Post mortem muscle protein degradation during ice-storage of Arctic (Pandalus borealis) and tropical...

10
Post mortem muscle protein degradation during ice-storage of Arctic (Pandalus borealis) and tropical (Penaeus japonicus and Penaeus monodon) shrimps: a comparative electrophoretic and immunological study Iciar Martinez,* Tone Jakobsen Friis and Mercedes Careche Norwegian Institute of Fisheries and Aquaculture, Ltd, N-9291 Tromsø, Norway Abstract: Water-, low-salt- and high-salt-soluble protein fractions from the abdominal muscles of Pandalus borealis, Penaeus japonicus and Penaeus monodon extracted immediately after death and after 5, 16, 24, 48, 72, 96 and 120 h P borealis) or 16, 22, 43, 71 and 92 h Penaeus spp) of ice-storage were analysed by one- and two-dimensional electrophoresis and immunological techniques. The most evident effect in P borealis was the decrease in the relative amount of myosin heavy chain MHC) and a concomitant increase in the number and intensity of bands of molecular size about 100 kDa cross- reacting with anti-MHC antiserum. MHC degradation of P borealis was con®rmed by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) of partially isolated native myosin. Other prominent features were the disappearance of bands of about 67 and 50 kDa after 24h and the appearance of a band of slightly less than 50 kDa after 5 h of ice-storage. These last bands showed the potential to be used as freshness markers. One spot tentatively identi®ed as desmin did not suffer signi®cant changes in any of the three species. Two bands about 100 and 96 kDa) gave a positive reaction with the a-actinin antibody in the zero-time extract of P borealis, but after 24 h only one faint 96 kDa band was detected. In contrast, the extracts of P japonicus and P monodon did not suffer signi®cant alterations during the examined period, and even after 92 h of ice-storage only the 100 kDa anti-a-actinin cross-reacting band was clearly visible in the high-salt extract of P japonicus. # 2001 Society of Chemical Industry Keywords: shrimp; Pandalus borealis; Penaeus japonicus; Penaeus monodon; skeletal muscle; post mortem degradation; freshness markers; ice-storage; electrophoresis INTRODUCTION Pandalus borealis is a valuable ®shery resource for Norway: 63 600 t were caught in 1999, constituting 2.4% of the total Norwegian landings of ®sh and shell®sh. 1 Its value at landing, however, was 9.1% of the total. The export value of P borealis for the same year was 1312 million Norwegian kroner 4.4% of the total), although shrimp products were only 1.7% of the total exported volume of seafood, including cultured ®sh species. 2 P borealis has a circumboreal distribution where the ambient temperature oscillates between 3 and 7 °C. 3 On the other hand, kuruma shrimp Penaeus japonicus) and black tiger or grass) shrimp Penaeus monodon), the dominant cultured species throughout Asia, 4 are tropical species reared at about 28 °C that can only tolerate cool conditions: in summer the survival rate after 36h at 10 and 13 °C was 3 and 83% respectively. 4 Both species, especially kuruma, are highly valued. Most of the published works on post mortem changes in shrimps and prawns refer to warm-water species. Summarised, the changes described include: de- creased levels of ATP, with corresponding increases in ADP, AMP, IMP, 5±8 adenine and hypoxanthine; 9 and autolytic degradation starting in the hepatopan- creas, 10 with the consequent release of proteolytic and collagenolytic enzymes from this organ that induce the development of mushiness in the muscle. 11,12 The structures most resistant to degradation are muscle, connective and cuticular tissues. 10 Papadopoulos et al, 13 in freshwater prawns, and our group, 14 in P borealis, reported the appearance and increase with storage time of fragments of molecular size 67± 180 kDa which were attributed to increased solubilisa- (Received 12 December 2000; revised version received 28 March 2001; accepted 22 June 2001) * Correspondence to: Iciar Martinez, Norwegian Institute of Fisheries and Aquaculture, Ltd, N-9291 Tromsø, Norway E-mail: iciar.martinez@fiskforsk.norut.no Current address: Instituto del Frı ´o, Ciudad Universitaria, E-28040 Madrid, Spain Contract/grant sponsor: Norwegian Research Council; contract/grant number: 108896/120 Contract/grant sponsor: European Community; contract/grant number: AIR3 CT94 2283 # 2001 Society of Chemical Industry. J Sci Food Agric 0022±5142/2001/$30.00 1199 Journal of the Science of Food and Agriculture J Sci Food Agric 81:1199±1208 online: 2001) DOI: 10.1002/jsfa.931

Transcript of Post mortem muscle protein degradation during ice-storage of Arctic (Pandalus borealis) and tropical...

����� � ��� ������� � �� ��� ��������� � ��� �� ���� ���� 6�"�/ )����� "���*4-&� ��#���"9;���# ��

���� ������ muscle protein degradation duringice-storage of Arctic (������ �������) andtropical (������ �������� and ����������) shrimps: a comparativeelectrophoretic and immunological studyIciar Martinez,� Tone Jakobsen Friis and Mercedes Careche†

Norwegian Institute of Fisheries and Aquaculture, Ltd, N-9291 Tromsø, Norway

(Rec

� CoE-ma† CurContCont

� "

��������� ����� ����� �� ��� ������� ���� �� ������ ��������� ���� �� �������� ���� � ��

�������� ������ ������� �������� ��� ������� ���� ������� ������� � ���� ���� ���

���� �� ��� ��� � � !�� "� ��� ��#� $� ������% �� ��� ��� �&� !� ��� "�� $������� ���% �� ��������� ��

��� ��� �� ��� ��� ������������� ����������� ��� ������ ����� �����'��( )� ����

*���� ���� �� � ��������� �� ����� �� �� � ���* ������ �� ������ ��*� ����� $+,-% ��� �

����������� ������ �� �� ����� ��� �������� �� ����� �� �� �� �� ��. ����� �##/0� ������

������� ���� �����+,- ��������( +,- ���������� �� � ������ ��� ���1��� �� ������ �����

�� ���� �� ����� ���� � ����������� $202�3�45% �� ������ � ��� ��� ����* ������( 6���

�������� ������ �� �� ����������� �� ����� �� ����� �! ��� �#/0� ���� ��� ��� ��

�������� �� � ���� �� � ���� � �� ���� �#/0� ���� �� �� ���������( )�� ��� ����� ����� ��

������� �� � ��� �� ������� ���/��( 6� ���� ������* � �����1� �� ����� ��� ��� �����

�����1���� ������ �� ��� �� �� ��� �����( )�� ����� $����� �## ��� "�/0�% ��* � ������*

������� ���� �� ��������� �������� �� �� .������ ������ �� � ������� ��� ���� ��� �� � �� �����

"�/0� ���� ��� �����( 7� ��������� �� ������� �� � �������� ��� � ���� ��� ��� �����

�����1���� � �������� ������ �� ������ ������ ��� *� ���� "�� �� ��������� �� � �� �##/0�

�������������� ������������� ���� ��� � �� � *���� �� �� ������� � ������ �� � ��������(

� �##� 2����� �� -����� 7�������

8������� ������� �������� ������� ������� �������� ������� ����� ���� � ��� ��� ��������������� ������� ������� ���������� �����������

