Influence des pigments malariques sur l'infection et la ...
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JULIETTE DIOU INFLUENCE DES PIGMENTS MALARIQUES SUR L'INFECTION ET LA DISSÉMINATION DU VIRUS DE L'IMMUNODÉFICIENCE HUMAINE DE TYPE 1 (VIH-l) Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval dans le cadre du programme de doctorat en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de Philosophire Doctor (Ph.D.) DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE ET CELLULAIRE FACUL TÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAV AL QUÉBEC 2009 © Juliette Diou, 2009
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JULIETTE DIOU
INFLUENCE DES PIGMENTS MALARIQUES SUR L'INFECTION ET LA DISSÉMINATION DU VIRUS DE
L'IMMUNODÉFICIENCE HUMAINE DE TYPE 1 (VIH-l)
Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de Philosophire Doctor (Ph.D.)
DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE ET CELLULAIRE F ACUL TÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LA V AL QUÉBEC
2009
© Juliette Diou, 2009
Résumé
La malaria et le VIH-l sont comptés parmi les maladies les plus meurtrières de ce
siècle. Ensemble, elles causent plus de quatre millions de mort annuellement au niveau des
mêmes régions géographiques, notamment en Afrique sub-saharienne. Les conséquences de
cette co-infection sont des problèmes majeurs de la santé publique à l'échelle mondiale.
L'agent responsable de la forme la plus sévère de la malaria est le parasite Plasmodium
falciparum. Afin d'infecter correctement son hôte humain, le parasite doit dégrader
l'hémoglobine en vu d'assurer son développement. Cette dégradation provoque la synthèse
de molécules d'hème qui, étant toxique pour le parasite, seront cristallisées sous la forme
de pigments malariques appelés hémozoïne (HZ). Ces pigments sont régulièrement associés
directement ou indirectement à la physiopathologie de la malaria. Notre étude repose sur
l'investigation de l'influence des pigments malariques sur l'infection rétrovirale du VIH-l
dans les cellules les plus ciblées par ces deux infections: les cellules phagocytaires
humaines dérivées de monocytes (MDC), à savoir les macrophages, les cellules
dendritiques et les lymphocytes T CD4 +. Lorsque les pigments d' HZ sont présents dans les
MDC, on observe une inhibition de l'infection virale mais une augmentation de la
dissémination du VIH -1 dans les lymphocytes. En effet, dans les macrophages dérivés de
monocytes cette phagocytose d' HZ est responsable de l'arrêt du cycle viral à une étape
comprise entre la transcription inverse et l'intégration du VIH -1. Le mécanisme
responsable de cette inhibition n'est pas tout à fait identifié, cependant l'explosion
oxydative induite par la phagocytose d'HZ semble être responsable d'une inhibition de la
production intracellulaire d'ATP, vitale pour le transport du VIH-l dans le noyau. En ce
qui concerne les cellules dendritiques, les changements phénotypiques induits par l'HZ
démontrent une diminution de l'expression du récepteur CCR5, essentiel pour l'entrée du
VIH-l dans la cellule hôte. La présence d'HZ dans les MDC rend les cellules plus aptes à
activer les lymphocytes, favorisant ainsi la réplication virale. Effectivement, l'HZ accroit la
prolifération des lymphocytes T CD4+ résultant en une augmentation de l'infection et du
transfert du VIH-l. Les co-infections étant de plus en plus contraignantes, il est primordial
d'augmenter le nombre d'études fondamentales afin de mieux comprendre les interactions
régissant l'aboutissement fatal de ces deux maladies. Ceci est impératif pour le
développement de nouvelles thérapies combinatoires pour les patients co-infectés.
Abstract
Malaria and HIV -1 are two of the most devastating global health problems of our
time. Together, malaria and HIV -1 cause more than 4 million deaths a year. To a
substantial extend, both are concentrated in the same geographical regions. The resulting
co-infection and interaction between the two diseases have major public health
implications. The agent responsible for malaria is the protozoan parasite Plasmodium
falciparum. To properly infect, the parasite needs to grow using the host's hemoglobin. As
so, during hemoglobin degradation free heme, toxic to the parasite is produced and
converted into malaria pigments called hemozoin (HZ). Those pigments have always been
directly or indirectly associated to the physiopathology of malaria. We investigated the
impact of HZ exposure on HIV -1 retro viral infection of preferential targets for both
infections: primary hurnan monocyte-derived phagocytic cells (MDCs) and CD4+ T
lymphocytes respectively. When HZ is present in MDCs cells, our experiments showed a
decrease of viral infection but an increase of HIV -1 dissemination to CD4 + T cells. Indeed,
hemozoin phagocytosis inhibited HIV -1 replication in monocytes-derived macrophages in
an event taking place between reverse transcription and integration in the host genome. The
complete mechanism implicated here was not fully described but we are expecting HZ
induced oxidative burst to inhibit intracellular A TP production, vital for HIV -1 transport to
the nucleus. In the case of monocyte-derived dendritic cells, cellular phenotypic changes
induced by HZ were responsible for reduced expression of CCR5, essential for HIV-1
entry. The presence of HZ within MDCs renders cells more efficient to prime lymphocytes
for HIV -1 replication. As a fact, HZ-induced proliferation of CD4+ T cells resulted in an
increase of viral infection and transfer. Co-infections are a growing problem. More and
more basic studies are thus needed to fully understand the cellular consequences of such
deadly interactions. This is imperative for future studies to find suitable drug combinations
for co-infected individuals.
11
111
Avant-Propos, remerciement et épilogue
Arrivée à l'aboutissement de mon doctorat, et plus particulièrement à la rédaction
cette toute dernière section, seuls deux mots me viennent à l'esprit : The End. En effet, cette
thèse est un aperçu concis des mes quatre années de doctorat, de la fin de ma vie étudiante
et du début d'une vie professionnelle qui, je l' espère, sera toute aussi fructueuse que cette
dernière. En me remémorant les raisons qui m' ont conduit à choisir cette voie, il vient sans
dire que mes motivations n'ont pas été seulement personnelles et stratégiques mais aussi
humaines. Ainsi, avant toute chose, je voudrais remercier le docteur Michel 1. Tremblay qui
a su reconnaitre mes aptitudes et surtout m'offrir l' opportunité de nourrir une de mes plus
grandes ambitions: rechercher, comprendre et participer à la lutte vers une meilleure
interprétation des mécanismes impliqués dans la co-infection par le Plasmodium
falciparum et le VIH-l. Effectivement, Michel a tout de suite accepté mon projet de
doctorat et m'a offert les possibilités d'en choisir le devenir. Je tiens également à remercier
Mélanie Tardif et Caroline Gilbert qui ont toujours été de bons conseils et qui ont été
associées de près comme de loin à mon projet. De plus, l'une des caractéristiques du
laboratoire du docteur M. J. Tremblay est l'importante diversité des membres qui la
compose. Par conséquent, remercier individuellement chaque individu est chose
impossible, mais merci à vous tous. Plus particulièrement, je tenais à faire un clin d'œil à
Lupe, Mike, Ravendra, Sandra, sans oublier les membres du SAFERA! Merci aux Bonnets
Verts, je serai toujours une militante active de votre art. A Nath pour nos conversations
dans le p2. Merci à Dave et Réjean pour les fous rires est une initiation inoubliable.
Maintenant pour la petite larme, je voudrais remercier mes plus grands fans: ma
famille. Merci pour avoir supporté, en tout sens, ma vie depuis ces presque 30 dernières
années. Merci pour m'avoir menti pendant tant d'années en me disant qu'avec le temps les
études devenaient plus faciles. Merci d'être vous! Merci également à ma sœur, qui a subi
les conséquences de mes études pendant tant d'années, que ferais-je sans toi? L'année
prochaine sera la notre! Merci à tous les copains dispersés aux quatre coins du monde mais
qui ont toujours été dans mon cœur. Et enfin, merci à Sylvain, l'amour de ma vie, mon roc!
Merci pour avoir toujours été là malgré les tempêtes et surtout merci pour la crise de 2005!
