Download - Post mortem muscle protein degradation during ice-storage of Arctic (Pandalus borealis) and tropical (Penaeus japonicus andPenaeus monodon) shrimps: a comparative electrophoretic and

Transcript

����� � ��� ������� � �� ��� ��������� � ��� �� ���� ���� 6�"�/ )����� "���*4-&� ��#���"9;���# ��

���� ������ muscle protein degradation duringice-storage of Arctic (������ �������) andtropical (������ �������� and ����������) shrimps: a comparativeelectrophoretic and immunological studyIciar Martinez,� Tone Jakobsen Friis and Mercedes Careche†

Norwegian Institute of Fisheries and Aquaculture, Ltd, N-9291 Tromsø, Norway

(Rec

� CoE-ma† CurContCont

� "

��������� ����� ����� �� ��� ������� ���� �� ������ ��������� ���� �� �������� ���� � ��

�������� ������ ������� �������� ��� ������� ���� ������� ������� � ���� ���� ���

���� �� ��� ��� � � !�� "� ��� ��#� $� ������% �� ��� ��� �&� !� ��� "�� $������� ���% �� ��������� ��

��� ��� �� ��� ��� ������������� ����������� ��� ������ ����� �����'��( )� ����

*���� ���� �� � ��������� �� ����� �� �� � ���* ������ �� ������ ��*� ����� $+,-% ��� �

����������� ������ �� �� ����� ��� �������� �� ����� �� �� �� �� ��. ����� �##/0� ������

������� ���� �����+,- ��������( +,- ���������� �� � ������ ��� ���1��� �� ������ �����

�� ���� �� ����� ���� � ����������� $202�3�45% �� ������ � ��� ��� ����* ������( 6���

�������� ������ �� �� ����������� �� ����� �� ����� �! ��� �#/0� ���� ��� ��� ��

�������� �� � ���� �� � ���� � �� ���� �#/0� ���� �� �� ���������( )�� ��� ����� ����� ��

������� �� � ��� �� ������� ���/��( 6� ���� ������* � �����1� �� ����� ��� ��� �����

�����1���� ������ �� ��� �� �� ��� �����( )�� ����� $����� �## ��� "�/0�% ��* � ������*

������� ���� �� ��������� �������� �� �� .������ ������ �� � ������� ��� ���� ��� �� � �� �����

"�/0� ���� ��� �����( 7� ��������� �� ������� �� � �������� ��� � ���� ��� ��� �����

�����1���� � �������� ������ �� ������ ������ ��� *� ���� "�� �� ��������� �� � �� �##/0�

�������������� ������������� ���� ��� � �� � *���� �� �� ������� � ������ �� � ��������(

� �##� 2����� �� -����� 7�������

8������� ������� �������� ������� ������� �������� ������� ����� ���� � ��� ��� ��������������� ������� ������� ���������� �����������

INTRODUCTION�������� ������ �� � �� �� ����� ��� �� ���

������� ������ �� �� ��� �� � ! ������� ����

"#$% �� �� ���� �������� ������� �� ��� ���

�����#� &�� �� �� ������! �����! ��� #�% ��

�� ����# '� (���� �� �� � ������ ��� �� ���

��� ��� ���" ����� �������� ����� )$#$% �� ��

����*! ���� �� ������ ���� ��� �� ��� �#+% �� ��

���� (����� �� � �� ������! ��� ���� � � ��

��� �����#"� ������ ��� � ���� ����� ������� ����

��� �� ������ ������ � ������� ���� �

��� +°,#� -� �� ���� ����! � � �� ������

)������� �������* ��� ���� ���� )�� �����* ������

)������� ����*! �� �������� � � �� �����

���� ��� � .���!$ �� ������� ����� ���� �� ��� �

"/°, ���� ��� ��� ����� ��� ����������� ��

� ��� �� � ����� ��� ���� ��� �� �� ��� ��°,

eived 12 December 2000; revised version received 28 March 2001; a

rrespondence to: Iciar Martinez, Norwegian Institute of Fisheries andil: [email protected] address: Instituto del Frı́o, Ciudad Universitaria, E-28040 Madridract/grant sponsor: Norwegian Research Council; contract/grant numract/grant sponsor: European Community; contract/grant number: AIR

��� 2����� �� ,����� &�� ����# � ��� �� ���� ��""65�$"9"

��� � ��� /�% ��������#$ 0��� �����! ������

� � ��! �� ����� �� �#

1��� �� �� � ����� ����� �� ��� ���� ������

�� ������� ��� ������ ��� �� ��������� �����#

2 �������! �� ������ ������� ��� �� ��

����� �� �� .'3! ���� ������������ �������

�� .43! .13! &13!56/ ����� ��� ����(�������

��� � ������ ���������� �������� �� �� ���������

����!�� ���� �� ����7 �� ��� �� ��������� ���

���������� �8��� ���� ���� ����� ���� ��� � ��

������� �� � ������ �� �� � ��#��!�" '�

��� �� �� ���� �������� �� ���������� �� � ��!

�������� ��� � ��� �� ���� �#�� 3������� �� ����!�� �� �������� ������! ��� � � ��� �!�$ �� �������! ������ �� �������� ��� ������ ����

������ ��� �� �������� �� ��� �� ��8 �+6

�/��4� ����� �� ������ �� �� ������� �� ������

ccepted 22 June 2001�

Aquaculture, Ltd, N-9291 Tromsø, Norway

, Spainber: 108896/1203 CT94 2283

���9:��#�� ��

� �������� � ������� ����� � �����

���� ��� ���������� �� ��������� �������# '� ������� �< �� �� .����� � ������ ��� �� �� ��

������ ���� +#$ �� /#"#�$!�5

,� ������� ��� ������������� ��� ����� �����

����� ����� ����� ���� ���� ������ �� =��� �

����� ���# '�� �� ������ �������� �����

�� � ����� ��� � �� �� �� ����� �����! ������!

