionnera la fermeture des canaux potassique (K+) de la

cellule, augmentant sa charge positive. Cette modification de la charge causera la

dépolarisation des cellules, ouvrant les canaux calcium. L'augmentation de calcium

intracellulaire causera l'exocytose de l'insuline [1]. L' insuline en circulation permet alors

l' entrée du glucose au muscle et au tissu adipeux et inhibe la lipolyse de ce dernier. Au

niveau du foie, l' hormone stimule la synthèse de glycogène et inhibe la production de

glucose, contrecarrant ainsi les processus de gluconéogenèse et de glycogénolyse. Bref,

l'insuline défavorise les actions dites cataboliques au profit de l'entreposage du glucose.

Ensuite, pour occasionner ses effets métaboliques, l'insuline doit lier le IR. Cette liaison

provoque son autophosphorylation permettant ainsi son activité tyrosine kinase. Le IR

13

servira ensuite de point d ' ancrage pour, entre autres, les substrats du récepteur de l' insuline,

les protéines IRS. Une fois associés, les IRS sont phosphorylés à leur tour permettant alors

le recrutement de la sous-unité régulatrice de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-Kinase)

: la p85. Cette dernière active la sous-unité catalytique de la même enzyme: la pllO. La PI

3-Kinase, comme son nom l' indique, phosphoryle et transforme à la membrane les

phosphatidylinositols PIC 4,5)P2 en PI(3 ,4,5)P3. Ces derniers vont permettre l'activation de

la 3-phosphoinositide-dependent kinase-l (PDK-l /2) qui phosphoryle les enzymes

Akt/PKB et les PKC-Ç/À. Ces kinases conduiront à la translocation des transporteurs de

glucose GLUT4 qui réaliseront l' étape ultime: la captation du glucose. Les prochaines

sections reprennent en détails les processus moléculaires impliqués dans cette cascade

signalétique.

2.2 Le récepteur de l'insuline (IR)

La signalisation de l' insuline menant au transport de glucose de l'extérieur vers l ' intérieur

de la cellule débute alors par le contact de l' insuline à son récepteur. Le récepteur de

l' insuline est un hétérotétramère composé de deux sous-unités -a et deux ~ liées entre

elles par des liens disulfures. La sous-unité a possède une section extracellulaire et lie ainsi

l'insuline circulante, alors que la sous-unité {3 est transmembranaire et permettra la

transmission du signal intracellulaire. La liaison de l' insuline provoquera un changement

de structure du récepteur rapprochant les sous-unités a à proximité l' une de l' autre. Ce

changement de conformation permettra l' autophosphorylation des sous-unités {3. Une fois

activé, le IR pourra phosphoryler plusieurs cibles sous-jacentes dont les substrats du

récepteur à l'insuline (IRS). Le IR doit absolument être phosphorylé sur son résidu tyrosine

Y960 dans le domaine juxta membranaire pour permettre son association avec IRS-l

contenant un domaine de liaison à la phosphotyrosine (PTB) [2]. Afin d'assurer un fin

control du IR, plusieurs mécanismes assurent sa régulation négative. D'abord, la protéine

tyrosine phosphatase PTP-lB interagit directement avec le récepteur afin de diminuer son

activité [3]. D'autres protéines interagissent directement avec le récepteur, empêchant son

interaction avec ses substrats ou induisant la dégradation du récepteur. C'est le cas des

14

suppressor of cytokine signaling (SOCS-l , SOCS-6 et SOCS-3), du growth-factor

receptor-bound protein 10 (Grb 1 0) et de la plasma glycoprotein-l (PC 1) [4] [5] [6].

2.3 Les substrats du récepteur à l'insuline (IRS)

Parmi les six IRS connus, IRS-1 fut le premier à avoir été identifié [7] . Alors qu'IRS-1 et

IRS-2 sont largement distribués, IRS-3 se situe au niveau du cerveau et dans le tissu

adipeux. IRS-4 pour sa part est particulièrement exprimé dans les tissus embryonnaires

alors qu'IRS-5 et IRS-6, sont peu exprimés, et semblent jouer un rôle mineur dans la

signalisation de l'insuline [8] [9] [10] [11] [12]. Les IRS peuvent être phosphorylés sur de

nombreux résidus sérine et thréonine (possiblement une cinquantaine) ainsi que sur des

résidus tyrosine. Même si l'ensemble des fonctions de ces phosphorylations n'est pas tout à

fait comprise, on sait que généralement les phosphorylations sur tyrosine permettent la

continuité du signal par l'insuline, alors que les modifications sur sérine et thréonine

peuvent provoquer des effets surtout négatifs. Le domaine pleckstrin homology (PH) des

IRS leur permettent d' être localisés au niveau de la membrane à proximité du récepteur de

l' insuline, tandis que par leur domaine PTB, IRS-1 et IRS-2 peuvent interagir avec le

récepteur de l' insuline. Ainsi activés, les IRS peuvent relayer la cascade de phosphorylation

par l'activation d'une enzyme clé: la PI 3-Kinase. Le recrutement de cette kinase se fait par

l' association de son domaine SH2 [13]. Du côté d' IRS-1 , les sites Tyr 608 et 628 (chez le

rat) représenteraient des sites majeurs d'ancrage [14]. Malgré l'expression ubiquitaire

d ' IRS-1 et d ' IRS-2, le rôle d'IRS-1 serait de permettre les ' fonctions métaboliques de

l' i'nsuline au muscle squelettique, au tissu adipeux et, dans une moindre mesure, au foie,

alors que les rôles d' IRS-2 s' exerceraient davantage au niveau du foie et du pancréas [15]

[16]. Dans les myocytes L6, où IRS-1 et IRS-2 sont exprimés, des études utilisant la

technologie des ARN interférant, ont montré qu' IRS-l aurait un rôle majeur sur le transport

du glucose stimulé par l'insuline alors qu'une réduction importante d' IRS-2 serait sans

impact [17].

15

L'exposition prolongée à l'insuline, à certaines cytokines et aux acides gras libres active des

serine/thréonine kinases qui occasionnent la phosphorylation sur sérine d'IRS-l. Les

kinases suivantes ont été impliquées: extracellular signal - regulated kinase (ERK), la S6

kinase, la c-Jun-N-terminal kinase (JNK), la PKC theta, l'AMPK, les salt-induced kinases

(SIKI et SAK2), l ' IL-l receptor-associated kinase (IRAK) et NF-kB [18] [19] [20] [21]

[22] [23] [24] [25] [26]. Finalement, la dégradation ou l'inhibition de la traduction des IRS

exercent aussi un contrôle sur le signal conduit par l'insuline [27] [28].

2.4 La phosphatidylinositol3-kinase (PI3-Kinase)

2.4.1 Son fonctionnement et ses composantes

Découlant de l' association des IRS à la sous-unité régulatrice p85 de la PI 3-Kinase, la

sous-unité catalytique plI 0 est à son tour recrutée. Il en résulte une activation de la PI 3-

kinase. Cette kinase est essentielle à l ' exercice de plusieurs fonctions métaboliques de

l' insuline comme la translocation des transporteurs de glucose GLUT4, la synthèse de

glycogène, l' inhibition de la lipolyse et la stimulation de la synthèse protéique [29] [30]

[31] [32].

Plusieurs enzymes possèdent une activité PI 3-kinase, c'est-à-dire capables de phosphoryler

en position D-3 l' anneau inositol de phospholipides membranaires [33] [34]. Ces enzymes

regroupées dans la grande famille des PI 3-kinases sont cependant plutôt hétérogènes et ont

donc été regroupées en sous catégories sur la base de leur ressemblance, de leur séquence,

et de leur fonction.

La classe 1, composée d'une sous-unité dite régulatrice nommée p85 et d 'une autre dite

catalytique nommée plI 0, se subdivise en classes lA et lB. Panni toutes ces fonnes de PI

3-kinase, seules celles de la classe lA pennettent la translocation des transporteurs de

glucose GLUT4, l' étape ultime pennettant l ' entrée du glucose dans la cellule stimulée par

l' insuline.

16

La sous-unité p85 sert d' adaptateur pour lier la sous-unité catalytique pllO. La p85 possède

un domaine SH3 et deux domaines SH2. Ces derniers vont permettre la liaison de peptides

contenant un motif composé d'une méthionine en position + 1 et +3 en amont d'une

tyrosine phosphorylée [35] [36] [37]. Cette capacité à lier ce motif particulier lui permet de

s' associer à IRS-l [38][39]. Dans la classe lA des PI 3-kinases, trois formes de sous-unités

régulatrices ont été caractérisées à ce jour: la p85a, la p85~ et la forme tronquée p55y [36]

[39]. La raison d' être des différentes sous-unités n 'est pas encore bien définie. En effet, la .

délétion des sous-unités p85a et p85~ cause des effets surprenants puisqu' il en résulte une

plus grande sensibilité à l' insuline. Cette conséquence inattendue pourrait s' expliquer par le

fait qu'en situation normale, la sous-unité p85 est plus abondante que la plIO, on retrouve

donc la p85 sous forme de monomère et aussi associée à la plI O. En effet, la sous-unité

p1l0 est rarement retrouvée non associée à sa partie régulatrice puisque seule elle est

rapidement dégradée [40]. Dans cette situation existe alors une compétition entre les deux

formes pour lier IRS-l. En réduisant l' expression de la p85, le nombre d 'hétérodimères

composés de la p85 et de la plI 0 sera alors favorisé [41] [42] [43]. Cependant, cet effet

d'un débalancement de la sous-unité p85 ne peut pas simplement s'expliquer par un

désordre stœchiométrique puisque la surexpression des sous-unités p55a ou p50a ne cause

pas cette augmentation de la sensibilité à l'insuline malgré leur effet semblable sur la plI 0

[44]. D'un autre côté, la sous-unité p85 peut causer l'activation de JNK par un mécanisme

encore nébuleux mais indépendant de l'activité PI 3-kinase. Étant donné que JNK peut

moduler négativement la sensibilité à l'insuline (comme nous le verrons plus loin), il est

concevable qu'une diminution de la p85 puisse augmenter la sensibilité à l'insuline en

diminuant ainsi l' activation de la JNK [43]. .

Trois versions de la sous-unité catalytique de la PI 3-kinase de la classe lA sont connues:

la plI Oa, la p Il O~ et la plI 08. Cependant, seules les formes a et fJ seraient impliquées

dans les rôles de signalisation de l'insuline puisqu'elles sont exprimées de façon

ubiquitaire, alors que la forme 8 n'est pas exprimée dans les tissus' sensibles à l'insuline

[45] [46] [47].

17

Il est clairement établi que la classe 1 A est nécessaire à l' exercice de plusieurs fonctions

métaboliques de l' insuline. Cependant, il existe aussi certaines hypothèses suggérant

qu' elle n'est pas seule en cause. Par exemple, l' introduction du produit de la PI 3-kinase

soit PI(3 ,4,5)P3 --dans une cellule n ' est pas suffisante pour permettre le transport de

glucose [48]. Des études réalisées à l' aide d'un inhibiteur de PI 3-kinase -la wortmannine

- montrent, par exemple, que deux processus semblent réguler la translocation de GLUT4,

puisque seule une partie de la translocation des GLUT4 est sensible à l' inhibiteur [49] [50].

Les autres classes de PI 3-kinases ne semblent pas en mesure de produire des PI(3 ,4,5)P3 in

vivo. Elles peuvent cependant produire le PI(3)P [51] .[52] [53] [54] [55]. Il est suggéré que

le PI(3)P est aussi important pour le transport du glucose stimulé par l' insuline. Une

diminution de PI(3)P par une phosphatase spécifique aux lipides, la myotubularine,

diminue le transport du glucose par l'insuline [5-6]. Une stimulation à l'insuline cause une

augmentation des niveaux de PI(3)P dans la cellule, mais son origine n' est pas encore tout à

fait claire. Comme cette augmentation n'est pas sensible à la wortmannine, on pourrait

croire que la production de PI(3)P provient de la PI3 K -C2a : une forme résistante à

l' inhibiteur [57] [58].

2.4.2 Les mécanismes inhibant la PI 3-kinase

Comme la PI 3 .. kinase joue plusieurs rôles physiologiques importants, son activation doit

être finement contrôlée. Son inhibition s'effectue par plusieurs mécanismes. La protéine

tyrosine phosphatase PTP-l B, par exemple, permet de déphosphoryler le récepteur à

l' insuline et ses substrats ayant ainsi pour conséquence, l'inhibition de la PI 3-kinase. Il fut

proposé que l'insuline activait elle-même la PTP-1B afin de limiter son propre signal

[59][60]. Il existe par ailleurs des phosphatases ciblant directement les PI(3 ,4,5)P3 tels que

SH2 domain-containing inositol phosphatase (SHIP2) et phosphatase and tensin

homologue (PTEN), contrecarrant ainsi l'effet de l'activation de la PI 3-kinase. Si le rôle de

PTEN fut clairement démontré pour inhiber la translocation de GLUT4, celui de SHIP2 est

18

plus controversé. En effet, même si les souris SHIP2 hétérozygottes ' sont plus sensibles à

l'insuUne, des études in vitro à l'aide de petits ARN interférant (siRNA) dirigés contre

SHIP2 n'ont pas été en mesure d'augmenter la sensibilité à l'insuline d'adipocytes 3T3-L1

[61] [62]. De plus, récemment, un nouveau modèle de souris hétérozygotes de SHIP2 n'a

pas démontré une amélioration de la sensibilité à l'insuline. Cependant, sous une diète riche

en graisses, une diminution de l'expression de SHIP2 fut démontrée bénéfique [63]. D'un

autre côté, des études de notre laboratoire ont montré l' impact négatif de la sre homology

domain 2-eontaining tyrosine phosphatase (SHP-1) sur la signalisation de l' insuline au

niveau du muscle et au foie par l'utilisation de souris invalidées pour cette phosphatase. De

plus, cette étude a permis de mettre en lumière un rôle de la phosphatase dans la clairance

hépatique de l'insuline par son interaction avec la protéine Careinoembryonie antigen~

related cel! adhesion moleeule (CEACAM-1) [64].

L' activité de la PI 3-kinase peut être aussi directement inhibée par sa phosphorylation. La

phosphorylation sur la sous-unité p85 sur sérine 608 inhibe l' activité catalytique de plI Oa

et serait le résultat d'un mécanisme de rétroaction de l'insuline [65] [66]. La PI 3-kinase

pourrait aussi phosphoryler IRS-1 sur des résidus sérine dans le même but, celui de

contrôler l'action de l'insuline, du moins dans un modèle cellulaire in vitro [67]. De la

même façon, la p110p peut être phosphorylée et être ainsi inhibée in vitro ; mais la

pertinence de ce mécanisme in vivo doit encore être démontrée [68].

L' importance de la PI 3-kinase pour les effets métaboliques de l' insuline est donc

indéniable, mais les processus qui la régissent sont très complexes et demandent à être

mIeux connus.

2.5 L'Akt/PKB

L'activation de la PI 3-kinase mènera à la mise en action d'une sérine/thréonine kinase

nommée Akt ou PKB. Ce processus est réalisé en deux étapes. D'abord, la production de

PI(3 ,4)P2 et PI(3 ,4,5)P3 est nécessaire pour l'attachement de l'Akt à la membrane

19

plasmique par l' intermédiaire de son domaine PH N-terminal. Cette translocation lui

permettra de se positionner à proximité d'une kinase qui pourra la phosphoryler et ainsi

l' activer: laphosphoinositide-dependent kinase-l (PDK-1) [69].

Trois formes d' Akt sont actuellement identifiées : Akt 1, Akt2 et Akt3 (aussi nommées

PKBu, PKBp et PKBy, respectivement) [70]. Leur expression est ubiquitaire et en absence

de stimulation, elles sont situées dans le cytosol. Une fois au niveau de la membrane,

l' interaction entre le domaine PH et ~es lipides membranaires permet un changement

conformationnel de l ' Akt, démasquant ainsi le site Thr308 et la rendant apte à être

phosphorylée par PDK-1. Afin d ' être complètement active, l' Akt doit aussi être

phosphorylée sur le résidu Ser4 73. La kinase responsable de cette dernière phosphorylation

n'est pas encore clairement identifiée. Cependant, la mitogen-activated protein kinase

activated protein kinase 2 (MAPKAPK2) , l'integrin-linked kinase (ILK) , la DNA-dependent

protein kinase (DNA-PK) et le complex rictor-mTOR complex 2, peuvent phosphoryler Akt

sur ce résidu sérine in vitro; il pourrait donc s'agir de candidats potentiellement

responsables de la phosphorylation in vivo [71] [72] [73] [74] [75].

En plus de ces deux sites de phosphorylation bien décrits, l'Akt serait aussi phosphorylée de

façon constitutive sur la sérine 124 et la thréonine 450 et l'activité de la kinase pourrait

aussi être régulée par sa phosphorylation sur tyrosine Y315 et Y326 [76].

Plus récemment, une étude a suggéré la présence de deux nouveaux sites de

phosphorylation responsables de l'activité de l'Akt : la thréonine 72 et la serine 246. Ces

sites seraient phosphorylés par l'Akt elle-même par autophosphorylation et seraient

responsables de l'activité de base de la kinase mais pourraient aussi être stimulés par des

facteurs externes [77].

Akt aura par la suite plusieurs fonctions. Le premier rôle physiologique de l'Akt à avoir été

rapporté fut la synthèse de glycogène par la phosphorylation et l'inactivation de la

glycogène synthase kinase 3 (GSK3). Lorsque cette dernière est inactivée, elle lève une

inhibition sur la glycogène synthase (GS) permettant ainsi son activation [78]. L'Akt a

20

aussi pour cible le facteur FOXO-l. Une fois modifié par la kinase, ce facteur de

transcription est exclus du noyau; il en découle qu' il ne peut plus permettre l'expression

des gènes de la phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPCK) et la glucose-6-phosphatase

(G6Pase), deux enzymes importantes dans la gluconéogenèse [79].

Par ailleurs, le lien subséquent entre l'Akt et la translocation de GLUT4, quoique toujours

un peu nébuleux, se clarifie peu à peu [80] [81]. D'abord, l'AS 160 ou (Fre-2/Bub2/Cdc16)

domain fami/y, member 4 (TBC 1 D4), 'qui serait le substrat le plus abondant de l' Akt, a un

poids moléculaire de 160kDa et possède une activité Rab GTP-ase. Cette protéine serait

impliquée dans la translocation des transporteurs de glucose GLUT4. L'AS 160 est

phosphorylée en réponse à l'insuline sur cinq sites ayant le motif ciblé de l'Akt [82]. En

condition basale, l'AS160 pourrait retenir les vésicules GLUT4 dans la cellule. Cependant,

lorsque l'insuline occasionne la phosphorylation de l' ~S 160 par l' intermédiaire de l' Akt,

cette dernière se dissocierait des vésicules GLUT4 permettant leur exocytose [83]. Un

défaut d'expression de l'AS160 ne serait pas en cause chez les diabétiques de type 2 mais

la phosphorylation de la protéine en réponse à l'insuline serait par contre réduite. De plus,

comme AS 160 est une protéine possédant une activité Rab GTP-ase, plusieurs membres de

la famille des Rab pourraient être impliqués dans le processus de translocation des GLUT4 ·

[84] [85]. Il est à noter que la contraction musculaire occasionne aussi la phosphorylation de

l'AS160 et permettrait ainsi la translocation de GLUT4 et le transport du glucose [86].

Finalement, phosphoinositide kinase for five position containing a Fyve finger (PIKfyve)

et Synip seraient aussi activées par l'insuline en fonction de l'Akt et pourraient aussi être

impliquées dans la translocation de GLUT4 [87] [88].

2.6 Les PKC atypiques

Parmi les trois classes de protein kinase C (PKC) existantes - conventionnelles (u, p, y),

nouvelles (8, E, v, 0) et atypiques (À, Ç) -, seules les dernières sont activées par l'insuline.

Ces PKC sont qualifiées d'atypiques puisque, contrairement aux formes classiques, elles

21

n'ont pas besoin de diacylglycérol ni de calcium pour leur activation [89] [90]. Elles sont

cependant, sensibles à la présence de PI(3 ,4,5)P3, produit de la PI 3-kinase [91] .

L' interaction entre les PI (3 ,4,5)P3 et les PKC atypiques occasionnera un changement de

conformation, ce qui les rendra sensibles à la phosphorylation par PDKI.

Tout comme l'Akt, les PKC atypiques semblent importantes pour permettre la translocation

des GLUT4 par l' insuline et rendre possible le transport du glucose. Plusieurs études

témoignent de leur importance dans ce processus. D'abord, la surexpression d'une forme

constitutivement active ou sauvage des PKC,,) Ç dans des cellules de muscles ou de tissu

adipeux mime l'action de l'insuline sur le transport de glucose alors que la présence de

dominant négatif produit l'effet contraire [92] [93]. Une autre étude montre que

l'expression de PKCÂ rétablit le transport du glucose stimulé par l' insuline dans des

cellules invalidées pour cette kinase. À l' opposé, une diminution de l' expression des deux

formes atypiques à l' aide de petits ARN interférant dans des adipocytes 3T3-L1 n' a pas

suffi à produire un défaut de stimulation de transport de glucose par l' insuline [94]. Il est à

noter cependant, qu'un défaut d'activation de PKC atypique chez l'humain diabétique de

type 2 de même que chez l'humain obèse intolérant au glucose a été observé [95] [96] [97].

Il faudra donc chercher encore avant d' établir la contribution exacte des PKC atypiques

dans le transport du glucose stimulé par l'insuline.

2.7 Les transporteurs de glucose: GLUT

L'un des objectifs ultimes de cette cascade de signalisation provoquée par l'insuline est de

permettre l 'entrée du glucose dans les cellules.

La membrane lipidique des cellules étant imperméable aux molécules comme les hydrates

de carbone, le transport du glucose doit s' effectuer par l' intermédiaire de transporteurs

particuliers, les GLUT. Jusqu'à maintenant, quatorze membres de la grande famille des

transporteurs de glucose ont été caractérisés. Ces protéines sont le produit de gènes

différents possédant des caractéristiques particulières au niveau de leur localisation

22

tissulaire et cellulaire, de leur affinité pour le glucose et de leur .expression en réponse à

certains facteurs particuliers. Grâce à leur diversité et à leurs caractéristiques, les GLUT

pennettent un fin contrôle de l'homéostasie glucidique. La grande famille des GLUT est

subdivisée en trois classes. La classe 1 regroupe les isofonnes les plus caractérisés :

GLUT1 , GLUT2, GLUT3 et GLUT4. La classe II inclut le transporteur de fructose

GLUT5, ainsi que trois autres protéines semblables: GLUT7, GLUT9 et GLUT11. La

classe III, enfin, est composée de GLUT6, GLUT8, GLUT10, GLUT12 et HMIT

(cotransporteur de proton/myoinositol) [98].

GLUTI fut identifié à l ' origine dans les érythrocytes, mais on sait aujourd hui qu' il est

exprimé de façon constitutive dans la plupart des tissus. Cet isofonne est responsable du

transport basal de glucose. GLUT2 est exprimé dans les cellules épithéliales de l'intestin,

aux reins, dans les hépatocytes et dans la membrane plasmique des cellules insulino

sécrétrices du pancréas et dans certaines régions de l'hypothalamus. La localisation

tissulaire de GLUT2 laisse supposer que ce transporteur joue un rôle majeur dans le

transport trans-épithélial du glucose au niveau de l'intestin et du rein [99]. Au niveau des

cellules f3 du pancréas, il pennet un équilibre rapide du glucose entre les espaces extra et

intracellulaires contrôlant ainsi la sécrétion de l'insuline [100]. Le rôle hypothalamique de

GLUT2 n'est pas connu avec précision. Il pourrait cependant intervenir dans les

mécanismes de détection des neurones sensibles au glucose contrôlant la satiété [101]. Au

niveau du foie, GLUT2 est nécessaire aussi bien au captage du glucose qu'à son

relâchement dans le sang au cours du jeûne. L'absence de GLUT2 induit chez la souris un

phénotype diabétique [102]. GLUT3 pour sa part est le principal transporteur de glucose

dans les neurones [103]. GLUT4 est présent dans le muscle et le tissu adipeux et est

responsable du transport de glucose en situation postprandiale et lors de l'exercice [104].

Comme les isofonnes 1 et 4 sont les principales responsables du transport de glucose basal

et en réponse à l'insuline au muscle, j'approfondirai davantage leurs caractéristiques et leur

régulation.

----------,

23

2.7.1 GLUTI

Le transporteur de glucose GLUT1 fut le premier à être cloné. Même si GLUT1 est

responsable du transport basal de glucose, son expression et son activité peuvent varier.

GLUT1 peut être considéré comme une protéine de stress. Il est en effet conce~able qu' en

situation stressante les cellules aient rapidement besoin de glucose et que GLUT1 permette

de répondre à ce besoin. Dans des cellules de muscle L8 en culture, la présence

d' ionophore de calcium, de 2-mercaptoethanol ou de tunicamycine, cause une forte

augmentation de l' expression de GLUT1 [105]. GLUT1 peut aussi être induit par les

concentrations environnantes de glucose. Ainsi, l' expression de GLUT1 augmente dans des

hépatocytes en culture maintenus dans un milieu à concentration de glucose sous la

normale et au foie de rats à jeun [106]. Le même phénomène est observable dans une

culture de cellules de muscles L6 en absence de glucose pour une période prolongée [107].

La dénervation de certains muscles peut aussi augmenter l' expression de ce transporteur

[108]. La présence de NO peut contribuer à l'induction de GLUT1 dans différents tissus.

Dans des cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC), la présence de

deux donneurs de NO différents, SNP et DETA, augmente l' expression de GLUT1 [109].

De plus, une étude de notre laboratoire a démontré que l' ajout de cytokines et de

l' endotoxine LPS dans le milieu de culture de cellules de muscles L6 augmentait

l ' expression de GLUT1 et que la présence d'un inhibiteur de NOS bloquait cette induction,

suggérant l' implication du NO dans cet effet [110]. De plus, l'hypoxie, le choc osmotique

. et certains éléments tels le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) et le TNF a

peuvent causer une augmentation de l'expression de GLUT1 [111] [112] [113] [114].

Finalement, le stress oxydatif pourrait aussi induire l'expression de GLUT1. En effet, le

stress oxydatif est reconnu pour moduler certains facteurs de transcription tel que l' AP l , un

facteur impliqué dans la régulation de ce transporteur de glucose [115]. Des études

réalisées dans les myocytes L6 de même que dans des adipocytes 3T3-L1 démontrent qu'un

stress oxydatif imposé pendant dix-huit heures par le H202 cause d'ailleurs l'induction de

GLUT1 [113].

Il semble par ailleurs que l'activité intrinsèque des GLUT1 puisse être modifiée par un

mécanisme impliquant l'AMPK (Les rôles de cette kinase seront discutés ultérieurement).

24

En effet, dans des cellules épithéliales de foie de rat (clone 9 ceUs) , le transport basal de

glucose par GLUTI est augmenté lors d'un stress osmotique par un mécanisme mal défini,

mais qui ferait en sorte que le transporteur de glucose serait démasqué et, ainsi, plus apte à

lier le glucose [116].

2.7.2 GLUT 4

En présence d' insuline, le glucose pénètre dans le muscle et le tissu adipeux à l' aide des

transporteurs GLUT4. Pour cela, les transporteurs GLUT4 doivent rapidement gagner la

surface des cellules. Au niveau du muscle squelettique, il a été démontré qu'en plus de l~

membrane plasmique, l'insuline induisait la translocation de GLUT4 au niveau d'un second

compartiment de surface, les tubules-T [117] [118]. Ces transporteurs sont en lent transit

continuel entre le cytoplasme et la membrane plasmique et ce processus est accéléré en

présence d ' insuline [119]. D'un autre côté, l' exercice va aussi permettre l' entrée de glucose

par le déplacement des transporteurs GLUT4 à la membrane plasmique et aux t-tubules

[120][121]. Dans le cytosol, les transporteurs de glucose GLUT4 se retrouvent associés à

des vésicules et la production de ces vésicules enrichies de GLUT4 est augmentée par la

présence d' insuline [122].

Pour que cette translocation des GLUT4 ait lieu dans les cellules musculaires, les filaments

d 'actine de .la cellule doivent se réorganiser en réponse à l'insuline. En présence d' agents

pharmacologiques bloquant ce processus de remodelage, la translocation des GLUT4 est

presque totalement abolie dans les cellules de muscles et en partie diminuée dans les

adipocytes [123] [81][124] [125] [126] [127] [128]. Cependant, tel qu'abordé dans la

section du rôle de la PI 3-kinase dans l'action de l'insuline, la simple translocation des

GLUT4 ne semble pas suffisante pour permettre l'entrée du glucose dans la cellule. En

effet, la présence de PI(3,4,5)P3 permet la translocation des GLUT4 à la membrane mais

cela ne suffit pas à provoquer la réponse normale de l' insuline [129] [130] [131]. De plus,

dans des cellules de muscles, la présence d'une faible concentration de wortmannine, un

inhibiteur de la PI 3-kinase, inhibe davantage le transport du glucose que la translocation

des GLUT4. Pour inhiber les deux processus, il faut utiliser une dose plus importante de

25

l' inhibiteur [132]. L' étape subséquente pourrait être la dissociation d'une protéine

inhibitrice associée à GLUT4 ou un changement conformationnel. Il fut proposé que,

malgré la translocation du transporteur en présence de PI(3 ,4,5)P3 ajouté de façon

artificielle, sa section C-terminale ne serait pas insérée dans la membrane - comme c' est

le cas à la suite d'une stimulation par l' insuline [129].

Grâce à des inhibiteurs pharmacologiques, certains résultats suggèrent que l' activité des

transporteurs serait sous le contrôle de la voie p38 MAPK. Des études récentes, réalisées à

l' aide de la technologie d ' interférence à l 'ARN, n'ont cependant pas permis de confmner la

responsabilité de cette avenue de signalisation [133] [134].

Les résultats probants de plusieurs rech~rches démontrent que les GLUT 4 seraient

déterminants dans la sensibilité à l'insuline. Dans le muscle, la résistance à l'insuline serait

principalement due à l'incapacité de recruter les GLUT4 à la membrane en réponse à

l'insuline, alors qu'au niveau du tissu adipeux, l'express,ion réduite des transporteurs serait

plutôt en cause. De plus, des souris invalidées pour l'expression de GLUT4 spécifiquement

dans le tissu adipeux deviennent résistantes à l'insuline au niveau muscles et au niveau foie

indiquant l'importance de ce transporteur de glucose dans la sensibilité à l'insuline [135].

Dans le même ordre d' idée, l' absence de GLUT4 spécifiquement dans le muscle cause,

chez la souris, la résistance à l' insuline dans ce tissu [136] [137].

26

GlUT

Glycogen synthestSJ PP1

Gen~SSion

Figure 1 : Représentation schématique de certains éléments de signalisation intracellulaire

activés via le récepteur de l' insuline et impliqués dans la translocation de GLUT4.

Adapapté de la page internet du Dr Arun Srinivasan .

http://arunbt.googlepages. com/pi3k.jpg

2.8 La résistance à l'insuline

Lorsque la résistance à l ' insuline s'installe, l'hormone ne peut agir aux tissus normalement

sensibles à l'hormone qui sont" résistants" à son action. Ceci oblige le pancréas à produire

de plus en plus d' insuline pour compenser. Le pancréas finira ultimement par se fatiguer et

par ne plus fournir assez d' insuline entraînant alors l ' apparition du diabète de type 2 [138].

La source de la résistance à l'insuline n'est pas identifiée avec précision, mais on devine

qu'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux est en cause. L'adiposité

est définitivement un facteur associé à la résistance à l'insuline. Il est bien établi que

l'accumulation excessive de tissu adipeux mène à la sécrétion de cytokines et des

27

hormones; les adipokines. À une époque où la nourriture se faisait rare, quand il fallait

chasser pour se nourrir et souffrir de longues périodes de jeûne, il était utile - voire

nécessaire - de mettre en réserve les graisses. Mais, aujourd'hui, alors que la noUrriture

est généralement disponible et l'exercice, la dépense d' énergie, moins répandus, l'obésité

est un tueur redoutable.

2.8.1 Rôle de l'inflammation dans la résistance à l'insuline

La survie des organismes dépend largement de l'habileté qu' ils ont à se défendre contre les

infections au moyen de leur système immunitaire; mais ce même processus, lorsqu' il est

mal contrôlé, peut conduire à la résistance à l'insuline. L'obésité peut désormais être

considérée comme une maladie inflammatoire. En effet, plusieurs études d'expression de

gènes démontrent, une nette induction de différents facteurs inflammatoires et de stress

dans le tissu adipeux de modèles d'animaux obèses [139] [140] [141].

2.8.1.1 Les cytokines pro-inflammatoires

Une augrpentation de la concentration de tumor necrosis factor a (TNFa) en circulation

peut, de différentes manières, causer la résistance à l'insuline. ' On a d'abord observé

l'augmentation de cette cytokine dans le tissu adipeux du rongeur au moyen de différents

modèles d'obésité [142] [143]. La présence de TNFa fut ensuite retracée dans le tissu

adipeux et le muscle de sujets humains obèses [144] [145] [146]. Bien que les adipocytes

en soit produisent du TNFa, on sait aujourd'hui que les macrophages infiltrant le tissu

adipeux d ' animaux obèses seraient les grands responsables de cette production massive

[147]. Le lien entre la TNFa et la résistance à l'insuline fut établi lorsque l'on a observé que

l'administration de TNF a à des animaux ou à des cellules musculaires en culture causait la

résistance à l'insuline. Plus convaincant encore est le fait que l'expression transgénique

d ' une forme non fonctionnelle du TNFa ou de son récepteur chez les souris obèses leur

procure une protection contre la résistance à l'insuline [144] [148].

