Procédé pour préparer des protéines du sang décolorées

European Patent Office

Office européen des brevets

© Numéro de publication: 0 1 4 8 1 1 4

A 1

© DEMANDE DE BREVET E U R O P E E N

© Numéro de dépôt: 84810530.0 © Int. Cl.4: A 23 J 3 /00

© Date de dépôt: 01.11.84

© Priorite: 03.11.83 CH 5935/83 © Inventeur: Kulhanek, Antonin 47, avenue de Lignon CH-1219 Le Lignon(CH)

© Date de publication de la demande: 10.07.85 Bulletin 85/28 © Inventeur: Porta, Augusto

52, route de Drize © Etats contractants designes: CH-1227 Carouge(CH)

AT BE CH DE FR GB LI LU NL SE © Inventeur: Ayerbe, Andre

@ Demandeur: BATTELLE MEMORIAL INSTITUTE Les Chavannes Ramboex 7 route de Drize CH-74800 Reignier(CH) CH-1227 Carouge/GenevelCH)

© Inventeur: Bunter, Guy 28, avenue Vibert CH-1227 Carouge(CH)

@ Mandataire: Dousse, Blasco et al, 7, route de Drize CH-1227 Carouge/GenevelCH)

54) Procédé pour préparer des protéines du sang décolorées.

(g) On soumet le sang complet, ou le cruor qui en provient après séparation du plasma, à une hémolyse puis à une digestion enzymatique ménagée, ce qui a pour effet de rendre plus accessible aux oxydants en milieu aqueux le pigment rouge de l'hémoglobine. Celui-ci peut alors être décoloré par oxydation dans des conditions douces, le mélange résultant de cette oxydation étant ensuite traité pour en séparer les solides contenant du fer assimilable sous forme d'une poudre sèche. Cette poudre s'utilise avantageu- sement dans l'alimentation humaine.

Croydon Printing Company Ltd.

O n soumet le sang complet, ou le cruor qui en provient après séparation du plasma, à une hémolyse puis à une digestion enzymatique ménagée, ce qui a pour effet de rendre plus accessible aux oxydants en milieu aqueux le pigment rouge de l'hémoglobine. Celui-ci peut alors être décoloré par oxydation dans des conditions douces, le mélange résultant de cette oxydation étant ensuite traité pour en séparer les solides contenant du fer assimilable sous forme d'une poudre sèche. Cette poudre s'utilise avantageu- sement dans l'alimentation humaine.

La p r é s e n t e i n v e n t i o n conce rne en g é n é r a l la mise en v a l e u r d e s

s o u s - p r o d u i t s de l ' i n d u s t r i e de la v i a n d e e t a notamment pour o b j e t

l ' u t i l i s a t i o n , dans l ' a l i m e n t a t i o n humaine ou a n i m a l e , des c o m p o s a n t s

s o l i d e s du sang des animaux de b o u c h e r i e en p r o v e n a n c e des a b a t t o i r s .

On s a i t que le sang des mammifères c o m p r e n d , d ' u n e p a r t , l e p l a s -

ma (une s o l u t i o n aqueuse qui r e p r é s e n t e 60 à 65% du volume du s a n g

e t qui c o n t i e n t env i ron le t i e r s des p r o t é i n e s de c e l u i - c i a c c o n p a -

gnées d ' a u t r e s p r o d u i t s s o l u b l e s t e l s que s e l s miné raux , g l u c o s e e t

a u t r e s ) e t , d ' a u t r e p a r t , les g l o b u l e s rouges ou e r y t h r o c y t e s c o n -

t e n a n t le r e s t a n t des p r o t é i n e s du sang (120 à 160 g/1) e t , p lus p a r - t i c u l i è r e m e n t , l ' h é m o g l o b i n e qui en e s t le c o n s t i t u a n t e s s e n t i e l .

Dans la p r a t i q u e h a b i t u e l l e , ap rès a d d i t i o n au sang d ' u n a n t i -

c o a g u l a n t (agent c h é l a t a n t comme un c i t r a t e a l c a l i n ou l 'EDTA), o n

s é p a r e l e s g l o b u l e s rouges (cruor) du plasma par c e n t r i f u g a t i o n . Le

plasma e s t couramment u t i l i s é sous forme l i q u i d e ou ap rè s d e s h y d r a -

t a t i o n , dans l ' a l i m e n t a t i o n humaine, notamment comme l i a n t dans l e s

p r o d u i t s de c h a r c u t e r i e .

Le c ruo r e s t , par c o n t r e , à cause de sa c o u l e u r peu a p p é t i s s a n -

t e , p l u t ô t r é s e r v é , en g é n é r a l , à l ' a l i m e n t a t i o n a n i m a l e . Or, l e s

p r o t é i n e s des g l o b u l e s rouges du sang c o n s t i t u e n t en p r i n c i p e , d e

par l e u r c o m p o s i t i o n en a c ide s aminés, un a l i m e n t de choix pour l ' h o m -

me; en e f f e t , la d i s t r i b u t i o n p a r t i c u l i è r e de c e r t a i n s des a m i n o a c i -

des q u ' e l l e s c o n t i e n n e n t permet , l o r s q u ' o n les mélange à des a l i m e n t s

p r o t é i q u e s d ' o r i g i n e v é g é t a l e , de compenser l e s d é f a u t s de ces d e r -

n i e r s en de t e l s a m i n o a c i d e s .

I l e s t donc hautement d é s i r a b l e pour l ' i n d u s t r i e a l i m e n t a i r e

de d i s p o s e r d 'un p rocédé s imple e t économique pour d é c o l o r e r l ' h é -

moglob ine du sang e t d e - c o n v e r t i r l e s m a t i è r e s n u t r i t i v e s c o n t e n u e s

dans c e l u i - c i sous une forme p e r m e t t a n t l eur u t i l i s a t i o n dans l ' a l i -

m e n t a t i o n h u m a i n e .

De nombreuses méthodes ont dé j à é té p r o p o s é e s dans une t e l l e

o p t i q u e , parmi l e s q u e l l e s on peut c i t e r l es s u i v a n t e s :

a) E x t r a c t i o n des p igmen t s c o l o r é s dans un s o l v a n t o r g a n i q u e :

s u i v a n t ce p rocédé (ANTONINI e t a l ; PALMIN e t a l ; TYBOR et al) o n

a j o u t e à une s o l u t i o n a c i d e d ' h é m o g l o b i n e une f o r t e c o n c e n t r a t i o n

d ' u n s o l v a n t o r g a n i q u e h y d r o s o l u b l e ( a l c o o l s , c é t o n e s , e t c . . ) ce q u i

c o n d u i t à une d é n a t u r a t i o n h y d r o l y t i q u e de la p o r t i o n p r o t é i q u e d e

l ' h é m o g l o b i n e , à la s c i s s i o n de la l i a i s o n e n t r e c e l l e - c i e t les g r o u -

pes p o r p h y r i q u e s c o n t e n a n t , sous forme de complexe , le fer de l ' h é -

m o g l o b i n e e t donnan t à c e l l e - c i sa c o u l e u r t y p i q u e ( r a d i c a l heme)

e t à l a d i s s o l u t i o n de ce r a d i c a l dans le s o l v a n t o rgan ique . I l s e

p r o d u i t a l o r s u n e s é p a r a t i o n de p h a s e s , la p r o t é i n e (g lobine) d é n a -

t u r é e é t a n t p r é c i p i t é e sous forme s o l i d e et le p igment r e s t a n t e n

s o l u t i o n dans la phase l i q u i d e .

b) D é c o l o r a t i o n par l ' e a u oxygénée (OORD e t al) : s u i v a n t ce p r o -

c é d é , on provoque d ' a b o r d l ' h é m o l y s e ( c ' e s t - à - d i r e l ' é c l a t e m e n t ) d e s

e r y t h r o c y t e s en l e s m é l a n g e a n t avec un excès d ' e a u ce qui f o u r n i t

une s o l u t i o n aqueuse d ' h é m o g l o b i n e qu 'on t r a i t e à t e m p é r a t u r e r e l a -

t i v e m e n t é l evée (70°C) avec un grand excès d ' e a u oxygénée. Ce t r a i -

t emen t a pour e f f e t de s c i n d e r l e s g roupes p o r p h y r i q u e s c o m p l e x é s

avec le fer de l ' h é m o g l o b i n e , de d é n a t u r e r i r r é v e r s i b l e m e n t l e s c h a i -

nes p r o t é i q u e s de c e l l e s - c i e t de d é c o l o r e r ces g roupes héniques p a r ,

v r a i s e m b l a b l e m e n t , o x y g é n o l y s e du complexe h é t é r o c y c l i q u e f e r r i q u e

( v o i r J . WISMER-BEBERSEN). Après d é c o l o r a t i o n , on d é t r u i t l ' e a u o x y - génée en excès , par exemple par la c a t a l a s e .

c) Hydro lyse e n z y m a t i q u e (STACHOWICS e t a l ; HELLQUIST; DREPPER

e t a l ; FRETHEIM et al) : ce p rocédé comprend la s c i s s i o n des g r o u p e s

p o r p h y r i q u e s par l ' a c t i o n d ' enzymes p r o t é o l y t i q u e s (par exemple l ' a l -

c a l a s e ) a i n s i que l ' h y d r o l y s e p a r t i e l l e des c h a î n e s p r o t é i q u e s e n

p e p t i d e s de po ids m o l é c u l a i r e s v a r i é s . O n s é p a r e e n s u i t e ces p e p t i -

des de la f r a c t i o n p igmen tée de l ' h y d r o l y s a t par u l t r a f i l t r a t i o n s u r

membranes s e m i - p e r m é a b l e s ou par a d s o r b t i o n de l ' heme sur c h a r b o n

a c t i f .