� ������ ��� ���� ����� ���#�� >������ ��

����� � ��;�� ������ ��������� �� ������ ������

��� �� �� ���� ��! ��� �� ��� ���� ����������

�� � ������� ��� ����� ��� � ���� ��� ���

��� ��������! �� �������� �� ������ ��� �� ����! ��

������� ����� ���#

2��� � ������ �� �� .����� �����! ��� ������ �

�8��� �� � �� ��� ��������� �����=��� �� �����

������������ ���! ����7 ���! ������ ��� �

����� ����� ���� �� ������� ����� � ���� ���

������# 2����� �� � �� �� ������ �� �� ������

������ � �8��� ��� �� ������� �8��� �� ��

������ ���� � ��� ��� �� ��# 3�����! ����� �����

��� � ������ �� ����� =��� � ��������� � � ��

��� ���� � ������� ��� ������� ������#

?��� �� ������� �� ��� ����������� �� ���

���� ���! ��� �� ���� ������ �� ����������� ��

��� ���� ������ ���� ����� ���� ������ �� �

�� �� ������ ������ ��� ������ �� �� �� ����

�������# '� ����� ���� ��� ������� �� ����

��� �� ��� ���� ���������� �� � �� ������� ��

.����� ��� ������� �������# -�� ��� ���������

����� ����������� � ����������� �� � ��

(������ ��� �� �� �������� ������� �� �������

���� � ���� �� ���� �������� ���������# '� ��� ��

������ ��� �� ��� �� � ������ �� 242�3.?@

������� �� �� ������� ������ ����� ������ �� �

�� �� ��� ��������� ���� �����.����� ����� ����

������ ���� ����� ������ �# &�� ��������� ���

��� �� �� ����� �� ���������� �� ���������# A

��� ���� �� � �� ���� ���������� ���� ���������

��� ���� � �� ������ ���������� �� .����� ���

������� �������#

Figure 1. Schematic representation of Pandalus borealis showing the area(cross-hatched) where samples were taken. Muscle samples fromPenaeus japonicus and Penaeus monodon were taken at the samelocation.

MATERIALS AND METHODSAnimal samples� ������ �� ��� � 5� ����� ����� ��� �� �� ���

�� ������� ��� �� 2������ ����� �� B � ���

�������� ���� �� ��# � ������� ��� � ������ ��� � "� ��� ��� ����� ����� �������� ���

�� ���� �� "/°, ��� �� ��� �� B � ��

�������� �� ��� ����# &������� ���� ����

)�� �� ���������* �� �������� � ���� ��

����� ��� � ��� �� �� ����� �������� � ��

��� � �! �� ����� �� >�� �! �� ������ �� �����! ���

���� ��� ����������� � � �� ������ (���������

�� ������� ���# '� (��������� �� �������

�� � ������ ���� ��� �� ����� �� �� ��� 5! ��! "$!

$/! +"! � ��� �"�� ��� �� � ������� ��� � �������� ��� �� �������� ��� ��! ""! $�! +� ��� "�#

@���� � ������! ��� � ������� ��� ��� � ������ ������ ��� ��� ������ �����# &� ��������! ��

�"��

���������! �� � ��� ���������� � � ��� �� �� �

���� �� �� �� ���������#

Extraction of muscle proteins'� ��� ����� � ��� ������ � � �� ��# .���

����� �� �� ��! ��� � ����� �� �� �����

� ��� �� (���� ��� ��� ����� �� ��

@������� � � ���� 5��� �� �� �� ������ <"-#

'� ������� �� ������ ��� ����� ��� �� � ��

�� ������ �� ��� 5��� �� �������# '� � ���

������� ���������� �� ���� (������ �� ���������

�� �� � ��! �� �����(����� 7 � �� � �� ���

��� ����� ��� ���� ��� �� (������ �� ����� ��

�"�°,# '� �< �� �� ���� (������ ��� ��� �� ��

�������� � ���� ���� �< ��������� ����#

'� ��� ��� ����������� � (������ �� ���

����� ������� �� ������� ������� �� �C.��� ����� �+ '� �� ��� �� �� �� � �� ���� �� ����

(��������! 5��� �� � ������ �� ���� )"��1 ��,!

��1 @?'.! �5�1 1�,"! 5�1 ������������!

"���1 ��������� ����� = ����! �#$�1

��3-$<" ��� �#��1 ��"3-$<! �< �#5* ��� ����#

'� ������� �� ������ ��� ����� ��� ������ ��

��� 5��� �� �������# '� � ��������� ����������

�� ��������� � ������ (������ �� ���������

�� �� � �� ��� �� �����(����� 7 � �� � ��

������ ����� ��� ����# '� �� �������� ���!

5��� �� � �������� �� ���� )5�1 @?'.! �5�1

1�,"! 5�1 ������������! "���1 ���������

� ����� = ���� ��� ����1 ��$3"-+! �< /#5*

��� ����# '� ������� �� ����� ������ ��� �����

��� ������ �� ��� 5��� �� �������# '� � ���

������� ���������� �� ����������� � ������

(������ �� ��������� �� �� � �� ��� ��

�����(����� 7 � �� � �� ������ ����� ���

����# . �� (������ �� ����� �� �"�°, ���

������# '� ��� � ��� �� (������ �� ���� � �

����� � �� ������ �7 � � (��������#

'� ������ ������ �� �� (������ �� �� ����

����� ��� ������� �� ���� ������ ������ ��

"/��� ���� �� ������������ )�"/�* �� �� �

)�������� ������� �� � � ���������*# >�� 242�

3.?@ �� (������ �� �� �� ���� D���� � ����/

)"��� �� �����! 5�� �� ��������������!

$/� �� 242 ��� �"5�1 '����<,! ��1 @4'.!

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

Figure 2. pH values of water extracts from muscle of Pandalus borealis(full diamonds), Penaeus japonicus (open squares) and Penaeus monodon(crosses) immediately after death and until 92h of ice-storage. Each pointis the average�standard deviation of individual determinations in threeshrimps.

3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������

�< �#/* �� � ������������ �� �#"�� ������ ���!���� ��� 5��� ��� ����� ���8�#

SDS-PAGE@����������� ��� ������� ��������� ��

D�����/ �� ���� �$������� �� /�������

)���� ��*! �#5�� ����� ��� ��# '� �������� �

�������� 5�� �� �������� ��� �#�� �� �����8������������! ����� �� ��������� � �������� ��

�5�� �� �������� ��� �#/+� �� �����8�� �����������#� !"� .�� � ��� �� ������ ��� ���� ���� ��

�� ��� ����������� ��� ������ � � �� "��. ��

��� )�$�������* �� �� � �������� �5�E )/�������*# '� �� �� �����������"� ��� ����

���� ��� ���� �� ������# '� ������ ��

��� �� ������� � �� � �� ���� �����# '�

�� �� ����� ��������� �� ���� (������ �� ����

� ������! ��� � ������� ��� ��� � ���� ���

��� ������ �����#

Two-dimensional electrophoretic analysis'������������ )"4* ����������� ������� ���

������ � � �� �� ���� ����������� � (������#

'� ���� ��������! �������� ��� ���� )&@>*! ���

������� ��������� �� -C>���"" �� ������#5��

�� ������� ��� �� ���������� ��� �� ������

���! �#/� �� �����8�� ����������"� ��� "�� ��

2����� &��4�� )���� �6�� ����� �� �� 56+ ����*#

. 5�� ��� �� �� ���� ������ ��� ���� ���� ��

����# &@> ��� ������� ��� ��� � +"��E�# '� ����

�� (�� ��! ���=� 7 ������� �� �"#5�1 '����

<, )�< �#/*! "�� �� 242! 5�� �� ����������

����� ��� ���� �� ����� ���������� ������

���� � ! ��� ���� �������� ���� ���� ��

�������������� ��� �� �� ����� ���8� �� �"�°,��� ��� �������#

'� ����� �������� )242�3.?@* ��� ���

����� �� ������� ���� �� �$������� ��# .