IV
À mafamille, Tooky et Claire
v
Table des matières
Résumé ..................................................................................................................................... i Abstract .................................................................................................................................. ii Avant-Propos, remerciement et épilogue .............................................................................. iii Table des matières .................................................................................................................. v Liste des tableaux ................................................................................................................. vii Liste des figures .................................................................................................................. viii Liste des abréviations ............................................................................................................. ix Chapitre 1. Le virus de l'immunodéficience humaine ............................................................ 1 1 Le SIDA dans le monde .................................................................................................. 1
1.1 Actualités épidémiologiques ................................................................................... 1 1.2 Historique du VIH -1 ............................................................................................... 2 1.3 Origine du VIH-1 .................................................................................................... 3
2 Le virus d'immunodéficience humaine de type 1 ........................................................... 4 2.1 Le VIH -1, un rétrovirus .......................................................................................... 4 2.2 Les types et sous-types du VIH .............................................................................. 4 2.3 La structure du VIH-l ............................................................................................. 5 2.4 Les récepteurs du VIH-l ......................................................................................... 7
2.4.1 Mécanisme de l'attachement viral ...................................................................... 8 2.4.2 Les protéines de l'enveloppe .............................................................................. 9 2.4.3 Les corécepteurs ......................................................................................... ........ 9 2.4.4 Les autres récepteurs du VIH-l ........................................................................ 10
2.5 Le cycle de la réplication virale ............................................................................ 11 2.5.1 L'entrée virale ............................................................................................. ...... 11
2.5.1.1 La fusion ................................................................................................... 12 2.5.1.2 L'endocytose ............................................................................................. 13
2.5.2 Le transport intracellulaire du VIH-1, de la fusion à l'intégration ................... 14 2.5.3 L'intégration et le complexe de pré-intégration ............................................... 16 2.5.4 La transcription virale ....................................................................................... 17 2.5.5 La traduction, l'assemblage et le bourgeonnement .......................................... 18
2.6 Les cibles du VIH-1 .............................................................................................. 21 2.6.1 Les lymphocytes ............................................................................................... 21
2.6.1.1 Les Lymphocytes T .................................................................................. 22 2.6.1.2 Les Lymphocytes B .................................................................................. 24 2.6.1.3 La latence et lymphocytes T mémoires .................................................... 25
2.6.2 Les monocytes .................................................................................................. 25 2.6.3 Les macrophages ............................................................................................... 26
2.6.3.1 Caractéristiques spécifiques aux macrophages ......................................... 26 2.6.3.2 Le transfert viral ........................................................................................ 28
2.6.4 Les cellules dendritiques ................................................................................... 30 2.6.4.1 L'infection des DC .................................................................................... 32 2.6.4.2 Le transfert viral ........................................................................................ 33
Chapitre II. La co-infection VIH-1/SIDA et malaria ............................................................ 37 1 Aspects épidémiologiques de la co-infection ............................................................... 38 2 Aspects immunologiques de la co-infection ......................................... .. ... .................. . 39 3 Impact de l'infection du VIH -1 et de la malaria en co-infection .................................. 40
3.1 Chez les adultes .................................................................................................... 40 3.2 Lors de la transmission mère enfant ..................................................................... 41
4 Les traitements anti-malariques et antirétroviraux en combinaison ............................. 42 Chapitre III. Le Plasmodiumfalciparum .............................................................................. 44 1 Le cycle du P. falciparum ............................................................................................ 46 2 Le cycle érythrocytaire ................................................................................................. 47
2.1 Les compartiments membranaires de l'érythrocyte infecté .................................. 47 2.2 La formation de l'hémozoïne ................................................................................ 49
3 L 'hémozoïne et la réponse immunitaire de l'hôte ........................................................ 51 3.1 Les effets inhibiteurs de l' HZ ............................................................................... 51 3.2 Inhibition de la différenciation et de la maturation des cellules dendritiques ...... 52 3.3 Activation des neutrophiles par l'HZ .................................................................... 54 3.4 Les autres effets de l'HZ ....................................................................................... 55 3.5 L'HZ comme cible thérapeutique possible ........................................................... 56 3.6 L'HZ et le VIH-1 .................................................................................................. 58
Chapitre IV. La phagocytose des pigments malariques (hémozoïne ou HZ) rend les macrophages humains moins permissifs à l'infection du VIH-1 .......................................... 59 1 Résumé .......................................................................................................................... 59 2 Article ........................................................................................................................... 61 Chapitre V. La maturation des cellules dendritiques dérivées de monocytes par les pigments malariques augmente le transfert précoce du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ ................. 1 04 1 Résumé ........................................................................................................................ 104 2 Article ......................................................................................................................... 105 Chapitre VI. Les cellules dendritiques dérivées de monocytes traités à l'hémozoïne possèdent un phénotype partiel de maturation favorisant l' insfection en trans et la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ .......................................................... 134 1 Résumé ........................................................................................................................ 134 2 Article ......................................................................................................................... 135 Chapitre VII. Discussion générale ...................................................................................... 169 1 La phagocytose de l'sHZ rend les MDM moins permissifs à l'infection du VIH-1 .. 171 2 L' sHZ induit une maturation des DC immatures similaire à celle induite par le LPS/IFN-y ........................................................................................................................... 174 3 Les changements phénotypiques induits par l' sHZ dans les cellules phagocytaires dérivées de monocytes augmentent le transfert du VIH-1 aux cellules T CD4+ ................ 176 4 Interactions possibles entre les pigments malariques et le VIH-1 dans le cerveau .... 180 5 Perspectives à court terme ................... ........................................................................ 182 6 Perspectives à long terme ........................................................................................... 185 Chapitre VIII. Conclusions ................................................................................................. 187
Bibliographie .................................................................................................................. 189 Annexe 1 : Interactions potentielles entre les drogues anti-malariques et anti-VIH-1 ....... 220 Annexe 2 : Phénotype des DC immatures traitées à l'sHZ ................................................. 223 Annexe 3 : Phénotype des monocytes dérivés en DC en présence d'sHZ ......................... 224 Annexe 4 : Phénotype des monocytes dérivés en macrophages en présence d'sHZ .......... 225 Annexe 5 : Article 4 ............................................................................................................ 226
VI
VIl
Liste des tableaux
Tableau 1: Rapport sur l'épidémie mondiale du SIDA en 2008 (ONUSIDA) ................. 2 Tableau 2: Phénotype des DC ............................................................................................ 32 Tableau 3: Résumé des études de l'effet du Plasmodium sur les DC ............................. 53 Tableau 4: Drogues anti-malariques inhibant la formation d'HZ ................................. 57
VU1
Liste des figures
Figure 1: Coupe schématique du VIH-l ............................................................................. 5 Figure 2: Organisation du génome et protéines du VIH-l ................................................ 6 Figure 3: Résumé du rôle des protéines virales ................................................................. 7 Figure 4: Illustration du mécanisme de l'attachement viral. ............................................ 8 Figure 5: Cycle viral du VIH-l .......................................................................................... 11 Figure 6: Changements de conformation à l'origine de la fusion virale à la membrane
plasmique ..................................................................................................................... 12 Figure 7: Localisation cellulaire du génome du VIH-1 en présence et en absence
d'ADNFlap .................................................................................................................. 15 Figure 8: Modèle actualisé du transport intracellulaire du VIH-1 ................................ 16 Figure 9: Trafic et voie d'assemblage du VIH-1 .............................................................. 20 Figure 10: Évolution de la charge virale et du système immunitaire ............................ 22 Figure Il: L'hypothèse du "cheval de Troie" .................................................................. 28 Figure 12: Différences et similitudes entre les synapses virale et immunologique ....... 29 Figure 13: Transmission du VIH-1 d'une DC à une cellule T CD4+ .............................. 34 Figure 14: altération de la synapse immunologique par le VIH-1 ................................. 36 Figure 15: Distribution globale de la malaria (à gauche) et de l'infection au VIH-1 (à
droite) ........................................................................................................................... 39 Figure 16: Organisation des organelles du P. falciparum ............................................... 44 Figure 17: Le cycle du Plasmodium falciparum ................................................................ 46 Figure 18: Cycle intra-érythrocytaire du P.falciparum .................................................. 48 Figure 19: Cristaux d'HZ dans la vacuole digestive ........................................................ 49 Figure 20: Accumulation de l'HZ (rate) ........................................................................... 50 Figure 21: Dosage de l'ATP intracellulaire dans les MDM .......................................... 182 Figure 22: Expression du CXCR4 dans les DC .............................................................. 184