On t r o u v e r a p l u s de d é t a i l s sur l ' é t a t de la t e chn ique dans c e

domaine en c o n s u l t a n t l e s documents s u i v a n t s don t fon t p a r t i e l e s

r é f é r e n c e s s u s m e n t i o n n é e s .

"ANTONINI, E. e t M. BRUNORT (1971): Hemoglobin and m y o g l o b i n

in t h e i r r e a c t i o n s with l i g a n d s . North Hol land P u b l i s h i n g Co. , Ams-

terdam, P. 125; BORCHERS, C.W.A. (1942): P a t e n t DE-PS 744 055; BUCH-

BJERG, K.O. (1977) : I s o l e r i n g af g l o b i n samt f u n k t i o n e l l e e g e n s k a b e r

af g l o b i n og haemoglob in . T h e s i s , Royal Vet. and A g r i c u l t u r a l U n i -

v e r s i t y , Copenhagen ; DREPPER, G. e t K. DREPEER (1979); V e r f a h r e n z u r

H e r s t e l l u n g neuer E i w e i s s p r o d u k t e aus S c h l a c h t t i e r b l u t für N a h r u n g s m i t -

t e l . F l e i s c h w i r t s c h . 59(9) 1952; DROSTE, R. (1915): C o n c e a l i n g t h e

use of b lood in b r ead , Chem. Z 39, 634, (Chem. Abs t r . 9, 2782) ; FRET-

HEIM, K.J. NORDAL. e t E. SLINDE (1979) : P r o d u c t i o n of a f l a v o u r i n g

with m e a t - l i k e s e n s o r y p r o p e r t i e s from s l a u g h t e r animal b lood . P r o -

c eed ings 25th Eurcpean Meeting of Meat Research Workers , B u d a p e s t ,

Paper 10.8; HALDCHRISTENSEN, V. (1978) : D e c o l o r i s a t i o n of s l a u g h t e r

blood by p a r t i a l enzymat i c h y d r o l y s i s . K o n g r e s s - D o k u m e n t a t i o n 2 4 .

E u r c p ä i s c h e r F l e i s c h f o r s c h e r - K o n g r e s s , Kullmbach, Paper H.5; HELLQUIST,

C.O.H. (1978): SE-A-396 .276 , Fbod Sci . Technol Abs t r . 10 ,45459 ; HILL,

R e t H.F. HOLDEN (1926): P r e p a r a t i o n and p r o p e r t i e s of the g l o b i n

and oxyhemoglobin . Biochem. J . 2 0 , 1326; MITSYK, V . E . I . F . OSADEHAYA,

E.A. KORSTYUK, R . I . PUGACHEVSKAYA, A.M. MOROZ et L.Z. REZNICHENKO

(1915) : Q u a l i t y of c l a r i f i e d a n i m a l s ' b lood and of food p r o d u c t s i n -

c o r p o r a t i n g i t . T o v a r o v e d e n i c 8,67; OORD, A.H.A. van den et J . J . WES-

DORP (1979): D e c o l o r a t i o n of s l a u g h t e r h o u s e blood by t r e a t m e n t w i t h

hydrogen p e r o x i d e . P r o c e e d i n g s 25th European Meeting of Meat R e s e a r c h

Workers , B u d a p e s t , Paper 10 .7 ; PAIMIN, V. e t O. PETROVA (1972) : O b t a i n -

ing g l o b i n from blood e r y t h r o c y t e s . SU-A-405.523 (C1.A.23J) ; STACHO-

WICS, K . J . C . E . ERIKSSON et S. T J E L L E ( 1 9 7 7 ) : Enzymat ic h y d r o l y s i s

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et W.A. LANDMANN (1975): F u n c t i o n a l p r c p e r t i e s of p r o t e i n s i s o l a t -

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1982; VPC 3, n o v . 8 2 , 13 -16" . On c i t e r a e n c o r e l es documents s u i v a n t s

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98 (1983), 52209t ( vo i r également U t i l . E n z y m e s Technol . A l imen t . Symp.

I n t . 1982, 389-93) i n t i t u l é "Enzyme D i g e s t i o n of Red Blood C e l l P r o -

t e i n s Deco lo r ed by E t h a n o l and Hydrogen P e r c x i d e T r e a t m e n t " ,

US-A-3 ,732 ,170 ; ce d e r n i e r concerne une c o m p o s i t i o n de n e t t o y a g e c o n -

t e n a n t une enzyme e t un agent oxydan t t e l qu ' un m o n o p e r s u l f a t e a l -

c a l i n ; c e t t e c o m p o s i t i o n e s t s u s c e p t i b l e d ' e n l e v e r les t â ches de s a n g ,

notamment sur l e s t i s s u s .

Les p r o c é d é s f a i s a n t p a r t i e de l ' é t a t de la t e c h n i q u e s u s m e n -

t i o n n é s o n t i n t é r e s s a n t s i n d u s t r i e l l e m e n t mais p r é s e n t e n t c e r t a i n s

i n c o n v é n i e n t s parmi l e s q u e l s on p e u t c i t e r le goût peu a g r é a b l e c o n -

f é ré aux p r o d u i t s ob t enus (amertume), une b a i s s e des q u a l i t é s a l i -

m e n t a i r e s de c e u x - c i l i é e à l a d é n a t u r a t i o n des p r o t é i n e s a i n s i q u ' u n e

p e r t e de l e u r s p r o p r i é t é s f o n c t i o n n e l l e s t e l l e s que s o l u b i l i t é e t

pouvo i r é m u l s i f i a n t . En ce qui c o n c e r n e l ' a s p e c t a l i m e n t a i r e , on n o -

t e r a p lus p a r t i c u l i è r e m e n t l ' é l i m i n a t i o n i n é v i t a b l e du fer a s s i m i -

l a b l e que c o n t i e n n e n t sous forme complexée l e s g roupes p o r p h y r i q u e s

de l ' h é m o g l o b i n e . Or, pour l ' a l i m e n t a t i o n humaine, i l e s t d é s i r a b l e

de c o n s e r v e r ce f e r en c o n t a c t avec l e s p r o t é i n e s qu 'on d é s i r e i s o -

l e r , la p o s s i b i l i t é de m a i n t e n i r ce m é t a l sous une forme consomma-

b le e t a s s i m i l a b l e par l ' o r g a n i s m e p r é s e n t a n t des a v a n t a g e s p h y s i o -

l o g i q u e s é v i d e n t s dans l ' i n d u s t r i e a l i m e n t a i r e .

La p r é s e n t e i n v e n t i o n permet de r é a l i s e r un t e l o b j e c t i f e t ,

de p l u s , se p r o p o s e de remédier aux i n c o n v é n i e n t s s u s m e n t i o n n é s , c ' e s t -

à - d i r e de f o u r n i r un p rocédé pour o b t e n i r l es p r o t é i n e s du sang s o u s

forme d ' une poudre s o l i d e dont l ' h é m o g l o b i n e e s t d é c o l o r é e e t c e c i ,

dans une t r è s l a r g e mesure , sans p r o v o q u e r la s é p a r a t i o n du f e r c o n -

tenu dans l e s g r o u p e s p o r p h y r i q u e s de c e l l e - c i ni la d é n a t u r a t i o n

h y d r o l y t i q u e i r r é v e r s i b l e de la g l o b i n e . Ce p rocédé , t e l que d é f i -

n i à la r e v e n d i c a t i o n 1, se d i s t i n g u e notamment par le f a i t q u ' o n

l i b è r e par c a t a l y s e enzymat ique , mais en é v i t a n t a u t a n t que p o s s i -

b le de l e s en s é p a r e r d é f i n i t i v e m e n t , l e s d i t s g roupes p o r p h y r i q u e s de l ' e n v e l o p p e de n a t u r e a p o l a i r e c o n s t i t u é e des c h a î n e s g l o b i n i q u e s

@ e t β dans l e s q u e l l e s i l s sont e n r o b é s , p u i s q u ' o n d é c o l o r e ces g r o u -

pes p o r p h y r i q u e s a i n s i mis à nu en l e s o x y d a n t .