��(� � �� ��� �� �! ��������� ��� ���������� �

� ��� ��� ��� ������ �� "4 ����������� ���

���������� � �����#

Immunoblotting'� ������ ������ �� ��� (����� ��� �������

������������� �� ������� ���� �� 0��F�� ����

��� �� )+���/��! �#5�� �����* �� � ��������

�5�E ��� ��# . ��� ��� �� �� ���� ������ ���

���� �� �� ���� �� ��� �����1<, ���������������

���! ��� ���� �� ��� ���� �����1<, ��� �����

��������� ����������������# '�� �� �� � � ��� ����������# .��� �����������! �� � ��� ������

���� ,������� 0������ 0 F�"5�! ����� ��

������� �� �� ����� � �� ��������� ����

������ �� ��������� �� '����� �� ��"� ���� �

0��F�� ���� ������� ��� �� ���E ��� 5����# '�

������� � ��� �������� �� �� 242! 5��1 '���!

�/��1 ����� ��� "��� �� �����# '� ������

� �� ���� �� ����� ���� �������� � ���

���� )���1 �������� � ���! "#+�1 G, ���

��+�1 ��,! �< +#$* ���������� 5�� �� ������

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

������ ��� ��� ��# '� ���� �� ��� ���� ��� ��

�� ��� � 5�� �� �� � ������� ������� ������ �

�����.����� ����� ���� ���� 1<, ���� �� ��

������� �� 1�����8 ��� 3�����#"$ 1�������

���� ��������� )2���� .�5�$$* ��� �� ��������� ��

�� ����� ������ �� �� ��� ���� ��# 2�������

��������� �� ���(�������� ���� �����������

&�? )2���� .���5$* ��� ������ ������� � &�?

)2���� .� �$$* ��������# 4������ ��� ������

���� &0& @�8�������� A� )G���� &����������

0����������� &��*#

Electrophoresis of native myosin isoforms@����������� ��� ������� ��������� �� �C.��� ����"5 ��� <�� �� ��"� ���� �� ������������ �������

�� 1�����8 �� ��� "+ '� � � ����� � ��� ��������

"��1 ��$3"-+ )�< /#5*! 5�1 1�,"! ���� ��

����� ��� �#5� �� ��������������# '� �����

����� )�����#5��* �� �������� $�� �� ����

�������� )� � �� �������� ��� �� �� �����8������������*# .�� � +�� �� ���� ������ ��� ����

�� ��� ���# 1����� ���� ��� ��������� � �� ���

�� �� �� ������ ��������# @����������� ���

������ � � �� � �������� ����� �� �E ��� � �� �

������ � ���� � ��� �"°,#"+

.��� ����������� �� �� �� ���=� ������ ���

"��� ���� ,������� 0������ 0 F�"5�! ���

������� ���� ������ ���� ��� �� ������ �����

���������� �� ����� ������ ���� �����# '�

����� �� � �! 7 ������� ��� ����� �� D����

� ����/ ��� ���� �� �� ���� �� �� �#+5��

����� ���� ��# '� �� ��� �� ��� ����������� ��

���� �� ��� �� ����� �������� )242�3.?@*

������� ����� ��� �� � � �� � �������� �+5E ���

��� � �� ��� �����������#"�

RESULTS'� �< �� � �� �� ���� (������ �� � ������� ���� ���� �� ����� �� >�� "# 2��� �� �< ���������

���� ��� ������� �� �� ������� �� ����� �� ����!

� �� ��� �� ��� � �� �< �� � �� � ������

�"��

Figure 3. SDS-150g l�1 PAGE of water extracts, low-salt extracts andhigh-salt extracts of (A) Pandalus borealis, (B) Penaeus japonicus and(C) Penaeus monodon. P borealis had been stored in ice for (a) 0, (b) 5,(c) 16, (d) 24, (e) 48, (f) 72, (g) 96 and (h) 120h before extraction.P japonicus and P monodon had been stored in ice for (a) 0, (c) 16, (d) 22,(e) 43, (f) 71 and (g) 92h before extraction. Lane S: Pharmacia’s low-molecular-weight calibration kit, with bands of (from top to bottom) 94, 67,43, 30, 20.1 and 14.4kDa. M, MHC; Ac, actin; T, tropomyosin. Thearrowheads, asterisk and bracket indicate bands referred to in the text.

� �������� � ������� ����� � �����

(������# '����� �� ���� ����� ��������� �� �

����� � (������ � ���� ����� � ������ ��� ��

�������� ��� 5��# '� � ������ �� �� ����

(������ ������ ���� �� ����� ��� �� ��8 ���

�� �� ���� ���� �� � �� ����� �� ���� ���� ��

����� ������ �� �� ����� �����#�$� ���� ���

�� ���� ������ �< �� ! ����� �� � ������� ���� ������! ��� ���� "/� �� ���������! � ������ ����� ������ �< �� �� �# A�� �� ���� (������ ��

�� ��� ������� ����� ��� �� ���� ���(�� � ��

�< +#� ���� ��� � $/� �� ��������� ��� �����

�������� �������! �� �< �� �� �� ���� (������

���� �������� � ������ ������ � �� ������ ����

$/ �� 5��#

'� �� �� �� 242�3.?@ �� �� �����! �������

��� ����������� � ��������� �� ����� �� >�� �# >��

� ������ )>�� �.* �� ����� ��� ��������� �

(������ ������ � ��� ������ 7 ������� ������

�����������# -� �� �� ���� �������� ��� �� ���

�� ����� �� � ���� �� ����� �� ��� �� ��8

��� � ����4� �� � �� (������! �� �� ��� ���

������� )��� ���� � ������ �� >�� �.*# '��

����� ��� � ������� ������� ���� �����������

������ �! �� ����� �� >�� $ ��� ��� ���� �

������# -�� �� ��� ����� �� �� ���� �� ����� ��

>�� $! ��� � ��� �� �� ���� ������� ����� ��

���# -� ���� �� ��� � �+�4� ������ �� 242�

3.?@ ������� )��� ���� �� �������� �� >�� �*!