28

Le TNFa est aussi en mesure de causer la phosphorylation d'IRS-l sur la sérine 307 (sérine

312 chez l'humain). Cette modification d'IRS-l est associée à une réduction de la

phosphorylation sur les résidus tyrosine d'IRS-l , ce qui diminue à son tour son association

avec IR [149]. En plus d'être associé à la phosphorylation de la sérine 307 d'IRS-l , le

TNFa peut causer la phosphorylation sur la sérine 632 d'IRS-l qui se trouve à proximité du

site de liaison de ' la PI 3-kinase. Le fait que cette phosphorylation soit sensible à la

rapamycine - un inhibiteur de mTOR (mammalian target of rapamycin) - sous-entend

que cette voie est concernée dans cet effet du TNFa [150]. Une étude récente montre que

les facteurs myosin le (Myolc) et nuclear factor kappa B essential modulator (NEMO)

seraient aussi essentiels pour l'effet du TNFa sur la phosphorylation sur sérine 307 d IRS-l

[151]. Le TNFa peut aussi diminuer l'expression d'IRS-l et l'expression des GLUT4 [152]

[153]. Finalement, un nouveau mécanisme détériorant le métabolisme de glucose par

l'action de cette cytokine fut récemment- établi. Dans les circonstances de l ' étude, la

présence de TNFa causait l'induction de la phosphatase 2C inhibant l'activation de l'AMPK

causant la résistance à l'insuline [154]. L'importance de cette kinase sera discutée

ultérieurement.

Cette cYtokine peut aussi être indirectement responsable de la résistance à l'insuline. Étant

un facteur inflammatoire, le TNFa peut, par exemple, conduire à la production d'autres

cytokines telles que l'interleukine-6 (IL-6) [155]. Le TNFa provoque également la lipolyse

des adipocytes, ce qui a pour effet d ' augmenter la quantité d'acides gras libres en

circulation et altérer la sensibilité à l'insuline [156]. Le rôle de ces facteurs dans la

résistance à l'insuline sera examiné ultérieurement dans cette section.

Le TNF a contribue encore à la résistance à l'insuline par la production de céramides. Il

active la sphingomyélinase, ce qui dégrade les sphingolipides et a, à son tour, pour effet de

produire des céramides [157]. Cette production de céramides serait associée à la

phosphorylation d'IRS-l sur sérine. Les céramides peuvent aussi causer la résistance à

l'insuline en interférant avec la translocation de l'Akt à la membrane plasmique et par la

déphosphorylation d'Akt par l'activation de la protéine phosphatase 2A [158] [159] [160]. Il

29

faut noter, incidemment, que la quantité de céramides retrouvée au niveau des muscles de

patients obèses est deux fois plus élevée que celle observée chez des sujets normaux [161].

Le TNFa peut aussi causer la résistance à l'insuline, du moins dans les adipocytes 3T3-L1 ,

en augmentant la présence de gangliosides (GM3). Les GM3 se situent dans des

microdomaines de la membrane plasmique et sont reconnus pour causer la résistance à

l'insuline dans les adipocytes [162]. Des souris génétiquement modifiées, incapables de

produire de GM3 , sont plus sensibles à l'insuline et sont protégées contre la résistance à

l'hormone induite par une diète riche « en gras» [163]. Il est aussi important de noter que le

TNF-u est un facteur contribuant à l' induction de iNOS, un joueur majeur dans la résistance

à l' insuline [164][165]. Les effets de cette enzyme et de son produit; le NO seront discutés

en détail dans une section ultérieure. Finalement, le TNFa bloque la production

d'adiponectine, une adipokine favorisant la sensibilité à l'insuline [166].

En dépit de, l'implication du TNFa dans la résistance à l'insuline, son rôle dans cette

pathologie chez l'humain reste controversé puisque la neutralisation de cette cytokine chez

des sujets diabétiques n'a pas permis d'améliorer la sensibilité à l'insuline et ce d'autant plus

que certaines différences distinguent le TNF a du rongeur et de l'humain [167]. En effet,

contrairement à ce qui est observé chez le rongeur, le TNFu ne serait pas relâché dans la

circulation à partir du tissu adipeux chez l'humain [168].

Outre le TNF -u, plusieurs autres cytokines pro-inflammatoires seraient impliquées dans la

résistance à l ' insuline c' est le cas de l'IL-1 et l'interféron-y qui sont surexprimés dans le

tissu adipeux de sujets humains obèses [144]. Des études chez l'humain ont aussi montré

que les cellules du tissu adipeux pouvaient aussi produire de l'IL-6. La présence de l ' IL-6

est augmentée avec l'indice de masse corporelle et le degré de résistance à l'insuline [169].

Cette cytokine a des effets directs sur la signalisation de l'insuline dans les adipocytes et les

hépatocytes [170]. L'IL-6 diminuerait l'activité d'IRS-1 , possiblement par l'activation de

supressor of cytokines signaling (SOCS-3) [171]. Comme c'est le cas pour le TNFa, l'IL-6

aurait des effets indirects sur la sensibilité à l'insuline par la stimulation de la lipolyse et la

libération d'acides gras [172]. C'est le cas chez l'humain où l'administration d'IL-6

30

augmente la lipolyse et inhibe le métabolisme du glucose [173]. Cela dit, les effets de l ' IL-

6 sur le métabolisme sont d ' autant plus complexes que les souris invalidées pour le gène de

l ' IL-6 deviennent obèses. Cette cytokine agirait au niveau central afin de contrôler la

dépense énergétique [174]. De plus, chez l 'humain, les niveaux d ' IL-6 dans le liquide

cérébrospinal sont inversement proportionnels au degré d ' obésité [175]. Le rôle de l' IL-6

dans la résistance à l'insuline demande donc à être mieux compris.

Plusieurs autres facteurs inflammatoires sont induits par l'obésité. Parmi les autres facteurs

inflammatoires possiblement impliqués dans la résistance à l' insuline, on a identifié l'acide

sialic et la protéine C-réactive [176] [177]. L ' apeline, une adipokine, est également induite

dans différents modèles d ' obésité ainsi qu'en réponse au TNFa dans les adipocytes. Le rôle

de cette dernière dans la sensibilité à l' insuline n ' a cependant pas clairement défini pour le

moment [1 78].

2.8.1.4 Le rôle des macrophages dans la résistance à l'insuline

Le tissu adipeux blanc se compose principalement d'adipocytes ; mais on y retrouve aussi

d'autres types de cellules, dont les macrophages. Le nombre de macrophages retrouvé dans

le tissu adipeux blanc est proportionnel à l'adiposité et à la grosseur des adipocytes ; tant

chez l'humain que chez les rongeurs [179] [141]. Bien qu' il y ait de nombreuses similitudes . entre les macrophages et les adipocytes - les préadipocytes pouvant même se différ·encier

en macrophages - , l'augmentation du nombre de macrophages associée à l'obésité provient

de la moelle osseuse, il s'agit donc de macrophages infiltrants [180]. Cette accumulation de

macrophages pourrait être impliquée dans la résistance à l'insuline et ce d'autant plus

qu'elle est la 'source majeure de TNFa et serait responsable d'environ 50 % de la

production d'IL-6 [141]. Une étude récente a suggéré que la présence des macrophages

dans le tissu adipeux serait cyclique et aurait pour but la réorganisation du tissu adipeux en

débarassant celui-ci des adipocytes morts; trop gros, laissant place à de nouveaux

adipocytes plus petits. Encore dans cette étude, le lien entre la résistance à l'insuline et la

31

présence des macrophages est souligné puisque le moment fort de leur occupation du tissu

adipeux correspond aux périodes de résistance à l ' insuline plus marquée de l' animal [181].

2.8.2 Les mécanismes moléculaires de la résistance à l'insuline

Les facteurs impliqués dans la résistance à l'insuline iront activer certaines VOles

contrecarrant la signalisation de l'insuline à divers niveaux.

2.8.2.1 La sérine/thréonine kinase c-jun N-terminal kinase: JNK

Puisque la phosphorylation d'IRS-1 sur les résidus sérine cause souvent une diminution de

son activité, beaucoup de recherches se sont intéressées à des kinases capables d' agir sur

ces résidus. On a par exemple cherché à établir le rôle que pourrait jouer la sérine/thréonine

kinase c-jun N-terminal kinase (JNK) dans la résistance à l'insuline en regard de l'obésité.

On a ainsi observé que l'activité JNK était anormalement élevée dans le foie, le muscle et le

tissu adipeux de modèles murins diabétiques de type 2. Des souris invalidées pour le gène

JNK sont par ailleurs protégées contre l'obésité et la résistance à l'insuline induite par une

diète riche en lipides [26]. La résistance à l'insuline associée à l'activation de JNK serait

due à la phosphorylation de IRS-1 sur la sérine 307 [182]. Cependant, puisque ces souris

sont aussi résistantes à l'obésité, il a été difficile de déterminer si JNK est vraiment en cause

dans la sensibilité à l'insuline observée ou si le responsable de cet effet ne serait pas plutôt

la résistance au gain de poids. Des études récentes sont cependant venues confirmer le rôle

de JNK dans la résistance à l' insuline. On a pu démontrer en effet que la surexpression d'un

adénovirus dominant négatif contre JNK au niveau du foie de souris obèses et résistantes à

l'insuline améliore clairement leur sensibilité à l'hormone en supprimant la production de

glucose hépatique et ce, sans modifier l'adiposité [183]. De plus, JNK doit s'associer à une

protéine no'mmée JNK-interacting protein-l (lIP 1) pour avoir une activité normale. Les

souris n'exprimant pas le gène lIP1 sont donc, elles aussi, plus sensibles à l'insuline [184J.

32

Finalement, une récente étude a démontré que l' absence de JNK 1 spécifiquement des les

cellules hématopoïétiques protégeait contre la résistance à l ' insuline induite par une diète

riche en «gras» sans modifier l' adiposité [185]. Dans un même ordre d' idée, il est

intéressant de noter que la voie JNK serait importante dans l' activation par les acides gras

libres des macrophages infiltrant le tissu adipeux d' animaux soumis à un régime riche en

« gras » [186] .

. 2.8.2.2 La sérine/thréonine kinase :IKKp

La kinase IKK~ est responsable de la phosphorylation de IKB qui permet l'activation du

facteur de transcription NF -KB. Cette kinase aurait aussi un rôle à jouer dans la résistance à

l'insuline puisqu' il a été démontré que les souris hétérozygotes pour IKK~ sont

partiellement protégées contre la résistance à l'insuline induite par une infusion de lipides,

une diète riche en « gras» ou par une modification génétique les rendant obèses [187]

[136]. De plus, une étude a démontré que des souris invalidées pour le gène IKK~

spécifiquement dans les cellules myéloïdes étaient complètement protégées contre la

résistance à l' insuline associée à une diète riche en « gras », à l' obésité ou au vieillissement

[188]. IKK~ pourrait avoir cet impact sur la sensibilité à l'insuline en activant le facteur de

transcription NF-KB, permettant ainsi la production d'autres facteurs inflammatoires [189]

[190].

2.8.2.3 Stress du réticulum endoplasmique : ER stress

On a récemment émis l' hypothèse que l'obésité surchargeait les capacités du réticulum

endoplasmique, ce qui y causerait un stress, le ER stress. Ce stress cellulaire contribuerait à

la résistance à l'insuline en activant des voies inflammatoires telles que JNK [191]. Le ER

stress ~st causé par une accumulation au réticulum endoplasinique de protéines mal formées

et une protéine chaperone, la ORP150, permettrait de réduire ce stress. Dans un modèle

murin diabétique de type 2, la surexpression de ORP150 améliore d'ailleurs la sensibilité à

33

l'insuline au niveau du foie et du muscle [192]. Il fut aussi proposé que les inhibiteurs de

protéases utilisés contre le HIV causaient comme effet secondaire la résistance à l' insuline

en surchargeant le reticulum endoplasmique de protéines qui auraient dues être dégradées

[193]. Dans des cellules adipeuses 3T3-L1 , une augmentation du ER stress fut aussi associé

à une induction de iNOS ce qui pourrait contribuer à la résistance à l' insuline (le rôle de

iNOS dans la résistance à l' insuline sera discuté ultérieurement) [194].

2.8.2.4 Suppressors of cytokine signaling (SOCS)

Les SOCS sont activés par des cytokines dont IL-l , IL-6, TNFa et IFNy. Elles ont pour

objectif de limiter la suractivation des récepteurs des cytokines mais sont également

étudiées en regard de leur éventuelle implication dans la résistance à l'insuline associée à

l'inflammation [195]. On a ainsi pu établir que les SOCS-1 ,3 et 6 peuvent interagir avec

IRS-1 , bloquant ainsi sa tyrosine phosphorylation et son association avec la PI 3-kinase

[196] [197] [198]. L'interaction des SOCS avec IRS-1 et IRS-2 peut aussi avoir pour effet

de les diriger vers les protéosomes afin de les dégrader [199] [4].

2.9 Autres facteurs adipocytaires importants dans la sensibilité à l'insuline

2.9.1 Adiponectine

L'adiponectine, aussi connue sous le nom de Acrp30 et AdipoQ, est réduite dans le ,diabète

de type 2 [200]. Une réduction des niveaux d'adiponectine chez les individus en santé est

d'ailleurs une prédisposition à la . résistance à l'insuline [201]. Plusieurs études montrent

qu'une diminution de l'adiponectine est associée à une augmentation de l'indice de masse

corporelle et à une augmentation du taux de glucose, d'insuline et de triglycérides sanguins

34

tant chez l'humain que chez le rongeur [202]. Cette hormone, exclusivement sécrétée par

les adipocytes, est formée d'une section collagène et d'un trimère globulaire.

L'adiponectine se retrouve en différents complexes. Dans le sérum, l'adiponectine peut être

exprimée sous la forme d'un dimère de trimère (la forme de bas poids moléculaire LMW

camplex) ou sous celle, plus large, de 12 à 18 sous-unités [203] [204]. On comprend

aujourd'hui que le rapport de ces deux formes est plus important que leur quantité

respective pour prédire la sensibilité à l'insuline. L'adiponectine favorisera la sensibilité à

l'insuline par différents moyens. Cette adipokine diminue l'expression de deux enzymes

clés de la production de glucose par le foie : la glucose-6-phosphatase (G6Pase) et la

phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK). L'adiponectine augmente le transport de

glucose dans le muscle et l'oxydation des acides gras. Elle favorise l'expression d'UCP2 et

d'UCP3 ; ce qui a pour effet d' augmenter la dépense énergétique [205].

2.9.2 La résistine

La résistine fut d'abord décrite comme une adipokine puisqu'elle fut isolée d'adipocytes.

Alors que chez les rongeurs, la principale source de résistine est l'adipocyte, ce sont plutôt

des macrophages dans la circulation sanguine qui en sont responsables chez l'humain[206].

La résistine tient son nom du fait que chez la souris, son injection cause une intolérance au

glucose et une diminution de la sensibilité à l'insuline. D'ailleurs, l'administration

d'anticorps neutralisant l'hormone réduit l'hyperglycémie de souris induite par une diète

riche « en gras» [207]. Le foie serait une cible déterminante dans la résistance à l'insuline

induite chez l'animal par la présence de ce facteur [208]. Chez l'humain, par contre, le rôle

de la résistine dans la résistance à l'insuline est ambigu.

2.9.3 La leptine

La leptine est une hormone majeure dans le métabolisme glucidique et lipidique. Il n'y a

pas actuellement de preuve d'un effet direct de la leptine sur la signalisation de l'insuline,

35

mais plusieurs des effets de l'hormone profitent indirectement à la sensibilité à l'insuline. La

leptine permet, par exemple, de réduire l'appétit, d'augmenter la dépense énergétique et de

stimuler l'oxydation des lipides au niveau du foie et du muscle. Les souris dont le gène de

la leptine (ob/ob) ou du récepteur de la leptine (db/db) est éliminé deviennent obèses. Ces

modèles sont très utiles pour la recherche sur le métabolisme. Chez ces animaux déficients

en leptine, on observe une susceptibilité aux infections, suggérant que l'hormone joue aussi

un rôle anti-inflammatoire [209].

2.9.4 Les acides gras libres

Dans les cas d'obésité, il y aura accumulation excessive de « gras» dans le tissu adipeux,

mais aussi dans le muscle squelettique et le foie, et une augmentation d'acides gras libres en

circulation. La concentration d'acides gras libres est directement liée à l'hyperglycémie, la

résistance à l'insuline au niveau du muscle et le risque de développer le diabète de type 2

[210].

À l'origine, le groupe de Randle expliqua que la résistance à l'insuline induite par les acides

gras libres provenait de la compétition entre l'utilisation du glucose et des acides gras par la

cellule. Leur hypothèse avait pour prémices le fait qu'en situation d'abondance d'acides

gras, la cellule les oxyde préférentiellement et cause une accumulation de citrate, ce qui a

pour effet d' inhiber la phosphofructokinase (PFK) et de causer, par voie de conséquence,

une accumulation de glucose-6-phosphate dans la cellule [211]. Randle et son groupe

proposèrent donc que l'accumulation de ce glucose intracellulaire causerait une inhibition

de l'entrée supplémentaire de glucose. Ce mécanisme de résistance à l'insuline fut revu par

le groupe de Shulman [212] [213]. Cette équipe démontra que les acides gras libres chez

l'humain causaient une diminution de la synthèse de glycogène au niveau du muscle

squelettique en raison d'une réduction de la quantité de glucose-6-phosphate dans la

cellule. On a donc compris qu'une diminution de l'entrée de glucose dans la cellule, plutôt

que son accumulation, était à l'origine du défaut induit par les acides gras libres [214].

36

Au ruveau du muscle squelettique, différents mécanismes expliquent la résistance à

l'insuline induite par les acides gras libres. Comme les PKCs (mis à part les formes

atypiques) sont activées par les lipides, plus particulièrement par le diacylglycérol (DAG),

ces kinases furent suspectées de jouer un rôle dans la résistance à l'insuline induite par les

acides gras libres. On a établi que l'accumulation de DAG par une augmentation

plasmatique d'acides gras libres activait la PKCpII et PKC8 chez l'humain et la PKC theta

chez le rat [215] [216]. L'activation de ces PKC pourrait causer une phosphorylation sur les

résidus sérine et thréonine des substrats du récepteur à l'insuline [217].

On a aussi démontré que la présence d'acides gras libres causait l'activation de NF -KB via la

dégradation de IKB pouvant ainsi induire des gènes inflammatoires impliqués dans la

résistance à l'insuline [218]. On sait aussi que les acides gras libres augmentent l'expression

de GLUTI et diminuent celle de GLUT4 contribuant à la diminution de la réponse à

l'insuline [219].

Dans une étude récente, des adipocytes 3T3-Ll traités avec un mélange d'acides gras

présentaient une diminution de la translocation de GLUT4 en réponse à l'insuline. Cette

résistance à l'insuline par la présence d'acides gras libres était accompagnée d'une activation

de JNK, d'IKKp, SOCS3, d'une augmentation de TNFa et d'une diminution de la sécrétion

d'adiponectine dans le milieu de culture [220].

Il faut aussi dire, finalement, que les acides gras libres inhibent la capacité de l'insuline à

supprimer la production de glucose par le foie. Le mécanisme de cette résistance dans le cas

du foie n'est pas encore déterminé, mais puisque les acides gras libres peuvent y activer la

PKC8, celle-ci pourrait bien être en cause - comme elle l'est, dans les mêmes

circonstances, dans le cas du muscle [221].

~-~ --------~-----

37

3. L'AMPK

La kinase activée par l'AMP (AMPK) fut d' abord perçue comme un simple détecteur et un

régulateur d' énergie à l' intérieur de la cellule. Une réduction en ATP intracellulaire active

en effet l' AMPK dans le but de régénérer et de conserver l' énergie de la cellule. On sait

maintenant que l' AMPK contrôle la balance énergétique de tout l'organisme en répondant

aux signaux hormonaux et nutritionnels des tissus périphériques et du système nerveux

central. D'ailleurs, l' orthologue de l'AMPK chez la levure nommée SNFI est activé en

réponse au stress causé par l' absence de glucose [222].

L'AMPK chez le mammifère fut découverte, simultanément, par deux groupes. En 1973,

Beg et ses collaborateurs découvraient qu'une enzyme phosphorylait et inhibait la 3-

hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG-Coa reductase) réduisant ainsi la

synthèse de cholestérol [223]. Pendant ce temps, Carlson et Kim observaient que l 'acetyl

CoA carboxylase (ACC) était phosphorylée et inhibée par une kinase non identifiée [224].

Plus tard, au milieu des années 80, le groupe de Carling purifiait cette enzyme qui, en

présence d'AMP, phosphorylait l'ACC avant de découvrir que cette kinase était aussi

responsable de la phosphorylation de l'HMG-Coa réductase. On la rebaptisa la kinase

stimulée par l' AMP - (AMPK) [225] -[226].

3.1 La structure de l'AMPK

L'AMPK est un hétérotrimère composé d'une sous-unité catalytique a et de deux sous

unités non catalytiques P et y. Les sous~unités sont exprimées sous différents isoformes : la

sous-unité a est exprimée sous les formes a 1 et a2, la sous-unitép en pl et p2 et la sous

unité y en yI , y2 et y3. Les différents agencements d' isoformes pourraient servir à répondre

à différents stimuli selon les tissus, mais la raison fondamentale de toute cette diversité

n' est pas encore connue. L' AMPK est exprimée de façon ubiquitaire même si les différents

isoformes des sous-unités varient selon les tissus étudiés [227] [228].

38

La sous-unité a est de 62 kDa et contient le domaine sérine/thréonine kinase dans la partie

N-terminale. Son activation permet de phosphoryler des protéines sur une séquence

revêtant des caractéristiques particulières. La séquence protéique des protéines ciblées par

l'AMPK contient un résidu hydrophobique en position -5 et +4 du site de phosphorylation

et au moins 1 résidu basique entre - 1 et --4. Par contre, cette séquence dite consensus ne se

retrouve pas dans toutes les cibles de l' AMPK [229]. La sous-unité a est phosphorylée en

position N-terminale sur le résidu thréonine 172 (Thr-172) et permet ainsi son activité. À

l'opposé, deux résidus sérines (ser-485) et (ser-491) peuvent être phosphorylés sur les sous

unités al et a2 respectivement et réduisent ainsi l'activité de l'AMPK. Il est aussi proposé

que l'AMPK pourrait s'autophosphoryler sur ces sites pour limiter son propre signal [230].

Les deux isoformes a 1 et a2 sont présentes dans le cytosol mais certaines études indiquent

que la sous-unité a2 se localise aussi dans le noyau, suggérant un rôle pour la transcription

de gène [231] [232]. D'ailleurs, l' AMPK fut impliquée dans la régulation des facteurs de

transcription TORC2, HNF4, SREBP1c et ChREBP [233] [234] [235]. Les sous-unités al

et a2 sont exprimées dans tous les tissus, mais elles auraient des impacts différents sur les

fonctions de l'AMPK. Par exemple, l' hétérotrimère composé de la sous-unité a2 serait plus

dépendant de l'AMP et essentiel à l'exercice, même s' il est présent en quantité semblable à

a 1. Pour sa part, a 1 serait recruté lors de stress cellulaires plus forts , par exemple en

situation d'hypoxie ou d ' intense activité physique [236]. Les souris AMPKa1-Ko ont une

homéostasie normale du glucose alors que les AMPKa2-KO sont moins sensibles à

l' insuline dans les muscles et ont un défaut de production d'insuline. On doit cependant

noter que les défauts de ces souris ne s' expliquent pas par un problème de transport de

glucose intrinsèque aux muscles causé par l'absence de sous-unité a2, puisque les muscles

isolés de ces souris répondent normalement à l' insuline. Ce défaut s'expliquerait plutôt par

une production accrue de catécholamines causant ainsi indirectement une résistance à

l' insuline dans le muscle [237].

La sous-unité P est une protéine de 30kDa. Celle qui est exprimée sous la forme pl peut

être phosphorylée et myristosylée, bien que les causes de ces modifications post-

39

transcriptionelles ne soient pas clairement identifiées [238]. Dans le muscle, la sous-unité

p2 est le plus exprimée. La sous-unité P lie tant les sous-unités a que y et pourrait donc

servir de joint entre les sous-unités. Cette sous-unité pourrait aussi réguler l' activité de

l'AMPK en fonction du glycogène puisqu'elle possède un site de liaison à cet effet [239].

Une étude récente a montré que la sous-unité pl interagit avec la glycogen-debranching

enzyme (ODE), une enzyme responsable de la dégradation du glycogène. La raison de

l'association entre l'AMPK et le glycogène n' est pas clairement établie, mais elle

diminuerait selon toute vraisemblance l' activité de l'AMPK [240]. Il n ' existe pas pour le

moment de modèle de modification génétique pour l' isoforme p ,ce qui en fait la sous-unité

la moins connue des trois.

Finalement, la sous-unité y est une protéine de 37 kDa essentielle à l' activité catalytique de

la sous-unité a. Cette sous-unité permet à l' AMPK d'être régulée par l' AMP et l'A TP. En

effet, c'est sur y que se lient les nucléotides sur deux paires de séquences nommées

cystathionine b-synthase [241]. La sous-unité y 3, exprimée uniquemènt au muscle revêt un

intérêt particulier puisqu' elle permettrait éventuellement de cibler l' action d'un

médicament spécifiquement sur ce tissu. Cet isofome peut aussi être induit par

l' entraînement physique spécifiquement dans le quadriceps rouge [242]. L' isoforme y 3

serait déterminant dans le métabolisme du glycogène basé sur un modèle de mutation

génétique connu chez le cochon : Hampshire pig, où l'isoforme y 3 est mutée et où le

glycogène s' accumule de façon anormale au niveau du muscle. En effet, cette mutation

activerait en premier lieu l'AMPK, augmentant le transport de glucose et la synthèse de

glycogène au niveau du muscle causant ainsi une rétroinhibition de l' activité de l' AMPK

qui est sensible à la présence de glycogène [243].

3.2 L'activation de l'AMPK

L'activation de l'AMPK requiert absolument la phosphorylation de sa sous-unité a sur le

résidu thréonine (Thr 172) par les AMPKK [244] [245]. Une interaction directe avec l'AMP

permet à l 'AMPK d'être davantage phosphorylé par les AMPKK. Un deuxième niveau de

40

contrôle par l' AMP est de rendre l' AMPK moins sensible à sa déphosphorylation par les

phosphatases PP2AC et PP2C. D'un autre côté, la présence en fortes concentrations d'ATP

antagonise les effets de l' AMP, procurant ainsi une régulation fine à cette kinase [246].

L' identité de la ou des kinases responsables de la phosphorylation de l'AMPK était jusqu'à

récemment inconnue. C'est grâce à l'analogie faite avec son orthologue SNF-1 qu'une

première AMPKK fut identifiée. Chez la levure, les kinases responsables de l'activation de

SNF-1 se nomment PaK1p, Tos3p et Elm1p. Chez les mammifères, la première kinase étudiée

- à cause de sa ressemblance avec les kinases de SNF-1 - fut la Ca2+/calmodulin

dependent protein kinase kinase (CaMKK) [247]. Cette kinase ne fut pas d'abord considérée

comme la kinase de l'AMPK puisqu'on observait que l'activation de l'AMPK était

indépendante du calcium et que la CaMKK extraite in vitro de cerveau de cochon n'arrivait

pas à activer de façon non équivoque l'AMPK in vitro. On a conclu de ces observations que la

CaMKK ne jouait pas un rôle physiologique significatif dans l'activation de l'AMPK. On a

cependant identifié récemment une autre kinase ayant de fortes similitudes avec la kinase

responsable de l'activation de snfl chez la levure. Cette kinase, présente chez les mammifères,

est LKB 1. Il fut clairement établi que la LKB 1 activait la phosphorylation de l' AMPK. La

stimulation de l'AMPK n'était pas observable dans des cellules Hela n'ayant pas de LKB1 ou

dans des cellules dont le gène LKB 1 avait été éliminé. Cependant, il semblait y avoir une autre

AMPKK en action puisqu'une certaine activation de base était observable même en l'absence

de LKB1 [248].

Par ailleurs on a revu, récemment, le rôle de la CaMKK. Différents groupes ont observé que

l'AMPK pouvait être activée en l'absence de LKB1 , que l'augmentation de Ca2+

intracellulaire menait à l'activation de l' AMPK, que l'expression de la CamKK augmentait

l' activation de l'AMPK, que l' inhibition pharmacologique ou génétique de la CamKK

réduisait l'activation de l'AMPK et , finalement, que l'AMPK in vitro était un substrat de la

CaMKK [249]. Il est à noter que les deux formes de la CaMKK- a et p- peuvent agir au

niveau de AMPKK [250]. Finalement, la transforming growth factor-beta-activated kinase

(T AK1), pourrait aussi causer la phosphorylation et l'activation de l'AMPK [251].

41

3.3 Les modulateurs physiologiques

Plusieurs phénomènes physiologiques conduisent à l' activation de l'AMPK. Puisqu'une des

fonctions majeures de. l'AMPK est de percevoir une baisse d'énergie intracellulaire et de la

corriger, les événements causant une élévation du rapport AMP/ATP et créatine/créatine

phosphate mèneront à son activation [252]. Une autre étude a proposé que le rapport

NADINADH, active l'AMPK. Dans ce cas, la présence en fortes concentrations de NAD

activait la kinase alors que l' ajout de NADH avait l'effet contraire [253].

La contraction musculaire qui cause une augmentation de ces rapports s' est donc

rapidement imposée comme l' un des activateurs clés de cette kinase. Les groupes de

Winder et de Ruderman démontrent que la contraction musculaire, lors de l' exercice ou

d'une décharge électrique, causent l'activation de l'AMPK au niveau du muscle [254]

[255] [256]. Par contre, l'exercice active aussi l'AMPK au foie et au tissu adipeux, ce qui

pourrait s'expliquer par une production d'IL-6 par le muscle. On a en effet suggéré que

cette cytokine jouerait un rôle dans l' activation de l' AMPK lors de la contraction du muscle

; en réponse à l' exercice, on a incidemment observé moins d'activité AMPK chez des

souris invalidées pour le gène de l' IL-6 [257].

Les facteurs de stress cellulaire - l 'hypoxie, une carence en glucose, les chocs osmotiques

et thermiques et l'ischémie - permettent aussi l'activation de l'AMPK [258] [259]. On

peut concevoir que ces facteurs recruteront l' AMPK pour rétablir un débalancement

cellulaire, donc à petite échelle.

La fonction de l'AMPK s'est récemment vue attribuer une fonction beaucoup plus globale;

elle répondrait à des besoins physiologiques élargis à tout l'organisme. Il fut démontré que

le contrôle de la prise alimentaire au niveau ducerveau est en partie régulé par les

modulations de l' AMPK dans l'hypothalamus. Ainsi, la leptine, qui inhibe la

consommation de nourriture, agirait en empêchant l'activation de l' AMPK, et à l'opposé, la

growth hormone releasing peptide (grhelin) et l'activation des récepteurs aux canabinoïdes

augmenteraient la satiété en activant l'AMPK [260]. Par contre, la leptine présente une

42

complexité particulière puisque, contrairement à son action au cerveau, elle active l'AMPK

des muscles et du foie [261]. Ce double effet se retrouve aussi dans le cas de l' acide u

lipoique, un anti-oxydant naturel qui diminue la prise alimentaire inhibant l'AMPK au

cerveau tout en l' activant au niveau du muscle [262] [263]. Cette différence de modulation

selon les tissus pourrait s' expliquer par la présence de la kinase responsable de la

phosphorylation de l ' AMPK. Il a en effet, été proposé que l' AMPKK responsable de

l' activation de l'AMPK au cerveau pourrait être la CaMKKb ; tandis que LKB-1 serait,

elle, responsable de son activation aux tissus périphériques [264].

L'AMPK contrôlerait ainsi la prise alimentaire par l' augmentation de l' expression des

neuropeptides orexigéniques NPY (neuropeptide Y) et AgRP (agouti related prote in) et

l'inhibition des facteurs anorexigéniques (POMC (proopiomélanocortine) et CART

(cocain-and amphetamine-regulated transcript). La mise en évidence d'une hyperphagie

couplée à une activation de l' AMPK hypothalamique chez des souris rendues diabétiques

par injection à la streptozotocine conforte également l' idée selon laquelle l'AMPK pourrait

constituer une cible thérapeutique intéressante dans la prise en charge des troubles du

comportement alimentaire [265].

L' adiponectine, une autre hormone déterminante dans l'homéostasie glucidique et

lipidique, produit pour sa part ses effets positifs par l' activation de l'AMPK en périphérie

[205]. Pendant, qu' au contraire, une hormone, proposée pour nuire à la sensibilité à

l' insuline, la résistine, diminuerait la phosphorylation de l' AMPK au niveau du foie et dans

les cellules de muscle en culture (L6) [266].

Bien que le mécanisme ne semble pas jouer ou être présent dans tous les tissus, d'autres

études proposent une modulation de l'AMPK par une augmentation des niveaux d'AMP

cyclique. Le groupe de Denton établit ce lien en 1998 ; le groupe de Bimbaum, en 2003.

Dans l'étude de Bimbaum, des adipocytes 3T3-Ll traités à la forskoline qui active la"

production de l'AMPc, de même qu'un traitement à l'analogue de l'AMPc, le Sp-cAMP,

activent l' AMPK. Ces résultats furent appuyés par une étude qui rapporte elle aussi l' effet

43

de la forskolin et d'un analogue de l'AMPc, le Bt2cAMP, sur l' activation de l'AMPK sur

des adipocytes isolés [267] [268].

Tout récemment, un nouveau mode de régulation de l'AMPK fut proposé. En effet, un

groupe de recherche a observé que l'AMPK pouvait être modifiée et activée par la

glycosylation causée par la suractivation chronique de la voie des hexosamine. Cette voie

étant sollicitée lors d'apports importants en glucose va à l'encontre du rôle habituellement

octroyé à l'AMPK. Cependant, ces observations furent réalisées sur les adipocytes où le

rôle de l'AMPK semble différer de celui des myocytes [269].