Pour mieux comprendre l ' i n v e n t i o n , on se r e f e r r e r a au d e s s i n

en annexe dans l e q u e l :

la f i g . 1 r e p r é s e n t e s chéma t iquemen t en p e r s p e c t i v e e t vu d e

dessus une mo lécu l e d ' h é τ o g l o b i n e ;

la f i g . 2 c o n s t i t u e une vue l a t é r a l e de c e t t e même m o l é c u l e ;

la f i g . 3 r e p r é s e n t e s c h é m a t i q u e m e n t un a p p a r e i l é l e c t r o l y t i -

que pour d é c o l o r e r , par o x y d a t i o n , l e s g roupes p o r p h y r i q u e s de l ' h é -

m o g l o b i n e .

La mo lécu l e d ' h é m o g l o b i n e , a i n s i q u ' o n peut le v o i r aux f i g u -

res 1 e t 2 s e c o m p o s e p r i n c i p a l e m e n t de deux p a i r e s de c h a î n e s p o -

l y p e p t i d i q u e s @ 1 , @2 e t β 1 , β 2 r e p l i é e s sur e l l e s - m ê m e s en un b l o c

r e l a t i v e m e n t compact e t e n t r e l es m a i l l e s d e s q u e l l e s s o n t i n m o b i l i -

sés des g roupes h é t é r o c y c l i q u e s p o r p h y r i q u e s ( r e p r é s e n t é s par le s i -

gne HEME) c o n t e n a n t , sous forme complexée , un atome de f e r . Ces g r o u -

pes HEME son t a i n s i normalement p l a c é s dans un e n v i r o n n e m e n t e s s e n -

t i e l l e m e n t a p o l a i r e et sont peu a c c e s s i b l e s aux r é a c t i f s a q u e u x .

Lors de l ' a p p l i c a t i o n d ' une des t e c h n i q u e s a n t é r i e u r e s de d é -

c o l o r a t i o n , l ' a p p o r t d 'une g rande q u a n t i t é d 'un s o l v a n t r e l a t i v e m e n t

peu p o l a i r e , comme par exemple l ' a c é t o n e , p e r m é a b i l i s e l ' é d i f i c e mo-

l é c u l a i r e de l ' h é m o g l o b i n e e t , o u t r e l ' i n s o l u b i l i s a t i o n d e la p a r -

t i e p r o t é i q u e q u ' i l p rovoque , c o n d u i t à une d i s s o l u t i o n s é l e c t i v e

des g roupes p o r p h y r i q u e s dans ce s o l v a n t .

Par a i l l e u r s , l o r s de l ' a p p l i c a t i o n d ' une a u t r e de ces t e c h n i -

ques de d é c o l o r a t i o n , c e l l e qui f a i t i n t e r v e n i r une o x y d a t i o n p a r

l ' e a u oxygénée en c o n c e n t r a t i o n é l e v é e , on conprend q u ' i l f a i l l e u t i -

l i s e r un g rand excès de c e l l e - c i pour p a r v e n i r au r é s u l t a t r e c h e r -

ché en r a i s o n du manque d ' a c c e s s i b i l i t é i n t r i n s è q u e des g roupes " h e -

me" p r o t é g é s par l ' é c h e v a u m o l é c u l a i r e formé par l e s c h a î n e s p o l y -

p e p t i d i q u e s @ e t β .

A i n s i , pour r endre p lus a c c e s s i b l e s à l ' o x y d a t i o n ces g r o u p e s

"heme", i l f a u t d é r o u l e r ou " d é b o b i n e r " c e t échevau; c ' e s t p r é c i s é -

ment ce que la p r é s e n t e i n v e n t i o n se p ropose de f a i r e par un t r a i -

tement enzyma t ique ménagé de l ' h é m o g l o b i n e , ce t r a i t e m e n t c o n d u i s a n t

à une m o d i f i c a t i o n non h y d r o l y t i q u e du réseau s t r u c t u r e l q u a t e r n a i -

re de c e l l e - c i . En e f f e t , on a c o n s t a t é avec s u r p r i s e que le t r a i -

t e n e n t p r é l i m i n a i r e de l ' h é m o g l o b i n e en m i l i e u aqueux par c e r t a i n e s

enzymes en f a i b l e c o n c e n t r a t i o n e t à t e m p é r a t u r e r e l a t i v e m e n t p e u é levée c o n d u i s a i t à la f o rma t ion d ' une s o l u t i o n ou s u s p e n s i o n d ' h é -

moglobine q u ' o n p o u v a i t e n s u i t e d é c o l o r e r par o x y d a t i o n dans des c o n -

d i t i o n s p a r t i c u l i è r e m e n t douces e t avec un minimum d ' o x y d a n t , u n e

t e l l e o p é r a t i o n pouvan t ê t r e e f f e c t u é e sans que se p r o d u i s e une d é -

n a t u r a t i o n ma jeu re i r r é v e r s i b l e des p r o t é i n e s de l ' h é m o g l o b i n e . On

a donc pu p o s t u l e r , en f o n c t i o n de ces o b s e r v a t i o n s , que l ' a c t i o n

e n z y m a t i q u e dans l e s c o n d i t i o n s p r é c i t é e s ne c o n d u i t pas à une r u p -

t u r e i r r é v e r s i b l e des l i a i s o n s p e p t i d i q u e s mais p l u t ô t à un a f f a i -

b l i s s e m e n t p l u s ou moins marqué des l i a i s o n s de n a t u r e s e c o n d a i r e

( l i a i s o n s é l e c t r o s t a t i q u e s , de Van der Waals , hydrogène ou a u t r e s )

a s s u r a n t la c o h é s i o n s p a t i a l e de la s t r u c t u r e q u a t e r n a i r e de l ' h é -

mog lob ine e t p rovoque p r o b a b l e m e n t un d é r o u l e m e n t ou l i n é a r i s a t i o n

p l u s ou moins p o u s s é s des c h a î n e s p o l y p e p t i d i q u e s @ e t β . La s t r u c -

t u r e de ces c h a î n e s g l o b i n i q u e s se r a p p r o c h e a l o r s s e n s i b l e m e n t d e

c e l l e des c h a î n e s c o r r e s p o n d a n t e s de la myoglobine p r é s e n t e dans l e s

m u s c l e s des mammifères e t , par c e l a , l e s g roupes p o r p h y r i q u e s de l ' " h e -

me" se t r o u v e n t p l o n g é s dans un m i l i e u p o l a i r e e t d e v i e n n e n t a i n s i

mieux a c c e s s i b l e s aux a g e n t s oxydants en m i l i e u aqueux sans p o u r t a n t

se d é s o l i d a r i s e r c o n p l è t e m e n t de la p o r t i o n p o l y p e p t i d i q u e à l a q u e l -

le i l s sont normalement r a t t a c h é s .

Comme enzymes, on u t i l i s e a v a n t a g e u s e m e n t dans le p r é s e n t p r o - cédé des p r o t é a s e s t e l l e s que les a l c a l a s e s , la p a p a i n e , la t r y p s i -

ne e t la p e p s i n e e t a u t r e s enzymes a n a l o g u e s en c o n c e n t r a t i o n s u f -

f i s a n t e pour p r o v o q u e r l ' e f f e t de "débob inage" évoqué c i - d e s s u s , m a i s

i n s u f f i s a n t pour p rovoque r une s c i s s i o n h y d r o l y t i q u e i r r é v e r s i b l e

des c h a î n e s p r o t é i q u e s de l ' h é m o g l o b i n e . Des c o n c e n t r a t i o n s de l ' o r -

d re de 0,001 à 0,5% en po ids d 'enzyme par r a p p o r t au po ids de la ma-

t i è r e sèche du sang p e u v e n t c o n v e n i r , é t a n t c e p e n d a n t donné que c e s

l i m i t e s peuven t ê t r e o u t r e p a s s é e s dans c e r t a i n s cas s p é c i a u x .