INTRODUCTION�������� ������ �� � �� �� ����� ��� �� ���

������� ������ �� �� ��� �� � ! ������� ����

"#$% �� �� ���� �������� ������� �� ��� ���

�����#� &�� �� �� ������! �����! ��� #�% ��

�� ����# '� (���� �� �� � ������ ��� �� ���

��� ��� ���" ����� �������� ����� )$#$% �� ��

����*! ���� �� ������ ���� ��� �� ��� �#+% �� ��

���� (����� �� � �� ������! ��� ���� � � ��

��� �����#"� ������ ��� � ���� ����� ������� ����

��� �� ������ ������ � ������� ���� �

��� +°,#� -� �� ���� ����! � � �� ������

)������� �������* ��� ���� ���� )�� �����* ������

)������� ����*! �� �������� � � �� �����

���� ��� � .���!$ �� ������� ����� ���� �� ��� �

"/°, ���� ��� ��� ����� ��� ����������� ��

� ��� �� � ����� ��� ���� ��� �� �� ��� ��°,

eived 12 December 2000; revised version received 28 March 2001; a

rrespondence to: Iciar Martinez, Norwegian Institute of Fisheries andil: [email protected] address: Instituto del Frı́o, Ciudad Universitaria, E-28040 Madridract/grant sponsor: Norwegian Research Council; contract/grant numract/grant sponsor: European Community; contract/grant number: AIR

��� 2����� �� ,����� &�� ����# � ��� �� ���� ��""65�$"9"

��� � ��� /�% ��������#$ 0��� �����! ������

� � ��! �� ����� �� �#

1��� �� �� � ����� ����� �� ��� ���� ������

�� ������� ��� ������ ��� �� ��������� �����#

2 �������! �� ������ ������� ��� �� ��

����� �� �� .'3! ���� ������������ �������

�� .43! .13! &13!56/ ����� ��� ����(�������

��� � ������ ���������� �������� �� �� ���������

����!�� ���� �� ����7 �� ��� �� ��������� ���

���������� �8��� ���� ���� ����� ���� ��� � ��

������� �� � ������ �� �� � ��#��!�" '�

��� �� �� ���� �������� �� ���������� �� � ��!

�������� ��� � ��� �� ���� �#�� 3������� �� ����!�� �� �������� ������! ��� � � ��� �!�$ �� �������! ������ �� �������� ��� ������ ����

������ ��� �� �������� �� ��� �� ��8 �+6

�/��4� ����� �� ������ �� �� ������� �� ������

ccepted 22 June 2001�

Aquaculture, Ltd, N-9291 Tromsø, Norway

, Spainber: 108896/1203 CT94 2283

���9:��#�� ��

� �������� � ������� ����� � �����

���� ��� ���������� �� ��������� �������# '� ������� �< �� �� .����� � ������ ��� �� �� ��

������ ���� +#$ �� /#"#�$!�5

,� ������� ��� ������������� ��� ����� �����

����� ����� ����� ���� ���� ������ �� =��� �

����� ���# '�� �� ������ �������� �����

�� � ����� ��� � �� �� �� ����� �����! ������!

� ������ ��� ���� ����� ���#�� >������ ��

����� � ��;�� ������ ��������� �� ������ ������

��� �� �� ���� ��! ��� �� ��� ���� ����������

�� � ������� ��� ����� ��� � ���� ��� ���

��� ��������! �� �������� �� ������ ��� �� ����! ��

������� ����� ���#

2��� � ������ �� �� .����� �����! ��� ������ �

�8��� �� � �� ��� ��������� �����=��� �� �����

������������ ���! ����7 ���! ������ ��� �

����� ����� ���� �� ������� ����� � ���� ���

������# 2����� �� � �� �� ������ �� �� ������

������ � �8��� ��� �� ������� �8��� �� ��

������ ���� � ��� ��� �� ��# 3�����! ����� �����

��� � ������ �� ����� =��� � ��������� � � ��

��� ���� � ������� ��� ������� ������#

?��� �� ������� �� ��� ����������� �� ���

���� ���! ��� �� ���� ������ �� ����������� ��

��� ���� ������ ���� ����� ���� ������ �� �

�� �� ������ ������ ��� ������ �� �� �� ����

�������# '� ����� ���� ��� ������� �� ����

��� �� ��� ���� ���������� �� � �� ������� ��

.����� ��� ������� �������# -�� ��� ���������

����� ����������� � ����������� �� � ��

(������ ��� �� �� �������� ������� �� �������

���� � ���� �� ���� �������� ���������# '� ��� ��

������ ��� �� ��� �� � ������ �� 242�3.?@

������� �� �� ������� ������ ����� ������ �� �

�� �� ��� ��������� ���� �����.����� ����� ����

������ ���� ����� ������ �# &�� ��������� ���

��� �� �� ����� �� ���������� �� ���������# A

��� ���� �� � �� ���� ���������� ���� ���������

��� ���� � �� ������ ���������� �� .����� ���

������� �������#

Figure 1. Schematic representation of Pandalus borealis showing the area(cross-hatched) where samples were taken. Muscle samples fromPenaeus japonicus and Penaeus monodon were taken at the samelocation.

MATERIALS AND METHODSAnimal samples� ������ �� ��� � 5� ����� ����� ��� �� �� ���

�� ������� ��� �� 2������ ����� �� B � ���

�������� ���� �� ��# � ������� ��� � ������ ��� � "� ��� ��� ����� ����� �������� ���

�� ���� �� "/°, ��� �� ��� �� B � ��

�������� �� ��� ����# &������� ���� ����

)�� �� ���������* �� �������� � ���� ��

����� ��� � ��� �� �� ����� �������� � ��

��� � �! �� ����� �� >�� �! �� ������ �� �����! ���

���� ��� ����������� � � �� ������ (���������

�� ������� ���# '� (��������� �� �������

�� � ������ ���� ��� �� ����� �� �� ��� 5! ��! "$!

$/! +"! � ��� �"�� ��� �� � ������� ��� � �������� ��� �� �������� ��� ��! ""! $�! +� ��� "�#

@���� � ������! ��� � ������� ��� ��� � ������ ������ ��� ��� ������ �����# &� ��������! ��

�"��

���������! �� � ��� ���������� � � ��� �� �� �

���� �� �� �� ���������#

Extraction of muscle proteins'� ��� ����� � ��� ������ � � �� ��# .���

����� �� �� ��! ��� � ����� �� �� �����

� ��� �� (���� ��� ��� ����� �� ��

@������� � � ���� 5��� �� �� �� ������ <"-#

'� ������� �� ������ ��� ����� ��� �� � ��

�� ������ �� ��� 5��� �� �������# '� � ���

������� ���������� �� ���� (������ �� ���������

�� �� � ��! �� �����(����� 7 � �� � �� ���

��� ����� ��� ���� ��� �� (������ �� ����� ��

�"�°,# '� �< �� �� ���� (������ ��� ��� �� ��

�������� � ���� ���� �< ��������� ����#

'� ��� ��� ����������� � (������ �� ���

����� ������� �� ������� ������� �� �C.��� ����� �+ '� �� ��� �� �� �� � �� ���� �� ����

(��������! 5��� �� � ������ �� ���� )"��1 ��,!

��1 @?'.! �5�1 1�,"! 5�1 ������������!

