Post mortem muscle protein degradation during ice-storage of Arctic (Pandalus borealis) and tropical...
-
Upload
independent -
Category
Documents
-
view
0 -
download
0
Transcript of Post mortem muscle protein degradation during ice-storage of Arctic (Pandalus borealis) and tropical...
����� � ��� ������� � �� ��� ��������� � ��� �� ���� ���� 6�"�/ )����� "���*4-&� ��#���"9;���# ��
���� ������ muscle protein degradation duringice-storage of Arctic (������ �������) andtropical (������ �������� and ����������) shrimps: a comparativeelectrophoretic and immunological studyIciar Martinez,� Tone Jakobsen Friis and Mercedes Careche†
Norwegian Institute of Fisheries and Aquaculture, Ltd, N-9291 Tromsø, Norway
(Rec
� CoE-ma† CurContCont
� "
��������� ����� ����� �� ��� ������� ���� �� ������ ��������� ���� �� �������� ���� � ��
�������� ������ ������� �������� ��� ������� ���� ������� ������� � ���� ���� ���
���� �� ��� ��� � � !�� "� ��� ��#� $� ������% �� ��� ��� �&� !� ��� "�� $������� ���% �� ��������� ��
��� ��� �� ��� ��� ������������� ����������� ��� ������ ����� �����'��( )� ����
*���� ���� �� � ��������� �� ����� �� �� � ���* ������ �� ������ ��*� ����� $+,-% ��� �
����������� ������ �� �� ����� ��� �������� �� ����� �� �� �� �� ��. ����� �##/0� ������
������� ���� �����+,- ��������( +,- ���������� �� � ������ ��� ���1��� �� ������ �����
�� ���� �� ����� ���� � ����������� $202�3�45% �� ������ � ��� ��� ����* ������( 6���
�������� ������ �� �� ����������� �� ����� �� ����� �! ��� �#/0� ���� ��� ��� ��
�������� �� � ���� �� � ���� � �� ���� �#/0� ���� �� �� ���������( )�� ��� ����� ����� ��
������� �� � ��� �� ������� ���/��( 6� ���� ������* � �����1� �� ����� ��� ��� �����
�����1���� ������ �� ��� �� �� ��� �����( )�� ����� $����� �## ��� "�/0�% ��* � ������*
������� ���� �� ��������� �������� �� �� .������ ������ �� � ������� ��� ���� ��� �� � �� �����
"�/0� ���� ��� �����( 7� ��������� �� ������� �� � �������� ��� � ���� ��� ��� �����
�����1���� � �������� ������ �� ������ ������ ��� *� ���� "�� �� ��������� �� � �� �##/0�
�������������� ������������� ���� ��� � �� � *���� �� �� ������� � ������ �� � ��������(
� �##� 2����� �� -����� 7�������
8������� ������� �������� ������� ������� �������� ������� ����� ���� � ��� ��� ��������������� ������� ������� ���������� �����������
INTRODUCTION�������� ������ �� � �� �� ����� ��� �� ���
������� ������ �� �� ��� �� � ! ������� ����
"#$% �� �� ���� �������� ������� �� ��� ���
�����#� &�� �� �� ������! �����! ��� #�% ��
�� ����# '� (���� �� �� � ������ ��� �� ���
��� ��� ���" ����� �������� ����� )$#$% �� ��
����*! ���� �� ������ ���� ��� �� ��� �#+% �� ��
���� (����� �� � �� ������! ��� ���� � � ��
��� �����#"� ������ ��� � ���� ����� ������� ����
��� �� ������ ������ � ������� ���� �
��� +°,#� -� �� ���� ����! � � �� ������
)������� �������* ��� ���� ���� )�� �����* ������
)������� ����*! �� �������� � � �� �����
���� ��� � .���!$ �� ������� ����� ���� �� ��� �
"/°, ���� ��� ��� ����� ��� ����������� ��
� ��� �� � ����� ��� ���� ��� �� �� ��� ��°,
eived 12 December 2000; revised version received 28 March 2001; a
rrespondence to: Iciar Martinez, Norwegian Institute of Fisheries andil: [email protected] address: Instituto del Frı́o, Ciudad Universitaria, E-28040 Madridract/grant sponsor: Norwegian Research Council; contract/grant numract/grant sponsor: European Community; contract/grant number: AIR
��� 2����� �� ,����� &�� ����# � ��� �� ���� ��""65�$"9"
��� � ��� /�% ��������#$ 0��� �����! ������
� � ��! �� ����� �� �#
1��� �� �� � ����� ����� �� ��� ���� ������
�� ������� ��� ������ ��� �� ��������� �����#
2 �������! �� ������ ������� ��� �� ��
����� �� �� .'3! ���� ������������ �������
�� .43! .13! &13!56/ ����� ��� ����(�������
��� � ������ ���������� �������� �� �� ���������
����!�� ���� �� ����7 �� ��� �� ��������� ���
���������� �8��� ���� ���� ����� ���� ��� � ��
������� �� � ������ �� �� � ��#��!�" '�
��� �� �� ���� �������� �� ���������� �� � ��!
�������� ��� � ��� �� ���� �#�� 3������� �� ����!�� �� �������� ������! ��� � � ��� �!�$ �� �������! ������ �� �������� ��� ������ ����
������ ��� �� �������� �� ��� �� ��8 �+6
�/��4� ����� �� ������ �� �� ������� �� ������
ccepted 22 June 2001�
Aquaculture, Ltd, N-9291 Tromsø, Norway
, Spainber: 108896/1203 CT94 2283
���9:��#�� ��
� �������� � ������� ����� � �����
���� ��� ���������� �� ��������� �������# '� ������� �< �� �� .����� � ������ ��� �� �� ��
������ ���� +#$ �� /#"#�$!�5
,� ������� ��� ������������� ��� ����� �����
����� ����� ����� ���� ���� ������ �� =��� �
����� ���# '�� �� ������ �������� �����
�� � ����� ��� � �� �� �� ����� �����! ������!