Liste des abréviations
4-HNE
A
ADN
ADNc
ADNv
ALT
AP-l
APOBEC3G
ARN
ARNg
ARNm
ARNt
ARNv
ARV
ATP
AZT
B
BAF
Bcl
Btk
C
CA
CCL
CCR
CD
CDm
CDp
CMH
4-hydroxynonénal
Apicoplaste
Acide désoxyribonucléique
Acide désoxyribonucléique complémentaire
Acide désoxyribonucléique viral
Asymptomatique à long terme
Protéine activatrice 1
de l' anglais apolipoprotein B mRNA-editing enzyme
ca ta ly tic polypeptide-like-3 G
Acide ribonucléique
Acide ribonucléique génomique viral
Acide ribonucléique messager
Acide ribonucléique de transfert
Acide ribonucléique viral
de l'anglais AIDS-associated retrovirus
Adénosine triphosphate
Azidothymidine
Bourse de Fabricius
de l'anglais B cel! activating factor
de l'anglais B-cel!leukemia/lymphoma
de l'anglais Bruton 's tyrosine kinase
Cytostome
Capside
de l' anglais Chemokine (C-C motif) ligand
de l'anglais CC-chemokine receptor
de l'anglais Cluster of differentiation
Cellule dendritique myéloïde
Cellule dendritique plasmacytoïde
Complexe majeur d'histocompatibilité
IX
cPPT
CPA
CPI
CPN
CREB
CTL
CTS
CXCR
CYP3A
OC
DCIR
DC-SIGN
EEAI
EFV
ERK
ESCRT
FISH
FM
FRO
G
GFP
GM-CSF
gp
GPI
GR
GRP
HAART
HLA-DR
de l'anglais Central polypurine tract
Cellule présentatrice d'antigène
Complexe de pré-intégration
Complexe du pore nucléaire
de l'anglais cAMP response element binding
Cellule T CD8+ cytotoxique
de l'anglais Central termination sequence
de l'anglais CXC-chemokine receptor
de l'anglais 3A subfamily of the cytochrome P450
de l'anglais Dendritic cells
de l'anglais Dendritic cell immunoreceptor
de l'anglais Dendritic cell-specific intercellular
adhesion molecule 3-grabbing non-integrin
de l'anglais Early endosome antigen 1 protein
Efavirenz
de l'anglais Extracellular signal-regulated kinase
de l'anglais endosomal sorting complex required for
transport
de l'anglais Fluorescent in situ hybridization
Fissures de Maurer
F orme réactives de l'oxygène
de l'anglais Guanine nucleotide binding pro teins
de l'anglais Green fluorescent protein
de l'anglais Granulocyte macrophage-colony
stimulating factor
glycoprotéine
Glycosylphosphatidylinositol
Globules rouges
Globules rouges parasités
de l'anglais Highly active an tire tro vira 1 therapy
de l'anglais Human Leukocyte Antigen DR
x
HSA
HTLV-III
HZ
ICAM
IFN-a
IFN-p
IFN-y
Ig
IL
IN
Ini
IRF
IS
ISRE
IVBMC
kDa
LAV
LCK
LE
LEDGF
LPS
LTA
LTR
M
MA
MAPK
M-CSF
MDC
MDDC
MDM
MlF
de l'anglais Heat stable antigen
de l'anglais Human T-cell lymphotropic virus type III
Hémozoïne
de l' anglais intercellular adhesion molecule
Interféron a
Interféron p
Interféron y
Immunoglobuline
Interleukine
Intégrase
de l'anglais Integrase interactor
de l'anglais IFN regulatory factor
Synapse immunologique
de l'anglais IFN-stimulated response element
de l'anglais Intervillous mononuclear ce Ils
Kilodalton
de l'anglais Lymphadenopathy-associated virus
de l'anglais Leukocyte-specific protein tyrosine kinase
Endosomes tardifs
de l'anglais Lens epithelium-derived growthfactor
Lipopolysacharide
de l'anglais Lipotechoic acid
de l'anglais Long terminal repeat
de l'anglais Major
Matrice
de l'anglais Mitogen activated pro te in kinase
de l'anglais Macrophage-colony stimulatingfactor
de l'anglais Monocyte-derived cells
de l'anglais Monocyte-derived dendritic cells
de l'anglais Monocyte-derived macrophages
de l' anglais Macrophage migration inhibiting fac tor
Xl
MIP
Mito
MMP
MPP
MVB
MVP
MyD88
N
NADPH
NC
Nef
NFAT
NF-KB
NK
NKT
NLS
NO
NRE
NRTI
NNRTI
o PAMP
PBMC
PBS
PDI
PtHZ
pH
PIC
de l'anglais Macrophage inflammatory protein
Mitochondrie
de l'anglais Matrix metalloproteinases
Membrane plasmique parasitaire
de l'anglais Multivesicular bodies
Membrane de la vacuole parasitophore
de l'anglais Myeloid difJerentiation primary response
gene 88
de l'anglais Non-M, Non-O
de l'anglais Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate
Nucléocapside
de l'anglais Negative regulatory factor
de l'anglais Nuclear factor of activated T ce Ils
de l'anglais Nuclear factor ofkappa B
de l'anglais Natural killer
de l'anglais Natural killer T ce Ils
Signal de localisation nucléaire
Oxyde nitrique
de l'anglais Negative regulatory element
de l'anglais Nucleoside reverse transcriptase inhibitor
de l'anglais Non-nucleoside reverse transcriptase
inhibitor
de l'anglais Outlier
de l'anglais Pathogen- associated molecular patterns
de l'anglais Peripheral blood mononuclear cell
de l'anglais Primer binding site
de l'anglais Protein disulfide isomerase
Hémozoïne isolé du P. falciparum (native)
de l'anglais Power ofhydrogen
de l'anglais Pre-integration comp/ex
Xll
PIP2
PG
PHA
PI3K
PKC
PKR
PM
PN
PPAR
PRR
RANTES
RCT
RE
Rev
RLU
RNAseH
RNP
ROS
RRE
RRL
RT
RTC
RXR
SDF
sHZ
SIDA
SLN
SOD
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate
Peptidoglycan
Phytohémaglutinine
Phosphatidylinositol-3-kinase
de l ' anglais Protein kinase C
de l'anglais Protein kinase R
Malaria placentaire
Polynucléaires neutrophiles
de l'anglais Peroxisome prolijera tor-activa ted
receptors
de l'anglais Pattern recognition receptor
de l'anglais Activation, normal T-cel/ expressed, and
secreted
Récepteur des cellules T
Réticulum endoplasmique
de l'anglais Regulation of expression of viral pro teins
de l'anglais Relative light units
Ribonucléase H
Ribonucléoprotéiques
Espèces réactives d'oxygène
de l'anglais Rev responsive element
Répétition riche en leucines
Rétro-transcription
de l'anglais Retro-transcription complex
Récepteur des rétinoïdes
de l'anglais Stroma cel/-derived factor
Hémozoïne synthétique
Syndrome de l'immunodéficience acquise
Signal de localisation nucléaire
Superoxyde dismutase
XlIi
STAT
SU
T
TAB
TAKI
TAR
Tat
TBKl
TGF
TH
THP-I
TI
TLR
TM
TNF
TNF-R
TRIM5a
TVN
VD
Vif
VIH
VIS
VP
Vp
VS
VSV
VRS
de l'anglais Signal Transducers and Activators of
Transcription protein
Glycoprotéine de surface
de l'anglais thymus-derived
de l'anglais TAK-l-binding pro te in
de l'anglais TGF-fJ-activated kinase 1
de l'anglais Transactivation response region
de l' anglais Transactivator of transcription
de l'anglais TRAF-family member associated NF-KR
activator (TANK)-binding kinase 1
de l'anglais Transforming growth factor
de l'anglais T helper
de l'anglais Human acute monocytic leukemia cel/line
Transcriptase inverse
de l'anglais Tol/-like receptor
Glycoprotéine transmembranaire
de l'anglais Tumor necrosis factor
de l'anglais Tumor necrosis factor receptor
de l'anglais Tripartite motif 5 a
Structures membranaires et vésiculaires
Vacuole digestive
de l'anglais Virion infectivity factor
Virus de l'immunodéficience humaine
Virus de l'immunodéficience simienne
Vacuole parasitophore
de l'anglais Viral protein
Synapse virologique
Virus de la stomatite vésiculaire
Virus respiratoire syncitial
XIV
1
Chapitre 1. Le virus de l'immunodéficience humaine
« Le virus d'immunodéficience humaine (VIH-l) est le virus qui cause le syndrome
d'immunodéficience acquise (SIDA). Le VIH-l attaque le système immunitaire, causant
ainsi une maladie chronique progressive, rendant les gens atteints vulnérables aux
infections opportunistes et aux cancers. La période moyenne dépasse maintenant 10 ans
entre le moment où l'infection est transmise et le moment où le SIDA est diagnostiqué. Le
SIDA est mortel. Il n'existe aucune façon de le guérir»
Santé Canada, 2008.
1 Le SIDA dans le monde
1.1 Actualités épidémiologiques
Le premier cas de sida a été relevé en 1981 aux États-Unis. Depuis ces 25 dernières
années dans le monde, on dénombre 25 millions de décès dus à des maladies associées au
SIDA et 65 millions de personnes ont été infectées par le VIH-1 (ONUSIDA). Les chiffres
le prouvent, le SIDA demeure une cause majeure de mortalité dans le monde. Cependant,
de nouvelles données montrent que la prévalence mondiale du VIH-1, c'est-à-dire le
pourcentage de personnes vivant avec le VIH-1, s'est stabilisée et que le nombre de
nouvelles infections a chuté (voir Tableau 1). Ce phénomène peut être partiellement
expliqué par la recrudescence de programmes de lutte contre le VIH-1. Néanmoins,
l'estimation précise des causes de mortalité est laborieuse dans la majeure partie du monde,
faute de données viables. En effet, le SIDA fournit un cas exemplaire des difficultés de
l'évaluation de l'état sanitaire du monde et en particulier de la morbidité. Dans le passé, la
majorité des chiffres produits étaient erronés, parce qu'ils avaient été calculés sur des
échantillons non représentatifs de populations très particulières [1]. Par conséquent, les
nouveaux chiffres traduisent l'amélioration (encore trop faible) des échantillonnages et de
la qualité des sources.
Tableau 1: Rapport sur l'épidémie mondiale du SIDA en 2008 (ONUSIDA)
Hommes 14 millions
Personnes vivant avec le 3~ ~11!l· . VIH/SIDA: ., ml Ions
~--~--~----~~
Femmes 17 millions
Enfants 2 millions
Hommes et
Personnes nouvellement Femmes 2.1 millions .....-----+-------1
2.33 millions
infectées par le VIH/SIDA:
Décès dus au VIH/SIDA: 2 milUons
Enfants
Hommes et Femmes
370000
2 .. 33 millions
Enfants 310000
5400 décès par jour en 2008
2
Selon les estimations de l'ONUSIDA, l'Afrique subsaharienne reste la région la plus
sévèrement touchée. En effet, il y a eu 1.9 millions [1.6 - 2.1 millions] de nouvelles
infections en Afrique subsaharienne en 2007, ce qui porte à 22 millions [20.5 - 23.6
millions] le nombre de personnes vivant avec le VIH -1, soit deux tiers (67%) du total
mondial. Trois quarts (75%) des décès dûs au SIDA s'y sont produits en 2007. Plus de 60%
des personnes infectées par le VIH-1 sont des femmes; 90% des enfants de moins de 15 ans
infectés par le VIH-1, et morts d'une maladie liée au SIDA, vivent en Afrique
subsaharienne. En somme, il est important d'adapter et de repenser les efforts de prévention
du VIH-1 au moment même où certains pays observent un renversement des tendances à la
baisse.
1.2 Historique du VIH-l
Le 5 juin 1981, Michael Gottlieb publiait un article sur cinq cas d'une maladie rare
diagnostiquée chez des hommes homosexuels. Il faisait état des cinq premiers cas d'une
maladie qui allait être connue sous le nom de SIDA. Ce que l'on ne savait pas à l' époque,
c'est que des milliers d' autres personnes étaient déj à infectées par le VIH -1. Par sa forte
période d'incubation entre l'infection et l'apparition des symptômes, la nature de la maladie
est difficile à détecter. La propagation du VIH -1 est l' épidémie à la fois la plus dévastatrice
3
et la plus paradoxale. L'épidémie la plus meurtrière de l'histoire moderne est due à un virus
qui n'est pas particulièrement contagieux contrairement à d'autres maladies infectieuses
dont la grippe et la rougeole. En revanche, la propagation du VIH-l est relativement facile
à prévenir, notamment lorsque les individus informés sont en mesure de se protéger [2].
En 1983, un groupe de chercheurs et de médecins à l'Institut Pasteur, dirigé par le
docteur Luc Montagnier, découvre un nouveau virus chez un patient présentant les signes et
les symptômes qui précèdent souvent le SIDA. Ils appellent leur découverte le virus associé
à la lymphadénopathie (LAV) [3] et suite à une collaboration avec le docteur Robert Gallo
aux États-Unis, le virus sera rebaptisé virus de l'immunodéficience humain ou VIH [4].
Depuis, plus de 190 000 publications dédiées la recherche sur le VIH -1 sont répertoriées
dans les services de recherches bibliographiques mondiales.
1.3 Origine du VIH-1
Il est connu que le virus du SIDA provient du chimpanzé. Il semblerait même que
différentes souches du VIH soient issue du VIS (Virus Immunodéficient Simien). En
réalité, le VIS proviendrait de la recombinaison de deux souches de virus provenant de
deux petits singes, dont se nourrissent les chimpanzés : des comparaisons génétiques ont en
effet montré que le VIH -1 était un mélange des virus immunodéficients respectifs du singe
hocheur (Cercopithecus nictitans) et du cercocèbe à collier blanc (Cercocebus torquatus)
[5]. Depuis plusieurs années, la plupart des chercheurs pensent que le VIS a contaminé
l'homme par le biais de chasseurs ou de braconniers se nourrissant de viande de chimpanzé.
En effet, cette logique émane de la capacité du VIH-l à se transmettre par le biais du sang
ou des sécrétions sexuelles. De façon étonnante, il semblerait que les chimpanzés aient
connu autrefois une épidémie de SIDA semblable à celle qui touche les populations
humaines actuelles. Celle-ci aurait littéralement décimé leur population, n'épargnant que les
rares individus restants dont les descendants sont les chimpanzés actuels et pour qui, une
infection par le VIS n'est désormais, que bénigne. La première souche identifiée VIH-l du
groupe Majeur (M), semble remonter aux années 1959 chez un patient originaire de la
république démocratique du Congo [6].