Finalement, les deux hormones clés du métabolisme du glucose, l' insuline et le glucagon,

exercent aussi certains de leurs effets au moyen de l' AMPK. D' abord, l' AMPK est

suspectée d'effectuer certains des effets cataboliques du glucagon. L' AMPK inhiberait la

synthèse protéique au niveau du foie en inhibant la voie mTOR par l'activation de la voie

LKB1/AMPK [270]. L' insuline, pour sa part, inhiberait l 'AMPK dans l' hypothalamus et

ainsi inhiberait la prise alimentaire et favoriserait l' utilisation du glucose au détriment des

acides gras au niveau cœur par l'inhibition de l'AMPK par la phosphorylation sur les

résidus sérine de la sous-unité a (485/491) [271] [272] [273].

3.4 Les modulateurs chimiques

L'activateur chimique par excellence de l' AMPK est sans aucun doute le 5' aminoimidazole-4-

carboxamide 1 ~-D-ribofuranoside ou AICAR. Le AICAR est transporté dans la cellule par

des transporteurs de nucléosides, avant d'être transformé en ZMP par l' adénosine kinase. Le

ZMP étant un analogue de l'AMP, il permet l'activation de l'AMPK [274]. Certains ont

cependant, questionné la spécificité du AICAR puisque, mimant l' AMP, il peut activer

d' autres kinases qui lui sont sensibles, produisant ainsi des effets non reliés à l'AMPK.

Récemment par exemple, une étude a montré que l'inhibition de la synthèse de

phosphatidylcholine (PC) par un traitement au AICAR s'effectuait de façon indépendante de

l'activation de l'AMPK puisque tant l'expression d'un dominant négatif que la présence d'un

adenovirus surexprimant la forme active de l'AMPK ne modulaient la production de PC [24].

- - - ----~~~~~----,

44

Un extrait de lilac, était déjà utilisé à l'époque médiévale pour ses propriétés médicinales

contre ce qui fut plus tard identifié comme le diabète de type 2. On sait aujourd'hui que

l ' ingrédient actif de la plante est la biguanidine, commercialisé sous le nom de metformine

ou glucophage [275]. La metformine est maintenant largement utilisée pour traiter le

diabète de type2. Par contre, les mécanismes d' action de la metformin sont demeurés

obscurs jusqu'à ce que Zhou et ses collaborateurs démontrent l' implication de l' activation

de l' AMPK dans les effets bénéfiques de la metformine. Ils ont montré que, dans des

hépatocytes ou des muscles isolés, la metformine activait l' AMPK en provoquant

l ' inhibition de l' ACC, donc l' oxydation des acides gras, et une suppression de SREBP-l :

un facteur clé dans la lipogenèse. De plus, grâce à un inhibiteur de l' AMPK, le compound

C, ils montrèrent que la metformine nécessitait l' activation de l' AMPK pour produire ces

effets bénéfiques [235].

Les thiazolidinediones (TZDs), qui sont eux aussi largement utilisés pour le traitement du

diabète de type2, activent l'AMPK [276]. Les TZDs lient et activent les récepteurs

nucléaires PP ARy, permettant ainsi la transcription de gènes cibles. Par contre, le

mécanisme par lequel les TZDs activent l' AMPK est encore nébuleux. Il a été suggéré que

la metformin et les TZDs agissaient sur, l' AMPK en inhibant le complexe 1 de la chaîne

respiratoire [277] [278]. D'autre part, les TZD augmentent les niveaux d' adiponectine et

diminuent ceux de la résistine en circulation ; ces mécanismes pourraient donc aussi

contribuer à l' activation de l' AMPK. Enfin, puisque l'activateur naturel des pp ARy (non

TZD) : la PGJ2 active l'AMPK, il est permis de croire que la mobilisation des récepteurs

nucléaires joue un rôle dans l' activation de l'AMPK [165]. On a récemment démontré, dans

le même ordre d' idées, que l' activation des PPAR8 causait aussi l'activation de l'AMPK.

Cette dernière découverte vient renforcer le potentiel antidiabétique de l' AMPK, puisque

l' activation des PP AR8 est maintenant considérée comme une cible prometteuse pour le

traitement du diabète de type 2 [279].

45

3.5 Rôles de l'AMPK

3.5.1 La conservation de l'énergie

Le rôle par excellence de l'AMPK est sans contredit la conservation de l' énergie

intracellulaire. Étant donné que le processus de synthèse de protéine est énergivore, il est

peu surprenant d' y voir l 'AMPK exercer son contrôle [280] [281]. D'abord, l 'AMPK peut

phosphoryler et activer la tuberine (TSC2) qui pourra ainsi s'associer avec l'hamartin

, (TSC1). Une fois activé, ce complexe sert de GTPase en causant une augmentation des

niveaux de Rheb-GDP diminuant l'activité d'une voie qui contrôle la synthèse protéique:

mTOR/S6K1. Il a aussi été démontré que l'AMPK peut directement phosphoryler et inhiber

mTOR [282]. Un deuxième niveau de contrôle de la synthèse protéique s' effectue par la

phosphorylation et l' inhibition du facteur d' élongation eucaryote eEF2 [280]. L' activation

de l'AMPK causera la phosphorylation de eEF2 sur son résidu thréonine 56 (Thr-56). Ainsi

modifié, le facteur de traduction bloquera la synthèse protéique en empêchant l'avancement

des ribosomes sur l' ARN messager. La phosphorylation de eEF2 ne se ferait pas

directement par l'AMPK ; l'AMPK activerait plutôt la kinase de eEF2, en la phosphorylant

[283]. Finalement, l'AMPK peut réduire la stabilité de 'certains ARNm en diminuant la

disponibilité de la protéine stabilisatrice HUR. Cette dernière lie les ARNm dans le noyau

et permet son transport au niveau du cytoplasme pour sa traduction éventuelle. Plusieurs

études révèlent que l' activation de l' AMPK réduit les niveaux cytoplasmiques de HUR,

altérant ainsi la synthèse de protéines ciblées [284] [285] [286].

L'AMPK régule aussi négativement la synthèse de glycogène. Ce processus étant lui aussi

énergivore, l'AMPK ira inhiber, par sa phosphorylation sur le résidu ser7, de la glycogène

synthase (GS) [236]. Par ailleurs, la présence de glycogène, signifiant l' abondance

énergétique au niveau muscle, inhibe l' activation de l'AMPK par la contraction ou par la

présence de AICAR [287]. La synthèse de cholestérol au moyen de la HMG-Coa reductase

est un autre processus régulé négativement par l'AMPK qui demande aussi beaucoup

d' énergie.

46

3.5.2 La production d'énergie

L'activation de l'AMPK ne se limite pas à réduire les processus consommant l'énergie. Elle

déclenchera plusieurs processus afm d'augmenter la régénération d'énergie. Un premier

mécanisme, bien établi, est l'augmentation de l'entrée de glucose dans la cellule. En effet, un

des paramètres très étudié de l'activation de l' AMPK fut l'augmentation du transport de

glucose dans le muscle. En fait, plusieurs d'études furent menées afin de déterminer si

l'augmentation du transport du glucose au niveau du muscle par la stimulation de l'AMPK ne

correspondrait pas au mécanisme par lequel l'exercice permet l' entrée de glucose,

indépendamment des voies de signalisation de l'insuline. En effet, lors de la contraction

musculaire, le muscle utilise l' ATP et la créatine phosphate disponible et déséquilibre les

ratios AMP/ATP et crétine/créatine phosphate; autant de conditions nécessaires à l'activation

de l'AMPK. On sait en outre que le AICAR stimule le transport du glucose au muscle, et cela,

de façon additive à l' insuline, comme le fait l'exercice. Comme c' est le cas durant l'exercice,

le transport du glucose stimulé par le AICAR n'est pas, ici non plus, sensible à l' inhibition de

la PI 3-kinase. Cependant, les expériences réalisées sur les modèles d' animaux transgéniques

remettent en question l'hypothèse selon laquelle l' AMPK serait bel et bien la kinase

responsable du transport du glucose stimulé par la contraction. Une première étude a montré

que l' inactivation de la sous-unité a2 agissant comme dominant négatif de l'AMPK empêche

le transport du glucose stimulé par le AICAR et 1 'hypoxie mais réduit le transport stimulé par

la contraction de seulement 30 à 40 % [288]. Jorgensen et collaborateurs ont par ailleurs

rapporté que le transport de glucose stimulé par la contraction n'est pas modifié, ni dans des

souris invalidées pour la sous-unité al ou a2 de l'AMPK. Une étude récente vient de montrer

que des souris dont la sous-unité a2 de l'AMPK a été éliminée au muscle ne peuvent pas

stimuler le transport de glucose par le AICAR ou par la roténone qui inhibe le complexe l de

la chaîne respiratoire mais, qu'à l'opposé, le transport du glucose stimulé par la contraction ou

par un choc osmotique créé par le sorbitol n'est pas affecté non plus par l' inactivation de la

sous-unité a2. Comme la sous-unité a2 qui est activée par l'exercice et que les auteurs n'ont

pas observé de compensation par la sous-unité al , ils concluent que le transport du glucose au

muscle ne peut être stimulé que de trois façons : par un mécanisme dépendant de l' insuline,

47

par un mécanisme dépendant de l'AMPK ou par un indépendant de l' insuline et de l' AMPK

[289].

L' activation de l'AMPK va permettre l' augmentation du transport du glucose par trois

mécanismes différents: le premier étant la translocation des transporteurs de glucose

GLUT4 à la surface cellulaire, le second par l' augmentation de l'expression de ces

transporteurs par les facteurs de transcription GLUT4 enhancer factor (GEF) et myocyte

enhancer factor 2 (MEF2) et, enfin, par l' augmentation de l' activité intrinsèque de ces

mêmes transporteurs [290] [291] [292] [293] [294]. L'AMPK pourrait utiliser sa capacité à

stimuler la map kinase p38 pour permettre l ' activité intrinsèque des GLUT4 [295] [296].

Le mécanisme par lequel la p38 est activée au moyen de l'AMPK pourrait faire intervenir

la protéine T AB 1. T AB 1 semble au moins importante au cœur, puisque la phosphorylation

de la p38 nécessite la formation d'un complexe avec l' AMPK et la protéine T AB 1 [297].

Cependant, le rôle de la p38 dans l' activité intrinsèque de GLUT4 demande encore à être

éclairci [134].

Tel que mentionné précédemment, on a par ailleurs montré que le AICAR augmentait

l' activité par le démasquage des transporteurs de glucose GLUTI dans des cellules du foie

- les clones 9 cells - et que cet effet était médié par l' activation de l' AMPK [298] [116].

Une autre façon de s'assurer de l'approvisionnement suffisant en énergie par l'AMPK consiste

en l'oxydation des acides gras libres. L'AMPK active ce processus par l' inhibition de l' acétyl

CoA carboxylase (ACC). En effet, l'AMPK inhibe cette enzyme par sa phosphorylation.

Considérant que l'ACC produit le malonyl-CoA qui bloque l'entrée et l'oxydation des acides

gras libres par l'obstruction de la carnityl plamitotransférase (CPT -1) aux mitochondries,

l' inhibition de l'ACC provoquera l'utilisation des acides gras. Ainsi, l'augmentation de

l'oxydation des acides gras par la leptine et par l' adiponectine' serait directement reliée à

l' activation de l'AMPK. Il fut démontré à cet effet que la présence d'un dominant négatif de

l'AMPK dans des cèllules de muscle H-2Kb empêche l'utilisation des acides gras par la

leptine [299]. Pour sa part, le groupe de Kadowaki a démontré que la présence d'un dominant

48

négatif de l'AMPK au niveau du muscle empêche l'adiponectine d'oxyder les acides gras dans

les myocytes C2C12 [205].

3.5.3 Rôle anti-inflammatoire

Quelques données récentes supportent le rôle anti-inflammatoire de l'AMPK. Le groupe de

Singh fut le premier à l' établir. Il a montré que l' activation de L'AMPK par le AICAR inhibe

la production de cytokines (TNFa, IL-1 p et IL-6) de même que l' induction de iNOS à la suite

d'un traitement à la LPS dans des astrocytes de rat en culture primaire, dans des cellules de la

microglie, de même que dans des macrophages péritonéaux. L'AMPK semblait bel et bien

responsable de ces effets puisque la présence d'un dominant négatif contre l 'AMPK

empêchait les effets du AICAR de se produire. Plus récemment, le même groupe a montré que

le AICAR pouvait servir d 'agent anti-inflammatoire en réduisant la production de certaines

cytokines dans le cas d'une maladie du système nerveux central nommée sclérose en plaque

[300] [301]. On a aussi établi que l ' inhibition de l'expression protéique de iNOS était reliée à

une réduction de la stabilité de l' ARNm engendrée par l' activation de l' AMPK [286]. Plus

récemment, la capacité de l'AMPK à réduire l'expression de la cytokine IL-2 dans des cellules

T fut aussi établie [302]. De plus, la metfonnine empêcherait certaines cytokines d'activer la

voie NfKB par l'action de l'AMPK [303]. Une autre étude a, pour sa part, démontré que

l' activation de l'AMPK dans l'hypothalamus renversait l' anorexie causée par une tumeur

possiblement en inhibant la production de molécules pro-inflammatoires [304]. Il fut aussi

rapporté que dans des cellules épithéliales de bronches cette fois, que l' activation de l' AMPK

permettait un meilleur contrôle de l' inflammation [305]. Finalement, la nicotine jourait un

certain rôle anti-inflammatoire par l' activation de l'AMPK dans les macrophages [306].

3.5.4 Les autres rôles bénéfiques de l'AMPK

Les rôles de l' AMPK qui viennent d' être mentionnés sont tous utiles pour empêcher le

développement du syndrome métabolique. À la longue liste de ces bénéfices, on peut ajouter

49

la synthèse de mitochondries par l' activation du facteur de transcription nuclear respiratory

factor 1 (NRF-1). Une plus grande concentration de mitochondries augmenterait la dépense

énergétique, contribuant ainsi à un meilleur contrôle du poids corporel [307].

L'AMPK inhibe aussi la néoglucogenèse hépatique en phosphorylant et en inhibant le facteur

de transcription TORC2 qui ne pourra plus activer les gènes responsables de cette production

de glucose [308]. Plusieurs auteurs ont finalement suggéré que l'AMPK, stimulé par un

environnement à faible concentration de glucose, inhibe l' exocytose de l' insuline par les

cellules fJ du pancréas, contrôlant ainsi l'hyperinsulinémie associée à la résistance à 1 insuline

[309] [231]. Aussi, une production modérée de NO par eNOS est reconnue pour dilater les

vaisseaux sanguins et contribuer ainsi à l'accessibilité de l' insuline aux tissus. Le groupe de

Kemp fut le premier à démontrer que l'AMPK pouvait activer eNOS en présence de Ca2+

calmoduline et ainsi permettre son activation [310]. Depuis, différents groupes ont observé des

effets semblables, bien que ce ne soit pas le cas pour tous les types de cellules ; dans les

cellules rénales, par exemple, l'activation de l' AMPK ne cause pas l'activation de eNOS par

sa phosphorylation [311] [312].

50

4. Le monoxyde d'azote

En 1987, les docteurs Murad, Ignarro et Furghgott firent une découverte majeure en

révélant un nouveau système biologique, ce qui leur valut un prix Nobel. Ils découvrirent

un gaz libéré par les cellules endothéliales qui se manifeste de multiples façons dans tout

l ' organisme: le monoxyde d' azote (NO).

Dans le système vasculaire, le NO maintient un tonus vasodilatateur nécessaire pour la

régulation de la circulation sanguine et le contrôle de la pression artérielle ; il inhibe

l ' agrégation et l ' adhésion des plaquettes, empêche l' adhésion des leucocytes et module la

prolifération des cellules musculaires lisses.

Dans le système nerveux central, il agit comme un neuromédiateur..Il est associé à diverses

fonctions physiologiques ; par exemple, la formation de la mémoire, la coordination entre

l' activité neuronale et le débit sanguin et la modulation de la douleur.

Le NO est, en outre, produit en grandes quantités dans les manifestations de défense de

l 'organisme. Il contribue à protéger contre les cellules tumorales, les bactéries et les virus.

Ainsi libéré, le NO peut cependant aussi favoriser le développement de pathologies comme

le choc septique et certaines formes d ' inflammation aiguë ou chronique.

Le NO est donc un médiateur biologique ubiquitaire dont les fonctions sont tantôt

physiologiques, tantôt pathophysiologiques.

En raison de son étendue d'action, de ses effets bénéfiques autant que de ses effets néfastes

et de sa càpacité à interagir avec une multitude de cibles, le NO mérite grandement son titre

de molécule de l' année attribué en 1992 par la revue Science. Et pourtant, le NO est l 'une

des plus vieilles molécules connues. La génération de NO dans l' atmosphère est née de la

réaction entre l' azote et l ' oxygène à des températures de 1 000 degrés Celsius. Pour cette

raison, la production cellulaire de NO fut longtemps perçue commé impossible.

51

Sans rien lui enlever, il faut aussi réaliser qu'une partie des effets du NO n'est pas produite

par la molécule elle-même, mais bien par ses produits de dégradation ou encore le produit

de ses interactions avec d'autres molécules chimiques ou protéiques. En milieux aqueux et

oxygéné par exemple, le NO est rapidement oxydé en nitrite (N02) et en nitrate (N03) ; il

activera aussi la production de cyclic guanidine monophosphate cGMP par l'activation de

la guanylyl cyclase ; il pourra devenir un oxydant puissant par son association avec le

superoxyde (02-) pour former le peroxynitrite (ONOO-), modifiant ainsi des protéines par

leur nitration. Le NO peut aussi interagir avec les domaines S-H de protéines leur causant

une modification nommée s-nitrosation. En milieu biologique, sa grande capacité à difuser

l' amènera souvent à sortir de la cellule qui l' a produite pour atteindre ses cibles. Il s'agit

donc d'une molécule simple aux effets complexes [313] [314].

4.1 La famille des NOS

Les synthétases de NO (NOS) sont les enzymes responsables de la synthèse du NO

catalysée par l' oxydation de la L-arginine en NO et en citrulline. Trois isoformes de NOS

distinctes ont été identifiées à ce jour: eNOS caractérisée initialement dans les cellules

endothéliales vasculaires, nNOS découverte dans les neurones et iNOS, une forme

inductible, découverte dans les macrophages. Les NOS sont codées par 3 gènes distincts:

NOSI (nNOS), NOS2 (iNOS) et NOS3 (eNOS) présents, respectivement, sur les

chromosomes 7, 12 et 17, et numérotés selon leur ordre de découverte. L'organisation

intron/exon des gènes NOS humains présente des similitudes structurales, mais les

mécanismes de régulation sont distincts - particulièrement dans le cas de iNOS. Les 3

isoformes sont distribuées dans un grand nombre de tissus et de cellules et il est maintenant

établi qu'une même cellule peut exprimer plusieurs isoformes de NOS. Les noms de ces

enzymes sont donc trompeurs, malgré qu'ils soient déjà consacrés par l'usage. Les enzymes

nNOS et eNOS sont dites constitutives, exprimées de façon basale et générant de faibles

quantités de NO ; elles sont ~econnues pour leur rôle bénéfique. À l'opposé, iNOS est peu

ou pas exprimée à l'état basal, mais elle est fortement induite en présence de stimuli

52

inflammatoires. Les quantités de NO générées par iNOS sont beaucoup plus importantes

que celles produites par les NOS constitutives. Cette dernière caractéristique en fait une

enzyme à « double tranchant» puisqu'elle peut exercer un rôle bénéfique pour combattre

un envahisseur viral ou bactérien, mais elle peut aussi avoir des conséquences délétères, si

son expression est mal contrôlée [315] [316] [317] [318j [319] [320].

4.2 La structure des NOS

On dit souvent que les NOS doivent s' autodimériser pour être actives. Il faudrait plutôt dire

que les NOS doivent être sous forme de tétramères puisqu'elles ont toutes besoin d' être

associées à deux calmodulines (CaMs). La structure simîlaire des trois enzymes suggère un

ancêtre commun. En effet, les NOS possèdent toutes un domaine oxygénase dans leur

section N -terminale et un domaine réductase en position C-terminale.

Si l' on regarde de près le domaine oxygénase, on remarque qu' il contient les sites de

liaison des cofacteurs essentiels suivants : le (6R)-5,6,7,8-tétrahydrobioptérine (BH4),

l 'hème, et la L-arginine. Pour sa part, le domaine réductase lie la. flavine adénine

mononucléotide (F AD), la flavine mononucléotide FMN et la nicotinamide adénine

~inucléotide phosphate (NADPH) [321] [322] [323]. Les NOS doivent obligatoirement être

associées en homodimères pour être activées. Le site de liaison qui permet cette interaction

déterminante se trouve dans le domaine oxygénase pour iNOS, alors que le domaine

réductase serait aussi concerné dans le cas des deux NOS constitutives. Les co-facteurs

BH4, hème et la L-arginine contribuent tous à l' association et à la stabilisation du dimère

[324] [325].

L'oxydation de la L-arginine qui permet la production de NO et de citrulline par les NOS

est réalisée en deux étapes. D'abord, la NADPH se fixe au domaine réductase par lequel il

est oxydé. Les deux électrons ainsi libérés transitent par la FAD, puis la FMN, avant

d' atteindre le domaine oxygénasè où ~e trouve le site de liaison du BH4 et de l'hème. Ce

flux d' électrons est rendu possible par la présence de la c~lmoduline. Le substrat, la L

arginine, sera hydroxylé par l'hème en présence de BH4 en Nw-hydroarginine (NOHA)

53

grâce aux électrons provenant de la NADPH et de l' oxygène moléculaire. Ensuite, le

composé intermédiaire sera oxydé à son tour pour produire le NO et la citrulline [326].

4.3 eNOS

4.3.1 La modulation de eNOS

eNOS est une protéine de 133kDa possédant un site de myristosylation et un site de

palmitosylation la distinguant des autres NOS. eNOS est d'abord myristosylée ce qui lui

permet d' être dirigée vers l' appareil de Golgi où elle sera palmitosylée ; elle pourra alors

s' intégrer à la membrane intérieure des structures nommées caveolea. Il s' agit de petites

invaginations de la membrane plasmique. À l' intérieur de ces structures; eNOS interagit

avec la calvéoline inhibant son action. L' augmentation de calcium intracellulaire cause la

dissociation du complexe eNOS/calvéolin permettant son actiyation [327].

Lorsqu' eNOS n' est plus palmitosylée, elle peut se déplacer au niveau cytoplasme où elle

pourra être activée ou inhibée par sa phosphorylation sur différents sites par des kinases

telles que l ' Akt/PKB, la PKA et l'AMPK [328] [310]. L'AMPK, l ' AkT/PKB et PKCa sont

connues pour phosphoryler eNOS sur le résidu sérine 1177 ou 1179, selon l' espèce. Cette

phosphorylation servirait à activer l' enzyme. Par contre, le groupe de Cohen a rapporté que

l' activation de l'AMPK par le ONOO- causait la phosphoryla~ion de eNOS sur ser1179

produisant un découplage de l' enzyme et augmentant la production de O2- au détriment de

celle du NO [329]. eNOS peut aussi être modulé négativement par sa phosphorylation sur

son résidu thréonine 497 ou 495 [330].

Plusieurs facteurs peuvent moduler eNOS. Au niveau de la transcription par exemple, le

TNFa peut déstabiliser l'ARNm de eNOS. Le mécanisme d ' action de cette cytokine sur

eNOS n'est pas complètement défini, mais on sait que le traitement au TNFa de cellules

endothéliales BAEC cause la formation d'un complexe de ribonucléoprotéines non

identifiées sur la séquence 3 '-untranslated region (3 ' -UTR) de eNOS réduisant la stabilité

54

de l' enzyme [331]. La lipopolysaccharide (LPS), seule ou en combinaison avec des

cytokines, peut aussi causer une diminution de l' expression de l'ARNm de eNOS [332]. À

l' opposé, le TGF-B1 est reconnu pour stabiliser l' expression de l'ARNm de eNOS dans des

cellules endothéliales HUVEC par un mécanisme impliquant la liaison du facteur de

transcription SMAD2 au site 3' -UTR de l'enzyme [333]. Le NO est incidemment lui-même

reconnu pour inhiber l' activité de eNOS. En effet, le NO peut lier le groupement hème de

l' enzyme et diminuer significativement sa production [334].

4.3.2 Les rôles d'eNOS.

Le premier rôle du NO généré par eNOS est sans contredit le contrôl~ de la pression

artérielle. Il fut, en effet, d' abord identifié comme étant l' endothelium-qerived rel~ing

factor EDRF découvert par Furchgott & Zawadski 1981. L'utilisation d'un inhibiteur

semblable à la L-arginine, le L-NMMA, augmente la pression artérielle in vivo et in vitro.

Plus récemment, ces résultats ont été confirmés chez des souris invalidées pour le gène

eNOS. Ces souris sont hypertendues, mais l'administration de NO exogène sous forme de

NaN02 (nitrite de sodium) permet le rétablissement d'une pression artérielle normale [335].

L'acétylcholine, la bradikinine; et le stress de cisaillement sont des stimuli qui activent des

récepteurs à la surface des cellules endothéliales augmentant alors le flux de calcium

intracellulaire. eNOS ainsi activée par l' augmentation de calcium dans la cellule génère du

NO qui diffuse jusqu' aux cellules musculaires lisses où il cause la dilatation des vaisseaux

par la production de cGMP par l' activation de la guanylate cyclase [336] [337] [338]. D'un

autre côté, l' administration exogène de NO par des drogues telles que la nitroglycérine ou

le sodium nitroprusside cause aussi la relaxation par la production de cGMP.

Comme. l' hypertension artérielle et la résistance à l'insuline sont souvent associées, le

groupe de Scherrer a cherché à comprendre si l' absence de eNOS pouvait contribuer à la

résistance de l 'hormone. En utilisant des souris eNOS( -/-), ils ont observé que ces souris

étaient bien sûr hypertendues, mais qu' elles étaient également hyperinsulinémiques et que

55

le transport du glucose à l ' intérieur du muscle était réduit de 40% comparativement aux

souris contrôles. De plus, différents groupes ont expliqué l ' association d'un polymorphisme

du gène eNOS à un défaut de la sensibilité à l' insuline. Le bon fonctionnement de eNOS

pourrait donc avoir un impact déterminant sur la sensibilité à l' insuline même si son rôle

n' est pas encore totalement défini [339] [340] {341].

La production du NO par eNOS peut aussi être associée à l' athérosclérose qui s' établit par

la formation de plaques d 'athérome. En inhibant l' adhésion des leukocytes et des

monocytes, en diminuant l' oxydation des lipoprotéine de f aible densité (LDL) et en

inhibant la synthèse des cytokines, le NO généré par l ' endothélium protège contre la

maladie. Une étude démontre d'ailleurs une susceptibilité des souris eNOS-/- à développer

des lésions athéroscérotiques [342].

Certains ont par ailleurs suggéré que eNOS pouvait exercer un rôle pro-inflammatoire. En

l' absence de l'enzyme, la LPS induit en effet moins efficacement iNOS et sa capacité à

causer une production de TNF a est réduite dans des cellules endothéliales et dans des

cardiomyocytes. Il est aussi rapporté que, dans la vessie de rats traités à la LPS, eNOS était

rapidement phosphorylé sur serl179 et qu' ainsi eNOS contribuait à la réponse

inflammatoire [343] [344] [345] [346].

4.4 nNOS

4.4.1 Modulation de nNOS

Malgré son appellation, la forme neuronale des NOS se retrouve aussi dans des tissus autres

que le cerveau; par exemple, dans le placenta, les testicules, la rate, les reins, les poumons

et le muscle squelettique. nNOS, une protéine de 160kDa, fut d'abord identifiée dans les

neurones. Elle se distingue de ses deux « enzymes-sœurs» par son domaine PSD/Discs

large/ZO-l (PDZ) positionné en N-terminal. Cette région lie des domaines PDZ d' autres

protéines, tels que la post synaptic density protein (PSD-95 et la PSD-93) La PSD-95 fait le

1

1

l' 1

56

pont entre nNOS et le récepteur de N-methy l-D-aspartate (NMDA). Ce motif PDZ permet

aussi à nNOS retrouvée au niveau du muscle de lier la protéine syntrophine, formant un

complexe avec la dystrophine [347].

nNOSa (la forme complète) peut subir un épissage alternatif de son ARNm permettant

l'expression de plusieurs variants (nNOSp, nNOSy, nNOSfJ, et nNOS-2). Les fonctions

précises de tous ces dérivés sont peu caractérisées [348]. On remarque par contre que les

formes nNOSp et nNOSy se retrouvent sous forme libre ; ils ne possèdent pas de domaine

PDZ et ne sont pas associées aux membranes [349].

nNOSfJ, se retrouve au niveau du cœur et est la forme prédominante du muscle' squelettique

[350]. La fonction de nNOS-2 est peu définie, mais elle pourrait agir comme dominant

négatif. En effet, nNOS-2 ne possède pas la région liant la L-arginine ; donc, cette forme de

l' enzyme est incapable de produire du NO. Cependant, l' enzyme présente tout de même

une activité NADPH diaphorase qui peut lui permettre de produire du O2-. Certains auteurs

ont émis l 'hypothèse que cette production de O2 pourrait contribuer à certains désordes

neuronaux causés par son interaction avec le NO, expliqués par la production de ONOO-

, [351].

Tout comme eNOS, l' activité de nNOS est dépendante du calcium. Elle est inhibée par la

présence de NO et peut aussi l'être en s'associant à la cavéoline. nNOS est aussi modulée par

sa phosphorylation mais ces modifications seraient dans l' ensemble inhibitrices. Par exemple,

la calmodulin kinase 1 et II (CaMKI et CaMKII) phosphorylent nNOS sur son résidu sérine

741 , ce qui inhibe son activité [352]. Sa phosphorylation sur le résidu thréonine 1296 cause

aussi son inhibition. D'un autre côté, sa déphosphorylation par les phosphatase 2A (PP2A) ou

SH2 domain-containingproteinphosphatase 1 (SHP-1) active l' enzyme [353] [354].

La -régulation de l' expression de nNOS en situation inflammatoire varie selon les tissus.

Dans le coeur de rats injectés à la LPS, l' expression de nNOS est réduite, alors qu'une autre

étude montre l' effet contraire dans l'utérus [355] [356]. Par ailleurs, l' induction de iNOS

dans les artères de porcs inhibe l'activité de nNOS [357].

57

4.4.2 ~ôles du NO généré par nNOS

Un des rôles importants de nNOS se situe au cerveau. Par son domaine PDZ, nNOS active

les récepteurs N-methyl-Daspartate type glutamate (NMDAR) par la liaison de la PSD-95

[358]. D'un autre côté, nNOS peut inhiber la transmission synaptique par la S-nitrosylation

des récepteurs NMDAR [359] (le processus de S-nitrosylation sera expliqué plus loin). Au

cerveau, nNOS joue un rôle dans le comportement, l' apprentissage et la sensibilité face à la

douleur. Par contre, la production de NO au cerveau doit être très bien régulée puisqu'une

trop grande production du gaz est associée à la maladie de Parkinson et à la maladie de

d'Huntington ; elle est aussi en cause dans l' étiologie des migraines [360].

Au muscle squelettique, la forme épissée nNOSJ.! est aussi très importante. Lors de la

contraction, le NO est libéré par le muscle et dilate les vaisseaux sanguins adjacents

permettant un apport sanguin adéquat. nN OS J.! pourrait pallier à certaines dystrophies

musculaires puisque l' expression d'un transgène de l' enzyme améliore le phénotype

d' animaux malades [361]. nNOSJ.! est aussi en cause dans la force et le développement du

muscle, dans le contrôle de l 'homéostasie du contenu en sodium du corps en régulant la

réabsorption aux reins ; elle est indispensable à l'exercice des fonctions sexuelles mâles et

au contrôle du péristaltisme de l ' intestin [362] [363]. Finalement, nNOS peut jouer un rôle

dans la sécrétion de l' insuline par les cellules f3 du pancréas [364].

4.5 MtNOS

L' existence d'une quatrième forme de NOS soulève actuellement bien des débats. Il s' agit

d'une forme mitochondriale nommée mtNOS. L' expression d'une forme mitochondriale de

NOS fut observée par différents groupes - presque simultanément -, il y a environ une

dizaine d 'années [365] [366]. Mais depuis, on a très peu appris sur ce sujet controversé.

58

L' identification d'une enzyme NOS propre aux mitochondries est rendue difficile d' abord

en raison des méthodes d' isolation des mitochondries qui ne permettent pas une pureté

absolue des organelles ; sans compter qu' eNOS possède des sites d' ancrage aux

membranes (palmitoyl et myristoyl) pouvant contribuer à la contamination des

mitochondries. Un autre argument de poids pour les détracteurs de l' existence des mtNOS

vient du fait que chaque NOS est codé par un gène distinct et que l' analyse extensive du

génome eukaryote n' a pas permis l' identification d'une autre séquence de NOS. Ce qui

signifie que mtNOS proviendrait d'une modification d'une des isoformes de NOS actuelles.

Cependant, aucune des NOS existantes ne possède de séquence la dirigeant vers les

mitochondries. D ' un autre côté, le NO semble avoir un rôle non équivoque dans la

biogenèse des mitochondries et qu' en présenc~ de calcium, mtNOS produirait du ONOO

[367]. La production de ONOO- par mtNOS conduirait à la nitration de protéines associées

à une dysfonction mitochondriale [368]. Ces organelles sont par ailleurs de plus en plus

mises en cause pour leur rôle potentiel dans la résistance à l' insuline [213]. Il serait donc

intéressant de mieux comprendre les mécanismes régulant la production de reactive oxygen

species (ROS) et reactive nitrogen species RNS par les mitochondries.