"���1 ��������� ����� = ����! �#$�1

��3-$<" ��� �#��1 ��"3-$<! �< �#5* ��� ����#

'� ������� �� ������ ��� ����� ��� ������ ��

��� 5��� �� �������# '� � ��������� ����������

�� ��������� � ������ (������ �� ���������

�� �� � �� ��� �� �����(����� 7 � �� � ��

������ ����� ��� ����# '� �� �������� ���!

5��� �� � �������� �� ���� )5�1 @?'.! �5�1

1�,"! 5�1 ������������! "���1 ���������

� ����� = ���� ��� ����1 ��$3"-+! �< /#5*

��� ����# '� ������� �� ����� ������ ��� �����

��� ������ �� ��� 5��� �� �������# '� � ���

������� ���������� �� ����������� � ������

(������ �� ��������� �� �� � �� ��� ��

�����(����� 7 � �� � �� ������ ����� ���

����# . �� (������ �� ����� �� �"�°, ���

������# '� ��� � ��� �� (������ �� ���� � �

����� � �� ������ �7 � � (��������#

'� ������ ������ �� �� (������ �� �� ����

����� ��� ������� �� ���� ������ ������ ��

"/��� ���� �� ������������ )�"/�* �� �� �

)�������� ������� �� � � ���������*# >�� 242�

3.?@ �� (������ �� �� �� ���� D���� � ����/

)"��� �� �����! 5�� �� ��������������!

$/� �� 242 ��� �"5�1 '����<,! ��1 @4'.!

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

Figure 2. pH values of water extracts from muscle of Pandalus borealis(full diamonds), Penaeus japonicus (open squares) and Penaeus monodon(crosses) immediately after death and until 92h of ice-storage. Each pointis the average�standard deviation of individual determinations in threeshrimps.

3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������

�< �#/* �� � ������������ �� �#"�� ������ ���!���� ��� 5��� ��� ����� ���8�#

SDS-PAGE@����������� ��� ������� ��������� ��

D�����/ �� ���� �$������� �� /�������

)���� ��*! �#5�� ����� ��� ��# '� �������� �

�������� 5�� �� �������� ��� �#�� �� �����8������������! ����� �� ��������� � �������� ��

�5�� �� �������� ��� �#/+� �� �����8�� �����������#� !"� .�� � ��� �� ������ ��� ���� ���� ��

�� ��� ����������� ��� ������ � � �� "��. ��

��� )�$�������* �� �� � �������� �5�E )/�������*# '� �� �� �����������"� ��� ����

���� ��� ���� �� ������# '� ������ ��

��� �� ������� � �� � �� ���� �����# '�

�� �� ����� ��������� �� ���� (������ �� ����

� ������! ��� � ������� ��� ��� � ���� ���

��� ������ �����#

Two-dimensional electrophoretic analysis'������������ )"4* ����������� ������� ���

������ � � �� �� ���� ����������� � (������#

'� ���� ��������! �������� ��� ���� )&@>*! ���

������� ��������� �� -C>���"" �� ������#5��

�� ������� ��� �� ���������� ��� �� ������

���! �#/� �� �����8�� ����������"� ��� "�� ��

2����� &��4�� )���� �6�� ����� �� �� 56+ ����*#

. 5�� ��� �� �� ���� ������ ��� ���� ���� ��

����# &@> ��� ������� ��� ��� � +"��E�# '� ����

�� (�� ��! ���=� 7 ������� �� �"#5�1 '����

<, )�< �#/*! "�� �� 242! 5�� �� ����������

����� ��� ���� �� ����� ���������� ������

���� � ! ��� ���� �������� ���� ���� ��

�������������� ��� �� �� ����� ���8� �� �"�°,��� ��� �������#

'� ����� �������� )242�3.?@* ��� ���

����� �� ������� ���� �� �$������� ��# .

��(� � �� ��� �� �! ��������� ��� ���������� �

� ��� ��� ��� ������ �� "4 ����������� ���

���������� � �����#

Immunoblotting'� ������ ������ �� ��� (����� ��� �������

������������� �� ������� ���� �� 0��F�� ����

��� �� )+���/��! �#5�� �����* �� � ��������

�5�E ��� ��# . ��� ��� �� �� ���� ������ ���

���� �� �� ���� �� ��� �����1<, ���������������

���! ��� ���� �� ��� ���� �����1<, ��� �����

��������� ����������������# '�� �� �� � � ��� ����������# .��� �����������! �� � ��� ������

���� ,������� 0������ 0 F�"5�! ����� ��

������� �� �� ����� � �� ��������� ����

������ �� ��������� �� '����� �� ��"� ���� �

0��F�� ���� ������� ��� �� ���E ��� 5����# '�

������� � ��� �������� �� �� 242! 5��1 '���!

�/��1 ����� ��� "��� �� �����# '� ������

� �� ���� �� ����� ���� �������� � ���

���� )���1 �������� � ���! "#+�1 G, ���

��+�1 ��,! �< +#$* ���������� 5�� �� ������

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

������ ��� ��� ��# '� ���� �� ��� ���� ��� ��

�� ��� � 5�� �� �� � ������� ������� ������ �

�����.����� ����� ���� ���� 1<, ���� �� ��

������� �� 1�����8 ��� 3�����#"$ 1�������

���� ��������� )2���� .�5�$$* ��� �� ��������� ��

�� ����� ������ �� �� ��� ���� ��# 2�������

��������� �� ���(�������� ���� �����������

&�? )2���� .���5$* ��� ������ ������� � &�?

)2���� .� �$$* ��������# 4������ ��� ������

���� &0& @�8�������� A� )G���� &����������

0����������� &��*#

Electrophoresis of native myosin isoforms@����������� ��� ������� ��������� �� �C.��� ����"5 ��� <�� �� ��"� ���� �� ������������ �������

�� 1�����8 �� ��� "+ '� � � ����� � ��� ��������

"��1 ��$3"-+ )�< /#5*! 5�1 1�,"! ���� ��

����� ��� �#5� �� ��������������# '� �����

����� )�����#5��* �� �������� $�� �� ����

�������� )� � �� �������� ��� �� �� �����8������������*# .�� � +�� �� ���� ������ ��� ����

�� ��� ���# 1����� ���� ��� ��������� � �� ���

�� �� �� ������ ��������# @����������� ���

������ � � �� � �������� ����� �� �E ��� � �� �

������ � ���� � ��� �"°,#"+

.��� ����������� �� �� �� ���=� ������ ���

"��� ���� ,������� 0������ 0 F�"5�! ���

������� ���� ������ ���� ��� �� ������ �����

���������� �� ����� ������ ���� �����# '�

����� �� � �! 7 ������� ��� ����� �� D����

� ����/ ��� ���� �� �� ���� �� �� �#+5��

����� ���� ��# '� �� ��� �� ��� ����������� ��

���� �� ��� �� ����� �������� )242�3.?@*

������� ����� ��� �� � � �� � �������� �+5E ���

��� � �� ��� �����������#"�

RESULTS'� �< �� � �� �� ���� (������ �� � ������� ���� ���� �� ����� �� >�� "# 2��� �� �< ���������

���� ��� ������� �� �� ������� �� ����� �� ����!