4
2 Le virus d'immunodéficience humaine de type 1
2.1 Le VIH-l, un rétrovirus
Les rétrovirus sont des VIruS globulaires enveloppés mesurant enVIron 100
nanomètres de diamètre et très répandus dans le monde animal. Ils sont la cause de
différentes formes de cancers, d'immunodéficiences (dont le SIDA) et de dégénérescences
du système nerveux central. En effet, leur classification permet l'identification de trois
sous-familles: les Oncovirus, les Spumavirus et les Lentivirus. Alors que les deux
premières sous-familles de virus peuvent induire des tumeurs des plus variées ou des
infections asymptomatiques, les Lentivirus sont responsables de maladies à évolution lente.
C'est à cette sous-famille qu'appartiennent les virus de l'immunodéficience humaine de type
1 (VIH-l) et 2 (VIH-2). La particularité de ces virus est leur capacité à s'intégrer à l'ADN
de la cellule hôte et d'utiliser la machinerie cellulaire afin de se répliquer. Ainsi, le VIH-l
engendre une infection chronique, caractérisée par une phase de latence clinique très longue
(pouvant atteindre dix ans). Cependant, dès la primo-infection et jusqu'aux stades avancés
de la maladie, le virus est présent en permanence. Tous les différents types cellulaires ciblés
par le VIH-l peuvent être responsables du phénomène de latence car ils jouent un rôle de
« réservoir viral ». En effet, les macrophages et les cellules dendritiques favorisent une
transmission de cellules à cellules au sein de différents organes en fonction de leur
localisation. Bien que les lymphocytes circulants ne constituent pas le réservoir le plus
important en nombre, ils représentent cependant un problème majeur pour l'élimination
complète du virus chez les patients en raison de leur demi-vie extrêmement longue [7].
2.2 Les types et sous-types du VIH
Les VIH sont des virus extrêmement divers et classés en 2 types: VIH-l et VIH-2.
Certaines données indiquent que le VIH-l a pour origine la sous-espèce de chimpanzés Pan
troglodytes [8], alors que le VIH-2 trouve son origine chez le singe Cercocebus torquatus
[9]. Alors que le VIH-l est présent dans tous les pays, le VIH-2 est principalement
cantonné principalement à l'Afrique de l'Ouest. Les virus du type 1 possèdent trois groupes
de VIH-l : le groupe M (Major), le groupe 0 (Oudier) et le groupe N (Non-M Non-O). Les
VIH-l du groupe M sont responsables de la pandémie du VIH/SIDA : à ce jour, 9 sous-
5
types ont été caractérisés (A, B, C, D, F, G, H, J et K) et plus de 20 formes recombinantes
ont été identifiées, dont certaines très récemment. Le VIH-2 se subdivise en sous-types A et
B. Cependant les techniques de séquençage d'ADN ont récemment permis de caractériser
les sous-types C, D et E [10]. Des données récentes recueillies au Sénégal suggèrent que
l'infection par le VIH -2 offre une protection partielle contre une surinfection par le VIH-1
[11 ].
Il n'est donc pas surprenant que la diversité de ces rétrovirus peut poser des
problèmes diagnostiques et thérapeutiques. En conséquence, il est nécessaire de bien
différencier une infection par VIH-l ou par VIH-2, du fait des différences de pathogénicité
des deux virus et de leur résistance naturelle aux antirétroviraux. En effet, le potentiel
évolutif de l'infection par VIH-2 est plus lent que celui de VIH-1, probablement en raison
d'une réplication virale moins importante. De même, le risque de transmission du VIH-2
est plus faible que celui du VIH-1.
2.3 La structure du VIH-l
~è~
CapSl(je, {p24.
m
(1)1201
(1)4' 1
Figure 1: Coupe schématique du VIH-l
Les lettres gp signifient glycoprotéine, p signifie protéine (Image originale de
Daniel Beyer traduite et illustrée sur le site internet Wikipédia [12])
6
Le génome du VIH-l, fonné de deux molécules d'ARN identiques d'environ 9700
paires de bases chacune, est constituée de trois gènes structuraux fondamentaux pour les
rétrovirus: gag, pol et env (de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3') (Figure 2). L ' intégration du
provirus (séquence d'ADN double brin incorporée dans un chromosome) dans le génome de
la cellule hôte est dépendant de séquences de taille variable appelées les L TR (Long
Terminal Repeat). Situées à chaque extrémité du génome, ces séquences renfennent les
éléments promoteurs nécessaires à l'expression de gènes spécifiques. Ce génome, en plus
des trois gènes habituels, possèdent également six gènes supplémentaires appelés « gènes
accessoires» qui sont situés entre les gènes pol et env et à la suite du gène env. Ces gènes
appelés tat, rev, vif, vpr, vpu (VIH-l) ou vpx (VIH-2) et nef sont impliqués dans des
phénomènes de régulation de l'expression des protéines virales et, par là même occasion,
de la multiplication du virus.
Figure 2: Organisation du génome et protéines du VIH-l
Adaptée d 'une image originale illustrée [13]
Contrairement à une cellule, le VIH-l ne peut se reproduire à l'état libre. Ainsi, il
requiert les fonctions de protéines spécialisées afin d'envahir la cellule hôte. Les lentivirus
diffèrent de la plupart des autres rétrovirus par leur capacité à réguler l'expression de leurs
propres gènes. Un résumé de la fonction des gènes du VIH -1 est illustré dans la figure 3.
Mais plus précisément, le gène gag code pour des protéines essentielles à l' assemblage et
LTR
7
au bourgeonnement des particules virales. En effet, l'obtention des protéines de la matrice
(MA), de la capside (CA) et de la nucléoprotéine (NC) sont issues de l'expression et du
clivage d 'un précurseur protéique codé par gag. Le gène pol (polymérase) est responsable
de l ' expression des enzymes essentielles à la réplication virale : la RT (transcription
inverse) associée à l'activité ribonucléase H (RNAse H), l ' intégrase (IN) et la protéase
(PR). La glycoprotéine de surface (SU) et la glycoprotéine transmembranaire (TM),
constituant l'enveloppe virale en association avec les protéines de la membrane cellulaire,
résultent du clivage par une protéase cellulaire d'un large précurseur codé par le gène env
(enveloppe). Les gènes accessoires codent pour différentes protéines régulatrices : Tat
(Transactivator of transcription), Rev (Regulation of expression of viral proteins),Vif
(Virion infectivity factor), Vpu (Viral protein u), Vpr (Viral protein r) et Nef (Negative
regulatory factor). Tat et Rev sont essentielles à la réplication virale, tandis que les autres
sont appelées protéines accessoires car leur mutation n'est pas délétère pour la réplication
virale in vitro. Leurs rôles est de permettre une augmentation de l'infectivité virale par
différents mécanismes [14].
vif env nef Gœnparte les réDons de conlrale de la transatpdon et estn~reàla IrW1sa1p11oo du B610me virai
SIabIllse les mmpleœs de la tran~on Inverse et InhIJe l'acllvllé des pr-ot&es mldvlJ'des (APOBEC 36)
"pu Favortsela~on des mol«Ues de (1)4 et la dlssodallon du virus à la membrane œlulalre
Se dive en 2 protéines: fil BPl20 essen1lele à rattac:hernent du virus et fil pl favodsantla fusion virale_la
Favutse l'KllvaIon des lymphocytes T CD4t-,
pr-éWent le • suldde œlldare 1, augmente rmfection llirale.(ette
manbillle a:IuIïJire J"",,-P'_uti:il_'. le est SOUftJlt associée à la pr-ocression cip.la maladlp.
gag Se dive en 3 protéines: la malriœ, la œpde et la nudéoapsides. Toutes sont illlpOf1Bltes pour l'assernI:Ase du virion
pol Code pour plusieurs enZ\1fK5 teles que 1"lIItêBrase, la pr-otœse et la transatptase Inverse
Régule les êbpes pr-émce de rlrlfeclion et
I l
est essenlele pour rev infMer ef6caœment les Répje l' eJpOrtnud6llre des maaophages ARNm néosyrnhélhlsés
Figure 3: Résumé du rôle des protéines virales
Adaptée et traduite d'une image originale illustrée [15]
2.4 Les récepteurs du VIH-l
3-'
tat Auptentela InInsaiptiorJ virale et favorise radlvatlon des Iymphocyles TCD4+
Le VIH-I est présent dans tous les liquides biologiques de 1'organisme des personnes
atteintes. Les risques de transmission du virus s'intensifient lorsqu' il y a contact entre un
8
liquide contaminant et une muqueuse ou une plaie ouverte. Il infecte essentiellement les
cellules T helper, les macrophages et dans une certaine mesure les cellules microgliales et
les cellules dendritiques. Ce tropisme est déterminé au niveau de l'entrée virale.
2.4.1 Mécanisme de l'attachement viral
Le processus d'entrée virale commence avec l'attachement de l'enveloppe virale à
une cellule permissive de l'hôte (Figure 4). Ainsi, les protéines de l'enveloppe virale
s'attachent au récepteur CD4 exprimé sur les cellules de 1 'hôte. Cette enveloppe virale est
dérivée de la surface membranaire des cellules de 1 'hôte par un mécanisme spécialisé ayant
lieu lors du bourgeonnement de virions matures. De plus, l'enveloppe virale est recouverte
de glycoprotéines de surface codées par le gène env.
Figure 4: Illustration du mécanisme de l'attachement viral
Approche du virus vers une cellule cible (A), attachement des récepteurs (B),
liaison des co-récepteurs (C), encrage du virus à la cellule cible via la gp41 (D)
suivi de lafusion (E) et de l'infection (F). Adaptée d'une image originale
illustrée [16]
9
2.4.2 Les protéines de l'enveloppe
Les protéines de l'enveloppe virale sont traduites en précurseur de polypeptide
(gp 160) qui est ensuite clivé en deux formes fonctionnelles (gp 120 et gp41) par une
protéase cellulaire. Les protéines sont glycosylées dans le Golgi et assemblées en trimères
de gp 120-gp41 hétérodimères. Ceux-ci sont ensuite transportés à la membrane plasmique
où la queue cytoplasmique du gp41 est reconnue par la nucléocapside virale [17]. Le virion
mature est le résultat du bourgeonnement des particules virales à la membrane plasmique
contenant les protéines de l'enveloppe [18]. La gp120 du VIH-l constitue la sous-unité la
plus imposante de la membrane externe. Elle est impliquée dans les étapes initiatrices de
l'interaction avec les récepteurs des cellules hôtes. La molécule CD4, découverte en 1984,
est indispensable à la fixation du virus mais n'est pas suffisante pour garantir la fusion de
l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire. Pour assurer l'entrée virale l'existence de
corécepteurs du VIH -1 est primordiale. En effet, la gp 120 a la capacité de se lier au CD4 et
aux récepteurs de chimiokines exprimés à la surface des lymphocytes T, des macrophages
et des cellules dendritiques (DC). La gp41 est la sous-unité transmembranaire à laquelle est
fixée la gp 120 au niveau de la membrane virale. Elle contient également des protéines de
fusion qui envahiront la membrane de la cellule hôte.
