Protein Oksidasyonu ve Yaşlanma

Gözde Hasbal

Proteinlerin reaktif oksijen türleri ile direkt olarak veya oksidatif stresin sekonder ürünleri ile indirekt olarak kovalent modifikasyonu sonucu meydana gelir.

Protein oksidasyonu ?

Serbest Radikaller Nelerdir?

o Bir veya daha fazla eşleşmemiş elektrona sahip

o Kısa ömürlüo Kararsızo Molekül ağırlığı düşük, reaktivitesi yüksek

o Atom veya moleküller

Serbest oksijen radikalleri tüm aerobik organizmalar tarafından mitokondrilerin normal metabolizmasının (oksijenin suya kadar indirgenmesi) bir ürünü olarak oluşur. Mitokondrilerde oluşan serbest radikaller karşılaştıkları herhangi bir molekülü okside etme eğilimindedirler.

Proteinler muhtemelen oksidatif hasara en duyarlı moleküllerdir ve hasarın etkisi diğer moleküllere göre oldukça fazladır.

Serbest radikaller;

• proteinlere, • lipidlere, • karbohidratlara ve • DNA’ya zarar vererek büyük oksidatif hasarlara neden olurlar ve sonuçta hücre ölümüne yol açarlar.

Proteinlerin oldukça farklı biyolojik fonksiyonları vardır. Proteinlerde in vivo olarak meydana gelen oksidatif değişiklikler proteinlerin rol oynadığı çeşitli hücresel fonksiyonları etkiler.Plazma fibrinojeni okside olduğu zaman solid pıhtı oluşturma yeteneğini kaybeder.

Sinoviyal sıvıdaki immunglobinlerin oksidasyonu agregasyona neden olur ve romatoid artritin etiyolojisine katkıda bulunur.

α-1 antitripsin’in oksidatif değişikliği ciddi fizyolojik sonuçlara neden olur.

Düşük dansiteli lipoproteinlerin (LDL) oksidasyonu, LDL apoproteininde karbonil gruplarının oluşumuna yol acar. LDL’nin oksidasyonu aterosklerozun etiyolojisinde önemli rol oynar.

Doymamış ve sülfür-içeren moleküllerin serbest radikallerle reaktivitesi yüksek olduğu için triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metionin, sistein gibi amino asitleri içeren proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler.

Papain ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz gibi reaktiviteleri için yukardaki amino asitlere bağımlı olan enzimler serbest radikallere maruz kaldıklarında inhibe edilirler.

Sitoplazmik proteinler ve membran proteinleri de okside edici ajanlara maruz kaldıklarında, çapraz bağlanma sonucu, dimerler ve büyük agregatlar oluştururlar.

Proteinlerin, serbest radikal harabiyetinden ne derece etkileneceği amino asit kompozisyonlarına bağlıdır. Proteinin hücresel lokalizasyonuna ve radikalin toksisite gücüne göre protein harabiyetinin boyutları değişebilir.

Proteinlerde yapısal değişikliğe yol açan başlıca moleküler mekanizmalar;

* Protein karbonil (PCO) gruplarının oluşumu

* Protein tiyol (P-SH) gruplarının kaybı

* Nitrotirozin (NT) oluşumu

* İleri oksidasyon protein ürünlerinin (AOPP)

oluşumu

Protein karbonil (PCO) gruplarının oluşumu

Karbonil gruplarının oluşumu birkaç mekanizma ile gerçekleşebilmektedir.

Protein karbonil grubu düzeylerinin saptanması oksidatif indüklü hücresel hasarın, protein oksidasyonunun en genel belirteci olarak kabul edilmekte ve yaygın olarak kullanılmaktadır.

Reaktif oksijen türevlerinin proteinlerle etkileşimi sonucunda, histidin, prolin, arjinin ve lizin gibi çok sayıda amino asit bakiyesinde ve/veya proteinlerin peptit omurgasında oluşan oksidatif hasara bağlı olarak PCO ürünleri meydana gelir.

Protein karbonil (PCO) türevlerinin oluşumuna yol açan primer modifikasyon reaksiyonları, amino asidlerin α-karbon atomlarının veya R yan zincirlerinin oksidatif modifikasyonlarından ve bu modifikasyonları takiben meydana gelen reaktif oksijen-aracılı peptit ayrılması reaksiyonundan oluşmaktadır.

Protein karbonil oluşumuna yol açan amino asidler

ROS ile proteinin reaksiyonu polipeptit omurgasındaki α-karbonundan α-hidrojen atomunun OH. ile bağlanarak ayrılması sonucunda karbon merkezli radikal oluşur (reaksiyon c). Bu reaksiyona yol açan OH. radikali suyun radyolizinden (x ve γ ışınlarıyla) veya H2O2’in metal katalizli yıkımından açığa çıkar (reaksiyon a ve b).