Pour e f f e c t u e r le t r a i t e m e n t , on p e u t u t i l i s e r le sang c o m p l e t

(donc t r a v a i l l e r en p r é s e n c e du plasma) ap rè s a d j o n c t i o n d 'un a n t i -

c o a g u l a n t , ou le c r u o r ap rè s s é p a r a t i o n de ce sérum. De manière g é -

n é r a l e , on commence par p rovoquer l ' h é m o l y s e des héma t i e s par l e s

ncyens h a b i t u e l s , par exemple par d i l u t i o n à l ' e a u de manière à l i -

b é r e r l ' h é m o g l o b i n e en m i l i e u aqueux e t à la r end re a c c e s s i b l e à l ' a c -

t i o n des enzymes. Pu i s on a j o u t e à la s o l u t i o n (dont le pH a é té a j u s -

té par l es moyens h a b i t u e l s à la v a l e u r la p lus f a v o r a b l e en f o n c -

t i o n du type d ' enzyme c h o i s i ) la q u a n t i t é r e q u i s e d 'enzyme et on p r o -

cède à une i n c u b a t i o n à une t e m p é r a t u r e compr i se e n t r e e n v i r o n 20

et 50°C pendant un temps convenab le (compris e n t r e e n v i r o n 2 et 24

h, par exemple) pour r é a l i s e r l ' e f f e t d é s i r é . Quoique les t e m p é r a -

t u r e s s u s m e n t i o n n é e s ne s o i e n t pas , en so i , c r i t i q u e s , on p r é f è r e

o p é r e r en dedans de t e l l e s l i m i t e s pour les r a i s o n s s u i v a n t e s : a u x

t e m p é r a t u r e s i n f é r i e u r e s à 20°, l ' a c t i o n des enzymes se r a l e n t i t s e n -

s i b l e m e n t e t le temps r é a c t i o n n e l r i s q u e de d e v e n i r exagérément l o n g

pour l e s a p p l i c a t i o n s p r a t i q u e s . Au de là de 50°C, l ' a c t i o n e n z y m a -

t i q u e v o l o n t a i r e m e n t l i m i t é e aux r é a c t i o n s non i r r é v e r s i b l e s d e v i e n t

p l u s d i f f i c i l e à c o n t r ô l e r , p a r t i c u l i è r e m e n t s i on u t i l i s e des c o n -

. c e n t r a t i o n s d 'enzymes dans le hau t de la gamme p r é c i t é e e t on r i s -

que une c e r t a i n e d é n a t u r a t i o n i r r é v e r s i b l e de la m a t i è r e p r o t é i q u e .

On n o t e r a c ependan t q u ' u n c e r t a i n taux de d é n a t u r a t i o n i r r é v e r s i b l e

e s t p a r f a i t e m e n t t o l é r a b l e dans le p r é s e n t p rocédé t a n t que ce p h é -

nomène ne c o n d u i t pas à des r é s u l t a t s i n d é s i r a b l e s t e l s qu 'une p e r -

te n o t a b l e de f e r , la f o r m a t i o n de p e p t i d e s de goût d é s a g r é a b l e o u

la p r é c i p i t a t i o n d 'un p r o d u i t qui ne p u i s s e p l u s ê t r e oxydé f a c i l e -

ment dans des c o n d i t i o n s douces , de t e l l e s c o n d i t i o n s c o n s t i t u a n t ,

c a m e on l ' a vu p lus h a u t , un des a v a n t a g e s de l ' i n v e n t i o n .

Une f o i s l ' a c t i o n p r é l i m i n a i r e due aux enzymes achevée , on p r o - cède à la d é c o l o r a t i o n pa r o x y d a t i o n douce de la s o l u t i o n ou s u s p e n - s ion c o l o r é e . On peu t s o i t a g i r d i r e c t e m e n t sur la s o l u t i o n t e l l e

q u ' e l l e r é s u l t e du t r a i t e m e n t enzymat ique s o i t p r o c é d e r a u p a r a v a n t à une c o n c e n t r a t i o n de la m a t i è r e à d é c o l o r e r , p a r e x e m p l e par c e n -

t r i f u g a t i o n . Pour a c c é l é r e r la s é d i m e n t a t i o n de l ' h é m o g l o b i n e à c o n -

c e n t r e r on peut a j o u t e r un s o l v a n t h y d r o c o m p a t i b l e , par exemple un

a l c o o l , le choix d 'un t e l s o l v a n t é t a n t p r i n c i p a l e m e n t d i c t é par d e s

c o n s i d é r a t i o n s o r g a n o l e p t i q u e s c ' e s t - à - d i r e le souc i d ' é v i t e r un s o l -

vant s u s c e p t i b l e de c o n f é r e r un goût d é s a g r é a b l e au p r o d u i t d é c o l o -

ré t e r m i n é . Bien en t endu , l o r s q u ' o n soumet l a s o l u t i o n de d i g e s t i o n

enzymat ique à une c e n t r i f u g a t i o n en vue de c o n d e n s e r la m a t i è r e à

oxyder , on reprend e n s u i t e le c u l o t r é s u l t a n t de c e t t e o p é r a t i o n p a r de l ' e a u ou une s o l u t i o n aqueuse dans l a q u e l l e i l se r e d i s s o u t o u

se r e d i s p e r s e f a c i l e m e n t . La p r é s e n c e é v e n t u e l l e d ' u n e f a i b l e p r o -

p o r t i o n de m a t i è r e i r r é v e r s i b l e m e n t d é n a t u r é e ne d e v r a i t pas g ê n e r

c e t t e remise en s o l u t i o n e t / o u d i s p e r s i o n , ni l ' o x y d a t i o n s u b s é q u e n -

t e .

Pour e f f e c t u e r l a d i t e d é c o l o r a t i o n par o x y d a t i o n des g r o u p e s

"heme", on p e u t u t i l i s e r l e s o x y d a n t s h a b i t u e l s t e l s que l ' h y p o c h l o -

r i t e ou l ' e a u oxygénée en f a i b l e s p r o p o r t i o n s . A i n s i , dans l e s c o n -

d i t i o n s h a b i t u e l l e s , on peu t u t i l i s e r des q u a n t i t é s d ' o x y d a n t s c o m -

p r i s e s e n t r e e n v i r o n 0,01 e t 0,5 p a r t i e s en po ids par p a r t i e en p o i d s

de m a t i è r e sèche du sang, ces q u a n t i t é s é t a n t p r évues pour q u ' i l n e

s o i t pas n é c e s s a i r e de d é t r u i r e l ' e x c è s d ' o x y d a n t ap rè s b l a n c h i m e n t

(si excès i l y a) comme dans l e s méthodes a n t é r i e u r e s . Par a i l l e u r s ,

on a c o n s t a t é que la q u a n t i t é d ' o x y d a n t à u t i l i s e r é t a i t en r a p p o r t

avec le t aux de s t a b i l i s a n t s i n c o r p o r é a u d i t oxydant pour a s s u r e r

sa c o n s e r v a t i o n au s t o c k a g e . A i n s i , i l e s t p o s s i b l e d ' u t i l i s e r u n e

n o t a b l e m e n t moindre q u a n t i t é de H2O2 l o r s q u e c e l l e - c i e s t f r a î c h e -

ment p r é p a r é e que l o r s q u ' e l l e p r o v i e n t d ' une sou rce commerc ia le e t

q u ' e l l e a é t é s t o c k é e en p r é s e n c e d ' u n s t a b i l i s a n t .

Pour e f f e c t u e r l ' o x y d a t i o n , on t r a v a i l l e à des t e m p é r a t u r e s r e -

l a t i v e m e n t b a s s e s pour é v i t e r t o u t e a c t i o n n é f a s t e de l ' o x y d a n t a u

n iveau des c h a î n e s p r o t é i n i q u e s e l l e s - m ê m e s . A i n s i , des t e m p é r a t u -

res de l ' o r d r e de 5 à 50°C c o n v i e n n e n t , de p r é f é r e n c e , e n t r e 5 e t

20°C, dans la m a j o r i t é des c a s , la du rée de l ' o x y d a t i o n é t a n t g é n é -

r a l e m e n t compr i s e e n t r e 1 e t 12 h .

A l t e r n a t i v e m e n t à l ' a d j o n c t i o n d ' u n r é a c t i f oxydan t comme men-

t i o n n é c i - d e s s u s , on peu t éga l emen t a v o i r r e c o u r s , pour la d é c o l o -

r a t i o n de l ' h é m o g l o b i n e , à une o x y d a t i o n é l e c t r o l y t i q u e . Pour ce f a i -

re , on u t i l i s e r a a v a n t a g e u s e m e n t le d i s p o s i t i f i l l u s t r é à la f i g .

3 du d e s s i n .

Ce d i s p o s i t i f comprend un bac ou cuve 1 en v e r r e , a c i e r i n o x y -

dab le ou m a t i è r e p l a s t i q u e i n e r t e pourvu d 'un c o u v e r c l e 2. Le f o n d

de la cuve 1 e s t muni d ' une e n t r é e de gaz 3, par exemple de l ' a i r

ou de l ' o x y g è n e e t le c o u v e r c l e e s t pourvu d 'une s o r t i e 4 de ce g a z .

Le d i s p o s i t i f comprend encore une c a t h o d e po reuse 5 en f e u t r e de g r a -

p h i t e ou a u t r e m a t i è r e p o r e u s e i n e r t e c o n d u c t r i c e de l ' é l e c t r i c i t é .