����� ��� ����� �� �� ��� �� ���� �� � ��

���������! ��������� ���������� ���� ���������

������ ��� ��� ��� ������� ���� "$� �� ���

������# '�� ���� ������ ����� �� ��� � 5��4�

)��� ���� �� ������� �� >�� �.* ��� � ����

������ � ���� ������# '� ��� ���� ��� �����

�� ��� � �� "$�# ,����������� ���� �� ����

�������� �� ���� ����! �� �������� �� �� ���

���� �������� �� ��� ����� �� ����� ��� ���

� ���� �� ���� 5� �� ���������! �� ��� �� ���� �

��(�� � �� ��� � "$� ��� ��� ��� �������� ������

�� �����#

'� ����� ��� ��������� � ��������� �� � ������� ��� � ���� ������ �� ��� ����� ����

�� ������������ (������ �� � ������# &� �� ������������! ��� 1<, ���������� ��� ������ ��

���� "� �� ���������! �� ������� �� �� ��� ���

���� ���� ��������� ������ ���� ����� ������ � )>��

$*#

'� ���������� �� ������ ��� ������� �� ������� �� ������ � ��������� �� ���� ��� ��

����������� ��� ����� ���������� ��� � ���

� ��7 �� 242�3.?@ ������� �� �� ����� �� �

���������� ����� ���������� )>�� 5*# >�� 5. �� �

�������� ����������� �� �� ����� �� ���� � �

� �# >�� 50 ����� �� ��� ���� �� �� 242�3.?@

� ��� �� (���� ����� 1! � ��� � �� >�� 5. ��

����# 0��� 1 �������� ����� ������ ��� � ��

������ 1<,! ��� ����� � ��� � �������� ������

��� � ���� ������ 1<,! � ������ �� �� ����

���� ����� � ��� � ������ ��� ���� �" ��� "$� ��

��������� �������� ��� ���� �������� �������

�"�"

���� ���# '��� ������� ��� ��� ������� �� ��

��������� �������! ��� � �� ��� 1<, �����

������ ��� ������ �� ��� ����� �� 242�3.?@#

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

Figure 4. Immunoreactivities of high-salt-soluble extracts of Pandalusborealis, Penaeus japonicus and Penaeus monodon resolved bySDS-150g l�1 PAGE with rabbit anti-Arctic charr fast MHC antiserum. Thenumber at the top of each lane indicates the hours of ice-storage. M, MHCband. The bracket indicates degradation fragments from MHC (see text).

3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������

"4 ����������� �� �� ����������� � (������

���� � ������ )>�� �* ���� �� ����� �� ���

�� ����������� ������� ��� ���� ����� �����# '�

�+�4� ������ ���� )������ �� >�� �* ��� � �& ��

Figure 5. (A) Schematic representation of native myosin isoforms after a9h run. From top to bottom the samples were rat diaphragm (used asstandard) and high-salt-soluble extracts of Pandalus borealis after 0, 5, 12,24, 72 and 120h of ice-storage respectively. M, bands corresponding to thenative myosin isoforms of P borealis; a and b, additional, faster-migratingbands noticed only after 12 and 24h respectively of ice-storage.(B) SDS-150g l�1 PAGE of electrophoretically isolated bands M, a and b,as indicated on top of the lanes. The arrowhead indicates the MHC band.The arrow indicates proteolytic fragments. Lane S: Pharmacia’slow-molecular-weight standards. Only the upper part of the gel is shown.

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

��� � 5#�! ��� ������ ���� �����# &� ��� �������� ��

���� � ��� 5� �� ���������! ��� ��� �� ������

���� ��������� ��� ��� �� ��������� ���� "$

��� $/� �� ���������# '� ��� ����� ��� ����

������ ��� �� �������� �� �� "4 �� ����� �� >�� �

�� �� � �� ���� ������� ��� �� �� ��� �����

��� ���� �� ������� �� >�� �# '� ���� �� �����

������� ��� �� ���� )��� ���� �� ����� �� >��

�* ��������� ���� ��������� ������ ���! ��� ��

��� ���� �� 242�3.?@ �� ���������� �� �� ���

��� ����� �� �� "4 ��� �� �������� �� ���� �����

������� ���� ��������� ������ ���! ������ ����

�� �� ���� ������ �� )��� ���� � ���� �����*#

'� "4 ������� �� � ������� ��� � ���� )>��+* �� ��� ������ �� ��� ���� ��� ������� ���� �������� �� �������� �� �� �+�4� ������ ����

)������ �� >�� +* ��� ��� ���� � �������� ������

���� ��������� ������ ���# -� ����! ��� ����

�� �������� �� >�� +! ��� ��������� �� �� ����

��� ��� ����� �� �� ��� ����� �� ��� � 5��4� ��

� ������ ����� �� >�� � ����� �� ��� �������� )�

��� �� ���� ��� �&* �� �� "4 ��# '��� ����!

��� �� � ��! �� ������ �� �� � ������������

�� >�� +�! � � ����� ����� �� �� �� �! �������

����� �� �������� �� �� ��� �� �� ������ ����#

.� �� � ������! ��� �� ���� ����� �����! � �

����������� ��� �� ���� ���� ��� ����� ��������

�� �& �� �� ��������� �������#

'� ����� �� ��������� �� �� ����������� �

(������ ��� ������� �� ��� ��� �����������# '� �

�� �� ���� ��! ��� ���� �� ��� ������ ��

�������� ���� ���� ���� �����1<, ������ � ���

�������������� ��������� )>�� /�*! �� ����� �����

������� �� ���� �������� ����������� �� �������!

��� ��� ��� ���� �������������� ��������� �� ����

��������� ��� )>�� /�*# 0���� ������� ���� �����1<,

������ � �� ��� ���� � ������! ��� �����

������������ �� ��������� ���� �� �������� )���

���(���� ��� �� ���� +�4�*# .� �� ��� ��

����! ��� �������������� ������������� ����� ��

������ �� � ������! ��� �� ���� ��� ����

����� ���� "$�! ��� �� ��� ���� �� � ����� �

��������� �� �� ���� )� � ��� �� �� �� �* ����

+"� �� ���������# &� ��������! ��� �� ��������������������������� ���� ��� ����� �� �� ���������

�� � (������ �� � ������� �� ���� "� �� ���

������# '� ����������� ������� �� ���� ���� ���

������ �� ���� �� �� ��������� ������� ������

������� ���� �� � ������#

DISCUSSION'� ����� �� �� �� ����� ���� �� ���� ����

�� ����� �������� ����� �� ���� �� ����� ����

���������� ���� ������� �8���! ���� �� �������

�������� ����� �� ������� � �� �� �� ����� �����#

'� ��� ���� �< �� � �� ������ � ��� ���

�� ������ ����� ���!�$!�5 ��� �� ������� ��

�� ���� �� � ��� �� �� ����� ���� +#�# >���

� ��! �� �� ���� ����! ���� ����� �� �

�"��

Figure 6. Two-dimensionalelectrophoresis of high-salt-solublemuscle proteins of Pandalus borealis.First dimension, IEF, from left (basic) toright (acidic). Second dimension,SDS-150g l�1 PAGE, from top tobottom. The shrimps had been storedon ice for (a) 0, (b) 5, (c) 16, (d) 24,(e) 48 and (f) 72h. A, actin; T,tropomyosin. The arrows, arrowheadsand circles indicate spots referred to inthe text.