Alkilperoksit, alkoksil radikali (reaksiyon h) üzerinden hidroksi protein türevini verir (reaksiyon j). Oksijen yokluğunda (reaksiyon d) gerçekleşmez. Oluşan karbon merkezli radikal diğer bir karbon merkezli radikal ile etkileşerek protein-protein çapraz bağlarının oluşumuna yol açar.

Oluşan bu radikal moleküler oksijen ile hızlı bir şekilde reaksiyonlaşarak (reaksiyon d) daha sonra alkil-peroksidi verecek olan alkilperoksil radikal ara ürününü oluşturur.

Alkoksil radikalinin oluşumu (reaksiyon h ve g) peptit bağının diamit veya α-amidasyon metabolik yolları ile ayrılmasına neden olur.

Tiyol gruplarının (P-SH) oksidasyonu

Serbest radikallerin proteinlerdeki sülfür içeren amino asidlerin tiyol (-SH) gruplarının oksidasyonuna yol açtığı gösterilmiştir. Sisteinin –SH grubu oksidatif atağa oldukça yatkındır ve –SH gruplarından değişik mekanizmalarla oluşan tiil radikali (-S.) proteinlerdeki disülfit bağlarının oluşumuna öncülük eder. –SH gruplarının disülfitlere ve oksiasitler gibi diğer oksitlenmiş türevlere dönüşümü, radikal aracılı protein oksidasyonunun en erken gözlenebilen belirtisidir.

Tiyol gruplarının diğer bir oksidasyon şekli; 4-Hidroksinonenal’in, proteinlerdeki –SH gruplarına Michael reaksiyonu sonucunda tiyoeter bağıyla bağlanmasıyla gerçekleşmektedir. Michael reaksiyonu geri dönüşümlü bir reaksiyondur.

Lizin ve histidin, 2-alkenal, 4-hidroksi-2-alkenal ve ketoaldehid gibi lipid peroksidasyonu ürünlerine karşı oldukça hassastırlar. Histidinin 2-alkenal ve 4-hidroksi-2-alkenal ile reaksiyonu Michael tipi katılma reaksiyonudur.

Nitrotirozin (NT) oluşumu

Nitrotirozin oluşumu, protein oksidasyonuna yol açan bir başka moleküler mekanizmadır. Peroksinitrit (ONOO-), nitrik oksidin (NO), O2- ile in vivo reaksiyonu sonucunda oluşan sitotoksik bir türevdir. Normal koşullarda, süperoksit dismutaz, oluşan tüm süperoksit radikallerini dismutasyona uğratmaya yetecek düzeydedir fakat, süperoksit düzeyleri çok artmışsa yada fazla miktarda NO radikali meydana gelmişse peroksinitrit oluşur.

Peroksinitrit oluşumu oksidatif protein hasarının hem ortaya çıkışına, hem de ilerlemesine sebep olmaktadır.

ONOO-’in proteinler üzerine atağının ana ürünü tirozinin orto pozisyonunda nitrolanmasıdır, bu da NT oluşumuna yol açar. Ayrıca sisteinin sülfidril gruplarının nitrolanmasına, triptofana nitrat grubunun eklenmesine ve metiyoninin oksitlenmesine sebep olur.

Tirozinin geri dönüşümsüz olarak nitrasyonu, tirozinin fosforillenmiş ve fosforillenmemiş formlarının birbirine dönüşümünü engelleyerek, enzim aktivitesinin düzenlenmesini ve sinyal ileti mekanizmalarının regülasyonunu etkiler.

NT’nin, ONOO- oksidasyonunun stabil son ürünü olmasına bağlı olarak, NT konsantrasyonu NO-bağımlı in vivo hasarın tespitinde kullanışlı bir marker’dır.

İleri oksidasyon protein ürünlerinin (AOPP) oluşumu

İleri oksidasyon protein ürünleri (Advanced Oxidation Protein Products-AOPP), ditirozin içeren çapraz bağlı protein ürünleri olarak tanımlanmaktadır.AOPP protein oksidasyonunun derecesini belirlemede duyarlı bir marker’dır.

Oksidatif stres sırasında, aktif fagositik hücrelerde miyeloperoksidaz tarafından oluşturulan hipoklorik asid (HOCl) ve kloramin gibi kloronize oksidanlar ile konakçı savunması sağlanır.

AOPP, vücutta oluşan kloronize oksidanların proteinlerle aktivasyonu ile oluşmaktadır. HOCl, proteinlerin tirozin kökü ile reaksiyona girerek stabil yapıdaki 3-klorotirozin ve 3-5 diklorotirozin oluşumuna, proteinler arası çapraz bağlara ve parçalanmaya neden olur.