Finalement, il est à noter que le NO peut être produit de façon non enzymatique à partir de

nitrites en situation réductrice dans un environnement à bas pH. Cependant, l' importance

physiologique de ce NO et son rôle ne sont pas encore clairement définis [369].

4.6 iNOS

iNOS est une protéine de 130kDa qui, contrairement à eNOS et nNOS est peu ou pas

exprimée en situation basale. Elle a une activité indépendante de la présence de calcium étant

toujours fortement liée à la calmoduline [370]. Cependant, en présence de signaux

inflammatoires, iNOS est induite et génère des quantités de NO de loin supérieures aux autres

formes de NOS. Même si cette forme de iNOS fut découverte dans les macrophages, on sait 1

aujourd'hui que iNOS peut être induite dans plusieurs tissus, dont le muscle et les tissus

adipeux [371] [372].

59

4.6.1 Facteurs et mécanismes responsables de l'induction de iNOS

Les facteurs inflammatoires induisant iNOS sont nombreux. Il y a, bien sûr, les cytokines

pro-inflammatoires: TNFa, IL-lp , IL-6, INF-y. L ' endotoxine LPS est aussi un 'activateur

de iNOS très étudié. Parmi les signaux qui mènent à l' induction de l ' ARNm de iNOS on

compte la voie NF-KB et la voie JAKISTAT [372]. Par ailleurs, la voie des mitogen

activated protein kinases (MAPK) va conduire à l ' activation d'autres facteurs de

transcription impliqués dans l' induction de iNOS, soit activator protein 1 (API),

l'acti"yating transcription factor 2 (ATF2), et d' autres facteurs de transcription de la famille

des Ets [373] [374] [375] [376] [377]. Dans les macrophages, les récepteurs toll-like

receptors (TLR4) et CD14 sont très importants pour permettre l' induction de iNOS. CD14

est le récepteur permettant la liaison de la LPS qui rendra alors possible l' activation de la

voie NF-KB [378]. Cette voie est un mécanisme déterminant de l' induction de iNOS. NF

KB est présent dans le cytosol et est inhibé lorsqu' il est associé IKB. Lorsque le complexe

est phosphorylé par IKB kinase (IKK) en présence de certains facteurs, NF-KB est libéré et

se dirige au noyau où il activera le promoteur de gènes tels qu' iNOS. Des études récentes

ont aussi démontré la présence des (TLR2) et (TLR4) dans le muscle, le foie et le tissu

adipeux, pouvant ainsi contribuer à l' induction de iNOS dans ces tissus[379] [380]. L' IFNy,

pour sa part, active la voix JAKISTAT qui mène à la synthèse du facteur de transcription

interferon response factor (IRF -1) stimulant à son tour la transcription de iNOS.

Dans la plupart des études in vitro, seule une combinaison de plusieurs facteurs

inflammatoires peut mener à une induction soutenue de iNOS. Donc, son expression est

relativement contrôlée et ne répond pas au premier stimuli. La région du promoteur de

iNOS contient d' ailleurs plusieurs éléments de liaison tels que NF-KB, c-juniFos, C/EBT,

CREB et STAT. On peut deviner que plus d'un site doit être stimulé pour qu' il y ait

induction de iNOS [381] [382] [383]. Par exemple, il existe une synergie entre les actions

de la LPS et de l ' IFNy, puisque IRF -1 et NF -KB interagissent au niveau du promoteur

causant une transformation dans la conformation de ce dernier, ce qui a pour effet de

l' activer davantage [384]. À l'opposé, la grande quantité de NO générée par iNOS inhibe sa

propre production en inhibant la voie NF-KB [382].

~I

60

Du côté traductionnel, la stabilité de l' ARNm détermine la quantité de protéine iNOS

produite. Un des mécanismes connus de stabilisation de iNOS implique la protéine HUR.

Cette nucléoprotéine lie une région 3'-UTR de iNOS et, ce faisant, maintient l'ARNm

disponible pour la traduction [286]. De plus, la protéine tristetraproline (TTP) aurait aussi

un rôle à jouer dans la stabilité de l' ARNm de iNOS pour sa traduction par un mécanisme

impliquant vraisemblablement JNK [385]. À l' opposé, la protéine KH-type splicing

regulatory protein (KSRP) se lie à la même région de l' ARNm de iNOS, mais diminue sa

stabilité [386].

L' inhibition de la dimérisation de iNOS est un autre mécanisme par lequel iNOS est

contrôlée. En effet, comme iNOS doit être exprimée sous forme d 'homodimères pour

produire le NO, des agents tels que la Kalirine protègent des effets néfastes de iNOS au

moyen de ce mécanisme. De la même façon, une protéine produite par les macrophages

NOS-associated protein-ll 0 kDa (NAP 110) contrôle la production de NO [387] [388].

La production de NO par iNOS peut aussi dépendre de la disponibilité du substrat, la L

arginine [389]. Comme pour les deux autres NOS, la phosphorylation de l ' enzyme pourrait

modifier son activité. En effet, sa phosphorylation en présence de LPS dans les

macrophages concorderait avec son activité [390]. Des études chez l' humain semblent aussi

suggérer que certains polymorphismes du gène iNOS sont associés à une plus grande

activité de l'enzyme puisque les gens présentant cette variation du gène seraient plus aptes

à se défendre contre le virus de la malaria [391].

Finalement, tout comme nNOS, iNOS peut aussi subir un épissage alternatif. Trois

variantes sont possibles. La raison d'être de ces enzymes n'est pas clairement définie, mais

elles ne présenteraient plus d'activité NO synthase et conserveraient une activité NADPH

diaphorase qui leur permettait de produire du superoxyde (02-) [392] [393].

,--------------_. --- --- - ~-~----

61

4.6.2 Autres Facteurs induisant iNOS

Mis à part les cytokines pro-inflammatoires, plusieurs autres facteurs d'origines diverses

peuvent contribuer à ·l ' induction de iNOS. Parmi eux, plusieurs sont augmentés dans

l' obésité ou associés à la résistance à l'insuline tels que les acides gras libres (AGL), les

céramides, les advanced glycation end products (AGEs), la leptine, la C-reactive protein

(CRP), les gangliosides, l 'homocystéine et une concentration de glucose circulante élevée

[394][395] [396] [397] [398] [399] [400] [401].

L' insuline qui est présente en plus fortes concentrations au début de l'établissement de la

résistance à celle ci, a des effets différents selon les tissus. Ainsi, des études de notre

laboratoire ont démontré que l'insuline augmentait l'expression de iNOS dans les adipocytes

en culture alors que l'effet opposé était observé dans les myotubes (Penfornis et Maretle

résultats non-publiés) [164]. L'effet inducteur de l'insuline a aussi été rapporté dans des

cellules d'îlots pancréatiques isolés en culture et dans des ostéoblastes. L' insuline pourrait

également actualiser la capacité d' IL-1 f3 à induire iNOS dans des cellules glomérulaires [402].

À l' opposé, dans les leucocytes de rats rendus diabétiques de type 1 à la suite d'un traitement à

l' alloxane (donc, qui ne produisent plus d' insuline), on observe une induction de iNOS.

Cependant, si les animaux sont préalablement traités à l' insuline, cette modulation de

l'enzyme n'est plus observée [403]. Bien entendu, in vivo, comme l' insuline a de multiples

actions, on ne peut pas déduire une relation directe. Cependant, ces études démontrent que

l' insuline et iNOS sont reliés d'une façon ou d'une autre et l'on suppose que les mécanismes

complexes qui sous-tendent cette interaction peuvent l'être davantage dans les cas d'obésité où

plusieurs autres facteurs modulent iNOS et où la résistance à l' insuline s' installe.

La concentration de glucose est aussi augmentée lorsque le pancréas ne parvient plus à

compenser pour la résistance à l' insuline et cela peut contribuer ainsi à l' induction de

iNOS. Ainsi, dans des cellules mésengliales de rats, une forte concentration de glucose

(30mM) potentialise l' induction d'iNOS en présence de LPS et d'IFNy [404]. Ces résultats

62

confirment ceux d'une étude précédente du groupe de Shanna [405]. Des résultats

similaires furent observés dans les cellules épithéliales humaines où la région de NF-KB

était activée en présence d' une forte concentration de glucose [406].

Par ailleurs, dans les kératinocytes où iNOS joue un rôle dans la réparation des blessures et

protège contre les infections, une forte concentration de glucose activerait iNOS après une

journée d' exposition, mais l ' inhiber~it après 10 jours en raison d'une inhibition de NF-KB

[407]. Une inhibition de iNOS fut aussi observée dans des cellules endothéliales bovine

aorta endothelial ceUs (BAEC) et dans des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC)

en présence d'une concentration élevée de glucose [408].

Le NO lui-même exercerait un effet biphasique sur sa transcription. À de faibles

concentrations, le gaz active NF-KB et augmente l'expression de iNOS. À de fortes

concentrations, l' effet opposé est observé prévenant une surproduction de NO [409] [410].

4.6.3.1 Le contrôle de iNOS par les Peroxisomes Proliferator Activated Receptors (PPAR)

Les peroxisome proliferator activated receptors r (PP ARy) sont des récepteurs nucléaires

contrôlant notamment des gènes impliqués dans la différentiation des adipocytes et inhibant

certains mécanismes pro-inflammatoires. L'étude des PPARy a suscité beaucoup d' intérêt

parce qu'une catégorie de drogues, les thiazolidinediones (TZDs), est reconnue pour lier

ces récepteurs et avoir des effets bénéfiques sur la sensibilité à l' insuline.

L'activation des PPARy cause une inhibition de iNOS, mais le mécanisme exact de

régulation n' a pas encore été bien identifié. Même si de nombreuses études montrent que

les agonistes de PPARy inhibent iNOS le mécanisme d'action en cause reste encore mal

connu.

La prostaglandine 15-deoxy-delta 12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2) serait un ligand

endogène potentiel pour l 'activation PPARy, mais l'importance des PPARy dans l' inhibition

63

de iNOS est loin d'avoir été démontrée. Par exemple, dans les astrocytes, les effets anti

inflammatoires de la 1SdPGJ2 ne seraient pas dépendants des PP ARy puisque la

surexpression d'un dominant négatif de PP ARr ou d'un inhibiteur pharmacologique de

PPARy (le GW9662), n' empêche pas la 1SdPGJ2 d' inhiber l'expression de iNOS. La

1SdPGJ2 utiliserait plutôt l' inhibition de l'activité IKK pour permettre ses actions anti

inflammatoires [411]. Dans le même ordre d' idées, la 1SdPGJ2 dans des cellules de

pancréas RinmSF empêche, d'une part, la dégradation de Iill en présence de IL-1 et,

d' autre part, l' activation de STAT en présence d'IFNy, mais là encore, la présence d'un

dominant négatif ou du GW9662 n' altère en rien les activités de la 1SdPGJ2 sur iNOS

[412]. Certaines études récentes suggèrent plutôt que le véritable ligand endogène des

PP ARy serait la lysophosphatidic acid (LP A) qui traverse les membranes cellulaires et

nucléaires et qui lie les PPARy [413]. Même si la LPA peut inhiber iNOS, son mécanisme

d' action exact est encore inconnu. La LP A est un produit lipidique généré par les cellules

endothéliales, les plaquettes et les fibroblastes des tissus endommagés, et qui contribuerait

à leur réparation - possiblement en contrôlant l' expression de iNOS [414].

Par ailleurs, le groupe de Gilkeson a suggéré que les PP ARy ne sont pas impliqués dans

l' inhibition de iNOS par les agonistes synthétiques tels que le GW34784SX, la

rosiglitazone et la pioglitazone. En effet, dans des macrophages RA W 264,7, où la présence

de PPARy est peu ou pas détectée, les agonistes de PPARy inhibent tout de même iNOS.

De plus, pour être convaincus de l' absence de PPARy fonctionnels dans leur modèle, les

auteurs ont utilisé un dominant négatif de PPARy. Même en présence de ce dominant

négatif, les TZDs inhibent iNOS de la même façon que dans les cellules contrôles. Dans la

même étude, les auteurs utilisent aussi des macrophages provenant de souris dont le gène

de PP ARy avait été préalablement détruit dans ces cellules précisément au moyen d'un

système Cre/Lox. Même en absence de PPARy, les TZDs étaient en mesure d' inhiber

iNOS, de la même façonque dans les cellules exprimant les PPARy. Les auteurs en

concluent que les PPARy ne sont pas nécessaires à l'inhibition de iNOS dans les

macrophages. Cependant, dans leur modèle Cre/Lox, une plus grande induction d'iNOS en

présence d' interféron et de LPS fut observée, suggérant que même si les TZDs ne semblent

64

pas utiliser ces récepteurs pour inhiber iNOS dans les macrophages, leur présence semble

avoir un rôle à jouer sur la modulation endogène de l' enzyme [415]. Cela pourrait

s'expliquer par les récentes publications démontrant un rôle des pp AR Y dans la polarisation

des macrophages. En effet, il fût observé par deux groupes différents, que l' absence de

PPARy dans les macrophages augmentait l' expression de facteurs inflammatoires

occasionnant la résistance à l' insuline au foie, au muscle et au tissu adipeux [416] [417].

Le groupe de Nowling a aussi identifié un élément de réponse aux PPAR: (PPRE) dans le

promoteur du gène iNOS. Par contre, cet élément ne serait pas impliqué dans l'inhibition de

iNOS par les agonistes PP ARy [418]. Finalement, comme les TZD à plus fortes

concentrations peuvent aussi activer la forme 8 des PP AR, il fut suggéré que leurs effets

observés sur iNOS concernent plutôt ces récepteurs. Il fut démontré en effet qu'iNQS était

inhibé par la présence d'un agoniste de PPAR8, le GW0742 et que, tout comme dans

l 'étude précédente, l' absence de PPARy dans des macrophages n 'empêchait pas un TZD (la

rosiglitazone) d'avoir des effets sur iNOS. Cependant, dans cette étude, l' inhibition de

iNOS par la rosiglitazone était plus efficace en présence de PPARy que dans le modèle KO.

Ces résultats suggèrent donc que l' inhibition de iNOS implique des mécanismes

dépendants et indépendants des PPARy [419].

D'autres observations suggèrent également que des PPARy exercent un rôle déterminant

dans l'inhibition de iNOS. Les résultats d'une étude réalisée dans les poumons de souris

injectées à la LPS suggèrent que la rosiglitazone inhibe iNOS par l' intermédiaire des

PPARy puisqu'en présence de BADGE, un inhibiteur de PPARy, le TZD est moins efficace

[420]. Il a aussi été montré que l' expression d'un dominant négatif des PPARy empêche

iNOS d'être inhibé par la 15dPGJ2 dans des myocytes [421].

Finalement, deux études distinctes vont à contre-courant en suggérant que dans des cellules

rénales ou de rétines, la présence d' activateurs de PPARy contribue à l ' induction d' iNOS.

Ces résultats contradictoires avec les autres études mentionnées ci-haut pourraient

s' expliquer par le type cellulaire étudié [422] [423].

65

4.6.3.2 L'inhibition de iNOS par l'activité physique

L' activité physique aurait une incidence sur l' expression de iNOS. Des études montrent

qu'un entraînement régulier permet de réduire considérablement l' expression de iNOS au

niveau du muscle squelettique. Dans ces études; iNOS était présent chez ces patients à la

suite d'une crise cardiaque et l' activité physique permettait une inhibition de l' enzyme

[424] [425]. Dans un autre modèle, où iNOS est induit chez les lapins par une diète

hypercholestérolémique, un · programme d' exercice régulier permet aussi d' inhiber

l' expression de iNOS dans les aortes [426]. Plus récemment, une étude du groupe de Saad a

montré qu' une seule période d ' exercice intense chez des rats rendus obèses par une diète

riche en gras, inhibait iNOS dans le muscle. Les auteurs ont aussi observé que la s

nitrosation d' éléments de signalisation de l ' insuline était bloquée par l'activité physique,

pouvant donc ainsi contribuer à la sensibilité à l' insuline [427].

4.6.4 iNOS et l'obésité

Il est maintenant acquis que l' obésité est une condition associée à une inflammation

modérée mais chronique. Le surplus de tissu adipeux produit des cytokines et des hormones

qui touchent l' ensemble des tissus avoisinants. Comme iNOS ·répond aux signaux

inflammatoires, il n ' est pas surprenant qu' il soit induit dans des cas de surcharges

pondérales importantes.

La première recherche faisant mention d'une association entre l' obésité et une induction de

iNOS remonte à plus de 10 ans. Dans cette étude, les auteurs observèrent une induction de

iNOS dans l' hypothalamus de souris obèses ( ob/ob) [428]. Des études plus récentes

montrent que dans ce modèle d'obésité, iNOS est aussi induit dans le muscle squelettique,

dans le tissu adipeux et au foie [429] [430]. Dans un autre modèle, chez le rat Zucker cette

fois, l ' induction de iNOS est observ~e au cœur [431]. Une étude réalisée dans notre

laboratoire montre pour sa part que l' obésité induite par une diète riche en « gras» est aussi

associée à une induction de iNOS dans le muscle squelettique et le tissu adipeux [432].

66

Cette association entre iNOS et l' obésité est aussi observée chez l 'humain. Une étude

réalisée chez trente femmes obèses a révélé une induction de iNOS dans leur tissu adipeux

[433]. De plus, une analyse du plasma de 363 adolescents montre que la concentration des

produits dérivés du NO (N02-/N03-) était près de 14 fois plus élevée chez les sujets obèses

(BMI >30 kg/m2) et 4,2 fois plus élevée chez les sujets présentant un surplus de poids

(BMI >25kg/m2) que chez les sujets normaux lai~sant supposé l'induction de iNOS [434] . 1

Plus récemment, une étude réalisée chez des patients obèses ayant subit une chirurgie

gastrique afin de perdre du poids s'est avérée très révélatrice. En effet, il fut observé que la

perte de poids induite par la chirurgie était associée à une nette réduction des concentrations

de nitrite et de nitrates en circulation laissant supposer une réduction de iNOS [435]. Il Y

aurait donc une relation certaine entre l' expression de iNOS et l' obésité.

4.6.9 iNOS et la résistance à l'insuline

Considérant le lien de causalité entre l' obésité et la résistance à l' insuline, et puisque

l' obésité semble souvent associée à une induction de iNOS, on a établi un lien entre iNOS

et la pathologie. Des études de notre laboratoire ont démontré que dans des myocytes en

culture, la présence d' IFNy, de TNFa et de LPS induit iNOS et augmente le transport de

glucose basal, mais cause un défaut dans le transport de glucose stimulé par l ' insuline.

iNOS semble dans ce cas bel et bien responsable de l'effet produit puisque la présence d'un

inhibiteur de NOS, le L-NAME, empêche cette manifestation [110]. Dans une autre étude,

Perreault et Marette ont démontré que l' absence du gène iNOS dans des souris

transgéniques protège contre la résistance à l ' insuline induite par une diète riche en « gras »

[432]. Ces résultats furent d'ailleurs confirmés par le groupe de Keamey quelques années

plus tard [436].

Chez l'humain, il a été démontré que les niveaux plasmatiques de nitrites et de nitrates

étaient plus élevés chez des patients diabétiques de type 2 que chez des sujets contrôles,

suggérant l'induction de iNOS. En effet, une étude a montré que chez quatorze patients

diabétiques de type 2, comparés à douze volontaires en bonne santé, l' expression de iNOS

était augmentée au niveau muscle squelettique [437]. Une autre étude, de polymorphisme

67

cette fois , montre une variante dans le promoteur de iNOS chez des patients diabétiques de

type 2, ce qui pourrait laisser croire à une modulation d ' activité de iNOS chez les

personnes diabétiques [438].

Perreault et Marette ont établi que iNOS cause la résistance à l'insuline au muscle

squelettique en créant une défaillance de la signalisation de l ' insuline au niveau de la PI 3-

kinase et de l 'Akt, une voie déterminante des effets métaboliques de l ' insuline [432]. Plus

récelllIllent, une étude a montré que l'exposition à un donneur de NO ou la transfection de

iNOS réduisait l'expression de la protéine IRS-1 dans les cellules musculaires en culture

primaire. Le donneur de NO augmente l'ubiquitination d'IRS-l , et les inhibiteurs du

protéasome bloquent la réduction de l'expression d'IRS-1 induite par le donneur de NO.

L'expression de iNOS est augmentée dans le muscle squelettique des souris obèses (ob/ob)

par rapport aux souris de type sauvage et la délétion du gène iNOS ou le traitement aux

inhibiteurs de iNOS améliore la diminution . de l'expression d'IRS-1 dans le muscle

squelettique de ces souris. Ces données proposent donc que iNOS réduit l'expression d'IRS-

1 dans le muscle squelettique par la dégradation d' IRS-1 et qu' il pourrait donc contribuer à

l'insulino-résistance associée à l' obésité [429]. Kaneki et Fuj imito ont pour leur part

observé les effets de iNOS induit au foie dans les souris obèses (ob/ob). Ils ont déterminé

que iNOS jouait un rôle dans l'hyperglycémie à jeun des souris obèses puisque la présence

d ' un inhibiteur de l' enzyme réduisait ce défaut. Cette étude révèle aussi que les souris

obèses traitées avec l'inhibiteur de iNOS présentaient une plus grande expression d ' IRS-1

et d' IRS-2 au foie et que la présence d'iNOS ou du donneur de NO dans des hépatocytes en

culture diminuait l' expression des deux substrats du récepteur à l'insuline [430].

4.7 La résistance à l'insuline induite par la S-nitrosylation

La S-nitrosylation est une modification post-traductionnelle réversible résultant de la

réaction du NO et d'un résidu cystéine d'un motif particulier d'une protéine en présence

d' 02- [439]. Cette modification peut altérer l ' activité de certaines enzymes telle H-ras, c

Jun N-terminal kinase-1 (JNK1), NF-KB et nNOS [440] [441] [442] [359].

68

Des études ont établi un rapprochement entre la S-nitrosylation induite par iNOS dans

l'obésité et la résistance à l' insuline. Dans une première étude, les auteurs obsérvèrent qu'un

donneur de NO dans un muscle isolé causait la S-nitrosylation du récepteur à l' insuline (IR),

de son substrat (IRS-I) et de l'Akt. L' expression d'IRS-I était aussi réduite par le traitement.

Ils utilisèrent ensuite deux modèles d'obésité associés à l' induction de iNOS, soit une diète

riche en ~< gras» et un modèle d'obésité génétique (ob/ob). Dans ces modèles, les auteurs ont

aussi observé la S-nitrosylation de IR, d' IRS-I et d'Akt et une diminution de la sensibilité à

l' insuline. L' inhibition de iNOS a permis de rétablir la signalisation par l' insuline [443]. Dans

une autre étude, les auteurs ont identifié le résidu cystéine d'Akt ciblé par la S-nitrosylation en

présence de iNOS [444].

D'un autre côté, une étude récente propose un rôle protecteur de la S-nitrosylation contre les

effets néfastes de l'hyperglycémie associée à la résistance à l' insuline. En effet, les auteurs

suggèrent qu'une forte concentration de glucose dans des cellules endothéliales, réduit la S

nitrosylation de eNOS et pourrait ainsi contribuer au dysfonctionnement de l' endothélium

chez les patients résistants à l'insuline. De plus, les auteurs de cette études observent que NF

KB est inhibé par la S-nitrosylation et suggèrent que le NO utilise donc ce mécanisme pour

réguler le facteur de transcription [445].

4.8 Le ONOO-

Le NO réagit très rapidement avec le superoxide (02-) pour former le ONOO- : le

peroxynitrite. Comme ces deux molécules sont souvent produites au site d' inflammation où

iNOS est induit par les macrophages et/ou par le tissu touché, le ONOO- est alors formé

très rapidement [446]. Bien que ni le NO ni le O2- ne soit des oxydants puissants, le

ONOO- est très réactif et peut attaquer plusieurs types de protéines par son action

oxydante [ 447].

69

4.9 L'origine du O2-

Le (02-) peut avoir différentes origines. Il peut d' abord être formé à partir des trois enzymes

NOS. En faibles concentrations de certains co-facteurs et substrats, les enzymes peuvent se

découpler et produire du (02-). Le découplage d' une enzyme fait référence à la perte d'un

électron qui devrait normalement être utilisé pour générer un produit à partir de son

substrat. L' oxygène peut alors servir d' accepteur d ' électrons et ainsi produire le (0 2-) . Dans

le cas des NOS, lorsque les niveaux de L-arginine et de BH4 sont sous-maximales, le

transfert d' électrons peut être déficient et produire du (02-) [448] [449]. Il est ainsi

intéressant de noter que les macrophages sont reconnus pour migrer aux endroits où la L

arginine est limitée,. ce qui peut contribuer à leur production de ONOO- [450]. Le NO peut

aussi inhiber la cytochrome c oxydase et ainsi inhiber la chaîne respiratoire mitochondriale,

menant alors à la production d' (02-) [451]. Plusieurs autres enzymes telles que la NADPH

oxydase, la cyclooxygenase, la lipoxygénase, et la xanthine oxydase peuvent aussi

contribuer à la génération de (02-) [452] [453].

4.10 La nitrotyrosination

La nitrotyrosination est une modification posttraductionelle sur un résidu tyrosine. Ce

processus peut faire intervenir plusieurs molécules telles que N02-, N02+, HONO et le

ONOO-. Le nitrite N02- qui est le produit majeur de dégradation du NO peut devenir un

agent de nitration. L' acidification du N02- en HN02 par des péroxydases peut mener à la

formation de N02CI un agent nitratant [454][455]. Ainsi donc, il fut proposé que ce

mécanisme de nitration était plus important que celui impliquant le NO in vivo chez la

souris. En effet, l'injection du parasite T spiralis augmente la présence de nitrotyrosine

dans des souris iNOS ,.../- au même titre que dans les souris sauvages, alors que l'induction

de l'expression de la myeloperoxidase (MPO) est pour sa part augmentée [456]. Cependant,

une autre étude a démontré que les macrophages n'exprimant pas iNOS pouvaient

effectivement produire une réaction oxydative en réponse à des cytokines, mais que la

70

quantité de nitrotyrosine était grandement réduite [457]. Chez l 'humain, la nitration de

résidus tyrosine sur des protéines particulières est retrouvée dans plus de cinquante

maladies [458].

La nitration est un processus sélectif qui ne touche pas tous les résidus tyrosine. Il faut

d' abord que le résidu tyrosine soit dans un environnement pauvre en cystéine, à proximité

d'une charge négative, dans une région bien exposée et de préférence dans une structure en

forme de boucle [459] [460].

Le rôle physiologique de la nitration pourrait être un signal de transduction dans la réponse

immunitaire. En effet, les protéines nitratées pourraient alors servir à la formation

d' antigènes pour la production d' anticorps, de facteur chémoattractant ou de signal pour

que les macrophages procèdent à la phagocytose. Il fut aussi démontré que la nitration peut

occasionner la dégradation de protéines par la chymotrypsine en particulier [461]. Il fut

aussi postulé que la nitration pouvait altérer la conformation, la structure et l'activité

catalytique de protéines [462]. Par ailleurs, comme la nitration est à la base de plusieurs

protéines dans différents tissus, cette modification pourrait avoir un rôle physiologique en

l' absence d' inflammation. Aussi, certains ont-ils suggéré que la nitration pouvait jouer un

rôle dans la transmission synaptique et dans l'ovulation [463].

4.10.1 Effets de la nitrotyrosination sur la signalisation cellulaire

La phosphorylation sur tyrosine est l'un des processus ' les plus reconnus ' dans la

signalisation cellulaire. Les tyrosines kinase catalysent le transfert d'un groupement

phosphate à un groupe hydroxyle d'un résidu tyrosine. Cette réaction est réversible en

présence de phosphatases. Le processus de phosphorylation sur tyrosine est sélectif. Par

exemple, une séquence particulière d'acides aminés entourant le résidu tyrosine et une

conformation adéquate de la protéine lui confèrent sa susceptibilité à être phosphorylée. De

la même façon, la nitration sur tyrosine demande un environnement particulier et est lui

aussi réversible par la présence de dénitrase [464]. Certains suggèrent que les deux

processus de modification sur tyrosine requièrent les mêmes exigences [460]. On suppose

71

que la nitration sur tyrosine empêche la phosphorylation de ce même résidu. En effet, il est

postulé que la nitration de résidus tyrosine fige l' enzyme cible dans une conformation

inactive [465] [466]. Par exemple, la molécule d' adhésion platelet endothelial cel! adhesion

molecule (PECAM-1) ne peut plus être modulée par sa phosphorylation à la suite de la

nitration sur le résidu tyrosine 686 [467]. Beaucoup d' autres enzymes telles que la

glutamine synthase, la prostacyclin synthase, la tyrosine hydrolase et la Ca-ATPase du

reticulum sarcoplasmique peuvent être inactivées ainsi [459] [468] [469] [470].

4.10.2 La nitration et la résistance à l'insuline

Il semble exister un lien entre la présence de nitrotyrosine et le diabète de type 2. Dans une

étude sur quarante sujets diabétiques type 2, comparés à 35 sujets en bonne santé, la

présence de nitrotyrosine fut observée dans tous les plasmas des sujets malades et non

détectée chez les contrôles [471]. Cette présence de nitrotyrosine pourrait connaître son

origine dans le déséquilibre des niveaux de glucose observés chez les diabétiques. En effet,

une forte concentration de glucose semble induire la nitration dans certains tissus et

certaines cellules en culture. Ainsi la perfusion de cœur de rat avec une solution à forte

teneur en glucose augmente la production d' 02- de 300 %, augmente de 40 % la production

de NO causée par une induction de iNOS et permet la détection de nitrotyrosine [472]. De

la même façon, des cellules endothéliales en culture (HAECs) exposées à des

concentrations de glucose au-dessus des normales cause la nitration de certaines protéines

[473]. Finalement, une étude chez des sujets humains en bonne santé a montré qu'une

augmentation du glucose sanguin à 15 mmollL durant deux heures augmentait la présence

de nitrotyrosine dans le plasma [474].

L' insuline qui possède des résidus tyrosine importants pour son interaction avec son

récepteur pourrait elle même être la cible de nitration. Différentes études indiquent que

l' insuline peut être nitratée sur des résidus tyrosine causant ainsi une réduction de sa

capacité à lier son récepteur [475] [476]. Il est à noter par ailleurs, qu' il a été suggéré que le

peroxynitrite inhiberait l' activation des PPARy par leur nitration dans les macrophages. Tel

que mentionné plus haut, ces derniers ont des rôles bénéfiques contre la résistance à

72

l' insuline donc leur inactivation par leur nitration pourrait contribuer au développement de

la pathologie [477].

73

5. Buts de l'étude

Les tissus adipeux étant sensibles à l'insuline, nous avons voulu dans une première étude

déterminer si les tissus adipeux, blanc et brun, étaient aussi la cible des effets néfastes de

iNOS sur la sensibilité à l'insuline au même titre que nous l'avions établi pour le muscle

squelettique. Cette étude fut publiée dans la revue Hormone and Metabolic Research

(2000 ; 32 : 480-484). Je suis première auteure de cet article.

Afin d'approfondir les mécanismes impliqués dans la résistance à l'insuline observée dans

le muscle squelettique en présence de iNOS, nous nous sommes questionnés sur

l'implication de la formation du ONOO- dans ce phénomène. Manuscrit en préparation. Je

suis première auteure de cet article.

Dans un troisième temps, nous avons déterminé si l'induction de iNOS pouvait contribuer

aux désordes métaboliques observés lors de l'incubation prolongée de muscles in vitro.

Cette étude est particulièrement déterminante pour l'interprétation des données obtenues par

quiconque utilisant cette technique pour répondre à ses objectifs scientifiques. Manuscrit en

préparation. Je suis première auteure de cet article.

Finalement, nous avons évalué si les effets sensibilisateurs à l' insuline de drogues activant

l'AMPK n'impliqueraient pas leurs capacités à inhiber l'expression de iNOS. Cette étude

fut publiée dans la revue Journal of Biological Chemistry 2004 May 14,·279(20):20767-74.

Je suis première auteure de cet article.

Chapitre 1. La production de monoxyde d'azote par les adipocytes : un rôle dans la pathogenèse de la résistance à l'insuline?

Cette étude compare les effets d' iNOS sur le muscle et le tissu adipeux en ce qui a trait à la

sensibilité à l' insuline au niveau du transport de glucose. Nous avons déjà rapporté que

l' induction d' iNOS au niveau du muscle cause une réduction de la capacité de l' insuline à

permettre le transport du glucose. Les conséquences de l' induction de l' enzyme sur la

sensibilité à l' insuline dans les adipocytes restaient à déterminer. Nous utilisons donc dans

cette étude, un modèle d'adipocytes blancs (3T3-Ll) et bruns (T37i) dans lesquels iNOS

est induit par un mélange de cytokines (TNFa et IFNy) accompagné de LPS. Le rôle

d' iNOS dans les effets observés fut déterminé par l' utilisation d'un inhibiteur spécifique:

le 1400W. Contrairement à ce que nous avions précédemment observé au niveau du

muscle, nous avons constaté que dans les adipocytes en culture la résistance à l' insuline

induite par la présence de cytokines et de LPS, n' impliquait pas iNOS puisque son

inhibition par le 1400W ne prévenait pas le défaut de transport du glucose stimulé par

l' insuline. Nous proposons finalement que, même si la présence d'iNOS dans le tissu

adipeux n' est pas dommageable pour ce dernier, il n' en demeure pas moins que son

induction pourrait contribuer à la résistance à l'insuline du muscle qui lui est affecté par la

présence de monoxyde d'azote.

75

Nitric oxide production by adipocytes : a role in the pathogenesis of insulin

resistance ?