� ������ ��� ���� ����� ���#�� >������ ��
����� � ��;�� ������ ��������� �� ������ ������
��� �� �� ���� ��! ��� �� ��� ���� ����������
�� � ������� ��� ����� ��� � ���� ��� ���
��� ��������! �� �������� �� ������ ��� �� ����! ��
������� ����� ���#
2��� � ������ �� �� .����� �����! ��� ������ �
�8��� �� � �� ��� ��������� �����=��� �� �����
������������ ���! ����7 ���! ������ ��� �
����� ����� ���� �� ������� ����� � ���� ���
������# 2����� �� � �� �� ������ �� �� ������
������ � �8��� ��� �� ������� �8��� �� ��
������ ���� � ��� ��� �� ��# 3�����! ����� �����
��� � ������ �� ����� =��� � ��������� � � ��
��� ���� � ������� ��� ������� ������#
?��� �� ������� �� ��� ����������� �� ���
���� ���! ��� �� ���� ������ �� ����������� ��
��� ���� ������ ���� ����� ���� ������ �� �
�� �� ������ ������ ��� ������ �� �� �� ����
�������# '� ����� ���� ��� ������� �� ����
��� �� ��� ���� ���������� �� � �� ������� ��
.����� ��� ������� �������# -�� ��� ���������
����� ����������� � ����������� �� � ��
(������ ��� �� �� �������� ������� �� �������
���� � ���� �� ���� �������� ���������# '� ��� ��
������ ��� �� ��� �� � ������ �� 242�3.?@
������� �� �� ������� ������ ����� ������ �� �
�� �� ��� ��������� ���� �����.����� ����� ����
������ ���� ����� ������ �# &�� ��������� ���
��� �� �� ����� �� ���������� �� ���������# A
��� ���� �� � �� ���� ���������� ���� ���������
��� ���� � �� ������ ���������� �� .����� ���
������� �������#
Figure 1. Schematic representation of Pandalus borealis showing the area(cross-hatched) where samples were taken. Muscle samples fromPenaeus japonicus and Penaeus monodon were taken at the samelocation.
MATERIALS AND METHODSAnimal samples� ������ �� ��� � 5� ����� ����� ��� �� �� ���
�� ������� ��� �� 2������ ����� �� B � ���
�������� ���� �� ��# � ������� ��� � ������ ��� � "� ��� ��� ����� ����� �������� ���
�� ���� �� "/°, ��� �� ��� �� B � ��
�������� �� ��� ����# &������� ���� ����
)�� �� ���������* �� �������� � ���� ��
����� ��� � ��� �� �� ����� �������� � ��
��� � �! �� ����� �� >�� �! �� ������ �� �����! ���
���� ��� ����������� � � �� ������ (���������
�� ������� ���# '� (��������� �� �������
�� � ������ ���� ��� �� ����� �� �� ��� 5! ��! "$!
$/! +"! � ��� �"�� ��� �� � ������� ��� � �������� ��� �� �������� ��� ��! ""! $�! +� ��� "�#
@���� � ������! ��� � ������� ��� ��� � ������ ������ ��� ��� ������ �����# &� ��������! ��
�"��
���������! �� � ��� ���������� � � ��� �� �� �
���� �� �� �� ���������#
Extraction of muscle proteins'� ��� ����� � ��� ������ � � �� ��# .���
����� �� �� ��! ��� � ����� �� �� �����
� ��� �� (���� ��� ��� ����� �� ��
@������� � � ���� 5��� �� �� �� ������ <"-#
'� ������� �� ������ ��� ����� ��� �� � ��
�� ������ �� ��� 5��� �� �������# '� � ���
������� ���������� �� ���� (������ �� ���������
�� �� � ��! �� �����(����� 7 � �� � �� ���
��� ����� ��� ���� ��� �� (������ �� ����� ��
�"�°,# '� �< �� �� ���� (������ ��� ��� �� ��
�������� � ���� ���� �< ��������� ����#
'� ��� ��� ����������� � (������ �� ���
����� ������� �� ������� ������� �� �C.��� ����� �+ '� �� ��� �� �� �� � �� ���� �� ����
(��������! 5��� �� � ������ �� ���� )"��1 ��,!
��1 @?'.! �5�1 1�,"! 5�1 ������������!
"���1 ��������� ����� = ����! �#$�1
��3-$<" ��� �#��1 ��"3-$<! �< �#5* ��� ����#
'� ������� �� ������ ��� ����� ��� ������ ��
��� 5��� �� �������# '� � ��������� ����������
�� ��������� � ������ (������ �� ���������
�� �� � �� ��� �� �����(����� 7 � �� � ��
������ ����� ��� ����# '� �� �������� ���!
5��� �� � �������� �� ���� )5�1 @?'.! �5�1
1�,"! 5�1 ������������! "���1 ���������
� ����� = ���� ��� ����1 ��$3"-+! �< /#5*
��� ����# '� ������� �� ����� ������ ��� �����
��� ������ �� ��� 5��� �� �������# '� � ���
������� ���������� �� ����������� � ������
(������ �� ��������� �� �� � �� ��� ��
�����(����� 7 � �� � �� ������ ����� ���
����# . �� (������ �� ����� �� �"�°, ���
������# '� ��� � ��� �� (������ �� ���� � �
����� � �� ������ �7 � � (��������#
'� ������ ������ �� �� (������ �� �� ����
����� ��� ������� �� ���� ������ ������ ��
"/��� ���� �� ������������ )�"/�* �� �� �
)�������� ������� �� � � ���������*# >�� 242�
3.?@ �� (������ �� �� �� ���� D���� � ����/
)"��� �� �����! 5�� �� ��������������!
$/� �� 242 ��� �"5�1 '����<,! ��1 @4'.!
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*
Figure 2. pH values of water extracts from muscle of Pandalus borealis(full diamonds), Penaeus japonicus (open squares) and Penaeus monodon(crosses) immediately after death and until 92h of ice-storage. Each pointis the average�standard deviation of individual determinations in threeshrimps.
3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������
�< �#/* �� � ������������ �� �#"�� ������ ���!���� ��� 5��� ��� ����� ���8�#
SDS-PAGE@����������� ��� ������� ��������� ��
D�����/ �� ���� �$������� �� /�������
)���� ��*! �#5�� ����� ��� ��# '� �������� �
�������� 5�� �� �������� ��� �#�� �� �����8������������! ����� �� ��������� � �������� ��
�5�� �� �������� ��� �#/+� �� �����8�� �����������#� !"� .�� � ��� �� ������ ��� ���� ���� ��
�� ��� ����������� ��� ������ � � �� "��. ��
��� )�$�������* �� �� � �������� �5�E )/�������*# '� �� �� �����������"� ��� ����
���� ��� ���� �� ������# '� ������ ��
��� �� ������� � �� � �� ���� �����# '�
�� �� ����� ��������� �� ���� (������ �� ����
� ������! ��� � ������� ��� ��� � ���� ���
��� ������ �����#
Two-dimensional electrophoretic analysis'������������ )"4* ����������� ������� ���
������ � � �� �� ���� ����������� � (������#
'� ���� ��������! �������� ��� ���� )&@>*! ���
������� ��������� �� -C>���"" �� ������#5��
�� ������� ��� �� ���������� ��� �� ������
���! �#/� �� �����8�� ����������"� ��� "�� ��
2����� &��4�� )���� �6�� ����� �� �� 56+ ����*#
. 5�� ��� �� �� ���� ������ ��� ���� ���� ��
����# &@> ��� ������� ��� ��� � +"��E�# '� ����
�� (�� ��! ���=� 7 ������� �� �"#5�1 '����
<, )�< �#/*! "�� �� 242! 5�� �� ����������
����� ��� ���� �� ����� ���������� ������
���� � ! ��� ���� �������� ���� ���� ��
�������������� ��� �� �� ����� ���8� �� �"�°,��� ��� �������#
'� ����� �������� )242�3.?@* ��� ���
����� �� ������� ���� �� �$������� ��# .