2.4.3 Les corécepteurs
Comme précédemment mentionné, en plus de sa liaison avec le récepteur CD4, il
est primordial que la protéine gp 120 se lie également aux corécepteurs appropriés selon le
tropisme viral. Les virus qui n'infectent que les macrophages (macrophage-tropiques ou M
tropiques) utilisent le co-récepteur CCR5 (récepteur des CC-chimiokines) alors que le
CXCR4 (récepteur des CXC-chimiokines) sert de co-récepteur pour les souches infectant
majoritairement les lymphocytes T (T-tropiques). Outre le CCR5 et le CXCR4, d 'autres
corécepteurs tels que le CCR2b et le CCR3 peuvent être utilisés par des souches qui
infectent les deux types cellulaires (bi-tropique) [19,20]. Les virus utilisant le récepteur
CCR5 représentent la population virale prédominante au début de l'infection et persistent
au cours des différents stades de la maladie. Les virus qui utilisent le CXCR4 ou les virus
bi-tropiques, émergent plus tard dans la maladie, simultanément avec la diminution des
cellules T CD4 + et la progression de la maladie.
10
Les corécepteurs possèdent sept domaines transmembranaires et sont couplés aux
protéines G. Leur fonction biologique consiste à lier les chimiokines, un phénomène qui
déclenche une cascade de signalisation menant à la migration des cellules. Le ligand naturel
du CXCR4, est une CXC chimiokine, nommée SDF -1 (stromal cell-derived factor 1). De
manière identique, les trois CC chimiokines, RANTES, MIP-l a et MIP-l B, sont les ligands
du CCR5. Certaines cellules n'utilisent pas CCR5, CCR3 ou CXCR4; ceci impliquerait
l'existence d'autres corécepteurs encore non identifiés [21,22].
2.4.4 Les autres récepteurs du VIH-l
Les cellules ne possédant pas de récepteur CD4 à leur surface peuvent également se
lier aux glycoprotéines d'enveloppe du VIH-l grâce à DC-SIGN ou DCIR. L'identification
de la molécule DC-SIGN (dendritic cell specific ICAM-3 grabbing non-integrin), une
lectine exprimée à la surface des cellules dendritiques et des macrophages, éclaire d'un
nouvel angle les relations entre les virus et leurs hôtes. Cette lectine a initialement été
décrite comme pouvant se lier aux glycoprotéines d'enveloppe du VIH-l. DC-SIGN ne joue
cependant pas le rôle traditionnel de « récepteur» du VIH -1 car il ne permet pas l'infection
des cellules en l'absence de CD4 et d'un corécepteur. En revanche, il favorise la capture des
virions et leur transmission aux cellules permissives [23-25].
Mis à part le récepteur CD4, le corécepteur CCR5 et la lectine DC-SIGN d'autres
récepteurs de type lectine, tel que le DCIR (dendritic cell immunoreceptor) pourrait aussi
participer à la transmission du VIH -1. Cette nouvelle lectine, appartenant à la même famille
des lectines de type C que le DC-SIGN, a été récemment découverte à la surface des DC.
Tout comme le DC-SIGN, l'expression de ce récepteur varie suivant l'état de maturation des
DC. Bien que le ligand du DCIR et sa fonction physiologique soient encore inconnus,
l'étude de l'implication de ce récepteur dans la transmission du VIH-l aux lymphocytes T
CD4 + met en évidence un rôle potentiel de cette lectine dans la transmission du VIH -1 [26].
Des débats récents subsistent afin d'identifier d'autres récepteurs pouvant lier la
gp120 du VIH-l [27-31]. En effet, dernièrement un nouveau récepteur capable de lier la
gp120 virale a était proposé, soit le Syndecan-3 [32]. Ce récepteur est un protéoglycane
sulfate héparane spécifique aux DC qui capture les VIH -1 grâce à son interaction avec la
Il
gp 120 virale. Il favorise ainsi la capture virale, l ' infection des DC et le transfert du VIH-1
aux lymphocytes T CD4+.
2.5 Le cycle de la réplication virale
Récepteur de chimiokines
tu,. d1nfectlon
Rev
lat ,:)
VIf
vpu
ef
Vpr
et...-crUMm .... *let. maturadon
,,-~
ARNP II
ka.,. d'exptèSSion
Transcription
Figure 5: Cycle viral du VIH-l
Adaptée et traduite d 'une image originale illustrée [13J
2.5.1 L'entrée virale
Après l'attachement, le VIH -1 pénètre dans la cellule hôte selon deux VOles
possibles : (1) par fusion à la membrane plasmique (le virus fusionne sa membrane avec
celle de la cellule hôte et expulse à l'intérieur du cytoplasme cellulaire sa capside -
décapsidation partielle) ou (2) par endocytose. Une étude approfondie de la protéine gp120
de l'enveloppe virale a permis d'identifier une région appelée boucle V3 qui joue un rôle
dans le choix des corécepteurs utilisés par le virus. Une différence d'un seul acide aminé
dans cette boucle pourrait être suffisante pour déterminer le mode d'entrée utilisé [33-35].
En effet, la glycosylation et, surtout, la charge électrique de V3 contribuent à la définition
12
du tropisme viral [36,37]. Ainsi, la présence de résidus basiques dans la boucle V3
déterminerait une liaison préférentielle au CXCR4 qui possède une charge nette plus
négative que celle du CCRS dans les domaines de liaison à la gp120 [38].
2.5.1.1 La fusion
La première étape de l'infection est l'adsorption virale, qui correspond à l'interaction
de glycoprotéines d'enveloppe avec des récepteurs exprimés à la membrane de la cellule
cible, permettant la reconnaissance spécifique de ces cellules et l'arrimage du virus à leur
membrane cytoplasmique. Pour tous les virus enveloppés, la pénétration cellulaire se fait
par un mécanisme de fusion de l'enveloppe virale avec une membrane cellulaire. La fusion
membranaire est un processus énergétiquement coûteux car elle nécessite la déstabilisation
de la structure ordonnée des deux bicouches lipidiques. L'énergie nécessaire à la fusion est
fournie par les glycoprotéines d'enveloppe de l'enveloppe virale.
1. Protéine de fusion 2. Projectjon du peptide de fusion à la membrane de la cellul~ible
3. Repliement de l'hélice afin d'obtenir la conformation six-helix bundle
(stade d'hémifusion)
4. Formation du pore de fusion
Figure 6: Changements de conformation à l'origine de la fusion virale à la membrane plasmique
Adaptée et traduite d 'une image originale illustrée [39]
Après formation du complexe gp l20-CD4 et leur liaison aux corécepteurs CCRS ou
CXCR4, des changements conformationnels de ces deux protéines permettent la formation
d'un complexe tri-moléculaire gp120/CD4/corécepteur ainsi que l'exposition du
groupement fusogénique de la gp41 (portion transmembranaire de l'enveloppe virale)
13
[40,41]. En effet, cette glycoprotéine présente une extrémité N-terminale (le peptide de
fusion) indispensable à la fusion qui, une fois exposée, favorise le contact avec la
membrane plasmique. Cela permet l'ancrage de la gp41 dans la membrane cellulaire et la
formation d'une structure en épingle à cheveux, très compacte et thermostable (six-helix
bundle), qui mène à l'apposition des membranes virales et cellulaires précédant la fusion
[42]. Ce rapprochement membranaire incite l'association de domaines transmembranaires
et des peptides de fusion (structure en « N-cap ») afin d'induire la fusion membranaire en
passant par de multiples intermédiaires lipidiques (stade d'hémifusion), avant d'arriver à la
formation d'un pore (Figure 6) [43].
2.5.1.2 L'endocytose
Les cellules vivantes intemalisent en permanence une partie de la membrane qui les
entoure en formant des vésicules. Ce phénomène appelé endocytose leur permet de capter
certains nutriments, réguler leur surface ou communiquer avec leur environnement. C'est
aussi par ce moyen que certains virus infectent les cellules. Suite à l'adsorption virale, une
protéine de l'enveloppe interagit avec un récepteur cellulaire qui oriente le virus vers une
voie d'endocytose (dépendante de la clathrine ou de la cavéoline) [39]. Au niveau de
l'endosome, l'acidification du milieu entraîne la protonation de certains résidus de la
glycoprotéine, qui la déstabilise et déclenche le changement de conformation à l'origine du
processus de fusion.
Plusieurs études proposent que la fusion virale ait majoritairement lieu à la
membrane cellulaire. En effet, contrairement à la plus part des virus, l'infection par le
VIH-1 a été décrite comme étant un processus indépendant du pH [44]. En plus d'une
fusion virale localisée à la membrane plasmique [45], celle-ci peut également avoir lieu
dans des vésicules endosomales [45,46]. En effet, par les méthodologies utilisées
(endocytose du récepteur CD4 et des corécepteurs du VIH -1) les études actuelles ne
peuvent exclure l'endocytose comme une voie d'entrée possible pour le VIH -1. De ce fait,
l'activité fusogénique de la gp41 peut être activée dans un environnement de faible pH
[47].
Subséquemment, le VIH-1 peut infecter une cellule grâce à un mécanisme
d'endocytose impliquant une internalisation par des vésicules à clathrine [45,46,48]. La
14
clathrine est une protéine qui reconnaît des récepteurs membranaires regroupés à des
endroits précis à la membrane. Elle entraîne l'invagination de la membrane plasmique et
s'assemble autour des vésicules. Même si ce mécanisme d'entrée est moins efficace que
celui de la fusion, il permet l'aboutissement à une intégration virale efficace et à une
expression génique précoce [47]. Le VIH -1 peut utiliser ce mécanisme à son avantage en
établissant un état de latence dans les cellules de l'hôte afin d'échapper à la surveillance
immunitaire.