Geneviève Pilon, Patrice Penfomis and André Marette*

Department of Physiology, Lipid Research Unit, Laval University Hospital Center, Québec,

G1V 4G2, Canada . .

Short title: NO and glucose metabolism in adipocytes.

* To whom correspondence should be adressed at:

Departement ofPhysiology & Lipid Research Unit

Laval University Hospital Research Center

2705 Laurier Boulevard, RC 9502

Sainte-Foy, Québec, G 1 V 4G2, Canada

Fax: (418) 654-2176

E-mail: [email protected]

76

INTRODUCTION

The radical gas nitric oxide (NO) has been shown to participate in an ever-growing

number of cellular processes. NO can be recognized as an intracellular second messenger, a

paracrin~ substance for regulation ofneighboring cells, and a neurotransmitter [see (1 , 2)].

NO is synthetized from L-arginine by a family of enzymes known as NO synthases (NOS).

There are at least three different isotypes of NOS enzymes: the endothelial type (eNOS or

NOS III), the neuronal type (nNOS or NOS 1), and the inducible type (iNOS or NOS II).

eNOS is mainly expressed in endothelial cells and catalyzes the synthesis of NO which

mediates vasorelaxation of the underlying smooth muscle. nNOS is highly expressed in the

central nervous system where NO serves as a messenger for neurons, much like a

neurotransmitter. Unlike its constitutive Ca2+-dependent eNOS and nNOS counterparts,

iNOS is mainly regulated at the expression level and its activity is in large part independent

from Ca2+. In most species, iNOS is expressed to very low levels under normal conditions.

However, its cellular expression is markedly stimulated by bacterial endotoxins or

inflammatory cytokines (2, 3). When induced, this isoform generates high concentrations of

NO as compared to eNOS or nNOS. In macrophages, sustained production of NO enables

cytotoxic activity against invading microorganisms. Although this high-output NO pathway

probably evolved to protect the host from infection, there is also evidence that it can cause

deleterious effects to other normal host cells which conf ers to iNOS the

protective/destructive duality inherent in every other major component of the immune

response. For example, the marked NO production that is consequent to iNOS expression in

many tissues in endotoxic shock is believed to cause hypotension, organ injury and

dysfunction [reviewed in (3)].

NOS expression in adipose tissue

Whereas iNOS expression in macrophages is well documented, we and others have

recently reported that the enzyme can also be induced by LPS and cytokines in many other

tissues including classical targets of insulin action such as the liver, skeletal muscle and

white and brown adipose tissues (4, 5, 6, 7, 8). The effects of LPS and proinflammatory

77

cytokines on iNOS induction in white and brown adipose tissues are depicted in Figure 1.

Low but detectable expression of iNOS mRNA and prote in can be foùnd in adipose tissues

. of normal rats (Figure lA-B). A single injection ofbacteriallipopolysaccharide (LPS) in rat

(a model of endotoxic shock) markedly increased iNOS expression in white (epididymal

and perirenal) and interscapular brown adipose tissues, raising iNOS enzymatic activity by

10-20-fold (Figure lB).

We have also used adipose cell lines to investigate the regulation of iNOS

expression by LPS and preinflammatory cytokines. We used 3T3-Ll adipocytes as a model

of white fat cells and T37i adipocytes as a model of brown adipose cells. The T37i fat cell

line was derived from a mouse hibemoma (9) and present typical features of brown

adipocytes (e.g. uncoupling protein-l expression; see (10)). As shown in Figure le, iNOS

cellular expression and activity can be directly increased by incubating cultured white and

brown adipocytes with a mixture of cytokines and LPS. We have previously reported that

neither LPS alone nor individual cytokine can increase iNOS-mediated NO production in

3T3-Ll adipocytes (8) and we have obtained similar findings with T37i brown adipocytes

(Penfomis and Marette, unpublished observations). This indicates that iNOS induction in

endotoxin-challenged rats is mediated by a complex network of interactions between

inflammatory cytokines and endotoxin at the level of the adipocyte.

1t has recently been reported that eNOS is also expressed in hum an adipose tissue

(11). Although adipose tissue eNOS may be explained by the presence of endothelial cells

in the tissue extracts, the fact that the enzyme could also be detected in isolated adipose

cells strongly suggest that eNOS is also expressed in adipocytes. However, we could not

detect eNOS in either 3T3-Ll white adipocytes (8) or T37i brown adipocytes (Penfomis

and Marette, unpublished observations). The neuronal isoform nNOS was not detected in

adipose tissues of either rat or humans (8, Il).

Biologica~ role of NOS in adipocytes

NO and lipid metabolism

78

There is sorne evidence that NO can regulate adipocyte lipolysis. 1ndeed, Gaudiot et

al. (12) reported that NO-releasing compounds inhibits catecholamine-stimulated lipolysis

in rat fat cells. The NO-dependent inhibition of catecholamine-stimulated lipolysis has been

recently confirmed in isolated human fat cells (13). On the other hand, in the absence of

catecholamines, NO donors can also increase basallipolysis (12). Whether NO is mediating

the known stimulatory effects of cytokines (such as TNF -u) on lipolysis remains to be

tested. 1t has also been speculated that eNOS-mediated NO production may decrease

lipolysis in human fat cells (11). 'Clearly, more studies are needed to clarify the precise role

of NO in modulating fat celllipolysis.

There is also evidence that NO regulates lipoprotein metabolism in brown

adipocytes. One study reported that TNF-u-induced inhibition of lipoprotein lipase (LPL)

activity was mediated by iNOS induction and NO production in brown adipocytes (14).

More recent studies from Deshaies and colleagues further suggest that iNOS induction in

skeletal muscle and brown fat of LPS-challenged rats is also mediated by iNOS activity

(Picard, Perreault, Kapur, Marette, and Deshaies, unpublished data). 1ndeed, they found

that LPS-induced LPL inhibition in these tissues was blocked by the specific iNOS

inhibitor aminoguanidine (AGN) and was prevented in iNOS knockout mice. 1ntriguingly,

although LPS also blunted LPL activity in white adipose tissue, this effect could not be

abrogated by AGN treatment or by targeted disruption of iNOS in mice, therefore

suggesting that NO exerts tissue-specific modulation of LPL activity in endotoxemia.

NO and glucose metabolism

1nsulin is believed to enhance glucose disposaI in peripheral tissues at least in part by

increasing muscle perfusion by vasodilatory mechanisms [reviewed in (15)]. The

stimulatory effect of insulin on tissue blood flow has been reported to be dependent on

endothelium NOS (eN OS). T~e implication of eNOS in insulin-mediated glucose disposaI

is also supported by our previous observation that in vivo administration of the NOS

inhibitor L-NAME significantly reduced insulin-stimulated glucose uptake by individual

skeletal muscles and white and brown adipose tissues (16). A role for eNOS in mediating

79

insulin-dependent glucose disposaI is also supported by the finding that mi ce with targeted

disruption in eNOS gene develop insulin resistance (17). Thus, eNOS-mediated NO

production in the microvasculature of muscle and adipose tissues appears to be important

for optimal glucose metabolism by these tissues

On the other hand, overproduction of NO by. iNOS induction may also directly

affect glucose metabolism in fat and muscle cells. Thus, we have previously demonstrated

that LPS and cytokines modulate glucose metabolism by inducing iNOS expression in

skeletal muscle and cultured L6 myocytes (6, 18). In L6 myocytes, chronic treatment with

cytokines and LPS caused a large increase in basal glucose transport but also completely

inhibited the ability of insulin to stimulate glucose transport. Both effects were largely

abrogated by the non-specific NOS inhibitor L-NAME (18). On the other hand, the

potential effect of adipose NO production on glucose metabolism has not yet been

investigated. As shown in Figure 1 C, the 3T3-L1 and T37i celllines represent valuable in

vitro models to study the impact of iNOS induction and NO production on white and brown

adipocyte glucose metabolism, respectively. Thus, we have investigated the potential role

of NO in mediating changes in glucose uptake in cytokines/LPS-treated adipocytes.

To test the implication of NO in cytokine/LPS-treated adipocytes, we used the

recently described and selective iNOS inhibitor 1400W (19). As shown in ' Figure 2A,

addition of 1400W to cytokines/LPS-treated cells totally abrogated iNOS activity, as

measured by nitrite production over 24 hrS, in 3T3-Ll white adipocytes. The inhibitor also

largely, but not completely, inhibited iNOS-mediated NO production in T37i brown

adipocytes (Fig. 2B). Cytokines/LPS markedly increased (3-4-fold) basal glucose transport

in both 3T3-L1 white adipocytes and T37i brown fat cells. However, iNOS inhibition with

1400W failed to prevent the increase in basal glucose uptake in white adipocytes (Fig. 2C)

and only partially inhibited this effect in brown adipocytes (Fig. 2D). These data indicate

that the elevated basal glucose uptake is entirely or mostly explained by NO-independent

pathways in cytokine/LPS-treated white and brown fat cells, respectively. The

cytokines/LPS mixture also markedly reduced the acute stimulatory effect of insulin on

glucose uptake in both white and brown adipocytes (Fig. 2E and F). Addition of 1400W

,------------~~--- - - -- ~

80

failed to reverse insulin resistance in both cell types. This is in marked contrast with our

observations that iNOS inhibition with L-NAME (18) or 1400W (Pilon and Marette,

unpublished data) reduced ~oth the basal increase in glucose uptake and the insulin

resistance induced by cytokines/LPS exposure in skeletal muscle cells.

These results indicate that NO modulates glucose metabolism in a cell type-specific

manner. In this regard, it is interesting to note that a similar difference in NO action was

observed for the effect of endotoxin challenge on LPL activity in skeletal muscle and

brown adipose tissue versus white adipose tissue. The mechanisms behind this selective

action of NO in different insulin target cells remain to be clarified.

Adipocyte iNOS and insulin resistance.

What is the physiological role of iNOS in adipose tissue? We have previously

suggested that iNOS induction in adipose tissues may play a role in the local immune

defense during inflammatory processes [see (8)]. White and brown fat are dispersed

throughout the body and are widely distributed along and even within maj or organs such as

the intestine, liver, kidney, blood vessels and skeletal muscle. It is therefore likely to

represent a major source of local NO generation in inflammatory settings. Such a link

between the immune system and adipose tissue is consistent with previous observations

that adipsin, the initial and rate-limiting enzyme of the alternative pathway of complement

activation (20), is mainly expressed in adipose tissue and that fat cells are a major site of

expression and synthesîs of immunoregulatory molecules such as the cytokines TNF -u and

leptin, the product of the ob gene T see (21) for a review].

On the other hand, iNOS-derived NO is also known as a double-edged sword since

it can also be detrimental to the host in a variety of inflammatory conditions. For example,

the marked NO production that is consequent to iNOS expression in many tissues in

endotoxic shock is believed to cause hypotension, organ injury and dysfunction [see(3)].

Our previous work indicates that another deleterious effect of endotoxemia that appears to

be related to iNOS induction is the development of muscle insulin resistance (6). Indeed,

both LPS challenge in vivo and treatment with cytokines in vitro caused insulin resistance

81

for glucose uptake in skeletal muscle. These effects can be mainly abrogated by the NOS

inhibition with L-NAME (18) or the selecctive iNOS inhibitor aminoguanidine (Perreault,

Kapur and Marette, unpublished data).

On the other hand, the present data suggest that NO is not an autocrine modulator of

glucose metabolism in white adipose cells since iNOS inhibition with ,1400W failed to

restore insulin action in both white and brown adipocytes chronically exposed to cytokines

and LPS. However, as proposed in Figure 3, it may be possible that NO exerts sorne

paracrine modulation of skeletal muscle glucose metabolism. Indeed, NO is a low

molecular weight, highly lipophilic molecule, and can diffuse rapidly to neighboring cells.

It is therefore conceivable that the marked iNOS induction and NO production by local

adipose cells contributes to muscle insulin resistance in endotoxemia. In this model, NO

may inhibit insulin action only when its levels are abnormally increased, i.e. when iNOS

expression is induced. In this situation, NO may react more readily with 02- to form the

potent oxidant · peroxynitrite (ONOO-) and override the cell natural defense against

oxidation (antioxidant enzymes and oxidant scavengers). This double-edged sword effects

of NO is well documented for other systems (e.g. cardiovascular, central nervous), and can

be compared to the protective/deleterious nature of adipose tissue TNF-a, which may

provide local immune protection but also inhibits insulin action in skeletal muscle of obese

animaIs (22, 23).

It is also possible that iNOS induction in adipocytes contribute to obesity-linked

insulin resistance. Indeed, since skeletal muscle is infiltrated with adipose tissue in obese

subjects, elevated NO production by adipocytes may thus contribute to the development of

insulin resistance in obesity. In line with this hypothesis, we have recently found that iNOS

expression is induced in both skeletal muscle and white adipose tissue of high-fat fed rats

and mice and that iNOS knockout mice are protected from the development of insulin

resistance in high-fat diet-induced obesity (Perreault and Marette, unpublished

observations ).

82

Conclusions

The studies reported and the new data presented in this minireview article present indicate

that iNOS expression is inducible in classical targets of insulin action, namely skeletal

muscle, white and brown adipose tissues. Our results also indicate that NO is not the

mediator of cytokine/LPS-mediated insulin resistance in white and brown fat cells,

respectively. Howev'er, iNOS induction in adipose tissue could contribute to insulin

resistance through a paracrine modulation of muscle insulin-stimulated glucose uptake.

Future studies will be aimed at testing whether selective iNOS invalidation in adipose

tissue of obese animaIs could reduce or even prevent the development of insulin resistance,

hypertriglyceridemia and associated cardiovascular complications.

83

Acknowledgments

We wish to thank Dr Amira Klip (Hospital for Sick Children, Toronto, Canada) and Dr

Marc Lombès (INSERM U478, Université Bichat, Paris, France) for providing the 3T3-Ll

and_T37i adipose cell lines, respectively. We also wish to thank Drs Yves Deshaies and

Claude'H. Côté for critical reading ofthis review.

The work presented in this review was supported by a grant from the Canadian Institute for

Health Research and by scholarships from the Fonds de la Recherche en Santé du Québec

to A. Maretle

G. Pilon was supported by studentship from Energy Metabolism Research Center

(CREME), Laval university, Québec.

P. Penfomis was supported by Doctoral studentship from the Canadian Institute for Health

Research.

84

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,----------------- ~ ~~

87

Legends to figures

Figure 1: iNOS expression in white and brown adipose tissues

A) LPS-induced expression of iNOS synthase (iNOS) mRNA ln white epididymal

(EW AT), perirenal (PW AT), and interscapular brown adipose tissue (BAT). Rats were

treated for 4 hours with LPS or vehicle, RNA was isolated and iNOS mRNA was measured

by RT-PCR, as in ref. (18). B) Effects ofLPS on iNOS prote in levels and iNOS activity in

white and brown adipose tissues. Rats were treated or not with LPS for 4 hours and tissue

iNOS protein levels and iNOS activity were determined by Western blotting with an iNOS-

specific antibody " and by the 3H-citrulline assay, respectively, as described in (6 8). C)

Effects of cytokines/LPS (interferon-y 200 U/ml, TNF-a lOng/ml and LPS 10Jlg/ml) on

iNOS protein levels in T37i brown adipocytes and in 3T3-Ll white adipocytes. Cells were

treated with cytokines/LPS for 24 hours and iNOS protein levels were detected by Western

blotting. Nitrite production was measured by the Griess reaction, as in (6). AlI data

represent means ± SE ofthree individual experiments. *P<O.Ol vs control values.

Figure 2 : Effect of the iNOS inhibitor 1400W on NO production and glucose uptake

in cytokines/LPS-treated 3T3-Ll white and T37i brown adipocytes.

Cells were treated or not for 24 ho urs with interferon-y (200 U/ml, lnM), TNF-a (lOng/ml),

LPS "(1 o Jlg/ml) ± l400W (0.1 mM), and A) NO production, B) basal glucose uptake, and

C), insulin-mediated glucose uptake was measured. NO production was determined by

measuring the accumulation of nitrite in the medium by the Griess reaction. Cellular

glucose uptake was measured by use of the glucose analogue 2-[3H]-2-deoxy-D-glucose as

described in (18). When present, insulin (100 nM) was added 30 min before uptake

measurements. Data represent means ± SD of 2 (T37i) and 3 (3T3-Ll) individual

experiments. *P<O.Ol vs control values. +P<O.Ol vs cytokines/LPS values.

Figure 3: Proposed role for adipose iNOS induction in skeletal muscle insulin

resistance in obesity and inflammation.

88

Increased concentrations of proinflammatory cytokines (and perhaps other mediators)

induce iNOS expression in skeletal muscle and adipocytes. NO inhibits insulin-stimulated

glucose uptake in skeletal muscle (6, 18) but not in adipose cells (results of the present

study). However, marked NO production by local adipocytes may affect insulin action in

muscle cells through a paracrine action, especially in obesity where muscle tissue is

infiltrated with fat cells.

Figure. 1

A LP8 :

B

c

+

EWAT

o COî1t'ol • LPS

EWAT

Basal Cyto IlPS

313 -ll vil ite adipocytes

+

FWAT

PW"AT

irJOS

500 c

'S 400 e :; 300 e ~2OJ o z 2 100 =l

+

"'-- îN08

~ GAPDH

BAT

BAT

Basal CytoA...PS

137i b rom ooipocytes

iN0 8

89

Figure 2

A

c:

~2oo Q. CT)

.e ~1oo Z :E =-

3T3-L 1 V\hi te adi poe e

O~---

c

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Figure 3

Obesity Inftammation

\ 1 t proinftammatory cytokines

ether mediaors ?

Skeletal Muscle

1 NO~

I."suu" resista"ce 1

Adipoc.yles

91

92

Chapitre 2. L'induction de iNOS cause la résistance à l'insuline par un mécanisme dépendant du peroxynitritre par la nitration d'IRS-l dans le muscle squelettique.

La synthase de NO inductible (iNOS) est connue pour produire de fortes concentrations de

monoxyde d' azote (NO) et est impliquée dans la défense immunitaire par ses activités anti

tumorales et antimicrobiennes. Cependant, une expression incontrôlée de iNOS a été

associée à la pathogenèse de différentes maladies. En particulier, il fut rapporté récemment

que l' induction de iNOS avait un rôle à jouer dans la résistance à l' insuline du muscle

associée à l' obésité. Dans la présente étude, nous avons démontré qu'un traitement à la LPS

chez le rat induisait iNOS et causait un défaut du transport du glucose stimulé par l' insuline

due à une diminution de l' activité PI 3-kinase associée à IRS-l. Nous avons trouvé que le

NO est un joueur majeur dans cet effet puisqu'un inhibiteur de iNOS ; l' aminoguanidine

rétablissait l' action de l'insuline. De plus, les souris invalidées pour le gène iNOS étaient

protégées contre la résistance à l'insuline induite par l' injection de LPS. L'exposition-de

cellules musculaires en culture à des cytokines et à la LPS causait aussi l' induction de

iNOS et la résistance à l'insuline par un mécanisme dépendant de l' activité PI 3-kinase

associée à IRS-l. Cependant, un inhibiteur spécifique de iNOS le 1400W ou l' agent

neutralisant de ONOO-, epigallocatechin gallate (EGCG) empêchaient tous deux la

résistance à l'insuline causée par le' traitement. De plus, nous avons observé que

l' exposition de ces mêmes cellules musculaires au ONOO- directement reproduisait l ' effet

inhibiteur des cytokines/LPS sur l'action de l'insuline au niveau du transport du glucose et

sur l' activité PI 3-kinase. Finalement, l' induction de iNOS ou le traitement direct à l'aide

du ONOO- causent la nitration d' IRS-l sur des résidus tyrosine causant ainsi une capacité

réduite d'IRS-l d'être phosphorylée sur ces tyrosines par l'action de l'insuline. Nos

résultats suggèrent donc que le ONOO- est le principal médiateur de la résistance à

l' insuline suivant l'induction de iNOS.

~----------------------------------------------------------------------------- ---- - ----

93

iNOS induction causes insulin resistance by a peroxynitrite-dependent tyrosine nitration of IRS-1 in skeletal muscle

Geneviève Pilon, Patrice Dallaire, Mylène Perreault, Sonia Kapur, and André Marette*

Department of Anatomy and Physiology, and Lipid Research Unit, Laval University Hospital Research Center, Sainte-Foy, Québec, G 1 V 4G2, Canada.

RUNNING TITLE: Peroxynitrite causes insulin resistance in muscle.

* Address correspondence to: Dr. André Marette Department ofPhysiology & Lipid Research Unit Laval University Hospital Research Center 2705, Làurier Blvd Ste-Foy, (Québec), Canada, G1V 4G2 Tel: (418) 656-4141 ext. 47908 Fax: (418) 654-2176 E-mail: [email protected]

94

Abstract

Inducible nitric oxide synthase (iNOS), an enzyme known to produce large amount of nitric

oxide (NO), is implicated in immune defense through its antitumor and its antimicrobial

activities. However, marked expression of iNOS has also been associated with the

pathogenesis of various diseases. Indeed, we have previously reported evidence for a

detrimental role of iNOS in obesity-linked insulin resistance in muscle. In the present

study, we show that LPS treatment in rats induces iNOS and causes a defect in insulin

stimulated glucose uptake in muscle due to a decrease in IRS-l associated PI 3-kinase

activity. Importantly, the insulin resistant effect of LPS could be blunted by the iNOS

inhibitor aminoguanidine or by targeted di~ruption of iNOS. Exposure of cultured muscle

cells to cytokines and LPS also induced iNOS and caused insulin resistance through

impairment of IRS-l associated PI 3-kinase activity. Interestingly, both the specific iNOS

inhibitor, 1400W, and the ONOO- scavenger, epigallocatechin gallate (EGCG), prevented

the cytokine/LPS induced insulin resistance in these cells. Moreover, we found that

exposure of muscle cells to authentic ONOO- reproduced the inhibitory effect of

cytokines/LPS on insulin mediated glucose transport and PI 3-kinase activity. Imp o rtantl y ,

both iNOS induction and ONOO- treatment caused nitration of IRS-l on tyrosine residues

which was linked to a reduced capacity of IRS-l to undergo insulin dependent tyrosine

phosphorylation. These results suggest that ONOO- is an important mediator of muscle

insulin resistance following iNOS induction and that this oxidant derivative inhibits insulin

action via nitration of IRS-l and inhibition of its associated PI 3-kinase activity.

95

INTRODUCTION

The highly reactive gas nitric oxide (NO) has been shown to participate in a large variety of

physlological processes such as neuronal transmission, kidney function, vascular relaxation

and immune modulation [1]. There are at least three different isoforms of the NO synthase

(NOS) enzymes: the endothelial type eNOS, the neuronal type nNOS and the inducible

type iNOS. Unlike the other members of the NOS family which are constitutively

expressed Ca2+-dependent enzymes, iNOS must be induced by inflammatory cytokines

and/or bacterial endotoxins. Once induced, iNOS then generates NO at a much higher rate

and for a longer period oftime than the other two NOS enzymes.

Even though iNOS has an important role to play in host defense, there is much evidence

that the mass production of NO by this enzyme also has a deleterious impact on healthy

host cells [2]. Indeed, it is weIl accepted that uncontrolled iNOS induction is involved in

the etiology of multiple disease states including Alzheimer' s disease, apoptosis/necrosis of

pancreatic Islets, hypotension, inflammatory bowel disease, and rheumatoid arthritis [3] [4]

[5] . Along with these findings our lab has shown that iNOS induction leads to disturbances

in glucose metabolism and is inyolved in the pathogenesis of obesity-linked insulin

resistance. However, this is not surprising since it is now weIl established that obesity is a

chronic inflammatory disorder characterized by increased expression of inflammatory

cytokines su ch as TNF-a, interferon-y, IL-6, IL-l~ that are known to induce iNOS

expression[ 6] . Indeed, iNOS induction has been observed in aorta, skeletal muscle and

adipose tissue of high-fat fed mice, in the heart of diabetic Zucker rats and in skeletal

muscle and platelets of type 2 diabetic subjécts [7] [8] [9] [10]. We have also previously

shown that iNOS knockout mice are protected against insulin resistance induced by high

fat feeding; and these results have 'been confirmeçl recently by Keamey' s group [7] [8].

Persistent high levels of NO in the cellular environment can lead to the production of

oxidative metabolites. Protein S-nitrosylation is one such form of oxidative modification

that has been proposed to play an important role in the pathogenesis of iNOS induced

insulin rësistance. Indeed, S-nitrosylation is elevated in patients with type 2 diabetes and

96

increased S-nitrosylation of the insulin receptor, insulin receptor substrate-1 and AKT have

been reported in skeletal muscle of obese, diabetic mice [11][12]. Alternatively, due to its

unpaired electron, NO may also act as a free radical within the cellular environrnent and

will readily react with superoxide O2- to form peroxynitrite (ONOO-). This powerful

oxidant has been reported to modulate cellular functions through nitration of tyrosine

residues and the detection of prote in tyrosine nitration is used as a footprint of peroxynitrite

formation. It is noteworthy that nitrated proteins have been detected in at least 50 human

diseases such as: Alzheimer disease, rheumatoid arthritis, glaucoma, asthma and

inflarnmatory bowel disease [13]. What is more it has been shown that nitration of tyrosine

residues decreases their subsequent phosphorylation capacity and different groups have

reported that protein tyrosine nitration is found at higher levels in type 2 diabetics [14] [15]

[16]. Thus, it is therefore conceivable that ONOO- could impair insulin action through

nitration of key residues on proteins involved . in insulin signaling. The aim of this study

was to determine the role of ONOO- in iNOS-mediated insulin resistance and to clarify the

target of its action within the insulin signaling pathway.

Materials and Methods

Interferon-y and TNF-a were purchased from Research Diagnostics Inc. , (Flanders, NJ),

and RD systems (Minneapolis, MN), respectively. 1400W and polyclonal nitrotyrosine

antibody were from Biomol Research Laboratories Inc. AlI cell culture solutions and

supplements were purchased from Life Technologies, Inc. except for fetal bovine serum,

which was purchased from Wisent (St-Bruno, QC, Canada). Reagents for SDS

polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting were from Bio-Rad. ECL and [2-

3H]Deoxyglucose were from PerkinElmer Life Sciences. [y_32P]ATP, protein A- and G

Sepharose, anti-mouse or anti-rabbit immunoglobulin G conjugated ta horseradish

peroxidase were purchased from Amersham Pharmacia Biotech (Baie d'Urfé, QC, Canada).

Polyclonal antibodies against IRS-1 (raised against 20 C-terminal amino acids (C-20)),

were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). The antibody IRS-1 for

the western blot was from Cell Signaling (Beverly, MA). Polyclonal iNOS antibody was

purchased from Upstate Biotechnology and eNOS and nNOS antibodies were from

97

transduction (San Jose, CA). PI 3-kinase substrate (Crosstide) and monoclonal antibody

against phosphotyrosine were obtained from Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY).

Human insulin was obtained from Eli Lilly (Toronto, ON, Canada). L-a -

phosphatidylinositol was from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Oxalate-treated TLC

si li ca gel H plates were obtained from Analtech (Newark, DE). AIl other chemicals were

from Sigma (St.Louis, MO).

Cell culture

L6 myoblasts were grown in a-MEM (10% FBS) containing 1 % antibiotic/antimycotic

(100 000 units/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, 0.25 mg/ml amphotericin) and

differentiated into myotubes in a-MEM (2% FBS). iNOS induction by cytokines and LPS

in L6 myotubes was the result of 24 hours incubation in presence of TNF-a (lOng/ml),

IFN-y (200U/ml) and LPS (lOJlg/ml). The accumulation of nitrite in the incubation medium

was used as an index of NO production. Nitrite was determined spectrophotometrically as

described previously [17].

AnimaIs

This study was approved by the Animal Care and Handling Committee of Laval University.

~ale Sprague-Dawley rats (200- 250 g) purchased from Charles River (Montréal, Canada)

were used in these studies. Rats were pre-treated with a single intraperitoneal injection of

aminoguanidine or saline (vehicle) 30 min prior to LPS (20 mg/kg, BW) or saline .

treatment. AnimaIs were sacrificed 6 h later, and muscles tissues were removed and stored

at -80 oC until further processing. Breeding pairs of Nos2-/- mice were a gift from C.

Nathan and J.S.Mudgett. The mice have been subsequently bred under specific pathogen

free conditions at the Animal Facility of Laval University hospital research center. Mice

were given free access to a standard low-fat diet (Purina Rodent Chow, Madison,

Wisconsin). AnimaIs were sacrificed 6 h after LPS treatment.

Tyrosine phosphorylation of the insulin receptor and IRS.

Cell or tissue lysates (500ug of prote in) were immunoprecipitated with 2 Jlg of anti

phosphotyrosine (4GlO) coupled to prote in A-Sepharose ovemight at 4°C. The immune

98

complex was washed three times in PBS (pH 7.4) containing 1 % NP-40 and 2 rnmol/l

Na3 V04 , resuspended in Laemmli buffer, and boiled for 5 min. Proteins were resolved on

SDS-PAGE (6% gel) and processed for Western blot analysis.

PI 3-Kinase Activity

Cell or tissue lysates (500 J.lg) were immunoprecipitated with 2 J.lg of anti-IRS-1 coupled to

protein A-Sepharose overnight at 4°C. PI 3-kinase activity was determined as described

previously [18].

Measurement of2-Deoxyglucose uptake

Measurement of 2-Deoxyglucose uptake was performed as previously described [17]. In

brief, cells were incubated for 8 min in HEPES-buffered saline containing 10 J.lM unlabeled

2-deoxyglucose and 10 J.lM D-2-deoxy-e H]glucose (0.5 J.lCi/ml). The reaction was

terminated by washing three times with ice-cold 0.9% NaCI (w/v). Cell-associated

radioactivity was determined by lysing the cells with 0.05 N NaOH, followed by liquid

scintillation counting. Glucose transport in isolated soleus and EDL muscles was measured

by use of the glucose analogue 2-eH]2-deoxy-D-glucose as described [19].

Nitrotyrosine measurement

Cell lysates (500J.lg of prote in) were immunoprecipitated with 2 J.lg of anti-nitrotyrosine

coupled to prote in G-Sepharose overnight at 4°C. The immune complex was washed three

times in PBS (pH 7.4) containing 1% NP-40 and 2 mmol/l Na3V04, resuspended in

Laemmli buffer, and boiled for 5 min. Proteins were resolved on SDS-PAGE (7,5% gel)

and processed for Western blot analysis.

Measurement of Plasma Nitrite and Nitrate

Nitrite and nitrate levels in plasma were measured by fluorometry. Briefly, blood was

collected in tubes containing EDTA and centrifuged for 10 min at 3200 x g to obtain

plasma. Plasma was then centrifuged at 5000 x g (4 OC) overnight in an Ultrafree®

Microcentrifuge 10,000 NMWL filter unit. Nitrate was reduced to nitrite using nitrate

99

reductase and the NADPH regenerating system. The fluorescence was measured at ex of

360 nm and em of 450 nm. NOS activity was performed as described previously [19].

Data Analysis

All data are presented as means ± SE. The effects of the treatments were compared by an

ANOV A followed by Pisher's post hoc test. Differences were considered to be statistically

significant at p<0.05.

100

RESULTS

iNOS inhibition prevents insu/in resistance in skeletal muscle of LPS-treated rats.

To study the role of iNOS in insulin resistance, we treated rats with LPS with or without

the iNOS inhibitor aminoguanidine. LPS was found to induce iNOS as reflected by

N02/N03 accumulation in the plasma (figure lA). As expected, pretreatment with

aminoguanidine partially (lOOmg/kg) or totally (150mg/kg) blocked NO production and

iNOS protein expression (figure lB). However, the two constitutive NOS enzymes, eNOS

and nNOS, were not affected by the aminoguanidine treatment. We next investigated the

influence of iNOS induction on insulin sensitivity ex vivo by measuring glucose uptake in

isolated soleus muscle. Here we observed that insulin-stimulated glucose uptake was

reduced in LPS-treated animaIs compared to the control group (figure 1 C). Importantly the

aminoguanidine treatment restored insulin stimulated glucose uptake in LPS treated

animaIs in a dose dependant manner such that the lower dose of aminoguanidine' partially

improved insulin sensitivity while the higher dose fully restored muscle insulin action

(figure 1C). Similar results were obtained in EDL muscle (data not shown). We had

previously reported that iNOS induction causes a defect in IRS-1 associated PI 3-kinase, a

key enzyme involved in insulin signaling [20] [7]. Therefore, we determined whether the

activity of this enzyme was altered in LPS-treated rats. Here we observed that LPS

treatment decreased the ability of insulin to stimulate PI 3-kinase activity while iNOS

inhibition with aminoguanidine fully restored insulin' s action on PI 3-kinase (figure 1 D).

Aminoguanidine treatment alone had no effect on insulin sensitivity (data not shown).

Targeted disruption of iNOS protects mice against LPS induced insu/in resistance.

We next used a genetic model of iNOS disruption to further demonstrate the role of iNOS

in LPS-induced insulin resistance. As mentioned above, we have previously reported that

mice lacking iNOS are protected against insulin resistance induced by obesity [7]. To

101

demonstrate the role of iNOS in endotoxemia induced insulin resistance, we challenged

iNOS knockout mi ce with LPS. As expected, iNOS induction and NO production by LPS

treatment were abrogated in these genetically modified mice (figure 2 A, B). As observed

after the pharmacological inhibition of iNOS with aminoguanidine, we found that iNOS

gene deletion protected mi ce against LPS-induced insuliri resistance. Indeed, we found that

insulin-mediated 2-DG glucose uptake was normalized in the soleus of iNOS-/- mice that

. had been treated with LPS compared to saline treated iNOS -/- mice (figure 2C). LPS

induced inhibition of muscle insulin-stimulated PI 3-kinase was also significantly

abrogated by iNOS deletion (figure 2D). Similar results were obtained in EDL muscle (data

not shown).

iNOS inhibits insulin-stimulated glucose uptake via the production of ONOO-

We next test whether iNOS-mediated insulin resistance could be reproduced in vitro.