� �� ��� �� ��� � �� �< �� � �� � ������

�"��

Figure 3. SDS-150g l�1 PAGE of water extracts, low-salt extracts andhigh-salt extracts of (A) Pandalus borealis, (B) Penaeus japonicus and(C) Penaeus monodon. P borealis had been stored in ice for (a) 0, (b) 5,(c) 16, (d) 24, (e) 48, (f) 72, (g) 96 and (h) 120h before extraction.P japonicus and P monodon had been stored in ice for (a) 0, (c) 16, (d) 22,(e) 43, (f) 71 and (g) 92h before extraction. Lane S: Pharmacia’s low-molecular-weight calibration kit, with bands of (from top to bottom) 94, 67,43, 30, 20.1 and 14.4kDa. M, MHC; Ac, actin; T, tropomyosin. Thearrowheads, asterisk and bracket indicate bands referred to in the text.

� �������� � ������� ����� � �����

(������# '����� �� ���� ����� ��������� �� �

����� � (������ � ���� ����� � ������ ��� ��

�������� ��� 5��# '� � ������ �� �� ����

(������ ������ ���� �� ����� ��� �� ��8 ���

�� �� ���� ���� �� � �� ����� �� ���� ���� ��

����� ������ �� �� ����� �����#�$� ���� ���

�� ���� ������ �< �� ! ����� �� � ������� ���� ������! ��� ���� "/� �� ���������! � ������ ����� ������ �< �� �� �# A�� �� ���� (������ ��

�� ��� ������� ����� ��� �� ���� ���(�� � ��

�< +#� ���� ��� � $/� �� ��������� ��� �����

�������� �������! �� �< �� �� �� ���� (������

���� �������� � ������ ������ � �� ������ ����

$/ �� 5��#

'� �� �� �� 242�3.?@ �� �� �����! �������

��� ����������� � ��������� �� ����� �� >�� �# >��

� ������ )>�� �.* �� ����� ��� ��������� �

(������ ������ � ��� ������ 7 ������� ������

�����������# -� �� �� ���� �������� ��� �� ���

�� ����� �� � ���� �� ����� �� ��� �� ��8

��� � ����4� �� � �� (������! �� �� ��� ���

������� )��� ���� � ������ �� >�� �.*# '��

����� ��� � ������� ������� ���� �����������

������ �! �� ����� �� >�� $ ��� ��� ���� �

������# -�� �� ��� ����� �� �� ���� �� ����� ��

>�� $! ��� � ��� �� �� ���� ������� ����� ��

���# -� ���� �� ��� � �+�4� ������ �� 242�

3.?@ ������� )��� ���� �� �������� �� >�� �*!

����� ��� ����� �� �� ��� �� ���� �� � ��

���������! ��������� ���������� ���� ���������

������ ��� ��� ��� ������� ���� "$� �� ���

������# '�� ���� ������ ����� �� ��� � 5��4�

)��� ���� �� ������� �� >�� �.* ��� � ����

������ � ���� ������# '� ��� ���� ��� �����

�� ��� � �� "$�# ,����������� ���� �� ����

�������� �� ���� ����! �� �������� �� �� ���

���� �������� �� ��� ����� �� ����� ��� ���

� ���� �� ���� 5� �� ���������! �� ��� �� ���� �

��(�� � �� ��� � "$� ��� ��� ��� �������� ������

�� �����#

'� ����� ��� ��������� � ��������� �� � ������� ��� � ���� ������ �� ��� ����� ����

�� ������������ (������ �� � ������# &� �� ������������! ��� 1<, ���������� ��� ������ ��

���� "� �� ���������! �� ������� �� �� ��� ���

���� ���� ��������� ������ ���� ����� ������ � )>��

$*#

'� ���������� �� ������ ��� ������� �� ������� �� ������ � ��������� �� ���� ��� ��

����������� ��� ����� ���������� ��� � ���

� ��7 �� 242�3.?@ ������� �� �� ����� �� �

���������� ����� ���������� )>�� 5*# >�� 5. �� �

�������� ����������� �� �� ����� �� ���� � �

� �# >�� 50 ����� �� ��� ���� �� �� 242�3.?@

� ��� �� (���� ����� 1! � ��� � �� >�� 5. ��

����# 0��� 1 �������� ����� ������ ��� � ��

������ 1<,! ��� ����� � ��� � �������� ������

��� � ���� ������ 1<,! � ������ �� �� ����

���� ����� � ��� � ������ ��� ���� �" ��� "$� ��

��������� �������� ��� ���� �������� �������

�"�"

���� ���# '��� ������� ��� ��� ������� �� ��

��������� �������! ��� � �� ��� 1<, �����

������ ��� ������ �� ��� ����� �� 242�3.?@#

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

Figure 4. Immunoreactivities of high-salt-soluble extracts of Pandalusborealis, Penaeus japonicus and Penaeus monodon resolved bySDS-150g l�1 PAGE with rabbit anti-Arctic charr fast MHC antiserum. Thenumber at the top of each lane indicates the hours of ice-storage. M, MHCband. The bracket indicates degradation fragments from MHC (see text).

3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������

"4 ����������� �� �� ����������� � (������

���� � ������ )>�� �* ���� �� ����� �� ���

�� ����������� ������� ��� ���� ����� �����# '�

�+�4� ������ ���� )������ �� >�� �* ��� � �& ��

Figure 5. (A) Schematic representation of native myosin isoforms after a9h run. From top to bottom the samples were rat diaphragm (used asstandard) and high-salt-soluble extracts of Pandalus borealis after 0, 5, 12,24, 72 and 120h of ice-storage respectively. M, bands corresponding to thenative myosin isoforms of P borealis; a and b, additional, faster-migratingbands noticed only after 12 and 24h respectively of ice-storage.(B) SDS-150g l�1 PAGE of electrophoretically isolated bands M, a and b,as indicated on top of the lanes. The arrowhead indicates the MHC band.The arrow indicates proteolytic fragments. Lane S: Pharmacia’slow-molecular-weight standards. Only the upper part of the gel is shown.

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

��� � 5#�! ��� ������ ���� �����# &� ��� �������� ��

���� � ��� 5� �� ���������! ��� ��� �� ������

���� ��������� ��� ��� �� ��������� ���� "$

��� $/� �� ���������# '� ��� ����� ��� ����

������ ��� �� �������� �� �� "4 �� ����� �� >�� �

�� �� � �� ���� ������� ��� �� �� ��� �����

��� ���� �� ������� �� >�� �# '� ���� �� �����

������� ��� �� ���� )��� ���� �� ����� �� >��

�* ��������� ���� ��������� ������ ���! ��� ��

��� ���� �� 242�3.?@ �� ���������� �� �� ���

��� ����� �� �� "4 ��� �� �������� �� ���� �����

������� ���� ��������� ������ ���! ������ ����

�� �� ���� ������ �� )��� ���� � ���� �����*#

'� "4 ������� �� � ������� ��� � ���� )>��+* �� ��� ������ �� ��� ���� ��� ������� ���� �������� �� �������� �� �� �+�4� ������ ����

)������ �� >�� +* ��� ��� ���� � �������� ������

���� ��������� ������ ���# -� ����! ��� ����

�� �������� �� >�� +! ��� ��������� �� �� ����

��� ��� ����� �� �� ��� ����� �� ��� � 5��4� ��

� ������ ����� �� >�� � ����� �� ��� �������� )�

��� �� ���� ��� �&* �� �� "4 ��# '��� ����!