2.5.2 Le transport intracellulaire du VIH-l, de la fusion à l'intégration
La décapsidation est une étape indispensable dans le cycle de réplication virale et
pourtant c'est aussi l'étape la moins étudiée. Dans le cas du VIH-1 il est bien admis que la
décapsidation est un processus lent qui permet d'utiliser la capside semi perméable comme
niche pour l'initiation de la reverse transcription du génome ARN en ADN double brin. Ce
complexe est transporté du cytoplasme vers le noyau de la cellule par un ensemble de
protéines virales et cellulaires [49-51]. Afin de mettre fin aux débats concernant le
déroulement de la décapsidation dans la cellule hôte, une étude récente à permis
l'observation ultrastructurale des complexes du VIH-1 [52]. La technique utilisée dans ce
cas, consistait à soulever les membranes plasmiques des cellules infectées révélant ainsi la
surface des noyaux et des éléments du cytosquelette. À partir de deux heures après
infection et jusqu'à l'aboutissement de la rétrotranscription, ils ont identifié des complexes
correspondant à des capsides intégrées, associées soit aux filaments d' actine proches de la
membrane nucléaire, soit arrimées directement aux pores nucléaires. De plus, la formation
de l'ADN Flap, dernière étape de la rétrotranscription, signale la décapsidation de ces
complexes, permettant ainsi l'import de l'ADN viral dans le noyau (Figure 7) [53].
15
Figure 7: Localisation cellulaire du génome du VIH-l en présence et en absence d'ADN Flap
En présence d'ADN Flap (à gauche) le VIH-l est localisé dans le noyau, alors
qu 'en sont absence (à droite) le virus demeure dans le cytoplasme. Les lettres C
signifie cytoplasme, N noyau et NE enveloppe nucléaire. Adaptée d 'une image
originale illustrée [53]
L'ADN du VIH-l peut pénétrer dans le noyau des cellules qui ne se divisent pas,
grâce à un processus appelé « import nucléaire ». Ce dernier est rendu possible grâce à la
présence de l'ADN Flap, une structure ADN à trois brins fabriquée par deux séquences
actives centrales (cPPT et CTS), à l'intérieur du génome du VIH-l et agissant comme
déterminant actif de l'import nucléaire de l'ADN viral (Figure 7). Après un transport
dépendant des microtubules vers le noyau, la capside virale se déplace lentement à l'aide de
l'actine avant son arrimage au pore nucléaire où elles effectuent alors un mouvement
vibratoire confiné dans l'espace. Ainsi, l'ultime étape de la rétro-transcription formant
l'ADN Flap, induit la maturation du complexe de rétro-transcription (RTC) en complexe de
pré-intégration, libéré de l'assemblage de protéines. Tout ceci semble confirmer que la
décapsidation ne s'effectue pas directement après la fusion du virus mais plutôt dans la
région cytoplasmique proche du pore nucléaire [54]. En résumé, pour obtenir une infection
productive, le VIH-l a besoin d'interagir avec le cortex d'actomyosine (couche fine du
réseau d'actine sous-jacent à la membrane plasmique) après son entrée dans la cellule hôte
[55]. Ultérieurement, le VIH-l va rapidement se déplacer dans le cytoplasme de la cellule,
grâce aux microtubules, qui vont le conduire à la périphérie du noyau [56]. Les
microfilaments d'actine vont ensuite le diriger plus lentement vers le noyau [57]. Le
16
génome viral encore entouré de sa capside va alors s'amarrer au pore nucléaire où aura lieu
la transcription inverse, la production d'ADN Flap et donc la maturation du complexe de
pré-intégration (CPI). Une fois dans le noyau, le génome viral intègre la chromatine de la
cellule hôte ou se replie sur lui-même afin de former les LTR 1 et 2 (Figure 8).
Figure 8: Modèle actualisé du transport intracellulaire du VIH-l
(1) Passage du cortex d'actomyosine, (2,3,4) déplacement du virus à travers les
microtubules et les microfilaments d'actine, (5) amarrage au pore nucléaire, (6) transcription
inverse, (7) production d'ADN Flap et décapsidation, (8) translocation du PIC au pore nucléaire et
(9,10) integration dans le génome cellulaire. Image originale illustrée [54].
2.5.3 L'intégration et le complexe de pré-intégration
Lorsque le VIH-l infecte une cellule, son ARN génomique est copié en ADN
double brin par l'ADN polymérase virale: la transcriptase inverse ou RT. Cet ADN va alors
migrer vers le noyau au sein d'un complexe multiprotéique ou complexe de pré-intégration
(PIC), et sera ensuite intégré dans le génome de la cellule par l'intégrase rétrovirale (IN).
Les fonctions catalytiques de l' intégrase sont strictement nécessaires au bon déroulement
du processus d'intégration. L'interaction de structures particulières de l'intégrase avec un
ou plusieurs co-facteurs cellulaires est responsable de la spécificité de l'intégration au
niveau des chromosomes cellulaires. Afin que l'ADN viral linéaire issu de la transcription
inverse du génome viral soit intégré, l'IN se fixe aux L TR viral et catalyse une maturation
endonucléolytique (3 '-processing) qui se traduit par l'élimination d'un dinucléotide à
17
chaque extrémité. Cet ADN clivé sert de substrat pour l'insertion covalente de l'ADN viral
dans le génome de la cellule infectée. La coupure des dinucléotides aux extrémités 5'
saillantes d'origine virale et la réparation de l'ADN sont nécessaires pour terminer la
réaction d'intégration [58].
L' intégrase et l'ADN viral se trouvent au sein d'un complexe de pré-intégration
dont la caractérisation demeure limitée. La transcriptase inverse (RT) et la protéine de
matrice (MA) sont vraisemblablement présentes dans le complexe. Vpr et la protéine de
nucléocapside (NC) pourraient également y être associées, cette dernière ayant été
impliquée dans le bon fonctionnement de l' intégration [58]. De plus, une interaction
physique entre l'intégrase et la RT a été observée suggérant que l'IN participe au contrôle
de la synthèse d'ADN viral [59]. Plusieurs facteurs cellulaires (Ini-l, BAF, Ku et
LEDGF/p75) sont connus pour interagir avec le PIC dans le noyau. En effet, des résultats
récents, concernant le facteur de transcription LEDGF/p75, suggèrent que celui-ci est
effectivement responsable du ciblage spécifique de l'intégration. Une fois intégré, le
pro virus persiste dans la cellule hôte et sert de matrice pour la transcription des gènes
viraux et la réplication du génome viral, permettant la production de nouveaux virus.
En absence d'intégration, l'ADN viral linéaire est circularisé, vraisemblablement
par une voie de recombinaison non-homologue, donnant naissance à des formes circulaires
non réplicatives mais qui peuvent persister dans le noyau pour une durée encore mal
évaluée. Il faut cependant noter que l'expression des protéines Nef et Tat du VIH-l a été
observée à partir de formes virales non intégrées, n'excluant pas définitivement que ces
ADN circulaires puissent jouer un rôle fonctionnel [60].
2.5.4 La transcription virale
La plupart des génomes viraux codent pour des protéines capables, entre autres
fonctions, de faire office de modulateurs transcriptionnels. En interagissant directement
avec les séquences virales, ou avec les facteurs de transcription se fixant sur ces régions,
les protéines virales permettent une régulation transcriptionnelle spécifique. La
transcription précoce des gènes du VIH-l est initiée par un promoteur présent dans la L TR
5' du virus. Ce promoteur est essentiellement régulé par des facteurs cellulaires tels que
SPI , CREB et NF-KB. Cependant, la transcription initiée est peu efficace. La présence de
18
Tat se fixant sur une structure en épingle à cheveux, créée par l' ARN messager naissant
(région TAR ou trans-activating response) serait à l'origine de la stabilisation nécessaire à
la transcription des 9 000 pb du virus [61]. Tat augmente ainsi plus de 100 fois la
transcription des ARNm viraux et pourrait avoir un rôle de co-activateur. En effet, il
interagit avec les facteurs de transcription NF-KB et SPI [62] ainsi qu'avec plusieurs
protéines du PIC [63-66]. Tat semble donc impliquée à la fois dans l'initiation, les étapes
initiales de l'élongation de la transcription et la latence.
La transcription des gènes viraux précoces est le plus souvent dépendante de
protéines cellulaires captées par les régions amplificatrices des promoteurs viraux. En
effet, les rétrovirus contiennent à leurs extrémités des régions répétées (L TR) dont la L TR
5' contenant le promoteur de l' ARNm viral polycistronique. La transcription de VIH -1 est
un modèle de régulation complexe, étant contrôlée par au moins 5 régions distinctes,
comportant chacune de nombreuses séquences de fixation pour des facteurs de
transcription cellulaire: (1) une région dite modulatrice, (2) une région d'amplificateur
transcriptionnel contenant deux sites de fixation pour les facteurs de transcription de la
famille NF -KB et NF AT, (3) un promoteur basal, (4) une région correspond à la séquence
TAR, (5) et une région correspondant à un deuxième amplificateur transcriptionnel [67].
2.5.5 La traduction, l'assemblage et le bourgeonnement
Les cellules eucaryotes possèdent des mécanismes qui empêchent l'exportation
depuis le noyau des transcrits qui ne sont pas entièrement épissés. Ces mécanismes peuvent
poser des problèmes au rétrovirus dont le développement dépend de l'exportation d'ARNm
non épissé, épissé une fois ou épissé plusieurs fois de manière à traduire toutes les protéines
virales. La protéine virale Rev fournit une solution à ce problème. L'exportation depuis le
noyau et la traduction des trois protéines du VIH-1 codées par les transcrits entièrement
épissés, Tat, Nef et Rev, sont assurés immédiatement après l'infection virale par les
processus cellulaires classiques d'exportation des ARNm. La protéine Rev pénètre dans le
noyau et se fixe sur une séquence particulière de l' ARN viral, l'élément de réponse à Rev
(RRE). Rev se fixe également à une protéine de transport nucléo-cytoplasmique de l'hôte,
la protéine Crm1, qui permet l'utilisation des voies cellulaires pour exporter les ARNm
viraux vers le cytoplasme à travers les pores nucléaires. La première fois que le provirus est
19
activé, le niveau de Revest faible, les transcrits sont transportés lentement du noyau au
cytoplasme, laissant ainsi le temps aux multiples évènements d'épissage de se produire.