��(� � �� ��� �� �! ��������� ��� ���������� �
� ��� ��� ��� ������ �� "4 ����������� ���
���������� � �����#
Immunoblotting'� ������ ������ �� ��� (����� ��� �������
������������� �� ������� ���� �� 0��F�� ����
��� �� )+���/��! �#5�� �����* �� � ��������
�5�E ��� ��# . ��� ��� �� �� ���� ������ ���
���� �� �� ���� �� ��� �����1<, ���������������
���! ��� ���� �� ��� ���� �����1<, ��� �����
��������� ����������������# '�� �� �� � � ��� ����������# .��� �����������! �� � ��� ������
���� ,������� 0������ 0 F�"5�! ����� ��
������� �� �� ����� � �� ��������� ����
������ �� ��������� �� '����� �� ��"� ���� �
0��F�� ���� ������� ��� �� ���E ��� 5����# '�
������� � ��� �������� �� �� 242! 5��1 '���!
�/��1 ����� ��� "��� �� �����# '� ������
� �� ���� �� ����� ���� �������� � ���
���� )���1 �������� � ���! "#+�1 G, ���
��+�1 ��,! �< +#$* ���������� 5�� �� ������
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*
������ ��� ��� ��# '� ���� �� ��� ���� ��� ��
�� ��� � 5�� �� �� � ������� ������� ������ �
�����.����� ����� ���� ���� 1<, ���� �� ��
������� �� 1�����8 ��� 3�����#"$ 1�������
���� ��������� )2���� .�5�$$* ��� �� ��������� ��
�� ����� ������ �� �� ��� ���� ��# 2�������
��������� �� ���(�������� ���� �����������
&�? )2���� .���5$* ��� ������ ������� � &�?
)2���� .� �$$* ��������# 4������ ��� ������
���� &0& @�8�������� A� )G���� &����������
0����������� &��*#
Electrophoresis of native myosin isoforms@����������� ��� ������� ��������� �� �C.��� ����"5 ��� <�� �� ��"� ���� �� ������������ �������
�� 1�����8 �� ��� "+ '� � � ����� � ��� ��������
"��1 ��$3"-+ )�< /#5*! 5�1 1�,"! ���� ��
����� ��� �#5� �� ��������������# '� �����
����� )�����#5��* �� �������� $�� �� ����
�������� )� � �� �������� ��� �� �� �����8������������*# .�� � +�� �� ���� ������ ��� ����
�� ��� ���# 1����� ���� ��� ��������� � �� ���
�� �� �� ������ ��������# @����������� ���
������ � � �� � �������� ����� �� �E ��� � �� �
������ � ���� � ��� �"°,#"+
.��� ����������� �� �� �� ���=� ������ ���
"��� ���� ,������� 0������ 0 F�"5�! ���
������� ���� ������ ���� ��� �� ������ �����
���������� �� ����� ������ ���� �����# '�
����� �� � �! 7 ������� ��� ����� �� D����
� ����/ ��� ���� �� �� ���� �� �� �#+5��
����� ���� ��# '� �� ��� �� ��� ����������� ��
���� �� ��� �� ����� �������� )242�3.?@*
������� ����� ��� �� � � �� � �������� �+5E ���
��� � �� ��� �����������#"�
RESULTS'� �< �� � �� �� ���� (������ �� � ������� ���� ���� �� ����� �� >�� "# 2��� �� �< ���������
���� ��� ������� �� �� ������� �� ����� �� ����!
� �� ��� �� ��� � �� �< �� � �� � ������
�"��
Figure 3. SDS-150g l�1 PAGE of water extracts, low-salt extracts andhigh-salt extracts of (A) Pandalus borealis, (B) Penaeus japonicus and(C) Penaeus monodon. P borealis had been stored in ice for (a) 0, (b) 5,(c) 16, (d) 24, (e) 48, (f) 72, (g) 96 and (h) 120h before extraction.P japonicus and P monodon had been stored in ice for (a) 0, (c) 16, (d) 22,(e) 43, (f) 71 and (g) 92h before extraction. Lane S: Pharmacia’s low-molecular-weight calibration kit, with bands of (from top to bottom) 94, 67,43, 30, 20.1 and 14.4kDa. M, MHC; Ac, actin; T, tropomyosin. Thearrowheads, asterisk and bracket indicate bands referred to in the text.
� �������� � ������� ����� � �����
(������# '����� �� ���� ����� ��������� �� �
����� � (������ � ���� ����� � ������ ��� ��
�������� ��� 5��# '� � ������ �� �� ����
(������ ������ ���� �� ����� ��� �� ��8 ���
�� �� ���� ���� �� � �� ����� �� ���� ���� ��
����� ������ �� �� ����� �����#�$� ���� ���
�� ���� ������ �< �� ! ����� �� � ������� ���� ������! ��� ���� "/� �� ���������! � ������ ����� ������ �< �� �� �# A�� �� ���� (������ ��
�� ��� ������� ����� ��� �� ���� ���(�� � ��
�< +#� ���� ��� � $/� �� ��������� ��� �����
�������� �������! �� �< �� �� �� ���� (������
���� �������� � ������ ������ � �� ������ ����
$/ �� 5��#
'� �� �� �� 242�3.?@ �� �� �����! �������
��� ����������� � ��������� �� ����� �� >�� �# >��
� ������ )>�� �.* �� ����� ��� ��������� �
(������ ������ � ��� ������ 7 ������� ������
�����������# -� �� �� ���� �������� ��� �� ���
�� ����� �� � ���� �� ����� �� ��� �� ��8
��� � ����4� �� � �� (������! �� �� ��� ���
������� )��� ���� � ������ �� >�� �.*# '��
����� ��� � ������� ������� ���� �����������
������ �! �� ����� �� >�� $ ��� ��� ���� �
������# -�� �� ��� ����� �� �� ���� �� ����� ��
>�� $! ��� � ��� �� �� ���� ������� ����� ��
���# -� ���� �� ��� � �+�4� ������ �� 242�
3.?@ ������� )��� ���� �� �������� �� >�� �*!