� �������� � ������� ����� � �����

���� �< +#�"/6�� � ���� �� ����# '� �� �<

�� � �� ��� � �� � �� ��� ��� ���� � ������

��� ������� ����������# D������ �� ���������

������� �� �� �< �� �! � �� ����������� ��

������� �� ����� ����� ���� �� ���# 2��� � ��������� �� ���� ����� �< �� � ����� ���� �� ����

��� ������� �����! ��� ������ �� ��������� ��� �

� (���� �� � ������������� ������#

A ����� ��� 1<, ����� �� �� ���������

�� � (������ �� �� ��� �����! �� �� ���

��� ������� ��# -�� �� ��� ����� �� � �������!����� �� �� ��� ���� ������ ���� �� ��� ��

����! �� ������� �� >�� �# '� ����� ������ �

�� �� �� �� ����� �� ��������� �� �� 1<,

���� ��� �� ���� ������� �� ����������� ��#

<����! �� ��� ����� �� ���� ����� � ���� ��

������� ��� �� �� ������������� ����� �# &� ��

������ ���� �� ��������������� ���� ��� ��������

���� ��������� ���������� �� �� ��������������

����! � � � ��� ��� ���� � ����� �� �� ��� ��

�� �� ��� ���� ����������� ���� �� ������ �� ��

��� �� �� �� ��� ����# A ����� ��� ���� ���

��� ����� ������ ��� ������� 1<, ��������! ��

�"�$

��� �� ����� �� � �� ��� �� ����� � ���!�� ���

���� ���� �������� � ���� � ������ ��� ��

��������� ���������� � ���� ���������! �� �����

�� �� ������ �� �� �������� �� ����� �� ��� ��

���� ���� /� ��� ����4� �� � ������# 2�� ��

��� �����! �����! ��� ������ ����������#

3��������� �� � ��������� ������ ��� ����

����� �� ����� ��� �� �� ����� ����� �� ����

��������� � ���!�"6�$ ��� ���� �� �������!�56�+

�� ����� �� ��� � ��� �� ��8 �� ��5! ��� �� ����4�!

������� �� �� �������#�5!�+ '�� �� �� ������ ��

�� ���������� ��� ��������� ��� ������ ���

�� ������ �� � ������� � �� ������ �� 1<,#�/

'����� ��������������� ���� �����1<, ������ �

�� � ����������# <����! �� ���� �� ����� �� ���

�����! ������ ���� �� ��� ���� � ����� ��

�������� �� ��1<, ����! �� � �� �� ��� �� ������

��������� �� � ���������� ���������� ���� ���� �����

1<, ������ � �� � ������� ��� � ����!� ����� ���� ��� �� ����� ���������� ��������

�� 1<,! �� ������ ���� ����� � ����� ��

�������#��!�$

'� �+�4� ���� ��� ��� �� � � �;�� ��

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������

��������� � ���� ��������� �� � ������ � � ��� �� � ������� �� � ����# &� �� �����! �� � �

������! �� � ����� ����� �� "4 ������� ��

�� ������ � ���! � ��� ���� �� ������� ���� ����

�� ���������� ���� � � ��� ������� �� ���� ���

� ��� ) �� �����*! ��� ���������! �� � ���

���������� � )>�� �* ��� �� ��� ���� � ��� ��

�� ��� ����� ��� �����!� ��� ���� � ����� "4

������� �� � �� (������ ���� ������!$� � ���

����� � ��$� ��� �� � ���������� �#$" -�� ��

�� "4 ������� �� .����� ����� ������ )���"������

Figure 7. Two-dimensionalelectrophoresis of high-salt-solublemuscle proteins of (a, b) Penaeusjaponicus, (c, d) Penaeus monodonand (e) mixture of high-salt-solubleextracts from rat diaphragm, soleusand gastrocnemius muscles. Firstdimension, IEF, from left (basic) to right(acidic). Second dimension,SDS-150g l�1 PAGE, from top tobottom. The shrimps had been storedon ice for (a, c) 0 and (b, d) 92h.A, actin; T, tropomyosin. Thearrowheads and circles indicate spotsreferred to in the text. Part (e) is afull-size gel, and the square indicatesthe part of the gel shown in Figs 6a–6fand 7a–7d.

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

�������* ��� � ���� ���� ������ ��� �� ���� ��� �&

������#$� '��� �������� ���� ���������� ����

������ ���� �������� ��� �� ��� �� ���� ������

�� �� �������� ���# '� ��� �� ���� �� ���� ����

����� ������ ������ ���� �� �� ���! � � ��� ��� �&�

��� �� � �� ��� ��� � �& �� �����(����� 5#$$"

��� �� ��� ����� ���� �����! �� ����� ���� ��� ��

������� �& �� ��� � 5#�! ��� ������ ���� �����# '���

���� ��� ������ � ���������� ������� �� � ������

��� �������� ������ �� � ��� ������# '� ����

���� �� ��� ����� �� � ��� ����� �� �� ��� ��

�"�5

Figure 8. (a) SDS-150g l�1 PAGE and Coomassie Brilliant Blue R-250staining of high-salt-soluble protein extracts of muscle from Penaeusjaponicus and Pandalus borealis stored on ice for various periods(indicated in hours at the top of each lane). Lane S: Pharmacia’slow-molecular-weight standards. (b, c) Immunoreactivities of the sameextracts with (b) both rabbit anti-Arctic charr fast MHC antiserum andmouse anti-�-actinin IgM and (c) mouse anti-�-actinin IgM only. M, MHC.The bracket indicates bands reacting with anti-fast MHC antiserum. Thearrowhead indicates bands reacting with anti-�-actinin IgM.