Protein oksidasyonunun biyokimyasal sonuçları;

►Enzim aktivitesinde azalma ►Protein fonksiyonlarının kaybı

► Proteaz inhibitör aktivitenin kaybı ► Protein agregasyonu

►Proteolize artmış/azalmış yatkınlık ► Reseptör aracılı endositozun bozulması

►Gen transkripsiyonundaki değişimler ► İmmünojen aktivitedeki artış

Yaşlanma, hücrelerden organlara kadar tüm yapılarda fonksiyonların giderek azaldığı, doğumla ölüm arasında yerini almış karmaşık yaşam sürecinin doğal bir parçasıdır.

Yaşlanmayla birlikte metabolizma yavaşlar, vücut detoksifikasyonu eskisi gibi yapamaz, vücutta zararlı olan serbest radikallerde artış görülür, hücre yenilenmesi yavaşlar, hücre ölümü artar ve sonuçta yaşlanma süreci ilerler.

Yaşlanma sürecini açıklamaya çalışan bir çok teori ileri sürülmüştür.Yaşlanma modelleri, yaşlanma ile ilgili tek bir mekanizmaya odaklansa da, yaşlanma oldukça karmaşık bir olay olduğundan tek bir mekanizma ile açıklanması mümkün gözükmemektedir. Oksidatif stres (serbest radikal teorileri)

Mitokondriyal hasar teorisi DNA hasarı ve tamiri Erken yaşlanma sendromları Telomer-telomeraz Lizozomlardaki değişiklikler

Yaşlanma teorileri içinde serbest radikal teorisi, ilk kez 1956’da biogerontolojist Denham Harman tarafından öne sürülmüş, günümüzün önde gelen teorilerinden biridir.

Serbest radikal teorisine göre yaşlanmanın en önemli nedenlerinden biri, yaş ilerledikçe metabolizmada serbest radikal oluşumunun artması ve bunların makromoleküllerin modifikasyonuna neden olmasıdır. Bir yandan da antioksidan enzim mekanizması yeterince işlev görememektedir.

Bu teorinin başlıca kanıtlarından birisi, serbest oksijen radikallerinin yoğun bir şekilde oluşmasına yol açan iyonize edici radyasyonun, normal yaşlanmaya benzer sonuçlar üretmesi ve yaşam süresini kısaltmasıdır.

Yine kanıt olarak kalori kısıtlaması ile veya diyete antioksidanların eklenmesi ile bazı türlerde ömür uzatılabilmiştir. Örneğin, Yu ve arkadaşları zorunlu besinler korunurken kalori alımında % 40'lık bir kısıtlamanın, sıçanların ortalama ömürlerinde % 40, maksimum yaşam sürelerinde % 47'lik bir artışa neden olduğunu bildirmişlerdir.

Kolay okside olan amino asitlerin diyetten çekilmesi de ortalama yaşam süresinin %6 oranında uzamasına yol açmıştır.

Ayrıca ateroskleroz, Alzheimer tipi demans, amiloidozis ve yaşlanmayla beraber ortaya çıkan bir çok dejeneratif hastalığın fizyopatolojisinde serbest oksijen radikallerinin rol oynaması da bu teoriye kanıt olarak gösterilmektedir.

Serbest Radikal Teorisi

Protein oksidasyonu ve yaşlanma

Artmış oksidatif stresin yaşlanmada gelişen oksidatif protein hasarındaki rolü güncel olarak ilgi konusudur.

Oksidatif olarak hasarlanmış proteinlerin birikimi yaş ile belirgin olarak artar.

Okside olmuş reaktif karbonil gruplarına sahip disfonksiyonel proteinlerin birikimi, protein amino grupları arasında molekül içi veya moleküller arası capraz bağların oluşumuna yol açar.

Bu da mitokondride fizyolojik ve biyokimyasal fonksiyonların kaybına neden olur. Sonuçta mitokondride protein oksidasyon ürünlerinin yaşa bağlı birikimi enerji üretiminin kaybına ve oksidanların üretiminin artmasına yol açar.

Yaşlanma, birçok enzimin ısıya daha duyarlı formlarının oluşması, aktivitelerinde azalma veya tamamen inaktive olması gibi enzim fonksiyonlarında bozulmaların artışı ile ilişkilidir.

Yaşlı hücrelerde bazı proteinlerin inaktif formlarının biriktiği de gösterilmiştir. Lipofuksin gibi protein içeren ‘yaş pigmentleri’ bazı dokularda birikir.