La p o r o s i t é de c e t t e ca thode (pores de l ' o r d r e du d ix ième de um à

q u e l q u e s u m ) e s t a p p r o p r i é e pour q u ' u n l i q u i d e aqueux ne la t r a v e r -

se pas a i s é m e n t t o u t en donnan t l i b r e p a s s a g e , à t r a v e r s e l l e , a u

g a z p é n é t r a n t par l ' o r i f i c e 3, la p r e s s i o n de c e l u i - c i é t a n t s u f f i -

s a n t e pour empêcher l e d i t l i q u i d e ( c a t h o l i t e ) imprégnant la c a t h o -

de p o r e u s e de s ' é c o u l e r à t r a v e r s c e l l e - c i , e t a i n s i d ' en r e t e n i r

la majeure p a r t i e dans le compar t iment c a t h o d i q u e . Le d i s p o s i t i f com-

prend encore un c o m p a r t i m e n t anodique 6 d é l i m i t é par des p a r o i s v e r -

t i c a l e s 7 e t un fond 8 de ma t i è r e poreuse a g i s s a n t comme s é p a r a t e u r

é l e c t r o l y t i q u e . La m a t i è r e de ce s é p a r a t e u r , i n e r t e , peut ê t r e d e

la p o r c e l a i n e p o r e u s e ou une ma t i è re p l a s t i q u e f r i t t é e (par e x e m p l e

DARAK 5000 de la S o c i é t é GRACE, U .S .A . ) . On v e r r a p lus l o i n que l a

p r é s e n c e de ce s é p a r a t e u r n ' e s t pas i n d i s p e n s a b l e aux o p é r a t i o n s d e

d é c o l o r a t i o n du sang. F i n a l e m e n t , le d i s p o s i t i f comprend une a n o d e

9 sous forme d 'une g r i l l e de ma t é r i au c o n d u c t e u r i n e r t e , c e t t e é l e c -

t r o d e , a i n s i que la c a thode é t a n t r e l i é e s à une source de c o u r a n t

non r e p r é s e n t é e .

Pour m e t t r e en oeuvre le p r é s e n t d i s p o s i t i f , on ve r se dans l a

cuve une c e r t a i n e q u a n t i t é d 'un é l e c t r o l y t e fo rman t c a t h o l y t e ( g é -

n é r a l e m e n t une s o l u t i o n a l c a l i n e ) indiqué au d e s s i n par le c h i f f r e

de r é f é r e n c e 10. Pu i s on i n t r o d u i t le c o n p a r t i m e n t anodique c o n t e -

nant le sang hémolyse e t t r a i t é enzymat iquement comme d é c r i t p l u s

haut ou la s u s p e n s i o n aqueuse c o r r e s p o n d a n t e d ' h é m o g l o b i n e s i le p r o -

d u i t de d é p a r t é t a i t du c r u o r . On r e l i e l e s é l e c t r o d e s à la s o u r c e

d i s p o n i b l e de c o u r a n t c o n t i n u e t on f a i t c i r c u l e r le gaz oxydant à

t r a v e r s la ca thode e t l e s l i q u i d e s à é l e c t r o l y s e r g râce aux t u b u l u -

res 3 e t 4. En p r é s e n c e d ' e a u , l ' oxygène gazeux qui d i f f u s e à t r a -

vers la ca thode e s t r é d u i t s u i v a n t le schéma s u i v a n t :

e t l ' h y d r o p e r o x y d e a i n s i formé, d i f f u s a n t à t r a v e r s le s é p a r a -

teur poreux 8, p r o d u i t la d é c o l o r a t i o n du s a n g .

En v a r i a n t e , on remplace l ' é l e c t r o l y t e 10 par une s u s p e n s i o n

de sang ou de c ruor p r é t r a i t é comme c i - d e s s u s e t on omet d ' i n t e r c a -

l e r le s é p a r a t e u r 8 ce qui permet une d é c o l o r a t i o n p lus r a p i d e , l ' o x y -

dan t é t a n t e n g e n d r é , in s i t u , dans la s o l u t i o n à d é c o l o r e r .

En v a r i a n t e enco re , on i n t r o d u i t dans le compar t imen t a n o d i q u e

un é l e c t r o l y t e q u e l c o n q u e , d e p r é f é r e n c e une s o l u t i o n d i l u é e de s o u -

de c a u s t i q u e et ap rès avo i r f a i t f o n c t i o n n e r le d i s p o s i t i f un t emps

s u f f i s a n t pour que se forme, dans le c o m p a r t i m e n t c a t h o d i q u e , u n e

c o n c e n t r a t i o n n o t a b l e en H2O2, par exemple 0,5 à 3 g/1 , on u t i l i s e

le c a t h o l y t e , ap rès n e u t r a l i s a t i o n par un a c i d e , comme agen t d é c o -

l o r a n t de la s o l u t i o n de sang ou de c ruo r t r a i t é e aux enzymes. B i e n

e n t e n d u , un t e l agen t oxydant , ext rêmement a c t i f , do i t ê t r e u t i l i -

sé f r a î c h e m e n t p r é p a r é vu son manque de s t a b i l i t é .

De p r é f é r e n c e , pour l ' o x y d a t i o n é l e c t r o l y t i q u e du sang, on u t i -

l i s e les p a r a m è t r e s o p é r a t o i r e s s u i v a n t s : t e m p é r a t u r e ambiante (20

- 30°C); p r e s s i o n d ' a i r ou d ' oxygène : 0,01 à 0,1 bar; t e n s i o n s é l e c -

t r i q u e s de 5 à 15 v o l t s .

Lorsque l ' o p é r a t i o n de d é c o l o r a t i o n par oxyda t ion de l ' h é m o g l o -

b ine e s t t e r m i n é e , on p rocède à l ' é l i m i n a t i o n de la phase a q u e u s e

dans l a q u e l l e s ' e s t d é r o u l é e c e t t e o x y d a t i o n a f i n d ' en s é p a r e r l a

m a t i è r e d é c o l o r é e sous forme d 'une poudre s è c h e .

Pour ce f a i r e , on peut p rocéde r de d i v e r s e s manières parmi l e s -

q u e l l e s on c i t e r a le t r a i t e m e n t d i r e c t de c e t t e phase aqueuse c o n -

t e n a n t en s u s p e n s i o n ou s o l u t i o n la m a t i è r e d é c o l o r é e , s o i t par é v a -

p o r a t i o n , s o i t par a t o m i s a t i o n dans l ' a i r ou un gaz i n e r t e , s o i t p a r

l y o p h i l i s a t i o n s u i v a n t l e s t e c h n i q u e s h a b i t u e l l e s . On peut a u s s i p r é -

c i p i t e r la m a t i è r e s o l i d e de la phase aqueuse par a d j o n c t i o n d ' u n

s o l v a n t a p p r o p r i é ( a l c o o l , a c é t o n e , THF, d ioxanne , e t c . . ) e t la s é -

p a r e r e n s u i t e par e s s o r a g e ou c e n t r i f u g a t i o n s u i v a n t les moyens h a -

b i t u e l s . On p r é f è r e c ependan t l es p r e m i e r s moyens c i t é s pour des r a i -

sons de commodité e t , éga lemen t , pour é v i t e r dans la mesure du p o s -

s i b l e une c o n t a m i n a t i o n par des m a t i è r e s é t r a n g è r e s s u s c e p t i b l e s d ' i n -

f l u e n c e r ses q u a l i t é s o r g a n o l e p t i q u e s .

La m a t i è r e a i n s i s épa rée e t séchée se p r é s e n t e en t a n t q u ' u n e

poudre de c o u l e u r c l a i r e , j a u n â t r e ou b e i g e , sans odeur e t de g o û t

p r a t i q u e m e n t n e u t r e . E l l e c o n t i e n t une q u a n t i t é de fer p r a t i q u e m e n t

i d e n t i q u e à c e l l e du sang o r d i n a i r e séché ou, dans le cas où s e u l

du c ruor a é té u t i l i s é , une q u a n t i t é c o r r e s p o n d a n t à du c ruor s é c h é

non d é c o l o r é . Ce fer se p r é s e n t e sous forme complexée ( v r a i s e m b l a -

b lement par l ' i n t e r m é d i a i r e des g roupes p o r p h y r i q u e s o x y g é n o l y s é s

t o u j o u r s p r é s e n t s dans la ma t i è re ) ce qui permet son a s s i m i l a t i o n

d i r e c t e e t f a c i l e l o r s de l ' i n g e s t i o n d ' a l i m e n t s c o n t e n a n t l a d i t e

poud re . C e l l e - c i c o n s t i t u e donc un i n g r é d i e n t de choix dans l ' a l i -

m e n t a t i o n humaine p u i s q u ' e l l e a l l i e le pouvo i r n u t r i t i f des p r o t é i -

nes dont e l l e e s t formée au pouvoi r r e c o n s t i t u a n t e t a n t i - a n é m i q u e

du fer a s s i m i l a b l e q u ' e l l e c o n t i e n t .