����� ��� ����� �� �� ��� �� ���� �� � ��
���������! ��������� ���������� ���� ���������
������ ��� ��� ��� ������� ���� "$� �� ���
������# '�� ���� ������ ����� �� ��� � 5��4�
)��� ���� �� ������� �� >�� �.* ��� � ����
������ � ���� ������# '� ��� ���� ��� �����
�� ��� � �� "$�# ,����������� ���� �� ����
�������� �� ���� ����! �� �������� �� �� ���
���� �������� �� ��� ����� �� ����� ��� ���
� ���� �� ���� 5� �� ���������! �� ��� �� ���� �
��(�� � �� ��� � "$� ��� ��� ��� �������� ������
�� �����#
'� ����� ��� ��������� � ��������� �� � ������� ��� � ���� ������ �� ��� ����� ����
�� ������������ (������ �� � ������# &� �� ������������! ��� 1<, ���������� ��� ������ ��
���� "� �� ���������! �� ������� �� �� ��� ���
���� ���� ��������� ������ ���� ����� ������ � )>��
$*#
'� ���������� �� ������ ��� ������� �� ������� �� ������ � ��������� �� ���� ��� ��
����������� ��� ����� ���������� ��� � ���
� ��7 �� 242�3.?@ ������� �� �� ����� �� �
���������� ����� ���������� )>�� 5*# >�� 5. �� �
�������� ����������� �� �� ����� �� ���� � �
� �# >�� 50 ����� �� ��� ���� �� �� 242�3.?@
� ��� �� (���� ����� 1! � ��� � �� >�� 5. ��
����# 0��� 1 �������� ����� ������ ��� � ��
������ 1<,! ��� ����� � ��� � �������� ������
��� � ���� ������ 1<,! � ������ �� �� ����
���� ����� � ��� � ������ ��� ���� �" ��� "$� ��
��������� �������� ��� ���� �������� �������
�"�"
���� ���# '��� ������� ��� ��� ������� �� ��
��������� �������! ��� � �� ��� 1<, �����
������ ��� ������ �� ��� ����� �� 242�3.?@#
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*
Figure 4. Immunoreactivities of high-salt-soluble extracts of Pandalusborealis, Penaeus japonicus and Penaeus monodon resolved bySDS-150g l�1 PAGE with rabbit anti-Arctic charr fast MHC antiserum. Thenumber at the top of each lane indicates the hours of ice-storage. M, MHCband. The bracket indicates degradation fragments from MHC (see text).
3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������
"4 ����������� �� �� ����������� � (������
���� � ������ )>�� �* ���� �� ����� �� ���
�� ����������� ������� ��� ���� ����� �����# '�
�+�4� ������ ���� )������ �� >�� �* ��� � �& ��
Figure 5. (A) Schematic representation of native myosin isoforms after a9h run. From top to bottom the samples were rat diaphragm (used asstandard) and high-salt-soluble extracts of Pandalus borealis after 0, 5, 12,24, 72 and 120h of ice-storage respectively. M, bands corresponding to thenative myosin isoforms of P borealis; a and b, additional, faster-migratingbands noticed only after 12 and 24h respectively of ice-storage.(B) SDS-150g l�1 PAGE of electrophoretically isolated bands M, a and b,as indicated on top of the lanes. The arrowhead indicates the MHC band.The arrow indicates proteolytic fragments. Lane S: Pharmacia’slow-molecular-weight standards. Only the upper part of the gel is shown.
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*
��� � 5#�! ��� ������ ���� �����# &� ��� �������� ��
���� � ��� 5� �� ���������! ��� ��� �� ������
���� ��������� ��� ��� �� ��������� ���� "$
��� $/� �� ���������# '� ��� ����� ��� ����
������ ��� �� �������� �� �� "4 �� ����� �� >�� �
�� �� � �� ���� ������� ��� �� �� ��� �����
��� ���� �� ������� �� >�� �# '� ���� �� �����
������� ��� �� ���� )��� ���� �� ����� �� >��
�* ��������� ���� ��������� ������ ���! ��� ��
��� ���� �� 242�3.?@ �� ���������� �� �� ���
��� ����� �� �� "4 ��� �� �������� �� ���� �����
������� ���� ��������� ������ ���! ������ ����
�� �� ���� ������ �� )��� ���� � ���� �����*#
'� "4 ������� �� � ������� ��� � ���� )>��+* �� ��� ������ �� ��� ���� ��� ������� ���� �������� �� �������� �� �� �+�4� ������ ����
)������ �� >�� +* ��� ��� ���� � �������� ������
���� ��������� ������ ���# -� ����! ��� ����
�� �������� �� >�� +! ��� ��������� �� �� ����
��� ��� ����� �� �� ��� ����� �� ��� � 5��4� ��
� ������ ����� �� >�� � ����� �� ��� �������� )�
��� �� ���� ��� �&* �� �� "4 ��# '��� ����!
��� �� � ��! �� ������ �� �� � ������������
�� >�� +�! � � ����� ����� �� �� �� �! �������
����� �� �������� �� �� ��� �� �� ������ ����#
.� �� � ������! ��� �� ���� ����� �����! � �
����������� ��� �� ���� ���� ��� ����� ��������
�� �& �� �� ��������� �������#
'� ����� �� ��������� �� �� ����������� �
(������ ��� ������� �� ��� ��� �����������# '� �
�� �� ���� ��! ��� ���� �� ��� ������ ��
�������� ���� ���� ���� �����1<, ������ � ���
�������������� ��������� )>�� /�*! �� ����� �����
������� �� ���� �������� ����������� �� �������!
��� ��� ��� ���� �������������� ��������� �� ����
��������� ��� )>�� /�*# 0���� ������� ���� �����1<,
������ � �� ��� ���� � ������! ��� �����
������������ �� ��������� ���� �� �������� )���
���(���� ��� �� ���� +�4�*# .� �� ��� ��
����! ��� �������������� ������������� ����� ��
������ �� � ������! ��� �� ���� ��� ����
����� ���� "$�! ��� �� ��� ���� �� � ����� �
��������� �� �� ���� )� � ��� �� �� �� �* ����
+"� �� ���������# &� ��������! ��� �� ��������������������������� ���� ��� ����� �� �� ���������
�� � (������ �� � ������� �� ���� "� �� ���
������# '� ����������� ������� �� ���� ���� ���
������ �� ���� �� �� ��������� ������� ������
������� ���� �� � ������#
DISCUSSION'� ����� �� �� �� ����� ���� �� ���� ����
�� ����� �������� ����� �� ���� �� ����� ����
���������� ���� ������� �8���! ���� �� �������
�������� ����� �� ������� � �� �� �� ����� �����#
'� ��� ���� �< �� � �� ������ � ��� ���
�� ������ ����� ���!�$!�5 ��� �� ������� ��
�� ���� �� � ��� �� �� ����� ���� +#�# >���
� ��! �� �� ���� ����! ���� ����� �� �
�"��
Figure 6. Two-dimensionalelectrophoresis of high-salt-solublemuscle proteins of Pandalus borealis.First dimension, IEF, from left (basic) toright (acidic). Second dimension,SDS-150g l�1 PAGE, from top tobottom. The shrimps had been storedon ice for (a) 0, (b) 5, (c) 16, (d) 24,(e) 48 and (f) 72h. A, actin; T,tropomyosin. The arrows, arrowheadsand circles indicate spots referred to inthe text.