Cytokine/ LPS exposure markedly induced NO production as detected by the accumulation

of nitrite in the culture medium and this was completely inhibited by co-incubation with the

iNOS inhibitor 1400W (ctr: 0.03 +/- 0.07 f.lM, cyto/LPS: 9.18 +/- 0.62 f.lM,

cyto/LPS+ 1400W: 0.0 +/- 0.06 f.lM). As depicted in Figure 3A, cytokine/LPS treatment

. increased basal glucose transport. This effect was, in major part, due to chronic iNOS

induction since 1400W greatly prevented this augmentation. In contrast to the basal state,

cytokine/LPS treatment caused a significant decrease in insulin-stimulated glucose

transport as shown in Figure 3B. As expected, this defect was reversed by iNOS inhibition.

These results clearly support a role for iNOS in cytokine/LPS-induced insulin resistance.

To determine the role of ONOO- in this process, we first used the peroxynitrite scavenger

epigallocathechin gallate (EGCG). As observed with iNOS inhibition, the neutralization of

ONOO- blunted the increase of basal glucose transport and reversed the deleterious effect

of iNOS on insulin-stimulated glucose uptake (Figure 3C and 3D). Next, we treated cells

directly with authentic ONOO-. As observed for iNOS induction, ONOO- treatment

increased basal glucose transport and decreased insulin-stimulated glucose uptake (Figure

3E and 3F). These data support a role for ONOO- in the deleterious effect of iNOS on

insulin-stimulated glucose transport.

102

iNOS inhibits insulin-stimulated PI 3-kinase activity via the production of ONOO- in

myocytes.

Following on from the observed defect in insulin stimulated PI 3-kinase activity in LPS

treated animaIs, we investigated the involvement of ONOO- in this defect in the cellular

model. As shown in figure 4, cytokine/ LPS treatment impaired insulin signaling as

revealed by a '" 50% reduction in the ability of insulin to stimulate IRS-1-associated PI 3-

kinase activity as compared to control cells (figure 4A). However, 1400W restored insulin

stimulated PI 3-kinase activity. We then used EGCG to look at the role of ONOO- in iNOS

mediated insulin resistance at the level of PI 3-kinase. As for glucose transport the ONOO

scavenger significantly prevented the inhibition caused by cytokines/LPS treatment (figure

4B). Furthermore exposing cells to ONOO- per se also reduced the ability of insulin to

stimulate IRS-1 associated PI 3-kinase activity (figure ' 4C). Importantly both the iNOS

inhibitor and EGCG failed to modulate PI 3-kinase in the absence or in the presence of

insulin (data not shown) and no effect of cytokines/LPS or ONOO- was observed on basal

PI 3-kinase activity. These results support a role for ONOO- in the iNOS-induced

impairment of insulin-stimulated PI 3-Kinase activity in skeletal muscle.

ONOO- causes nitration of tyrosine on IRS-l

Since a major reaction of ONOO- with proteins is the formation of nitrotyrosine, we looked

at this modification on the insulin receptor substrate-1, a critical element for insulin action.

To evaluate specifically the nitration of IRS-1 we first immunoprecipitated aIl nitrated

proteins following treatment of L6 muscle cells with ONOO- or cytokine/LPS and then we

looked at whether IRS-1 was nitrated using an antibody against IRS-1. We observed that

increasing doses of ONOO- (Fig. SA) as weIl as cytokine/LPS (Fig.SB) treatment increases

the tyrosine nitration of IRS-1. Furthermore, we observed that iNOS inhibition by 1400W

in cytokine/LPS treated cells blunted the tyrosine nitration of IRS-1 (figure SB). We then

confirmed these results by performing the reverse experiment; where we

103

immunoprecipitated IRS-1 and confirmed its tyrosine nitration by western blotting (figure 1

5C and 5D). Since our results reveal a .role for ONOO- in iNOS induced insulin resistance,

we asked whether nitration of IRS-1 on tyrosine residues couIC! decrease the ability of

insulin to stimulate IRS-l tyrosine phosphorylation. To answer this question we measured

IRS-1 tyrosine phosphorylation of cells treated with insulin in the absence or in the

presence of ONOO-. Here we found that ONOO- treatment caused a decrease in the

capacity of insulin to induce tyrosine phosphorylation of IRS-1 (figure 5E).

DISCUSSION

Until now our understanding of the molecular mechanisms by which iNOS mediates

insulin resistance in skeletal muscle was limited to NO mediated S-nitrosylation[12] [21].

Herein we show for the first time that the radical NO oxidation product ONOO- also

contributes to the iNOS mediated insulin signaling defects in skeletal muscle via tyrosine

104

nitration of IRS-1. This post translational modification appears to impede insulin signal

transduction by blocking tyrosine phosphorylation of IRS-1 and thereby limiting its

interaction with PI 3 -Kinase.

Our report of a negative role for elevated tyrosine nitration in skeletal muscle exposed to

cytokines and LPS or authentic ONOO- is in line with observations in other tissues and

fields. Indeed, ONOO- mediated tyrosine nitration has been shown to negatively modulate

the function of several other enzymes such as glutamine synthase, prostacyclin synthase,

cytochrome P450, tyrosine hydrolase and sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase [22] [23] [24]

[25] [26] . Furthemore tyrosine nitration has previously been implicated in the diminution

of insulin stimulated PI 3-kinase activity in other tissues. Indeed, in endothelial cells,

authentic ONOO- or high glucose concentration was found to cause protein nitration

associated with a weaker PI 3-kinase activity. While, in 3T3-L1 adipocytes, it has been

reported that the presence of ONOO- is associated with IRS-1 tyrosine nitration and a

subsequent decline in insulin stimulated glucose transport. A defect in PI 3-kinase activity

has also been reported in ONOO- treated macrophages [27] [28]. However, in the latter

work, it was shown that the failure in PI 3-kinase activity resulted from a defect in the

association between the p85 and plI 0 subunits of the kinase rather than IRS-1

nitrotyrosination as demonstrated by our work. Since insulin mediates its action through

phosphorylation of specific tyrosine residues on IRS-1 , we can assume that tyrosine

alteration likely - affects this manner of signal transduction. As with most other post

translational modifications tyrosine nitration is a selective process and not aIl tyrosine

residues present in proteins are nitrated. To date no specific consensus sequence or motif

has been identified for prote in tyrosine nitration. However, it is known that the presence of

one or more acidic residues and a relative paucity of cysteine, methionine and basic amino

acids are required for tyrosine nitration to occur [13]. After searching the sequence of IRS-

1 we have identified one tyrosine residue that respoIids to these critieria, the tyrosine at

position 895 in rat or 896 in humans. Further experiments will be needed to determine

whether this key tyrosine is the target of ONOO- nitration in skeletal muscle.

105

In conclusion, we and others have previously shown that iNOS can be induced in muscle

and adipose tissues in obesity [8] [7] [29] [30]. Furthermore, it has also been proposed that

obesity is associated with an increase in infiltration of macrophages which highly express

iNOS [31]. We thus propose here that iNOS induction in obesity can cause insulin

resistance in muscle via tyrosine modification of IRS-1 following ONOO- formation. A

better understanding of the mechanism linking iNOS to insulin resistance will provide

means to develop tools to treat this ever growing disease.

106

LEGENDS TO FIGURES

Figure 1. Effect of aminoguanidine on iNOS induced insulin resistance in muscle in vivo.

Rats were injected i.p with LPS 20mg/kg with or without aminoguanidine (100 or

l50mg/kg) and sacrificed 6 hours later. A) Nitrite accumulation in plasma was measured by

fluorometry. B) NOS enzyme protein expression was measured by western blot in soleus

muséle. C) Effect of LPS with or without aminoguanidine was measured on basal or insulin

stimulated glucose transport in strips of soleus muscle. D) IRS-l associated PI 3-kinase

activity was measured in muscle of LPS +/- aminoguanidine (100mg/kg) treated animaIs.

Insulin (3 ,8U/kg i.v) was, injected 4 minutes prior to sacrifice.

Figure 2. iNOS disruption protects mlce against insulin resistance induced by LPS

treatment. Wild type (WT) or iNOS-/- mice were treated with saline or LPS A) nitrite

accumulation in plasma was measured by fluorometry. iNOS Protein expression is

represented in panel B). Basal and insulin stimulated 2-DG uptake is represented in panel

C) and insulin induced IRS-l-associated PI 3-kinase activity is represented in panel D).

Figure3. Effect of·ONOO- and iNOS induction on basal and insulin stimulated glucose

transport in L6 muscle cells. Glucose transport was measured as described under "Materials

and Methods" following these treatments. A) The effect of cyto/LPS on basal and insulin

stimulated glucose uptake was measured in L6 muscle cells treated with TNF-a (lOng/ml),

IFN-y (200units/ml) and LPS (lOJlg/ml) for 24 hours, +/- l400W ( expressed as % offold

change relative to insulin alone) (B). (C) The effect of EGCG (lOJlM) on basal glucose

transport in the presence of cytokines/L~S(D) The effect of EGCG(lOuM) on insulin

stimulated glucose transport in the presence of cytokines/LPS. (E) Basal glucose transport

in the presence of ONOO- is represented F) Insulin-stimulated glucose transport in the

presence ofONOO-.

Figure 4. Effect of iNOS and ONOO- on IRS-1-associated PI 3-kinase activity in L6

myocytes. PI 3-kinase was measured in anti-IRS-I immonoprecipitates of L6 cells treated

--------------------------------------------------------- ---------------------- - --- - - ----

107

with A) (cyto/LPS) with TNF-a (lOng/ml), IFN-y (200 units/ml) and LPS (lOJlg/ml) for 24

hours, +/- iNOS inhibitor l400W (O, lmM), B) +/- EOCG (lOJlM) or C) in cells directly

treated for 1 hour with ONOO- . Quantification of 32p incorporated into PI 3-phosphate (PI

3P) was expressed relative to insulin control value. A representative autoradiograph is

shown at the top of the figure.

Figure5. Effect of ONOO- and iNOS induction on IRS-l tyrosine nitration and

phosphorylation. A) and B) Protein lysates from cells treated with increasing doses of

ONOO- or cytokines +/- the iNOS inhibitor 1400W (O.lmM) were immunoprecipitated

with anti-nitrotyrosine antibody and then immunoblotted with anti-IRS-l antibody. C) and

D) Cells lysates were immunoprecipitated with anti-IRS-l antibody and then

immunoblorted with anti-nitrotyrosine antibody. E) L6 cells were serum deprived for 4

hours and then treated with or without ONOO- for 1 hour. Cells were then stimulated with

100nM insulin for the last 5 minutes of the treatment. Celllysates were immunoprecipitated

with anti-phosphotyrosine antibody (4010) and then immunoblorted using the IRS-l

antibody.

108

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be a second messenger, autacoid, paracrine substance, neurotransmitter, and hormone?

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111

A B

8 DSAL Plasma kOa

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113

A B

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11 5

Figure 5

Chapitre 3. Une incubation prolongée du muscle épitrocléaris cause l'induction de iNOS et des altérations du transport de glucose.

Le but de la présente étude était d' éval:uer l' implication de la synthase de NO inductible

(iNOS) dans les limitations observées lors de l' incubation prolongée d'un muscle. Des

épitrocléaris de rats furent incubés ex vivo pendant 10 heures et l' induction de iNOS fut

évaluée. Nous avons observé que le processus d' incubation causait l' induction de l'ARNm

de iNOS, de la protéine et l ' accumulation de nitrites et nitrates dans le milieu d 'incubation.

L' incubation était aussi associée à une augmentation de l' activité de iNOS tandis que

l' activité des NOS constitutives (cNOS) était réduite. Puisque iNOS est connu pour affecter

le métabolisme du glucose dans le muscle, nous avons vérifié l' impact de cette production

de NO dans ce modèle. L' induction de iNOS était corrélée à l' induction de l' expression du

transporteur de gl~cose 1 (GLUT1). De plus, la présence d'un inhibiteur spécifique de

iNOS; le 1400W dans le milieu d' incubation a bloqué l'augmentation de l' expression de

GLUTl. Nous avons par ailleurs observé que la présence d'un donneur de NO (NOC-15)

dans un modèle de cellules musculaires en culture (L6) avait des effets similaires sur

l' induction de GLUT1, supportant ainsi le rôle du NO sur l'expression de ce transporteur de

glucose. Nous avons observé que l'incubation des muscles causait la résistance à l'insuline

au niveau du transport du glucose et que cet effet était renversé par la présence du 1400W.

Ce manque d' effet de l' insuline était relié à la réduction de la stimulation de l' activité PI 3-

kinase associée à IRS-1 dans le muscle incubé. Ces résultats suggèrent donc que

l' incubation à long terme de muscle cause l'induction de iNOS induisant des altérations

dans l' utilisation du glucose. Cette étude souligne une fois de plus l'effet délétère de iNOS

sur la sensibilité à l'insuline, et questionne les limites des études utilisant l' incubation des

muscles pour une période prolongée.

117

Long-term incubation of epitrochlearis muscle causes iNOS induction and nitric

oxide-dependent alteratio:Ds in glucose uptake

Geneviève Pilon, Kathleen Lemieux, and André Marette*

Department ofPhysiology, Lipid Research Unit, Laval University Hospital Center, Québec,

G 1 V 402, Canada.

* To whom correspondence should be addressed at:

Department ofPhysiology & Lipid Research Unit


2705 Laurier Boulevard, RC 9502

Sainte-Foy, Québec, G 1 V 4G2, Canada

Fax: (418) 654-2176

118

Abstract

The aim of the present study was to evaluate sorne of the limitations of prolonged skeletal

muscle incubation related to the modulation of inducible nitric oxide synthase (iN OS).

iNOS expression was evaluated in rat epitrochlearis following a 10 hour incubation period.

Rere we observed that the incubation process leads to iNOS mRNA and protein induction,

as well as nitrite and nitrate accumulation in the incubation medium. As expected these

changes were associated with an increase in iNOS activity, however in contrast to iNOS the

activity of constitutive NOS (cNOS) was reduced. Since iNOS is known to disturb glucose

metabolism in muscle, we investigated the impact of high NO output in the incubation

model on the expression of glucose transporter 1 (GLUT1) and insulin action. iNOS

induction in the incubation model was associated with an increase in GLUT1 expression

importantly the presence of 1400W (a specific iNOS inhibitor) in the incubation medium,

prevented this effect of long-term skeletal muscle incubation. In L6 skeletal muscle cells,

the NO donor NOC-15 had similar effects on GLUT1 expression, adding further support to

a role for NO in the induction of this glucose transporter. We also observed that long-term

muscle incubation impaired insulin stimulated glucose transport and this was reversed by

the presence of 1400W. This defect in insulin action was related to a reduced insulin

stimulated IRS-1 associated PI 3-kinase activity in incubated muscle. Taken together, these

results suggest that long-term muscle incubation causes iNOS induction and thereby leads

to alterations in both basal and insulin stimulated glucose utilization. Rence, these findings

provide further support for a deleterious role of iNOS on insulin sensitivity. Our data also

call for caution when using long-term muscle incubation for metabolic studies.

119

Introduction

The radical gas nitric oxide (NO) is an essential player in an ever-growing number of

cellular processes. This diffusible and reactive molecular messenger is fundamental for the

regulation of vasodilatation, neurotransmission and immune responses. The synthesis of

NO is generated by the oxidation of nitrogen atoms from L-arginine by at least three

isoforms of nitric oxide synthase (NOS): the endothelial type (eNOS or NOS3), the

neuronal type (nNOS or NOSl) and the inducible type (iNOS or NOS2) [1]. While eNOS

and nNOS are expressed constitutively and transiently activated by an increase in

intracellular Ca2+, iNOS activity is relatively calcium independent and its prolonged

activation plays an important role in host defense [2]. 1ndeed, iNOS is expressed at very

low levels under normal conditions. However, inflammatory cytokines and bacterial

endotoxins markedly stimulate iNOS expression [3]. Although this mechanism evolved to

protect the host from bacterial or viral invaders, it is well accepted that an uncontrolled

iNOS induction is directlY involved in the etiology of many diseases. 1ndeed, iNOS has

been associated with the necrosis of pancreatic islets, hypotension, Huntington' s disease,

Alzheimer' s disease, rheumatoid arthritis, and inflammatory bowel disease.

Among all deleterious effects of marked iNOS induction, we have clearly demonstrated its

role in glucose metabolism and insulin sensitivity [4] [5]. 1ndeed, we have shown that

iNOS knockout micewere protected against insulin resistance induced by high-fat feeding

and these results have been confirmed recently by the group of Kearney [6] [7]. 1t has also

been reported that treatment with the iNOS inhibitor L-N1L reverses fasting hyperglycemia

and restores hyperinsulinemia in ob/ob mice [8] [8]. We have also demonstrated, that iNOS

induction by cytokines and LPS in L6 muscle cells, causes insulin resistance by blunting

insulin-induced 1RS-1 associated P13-kinase activity, a key signaling event in insulin's

metabolic action [5]. This link between iNOS and insulin resistance is not surprising since

iNOS induction has been detected in different tissues from humans and animal models of

120

both diabetes and obesity. lndeed, iNOS has been detected in aorta and skeletal muscle of

high-fat fed mice, in skeletal muscle, liver and adipose tissue of ob/ob mice, in heart of

diabetic Zucker rats and in skeletal muscle and platelets from type 2 diabetic subj ects [9]

[7] [10].

The incubation of isolated skeletal muscle in vitro lS a useful technique for the

understanding of the tissue response to specific stimuli without the influence of other

organs and hormonal factors. However this method has its limitations and disadvantages.

Several groups have observed that long-term muscle incubation was associated with

disturbance of glucose metabolism [11][12]. However the cellular mechanism behind this

defect has been left unanswered. In the present study, we show that prolonged muscle

incubation gives rise to iNOS induction causing major perturbations in the regulation of

glucose uptake. Our findings point out a limitation for long-term muscle incubation and

confirm a role for iNOS in insulin resistance.

121

Experimental procedures

AnimaIs


Male Sprague-Dawley rats (175-200 g) purchased from Charles River (Montreal, Qc,

Canada) were maintained on a 12 h dark and light schedule, and fed ad libitum with Purina

rat chow. '

Muscle sample preparation

Rats were anesthetised by a ketamine/xylazine injection after over-night fasting. The

epitrochlearis muscles were rapidly isolated and immediately flash frozen in liquid nitrogen

or preincubated for 30 min in 6 ml of Krebs-Ringer bicarbonate (KRB) buffer, pH 7.4,

containing 2 mM sodium pyruvate (KRB-P). Muscles were then incubated for the

appropriate times (up to 12 hours) in the KRB buffer supplement containing aIl amino

acids and the incubation medium was changed every two hours. After the appropriate

incubation period, the muscles were frozen in liquid nitrogen or kept for in vitro glucose

transport.

Materials

1400W was from Biomol Research Laboratories (Plymouth, PA). ADP-Sepharose 4B

beads were from Amersham Biosciences, and the Renaissance enhanced

chemiluminescence kit was from PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA). Monoclonal

antibodies against iNOS and eNOS and the polyclonal anti,body against nNOS were

obtained from Transduction Laboratories (Mississauga, Canada). IRS-l antibody (C-20)

was obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). NOC-15 was from Alexis

(San Diego, Calif. , USA). [3H]-I-arginine was from Amersham (OakviIle, Ont. , Canada)

and Dowex AG50W-X8 from Bio-Rad (Mississauga, Ont. , Canada). a-Minim~ essential

medium (a-MEM), fetal bovine serum and other tissue-culture products were obtained from

Gibco BRL. Human insulin (Humulin R) was purchased from Eli Lilly. 2,3-

diaminonaphthotriazole (DAN) was purchased from Aldrich chemicals (Milwaukee, WI) ,

and aIl others products were from Sigma Chemicals (St. Louis, MO).,

122

.Cell Culture

A line of L6 skeletal muscle cells (kind gift of Dr. Amira Klip, Hospital for Sick Children,

Toronto, ON, Canada) clonally selected for high fusion potential were used in the present

study. The L6 cellline was derived from neonatal rat thigh skeletal muscle cells and retains

many morphological, biochemical, and metabolic characteristics of skeletal muscle. Cells

were grown and maintained in monolayer culture in oc-MEM containing 2% (v/v) fetal

bovine serum and 1 % (v/v) antibiotic/antimycotic solution (10000 units/ml penicillin,

10000 J.lg/ml streptomycin and 25 J-lg/ml amphotericin B) in an atmosphere of 5% CO2 at

37 oC.

Glucose transport assay

2-Deoxyglucose uptake was deterrnined as previously described [4]. Briefly, L6 myotubes

were incubated with or without NOC-15 for 1h, followed by the addition of insulin 100nM

(or medium alone) for an additional 30 min. Cells were rinsed once with glucose-free

Hepes-buffered saline solution, pH 7.4 (140 mM NaCI, 20 mM Hepes/Na, 5 mM KCI, 2.5

mM MgS04 and 1 mM CaCb), and were subsequently incubated for 8 min with la JlM 2-

deoxy-D-glucose containing 0.3 J-lCi/ml 2-deoxy-D-eH]glucose in the same buffer. After

the incubation in transport medium, cells were rinsed three times with ice-cold saline

solution, and then disrupted by adding 50 mM NaOH. Cell-associated radioactivity was

deterrnined by scintillation counting. Protein concentrations were deterrnined by the

bicinchoninic acid method (Pierce), and the results were expressed in pmol/min per mg.

Glucose uptake values were corrected for non-carrier-mediated transport by measuring

hexose uptake in the presence of la J-lM cytochalasin B.

In vitro glucose uptake in isolated muscle.

Glucose transport in isolated epitrochlearis muscles was measured uSlng the glucose

analogue 2-eH]2-deoxy-d-glucose as described in [13].

123

Immunoblotting

Protein extraction was prepared using (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI, 10% glycerol,

1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2 mM Na3V04, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 10

f.!g/ml aprotinin, and 10 f.!g/ml leupeptin), and insoluble material was removed by

centrifugation at 12,000 x g. For western blotting, prote in extracts were resolved by SDS

P AGE and transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane. Blots were

blocked with 5% non-fat dry milk in 10 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI, and 0.05%

Tween 20; incubated with primary antibody; and then il?-cubated with a secondary

horseradish-conjugated antibody. Immunoreactive bands were visualized by enhanced

chemiluminescence.

RNA analysis

Total cellular RNA was isolated uSlng guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform

extraction and iNOS, eNOS, nNOS, GLUT4 and GLUT1 mRNAs were measured by semi

quantitative RT-PCR as described previously [14][4].


500 f.!g of muscle lysates were immunoprecipitated with 2 f.!g of anti-IRS-1 coupled to

protein A-Sepharose overnight at 4 oC and the IRS-1 associated PI 3-kinase activity was

measured as described previously [15].

Nitric oxide synthase activity

Nitric oxide synthase activity was quantified by the conversion of [3H]-I-arginine to [3H]-I

citrulline as described previously in [4] [6].

Nitrite and nitrate measurements

Nitrite and nitrate levels in plasma and incubation medium were measured by fluorometry.

Nitrate was reduced to nitrite using nitrate reductase and the NADPH regenerating system

as described previously [16]. Nitrite levels were determined by measuring the fluorescence

of 2,3-diaminonaphthotriazole DAN at Àex of 360 nm and :.\em of 450 nm.

124

Data Analysis- All data are presented as means ± S.E. The effects of the treatments were

compared by an analysis of variance followed by Fisher's post hoc test. Differences were

considered to be statistically significant at p < 0.05

Results

Long-term incubation of epitrochlearis muscle modulates NOS expression

Since muscle incubation has been shown to promote insulin resistance and we have

previously demonstrated that iNOS induction causes insulin resistance in skeletal muscle,

we speculated that muscle incubation may lead to induction of the iNOS enzyme. Rat

epitrochlearis muscles were isolated and frozen immediately or incubated for 10 hours (as

indicated on the figures) and th en frozen. In figure 1 we show that, without any treatment,

long-term muscle incubation leads to robust iNOS mRNA and protein induction (Fig. lA,

~). In contrast, the two calcium dependent NOS, eNOS and nNOS, were down-regulated

following incubation of the muscle. This alteration in NOS expression was associated with

shifts in NOS activity. Indeed, cNOS activity was dramatically reduced by long-term

skeletal muscle incubation while iNOS activity was up-regulated in muscle following 10

hours of incubation (Fig. 1 C). We also measured nitrite accumulation, a stable product of

NO degradation, in the incubation medium. In accordance with the iNOS expression and

activity data we observed that nitrite concentration was about 4 times higher in long-term

incubated muscle medium compared to the frozen muscle control, indicating that the iNOS

in these tissues was functional (Fig. ID). These results suggest that long-term incubation of

skeletal muscle enhances iNOS mRNA and protein expression along with enzyme activity

at the expense of cNOS.

Time course ofiNOS and GLUTl induction

To further characterize iNOS modulation by the muscle incubation, we looked at the time

course of iNOS induction. Muscles were incubated and frozen every hour for up to 12

hours. In muscles incubated for 2 and 3 hours, a slight iNOS prote in induction was

observed followed by a stronger induction at 2:4 hours (fig.2 A). We have previously

125

reported that iNOS induction by cytokines and LPS increased the expression of the glucose

trarisporter-l (GLUTl), leading to increased basal glucose transport [4]. We thus next

investigated whether GLUTI was modulated by iNOS induction in incubated

epitrochlearis. Here we observed that GLUTI expression was actually induced by the

incubation and the time course of its expression closely followed the time course ·of iNOS

expression (Fig.2B).

iNOS induction causes insulin resistance in incubated muscle

We next sought to determine whether iNOS induction leads to insulin resistance in these

long-term incubated muscles. We measured basal and insulin-stimulated glucose transport

in muscle incubated for 10 hours in the presence or in the absence of 1400W, a specific

iNOS inhibitor. Insulin failed to stimulate glucose transport after long-term incubation in

untreated muscles (Figure 3A). However, insulin significantly enhanced glucose transport

in the presence of 1400W. The effect of 1400W on insulin stimulated glucose transport

appeared to be explained in most part by normalization of basal glucose transport

potentially through "inhibition of GLUTI induction. To directly test this hypothesis, we

looked at the expression of GLUTI and GLUT4 in these muscles. GLUTI expression was

induced by long-term skeletal muscle incubation but this response was repressed by the

presence of the iNOS inhibitor (Fig. 3C). Importantly, no change in GLUT4 expression was

observed in incubated muscle treated with or without 1400W (Fig. 3D). To further

investigate the mèchanism by which iNOS caused the defect in insulin signal transmission,

we next assessed IRS-l associated PI 3-kinase activity, an essential step in the stimulation

of glucose transport by insuline No effect of incubation was observed on basal PI 3-kinase

activity; however, the potent effect of insulin on IRS-l associated PI 3-kinase activity was

markedly impaired following long-term skeletal muscle incubation (Fig 3E).

NO donor increases GLUTl expression in L6 muscle ceUs

To clarify the link between high NO output and GLUTI expression, we tested the effect of

NOC-15 (a chemical NO donor) in L6 muscle cells. Increasing doses ofNOC-15 caused a

dose dependent augmentation of GLUTI mRNA expression (Fig. 4A). The induction of

GLUTI mRNA corresponded with GLUTI prote in expression (Fig. 4B). As in incubated

126

muscle, no effect of the NO donor was observed on GLUT4 mRNA expression in this

cellular model. To further test the role of NO in mediating insulin resistance, we looked at

the effect of NOC-15 on basal and insulin stimulated glucose uptake in these cells. L6

myocytes were incubated with or without increasing doses ofNOC-15 for 24h, followed by

measurement of glucose uptake. Basal glucose uptake was augmented by the NO donor

while insulin-stimulated glucose uptake was reduced (Fig. 4C and 4D). These results are

consistent with our observations in incubated muscles and confirm the implication of iNOS

derived NO in the perturbations of glucose metabolism during long-term incubation of

muscles ex vivo.

Discussion

We have previously reported a causal link between iNOS induction and skeletal muscle

insulin resistance. In effect, we have shown that cytokines and LPS induce iNOS in

myocytes and in rat muscle, impairing insulin stimulated glucose transport [5] [13].

Furthermore, at the genetic level, we demonstrated that targeted disruption of iNOS

prevents the development of muscle insulin resistance associated with obesity caused by

high fat feeding [6]. In the present study, we consolidated this relationship in a new model

of iNOS induction. Here we observed that, long-term skeletal muscle incubation induces

iNOS, giving rise to alterations in glucose uptake. Under these conditions we observed that

basal glucose uptake was increased whereas insulin mediated glucose transport was

hindered. These perturbations in glucose utilization appear to be linked to increased

GLUTI expression and an impairment of insulin to stimulate IRS-1-associated PI 3-kinase

activity. We already reported that in L6 muscle cells, iNOS induction by cytokines and LPS

treatment leads ta insulin resistance by causing a defect ln the activation of IRS-1

as~ociated PI 3-kinase [5]. Furthermore insulin mediated PI 3-kinase activation was

reduced in skeletal muscle of wild type high-fat-fed obese mice, but remained normal in

high-fat fed obese iNOS-I- mice [6]. Consistent with these observations, we observed here

that iNOS mediated insulin resistance is caused by the inhibition of IRS-1 associated PI 3-

kinase activity in incubated muscles.

127

Whereas insulin-stimulated glucose uptake was reduced, basal glucose uptake was

increased in our model. This augmentation of basal glucose transport in incubated muscle is

in accordance with a previous study [12]. It has been proposed that the increase in basal

glucose uptake in incubated muscle could be due to a greater amount of glucose reaching

the cells by diffusion compared to the amount of glucose available in vivo by capillaries

within the muscle [12]. On the other hand, different groups have also reported that GLUT1

is induced in stressful conditions such as oxidative stress, denervation, hyperosmolarity,

glucose deprivation and hypoxia which could likely explain the elevated basal glucos~

uptake.

ln stressful situations, where energy is critical for survival, it is likely that GLUT1 is

mobilized to fulfill essential functions and ensure host defense. It is noteworthy that these

stress situations have a~so been linked to insulin resistance [17]. We can consider the

incubation process as stressful since the muscle is denervated and isolated from its natural

environment. Accordingly, it has been demonstrated that situations such as crush injuries,

shear stress or oxidative stress, also lead to iNOS induction [18] [19] [20]. In these

circumstances, cellular damage or stress may induce cytokine expression leading to iNOS

expression. Interestingly, it has been shown that heat shock protein 70 (HSP70), which is

produced during cellular stress, enhances cytokine-induced iNOS expression by activating

p38 MAP kinase [21]. In our model, muscle denervation could cause enough stress to

increase cytokine expression or activate stress-signaling pathways leading to iNOS

induction. Importantly, high NO concentrations are known to activate GLUT1 in different

models. Indeed, we have already reported that cytokines and LPS treatment increase

glucose transport in L6 muscle cells via GLUT1 induction [4]. Furthermore, the NO donors

soduim nitroprusside (SNP) or diethylenetriamine (DETA) induce GLUT1 in HUVEC cells

[22]. However, to our knowledge, NO's potential role as an inducer of GLUT1 in intact

muscle has never been investigated. Here, we provide novel complementary evidence that

iNOS induction leads to GLUT1 overexpression since the iNOS inhibitor 1400W blunted

both GLUT1 protein expression and the increase in basal glucose transport in intact skeletal

muscle that had been incubated long-terme

128

We also observed a decreased expreSSIon and activity of cNOS following long-term

skeletal muscle incubation. This downregulation could be explained by the effect of high

NO output from iNOS. Indeed, sorne studies have reported that NO inhibits NOS activity

and that nNOS and eNOS are more sen~itive than iNOS to the inhibitory action of NO [23].

Our finding of reduced expression of eNOS and nNOS is also consistent with previous

observations that iNOS induction in endothelial cells, reduces the expression of eNOS [24].

It is thus possible that this mechanism has evolved to temporarily inhibit cNOS in an effort

to keep cofactors available for iNOS during infection.

While previous studies on denervated and incubated muscles have reported a decrease in

GLUT4 expression, we could not explain the reduction in insulin sensitivity seen in our

study by changes in the expression of this glucose transporter [25] [12]. This apparent

discrepancy is likely explained by the composition of the muscle fiber type. Following

denervation, Handberg et al. reported a much greater GLUT4 decrement in oxidative red

muscle (type 1) compared to (type lIB) glycolytic white muscle [26]. Thus, the fact that

epitrochlearis is a fast twitch glycolytic muscle could explain why we did not observe a

reduction ofGLUT4 expression in our study.

In summary, the present study demonstrates that long-term incubation causes iNOS

induction in skeletal muscle leading to altered basal and insulin stimulated glucose

metabolism. The incubation dependant iNOS expression caused an increase in basal

glucose transport through elevated GLUT1 expression and decreased insulin-stimulated PI

3-kinase activity leading to defective insulin stimulated glucose transport. These results

may possibly provide a molecular basis for the alterations in glucose utilization that

manifest in patients suffering from denervated muscle following injuries. Our findings also

provide important considerations for those planning studies with incubated muscle

preparations.

129

LEGENDS TO FIGURES

Figure 1. Long-term incubation of epitrochlearis muscle modulates NOS expression. Rat

epitrochlearis muscles were isolated and frozen immediately or incubated for 10h before

being frozen. A) RT-PCR of iNOS, eNOS, nNOS and GAPDH rnRNA is shown. B)

immunoblot of iNOS, eNOS and nNOS protein is presented C) NOS activity in n0t:!

incubated (CTL) or incubated muscle (INC). D) Measurement of nitrite production in the

incubation medium.

Figure 2. Time-course of iNOS induction. Rat epitrochlearis muscles were incubated and

frozen each hour for up to 12 hours. A) Representative immunoblot of iNOS prote in B)

Representative RT-PCR ofiNOS and GLUTI mRNA and quantification.