��� �� � ��! �� ������ �� �� � ������������

�� >�� +�! � � ����� ����� �� �� �� �! �������

����� �� �������� �� �� ��� �� �� ������ ����#

.� �� � ������! ��� �� ���� ����� �����! � �

����������� ��� �� ���� ���� ��� ����� ��������

�� �& �� �� ��������� �������#

'� ����� �� ��������� �� �� ����������� �

(������ ��� ������� �� ��� ��� �����������# '� �

�� �� ���� ��! ��� ���� �� ��� ������ ��

�������� ���� ���� ���� �����1<, ������ � ���

�������������� ��������� )>�� /�*! �� ����� �����

������� �� ���� �������� ����������� �� �������!

��� ��� ��� ���� �������������� ��������� �� ����

��������� ��� )>�� /�*# 0���� ������� ���� �����1<,

������ � �� ��� ���� � ������! ��� �����

������������ �� ��������� ���� �� �������� )���

���(���� ��� �� ���� +�4�*# .� �� ��� ��

����! ��� �������������� ������������� ����� ��

������ �� � ������! ��� �� ���� ��� ����

����� ���� "$�! ��� �� ��� ���� �� � ����� �

��������� �� �� ���� )� � ��� �� �� �� �* ����

+"� �� ���������# &� ��������! ��� �� ��������������������������� ���� ��� ����� �� �� ���������

�� � (������ �� � ������� �� ���� "� �� ���

������# '� ����������� ������� �� ���� ���� ���

������ �� ���� �� �� ��������� ������� ������

������� ���� �� � ������#

DISCUSSION'� ����� �� �� �� ����� ���� �� ���� ����

�� ����� �������� ����� �� ���� �� ����� ����

���������� ���� ������� �8���! ���� �� �������

�������� ����� �� ������� � �� �� �� ����� �����#

'� ��� ���� �< �� � �� ������ � ��� ���

�� ������ ����� ���!�$!�5 ��� �� ������� ��

�� ���� �� � ��� �� �� ����� ���� +#�# >���

� ��! �� �� ���� ����! ���� ����� �� �

�"��

Figure 6. Two-dimensionalelectrophoresis of high-salt-solublemuscle proteins of Pandalus borealis.First dimension, IEF, from left (basic) toright (acidic). Second dimension,SDS-150g l�1 PAGE, from top tobottom. The shrimps had been storedon ice for (a) 0, (b) 5, (c) 16, (d) 24,(e) 48 and (f) 72h. A, actin; T,tropomyosin. The arrows, arrowheadsand circles indicate spots referred to inthe text.

� �������� � ������� ����� � �����

���� �< +#�"/6�� � ���� �� ����# '� �� �<

�� � �� ��� � �� � �� ��� ��� ���� � ������

��� ������� ����������# D������ �� ���������

������� �� �� �< �� �! � �� ����������� ��

������� �� ����� ����� ���� �� ���# 2��� � ��������� �� ���� ����� �< �� � ����� ���� �� ����

��� ������� �����! ��� ������ �� ��������� ��� �

� (���� �� � ������������� ������#

A ����� ��� 1<, ����� �� �� ���������

�� � (������ �� �� ��� �����! �� �� ���

��� ������� ��# -�� �� ��� ����� �� � �������!����� �� �� ��� ���� ������ ���� �� ��� ��

����! �� ������� �� >�� �# '� ����� ������ �

�� �� �� �� ����� �� ��������� �� �� 1<,

���� ��� �� ���� ������� �� ����������� ��#

<����! �� ��� ����� �� ���� ����� � ���� ��

������� ��� �� �� ������������� ����� �# &� ��

������ ���� �� ��������������� ���� ��� ��������

���� ��������� ���������� �� �� ��������������

����! � � � ��� ��� ���� � ����� �� �� ��� ��

�� �� ��� ���� ����������� ���� �� ������ �� ��

��� �� �� �� ��� ����# A ����� ��� ���� ���

��� ����� ������ ��� ������� 1<, ��������! ��

�"�$

��� �� ����� �� � �� ��� �� ����� � ���!�� ���

���� ���� �������� � ���� � ������ ��� ��

��������� ���������� � ���� ���������! �� �����

�� �� ������ �� �� �������� �� ����� �� ��� ��

���� ���� /� ��� ����4� �� � ������# 2�� ��

��� �����! �����! ��� ������ ����������#

3��������� �� � ��������� ������ ��� ����

����� �� ����� ��� �� �� ����� ����� �� ����

��������� � ���!�"6�$ ��� ���� �� �������!�56�+

�� ����� �� ��� � ��� �� ��8 �� ��5! ��� �� ����4�!

������� �� �� �������#�5!�+ '�� �� �� ������ ��

�� ���������� ��� ��������� ��� ������ ���

�� ������ �� � ������� � �� ������ �� 1<,#�/

'����� ��������������� ���� �����1<, ������ �

�� � ����������# <����! �� ���� �� ����� �� ���

�����! ������ ���� �� ��� ���� � ����� ��

�������� �� ��1<, ����! �� � �� �� ��� �� ������

��������� �� � ���������� ���������� ���� ���� �����

1<, ������ � �� � ������� ��� � ����!� ����� ���� ��� �� ����� ���������� ��������

�� 1<,! �� ������ ���� ����� � ����� ��

�������#��!�$

'� �+�4� ���� ��� ��� �� � � �;�� ��

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������

��������� � ���� ��������� �� � ������ � � ��� �� � ������� �� � ����# &� �� �����! �� � �

������! �� � ����� ����� �� "4 ������� ��

�� ������ � ���! � ��� ���� �� ������� ���� ����

�� ���������� ���� � � ��� ������� �� ���� ���

� ��� ) �� �����*! ��� ���������! �� � ���

���������� � )>�� �* ��� �� ��� ���� � ��� ��

�� ��� ����� ��� �����!� ��� ���� � ����� "4

������� �� � �� (������ ���� ������!$� � ���

����� � ��$� ��� �� � ���������� �#$" -�� ��

�� "4 ������� �� .����� ����� ������ )���"������

Figure 7. Two-dimensionalelectrophoresis of high-salt-solublemuscle proteins of (a, b) Penaeusjaponicus, (c, d) Penaeus monodonand (e) mixture of high-salt-solubleextracts from rat diaphragm, soleusand gastrocnemius muscles. Firstdimension, IEF, from left (basic) to right(acidic). Second dimension,SDS-150g l�1 PAGE, from top tobottom. The shrimps had been storedon ice for (a, c) 0 and (b, d) 92h.A, actin; T, tropomyosin. Thearrowheads and circles indicate spotsreferred to in the text. Part (e) is afull-size gel, and the square indicatesthe part of the gel shown in Figs 6a–6fand 7a–7d.