� �������� � ������� ����� � �����
���� �< +#�"/6�� � ���� �� ����# '� �� �<
�� � �� ��� � �� � �� ��� ��� ���� � ������
��� ������� ����������# D������ �� ���������
������� �� �� �< �� �! � �� ����������� ��
������� �� ����� ����� ���� �� ���# 2��� � ��������� �� ���� ����� �< �� � ����� ���� �� ����
��� ������� �����! ��� ������ �� ��������� ��� �
� (���� �� � ������������� ������#
A ����� ��� 1<, ����� �� �� ���������
�� � (������ �� �� ��� �����! �� �� ���
��� ������� ��# -�� �� ��� ����� �� � �������!����� �� �� ��� ���� ������ ���� �� ��� ��
����! �� ������� �� >�� �# '� ����� ������ �
�� �� �� �� ����� �� ��������� �� �� 1<,
���� ��� �� ���� ������� �� ����������� ��#
<����! �� ��� ����� �� ���� ����� � ���� ��
������� ��� �� �� ������������� ����� �# &� ��
������ ���� �� ��������������� ���� ��� ��������
���� ��������� ���������� �� �� ��������������
����! � � � ��� ��� ���� � ����� �� �� ��� ��
�� �� ��� ���� ����������� ���� �� ������ �� ��
��� �� �� �� ��� ����# A ����� ��� ���� ���
��� ����� ������ ��� ������� 1<, ��������! ��
�"�$
��� �� ����� �� � �� ��� �� ����� � ���!�� ���
���� ���� �������� � ���� � ������ ��� ��
��������� ���������� � ���� ���������! �� �����
�� �� ������ �� �� �������� �� ����� �� ��� ��
���� ���� /� ��� ����4� �� � ������# 2�� ��
��� �����! �����! ��� ������ ����������#
3��������� �� � ��������� ������ ��� ����
����� �� ����� ��� �� �� ����� ����� �� ����
��������� � ���!�"6�$ ��� ���� �� �������!�56�+
�� ����� �� ��� � ��� �� ��8 �� ��5! ��� �� ����4�!
������� �� �� �������#�5!�+ '�� �� �� ������ ��
�� ���������� ��� ��������� ��� ������ ���
�� ������ �� � ������� � �� ������ �� 1<,#�/
'����� ��������������� ���� �����1<, ������ �
�� � ����������# <����! �� ���� �� ����� �� ���
�����! ������ ���� �� ��� ���� � ����� ��
�������� �� ��1<, ����! �� � �� �� ��� �� ������
��������� �� � ���������� ���������� ���� ���� �����
1<, ������ � �� � ������� ��� � ����!� ����� ���� ��� �� ����� ���������� ��������
�� 1<,! �� ������ ���� ����� � ����� ��
�������#��!�$
'� �+�4� ���� ��� ��� �� � � �;�� ��
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*
3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������
��������� � ���� ��������� �� � ������ � � ��� �� � ������� �� � ����# &� �� �����! �� � �
������! �� � ����� ����� �� "4 ������� ��
�� ������ � ���! � ��� ���� �� ������� ���� ����
�� ���������� ���� � � ��� ������� �� ���� ���
� ��� ) �� �����*! ��� ���������! �� � ���
���������� � )>�� �* ��� �� ��� ���� � ��� ��
�� ��� ����� ��� �����!� ��� ���� � ����� "4
������� �� � �� (������ ���� ������!$� � ���
����� � ��$� ��� �� � ���������� �#$" -�� ��
�� "4 ������� �� .����� ����� ������ )���"������
Figure 7. Two-dimensionalelectrophoresis of high-salt-solublemuscle proteins of (a, b) Penaeusjaponicus, (c, d) Penaeus monodonand (e) mixture of high-salt-solubleextracts from rat diaphragm, soleusand gastrocnemius muscles. Firstdimension, IEF, from left (basic) to right(acidic). Second dimension,SDS-150g l�1 PAGE, from top tobottom. The shrimps had been storedon ice for (a, c) 0 and (b, d) 92h.A, actin; T, tropomyosin. Thearrowheads and circles indicate spotsreferred to in the text. Part (e) is afull-size gel, and the square indicatesthe part of the gel shown in Figs 6a–6fand 7a–7d.
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*
�������* ��� � ���� ���� ������ ��� �� ���� ��� �&
������#$� '��� �������� ���� ���������� ����
������ ���� �������� ��� �� ��� �� ���� ������
�� �� �������� ���# '� ��� �� ���� �� ���� ����
����� ������ ������ ���� �� �� ���! � � ��� ��� �&�
��� �� � �� ��� ��� � �& �� �����(����� 5#$$"
��� �� ��� ����� ���� �����! �� ����� ���� ��� ��
������� �& �� ��� � 5#�! ��� ������ ���� �����# '���
���� ��� ������ � ���������� ������� �� � ������
��� �������� ������ �� � ��� ������# '� ����
���� �� ��� ����� �� � ��� ����� �� �� ��� ��
�"�5
Figure 8. (a) SDS-150g l�1 PAGE and Coomassie Brilliant Blue R-250staining of high-salt-soluble protein extracts of muscle from Penaeusjaponicus and Pandalus borealis stored on ice for various periods(indicated in hours at the top of each lane). Lane S: Pharmacia’slow-molecular-weight standards. (b, c) Immunoreactivities of the sameextracts with (b) both rabbit anti-Arctic charr fast MHC antiserum andmouse anti-�-actinin IgM and (c) mouse anti-�-actinin IgM only. M, MHC.The bracket indicates bands reacting with anti-fast MHC antiserum. Thearrowhead indicates bands reacting with anti-�-actinin IgM.