Figure 3. Incubation causes alterations in glucose metabolism. A) Basal and insulin

stimulated glucose transport were measured in incubated muscle for 10 hours in the

presence or in the absence of 1400W, a specific iNOS inhibitor. B) Insulin stimulated

glucose transport is expressed as fold stimulation over basal. C) and D) show GLUTI and

GLUT4 mRNA expression (respectively) following muscle incubation in the presence or

the absence of 1400W. E) Insulin (INS) or basal (CTR) IRS-l associated PI 3-kinase

activity was measured in control (frozen) and incubated muscle.

Figure 4. NO donor increases GLUTI expression in L6 muscle cells. L6 muscle cells were

incubated with increasing doses of NOC-15 (a chemical NO donor) A) GLUTI and

GLUT4 were measured by RT-PCR (B) GLUTI protein expression. (C) Basal and (D)

insulin-stimulated 2-DG uptake were measured in L6 cells pretreated for 24 hours with

increasing doses ofNOC-15.

130

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A.

C.

2

e-~o_

.~ E > ........... 0- en t E lU ...........

V) -o 0 z E s-

0

_iNOS

~eNOS

CTL INe

*

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B.

D.

20

N

0 Z 10 ~ c

0

~~

eTL INe

iNOS

eNOS

nNOS

CTL INe

133

Figure 1

134

A.

al 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 1 2 +

B.

iNOS

GlUTl

GAPDH

CTL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 1 2

:r: 1.2 0 1.0 Cl..

iNOS

-< O.~ \..? G.G ............ V")

o .• 0 z 0.2 0

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}:: :O~5 ~ ....J \..? 0 cm 1 2 3 45 e 7 $0 ·10 11 12

Figure 2

c.

A.

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7 tU ~

0.. ::J C

6 'f Q) V'l mS 0 U E ::J ......... rn ë5 4 >- E X 0 0. 3 Q)

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2 -,.---------.

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1400W

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135

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U tU Q) 60 V'l tU c: 40 ~ M 20 a::

ins + + CTL INC

Figure 3

c.

A.

B.

CTL la 50 100 150 200

NOC-15 (J.lM)

GLUTl

GLUT4

GAPDH

1 ......... ---- .--, ·.--.,1 GLUT 1

CTL 1 50 100

NOC -15 (~lM)

D.

3·..,..... ......... ______ ,.,....",

2

0 : o CTL 5 25

NOC-15 (J.lM)

136

ins 5 25

ins + NOC-15 (J.lM)

Figure 4

Chapitre 4. L'inhibition de la synthase de NO inductible par les activateurs de la l kinase activée par l'AMP (AMPK): un nouveau mécanisme antiinflammatoire.

La kinase activée par l' AMP (AMPK), est une enzyme sensible aux niveaux d'énergie qui

est activée en réponse aux stress cellulaires et représente une étape critique pour la

régulation de plusieurs processus métaboliques. L'AMPK a récemment émergée comme

une nouvelle cible de choix pour le traitement de l' obésité et du diabète de type II puisque

son activation augmente l' oxydation des acides gras et améliore l 'homéostasie du glucose.

Nous avons démontré dans cet article que l' activation pharmacologique de l'AMPK par des

médicaments anti-diabétiques inhibait fortement la synthase de NO inductible (iNOS), un

élément pro-inflammatoire retrouvé dans le choc endotoxique et dans l' état d' inflammation

chronique relié à l'obésité. L'inhibition de iNOS par l'AMPK fut observée dans différents

types cellulaires (myocytes, macrophages, adipocytes) et serait le résultat d'une régulation

post-transcriptionnelle de la protéine iNOS. L' activation de L'AMPK in vivo bloque aussi

complètement l'induction de iNOS dans le muscle et dans le tissu adipeux de rats traités à

la LPS. Nous avons aussi observé que la réduction de l' expression de l'AMPK par des

petits ARN interférent renversait les effets inhibiteurs de l'AMPK sur l'expression de iNOS

et la production de NO dans les myocytes. Ces résultats indiquent que l' AMPK représente

une nouvelle avenue anti-inflammatoire, donc une cible thérapeutique pour des maladies

immunitaire inflammatoire.

138

Inhibition of inducible nitric oxide synthase by activators of AMP-activated protein

kinase: a new anti-inflammatory pathway

Geneviève Pilon, Patrice Dallaire and André Marette *

Department of Anatomy and Physiology, and Lipid Research Unit, Laval University

Hospital Research Center, Sainte-Foy, Québec, G 1 V 4G2, Canada.

RUNNING TITLE: activation of AMPK inhibits iNOS

* Address correspondence to: Dr. André Marette

Department ofPhysiology & Lipid Research Unit


2705, Laurier Bld

Ste-Foy, (Québec), Canada, G1V 4G2

Tel: (4i8) 656-4141 ext. 7908

Fax: (418) 654-2176

E-mail:[email protected]

139

ABSTRACT

AMP-activated protein kinase (AMPK), an energy-sensing enzyme that is activated

in response to cellular stress, is a critical signaling molecule for the regulation of multiple

metabolic processes. AMPK has recently emerged as an attractive novel target for the

treatment of obesity and type 2 diabetes since its activation increases fatty acid oxidation

and improves glucose homeostasis. Here we show that pharmacological activation of

AMPK by anti-diabetic drugs markedly inhibits inducible nitric oxide (NO) synthase

(iN OS), a proinflammatory mediator in endotoxic shock and in chronic inflammatory states

including obesity-linked diabetes. AMPK-mediated iNOS inhibition was observed in

several cell types (myocytes, adipocytes, macrophages) and primarily resulted from post

transcriptional regulation of the iNOS proteine AMPK activation in vivo also blunted iNOS

induction in muscle and adipose tissues of endotoxin-challenged rats. Reduction of AMPK

expression by small interfering RNA reversed the inhibitory effects of AMPK activators on

iNOS expression and NO production in myocytes. These results indicate that AMPK is a

novel anti -inflammatory signaling pathway and thus represents a promising therapeutic

target for immune-inflammatory disorders.

140

AMP-activated protein kinase (AMPK) is emerglng as an important energy

sensing/signaling system in mammalian tissues. It is a member of a metabolite-sensing

protein kinase family that acts as a fuel gauge monitoring cellular energy levels 1. When

AMPK "senses" decreased energy storage, it acts to switch off ATP-consuming pathways

and switch on alternative pathways for ATP regeneration. AMPK is a heterotrimer

consisting of a catalytic a-subunit and two regulatory subunits, ~ and y. In response to

cellular energy depletion, as reflected by an increase in the AMP / A TP ratio, AMPK is

phosphorylated and activated by a still uncharacterized upstream AMPK kin~se2 . It can also

be activated allosterically by increases in the AMP/ ATP and creatine/creatine-P ratios. The

metabolic function of AMPK has perhaps been best documented ~n exercising skeletal

muscle, where its activation seems to contribute to increased glucose transport and fatty

acid oxidation3,4. AMPK can be activated chemically with 5-aminoimidazole-4-

carboxamide-riboside (AICAR), which is taken up by cells and phosphorylated by

adenosine kinase to form 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (ZMP), a

nucleotide that mimics the effect of AMp5• More recent studies have also identified AMPK

as the mediator of the metabolic effects of the adipose-derived peptidic hormones leptin

and adiponectin in skeletal muscle and liver6-8.

Chronic treatment of animal models of type 2 diabetes with the AMPK activator

AICAR improves glucose homeostasis and insulin sensitivity9-14. · These beneficial effects

are thought to be mainly explained by the weIl known actions of AMPK on glucose

metabolism and lipid oxidation in muscle and liver. Accordingly, the anti-diabetic drugs

metformin and rosiglitazone also activate AMPK and this is believed to contribute to their

insulin-sensitizing actions in diabetic subjects1S-18. However, the potential effects of AMPK

activation on pro-inflammatory mediators of insulin resistance have not yet been

investigated. Indeed, an inflammatory component lS also present in obesity-linked

diabetes 19,20, as reflected by increased systemic and tissue concentrations of the

proinflammatory cytokines TNF-a and interleukin-6 in obese hum an subjects21 ,22 and

several animal models of obesiti3-2S . Furthermore, we have recently reported that inducible

nitric oxide synthase (iNOS), a cytokine-inducible proinflammatory mediator in several

141

pathological conditions, is overexpressed in muscle and fat of genetic and dietary models of

obesity and type 2 diabetes25. Targeted disruption of the iNOS gene was found to proteet

high-fat fed obese mice from developing insulin resistance and to significantly improve

glucose tolerance25. A role for iNOS in mediating insulin resistance is also supported by the

finding that pharmacological inhibition of iNOS reverses impaired insulin action in

cultured myocytes exposed to cytokines and the endotoxin LPS26. Since an inflammatory

component that includes iNOS is involved in the pathogenesis of muscle insulin resistance

in obesity-linked type 2 diabetes, we asked whether AMPK activation might improve

insulin action in muscle cells through inhibition of iNOS, and if so, whether AMPK is a

key iNOS inhibitory pathway in other cell types where increased iNOS expression is

pathogenic.

RESULTS

AMPK activators inhibit iNOS and reverse insulin resistance in skeletal muscle cells

We first tested the effect of the AMPK activator AICAR on iNOS induction in L6

myocytes chronically exposed to cytokines and LPS, a model of chronic inflammation

associated with insulin resistance26,27. As shown in Figure 1 A, treatment of muscle cells

with AICAR stimulated AMPK activity as reflected by increased phosphorylation of

AMPK on Thr172, a site known to activate the enzyme28, as weIl as by its ability to

enhance phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase (ACC), a downstream target of AMPK

and a good correlate of its activation29• The anti-diabetic drug metformin and the PPAR-y

agonists troglitazone and 15dPGJ2 also activated AMPK in these cells (Fig. lA). Chronic

exposure of L6 myocytes to cytokines (TNF-a and IFN-y) and LPS markedly induced NO

production, as detected by the accumulation of the stable bioproduct nitrite in the culture

medium (Fig. lB). This effect was explained by a robust induction of iNOS mRNA and

prote in levels (Fig. 1 C-D). Neither eNOS nor nNOS are expressed in control or

cytokine/LPS-treated L6 myocytes, and NO production was completely inhibited by co

incubation with the specifie iNOS inhibitor 1400W3o (data not shown).

Addition of AICAR caused a dose-dependent reduction of cytokine/LPS-induced

NO production, reaching a maximal 80% inhibition at 2.5 mM (Figure lB). Treatment with

142

either metformin or PPARy agonists also decreased (by 50-90%) the effect of cytokine/LPS

on NO production. AlI AMPK activators inhibited NO production through reduction of

cellular iNOS protein levels (Fig. 1 C). AMPK activators failed to change the cellular

expression of desmin, the main intermediate filament protein in myocytes, here used as an

internaI control (data not shown). Reduction of iNOS protein expression was not linked to

suppression of iNOS transcription since iNOS mRNA levels were not affected by AICAR

or the anti-diabetic drugs metformin and troglitazone (Fig. ID). However, high

concentrations of 15dPGJ2 did reduce iNOS mRNA levels (see 25 JlM 15dPGJ2 in Fig.

ID). In additional studies, we also tested whether AICAR could inhibit iNOS-mediated NO

production either through reduction in substrate (L-arginine) uptake or by direct inhibition

of iNOS enzymatic activity. L-arginine uptake by muscle cells was not found to be affected

by AICAR (2.5 mM) (1297 ± 209 vs 1369 ± 90 pmol/min/mg for control and AICAR

treated cells, respectively). Furthermore, AICAR did not affect iNOS subunit dimerization

and failed to reduce iNOS catalytic activity in cytokine/LPS-treated myocytes, as assessed

by the formation of L-eH]citrulline form L-eH]-arginine (see Figures A and B,

supplementary materials). It has been reported that AICAR increases adenosine release by

ischemic heart tissue31 and this could contribute to iNOS inhibition. However, adenosine

per se failed to affect iNOS activity in L6 myocytes and the inhibitory effect of AICAR on

NO production was not decreased by blocking adenosine receptors with 8-(p-sulfophenyl)

theophylline (Figures C and D, supplementary materials) ruling out any role for adenosirie

release in AMPK-dependent iNOS inhibition.

To test whether AMPK-induced iNOS inhibition reverses the insulin resistance

promoting effects of cytokine/LPS, we next measured the effects of AMPK activators on

insulin action in L6 myocytes. We chose to assess insulin-induced activation of PI 3-kinase,

an essential mediator of insulin's metabolic actions, rather than glucose uptake since the

latter is increased by AMPK through insulin-independent pathways. As shown in Figures

2A and 2B, cytokines and LPS treatment caused insulin resistance as revealed by a 60%

reduction in the ability of insulin to stimulate IRS-l-associâted PI 3-kinase activity as

compared to control cells. However, addition of either AICAR, metformin or troglitazone

to cytokine/LPS-treated cells fully restored insulin action on PI 3-kinase. AMPK activating

---------------~ - - - ----

143

agents failed to increase PI 3-kinase in the absence of insulin (Figure 2A). The restoration

of insulin action by AMPK activating agents was similar to that obtained with the specific

iNOS inhibitor 1400W (Figure 2B).

AMPK activators inhibit iNOS in adipocytes and macrophages

We next tested whether AMPK activation inhibits iNOS in other cell types. We

have reported that adipose tissue is a major site of iNOS expression in endotoxemia and

that chronic treatment of adipocytes with cytokines and endotoxins reproduces this

inflammatory response in vitr032. As shown in Fig. 3A, addition of AICAR or anti-diabetic

drugs to cultured 3T3-Ll adipocytes activated AMPK, as reflected by enhanced ACC

phosphorylation. Activation of AMPK reduced cytokine/LPS-mediated NO production

(Fig. 3B) and cellular iNOS protein content (Fig. 3C) but not iNOS mRNA levels (Fig.

3D). Monocytes and macrophages are major sites of iNOS expression, particularly in

infectious or inflammatory diseases. Sustained production of NO endows macrophages

with cytostatic or cytotoxic activity against several pathogens and tumor cells but it can

also exert deleterious pro-inflammatory effects on host cells33. Activation of AMPK by

AICAR and metforrnin inhibited iNOS induction upon exposure of macrophages to

interferon-y (Fig. 3E and F). The PP ARy ligand troglitazone also increased AMPK and

caused a dose-dependent inhibition of NO production in these cells (Fig. 3E and F). The

inhibitory effects of AMPK activators was also linked to reduction in iNOS prote in

induction through a post-transcriptional mechanism (Fig. 3G and H). However, at higher

concentrations (> 10 J.lM) of troglitazone, a reduction in iNOS mRNA levels was also

observed.

Activation of AMPK by in vivo injection of AICAR and metformin inhibits iNOS in

muscle and adipose tissues of LPS-treated rats

To test whether AMPK also blunts iNOS induction in vivo, we assessed the ability

of AICAR and metforrnin to inhibit iNOS in rskeletal muscle and adipose tissue of rats

injected with the bacterial endotoxin LPS, a model of septic shock. Pre-treatment of LPS

challenged rats with AICAR or metforrnin increased ACC phosphorylation (Fig. 4A) and

significantly reduced NO production in the plasma as weIl as in muscle (gastrocnemius and

144

tibialis) and adipose tissues (Fig 4B). AICAR and metformin treatments prevented

induction of iNOS protein expression in muscle and fat tissues of septic rats (Fig. 4C). In

marked contrast, neither eNOS nor nNOS~ enzymes were affected by LPS or AMPK

activators in muscle and fat (nNOS~ was not detectable in fat) , highlighting the isoform

specific effect of AMPK on iNOS protein. As observed for celllines, the inhibitory effects

of AMPK activators on iNOS-mediated NO production was explained by post

transcriptional mechanisms si~ce LPS-induced iNOS mRNA expression was not affected

by AICAR or metformin treatments. (Fig. 4D). However, one notable exception is

metformin which causes a small but reproducible reduction in iNOS mRNA only in adipose

tissue.

RNA interference-mediated depletion of AMPK reverses the inhibitory effects of AMPK

activators on iNOS protein and NO production

To establish whether AICAR and anti-diabetic drugs inhibit iNOS through AMPK

activation, we next used RNA interference technology to «knockdown» endogenous

AMPK. Immunoblotting experiments confirmed that transfection of small interfering RNA

(siRNA) specific for the al and a2 catalytic subunits reduced AMPK expression to 53 ± 5

% of that of cells mock transfected with unre.1ated siRNA (Fig. 5A). Moreover, combined

siRNA treatment resulted in a comparable inhibition of AMPK and ACC phosphorylation

by AMPK activators (Fig. 5A). In AMPK-depleted myocytes, the ability of AI CAR,

metformin and troglitazone to inhibit cytokine/LPS-induced NO production and iNOS

prote in expression was significantly reduced as compared to cells treated with unrelated

siRNA (Fig. 5B). These results confirmed that these agents blunt iNOS expression and NO

production at least in part through activation of AMPK.

DISCUSSION

Elucidation of the multiple roles of NO in health and disease states has uncovered

many areas where manipulation of NO production would be of therapeutic bene fit. Thus,

whereas focal iNOS induction and NO production is an important anti-infectious and anti-

145

tumor mechanism of innate immunity34, high amounts of iNOS-derived NO can also lead to

self-tissue destruction in autoimmune diseases, allograft rejection, sepsis, rheumatoid

arthritis, chronic heart failure and other disorders accompanied by excessive activation of

the immune system (see3S-38). iNOS induction is also implicated in chronic metabolic

disorders such as atherosclerosis39,40 and obesity-linked diabetes2S,41 in which an

inflammatory condition is also believed to play a pathogenic role. Such wide implication

has produced an intense interest in understanding the modulation of iNOS expression and

activity, with the goal of finding novel mechanisms of control of this high output NO

pathway. For these reasons, the design of selective iNOS inhibitors and the identification of

iNOS inhibitory pathways have received much attention in recent years. In the present

study, we show that pharmacological activation of AMPK by AICAR and two classes of

anti-diabetic drugs inhibits iNOS induction in cells and tissues exposed to inflammatory

mediators. Gene silencing experiments confirmed that AMPK -activating agents blunt

iNOS-mediated NO production at least in part via activation of AMPK. Indeed, depletion

of AMPK in L6 myocytes by using the combination of al and a2-AMPK siRNA species

led to a significant loss in the ability of AICAR, metformin and troglitazone to reduce

cytokine/LPS-induced iNOS protein expression and NO production.

Metformin and the PPARy agonist rosiglitazone activate AMPK and this is believed

to contribute to their insulin-sensitizing actions in diabetic subjects9,lS-18. These anti

diabetic effects have been mainly attributed to the lipid and glucose-related metabolic

effects of AMPK activation. However, our data strongly suggest that inhibition of iNOS

induction and reduced NO formation a novel mechanism by which AMPK improves insulin

action in muscle. Indeed, we show here that AMPK activation -by several drugs reduces

iNOS induction in L6 myocytes chronically exposed to cytokines and LPS, an in vitro

model of insulin resistance for glucose transport26. Accordingly, we also found that iNOS

mediated impairment in insulin-induced PI 3-kinase activation can be reversed by AMPK

activators. Furthermore, the inhibitory effect of AMPK activation on iNOS was confirmed

in vivo in a model of septic shock associated with insulin resistance27. Further studies will

be needed to test whether long-term AMPK activation can also prevent or reduce iNOS

,.------ ------ ----~------ ~ - ~ - ---

146

induction in lower grade but chronic inflammatory disorders associated with insulin

resÎstance such as atherosclerosis and obesity-linked diabetes.

AMPK activation also suppressed iNOS protein expression and NO production in

cytokine/LPS-treated adipocytes and in adipose tissue of LPS-challenged rats. Whereas the

precise role of iNOS-derived NO in adipose cells is still not fully understood, it is thought

to be involved in the modulation of lipid metabolism in endotoxemia32,42 and may be a

paracrine mediator of skeletal muscle insulin resistance in obesity-linked diabetes25,43 .

Activation of AMPK in macrophages, an important site of iNOS expression, also caused

inhibition of IFNy-induced NO production. The latter finding is of important clinical

relevance since macrophage/monocyte iNOS induction has been implicated in the

pathogenesis or promotion of several inflammatory/immune disorders such as septic and

hemorrhagic shock44,45, multiple sclerosis46, myocardial infarction47,48, inflammatory bowel

disease49-51 , and pancreatic ~-cell dysfunction52,53.

It will be important to dissect out the molecular mechanisms by which AMPK

activators cause iNOS inhibition. It is well established that inflammatory cytokines and

LPS trigger iNOS transcription through a complex network of intracellular pathways

including NF-KR , JAKISTAT and MAP kinase54,55. Moreover, the PPARy igands

rosiglitazone and l5dPGJ2 were previously shown to reduce iNOS expression in several

cell types52,53,56 through transcriptional repression56. We were therefore expecting that

PPARy-dependent activation of AMPK would inhibit iNOS by reduction of its

transcription. Surprisingly, we found that all AMPK activating agents, including the

pp ARy agonists troglitazone and 15dPGJ2, decreased iNOS protein but barely affected

mRNA expression. Only when higher concentrations of troglitazone and 15dPGJ2 were

used did we observe a reduction in iNOS transcript levels. It should be noted that recent

studies have shown that inhibition of iNOS transcription by rosiglitazone may result from

activation of both pp ARô and pp ARy57. Thus high concentrations of rosiglitazone inhibit

iNOS in PPARy-l- macrophages at least in part by activating PPARy. Troglitazone is 100-

fold less potent than rosiglitazone58 for pp ARy but its affinity for pp ARô has not been

established. Therefore, it cannot be excluded that its inhibitory action on iNOS may be

147

mediated in part through PPAR8. Studies in cells lacking both PPAR8 and PPARy will be

needed to answer this important question. "

The inhibitory effect of AMPK activators on NO production were highly correlated with

the reduction in iNOS protein content, suggesting that AMPK modulates iNOS protein

turnover. In this regard, recent reports suggest that AMPK switches off protein synthesis

either through suppression of the mTOR-p70S6 kinase pathway59-61 , or by direct activation

of eukaryotic elongation factor 2 (eEF2) kinase, resulting in the phosphorylation and

inactivation of eEF262. It is also possible that AMPK reduces iNOS protein content by

promoting its ubiquitination, a process required for targeting iNOS through the proteasome

proteolysis pathway63. However, ubiquitination has also been reported to be involved in the

proteolytic degradation of nNOS64 whereas the inhibitory effects of AMPK on NO

production appears to be" specific for the iNOS isoform. Indeed, neither nNOS nor eNOS

proteins were affected by AICAR or metformin treatments in muscle and adipose tissue of

LPS-challenged rats, and AMPK activators blunted LPS-induced NO production but did

not reduce basal NO formation by constitutive NOS enzymes. This argues for inhibition of

prote in synthesis rather than ubiquitin-mediated proteasomal degradation as the principal

mechanism by which AMPK regulates iNOS prote in turnover.

The identification of AMPK as a selective iNOS-inhibitory pathway may provide a

molecular basis for the recent observations that exercise training, which increases AMPK

expression lO, improved exercise capacity in association with reduced skeletal muscle iNOS

expression in patients with chronic heart failure38. Our data further suggest that AMPK

represents a promising therapeutic target for immune-inflammatory disorders in which

iNOS induction is pathogenic but not critical for health (i.e. non-infectious diseases). These

include metabolic disorders such as atherosclerosis and obesity-linked diabetes. " However,

even for those inflammatory conditions, caution must be exerted since iNOS can also play

more subtle yet important physïological roles with potential adverse consequences

attendant on its inhibition in diseased states. For example, iNOS plays a protective role in

the development of transplant arteriosclerosis 65,66 and is also critical for optimal wound

healing67 which calls into question the use of iNOS inhibitory agents to treat diseases such

148

as atherosclerosisand diabetes. Bearing these cautions in mind, it is crucial to elucidate the

molecular mechanisms by which AMPK inhibits iNOS, since this may help design novel

strategies for an effective and tissue-specific inhibition of iNOS in inflammatory settings

while limiting adverse physiological consequences.

METHODS

Materials

AICAR was purchased from Toronto research chemicals (Toronto, ON, Canada).

Troglitazone and 15 deoxy PGJ2 were from Cayman Chemical company (Ann Arbor, MI) .

Interferon-y and TNF-a were from Research Diagnostics Inc. , (Flanders, NJ), and RD

systems (Minneapolis, MN), respectively. 1400W was from Biomol Research Laboratories

Inc. (Plymouth, PA) and Oligofectamine from Invitrogen (Burlington, Ontario, Canada). 2',

5'-ADP sepharose (4B) beads were from 'Amersham Pharmacia (Baie d'Urfe, Quebec,

Canada) and the Renaissance Enhanced chemiluminescence kit from NEN Life Science

Products (Boston, MA). AlI other chemicals were from Sigma (St.Louis~ MO). Monoclonal

antibodies against iNOS and eNOS and a polyclonal antibody against nNOS were obtained

from Transduction Laboratories (Mississauga, Ontario, Canada). Polyclonal antibodies

against AMPK, phospho-AMPK (Thr 172) and phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser 79)

were purchased from New England Biolabs (Beverly, MA). IRS-1 antibody (C-20) was

obtained from Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA).

CelI culture

L6 myoblasts and 3T3-L1 fibroblasts were grown a-MEM (10% FBS) or DMEM (20 %

calf serum) containing 1 % antibiotic/antimycotic (100 000 units/ml penicilIin, 100 mg/ml

streptomycin, 0.25 mg/ml amphotericin) and differentiated into myotubes and adipocytes as

previously described26,32. Bone-marrow derived macrophages were a kind gift of Dr. M.

Olivier (CHUL Research Center, Laval University, Quebec, Canada). Generation and

immortalization of the mac~ophages from mouse femurs was performed as previously

described68. Induction of iNOS by cytokines and/or LPS in L6 myotubes, 3T3-L1

149

adipocytes and macrophages, and the effects of AMPK activating agents was carried out as

described in the figure legends. The accumulation of nitrite in the incubation medium was

used as an index of NO production. Nitrite was determined spectrophotometrically as

previously described26.

RNA interference

siRNAs were synthesized by Dharmacon Research (Lafayette, CO) and annealed according

to the manufacturer' s instructions. The sequence of the 19 nt (plus 2AA overhanging at S')

siRNAs were as follows: a1-AMPK: (GCAUAUGCUGCAGGUAGAU); a2-AMPK

(CGUCAUUGAUGAUGAGGCU), unrelated siRNA: (AUUGUAUGCGAUCGCAGAC).

L6 myotubes in 12-well plates were transfected 24 hours prior to cytokines/LPS treatment

with 0.27 JlM of a1- and a2-AMPK siRNAs by using Oligofectamine reagent. Mock

controls were transfected with unrelated siRN A.

AnimaIs


Male Sprague-Dawley rats (200-250 g) purchased from Charles River (Montréal, Qc,

Canada) were used in these studies. Rats were pretreated with a single i.p. injection of

AICAR (1 g/kg BW), metformin (100 mg/kg BW) or saline (vehicle) 30 min prior to LPS

(20 mg/kg BW ) or saline treatment. AnimaIs were sacrificed 4 hours later and hindlimb

muscles and white adipose tissues were removed and stored 'at -80°C until further

processlng.

Measurement of plasma and tiss~e nitrite and nitrate

Nitrite and nitrate levels in ,plasma, skeletal muscles and adipose tissue was measured by

fluorometry69. Briefly, blood was collected in tubes containing EDTA and centrifuged for

10 minutes at 3200 x g to obtain plasma. Tissues were grounded in liquid nitrogen using a

morter. The tissue powder was resuspended in 5 volumes of Tris-EDTA buffer (20 mM

Tris pH 7.5 , 10 mM EDTA) containing a protease inhibitor cocktail. Tissue lysates were

centrifuged at 2800 x g for 20 min and prote in concentration of the supematant was

measured by the BCA prote in assay. Plasma and tissue lysates were then centrifuged at

150

5000 x g (4°C) overnight in a Ultrafree®-Microcentrifuge 10 000 NMWL filter unit.

Nitrate was reduced to nitrite using nitrate reductase and the NADPH regenerating system

as described previously69. The fluorescence was measured at Àex 360 nm and !vern 450 nm.

Determination of NOS protein expression and Western blot analysis

Muscle and adipose tissue lysates (1 mg of protein) were used to purify NOS enzymes

using 2',5'-ADP sepharose resine as previously described25 . Samples were subjected to

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-P AG~) and

immunoblotting was performed as previously described27. Immunoreactive bands were

detected by the enhanced chemiluminescence method.

RNA analysis

Total cellular RNA was isolated uSlng guanidium thiocyanate-phenol-chloroform

extraction and iNOS mRNA was measured by semi-quantitative reverse transcriptase

polymerase chain reaction as previously described26,32.


Celllysates (500 Ilg) were immunoprecipitated with 2 Ilg of anti-IRS-1 ·coupled to protein

A-Sepharose overnight at 4°C. PI 3-kinase activity was determined as previously

described 70.

Data Analysis

AlI data are presented as means ± SE. The effects of the treatments were compared by an

ANOV A analysis followed by Pisher's post hoc test. Differences were considered to be

statistically significant at p<0.05.

151

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by grants from the Canadian Institutes for Health Research

(CIHR) to A.M. A.M. is a CIHR Scientist. G. P. and P. D. were supported by CIHR and

Canadian Diabetes Association doctoral awards, respectively. We thank Bruno Marcotte

and Sandra F avret for expert technical assistance. We are grateful to Dr. Daniel Konrad for

his helpful advices on the use of siRNA and to Drs Yves Deshaies and Claude H. Côté for

critical reading of the manuscript.

152

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158

LEGENDS TO FIGURES

Figure 1: Effects of AMPK activators on NO production and iNOS expression in L6

myocytes. Cells were treated for 24 hours with or without cytokines (TNF -u lOng/ml and

IFN-y, 200 units/ml) and LPS (10 ~g/ml) (Cyto/LPS) in the presence of AICAR (2.5 mM),

metformin (2 mM), troglitazone (10 ~M), or 15 deoxy PGl2 (10 and 25 ~M). A)

Representative immunoblots of ACC (ser-79) and AMPK (Thr 172) phosphorylation

following treatment with AMPK activators. B) NO production was measured by nitrite

accumulation in the incubation medium. Results are expressed as mean ± SE for 3-6

individual experiments. C) Representative immunoblots of iNOS protein expression. iNOS

migrated as a,,-, 130 kDa band. D) Representative RT-PCR for iNOS and GAPDH (internaI

control) mRNAs. Immunoblots and RT-PCR and representatives of 3-6 individual

experiments. * P < 0.05 as compared with cyto/LPS values.

Figure 2: Effects of cytokinelLPS and AMPK activators on IRS-I-associated PI 3-

kinase activity in L6 myocytes. PI 3-kinase was measured in anti-IRS-1

immunoprecipitates from lysatès of L6 myocytes treated for 24 hours with or without

cytokines (TNF-u 10 ng/ml and IFN-y, 200 units/ml) and LPS (10 ~g/ml) (Cyto/LPS) in

the presence of AICAR (2.5 mM), metformin (2 mM), troglitazone (10. J.lM), or the specifie

. iNOS inhibitor 1400W (0.1 mM). Quantification of 32p incorporated into PI 3-phosphate

(PI 3P) was expressed relative to insulin-stimulated values in control (CTR) cells.

Representative autoradiographs are shown in A. Results in B are expressed as mean ± SE

from 3-6 individual experiments. * P < 0.05 as compared with control values.

Figure 3: Effects of AMPK activators on NO production and iNOS expression in 3T3-

LI adipocytes and macrophages. 3T3-L1 adipocytes (panels A to D) were treated for 24

hours with or without cytokines (TNF-a 10 ng/ml and IFN-y, 200 units/ml) and LPS (10

J.lg/ml) (Cyto/LPS) in the presence of AICAR (2.5 mM), metformin (2 mM) or troglitazone

(10 J.lM). Macrophages (panels E to If) were treated for 10 hours with IFN-y (200 units/ml)

and the same AMPK activators. (A and E) Representative immunoblots of ACC ser-79

159

phosphorylation following treatment with AMPK activators. (B and F) Measurement of

nitrite production in the incubation medium. Data are from 2-4 independent experiments

and are expressed relative to nitrite production in cyto/LPS · cells in the absence of AMPK

activators. (C and G) Representative immunoblots of iNOS protein expression. (D and H)

Representative RT-PCR of iNOS and GAPDH mRNAs. Immunoblots and RT-PCR are

representative of 2-4 independent experiments * P < 0.05 as compared with cyto/LPS

values.

Figure 4: Effect of AICAR and metformin on iNOS in skeletal muscle and adipose

tissue in vivo. Rats were pre-treated with a single i.p. injection of AICAR (1 g/kg BW),

metformin (100 mg/kg BW) or saline (vehicle) 30 min prior to injection of LPS (20 mg/kg

BW, i.p.). Tissues and plasma were sampled 4 hours after LPS injection. A) immunoblots

of ACC (Ser 79) phosphorylation in muscle and! fat tissues, B) Measurement of nitrite and

nitrate in plasma, gastrocnemius, tibialis anterior and adipose tissue. Results are expressed

as mean ± SE from 4 animaIs. C) Representative immunoblots of eNOS, nNOSJ,l and iNOS

prote in expression in muscle and fat tissues. D) Representative RT-PCR of iNOS and

GAPDH mRNAs in muscle and adipose tissue. lmmunoblots and RT-PCR data are

representative of 4 independent experiments with different rats. + P < 0.05 as compared

with saline values.

Figure 5: siRNA-mediated reduction in AMPK expression reverses the inhibitory

effects of AMPK activators on iNOS expression and activity. L6 myocytes were

transfected with 0.27 J-lM of al-and a2-AMPK siRNAs by using Oligofectamine reagent.