� �������� � ������� ����� � �����

���� ��� ��������� ��� �� � ������ ��� � ��� ���� ���� �� ��� ������ � ������ ������������� ��

������ � ���#

.� �� �� ������� �� �� ���� ��� ����� �� ���

� �� ���� �� ��� � 5��4� )>�� �*! �� ����� ���

���� ����� ����� � �����! �� ���������� ����

� ����� "4 ������� �� � �� (������ �� � ���!$�

�� �$" ��� .������ ����� )���� ����*#$$ &� ����

������������ �� ������! ��� ����� �� � ��� �

���� ������ �� ��� ���� ����������� � ����

��������� �� ��� �� �� ��� ������ �����! �� ���

�� � �� ��� �� ��� � � ��� �� ����� � ���#$5

A ��� ��� �� �� �� ������� �� ���� ���

5��4� )>�� �* ����� ���� ��� � �� � ������# &� ���

�� ��� ��� ���� �� ��� ���� ����� � � ����������

������� �� �� ����� �� ����� �� ���� ������ �&

�� � ��� ���� ����������� ������ ��� ����� ��

�������� ��������# '� ��� ��� �� �������� ���

����������� �� ��� ����� � ���� ��������� ���

�������� ������ �� ���� �� �� �� � ����� � ����!�$

���� �� �� ������� �� �� ������ �� ��8 ���

����� �����$� ��� �� ����� � ����� �� ����

���� �� ����� ����� �� �� ���# '��� ���� ����

��� ����� ��� � �� �� ������ �� ������ ��

������� �� � ������ �� H���� �� ��C# &������

������ ������ � �� ������ �� ������ �� ��

������ ������!�$ ��� ������ ��� ������ ������

�� � �=�� �� 7 ���� �� �� ������� ���� ���� ��

��� ���������� H���� ���� ���� �C#

��.������ ��� �� ����� �� � ����� ���� ��

I����� � ���� ��� ���� ����� �� ��� � ���$+6$

����� �� �� ���� ������ �� �� �� ,�"� ����

����5� ��� �� ������ �� ������#5� '� ����� ���

2��5� �� �� ���� ���� ������ �� � ��� ���������!���� � ��� �� ���� �� ����4�! ����� � ���������

���� �� �������� ��� ��� ����� �� �������� ��

���� � ������� �� ��4�# '��� �� �� �� ��

(���� �� ����� �� ��� �������������� ������

�"��

������� �����! �� ��� �� ����� ��� �� ��� ���

��4� ��������! �� � � ��� ��� ����� �� �������# ��.������ �������� �� ��������� ��� ��

����� �� � ������������!$/ ����� �� �������

��� ��� .����� � ������ ����� �� � � ���

� ������ ����� )��� ����� �� ����� ����

����� ���� ����! ��� ��� �� ��4� ��������������������������� ���� ������ ���� ������ ����

"$� �� ��������� ��� ����� ������ ���� +"�*!

������� � ������� ��� ��� )�� ��������� ���

���� )����4�* �������������� ������������� ����

�� � � ���� ����� ���� "� �� ���������*#

'� ������������ ��� ������� ����� �� �� ����

���� �� ��� ���� �� ��������� ��� ����������

�8���#5"655 <����! � �� ��� ������ � ��

��������� ���������� ������ �� ���� ���� ��

������������� ���� �������� ������� �� �������

�8���# &� ������ � (����� ���� �� ��� ����

���� �� ������� �� �������� �� ����� �� ����!

���� �� ������� ���� ��� �� � ��� ��� �� ����

��� �� �� ������# .� �������� (�������� ��� � ��

�� ���� ���� �� � ��� �� �� ������� �� ���� �� ����

,�"��������5�!5+ )��� �� �����! �� ��������!

�������� ����� ��������� �������5/* ��� ,�"����������5 6�$ ��������� �8��� ��� ���� ����

�8��� �� ������� ������ �� ������ �� �� ��� ��

����� ������ � �� �� ��������� �� ��� � �°, ��

.����� ����� ��� �� ��� � "/°, �� ������� �����#

'�����! ��� ��������� ��� ����������� �������

�� �������� �� ���������� �8���! �� ����� ��� ���

���������� ���� �� ������������ ���# .���������!

��������� ���������� ��� ��� ��� �� � ����� ���

� ���� ��� ������ �� .����� ����� ���� � ���� ���

������ �� ������ �� ������� �����# 1 ��

������� �� � �� ����� ������ �� �< ����

��� �� �� �� ���� (������# 2��� ���� �� ���

��� �������� (������ �������� @?'.! �� ��������� ��

,�"���������� �������!$+!5+ �� �� ��� ���� ���� ��

�� ���������� ������ �� �� 8������ ����� �� ������� )����� ��� ���� � ������ �� >�� �.*

��� ��� � ���� �� ��� ������� �� ����� � � ��

���� (��������#

&� � �����! �� ��� ���� ���������� � ���� ���

������ ��� �� � ������ ������� �� �� .�����

���� �� �� ������� ������ ��� �� �� .����� �����

��������� ������ ���������� )������ ��� �� �����

���� ���� �� ������� �� � �� �� ������ ���

�������* � ����� ����� � �� �������! �������

��� ���������� �� �� ������� ����� ��� �� � ��

� �� �� ����� ��� ������� �������� �� ��

����� ������� ���� �� ����� ����� �������

���� )"/°,* ��� ������ )�°,* ������ ��# '�

������ � ���� ��������� �� ������� ����� �����

������ � ���� �=��� �� ������ �� ����

��� �#

ACKNOWLEDGEMENTSA ���� �� (���� � � ������ � �� 4� .�� 0����

)4����� &����� � ��� >������ F�����! D�����!

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

3��� ����� ������ ����� ��������� �� ���!���� ������

4�����* ��� 0� � ?������� )J ����� 4�����

��� �� 3������ &�� �����! 0������! . ������* ���

��������� �� ����� �� � ������� ��� � ���� ��� �� �� �������� �� ����� � � �� ������ (���������

���� ��� �����# '� �������� F����� ,� ���

�� ����� � ��������� ��� ������� � ����� �� ��

���;�� ��// �9�"�! ��� �� @ ����� ,��� ����

��� �������� �� (����� ����� �� 4� 1����

,���� �� �� �������� &����� � �� >������ ���

.7 �� � � �� ���� �� �� ,������ .����� .&F�

,' $ ""/� H@�� ����� �� >��� >������C#

REFERENCES� 4�������� �� >������! D������ ����������K�������� ������

� �6� # ������� #��� ���5 )"���*#

" �������� 2����� @(���� ,� ���! .L ������������ 4����

� # $������"����� � ���� %������! � �+ )� *#

� 2M�� F!1�;N�������# ������ � &�"��� �'����� (! &����� � ��

1���� F�����! 0��� )� +*#

$ 0���� <.! 3������ 04 ��� ?������� 0! D�� ��������� ��

����� ��� ������ ���� . ������K� � �� ������ ��� ������

����� �� ����������� ��� �� ���! �� ����� �� ����� �

�����! @� �� D �� B0! 0N���� ' ��� -������O�� B!