Mitokondriyal DNA’da (mtDNA) oksidatif hasar ve bu hasara bağlı mutasyonların yaşlanma sürecinde önemli olduğu ve mitokondrilerin yaşlanmada anahtar rol oynadıkları Miquel ve ark. tarafından 1980’de açıklanmıştır.Yaşlanma ile birlikte mtDNA görülen oksidasyon, nükleer DNA’dakine göre çok daha ön plandadır. Bunun ana nedenleri mtDNA’nın nükleer DNA gibi histonlar tarafından korunmaması ve oksidan maddelerin temel üretim yerinin mitokondri olmasıdır. Bu mtDNA’da mutasyonların daha sık oluşmasına yol açar.

Mitokondriyal Hasar

Mitokondriyal hasar;

Oksijenin CO2 ve suya indirgene bilmesi için 4 e- alması gerekmektedir. Bu gerçeklemediğinde mitokondride oluşan serbest oksijen radikalleri mitokondri zarı ve mitokondriyal DNA’yı hasara uğratır.

Mitokondride meydana gelen dejeneratif hastalıklar;

•Mitokondri zarlarında hasar•DNA hasarı•Kardiyolipin, karnitin, ubikinon gibi önemli mitokondriyal proteinlerde azalma

Mitokondri iç zarında yer alan kardiyolipin, zardan bazı iyonların özellikle protonların, taşınmasında görev yapar. Lipid peroksidasyonu sonucu sağlam kardiyolipin miktarı azalırken hasar gören kardiyolipin miktarının artması, iyon taşınması ve enerji üretimini etkileyerek hücre yaşlanmasına katkıda bulunur.Karnitin; yağ asidlerinin mitokondriye taşınmasında görev yapan bir amino asiddir. Karnitinde oluşan bozukluk, yağ asidlerinden elde edilen enerji miktarında azalmanın yanında yağ asidleri metabolizması sonucu oluşan ve hücrede toksik etki yapan ara metabolitlerin artmasına neden olur.

Ubikinon (Koenzim Q10); mitokondrilerde elektron taşınmasında, dolayısıyla enerji üretiminde görev alan bir bileşendir. Yaşlı hücrelerde ubikinon miktarının azalmış olması, ubikinonun da hücre yaşlanmasında etkili olduğunu göstermektedir.

Telomerlerin Kısalması (Replikatif Hücre Yaşlanması) Telomerler,

kromozomların uç kısmını oluştururlar ve özgül DNA dizi (TTAGGG) tekrarından oluşurlar.Her hücre bölünmesi sonucunda telomerler kısalır ve kritik bir kısalığa ulaştığında yaşlanma ile ilgili mekanizmalar tetiklenir. Normal hücrelerin belirli sayıda bölündükten sonra çoğalmalarının durması “Hayflick sınırı” olarak adlandırılır.

Telomeraz, telomer sentezleyerek onu koruyan bir enzimdir. Çoğu insan dokusunda telomeraz özelliği yokken, tümör hücrelerinin % 85’inde yüksek seviyede telomeraz eksprese edilir.

Okside proteinler, selektif olarak ve hızlı bir şekilde yıkılırlar. Lizozom ve proteozomlar proteinlerin yıkımını sağlayan ve strese karşı belirli maddeler tarafından aktive edilen iki intraselluler sistemdir. Proteolitik aktivitenin azaldığı durumlarda okside proteinlerin birikimi söz konusu olur.

Lizozomlara alınan ve sindirilemeyen bazı maddelerin (lipofuksin ve ceroid) lizozomlardaki miktarı zamanla artar ve lizozomların görev yapmasını engeller. Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan bu ürünler yaşlılık pigmenti olarak bilinir ve yaşla birlikte artarlar.

Artan lipofuksin özellikle kalp kası ve sinir hücreleri gibi bölünmeyen hücrelerde birikir. Hücrelerde bu maddelerin birikimi de hücre yaşlanmasının nedenlerinden biridir.

Proteinlerde in vivo olarak meydana gelen oksidatif değişiklikler, proteinlerin rol oynadığı çeşitli hücresel fonksiyonları etkiler. Reseptörlerin, sinyal ileti mekanizmalarının, yapısal proteinlerin, taşıma sistemlerinin ve enzimlerin rol oynadığı hücresel olaylar oksidatif protein hasarından etkilenir.

Protein oksidasyonunun sonuçları, protein ya da amino asidlerde dimerleşme, çökelme, proteinin normal katlanmasının bozulması, konformasyon değişimi, yapısal bozulmaya bağlı işlevsel kayıp, proteolitik enzimlerde aktivite kaybı, gen düzenlenmesinin ve ifadesinin değişimi, hücre sinyal yollarında modifikasyon, apoptoz ve nekrozun uyarılması olarak sıralanabilir.