Pour u t i l i s e r c e t t e poudre dans l ' i n d u s t r i e a l i m e n t a i r e , on l a

mélange à des p r o t é i n e s dont e l l e complè te la b a l a n c e en a m i n o a c i -

des la p lus p r o p i c e à l ' u s a g e a l i m e n t a i r e r e c h e r c h é ( a l i m e n t a t i o n

humaine par e x e n p l e ) . Comme p r o t é i n e s v é g é t a l e s , on peu t c i t e r c e l -

les des l égumineuses ou du s o j a . On peu t également combiner les p r o -

t é i n e s d é c o l o r é e s du sang à des a l i m e n t s peu p r o t é i n é s ( t e l s que f é -

c u l e s e t c é r é a l e s ) de maniè re à e n r i c h i r c e u x - c i . On p e u t en f a b r i -

quer des a l i m e n t s v a r i é s t e l s que soupes , f a r i n e s , b i s c u i t s , p a i n ,

g â t e a u x , e t c . .

Les Exemples qui s u i v e n t i l l u s t r e n t l ' i n v e n t i o n .

Exemple 1

On a a j o u t é à 150 ml de sang de porc , c o n t e n a n t 0,02% d'EDTA

(Ethy lène d iamine t e t r a c é t i q u e ) comme a n t i - c o a g u l a n t ( con tenu en m a -

t i è r e s s èches env i ron 30 g) 300 ml d ' e a u à t e m p é r a t u r e o r d i n a i r e e t

on a a g i t é la s u s p e n s i o n j u s q u ' à hémolyse complè te des c e l l u l e s r o u -

g e s .

On a a l o r s a j u s t é le pH à 3 , 5 - 4 avec du HC1 N/10 e t on a a j o u -

té à la s o l u t i o n de c o u l e u r rouge c o n t e n a n t , en s u s p e n s i o n , des d é -

b r i s de p a r o i s c e l l u l a i r e s 0,03 g (0,1% en po ids de m a t i è r e s è c h e )

d 'enzyme p r o t é o l y t i q u e de Rhizopus f o u r n i par la s o c i é t é RAPIDASE,

France) e t , ap rès h o m o g é n é i s a t i o n , on a l a i s s é le t o u t 12 h à 4 0 ° .

Après c e t t e p é r i o d e , on n ' a c o n s t a t é aucune p r é c i p i t a t i o n p a r - t i c u l i è r e dans la phase aqueuse qu 'on a c o n c e n t r é e au ROTAVAPOR à

40°C j u s q u ' à un volume de 170 ml. On a a l o r s a j o u t é , ap rès r e f r o i -

d i s s e m e n t à t e m p é r a t u r e ambian te , 90 ml d ' eau oxygénée à 1% v/v e t

on a l a i s s é une n u i t au repos à 5°C. Après c e t t e p é r i o d e , on a c o n s - t a t é que la phase aqueuse a v a i t pe rdu la p lus g rande p a r t i e de s a

c o u l e u r ( t e i n t e brun c l a i r ) . Après y avo i r a j o u t é 100 ml d ' a l c o o l ,

on a soumis c e t t e phase à une c e n t r i f u g a t i o n (10.000 rpm) p e n d a n t 5 min ce qui a o c c a s i o n n é la c o n d e n s a t i o n au fond du r é c i p i e n t d e

c e n t r i f u g a t i o n d 'une p a r t i e n o t a b l e de la m a t i è r e en s u s p e n s i o n . On

a s épa ré ce c o n c e n t r a t d ' a v e c la phase p l u s l i q u i d e s u p é r i e u r e e t

on a l y o p h i l i s é ce c o n d e n s a t de manière à le c o n v e r t i r en une p o u - dre sèche de cou leu r be ige . C e t t e poudre , non h y g r o s c o p i q u e , é t a i t

p r a t i q u e m e n t sans goût et sans odeur . Rendement 15,7 g (env. 50%).

A t i t r e c o m p a r a t i f , un é c h a n t i l l o n i d e n t i q u e de sang a é té t r a i -

té comme c i - d e s s u s , mais à l ' e x c e p t i o n de l ' é t a p e de d i g e s t i o n e n -

z y m t i q u e p a r t i e l l e . Aucune d é c o l o r a t i o n n o t a b l e de c e t é c h a n t i l l o n

3e c o n t r ô l e n ' a é té c o n s t a t é ap rè s a d j o n c t i o n de l ' e a u o x y g é n é e .

Exemple 2

A 150 ml d e sang de porc c o n t e n a n t en po ids 0,02% de c i t r a t e

de p o t a s s i u m comme a n t i - c o a g u l a n t , on a a j o u t é 300 ml d ' e a u comme

dans l ' E x e m p l e 1 e t , ap rè s hémolyse complè t e , on a a j o u t é , à pH 7 , 6 ,

0 ,15 g de p a p a ï n e ( d ' o r i g i n e v é g é t a l e , e x t r a i t e d 'un f r u i t t r o p i c a l ,

la p a p a y e ) .

Après une n u i t à 40°C, on a ramené le pH à 5 e t a j o u t é 150 m l

d ' a l c o o l . Après q u e l q u e s h e u r e s de r e p o s , on a c e n t r i f u g é la s o l u -

t i o n e t , ap rès r i n ç a g e du c u l o t avec de l ' e a u d i s t i l l é e (3 f o i s ) ,

on a r e p r i s c e l u i - c i avec 150 ml d ' e au où i l s ' e s t r e d i s p e r s é s a n s

d i f f i c u l t é . On a p rocédé à la d é c o l o r a t i o n de c e t t e s u s p e n s i o n p a r

du H2O2 du commerce comne à l ' E x e m p l e 1 e t , après une n u i t de r e p o s

à 5°C, on a r e c e n t r i f u g é , lavé le c u l o t 3 f o i s à l ' e a u e t p r o c é d é

à une l y o p h i l i s a t i o n , ce qui a f o u r n i 15,4 g de poudre l é g è r e m e n t

j a u n â t r e . C e t t e poudre é t a i t p r a t i q u e m e n t i n s i p i d e e t a pu ê t r e u t i -

l i s é e , e n m é l a n g e avec une p r o t é i n e v é g é t a l e ( s o j a ) , pour la p r é p a -

r a t i o n de b i s c u i t s d i é t é t i q u e s r e c o n s t i t u a n t s e t d e s a n é m i a n t s .

Exemple 3

On a u t i l i s é 200 ml de sang de porc c o n t e n a n t 0,02% d ' a c i d e é t h y -

lène d iamine t e t r a a c é t i q u e (EDTA) comme a n t i - c o a g u l a n t e t a p r è s

l ' a v o i r hémolysé par 400 ml d ' e a u e t t r a i t é enzymat iquement comme

à l E x e m p l e 1 (0,2 g de t r y p s i n e au l i e u d 'enzyme de R h i z o p u s ) , o n

l ' a soumis à un t r a i t e m e n t de d é c o l o r a t i o n par é l e c t r o l y s e au moyen d ' u n d i s p o s i t i f c o n f o r m e à c e l u i r e p r é s e n t é à la f i g . 3 .

Le bac u t i l i s é a v a i t une c o n t e n a n c e g l o b a l e de 1 - 1,2 l i t r e ,

la c a t h o d e é t a n t c o n s t i t u é e de f e u t r e SIGRI de 10. mm d ' é p a i s s e u r e t

d ' u n e s u r f a c e de base de 100 cm2 e t l ' a n o d e d ' une g r i l l e de t i t a n e - p l a -

t i n é à m a i l l e s g r o s s i è r e s de type h a b i t u e l . On a t r a v a i l l é en l ' a b -

sence d ' u n s é p a r a t e u r 8 (donc sans f a i r e de d i s t i n c t i o n p a r t i c u l i è -

re e n t r e l e s zones c a t h o d i q u e s e t a n o d i q u e s ) . On a donc v e r s é t o u -

te la s o l u t i o n à d é c o l o r e r d i r e c t e m e n t dans le bac e t ap rè s a v o i r

a j u s t é le pH à 6 - 7 (NaOH N/100) , on a d i sposé la g r i l l e a n o d i q u e

à une d i s t a n c e a p p r o x i m a t i v e m e n t moyenne e n t r e le fond du bac e t l e

n iveau s u p é r i e u r de la s o l u t i o n . On a e n s u i t e procédé à l ' é l e c t r o -

lyse dans l es c o n d i t i o n s s u i v a n t e s : P r e s s i o n d ' oxygène i n t r o d u i t p a r

la t u y a u t e r i e 3: 0 , 0 2 bar; d e n s i t é de c o u r a n t : 1 A/dm2; t e m p é r a t u -

re 24°C; l e n t e a g i t a t i o n de l a s o l u t i o n à t r a i t e r .

Après e n v i r o n 50 min de t r a i t e m e n t , on a obse rvé une d é c o l o r a -

t i c n p r a t i q u e m e n t complè te de la s o l u t i o n (cou leur b r u n - c l a i r ) e t

le dépôt d ' une p r o p o r t i o n n o t a b l e de p r o t é i n e s sur la g r i l l e a n o d i -

que. On a a l o r s r e t i r é l ' a n o d e e t , a p r è s lavage à l ' e a u e t s é c h a g e

à l ' a i r sec (40°C), on en a dé taché par b r o s s a g e env i ron 8 g de p r o - t é ine b l a n c h â t r e .