� �������� � ������� ����� � �����
���� ��� ��������� ��� �� � ������ ��� � ��� ���� ���� �� ��� ������ � ������ ������������� ��
������ � ���#
.� �� �� ������� �� �� ���� ��� ����� �� ���
� �� ���� �� ��� � 5��4� )>�� �*! �� ����� ���
���� ����� ����� � �����! �� ���������� ����
� ����� "4 ������� �� � �� (������ �� � ���!$�
�� �$" ��� .������ ����� )���� ����*#$$ &� ����
������������ �� ������! ��� ����� �� � ��� �
���� ������ �� ��� ���� ����������� � ����
��������� �� ��� �� �� ��� ������ �����! �� ���
�� � �� ��� �� ��� � � ��� �� ����� � ���#$5
A ��� ��� �� �� �� ������� �� ���� ���
5��4� )>�� �* ����� ���� ��� � �� � ������# &� ���
�� ��� ��� ���� �� ��� ���� ����� � � ����������
������� �� �� ����� �� ����� �� ���� ������ �&
�� � ��� ���� ����������� ������ ��� ����� ��
�������� ��������# '� ��� ��� �� �������� ���
����������� �� ��� ����� � ���� ��������� ���
�������� ������ �� ���� �� �� �� � ����� � ����!�$
���� �� �� ������� �� �� ������ �� ��8 ���
����� �����$� ��� �� ����� � ����� �� ����
���� �� ����� ����� �� �� ���# '��� ���� ����
��� ����� ��� � �� �� ������ �� ������ ��
������� �� � ������ �� H���� �� ��C# &������
������ ������ � �� ������ �� ������ �� ��
������ ������!�$ ��� ������ ��� ������ ������
�� � �=�� �� 7 ���� �� �� ������� ���� ���� ��
��� ���������� H���� ���� ���� �C#
��.������ ��� �� ����� �� � ����� ���� ��
I����� � ���� ��� ���� ����� �� ��� � ���$+6$
����� �� �� ���� ������ �� �� �� ,�"� ����
����5� ��� �� ������ �� ������#5� '� ����� ���
2��5� �� �� ���� ���� ������ �� � ��� ���������!���� � ��� �� ���� �� ����4�! ����� � ���������
���� �� �������� ��� ��� ����� �� �������� ��
���� � ������� �� ��4�# '��� �� �� �� ��
(���� �� ����� �� ��� �������������� ������
�"��
������� �����! �� ��� �� ����� ��� �� ��� ���
��4� ��������! �� � � ��� ��� ����� �� �������# ��.������ �������� �� ��������� ��� ��
����� �� � ������������!$/ ����� �� �������
��� ��� .����� � ������ ����� �� � � ���
� ������ ����� )��� ����� �� ����� ����
����� ���� ����! ��� ��� �� ��4� ��������������������������� ���� ������ ���� ������ ����
"$� �� ��������� ��� ����� ������ ���� +"�*!
������� � ������� ��� ��� )�� ��������� ���
���� )����4�* �������������� ������������� ����
�� � � ���� ����� ���� "� �� ���������*#
'� ������������ ��� ������� ����� �� �� ����
���� �� ��� ���� �� ��������� ��� ����������
�8���#5"655 <����! � �� ��� ������ � ��
��������� ���������� ������ �� ���� ���� ��
������������� ���� �������� ������� �� �������
�8���# &� ������ � (����� ���� �� ��� ����
���� �� ������� �� �������� �� ����� �� ����!
���� �� ������� ���� ��� �� � ��� ��� �� ����
��� �� �� ������# .� �������� (�������� ��� � ��
�� ���� ���� �� � ��� �� �� ������� �� ���� �� ����
,�"��������5�!5+ )��� �� �����! �� ��������!
�������� ����� ��������� �������5/* ��� ,�"����������5 6�$ ��������� �8��� ��� ���� ����
�8��� �� ������� ������ �� ������ �� �� ��� ��
����� ������ � �� �� ��������� �� ��� � �°, ��
.����� ����� ��� �� ��� � "/°, �� ������� �����#
'�����! ��� ��������� ��� ����������� �������
�� �������� �� ���������� �8���! �� ����� ��� ���
���������� ���� �� ������������ ���# .���������!
��������� ���������� ��� ��� ��� �� � ����� ���
� ���� ��� ������ �� .����� ����� ���� � ���� ���
������ �� ������ �� ������� �����# 1 ��
������� �� � �� ����� ������ �� �< ����
��� �� �� �� ���� (������# 2��� ���� �� ���
��� �������� (������ �������� @?'.! �� ��������� ��
,�"���������� �������!$+!5+ �� �� ��� ���� ���� ��
�� ���������� ������ �� �� 8������ ����� �� ������� )����� ��� ���� � ������ �� >�� �.*
��� ��� � ���� �� ��� ������� �� ����� � � ��
���� (��������#
&� � �����! �� ��� ���� ���������� � ���� ���
������ ��� �� � ������ ������� �� �� .�����
���� �� �� ������� ������ ��� �� �� .����� �����
��������� ������ ���������� )������ ��� �� �����
���� ���� �� ������� �� � �� �� ������ ���
�������* � ����� ����� � �� �������! �������
��� ���������� �� �� ������� ����� ��� �� � ��
� �� �� ����� ��� ������� �������� �� ��
����� ������� ���� �� ����� ����� �������
���� )"/°,* ��� ������ )�°,* ������ ��# '�
������ � ���� ��������� �� ������� ����� �����
������ � ���� �=��� �� ������ �� ����
��� �#
ACKNOWLEDGEMENTSA ���� �� (���� � � ������ � �� 4� .�� 0����
)4����� &����� � ��� >������ F�����! D�����!
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*
3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������
4�����* ��� 0� � ?������� )J ����� 4�����
��� �� 3������ &�� �����! 0������! . ������* ���
��������� �� ����� �� � ������� ��� � ���� ��� �� �� �������� �� ����� � � �� ������ (���������
���� ��� �����# '� �������� F����� ,� ���
�� ����� � ��������� ��� ������� � ����� �� ��
���;�� ��// �9�"�! ��� �� @ ����� ,��� ����
��� �������� �� (����� ����� �� 4� 1����
,���� �� �� �������� &����� � �� >������ ���
.7 �� � � �� ���� �� �� ,������ .����� .&F�
,' $ ""/� H@�� ����� �� >��� >������C#
REFERENCES� 4�������� �� >������! D������ ����������K�������� ������
� �6� # ������� #��� ���5 )"���*#
" �������� 2����� @(���� ,� ���! .L ������������ 4����
� # $������"����� � ���� %������! � �+ )� *#
� 2M�� F!1�;N�������# ������ � &�"��� �'����� (! &����� � ��
1���� F�����! 0��� )� +*#
$ 0���� <.! 3������ 04 ��� ?������� 0! D�� ��������� ��
����� ��� ������ ���� . ������K� � �� ������ ��� ������
����� �� ����������� ��� �� ���! �� ����� �� ����� �
�����! @� �� D �� B0! 0N���� ' ��� -������O�� B!