Ces différents épissages s'accompagnent de la production de protéines Tat et Rev. Tat va
alors augmenter la production des transcrit viraux. Par la suite, les taux de Rev augmentent
et les transcrits sont alors transportés rapidement depuis le noyau, qu'ils aient été non
épissés ou épissés juste une fois. La traduction de ces transcrits aboutit alors à la synthèse
des composants de l'enveloppe et de la capside virale ainsi que de la transcription inverse,
de l'intégrase et de la protéase virale. Tous les éléments sont alors réunis pour la production
d'une nouvelle particule virale. Les transcrits complets non épissés, qui sont ultérieurement
transportés depuis le noyau, permettent la traduction de gag et pol et vont être empaquetés
avec les protéines afin de constituer les ARN génomique des nouvelles particules virale
[68].
Lors des étapes tardives de la réplication virale, les composants du virus sont
concentrés en un site cellulaire où ils s'assemblent pour donner des particules virales qui
sont libérées dans le milieu extérieur. Ces étapes font actuellement l'objet d'un réexamen
approfondi, à la lumière des développements technologiques récents en biologie
moléculaire et cellulaire, et particulièrement en imagerie cellulaire. Dans le cas du VIH -1,
une vision nouvelle de l'assemblage et de la production des particules, d'une complexité
jusqu'alors insoupçonnée, s'en dégage. Des interactions spécifiques ont été identifiées entre
des composants viraux et des facteurs cellulaires impliqués dans la compartimentalisation
et le bourgeonnement du VIH -1. À la multiplicité des signaux de localisation correspond
une variété de sites d'assemblage, dont le choix reste mal compris. Dans certaines cellules
cibles physiologiques de l'infection, les particules virales s'assembleraient et/ou
s'accumuleraient dans des compartiments intracellulaires tels que les endosomes tardifs,
pour être libérées dans le milieu extrace llul aire , ou transmises directement à une cellule
saine via une «synapse virale» [69].
Complexes GQg-AR
1
Figure 9: Trafic et voie d'assemblage du VIH-l
Image originale illustrée [69]
20
Lors des phases tardives de la réplication virale (Figure 9), les molécules Gag sont
synthétisées au niveau des polysomes (sans doute dans le cytoplasme) et se multimérisent
sur l'ARN génomique viral (ARNg) grâce au domaine nucléocapside (Ne) (1), formant
ainsi des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) viraux qui s ' ancrent aux membranes de la
cellule infectée. Sous l'effet de multiples signaux de distribution cellulaire au sein de Gag,
les complexes peuvent être dirigés vers la membrane plasmique (2) ou des compartiments
endosomaux (3). La formation de virus infectieux nécessite le recrutement de la
glycoprotéine d' enveloppe (Env) au niveau de ces complexes. L'enveloppe est produite dans
le réticulum endoplasmique, glycosylée dans le Golgi et secrétée jusqu'à la membrane
plasmique (4) d'où elle est recyclée. Elle peut se retrouver dans les endosomes précoces, de
recyclage, et tardifs (5), ou suivre un transport rétrograde des endosomes tardifs vers le
réseau trans-golgien (6). Une interaction précoce de l'Env avec les complexes Gag/ ARN g
pourrait aussi influer sur le trafic de ceux -ci. Le choix d'assemblage viral à la membrane
21
dépend du type cellulaire et pourrait résulter d'un jeu complexe entre les signaux de
distribution subcellulaire. Par exemple, dans les cellules cancéreuses 293T, l ' assemblage
s'observe à la fois à la membrane plasmique (7) et dans les endosomes (8). Dans les
lymphocytes T CD4+ chroniquement infectés par VIH-l et dans les macrophages, le virus
s'assemble dans les endosomes tardifs (8). Le bourgeonnement viral, dans les lymphocytes,
peut également avoir lieu au niveau de la membrane plasmique. Dans les deux cas, Gag
recrute les complexes ESCRT nécessaires aux phases tardives du bourgeonnement [70].
L'accumulation de virions matures dans les endosomes tardifs montre que le VIH -1 exploite
cette voie de trafic intracellulaire à son avantage. Sous l'effet d ' une stimulation cellulaire,
ces virions seraient exocytés par fusion des endosomes tardifs avec la membrane plasmique
et relargués massivement dans le milieu extracellulaire ou transférés spécifiquement à une
autre cellule environnante grâce à un contact intercellulaire déterminant (9) [69].
2.6 Les cibles du VIH-l
Les cibles de l'infection au VIH -1 sont nombreuses. En effet, dans les muqueuses se
sont les cellules dendritiques immatures, localisées à la surface des muqueuses, qui sont les
premières infectées lors d'une contamination par voie sexuelle. Dans les ganglions et la rate
ce sont les lymphocytes T CD4+ et d'autres cellules appelées folliculaires dendritiques.
Dans la moelle osseuse et le thymus ce sont les cellules précurseurs des lymphocytes T . Un
peu partout dans le corps, d'autres cellules dérivées des monocytes comme les
macrophages ou les cellules dendritiques abritent le VIH -1 (dans le cerveau, par exemple).
Par contre, c'est essentiellement dans les lymphocytes T CD4+ que le VIH-l se multiplie en
grande quantité.
2.6.1 Les lymphocytes
Les lymphocytes sont des leucocytes qui ont un rôle majeur dans le système
immunitaire. En termes de structure et de fonction, on distingue deux lignées
lymphocytaires différentes: les lymphocytes B et T. Les lymphocytes T représentent 65 à
80% de la population des lymphocytes présents dans la circulation sanguine, 30 à 50% dans
la rate et 70 à 80% dans le nœud lymphoïde. Pour les lymphocytes B leur distribution
représente: 5 à 15% dans la circulation sanguine, 20 à 30% dans la rate et 10 à 20% dans le
nœud lymphoïde [71].
22
2.6.1.1 Les Lymphocytes T
Il existe plusieurs types de cellules T parmi lesquels figurent:
1. Les lymphocytes T CD8+ évoluant en cellules T cytotoxiques ou lymphocytes
tueurs détruisent les cellules infectées. Ces cellules fonctionnent comme des cellules
tueuses (NK) ou cytotoxiques car elles sont capables de détruire des cellules cibles
exprimant des antigènes spécifiques qu'elles reconnaissent, en libérant une
substance chimique, la perforine, qui s'insère dans la membrane plasmique et la
perfore, ce qui provoque l'explosion de la cellule par un afflux massif d'eau dû aux
pressions osmotiques.
2. Les lymphocytes T CD4+ évoluant en lymphocytes T auxiliaires ou lymphocytes
sécréteurs (T-Helper) sont des intermédiaires de la réponse immunitaire qui
prolifèrent après contact avec l'antigène présenté par une cellule présentatrice
d'antigènes (CPA) pour activer quantité d'autres types de cellules par une action
directe. Ces cellules sont une des cibles majeures du VIH -1 et la chute de leur
population est connue comme étant l'un des symptômes du SIDA (Figure 10) .
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Figure 10: Évolution de la charge virale et du système immunitaire
Adaptée et traduite d 'une image originale illustrée [72}
23
Les lymphocytes T CD4+ sont infectés par le VIH-I du fait de l'expression du récepteur
principal du virus, la molécule CD4, et d'un ou plusieurs des corécepteurs auxiliaires du
virus (CCR5, CXCR4) [73]. Lors de la phase aiguë de l'infection par le VIH-I, le nombre
total de lymphocytes T CD4+ chute rapidement, alors que celui des lymphocytes T CD8+
augmente. Le VIH-I induit la mort cellulaire non seulement des lymphocytes T CD4+ qu'il
infecte (effet cytopathogène) mais aussi des lymphocytes qu'il n'infecte pas. La
conséquence de la stimulation du système immunitaire par les protéines du VIH -1, qui
activent des programmes de mort cellulaire, mettent en jeu les récepteurs de mort et/ou la
mitochondrie. Les récepteurs CD95, TNF-RI et TNF-RII apparaissent essentiels à
l'induction d'apoptose dans les lymphocytes de personnes VIH-I +. En effet, leur expression
est préférentiellement régulée à la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ chez les sujets
infectés et la ligation de ces récepteurs par un anticorps agoniste ou par le ligand induit un
puissant signal apoptotique in vitro. La contribution des récepteurs de mort à la destruction
des cibles T CD4+ est supposément induite par la corrélation existant entre le taux
d'apoptose médié par ces récepteurs et la perte de ces cellules in vivo [74]. La mort
prématurée des lymphocytes T a pour conséquence la disparition des lymphocytes T CD8+
(CD45RO+, perforine +, Bcl-2-) et celle des lymphocytes T CD4+ helper, en particulier ceux
qui produisent de l'IL-2, cytokine essentielle à la différenciation des effecteurs anti-viraux
[75].
De rares individus infectés par le virus du SIDA contrôlent l'infection (HIC ou HIV-l
control/ers) et ne développent pas la maladie malgré plus de 10 ans de séropositivité et
l'absence de traitement. Les lymphocytes T CD4+ de ces patients sont sensibles au virus,
comme dans la population générale, et ne possèdent aucune résistance intrinsèque à
l'infection. En outre, ces individus sont bien infectés par des virus réplicatifs. Cependant,
les individus HIC ont un fonds génétique particulier, susceptible de favoriser la réponse
immune. En effet, lorsque les lymphocytes T CD8+, des contrôleurs du VIH-I, sont mis en
contact avec des lymphocytes T CD4+ autologues, ils sont capables, sans aucune
stimulation préalable, d'inhiber totalement leur infection in vitro dû à une destruction
puissante et rapide des cellules infectées. Ce phénomène a été associé au phénotype
particulier de ces patients: la surexpression du marqueur d'activation HLA-DR et l'absence
24
de CD38 favorisant une meilleure présentation antigénique et la restauration de leur
fonctions effectrices [76].