Le r e s t e de la s o l u t i o n a été soumis à une é v a p o r a t i o n sous p r e s - s ion r é d u i t e c a m e à l 'Exemple 1 p u i s , l o r s q u e le r é s i d u s ' é t a i t r é -

d u i t à un volume d ' e n v i r o n 1 5 0 - 200 ml, on a soumis c e l u i - c i à u n e

l y o p h i l i s a t i o n , ce qui a f o u r n i e n v i r o n 30 g d 'une poudre p r o t é i n i -

que de c o u l e u r brun c l a i r .

Par a n a l y s e de c e t t e poudre , on a c o n s t a t é q u ' e l l e c o n t e n a i t

87% de p r o t é i n e s e t 0,17% de f e r . A t i t r e c o n p a r a t i f , la t eneu r moyen-

ne en fer du sang séché b r u t e s t d ' e n v i r o n 0,15% (voir R.A.M. DEIA-

NEY, Y. Food Techn. 1977 (12), 3 3 9 - 3 5 8 ) . La v a l e u r mesurée du f e r

d é p a s s a n t la v a l e u r t h é o r i q u e , on a admis que la d i f f é r e n c e e s t à

a t t r i b u e r à une e r r e u r e x p é r i m e n t a l e i n h é r e n t e à la méthode d ' a n a -

l y s e .

Exemple 4

On a u t i l i s é un d i s p o s i t i f t e l que r e p r é s e n t é à la f i g . 3 e t

conforme à la p r é s e n t e d e s c r i p t i o n c o m p o r t a n t un s é p a r a t e u r 8 en p l a s -

t i que poreux (DARAK 5000 de la S o c i é t é GRACE). Les p a r a m è t r e s o p é -

r a t o i r e s mis en jeu é t a i e n t les s u i v a n t s : c a t h o l y t e : 150 ml de NaOH

0,2 N; a n o l y t e : 150 ml de NaOH 1 N; t e n p é r a t u r e : 25°C; d e n s i t é d e

c o u r a n t : 0,5 A/dm2; p r e s s i o n d ' o x y g è n e : 0,05 bar ; t e n s i o n : 6,8 V;

durée: lh; c o n c e n t r a t i o n du c a t h o l y t e en H02: 1,275 g/1; r e n d e m e n t

f a r a d i q u e (% = 68%).

On a par a i l l e u r s p r é p a r é une s o l u t i o n aqueuse d ' h é m o g l o b i n e

de sang de porc ( env i ron 30 g/300 ml) à p a r t i r de 200 ml de sang d e

p o r c , c o a g u l a t i o n par l e s moyens h a b i t u e l s , s é p a r a t i o n du c r u o r p a r

c e n t r i f u g a t i o n et hémolyse de ce c ruor dans 300 ml d ' e a u à pH 5 .

On a e f f e c t u é une d i g e s t i o n de c e t t e s o l u t i o n par a d j o n c t i o n

de 0 ,3 g de p e p s i n e e t repos 12 h à 30°C. A 150 ml de c e t t e s o l u t i o n ,

on a a j o u t é l e s 150 ml de c a t h o l y t e c o n t e n a n t H2O2 p r é p a r é comme

c i - d e s s u s a p r è s a v o i r r a p i d e m e n t n e u t r a l i s é c e l u i - c i par du HCl 2 N.

Dans l e s 150 ml r e s t a n t s de la s o l u t i o n d ' h é m o g l o b i n e , on a a j o u t é

40 ml d ' e a u oxygénée commerc ia l e à 1% v /v . Les deux é c h a n t i l l o n s o n t

é té l a i s s é s au repos à t e m p é r a t u r e ambian te e t on a c o n s t a t é q u e l ' é c h a n t i l l o n c o n t e n a n t l ' o x y d a n t p r é p a r é é l e c t r o l y t i q u e m e n t se d é -

c o l o r a i t p l u s r ap idemen t que c e l u i c o n t e n a n t l ' e a u oxygénée du com-

merce quo ique la c o n c e n t r a t i o n e f f e c t i v e en oxydan t s o i t i n f é r i e u -

re dans le p r e m i e r cas que dans le s e c o n d .

On a e n s u i t e t r a i t é l e s é c h a n t i l l o n s pour en s é p a r e r la p o u d r e

p r o t é i n i q u e d é c o l o r é e comme dans l e s Exemples p r é c é d e n t s . Rendement

g l o b a l e n v i r o n 30 g .

Exemple 5

On a t r a v a i l l é comme dans l ' E x e m p l e 4 e t d é c o l o r é 150 ml d ' u n e

s o l u t i o n d ' h é m o g l o b i n e en u t i l i s a n t une s o l u t i o n d ' é l e c t r o l y s e f r a î -

chement p r é p a r é e e t n e u t r a l i s é e .

On a soumis la s o l u t i o n d é c o l o r é e à un séchage par a t o m i s a t i o n

dans un c o u r a n t d ' a i r à 40°C au moyen d 'un d i s p o s i t i f h a b i t u e l d ' a t o -

m i s a t i c n ( u t i l i s é no rmalemen t , par exemple, pour l ' a t o m i s a t i o n du

c a f é i n s t a n t a n é ) , on a ob tenu a l o r s une poudre p r o t é i n i q u e de g o û t

s a l é , ce goû t r é s u l t a n t des s e l s m é l a n g é s à la poudre e t p r o v e n a n t de la n e u t r a l i s a t i o n de la s o l u t i o n .

On a c e p e n d a n t pu u t i l i s e r c e t t e poudre en mélange c o n v e n a b l e

avec d ' a u t r e s i n g r é d i e n t s dans la f a b r i c a t i o n d ' a l i m e n t s de goût s a -

lé ( l i a n t pour sauces ; poudre pour po t age i n s t a n t a n é ) .

Exemple 6

On a a c i d i f i é 5 1 de sang de porc non s t a b i l i s é par un a n t i - c o a -

g u l a n t à pH 5 et a p r è s une nui t de repos à 5°C, on a p rocédé à u n e

c e n t r i f u g a t i o n pour en s épa re r le c ruor . On a a i n s i obtenu e n v i r o n

1,5 kg de c ruor b r u t ( c a i l l o t ) c o n t e n a n t env i ron 50-60% d ' e a u . On

a hémolysé 170 g de c e t t e masse b ru te dans 350 ml d ' e a u et on a e f -

f ec tué une d i g e s t i o n de ce t h é τ o l y s a t 24 h à 40° avec 0,07 g de t r y p - s ine . On a a j o u t é 250 ml d ' a l c o o l à 95° e t , après que lques h e u r e s

de repos à 10°C, on a c e n t r i f u g é la s o l u t i o n . On a e n s u i t e r e d i s p e r - sé le c u l o t dans 300 ml d 'eau et a j o u t é p r o g r e s s i v e m e n t un m é l a n g e

de 20 ml d'H2O2 à 1% v/v et 100 ml d ' e au de J a v e l à 1% en po ids . On

a observé une d é c o l o r a t i o n rap ide (environ 15-30 min à t e m p é r a t u r e

ambiante) après quoi on a r e c e n t r i f u g é , lavé le c u l o t 4 f o i s à l ' e a u

d i s t i l l é e e t séché c e l u i - c i sous p r e s s i o n r é d u i t e à une t e m p é r a t u -

re ne d é p a s s a n t pas 30-35°C. On a a i n s i obtenu 27,5 g de poudre d e

p r o t é i n e d é c o l o r é e ana logue aux p r o d u i t s ob tenus s u i v a n t l e s Exem-

p les p r é c é d e n t s .

Exemple 7

U t i l i s a t i o n de la poudre de sang d é c o l o r é en a l i m e n t a t i o n h u -

maine: p r é p a r a t i o n d 'un snack s a l é .

Dans un r é c i p i e n t , on f a i t fondre 100 g de m a t i è r e g r a s s e com-

posée de 20% de b e u r r e et 80% de s u b s t i t u t de beu r re de cacao s o u s

forme de g r a i s s e v é g é t a l e hydrogénée . Ceci c o n s t i t u e le mélange 1 .

Dans un second r é c i p i e n t , on mélange in t imement 120 g d ' a m i d o n ,

180 g de l a i t écrémé en poudre, 210 g de fromage en poudre , 3 g d e

g é l a t i n e et 75 g de poudre de sang e n t i e r d é c o l o r é .

Dans un t r o i s i è m e r é c i p i e n t , on p r é p a r e une s o l u t i o n dans 200 g d ' eau des i n g r é d i e n t s s u i v a n t s : 12 g de s e l , 1,2 g de s o r b a t e de p o -

tass ium, 25 g de s i r o p de glucose et 1 g de g l y c é r i n e .