@���� 2���� 3 ������! .�������! �� +�6/5 )� +*#
5 0�� 1! P���� < ��� Q������� <! 3�������� ���������
������ �� � �� �� )������� ����������� � ���� ������#
�������� ��� ���$/"6$/� )� /*#
� >��� ?B ��� D�� F'! 3��������� ��������� ������ ��
�� � �� �� �� ? � ������! ������� �������# � �� ���
&!��� 6��� )� +"*#
+ 1��� ���� 1 ��� Q������� <! 2� ��� �� ������������ ��
� � �� ����� � ��# *���� ������ #�������� �!�"�"�6
"�"� )� �*#
/ Q������� < ��� 2������ F! 3��������� ��������� ������
�� �� � �� �� �� B����� ����� ����� � ���� ������#
�������� ��� ���/"�6/"$ )� �*#
D� 2�! 3 ��� ������ �� ����� ������ � ���� ������ �� ����
�� �������# � �� ��� �&�$$"6$$$ )� /*#
�� D������4E! ����� ���� ����� ������ �� �� ����� ������!
������� �������# ���� )��� !��""�6"�� )� +�*#
�� 0��������� @2! ���AG ���1�� B<! 3����� ���������8����� ��
� �� � �8�� (����� ���� �� �������� ����� ���!
������� ��������# � �� ��� �"��$ $6�$ 5 )� /$*#
�" ��� AG! D�� ,Q ��� 1�� B<! 3����� ���������8����� �� �
���������� �8�� �������� ���� �� ������������ �� ��
�������� �����! ���������� ��������# � �� ���
�#���/+6��// )� /5*#
�� 3������� �� D2! 2���� 20! A�� 'D ��� >��� ?! 1 ��
������ �� �� ������ �� �������� ������! �����������
�������� � ���� ��� ������# � �� ��� �����"56��"/! ��5+
)� / *#
�$ 1�����8 & ��� D� ���8�� G! @���� �� ������ ���������� �� ��
������ ������ �� �� ������ �������� ������! �� ������ ���
��� �� � ��� ����� ��������� �� �� ����������� ���!
��"��� ����� �+������! @� �� 0���� .! 4���� , ���
. ���� 0! '� ������� 2����� ,���! . ������! 0������!
�� �"�6�"/ )� +*#
�5 E������� <! .������� ����� �� ���# ���� ,�� -./ )� //*#
�� G���� 2 ��� Q���� ��� G! '� =��� � ��������� �� ��� ���
�����! �� ������+ ��� )��������+ � ����� �� ������!
@� �� 1����� F@! >��� ?B! <���� ,@ ��� A��� 4F! .E&
3 �������! A������! ,'! �� ��+6$�$ )� /"*#
�+ 4C.��� .! B����� , ��� 0R��� BB! ,��������� �� ������� ����
�� ������ � �� �� �� � ���! �� � ��� � ��� ���#
3������� �� ���������� �������� �� �� � ��� � ��#
$� � )����� ����" �6" � )� /�*#
�/ D���� PG! ,���� �� ��� �� �� ������� � ���� ��
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*
������ �� �� ��� �� ����������� '$# *���� ��!��/�6
�/5 )� +�*#
� .������ ,A! 0� � 3F ��� ?����� F>! 3�������� ��
������� � "���� �� �������# � 0�� ���$�"6$"� )� +�*#
"� <���������� 4! 3��������� . ��� 1��� ,! 4������ ��
����������� �� ���� ������ �� ��������� �� �������
��� ���� ������� �� ���� ��������# ���� )����� �!&�$�"6
$"� )� //*#
"� .����� A! >��� ��� ��8����� �� ������ ����� �� �����������
�� ������� � ���������� ��� ���� ������! �� $����������
12(! @� �� 2��������4!A��� � ?� ���! 0���! �� "�56"$"
)� /�*#
"" -C>��� 3<! <��� ��� ���� ������������� �����������
�� �������# � )�� ��� ��#�$��+6$�"� )� +5*#
"� '����� <! 2����� ' ��� ?����� B! @����������� ������� ��
������� ���� ����������� �� �� ������ �� �����
����� � ��� ��� �����������# �� *��� ���� ��� -��
!��$�5�6$�5$ )� + *#
"$ 1�����8 & ��� 3����� ?A! '����� ����� �� ������� �
����������� �� ������ ���� ����� �������� �� �� ���� � ��
�� .����� �����! ���"������ �������# )���� ��� ������� �+��+
��/ 6 5 )� "*#
"5 4C.��� .! 3������� , ��� 0R��� BB! .� ����������� �� ��
�� ����� ������ ����8��� ��� ���� � � ��� ������# $� �
)����� ""�"��6"+" )� + *#
"� <�� B>Q! 1�?���� 3. ��� A��� F&! @����������� �������
�� � ��� ����� �� ������ �� ����������� ��� ����������
� ��� �� �� �����# )����� � ��!�/+6 5 )� +�*#
"+ 1�����8 &! -����� F ��� -�� FD! @����������� �� �� ��
������ �������� �� ���� � ��� �� ��� ���� ����# ��
)����� ��+��� "�9�""�6""+ )� �*#
"/ 4 ���;��� @! '(� � �� ��� � ��# � ��3��� ���� �#����6��/
)� + *#
" 1�����8 &! -����� F ��� @�� -! ,�������� �� ������
�������� �� ��� ���� ��� � ���� ���� �� � ���� 7 ����! ��
����� 4�����+ %����������! @� �� G���� 4@ ��� D����� B!
@���� 2���� 3 ������! .�������! �� �/ 6$�� )� /+*#
�� F ���� '! 1 �� �������� ��� 7 ���� �� ��� ��� ����� ���!
�� 4�����+ �������� �� ��� ���� ������+! @� �� < �� <<!
B������ 1 ��� D����� B! @���� 2���� 3 ������!