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

�������* ��� � ���� ���� ������ ��� �� ���� ��� �&

������#$� '��� �������� ���� ���������� ����

������ ���� �������� ��� �� ��� �� ���� ������

�� �� �������� ���# '� ��� �� ���� �� ���� ����

����� ������ ������ ���� �� �� ���! � � ��� ��� �&�

��� �� � �� ��� ��� � �& �� �����(����� 5#$$"

��� �� ��� ����� ���� �����! �� ����� ���� ��� ��

������� �& �� ��� � 5#�! ��� ������ ���� �����# '���

���� ��� ������ � ���������� ������� �� � ������

��� �������� ������ �� � ��� ������# '� ����

���� �� ��� ����� �� � ��� ����� �� �� ��� ��

�"�5

Figure 8. (a) SDS-150g l�1 PAGE and Coomassie Brilliant Blue R-250staining of high-salt-soluble protein extracts of muscle from Penaeusjaponicus and Pandalus borealis stored on ice for various periods(indicated in hours at the top of each lane). Lane S: Pharmacia’slow-molecular-weight standards. (b, c) Immunoreactivities of the sameextracts with (b) both rabbit anti-Arctic charr fast MHC antiserum andmouse anti-�-actinin IgM and (c) mouse anti-�-actinin IgM only. M, MHC.The bracket indicates bands reacting with anti-fast MHC antiserum. Thearrowhead indicates bands reacting with anti-�-actinin IgM.

� �������� � ������� ����� � �����

���� ��� ��������� ��� �� � ������ ��� � ��� ���� ���� �� ��� ������ � ������ ������������� ��

������ � ���#

.� �� �� ������� �� �� ���� ��� ����� �� ���

� �� ���� �� ��� � 5��4� )>�� �*! �� ����� ���

���� ����� ����� � �����! �� ���������� ����

� ����� "4 ������� �� � �� (������ �� � ���!$�

�� �$" ��� .������ ����� )���� ����*#$$ &� ����

������������ �� ������! ��� ����� �� � ��� �

���� ������ �� ��� ���� ����������� � ����

��������� �� ��� �� �� ��� ������ �����! �� ���

�� � �� ��� �� ��� � � ��� �� ����� � ���#$5

A ��� ��� �� �� �� ������� �� ���� ���

5��4� )>�� �* ����� ���� ��� � �� � ������# &� ���

�� ��� ��� ���� �� ��� ���� ����� � � ����������

������� �� �� ����� �� ����� �� ���� ������ �&

�� � ��� ���� ����������� ������ ��� ����� ��

�������� ��������# '� ��� ��� �� �������� ���

����������� �� ��� ����� � ���� ��������� ���

�������� ������ �� ���� �� �� �� � ����� � ����!�$

���� �� �� ������� �� �� ������ �� ��8 ���

����� �����$� ��� �� ����� � ����� �� ����

���� �� ����� ����� �� �� ���# '��� ���� ����

��� ����� ��� � �� �� ������ �� ������ ��

������� �� � ������ �� H���� �� ��C# &������

������ ������ � �� ������ �� ������ �� ��

������ ������!�$ ��� ������ ��� ������ ������

�� � �=�� �� 7 ���� �� �� ������� ���� ���� ��

��� ���������� H���� ���� ���� �C#

��.������ ��� �� ����� �� � ����� ���� ��

I����� � ���� ��� ���� ����� �� ��� � ���$+6$

����� �� �� ���� ������ �� �� �� ,�"� ����

����5� ��� �� ������ �� ������#5� '� ����� ���

2��5� �� �� ���� ���� ������ �� � ��� ���������!���� � ��� �� ���� �� ����4�! ����� � ���������

���� �� �������� ��� ��� ����� �� �������� ��

���� � ������� �� ��4�# '��� �� �� �� ��

(���� �� ����� �� ��� �������������� ������

�"��

������� �����! �� ��� �� ����� ��� �� ��� ���

��4� ��������! �� � � ��� ��� ����� �� �������# ��.������ �������� �� ��������� ��� ��

����� �� � ������������!$/ ����� �� �������

��� ��� .����� � ������ ����� �� � � ���

� ������ ����� )��� ����� �� ����� ����

����� ���� ����! ��� ��� �� ��4� ��������������������������� ���� ������ ���� ������ ����

"$� �� ��������� ��� ����� ������ ���� +"�*!

������� � ������� ��� ��� )�� ��������� ���

���� )����4�* �������������� ������������� ����

�� � � ���� ����� ���� "� �� ���������*#

'� ������������ ��� ������� ����� �� �� ����

���� �� ��� ���� �� ��������� ��� ����������

�8���#5"655 <����! � �� ��� ������ � ��

��������� ���������� ������ �� ���� ���� ��

������������� ���� �������� ������� �� �������

�8���# &� ������ � (����� ���� �� ��� ����

���� �� ������� �� �������� �� ����� �� ����!

���� �� ������� ���� ��� �� � ��� ��� �� ����

��� �� �� ������# .� �������� (�������� ��� � ��

�� ���� ���� �� � ��� �� �� ������� �� ���� �� ����

,�"��������5�!5+ )��� �� �����! �� ��������!

�������� ����� ��������� �������5/* ��� ,�"����������5 6�$ ��������� �8��� ��� ���� ����

�8��� �� ������� ������ �� ������ �� �� ��� ��

����� ������ � �� �� ��������� �� ��� � �°, ��

.����� ����� ��� �� ��� � "/°, �� ������� �����#

'�����! ��� ��������� ��� ����������� �������

�� �������� �� ���������� �8���! �� ����� ��� ���

���������� ���� �� ������������ ���# .���������!

��������� ���������� ��� ��� ��� �� � ����� ���

� ���� ��� ������ �� .����� ����� ���� � ���� ���

������ �� ������ �� ������� �����# 1 ��

������� �� � �� ����� ������ �� �< ����

��� �� �� �� ���� (������# 2��� ���� �� ���

��� �������� (������ �������� @?'.! �� ��������� ��

,�"���������� �������!$+!5+ �� �� ��� ���� ���� ��

�� ���������� ������ �� �� 8������ ����� �� ������� )����� ��� ���� � ������ �� >�� �.*

��� ��� � ���� �� ��� ������� �� ����� � � ��

���� (��������#

&� � �����! �� ��� ���� ���������� � ���� ���

������ ��� �� � ������ ������� �� �� .�����

���� �� �� ������� ������ ��� �� �� .����� �����

��������� ������ ���������� )������ ��� �� �����

���� ���� �� ������� �� � �� �� ������ ���

�������* � ����� ����� � �� �������! �������

��� ���������� �� �� ������� ����� ��� �� � ��

� �� �� ����� ��� ������� �������� �� ��

����� ������� ���� �� ����� ����� �������

���� )"/°,* ��� ������ )�°,* ������ ��# '�

������ � ���� ��������� �� ������� ����� �����

������ � ���� �=��� �� ������ �� ����

��� �#

ACKNOWLEDGEMENTSA ���� �� (���� � � ������ � �� 4� .�� 0����

)4����� &����� � ��� >������ F�����! D�����!