Mock controls were transfected with the unrelated siRNA. Twenty-four hours after

transfection, cells were treated w~th cytokines, LPS and AMPK activators exactly as

described in Figure 1. A) Representative immunoblots of AMPK prote in expression,

AMPK (Thr 172) phosphorylation and ACC (Ser 79) phosphorylation in siRNA (a1/a2)

and mock transfected cells. B) Cellular iNOS protein expression and nitrite accumulation in

the medium of siRNA (a1/a2) and mock transfected cells. Nitrite data are mean ± SE of 3-

7 individual experiments. lmmunoblots in A and B are representative of at least 3

experiments. * P < 0.05 as compared with mock controls.

A @AMPK l ,,-,- --" 1

CTR AICAR CTR TRO @ACC

CTR AICAR MET TRO

CTR MET o 10 25

PGJ2 (IlM)

B

__ 120 120 (/)

120~----------~ 120 -r-------, Cl) :::l 100 ëti 100 >

Cf) a.. 80 80 ....1 Ô 60 >. 60 (.)

'0 40 40 ~ e..-

~ 20 20

Z 0 0 CTR 0 2.5

CYTO/LPS + AICAR (mM)

C

iN OS L-t ___ .", ""-" " _" " ___ , CTR 0 0.5 1 2.5

CYTO/LPS + AICAR (mM)

o

iNOS

GAPDH

Figure 1

CTR CYTO CYTO LPS LPS

AI CAR

100 1<'

/ )\ ,:[ * li

80

60 l '"""

40 1;:

: 20

Lc=::a..... {

o CTR 0 0.5 1 2

CYTO/LPS + MET (mM)

CTR 0 0 .5 2

CYTO/LPS + MET (mM)

CTA CYTO CYTO LPS LPS

MET

100

CTR 0 5 10 20

CYTO/LPS + TRO (IJM)

CTR 0 10 20

CYTOILPS + TRO (IJM)

CTR CYTO CYTO LPS LPS

TRO

80

60

40

20

a CTR 0 1 10 25

CYTO/LPS + PGJ2ÜJM)

•• CTR 0 1 10 25

CYTO/LPS + PGJ2 (!lM)

CTR 0 10 25

CYTO/LPS + PGJ2 (IJM)

160

A

PI(3)P ___ 1

1

r 1

Insulin

CYTO/LPS

Agent

B > 140 ...., "S: += (,)

120 cu (1.) <n mû) cO> 100 "- ::l ..:.:-lm M> -0 Il.!:: 80 "tJ§ (1)U ....,-('(Jo 60 ·ü~ o~ <n <n 40 CU

1 ,... 1

U) 20 Cl:

0

CTR

Figure 2

+ +

+ + +

+ +

+ +

AICAR MET TRO 1400W

CYTO/LPS

161

MET

TRO

1400W

A 3T3~L 1 ADIPOCYTES

CTA - AICAR MET TAO

CYTO/LPS

8

(il 120 Cl.> :::J ~ 100 >

Cf) c.. 80 -l 0 >. 60 ()

'0 ~ 4 0

~ 20 ~ z

0 CTA * AICAA MET TAO

CYTO/LPS

c

CTR - AICAA MET TAO

CYTOiLPS

o

CTR - AICAA MET TRO

CYTO/LPS

Figure3

E

@ACC

F

120

~1 00 :;:, ~ 80 > :;.-z ~ 60 '0 ê 4 0

S 20 E Z

0

G

iNOS

H

iNOS

GAPDH

MACROPHAGES

CTR - AICAR MET CTR - 10 20 40 100 CYTO/LPS IFNI' + TRO (~M)

~----------~ 120~--------------~

CTA - AICAR MET

IFN~y

CTR - AICAA MET

IFN~y

100

80

60

40

20

o CTR 0 10 20 40 100

IFNy + TRO ÜJM)

CTR 0 10 20 40 100

IFNy + TRO (lJM)

CTR - AICAR MET CTR 0 10 20 40 100

IFNy + TRO (~M) IFNy

162

SKELET AL MUSCLE A

@ACC ' $$.$# rIe ,,; .. 1.1

B

(j) 120

Cl>

~ 100 >

~ 80 -l

60

8 40 Z ""N 20 o Z

o

c

140 Kd

SALINE LPS LPS LPS AICAR MET

PLASMA GASTROCNEMIUS 120..,.-------...,

100

80

60

40

20

o o SALlNÉ • LPS

SKELETAL MUSCLE

eNOS

130Kdl _ iNOS

SAUNE LPS LPS LPS

o

SALINE

Figure4

AICAR MET

SKELETAL MUSCLE

LPS LPS AICAR

LPS MET

163

ADIPOSE TISSUE


TISIALIS ADIPOSE TISSUE 1 20~-----"'" 120 -r-------,

+

100 100

80 BO

60 60

40 40

20 20

o o

o LPS +AICAR f2l LPS + MET

ADIPOSE TISSUE

eNOS

îNOS


ADIPOSE TISSUE

iNOS iNOS

GAPDH Wwuw GAPDH

SALINE LPS lPS LPS AICAR MET

A

B

fi) 100

CI) ::l ëii > 80 (J) a. ...J ....... 0 '> 60 u ..... 0

~ CI) 40 -' '::: -Z

20

o ~-'--'---"'---CYTO/LPS

AGENT

siRNA

FigureS

164

AMPK

1--1 iNOS

+ + + + + + + + AICAR AICAR MET MET TRO TRO

Conclusion

Il est maintenant admis que l' obésité est caractérisée par un désordre inflammatoire associé

à la présence de cytokines telles que l' interleukine-6 (IL-6), le TNFu, et l' interferon-y.

L' implication de ces facteurs inflammatoires dans la résistance à l' insuline se précise de

plus en plus. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette inflammation

chronique permettra de développer de nouvelles avenues afin de combattre ce dérangement

métabolique de plus en plus répandu.

Des études de notre laboratoire ont permis d' identifier l'enzyme iNOS comme cible

majeure à déchiffrer et à contrôler afin de combattre la résistance à l' insuline associée à

l' obésité. Les travaux présentés dans le présent ouvrage auront aidé à identifier le rôle de

iNOS dans la résistance à l'insuline selon les tissus, à préciser les mécanismes par lesquels

iNOS provoque ses effets délétères, à déterminer les implications physiologiques de

l' enzyme dans un modèle expérimental (soit l'incubation de muscles) et, enfin, à proposer

une nouvelle avenue pour limiter l'induction de iNOS soit l'activation de l'AMPK.

La production de monoxyde d'azote par les adipocytes : un rôle dans la pathogenèse de la résistance à l'insuline?

Notre première étude avait pour objectif de faire la revue comparative des effets du NO sur

le muscle et les tissus adipeux. Nous avions préalablement observé que l'induction d' iNOS

dans un modèle cellulaire de muscle (L6) causait la résistance à l'insuline au niveau du

transport du glucose. Les conséquences de l'induction de l'enzyme sur la sensibilité à

l' insuline dans les adipocytes restaient à déterminer. Nous avons donc utilisé un modèle

d' adipocytes blancs (3T3-Ll) et bruns (T37i) dans lesquels iNOS fut induit par un mélange

de cytokines (TNFu et IFNy) accompagné de LPS. Le rôle d'iNOS dans les effets observés

fut déterminé par l'utilisation d'un inhibiteur spécifique: le 1400W. Nous fûmes surpris de

constater que dans les adipocytes blancs et bruns en culture, contrairement à ce qui avait

166

préalablement été observé dans le modèle musculaire, que la résistance à l ' insuline induite

par la présence de cytokines et de LPS, n' impliquait pas iNOS puisque son inhibition par

le 1400W ne prévenait pas le défaut de transport du glucose stimulé par l ' insuline.

Pour tenter d' expliquer le rôle de iNOS dans la résistance à l ' insuline au niveau du muscle

il faut se questionner sur les avantages que procure ce défaut. Il faut d ' abord considérer

qu' iNOS fait partie de l' arsenal des défenses contre les infections. En pareils cas, on peut

penser que l ' organisme a évolué de façon à conserver l' énergie disponible en circulation

pour le cerveau et pour les cellules immuniatires qui, elles, n ' ont pas besoin d' insuline pour

utiliser le glucose. Il fut d ' ailleurs démontré qu'en situations pro-inflammatoires, il y a une

hausse de la gluconéogenèse, de la glycogénolyse et une augmentation de l 'utilisation du

glucose par les cellules immunitaires [478] [479]. On peut aussi observer dans ces

circonstances une augmentation des acides gras en circulation, ce qui contribue à

développer la résistance à l' insuline et diminue la capacité de l'hormone à inhiber la

production de glucose hépatique [480]. Comme le tissu musculaire consomme la majeure

partie du glucose en èirculation, il est concevable que l ' organisme développe cette

résistance à l' insuline plus fortement dans ce tissu pour utiliser l' énergie à meilleur escient

au moment de semblables situations pathologiques. De plus, il est maintenant établi que

l ' infiltration de macrophages au niveau du tissu adipeux peut contribuer à la résistance à

l ' insuline causée par l ' obésité. En effet, certains signaux tels que l' expression de monocyte

chemottractant protein-l (MCP-1) et de son récepteur C-C motif chemokin receptor-2

(CCR2), seraient impliqués dans l ' appel des macrophages aux tissus adipeux. Le groupe de

Martin Obin a d' ailleurs démontré qu'il y avait trente fois plus de mort cellulaire

d ' adipocytes chez les souris obèses db/db et chez les humains obèses et que cette nécrose

du tissu adipeux, occasionnait l ' appel des macrophages dans ce tissu. On peut donc émettre

l 'hypothèse que les adipocytes trop nombreux et trop gros sont moins efficacement irrigués

causant ainsi leur nécrose. L'induction de iNOS aux tissus adipeux pourrait alors présenter

un avantage puisque favorisant l'irrigation et l'angiogénèse du tissu, le NO contriburait à

une meilleure qualité du tissu et donc à une infiltration réduite de macrophages [481] [140].

Cela dit, nous avons tout de même observé - comme nous l'avons rapporté -une

résistance à l' insuline au tissu adipeux qui ne fait pas intervenir iNOS. Une étude

167

subséquente pourrait identifier la ou les causes de ce défaut. Il est probable que la présence

du TNFa en soit la cause. En eff~t, l' implication de cette cytokine fut mise en cause dans la

résistance à l' insuline dans les adipocytes bruns et blancs [482] [220].

Cette dichotomie dans la relation iNOS/insuline entre la cellule musculaire et celle du tissu

adipeux a déjà été observée dans notre laboratoire. Nous avons en effet démontré que

l'insuline avait la capacité d' inhiber l' induction d' iNOS dans les cellules de muscles L6 en

culture alors que le phénomène inverse était observé dans les adipocytes 3T3-L1 ([164] et

données non publiées de Penfornis et Marette). Il est alors concevable qu'au muscle

l' insuline tente de réprimer iNOS pour limiter la résistance à l' insuline induite par l' enzyme

alors qu'au tissu adipeux cette régulation n'est pas nécessaire puisque l'enzyme n'est pas

dans ce cas délétère. En fait, non seulement iNOS ne semble pas néfaste au point de vue de

la sensibilité à l'insuline au tissu adipeux mais on peut imaginer que sa présence pourrait

avoir des aspects bénéfiques. En effet, une étude de notre laboratoire a démontré que

l'induction d' iNOS inhibait la lipolyse, induite en présence de cytokines dans des adipocytes

en culture. En fait, la présence de cytokines et de LPS induisait la lipolyse mais la présence

d'un inhibiteur de iNOS augmentait cet effet suggérant un rôle de iNOS sur le processus

[483]. On peut donc en déduire que iNOS limitera la prod,uction d'acides gras libérés par le

tissus adipeux limitant ainsi la résistance à l'insuline causée par leur présence dans la

circulation. Il faut aussi dire qu'alors que l'activation de l'AMPK dans les cellules

musculaires a un effet positif sur le transport du glucose, cette même voie cause la

résistance à l'insuline dans les adipocytes [484] [485]. Les raisons de cette différence

marquée , demeurent nébuleuses pour le moment mais elles mettent tout de même en

lumière, une fois de plus, les différences complexes qui opposent le muscle au tissu

adipeux par rapport à la sensibilité à l' insuline.

Finalement, nous proposons dans cet article un modèle selon lequel les adipocytes qui

infiltrent le muscle expriment iNOS et y causent la résistance à l'insuline. En effet, des

études de notre laboratoire ont démontré qu' iNOS était clairement induit dans le tissu

adipeux de rats obèses sous un régime riche en gras [432]. Certains ont émis l'hypothèse

que lorsque le tissu adipeux prend de l'expansion, les adipocytes peuvent devenir

168

hypoxiques et sécréter des cytokines inflammatoires afin de favoriser l ' apport en sang

[486].

Le potentiel vasodilatateur et les propriétés d' angiogénèse du NO pourraient donc justifier

sa présence dans les adipocytes d' individus obèses mais, en contrepartie, créer la résistance

à l' insuline au muscle. Dans un même ordre d' idée, une étude, récente de notre laboratoire a

proposé un rôle indirect du NO produit par iNOS du tissu adipeux dans la résistance à

l'insuline du muscle. En effet, nous avons observé que la présence de NO causait

l' inhibition des pp ARy de cellules adipeuses diminuant ainsi l' adiponectine de haut poids

moléculaire en circulation [487]. Une diminution de cette forme particulière aura des

conséquences néfastes sur la sensibilité à l' insuline du muscle et particulièrement du foie.

Cette étude met une fois· de plus en lumière la complexité 'des effets du NO sur les

différents tissus. Des études plus approfondies seront nécessaires avant de développer des

outils thérapeutiques afin de mieux comprendre la relation entre les tissus individuellement

et cette molécule gazeuse.

Le peroxynitrite cause la résistance à l'insuline induite en présence d'iNOS par la nitration de IRS-l dans le muscle squelettique

Différentes études réalisées dan's notre laboratoire nous ont permIS de conclure à

l' implication d' iNOS dans la résistance à l'insuline dans le muscle squelettique. Le

mécanisme impliqué dans ce défaut induit par cette forte production de NO n 'avait

cependant pas encore été élucidé. Nous avons cherché à le faire. Nous avons trouvé que la

formation de peroxynitrite à partir du NO généré par iNOS est responsable de l ' inhibition

de l'action de l'insuline sur le transport du glucose. Dans cette seconde étude, nous avons

incidemment observé qu'une diminution de l'activité PI 3-kinase par la nitration de IRS-l

est la cible du ONOO-, un puissant oxydant dérivé du NO.

Il est admis qu'une surproduction de NO peut causer des dommages tissulaires par sa

réaction rapide avec le O2- en produisant du ONOO-. Cependant, quoique le ONOO- puisse

réagir avec des résidus tyrosines pour former des nitrotyrosines, la spécificité de cette

réaction au ONOO- est de plus en plus remise en question. Certains auteurs ont proposé que

169

le NO, le HN02 ainsi que le N02, en présence ou non de myeloperoxidase, pouvaient aussi

causer la nitration sur les résidus tyrosine [488] [489]. Afin de démontrer que le ONOO

pouvait bel et bien occasionner les effets observés par l' induction d' iNOS, nous avons

traité nos cellules directement avec l' oxydant. Observant les mêmes désordres

métaboliques selon un traitement aux cytokines et à la LPS ou encore au ONOO-, nous

avons conclu à l ' implication du ONOO- dans le processus.

Pour prouver hors de tout doute qu' il s ' agit bien du ONOO- généré en présence d' iNOS

qui cause la résistance à l' insuline, et que nous ne sommes pas en présence d'une

coïncidence voulant que le ONOO- et iNOS causent la résistance à l ' insuline par des

mécanismes similaires, il faudrait comprendre les mécanismes par lesquels le ONOO- est

formé en pareille circonstance. En effet, quoi qu' il soit bien entendu que le NO soit formé

par iNOS, la provenance du O2- n' a pas été strictement identifiée dans notre étude. On sait

cependant que les sources de O2- sont nombreuses dans une cellule: la NADPH oxydase, la

xanthine oxydase, la fumarate réductase, la succinate deshydrogénase ainsi que l' aspartate

oxidase [490] [491]. De plus, certaines de ces enzymes sont activées par le TNFa ou

l' IFNy, les deux cytokines employées dans notre étude [492] [493]. Une autre source de O2-

peut provenir de l'enzyme iNOS elle-même. En effet, en présence d'une faible

concentration de son substrat, la L-arginine, comme il fut rapporté lors de situations

inflammatoires, le O2- peut être généré par iNOS [494]. Dans cette optique, il est d ' ailleurs

important de mentionner que l'arginase II est aussi induite par certaines cytokines [495].

Ainsi, en situation inflammatoire, il est concevable que l'action des arginases contribuent à

la production de ONOO- pour combattre plus efficacement les pathogènes en diminuant les

niveaux d'arginine forçant ainsi iNOS à produire plus de O2-. Sans avoir identifié la source

de O2-, nous imaginons néanmoins qu'il s'agit d'un processus faisant intervenir l' action des

cytokines puisque des résultats préliminaires à l'aide d'un donneur de NO, le NOC-15, ne

nous a pas permis de recréer le défaut d'activation de la PI 3-kinase dans nos cellules de

muscle en culture.

170

Toujours dans l'optique de prouver l'implication du ONOO-, nous avons utilisé un

neutralisateur de l'oxydant provenant du thé: l' epigallocathéchin gallate (EGCG). Ces

expériences ont confirmé que la neutralisation du ONOO-. pouvait renverser la résistance à

l' insuline induite par le ONOO- et par les cytokines. Quoi qu' il fût rapporté que ce puissant

antioxydant puisse inhiber iNOS directement, nous n ' avons pas observé de réduction de

nitrite aux concentrations utilisées [496].

Une autre avenue intéressante, serait d' investiguer si, en plus de la nitration sur IRS-l , le

ONOO- ne causerait pas la résistance à l' insuline en activant certaines voies de

signalisation. En effet, des études ont démontré que le ONOO- pouvait activer la voie de

JNK et la voie de NF-KB, deux voies capables de causer la résistance à l' insuline [182]

[187]. Il fût aussi rapporté que la présence de ONOO- dans des cellules endothéliales

provoquaient l' activation de LKB 1 [497]. Quoi que cette kinase soit connue pour activer

l'AMPK ce qui provoque généralement des effets positifs sur la sensibilité à l' insuline, il

fût aussi observé que des souris invalidées pour le gène de LKB 1 spécifiquement aux

muscles étaient plus sensibles à l ' insuline [498]. Les souris n'exprimant pas LKBl au

muscle ont une plus grande activation de la voie AKT en réponse à Pinsuline puisque

l' expression de la protéine homologue à D. melanogaster tribbles (TRB3) est alors réduite.

En effet, TRB3 serait un facteur régulant négativement l' activation de l' AKT en réduisant

son expression. On peut donc concevoir qu'une suractivation de LKB 1 par la présence de

ONOO- puisse éventuellement causer la résistance à l'insuline via ce mécanisme.

Finalement, il faut être prudent avec l' interprétation de nitrotyrosine puisque dans certains

cas cette modification peut mimer la tyrosine phosphorylation [451]. En effet, la

nitrotyrosination est de plus en pl~lS perçue comme un mécanisme de signalisation

cellulaire permettant une perte ou parfois un gain de fonction [499]. Il est peu probable

cependant que ce fut le cas dans notre étude puisque la nitration sur les résidus tyrosine de

IRS-l est accompagnée d'une réduction de l' activité PI 3-kinase associée à IRS-l.

Malgré les conclusions de cette étude pointant le lien entre le ONOO- et la résistance à

l'insuline au muscle, il faut demeurer prudent avant de conclure que la neutralisation de cet

oxidant pourrait être la solution afin d'enrayer la résistance à l'insuline. En effet, la nature

171

évolue habituellement de façon intelligente de manière à protéger les organismes vivants.

Ainsi, il est concevable que la production de ONOO- ait sa raison d'être. En , effet, il fut

proposé que la présence de ONOO- causait l'inactivation rapide et irréversible des tyrosines

phosphatases PTP-1B, CD45 et LAR [466]. Comme les tyrosines phosphatases peuvent

bloquer les signaux envoyés par l'insuline, il est concevable que la résistance à l'insuline

puisse être amoindrie par la présence de ONOO- [3] [64]. Finalement, puisque certaines

tumeurs hormone-dépendantes sont associées à l'obésité, il est concevable que la présence

de ONOO- puisse avoir des effets protecteurs contre cet autre effet secondaire relié à une

surcharge pondérale en induisant l'apoptose de cellules tumorales.

L'incubation à long terme d'epitrochlearis cause l'induction d'iNOS un nouveau modèle de résistance à l'insuline

L' incubation de muscle in vitro peut s'avérer incontournable' lorsque l' on veut éliminer les

facteurs endogènes qui pourraient influencer notre interprétation de résultats. Cependant,

plusieurs auteurs ont mis en lumière certains déséquilibres au niveau du transport du

glucose basal et stimulé par l ' insuline dans de telles préparations [500] [501].

Comme nous l'avons mentionné à plusieurs reprises, nous avions observé que l' induction

d' iNOS pouvait être associée à des changements de transport du glucose au niveau du

muscle tant en situation basale qu'en présence d' insuline. Nous avons donc examiné si

l' induction d' iNOS pouvait expliquer les changements métaboliques observés lors de

l' incubation de muscles.

Nous avons observé que l' incubation d'epitrochlearis causait l' induction d' iNOS assez

rapidement lors de l' incubation. Plus précisément, nous n'observions pas d'iNOS dans les

muscles directement congelés après leur excision, mais dès que les muscles furent

préincubés 30 minutes pour être stabilisés, nous pouvions voir une très nette induction. Le

muscle était par la suite changé de milieu d' incubation toutes les deux heures. Nous fûmes

surpris de voir qu' après une heure d ' incubation, la présence d ' iNOS observée lors de

l' étape de stabilisation de 30 minutes n 'était plus apparente mais ne réapparaissait qu'après

172

deux heures pour atteindre son plus haut niveau après sept heures d' incubation. Comme

iNOS n'est pas présent normalement au muscle en absence de pathologie, il serait

surprenant que cette induction rapide en 30 minutes provienne effectivement du muscle. Il

est plutôt probable que la détection de l' enzyme soit plutôt due à la présence de

macrophages dans le muscle excisé. En effet, les macrophages répondent beaucoup plus

facilement à des stimuli inflammatoires. Cependant, au cours des lavages occasionnés par

les changements de milieu, on peut penser que la quantité de macrophages fut réduite.

Ainsi, lors de l' atteinte de la plus forte expression d' iNOS après sept heures, il y a fort à

parier que peu de macrophages étaient alors impliqués dans l' effet observé. Nonobstant la

provenance d' iNOS, la modification du transport du glucose basal et de la sensibilité à

l' insuline demeure et' elle doit être prise en considération lors d' études faisant intervenir

l' utilisation de muscles incubés.

Nous observons en effet que le transport du glucose basal est augmenté par la présence de

fortes concentrations de NO. L'association entre le NO et l' augmentation du transport du

glucose basal a déjà été rapportée dans divers modèles cellulaires [110] [109]. Cependant,

les mécanismes qui soutendent cette interaction n'ont jamais été précisément démontrés.

On sait par contre que la section non traduite de GLUT1 contient des éléments de réponse à

l'activator protein-l (AP-1 ) et au serum responsive element (SRE) [113]. Ces facteurs de

transcription pouvant être activés en présence d' oxydant, on peut imaginer que la forte

concentration de NO permettra leur activation et par conséquent l' induction de GLUT1.

Ces facteurs sont cependant reconnus pour être dépendants de l'activation de JNK. Si c'est

effectivement le cas dans la situation présente, il serait intéressant de savoir si l' activation

de cette voie contribue aussi, en partie, à l'état de résistance à l'insuline observée dans le

présent modèle à l' étude. Finalement, l' entrée massive de glucose occasionnée par

l' augmentation de l'expression de GLUT1 pourrait aussi avoir un rôle à jouer dans la

résistance à l'insuline. En effet, il fut proposé que les souris surexprimant GLUT1 au

muscle devenaient résistantes à l'insuline en raison de la modification de protéines

occasionnée par la voie de l'hexoxamine. En effet l'ajout de O-GlcNAC à certaines

protéines pouvait conduire à la résistance à l'insuline [502].

173

Dans le cas présent, le seul fait d' ajouter un inhibiteur spécifique d' iNOS rétablit la

sensibilité à l' insuline, ce qui laisse croire qu' il est à l' origine de tous les défauts

subséquents contribuant à une réduction de la sensibilité à l' insuline.

D'un autre côté, nous avons aussi observé que l' induction d' iNOS s' accompagnait d'une

réduction de l' activité des cNOS expliquée par une diminution de leur expression. Les

interrelations entre les trois enzymes NOS ont été abondamment rapportées, tantôt

démontrant que les enzymes répondaient aux mêmes stimuli, tantôt indiquant plutôt

qu' iNOS causait la réduction de ses deux consœurs [503] [357] [504]. La raison d'être de

ces différentes régulations s'explique difficilement puisqu'elle pourrait varier à mon avis

selon les tissus étudiés, la nature des cytokines présentes, la force d' induction de iNOS et la

nature des ROS présents dans le système. Il est donc probable que les niveaux

d'antioxydants et la présence de O2- aux différents tissus selon les différentes situations

pourraient expliquer la présence ou non de l' inhibition des cNOS par iNOS.

L'activation de l'AMPK : un nouvel outil pour réduire l'inflammation

Dans notre dernier article, nous avons démontré que iNOS est inhibé de façon post

transcriptionnelle par. les activateurs d'AMPK suivants : le AICAR, la metformine et les

agonistes de pp ARr : la troglitazone et la 15dPGJ2• Par la même occasion, nous avons

démontré que l' inhibition par iNOS de la PI 3-kinase était rétablie lorsque iNOS était

inhi bée en présence d' activateurs d' AMPK.

Il est déj à clairement établi que l' activation de l' AMPK présente des vertus non seulement

prometteuses pour la mise au point de futurs médicaments contre la résistance à l' insuline

mais 1; AMPK serait aussi responsable des propriétés antidiabétiques des médicaments les

plus utilisés présentement pour contrer la rési~tance à l' insuline, soit les TZDs et la

metformine.

174

Alors que la metformine active l' AMPK par un mécanisme dépendant de LKB-1 , la

relation entre les agonistes de PPARy et l'AMPK est plus compliquée à établir [505]. En

effet, il est . difficilement concevable que l' activation de récepteurs nucléaires régulant

normalement l' expression de gènes puisse causer une activation rapide de l' AMPK située

en grande partie dans ·le cytosol. Il serait sans doute fort utile de comprendre comment les

agonistes de pp ARy permettent l' activation de l ' AMPK afin de mettre au point d' autres

activateurs d ' AMPK.

Il serait surprenant, mais non impossible cependant, que l' activation des PPARy ne fasse

pas intervenir ces facteurs nucléaires. En effet, il fut proposé que la troglitazone occasionne

des changements au niveau du potentiel membranaire mitochondrial causant ainsi

l' activation de l'AMPK par les TZD [506]. Cependant, puisque tant les ligands

synthétiques TZD que le ligand naturel 15dPGJ2 activent l'AMPK, il serait surprenant que

ces ligands ne soient pas impliqués d'une façon ou d'une autre. Bien qu' il soit établi que les

pp ARy soient des récepteurs nucléaires, il est tout de même concevable que certains de ces

récepteurs puissent se retrouver dans le cytosol ou même à la membrane cellulaire. Ainsi

positionnés, ils pourraient permettre l' activation de voie de signalisation conduisant à

l' activation de l'AMPK plus directement.

Une autre piste de réponse envisageable pourrait se trouver ~u niveau des corépresseurs

situés sur les pp ARy non liés à un agoniste. En effet, Evans et ses collaborateurs ont

élaboré une hypothèse ouvrant à de plus grands horizons la conception de ces récepteurs

nucléaires. Dans le modèle proposé, la liaison d'un ligand au pp AR8 permet la libération

de corépresseurs inhibant certains gènes inflammatoires. Conséquemment, la présence de

pp AR8 non lié à un agoniste agit de façon pro-inflammatoire puisqu' ainsi ils agissent

comme agents neutralisants de corépresseurs qui, eux, sont anti-inflammatoires à l'état

libre. Sur la foi de cette hypothèse, il n'est pas impossible que la liaison de ligands des

pp ARy permette la libération de cofacteurs pouvant, eux, causer l' activation de l' AMPK.

Ainsi, l' interaction de ces facteurs libérés avec l' AMPK pourrait la rendre plus attrayante

pour l'une de ses kinases. Ou encore, ces facteurs pourraient interagir avec une kinase de

l'AMPK. Il est donc permis de croire que certains facteurs permettent le pont entre

175

l'AMPK et sa kinase rendant ainsi possible son activation. Ainsi donc, il ne faudrait pas

avoir une conception trop étroite de ces récepteurs PPAR et les déclarer d' emblée

incapables d' activer une kinase cytosolique.

Cette conception pourrait d' ailleurs expliquer pourquoi les souris hétérozygotes PPARy

ont, contre toute attente, une sensibilité à l' insuline améliorée [507]. En effet il est

surprenant de penser qu'une réduction de l' expression de PPARy cause une augmentation

de la sensibilité à l' insuline alors que l'activation de ces récepteurs cause le même effet.

Cela pourrait donc s' expliquer par le fait que la liaison des agonistes PPARy libère des

facteurs profitables pour la sensibilité à l'insuline et qu' ainsi une réduction du nombre de

pp AR Y augmente le nombre de ces facteuts à l' état libre, d' autant plus si ces facteurs

mènent à l'activation de l 'AMPK.

Cette étude nous a donc permis de conclure à l' implication de l'AMPK dans les effets

inhibiteurs sur iNOS du AICAR, de la metformin et de la troglitazone. Comme nous avons

démontré qu' iNOS était impliqué dans la résistance à l'insuline associée à l' obésité, si nous

sommes en mesure de trouver l' activateur idéal de l'AMPK, nous nous approcherons de la

drogue idéale pour contrer la résistance à l' insuline. Lors d'études futures , il pourrait être

intéressant d' envisager la relation inverse entre iNOS et l' AMPK. C'est-à-dire,

d' investiguer si l ' induction de iNOS peut causer l'inhibition de l'AMPK. Quoi que peu

d' indices nous laissent actuellement croire à cette hypothèse, il est possible d' établir

certaines pistes. Par exemple, les indices' fournies par les souris iNOS -/- de l' étude de

Mylène Perreault réalisée dans notre laboratoire. Il 'fut en effet noté que ces dernières

mangeaient considérablement plus que les souris sauvages sans cependant engraisser

davantage. Une relation d' inhibition entre iNOS et l'AMPK pourrait expliquer ces résultats.

En effet, si l'absence de iNOS dans l'hypothalamus permet une activation de base de

l'AMPK plus élevée dans cet organe, une prise alimentaire augmentée devrait en découler.

De plus, en périphérie, l' absence de iNOS pourrait, là aussi, lever une inhibition sur

l'AMPK causant une augmentation de la dépense énergétique par l'augmentation de la

mitochondriogénèse et l ' expression d'UCP3, expliquant pourquoi ces souris ne prennent

relativement peu de poids malgré une prise alimentaire grandement augmentée [432] [508].

176

Alors que les PPARy occasionnèrent une véritable révolution sur le plan pharmaceutique

dans le traitement du diabète de type2, les pp AR8 suscitent désormais de plus en plus

d' intérêt. Non seulement l'activation de ces récepteurs sensibilise à l'insuline, mais ils ne

causent pas l' augmentation, mais plutôt la diminution de la masse adipeuse, contrairement

à la sollicitation des PPARy [509].

Cependant, certains auteurs ont remis en doute l' importance de ces récepteurs dans la

sensibilité à l'insuline. En effet, le groupe de Terada et Han, n'a pas observé

d'augmentation du transport du glucose dans un modèle d' épitrochlearis incubé pendant six

heures en présence d ' un agoniste de PPARb. On peut cependant deviner que ce type de

modèle expérimental n 'est pas adéquat pour étudier la sensibilité à l' insuline pour les

raisons énumérées dans l ' étude du chapitre 3 de la présente thèse [510].

Malheureusement, pour l'instant, il n 'y a pas de médicament disponible pour activer les

PPAR8 chez l' humain, mais il s' agit sans aucun doute d'une cible prometteuse.

De notre côté, des études préliminaires nous ont permis de constater que l' activation des

PPAR8 à l' aide d'un agoniste spécifique; le GW0742 activait l'AMPK dans des cellules de

muscle L6 en culture et inhibait l' induction d' iNOS par un mécanisme post-transcriptionnel

pouvant impliquer l' inhibition par sa phosphorylation du facteur de traduction eEF2. En

effet, quoi que l'expression protéique de iNOS soit réduite, l'ARNm n'est pas modifiée.

D'un autre côté, il serait aussi intéressant d' étudier si cette régulation post

transcriptionnelle pourrait être expliquée par l'induction de micro ARN (mi RNA) par

l' activation de l'AMPK. En effet, les miRNA ont récemment été découverts et ont mis en

lumière un tout nouveau mode de régulation de la traduction [511]. Ces petits ARN

agissent en répresseurs post-transcriptionnels en s' appariant à des ARN messagers

particuliers réprimant ainsi leur traduction. Il serait donc intéressant de regarder si

l'activation de l'AMPK peut bloquer la traduction de la protéine iNOS par l' induction de

miRNA particuliers.

Pour conclure, même si pour le moment, plusieurs solutions pharmacologiques s' offrent à

nous, aucune n ' est sans conséquence ni totalement efficace pour contrer la résistance à

177

l' insuline. La prévention de l'obésité par l' éducation, l ' exercice et une alimentation

équilibrée demeure à mon sens l' avenue la plus efficace - sans être la plus simple, j ' en

cqnviens - pour lutter contre cette épidémie.

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Rôle du monoxyde d'azote dans la résistance à l'insuline ...

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