@���� 2���� 3 ������! .�������! �� +�6/5 )� +*#

5 0�� 1! P���� < ��� Q������� <! 3�������� ���������

������ �� � �� �� )������� ����������� � ���� ������#

�������� ��� ���$/"6$/� )� /*#

� >��� ?B ��� D�� F'! 3��������� ��������� ������ ��

�� � �� �� �� ? � ������! ������� �������# � �� ���

&!��� 6��� )� +"*#

+ 1��� ���� 1 ��� Q������� <! 2� ��� �� ������������ ��

� � �� ����� � ��# *���� ������ #�������� �!�"�"�6

"�"� )� �*#

/ Q������� < ��� 2������ F! 3��������� ��������� ������

�� �� � �� �� �� B����� ����� ����� � ���� ������#

�������� ��� ���/"�6/"$ )� �*#

D� 2�! 3 ��� ������ �� ����� ������ � ���� ������ �� ����

�� �������# � �� ��� �&�$$"6$$$ )� /*#

�� D������4E! ����� ���� ����� ������ �� �� ����� ������!

������� �������# ���� )��� !��""�6"�� )� +�*#

�� 0��������� @2! ���AG ���1�� B<! 3����� ���������8����� ��

� �� � �8�� (����� ���� �� �������� ����� ���!

������� ��������# � �� ��� �"��$ $6�$ 5 )� /$*#

�" ��� AG! D�� ,Q ��� 1�� B<! 3����� ���������8����� �� �

���������� �8�� �������� ���� �� ������������ �� ��

�������� �����! ���������� ��������# � �� ���

�#���/+6��// )� /5*#

�� 3������� �� D2! 2���� 20! A�� 'D ��� >��� ?! 1 ��

������ �� �� ������ �� �������� ������! �����������

�������� � ���� ��� ������# � �� ��� �����"56��"/! ��5+

)� / *#

�$ 1�����8 & ��� D� ���8�� G! @���� �� ������ ���������� �� ��

������ ������ �� �� ������ �������� ������! �� ������ ���

��� �� � ��� ����� ��������� �� �� ����������� ���!

��"��� ����� �+������! @� �� 0���� .! 4���� , ���

. ���� 0! '� ������� 2����� ,���! . ������! 0������!

�� �"�6�"/ )� +*#

�5 E������� <! .������� ����� �� ���# ���� ,�� -./ )� //*#

�� G���� 2 ��� Q���� ��� G! '� =��� � ��������� �� ��� ���

�����! �� ������+ ��� )��������+ � ����� �� ������!

@� �� 1����� F@! >��� ?B! <���� ,@ ��� A��� 4F! .E&

3 �������! A������! ,'! �� ��+6$�$ )� /"*#

�+ 4C.��� .! B����� , ��� 0R��� BB! ,��������� �� ������� ����

�� ������ � �� �� �� � ���! �� � ��� � ��� ���#

3������� �� ���������� �������� �� �� � ��� � ��#

$� � )����� ����" �6" � )� /�*#

�/ D���� PG! ,���� �� ��� �� �� ������� � ���� ��

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*

������ �� �� ��� �� ����������� '$# *���� ��!��/�6

�/5 )� +�*#

� .������ ,A! 0� � 3F ��� ?����� F>! 3�������� ��

������� � "���� �� �������# � 0�� ���$�"6$"� )� +�*#

"� <���������� 4! 3��������� . ��� 1��� ,! 4������ ��

����������� �� ���� ������ �� ��������� �� �������

��� ���� ������� �� ���� ��������# ���� )����� �!&�$�"6

$"� )� //*#

"� .����� A! >��� ��� ��8����� �� ������ ����� �� �����������

�� ������� � ���������� ��� ���� ������! �� $����������

12(! @� �� 2��������4!A��� � ?� ���! 0���! �� "�56"$"

)� /�*#

"" -C>��� 3<! <��� ��� ���� ������������� �����������

�� �������# � )�� ��� ��#�$��+6$�"� )� +5*#

"� '����� <! 2����� ' ��� ?����� B! @����������� ������� ��

������� ���� ����������� �� �� ������ �� �����

����� � ��� ��� �����������# �� *��� ���� ��� -��

!��$�5�6$�5$ )� + *#

"$ 1�����8 & ��� 3����� ?A! '����� ����� �� ������� �

����������� �� ������ ���� ����� �������� �� �� ���� � ��

�� .����� �����! ���"������ �������# )���� ��� ������� �+��+

��/ 6 5 )� "*#

"5 4C.��� .! 3������� , ��� 0R��� BB! .� ����������� �� ��

�� ����� ������ ����8��� ��� ���� � � ��� ������# $� �

)����� ""�"��6"+" )� + *#

"� <�� B>Q! 1�?���� 3. ��� A��� F&! @����������� �������

�� � ��� ����� �� ������ �� ����������� ��� ����������

� ��� �� �� �����# )����� � ��!�/+6 5 )� +�*#

"+ 1�����8 &! -����� F ��� -�� FD! @����������� �� �� ��

������ �������� �� ���� � ��� �� ��� ���� ����# ��

)����� ��+��� "�9�""�6""+ )� �*#

"/ 4 ���;��� @! '(� � �� ��� � ��# � ��3��� ���� �#����6��/

)� + *#

" 1�����8 &! -����� F ��� @�� -! ,�������� �� ������

�������� �� ��� ���� ��� � ���� ���� �� � ���� 7 ����! ��

����� 4�����+ %����������! @� �� G���� 4@ ��� D����� B!

@���� 2���� 3 ������! .�������! �� �/ 6$�� )� /+*#

�� F ���� '! 1 �� �������� ��� 7 ���� �� ��� ��� ����� ���!

�� 4�����+ �������� �� ��� ���� ������+! @� �� < �� <<!

B������ 1 ��� D����� B! @���� 2���� 3 ������!