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������

4�����* ��� 0� � ?������� )J ����� 4�����

��� �� 3������ &�� �����! 0������! . ������* ���

��������� �� ����� �� � ������� ��� � ���� ��� �� �� �������� �� ����� � � �� ������ (���������

���� ��� �����# '� �������� F����� ,� ���

�� ����� � ��������� ��� ������� � ����� �� ��

���;�� ��// �9�"�! ��� �� @ ����� ,��� ����

��� �������� �� (����� ����� �� 4� 1����

,���� �� �� �������� &����� � �� >������ ���

.7 �� � � �� ���� �� �� ,������ .����� .&F�

,' $ ""/� H@�� ����� �� >��� >������C#

REFERENCES� 4�������� �� >������! D������ ����������K�������� ������

� �6� # ������� #��� ���5 )"���*#

" �������� 2����� @(���� ,� ���! .L ������������ 4����

� # $������"����� � ���� %������! � �+ )� *#

� 2M�� F!1�;N�������# ������ � &�"��� �'����� (! &����� � ��

1���� F�����! 0��� )� +*#

$ 0���� <.! 3������ 04 ��� ?������� 0! D�� ��������� ��

����� ��� ������ ���� . ������K� � �� ������ ��� ������

����� �� ����������� ��� �� ���! �� ����� �� ����� �

�����! @� �� D �� B0! 0N���� ' ��� -������O�� B!

@���� 2���� 3 ������! .�������! �� +�6/5 )� +*#

5 0�� 1! P���� < ��� Q������� <! 3�������� ���������

������ �� � �� �� )������� ����������� � ���� ������#

�������� ��� ���$/"6$/� )� /*#

� >��� ?B ��� D�� F'! 3��������� ��������� ������ ��

�� � �� �� �� ? � ������! ������� �������# � �� ���

&!��� 6��� )� +"*#

+ 1��� ���� 1 ��� Q������� <! 2� ��� �� ������������ ��

� � �� ����� � ��# *���� ������ #�������� �!�"�"�6

"�"� )� �*#

/ Q������� < ��� 2������ F! 3��������� ��������� ������

�� �� � �� �� �� B����� ����� ����� � ���� ������#

�������� ��� ���/"�6/"$ )� �*#

D� 2�! 3 ��� ������ �� ����� ������ � ���� ������ �� ����

�� �������# � �� ��� �&�$$"6$$$ )� /*#

�� D������4E! ����� ���� ����� ������ �� �� ����� ������!

������� �������# ���� )��� !��""�6"�� )� +�*#

�� 0��������� @2! ���AG ���1�� B<! 3����� ���������8����� ��

� �� � �8�� (����� ���� �� �������� ����� ���!

������� ��������# � �� ��� �"��$ $6�$ 5 )� /$*#

�" ��� AG! D�� ,Q ��� 1�� B<! 3����� ���������8����� �� �

���������� �8�� �������� ���� �� ������������ �� ��

�������� �����! ���������� ��������# � �� ���

�#���/+6��// )� /5*#

�� 3������� �� D2! 2���� 20! A�� 'D ��� >��� ?! 1 ��

������ �� �� ������ �� �������� ������! �����������

�������� � ���� ��� ������# � �� ��� �����"56��"/! ��5+

)� / *#

�$ 1�����8 & ��� D� ���8�� G! @���� �� ������ ���������� �� ��

������ ������ �� �� ������ �������� ������! �� ������ ���

��� �� � ��� ����� ��������� �� �� ����������� ���!

��"��� ����� �+������! @� �� 0���� .! 4���� , ���

. ���� 0! '� ������� 2����� ,���! . ������! 0������!

�� �"�6�"/ )� +*#

�5 E������� <! .������� ����� �� ���# ���� ,�� -./ )� //*#

�� G���� 2 ��� Q���� ��� G! '� =��� � ��������� �� ��� ���

�����! �� ������+ ��� )��������+ � ����� �� ������!

@� �� 1����� F@! >��� ?B! <���� ,@ ��� A��� 4F! .E&

3 �������! A������! ,'! �� ��+6$�$ )� /"*#

�+ 4C.��� .! B����� , ��� 0R��� BB! ,��������� �� ������� ����

�� ������ � �� �� �� � ���! �� � ��� � ��� ���#

3������� �� ���������� �������� �� �� � ��� � ��#

$� � )����� ����" �6" � )� /�*#

�/ D���� PG! ,���� �� ��� �� �� ������� � ���� ��

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

������ �� �� ��� �� ����������� '$# *���� ��!��/�6

�/5 )� +�*#

� .������ ,A! 0� � 3F ��� ?����� F>! 3�������� ��

������� � "���� �� �������# � 0�� ���$�"6$"� )� +�*#

"� <���������� 4! 3��������� . ��� 1��� ,! 4������ ��

����������� �� ���� ������ �� ��������� �� �������

��� ���� ������� �� ���� ��������# ���� )����� �!&�$�"6

$"� )� //*#

"� .����� A! >��� ��� ��8����� �� ������ ����� �� �����������

�� ������� � ���������� ��� ���� ������! �� $����������

12(! @� �� 2��������4!A��� � ?� ���! 0���! �� "�56"$"

)� /�*#

"" -C>��� 3<! <��� ��� ���� ������������� �����������

�� �������# � )�� ��� ��#�$��+6$�"� )� +5*#

"� '����� <! 2����� ' ��� ?����� B! @����������� ������� ��

������� ���� ����������� �� �� ������ �� �����

����� � ��� ��� �����������# �� *��� ���� ��� -��

!��$�5�6$�5$ )� + *#

"$ 1�����8 & ��� 3����� ?A! '����� ����� �� ������� �

����������� �� ������ ���� ����� �������� �� �� ���� � ��

�� .����� �����! ���"������ �������# )���� ��� ������� �+��+

��/ 6 5 )� "*#

"5 4C.��� .! 3������� , ��� 0R��� BB! .� ����������� �� ��

�� ����� ������ ����8��� ��� ���� � � ��� ������# $� �

)����� ""�"��6"+" )� + *#

"� <�� B>Q! 1�?���� 3. ��� A��� F&! @����������� �������

�� � ��� ����� �� ������ �� ����������� ��� ����������

� ��� �� �� �����# )����� � ��!�/+6 5 )� +�*#

"+ 1�����8 &! -����� F ��� -�� FD! @����������� �� �� ��

������ �������� �� ���� � ��� �� ��� ���� ����# ��

)����� ��+��� "�9�""�6""+ )� �*#

"/ 4 ���;��� @! '(� � �� ��� � ��# � ��3��� ���� �#����6��/

)� + *#

" 1�����8 &! -����� F ��� @�� -! ,�������� �� ������

�������� �� ��� ���� ��� � ���� ���� �� � ���� 7 ����! ��

����� 4�����+ %����������! @� �� G���� 4@ ��� D����� B!

@���� 2���� 3 ������! .�������! �� �/ 6$�� )� /+*#

�� F ���� '! 1 �� �������� ��� 7 ���� �� ��� ��� ����� ���!

�� 4�����+ �������� �� ��� ���� ������+! @� �� < �� <<!

B������ 1 ��� D����� B! @���� 2���� 3 ������!