Dans un mélangeur à bras du type "Hobar t " , on mélange les c o n -

tenus des r é c i p i e n t s II e t I I I puis on a j o u t e le contenu fondu du

r é c i p i e n t I. On p o r t e le mélange au bain marie sous a g i t a t i o n c o n s -

t a n t e , puis on l a i s s e r e f r o i d i r . La masse obtenue e s t formée en p â -

tons e t r ou l ée dans une pâ t e b o u l a n g è r e ou p a t i s s i è r e , b r i s é e ou f e u i l -

l e t é e . Le p r o d u i t f i n a l , ap rès pas sage au f o u r , e s t un snack à c a -

r a c t è r e s a l é e n r i c h i en p r o t é i n e s an ima le s par l ' a p p o r t de 8% de p o u -

dre de sang d é c o l o r é .

Exemple 8

On a p r épa ré une s o l u t i o n de c i t r a t e de sodium à 3,7% de c o n - c e n t r a t i o n (w/v), p u i s on a mélangé 130 ml de c e t t e s o l u t i o n à 870 m l

de sang de porc f r a î c h e m e n t r e c u e i l l i e t on a a j o u t é 1 l i t r e d ' e a u

au mélange pour p r o v o q u e r l ' h é m o l y s e des g l o b u l e s r o u g e s . Par a d j o n c -

t i o n à l a s o l u t i o n c i - d e s s u s de HCl N, on l ' a p o r t é e au pH de 5 .

On a t r a i t é à 4 0 ° C l a s o l u t i o n par de la t r y p s i n e à r a i s o n d e

0,4 g de t r y p s i n e / l i t r e de sang. On a e n s u i t e r e f r o i d i à 8 ° C l a s o -

l u t i o n e t on a a j o u t é 400 ml d ' a l c o o l 70° par 2 l i t r e s de s o l u t i o n

ce qui a occas ionné la f o r m a t i c n d 'un p r é c i p i t é . Cn a s é p a r é ce p r é -

c i p i t é par c e n t r i f u g a t i o n e t on l ' a r e d i s p e r s é dans 150 ml d ' e a u ;

p u i s sous a g i t a t i o n c o n s t a n t e à 35°C, on a i n t r o d u i t de l ' e a u o x y - génée à 1% v/v j u s q u ' à d é c o l o r a t i o n , s o i t 40 m l .

On a a l o r s c e n t r i f u g é la s u s p e n s i o n e t on a lavé le c u l o t r é -

s i d u e l à deux r e p r i s e s avec de l ' e a u pure p u i s on a séché ce s o l i -

de par l y o p h i l i s a t i o n .

Le p r o d u i t ob tenu (80 g) é t a i t d ' une c o u l e u r jaune c l a i r e t s e

p r ê t a i t aux a p p l i c a t i o n s a l i m e n t a i r e s .

1. Procédé pour o b t e n i r , à l ' é t a t de m a t i è r e p u l v é r u l e n t e s o -

l i d e , l es p r o t é i n e s du sang dont l ' h é m o g l o b i n e e s t s u b s t a n t i e l l e m e n t

d é c o l o r é e t ou t en p e r m e t t a n t d ' é v i t e r ou de s e n s i b l e m e n t r é d u i r e ,

pendan t c e t t e o p é r a t i o n , l a p e r t e du fer con tenu dans sa p o r t i o n " h e -

me" a i n s i que sa d é n a t u r a t i c n i r r e v e r s i b l e , c a r a c t é r i s é par le f a i t

que (a) on soumet c e t t e hémoglobine en m i l i e u aqueux à un t r a i t e m e n t

ménagé de c a t a l y s e enzymat ique , de man iè re que les c h a i n e s g l o b i n i -

.ques, t o u t en ne s u b i s s a n t qu 'un minimum ou une absence de s c i s s i o n s

h y d r o l y t i q u e s , se d i s s o c i e n t e t , en se d é p l o y a n t , r e n d e n t l e s g r o u -

pes p o r p h y r i q u e s de l ' heme p lus a c c e s s i b l e s aux agen t s de d é c o l o r o -

t i on ; p u i s (b) on d é c o l o r e par o x y d a t i o n ces groupes hémiques a i n -

si l i b é r é s .

2. Procédé s u i v a n t la r e v e n d i c a t i o n 1, c a r a c t é r i s é par le f a i t

que pour l ' é t a p e (a) on u t i l i s e des p r o t é a s e s t e l l e s que l ' a l c a l a -

se, la p a p a î n e , la p e p s i n e , la t r y p s i n e e t la p r o t é a s e de R h i z o p u s .

3. P rocédé s u i v a n t la r e v e n d i c a t i o n 2, c a r a c t é r i s é par le f a i t

qu 'on u t i l i s e des c o n c e n t r a t i o n s en po ids d 'enzymes par r a p p o r t à

la m a t i è r e sèche du sang de 0,001 à 0 , 5%.


que pour l ' é t a p e (a) on t r a v a i l l e e n t r e 20 e t 50°C.

5. Procédé s u i v a n t la r e v e n d i c a t i o n 1, c a r a c t é r i s é par l e f a i t

que pour l ' é t a p e (b) on u t i l i s e , en m i l i e u aqueux, un agen t o x y d a n t

h y d r o s o l u b l e t e l que l ' h y p o c h l o r i t e ou l ' e a u o x y g é n é e .


que pour l ' é t a p e (b) on procède par o x y d a t i o n é l e c t r o l y t i q u e .


q u ' a p r è s l ' é t a p e (a) e t avant d ' e f f e c t u e r l ' é t a p e (b), on c o n c e n t r e

la s o l u t i o n ou s u s p e n s i o n d ' hémog lob ine r é s u l t a n t du t r a i t e m e n t e n -

zymatique de maniè re à r é d u i r e le volume g loba l occupé par l a m a t i è -

re à d é c o l o r e r s u i v a n t l ' é t a p e ( b ) .

8. Procédé s u i v a n t la r e v e n d i c a t i o n 7, c a r a c t é r i s é par l e f a i t

qu 'on a j o u t e un s o l v a n t h y d r o c o m p a t i b l e à la s o l u t i o n ou s u s p e n s i o n

d ' h é m o g l o b i n e r é s u l t a n t de la mise en oeuvre de l ' é t a p e (a) a f i n d e

d iminuer la s o l u b i l i t é de c e l l e - c i dans le m i l i eu aqueux de t r a i t e -

ment e n z y m a t i q u e e t de f a c i l i t e r sa c o n c e n t r a t i o n par c e n t r i f u g a t i o n .


q u ' a p r è s l ' é t a p e (b), on é l i m i n e la phase aqueuse où s ' e s t d é r o u l é e

l ' o x y d a t i o n a f i n d ' e n s é p a r e r l ' h é m o g l o b i n e d é c o l o r é e sous forme d ' u n e

p o u d r e .


q u ' e n p r o c è d e par é v a p o r a t i o n , a t o m i s a t i o n ou l y o p h i l i s a t i o n .


que le c o n t e n u en fer de l a d i t e poudre d é c o l o r é e e s t p r a t i q u e m e n t

i d e n t i q u e à c e l u i d ' un sang ou d ' u n c ruor séché non d é c o l o r é .


q u ' o n e f f e c t u e la d é c o l o r a t i o n de l ' h é m o g l o b i n e du sang en p r é s e n -

ce ou en l ' a b s e n c e du plasma s a n g u i n .

13. Poudre p r o t é i n i q u e c o m e s t i b l e d é c o l o r é e c o n t e n a n t du f e r

ob t enue à p a r t i r du sang e n t i e r ou de c ruo r d é c o l o r é par le p r o c é -

dé s u i v a n t la r e v e n d i c a t i o n 1 .

14. Poudre p r o t é i n i q u e d é c o l o r é e u t i l i s a b l e dans l ' a l i m e n t a t i o n

humaine o b t e n u e à p a r t i r de sang e n t i e r ou de c r u o r don t l ' h é m o g l o -

b ine a é t é d é c o l o r é e par o x y d a t i o n , c a r a c t é r i s é e par l e f a i t q u ' e l -

le c o n t i e n t du f e r sous forme c o m p l e x é e .

15. Poudre p r o t é i n i q u e s u i v a n t la r e v e n d i c a t i o n 13, c a r a c t é r i -

sée par le f a i t que l e f e r e s t c e l u i n a t u r e l l e m e n t c o n t e n u dans l a

p o r t i o n heme du sang soumis à la d é c o l o r a t i o n .

16. U t i l i s a t i o n de la poudre p r o t é i n i q u e s u i v a n t l e s r e v e n d i -

c a t i o n s 13 à 15 pour la p r é p a r a t i o n d ' a l i m e n t s r e c o n s t i t u a n t s .

Procédé pour préparer des protéines du sang décolorées

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