.�������! �� � 6"+ )� "*#
�� I��� ,! .�� ? ��� 0������ ?! @����� ��� ��� ������
���� �� ������� ����� =���� � ���# �� )����� ��+���
�#!9� �6 / )� $*#
�" 0 ��� 0! D � 0 ��� A������ D! '� ���������� �� �����
=���� � ��# � �� )�� !���5 6��+ )� +�*#
�� ,��� ,! 28���?��O���� .? ��� G�������B��� B! 3���������
��� �� ����� �� �� ���� H�����C � ���# &# 3���������
��� �� � ��� ������# � �� )�� ���""�6"�+ )� +�*#
�$ 2�����8 <! .����� >'! 3� >. ��� 0������ ?! 2 ���� ��
� �� �� �� ��� �� �� ����� ������� ��������� ���
� ��� �� ������ �� �� ���������� ������ �� ����� =����
� ���# ������ ��� ���/�6��� )� $*#
�5 1����� 1! .������� BB! 2�� F���R� 1! 1���� F ��� ,����
1! .������ �� ����������9�������������� ��# � )�� ���
�!#�$�+56$�/" )� 5*#
�� 1��� 4D! <�������� �� ��������� ������� �� ����� ����
��� ��� � ���� �������� �� ��������! ����������! ���
������ ���� ������ ������� �� � �������� ������ ��������#
� $3� 5� �&��"�6�" )� /5*#
�+ 2�� ��� Q! G��8��� � ��� 1�� ���� G! ,��������8����� ��
������ ��� ���������� ���� ������� ���� ��� ��� � ���#
�� )����� ��+��� ��&9���56��� )� �*#
�/ <��� 3@ ��� A������� F<! F����� �� �� ��� ��������� ���
������ ��� ���������� �� ���� �� � ��# )���+� �
!#�2P.15 )� �*#
� 1�����8 &! -����� F ��� -�� FD! 1����� �������� �� �� ���
���� � ��� �� ��� ����� ���� ����# � ������ ,�� ���
���� ���$/ 6$ 5 )� �*#
$� <���������� '! '������������ � ����������� �� ������
�"�+
� �������� � ������� ����� � �����
���� � �� ���� ������ �� �� �� ���� ��������# ����
)����� ��!�$$�6$5� )� /�*#
$� ?������ ,2! 4���� 1B ��� .������ �?! < ��� � ��
�������� ������� �� ������������� �����������# *���!
�+ &&���5"6��5� )� /�*#
$" 2A&22�"4�3.?@ 4������# .����� )"� B �! "���*� �����99
���#(����#��9�������9���"9��S91P2,D@T1-P2@#
$� 1�����8 & ��� ,���������� B2! 1�������� ������� ��
������� ���� � �� �� .����� �����! ���"������ �������
)D#*# �� )����� ��+��� �#!9���6"� )� $*#
$$ 1��8 1! E��8�0����� E! .���� @G ��� > ��� B! P� ��
������������� ����������� �� �� �� ��������� ��
����� )���� ����* � �� �� ������ �� ����� ���� �����
������# � ���� �� ��� � �"� 6"$$ )"���*#
$5 E��8�0����� E! ���!���� ���� ������ �� ��� � ��
�������K������ �� ��� ���������! ��������� �����
��� ��������� �������! �� ��������� � ����� �������
������ ����� 6$"������� � ���� ��������1� ��,7 �8.
((27! @� �� -��������� ?! D �� B! 4������ 3! ,���� 1!
E��8�0����� E! 1������������ @ ��� <�� G! &����������
&����� � �� F����������! 3����! �� "" 6"�+ )� +*#
$� 1�����8 &! 2�;��� '! 4��� 0 ��� .;����� 2! ?����
��� �� ���� �� �������� ������ �� �� �������� .������# &&#
F.34 �������# 988/ ��� ��� �� � ��� ����������� �����
� ��� $3������ � ��� ��� :� $�;! ���� ������ �� ��
&,@2 ,������ � +#
$+ .���� ,! D��� B3! F� ���� , ��� 0�;���� Q! 2��������
���������8����� �� ��������� ��� � ���# �� )�����
��+��� �##9�$5 6$�5 )� �*#
$/ 3��� &! .���8 ,! E��8�0����� E! > ��� B ��� 0������
Q! ��� ���� ��� �� ��� ���� � �� ��������� �� ������
�� ���������8�����# � ��� �� ���� !����6+� )� �*#
$ '� ����� <! G��� 2 ��� 2�� �! 3�������� ������ �� ������������ �������� �� ���� ��� ������� ��� � � ���# *����
������ #�������� � �+ �6+ / )� "*#
5� 0 ��� A.! 2����� 1<! ?� 4@ ��� 2 8 �� .! ,�"������������� �� I ��� ���� ������ ���� � ��# � ��� )��
�����+6�/� )� +"*#
5� '� ����� < ��� 2�� �! .����� �� ������ �� ��������� ������ ��������� ���� ���� ��������# *���� ������ #��������
�!�����6��� )� �*#
�"�/
5" ?��� 0B ��� '����� B! &������� ��� �������� �� ������ �������#
)��������+ �$$/�6$$/ )� � *#
5� G����� G! G ���� 2 ��� 1�� ���� G! 3 ��������� ���
���������8����� �� ���� ��������� ���� $������� ������#
���� )�� ��� �!�5" 65�$ )� /�*#
5$ G����� -.! 0�� ���� 2&! 2������ �&! 0�������� '- ���
2������� .Q! '� �������� ��� �������� �� ����������
������� ���� ���� ������������# )����� )���+� ,��
���� �����$��6�$"� )� �*#
55 '��� &<! ,� ��� GD ��� ,� ��� BD! ,������������ ��
������� ������ �� �� ������ ������� )�������*# ��
)����� ��+��� �9�"�56"� )� /�*#
5� 0��� BF! 1� B2 ��� 1��� 4D! 3 ��������� ��� � ������
���������� �� � ��������� ���� �������� ��������
���� ����� )&���� ���������* ������� � ��# ��
)����� ��+��� �#�� 56 )� �*#
5+ 1��� 4D ��� 2����� 41! >� � ,�"�������� ����������������� ������ ���� �� ������ � �� �������� �� ��8! ��
����� ��� ���������� �� ,�"� ��� ����������# � )�� ���
���� /�56 /+� )� /�*#
5/ 1��� 4D ��� 2����� 41! 1������ ��������� ������ ��
���� �������� �������� �������� ���� ������ ����� ���
������ �� �� ������ � ��# %�" )�� "���/�6� + )� /"*#
5 4�� 2� ������;��� E! ,������������� �� �� ����� ��������
��� (�������� ���� ������ )������� �������* � ��# � ��
��� ����"��6�"�/! �"�� )� /+*#
�� G����� 1�! ?�� 12 ��� ���� 31! <��� ��� �� ��� ��
����� ��������� ��������� �� ����� )����������� ��"�����*
� ��# ������ � )����� )���+� &��"+"6"/5 )� *#
�� 1��� 4D! <������� �������� ���� �������� ����
����� � �� ���� ������ ��������� �������# � $3� 5�
��#�"$$6"5" )� / *#
�" 1��� 4D! 3 ��������� ��� ���������8����� �� � � ����������
�������� ���� �� ������ � ��� ���������� �� ���� ���
������������ �����# ��� )����� )���+� �!��"�"�6"�"/
)� / *#
�� 2����� 2E! 4�� 2�! ?�� 12 ��� ���;��� E! 3�������� ��
������� ��� ��� ���� �� �� � ������# ������ � $3� )��
���$$�6$$$ )� /�*#
�$ 2����� 2E! ?�� 12 ��� ���;��� E! 2< �������� �����
��������� �� ������ )������� �������*# ������ � $3� )��
�"�$��6$�" )� �*#
� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*