.�������! �� � 6"+ )� "*#

�� I��� ,! .�� ? ��� 0������ ?! @����� ��� ��� ������

���� �� ������� ����� =���� � ���# �� )����� ��+���

�#!9� �6 / )� $*#

�" 0 ��� 0! D � 0 ��� A������ D! '� ���������� �� �����

=���� � ��# � �� )�� !���5 6��+ )� +�*#

�� ,��� ,! 28���?��O���� .? ��� G�������B��� B! 3���������

��� �� ����� �� �� ���� H�����C � ���# &# 3���������

��� �� � ��� ������# � �� )�� ���""�6"�+ )� +�*#

�$ 2�����8 <! .����� >'! 3� >. ��� 0������ ?! 2 ���� ��

� �� �� �� ��� �� �� ����� ������� ��������� ���

� ��� �� ������ �� �� ���������� ������ �� ����� =����

� ���# ������ ��� ���/�6��� )� $*#

�5 1����� 1! .������� BB! 2�� F���R� 1! 1���� F ��� ,����

1! .������ �� ����������9�������������� ��# � )�� ���

�!#�$�+56$�/" )� 5*#

�� 1��� 4D! <�������� �� ��������� ������� �� ����� ����

��� ��� � ���� �������� �� ��������! ����������! ���

������ ���� ������ ������� �� � �������� ������ ��������#

� $3� 5� �&��"�6�" )� /5*#

�+ 2�� ��� Q! G��8��� � ��� 1�� ���� G! ,��������8����� ��

������ ��� ���������� ���� ������� ���� ��� ��� � ���#

�� )����� ��+��� ��&9���56��� )� �*#

�/ <��� 3@ ��� A������� F<! F����� �� �� ��� ��������� ���

������ ��� ���������� �� ���� �� � ��# )���+� �

!#�2P.15 )� �*#

� 1�����8 &! -����� F ��� -�� FD! 1����� �������� �� �� ���

���� � ��� �� ��� ����� ���� ����# � ������ ,�� ���

���� ���$/ 6$ 5 )� �*#

$� <���������� '! '������������ � ����������� �� ������

�"�+

� �������� � ������� ����� � �����

���� � �� ���� ������ �� �� �� ���� ��������# ����

)����� ��!�$$�6$5� )� /�*#

$� ?������ ,2! 4���� 1B ��� .������ �?! < ��� � ��

�������� ������� �� ������������� �����������# *���!

�+ &&���5"6��5� )� /�*#

$" 2A&22�"4�3.?@ 4������# .����� )"� B �! "���*� �����99

���#(����#��9�������9���"9��S91P2,D@T1-P2@#

$� 1�����8 & ��� ,���������� B2! 1�������� ������� ��

������� ���� � �� �� .����� �����! ���"������ �������

)D#*# �� )����� ��+��� �#!9���6"� )� $*#

$$ 1��8 1! E��8�0����� E! .���� @G ��� > ��� B! P� ��

������������� ����������� �� �� �� ��������� ��

����� )���� ����* � �� �� ������ �� ����� ���� �����

������# � ���� �� ��� � �"� 6"$$ )"���*#

$5 E��8�0����� E! ���!���� ���� ������ �� ��� � ��

�������K������ �� ��� ���������! ��������� �����

��� ��������� �������! �� ��������� � ����� �������

������ ����� 6$"������� � ���� ��������1� ��,7 �8.

((27! @� �� -��������� ?! D �� B! 4������ 3! ,���� 1!

E��8�0����� E! 1������������ @ ��� <�� G! &����������

&����� � �� F����������! 3����! �� "" 6"�+ )� +*#

$� 1�����8 &! 2�;��� '! 4��� 0 ��� .;����� 2! ?����

��� �� ���� �� �������� ������ �� �� �������� .������# &&#

F.34 �������# 988/ ��� ��� �� � ��� ����������� �����

� ��� $3������ � ��� ��� :� $�;! ���� ������ �� ��

&,@2 ,������ � +#

$+ .���� ,! D��� B3! F� ���� , ��� 0�;���� Q! 2��������

���������8����� �� ��������� ��� � ���# �� )�����

��+��� �##9�$5 6$�5 )� �*#

$/ 3��� &! .���8 ,! E��8�0����� E! > ��� B ��� 0������

Q! ��� ���� ��� �� ��� ���� � �� ��������� �� ������

�� ���������8�����# � ��� �� ���� !����6+� )� �*#

$ '� ����� <! G��� 2 ��� 2�� �! 3�������� ������ �� ������������ �������� �� ���� ��� ������� ��� � � ���# *����

������ #�������� � �+ �6+ / )� "*#

5� 0 ��� A.! 2����� 1<! ?� 4@ ��� 2 8 �� .! ,�"������������� �� I ��� ���� ������ ���� � ��# � ��� )��

�����+6�/� )� +"*#

5� '� ����� < ��� 2�� �! .����� �� ������ �� ��������� ������ ��������� ���� ���� ��������# *���� ������ #��������

�!�����6��� )� �*#

�"�/

5" ?��� 0B ��� '����� B! &������� ��� �������� �� ������ �������#

)��������+ �$$/�6$$/ )� � *#

5� G����� G! G ���� 2 ��� 1�� ���� G! 3 ��������� ���

���������8����� �� ���� ��������� ���� $������� ������#

���� )�� ��� �!�5" 65�$ )� /�*#

5$ G����� -.! 0�� ���� 2&! 2������ �&! 0�������� '- ���

2������� .Q! '� �������� ��� �������� �� ����������

������� ���� ���� ������������# )����� )���+� ,��

���� �����$��6�$"� )� �*#

55 '��� &<! ,� ��� GD ��� ,� ��� BD! ,������������ ��

������� ������ �� �� ������ ������� )�������*# ��

)����� ��+��� �9�"�56"� )� /�*#

5� 0��� BF! 1� B2 ��� 1��� 4D! 3 ��������� ��� � ������

���������� �� � ��������� ���� �������� ��������

���� ����� )&���� ���������* ������� � ��# ��

)����� ��+��� �#�� 56 )� �*#

5+ 1��� 4D ��� 2����� 41! >� � ,�"�������� ����������������� ������ ���� �� ������ � �� �������� �� ��8! ��

����� ��� ���������� �� ,�"� ��� ����������# � )�� ���

���� /�56 /+� )� /�*#

5/ 1��� 4D ��� 2����� 41! 1������ ��������� ������ ��

���� �������� �������� �������� ���� ������ ����� ���

������ �� �� ������ � ��# %�" )�� "���/�6� + )� /"*#

5 4�� 2� ������;��� E! ,������������� �� �� ����� ��������

��� (�������� ���� ������ )������� �������* � ��# � ��

��� ����"��6�"�/! �"�� )� /+*#

�� G����� 1�! ?�� 12 ��� ���� 31! <��� ��� �� ��� ��

����� ��������� ��������� �� ����� )����������� ��"�����*

� ��# ������ � )����� )���+� &��"+"6"/5 )� *#

�� 1��� 4D! <������� �������� ���� �������� ����

����� � �� ���� ������ ��������� �������# � $3� 5�

��#�"$$6"5" )� / *#

�" 1��� 4D! 3 ��������� ��� ���������8����� �� � � ����������

�������� ���� �� ������ � ��� ���������� �� ���� ���

������������ �����# ��� )����� )���+� �!��"�"�6"�"/

)� / *#

�� 2����� 2E! 4�� 2�! ?�� 12 ��� ���;��� E! 3�������� ��

������� ��� ��� ���� �� �� � ������# ������ � $3� )��

���$$�6$$$ )� /�*#

�$ 2����� 2E! ?�� 12 ��� ���;��� E! 2< �������� �����

��������� �� ������ )������� �������*# ������ � $3� )��

�"�$��6$�" )� �*#

� ��� �� ���� ����� 6�"�/ )����� "���*