.�������! �� � 6"+ )� "*#

�� I��� ,! .�� ? ��� 0������ ?! @����� ��� ��� ������

���� �� ������� ����� =���� � ���# �� )����� ��+���

�#!9� �6 / )� $*#

�" 0 ��� 0! D � 0 ��� A������ D! '� ���������� �� �����

=���� � ��# � �� )�� !���5 6��+ )� +�*#

�� ,��� ,! 28���?��O���� .? ��� G�������B��� B! 3���������

��� �� ����� �� �� ���� H�����C � ���# &# 3���������

��� �� � ��� ������# � �� )�� ���""�6"�+ )� +�*#

�$ 2�����8 <! .����� >'! 3� >. ��� 0������ ?! 2 ���� ��

� �� �� �� ��� �� �� ����� ������� ��������� ���

� ��� �� ������ �� �� ���������� ������ �� ����� =����

� ���# ������ ��� ���/�6��� )� $*#

�5 1����� 1! .������� BB! 2�� F���R� 1! 1���� F ��� ,����

1! .������ �� ����������9�������������� ��# � )�� ���

�!#�$�+56$�/" )� 5*#

�� 1��� 4D! <�������� �� ��������� ������� �� ����� ����

��� ��� � ���� �������� �� ��������! ����������! ���

������ ���� ������ ������� �� � �������� ������ ��������#

� $3� 5� �&��"�6�" )� /5*#

�+ 2�� ��� Q! G��8��� � ��� 1�� ���� G! ,��������8����� ��

������ ��� ���������� ���� ������� ���� ��� ��� � ���#

�� )����� ��+��� ��&9���56��� )� �*#

�/ <��� 3@ ��� A������� F<! F����� �� �� ��� ��������� ���

������ ��� ���������� �� ���� �� � ��# )���+� �

!#�2P.15 )� �*#

� 1�����8 &! -����� F ��� -�� FD! 1����� �������� �� �� ���

���� � ��� �� ��� ����� ���� ����# � ������ ,�� ���

���� ���$/ 6$ 5 )� �*#

$� <���������� '! '������������ � ����������� �� ������

�"�+

� �������� � ������� ����� � �����

���� � �� ���� ������ �� �� �� ���� ��������# ����

)����� ��!�$$�6$5� )� /�*#

$� ?������ ,2! 4���� 1B ��� .������ �?! < ��� � ��

�������� ������� �� ������������� �����������# *���!

�+ &&���5"6��5� )� /�*#

$" 2A&22�"4�3.?@ 4������# .����� )"� B �! "���*� �����99

���#(����#��9�������9���"9��S91P2,D@T1-P2@#

$� 1�����8 & ��� ,���������� B2! 1�������� ������� ��

������� ���� � �� �� .����� �����! ���"������ �������

)D#*# �� )����� ��+��� �#!9���6"� )� $*#

$$ 1��8 1! E��8�0����� E! .���� @G ��� > ��� B! P� ��

������������� ����������� �� �� �� ��������� ��

����� )���� ����* � �� �� ������ �� ����� ���� �����

������# � ���� �� ��� � �"� 6"$$ )"���*#

$5 E��8�0����� E! ���!���� ���� ������ �� ��� � ��

�������K������ �� ��� ���������! ��������� �����

��� ��������� �������! �� ��������� � ����� �������

������ ����� 6$"������� � ���� ��������1� ��,7 �8.

((27! @� �� -��������� ?! D �� B! 4������ 3! ,���� 1!

E��8�0����� E! 1������������ @ ��� <�� G! &����������

&����� � �� F����������! 3����! �� "" 6"�+ )� +*#

$� 1�����8 &! 2�;��� '! 4��� 0 ��� .;����� 2! ?����

��� �� ���� �� �������� ������ �� �� �������� .������# &&#

F.34 �������# 988/ ��� ��� �� � ��� ����������� �����

� ��� $3������ � ��� ��� :� $�;! ���� ������ �� ��

&,@2 ,������ � +#

$+ .���� ,! D��� B3! F� ���� , ��� 0�;���� Q! 2��������

���������8����� �� ��������� ��� � ���# �� )�����

��+��� �##9�$5 6$�5 )� �*#

$/ 3��� &! .���8 ,! E��8�0����� E! > ��� B ��� 0������

Q! ��� ���� ��� �� ��� ���� � �� ��������� �� ������

�� ���������8�����# � ��� �� ���� !����6+� )� �*#

$ '� ����� <! G��� 2 ��� 2�� �! 3�������� ������ �� ������������ �������� �� ���� ��� ������� ��� � � ���# *����

������ #�������� � �+ �6+ / )� "*#

5� 0 ��� A.! 2����� 1<! ?� 4@ ��� 2 8 �� .! ,�"������������� �� I ��� ���� ������ ���� � ��# � ��� )��

�����+6�/� )� +"*#

5� '� ����� < ��� 2�� �! .����� �� ������ �� ��������� ������ ��������� ���� ���� ��������# *���� ������ #��������

�!�����6��� )� �*#

�"�/

5" ?��� 0B ��� '����� B! &������� ��� �������� �� ������ �������#

)��������+ �$$/�6$$/ )� � *#

5� G����� G! G ���� 2 ��� 1�� ���� G! 3 ��������� ���

���������8����� �� ���� ��������� ���� $������� ������#

���� )�� ��� �!�5" 65�$ )� /�*#

5$ G����� -.! 0�� ���� 2&! 2������ �&! 0�������� '- ���

2������� .Q! '� �������� ��� �������� �� ����������

������� ���� ���� ������������# )����� )���+� ,��

���� �����$��6�$"� )� �*#

55 '��� &<! ,� ��� GD ��� ,� ��� BD! ,������������ ��

������� ������ �� �� ������ ������� )�������*# ��

)����� ��+��� �9�"�56"� )� /�*#

5� 0��� BF! 1� B2 ��� 1��� 4D! 3 ��������� ��� � ������

���������� �� � ��������� ���� �������� ��������

���� ����� )&���� ���������* ������� � ��# ��

)����� ��+��� �#�� 56 )� �*#

5+ 1��� 4D ��� 2����� 41! >� � ,�"�������� ����������������� ������ ���� �� ������ � �� �������� �� ��8! ��

����� ��� ���������� �� ,�"� ��� ����������# � )�� ���

���� /�56 /+� )� /�*#

5/ 1��� 4D ��� 2����� 41! 1������ ��������� ������ ��

���� �������� �������� �������� ���� ������ ����� ���

������ �� �� ������ � ��# %�" )�� "���/�6� + )� /"*#

5 4�� 2� ������;��� E! ,������������� �� �� ����� ��������

��� (�������� ���� ������ )������� �������* � ��# � ��

��� ����"��6�"�/! �"�� )� /+*#

�� G����� 1�! ?�� 12 ��� ���� 31! <��� ��� �� ��� ��

����� ��������� ��������� �� ����� )����������� ��"�����*

� ��# ������ � )����� )���+� &��"+"6"/5 )� *#

�� 1��� 4D! <������� �������� ���� �������� ����

����� � �� ���� ������ ��������� �������# � $3� 5�

��#�"$$6"5" )� / *#

�" 1��� 4D! 3 ��������� ��� ���������8����� �� � � ����������

�������� ���� �� ������ � ��� ���������� �� ���� ���

������������ �����# ��� )����� )���+� �!��"�"�6"�"/

)� / *#

�� 2����� 2E! 4�� 2�! ?�� 12 ��� ���;��� E! 3�������� ��

������� ��� ��� ���� �� �� � ������# ������ � $3� )��

���$$�6$$$ )� /�*#

�$ 2����� 2E! ?�� 12 ��� ���;��� E! 2< �������� �����

��������� �� ������ )������� �������*# ������ � $3� )��

�"�$��6$�" )� �*#

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*