Les résultats d'une étude collaborative sur l'influence de l'hétérozygotisme ~32 sur la
progression vers la maladie suggèrent que la présence d'un allèle anormal de CCR5 pourrait
rendre les cellules hôtes plus résistantes à l'infection par le VIH -1, limitant ainsi sa
réplication [77]. Cette anomalie provoque un changement du cadre de lecture du gène et
donc l'obtention d'un récepteur CCR5 non fonctionnel. La mutation hétérozygote ~32 est
exprimée dans 17% de la population caucasienne et touche environ 1 % de cette même
population lorsqu' elle est homozygote. L'anomalie est virtuellement absente de populations
originaires de l'Afrique centrale ou de l'Ouest, le Japon ou le Sud-Est asiatique. Cette
résistance n' est cependant pas complète et plusieurs cas documentant l' infection par le
VIH -1 d'individus sans expression de CCR5 ont été rapportés.
2.6.1.2 Les Lymphocytes B
Les cellules B sont des lymphocytes qui jouent un grand rôle dans l'immunité humorale,
par opposition à l'immunité cellulaire induite par les lymphocytes T. Ces cellules
participent à la réponse immunitaire spécifique, c'est-à-dire, qu'après avoir reconnu un
antigène, le lymphocyte B ne peut plus fabriquer des anticorps que contre l'antigène qu'on
lui avait présenté. Il existe deux types de cellules B :
1. Les plasmocytes sécrètent des anticorps qui se chargent de la destruction des
antigènes en se liant à ceux-ci afin qu'ils deviennent des proies plus faciles pour les
phagocytes.
2. Les cellules B mémoires sont formées spécifiquement contre les antigènes
rencontrés lors de la réponse immunitaire primaire; comme elles peuvent vivre
longtemps, ces cellules peuvent réagir rapidement lors d'une seconde exposition à
leur antigène spécifique.
Encore aujourd'hui, les lymphocytes B ne sont pas envisagés comme une cible
potentielle à l'infection au VIH -1. Cependant, dès ses phases initiales, l'infection provoque
de graves perturbations du compartiment lymphocytaire B, tant au plan de l'activation et de
25
l'ontogénie, qu'au plan fonctionnel [78-81]. Trois types de mécanismes peuvent participer à
l'altération du compartiment B au cours de la maladie: 1) l'infection des lymphocytes B par
le VIH-1, 2) la stimulation directe des lymphocytes B par les antigènes viraux et 3) la
désorganisation des divers microenvironnements successifs des cellules B, et plus
particulièrement des centres germinatifs (CG) dans les organes lymphoïdes primaires et
secondaires[82]. En effet, les ganglions lymphatiques sont des organes très structurés où se
déroule l'interaction entre cellules présentatrices d'antigène et lymphocytes, indispensable
au déclenchement de la réponse immune. Lors de l'infection au VIH-1 de larges quantités
de virus sont séquestrées dans les CG folliculaires. La désorganisation associée à l'infection
virale émanerait de l'établissement d'une fibrose (dépôt de collagène suite à la sécrétion de
TGF-~1) empêchant ainsi un contact cellule-cellule spécifique [83]
2.6.1.3 La latence et lymphocytes T mémoires
Un des obstacles majeurs à l'éradication de la maladie dévastatrice du SIDA est la
latence du VIH -1. La capacité du VIH -1 à établir un état de latence dans les cellules de
l'hôte permet au virus d'échapper à la surveillance du système immunitaire. Même dans les
pays riches, où les drogues antivirales sont accessibles, les réservoirs latents de virus posent
de graves problèmes. Les lymphocytes mémoires contenant un pro virus latent constituent
une source persistante de production virale cachée mais inductible. Une fois infectés, ils
peuvent constituer une réserve de cellules capables de produire du VIH-1 (qu'elles ont
intégré dans leur génome) en cas de réactivation [84]. Elles constituent ce qu'on appelle un
réservoir. Les cellules responsables de cette latence sont donc les lymphocytes T CD4+ qui
après avoir été infectés productivement, passent d'un état d'activation à un état de
quiescence [85]. En absence d'activation, cette sous-population de lymphocytes ne peut
produire de virus mais possède une demi-vie de 44 mois [86]. Une étude estime que
l'éradication de ce réservoir peut prendre jusqu'à 60 ans sachant que les thérapies actuelles
n'affectent pas les pro virus présents de façon latente car leur nombre diminue que très
lentement [87].
2.6.2 Les monocytes
Les monocytes sont des leucocytes spécifiques qui interviennent très efficacement
dans la lutte contre les virus, certains parasites et les bactéries situés à l'intérieur des
26
cellules. Ils ont un fort potentiel de phagocytose (destruction et digestion des corps
étrangers) et une mobilité très élevée leur permettant de se déplacer rapidement au site
d'infection. Dès que les monocytes pénètrent les tissus, ils subissent une série de
changements pour devenir des macrophages ou des cellules dendritiques selon les stimuli
de leur microenvironnement.
Les monocytes ne sont pas des cibles du VIH -1. En effet, même si la fusion virus
cellule est fonctionnelle dans ces cellules, l'entrée virale semble être compromise [88] et la
synthèse d'ADN viral inefficace [89]. Cependant, l' identification des différentes
populations de monocytes a permis de mettre en évidence un sous-groupe de monocytes
capable d'être soumis à l'infection virale. En effet, les monocytes CD163+/CD16+ seraient
des bio-marqueurs de la progression du VIH-1 [90]. Les patients, chez qui le virus est
détectable, présentent une augmentation de ce sous-groupe de monocytes qui corrèle avec
la quantité du virus présente dans leur sang. De plus, chez les patients ayant moins de 450
cellules par microlitre de lymphocytes T CD4+ (200 ou moins par microlitre est défini
comme étant le SIDA), l'augmentation de ce groupe de monocytes corrèle inversement
avec le nombre de lymphocytes T. Dans une population normale, le nombre de ces
monocytes est minime, alors que chez les patients atteints du SIDA, ils représentent 40% de
l'ensemble de la population monocytique [91]. Ces monocytes produisent de grandes
quantités de cytokines pro-inflammatoires et partagent des caractéristiques phénotypiques
et fonctionnelles avec les macrophages (M<l» et les cellules dendritiques (DC) [92,93]. La
différenciation de ces monocytes en M<l> et en DC potentialise l'infection et la
dissémination du VIH-1 [89,94,95].
2.6.3 Les macrophages
2.6.3.1 Caractéristiques spécifiques aux macrophages
Comme nous venons de le voir les lymphocytes T représentent les réservoirs
préférentiels de l'infection par le VIH -1. Cependant, le macrophage infecté sert également
de réservoir et de sanctuaire au VIH -1, lui permettant d'échapper à l'immunosurveillance
[96]. En effet, contrairement aux lymphocytes T, les macrophages sont infectés très tôt au
cours de la maladie et sont plus résistants aux effets cytopathogènes du virus [97]. Les
macrophages infectés peuvent survivre pendant plusieurs semaines. Pendant cette période,
27
ces cellules circulent dans les différentes régions de l'organisme, passant par le cerveau et
d'autres organes. Au cours de ces périples, les macrophages infectés transportent le VIH-1
partout dans l'organisme [96]. Les macrophages sont donc fondamentaux dans la
pathogénèse du VIH -1 car ils contribuent activement à la transmission virale aux stades
précoces de l' infection. La longévité de l' infection dans les macrophages dépend
essentiellement de la nature de l'interaction entre le virus et son hôte, comme
l' accumulation de virions dans la machinerie endosomale [98]. En comparaison aux
lymphocytes T CD4+, l' infection dans les macrophages module préférentiellement des
facteurs cellulaires impliqués dans la réponse immune inflammatoire. En effet, une étude
comparative utilisant des biopuces a observée une régulation à la hausse de facteurs de
transcription (STAT SA), de protéines kinase (ERK, PKR), de protéines impliquées dans
les réponses immunes (interféron) et de chimiokines connues pour augmenter la
dissémination virale par le recrutement de lymphocytes T CD4+ (CCL2, CCL8) [99].
Pendant longtemps la communauté scientifique a attribué le tropisme du VIH-1 à
l'expression spécifique de corécepteurs à la surface des cellules cibles. En effet, un virus T
tropique infecte une cellule par le corécepteur CXCR4, et M-tropique par CCR5.
Cependant des études récentes ont prouvées que ce mécanisme était bien plus complexe.
L'entrée virale semble être dépendante de la souche virale et de l'utilisation cellule
dépendante des corécepteurs toutes déterminés par les caractéristiques de la protéine Env
[100]. Les macrophages expriment les deux corécepteurs et peu importe la cascade
d'évènements que cela engage il y aura continuité des étapes de l'infection virale. Alors
qu'une infime portion des macrophages peut établir une infection latente [101], la plupart
produisent des quantités non négligeable de virus [102]. Ceci implique que les
macrophages possèdent un mécanisme très efficace pour la libération virale. En effet, le
bourgeonnement et l'accumulation du VIH -1 s'effectuent dans des vacuoles
cytoplasmiques appelées endosomes tardifs (LE) ou corps multivésiculaires (MVB) (63,
56, 65, 72, 82). Ces LE/MVB peuvent se rendre à la surface cellulaire et fusionner avec la
membrane plasmique pour relarguer les virus dans le milieu extracellulaire (84). Cette
capacité, également observées dans les cellules non-hématopoïétiques (56, 82), a permis de
proposer un mécanisme par lequel les virus sont capables d'échapper à l'immuno
surveillance et aux traitements antirétroviraux (Figure Il, [103]). Ce mécanisme repose sur
Environnement .xtrac.llulalr.
Dest inati on
~ Membrane plasmique
1 Autres
tO Lysosomes
~LY osomas
t Trafic éloigné de la ~ membra ne plasmique
'lit Trafic vers la 1 membrane plasmique
Théorie du Cheval de Troie:;
Figure Il: L 'hypothèse du "cheval de Troie"
28
la capacité des VIruS à prendre
un aspect « inoffensif », celui
d'un exosome, pour éviter la
reconnaissance et l ' élimination.
Ceci implique qu 'au lieu d 'être
dirigé vers les compartiments de
dégradation (les lysosomes), le
VIruS arrIve à déjouer les
mécanismes de tri cellulaire en
fusionnant ou en maturant à
l'intérieur des endosomes
tardifs. Cette hypothèse n' a
cependant pas fait l 'unanimité,
ainsi il a été proposé que des
radeaux membranaires, enrichis
de marqueurs endosomaux (EEA 1) et de tétraspanines, puissent servir de plates-formes
pour le bourgeonnement du VIH-l. Nydegger et collaborateurs ont identifiés des
microdomaines contenant les tétraspanines CD9, CD63 et CD81 où s'accumulaient la
protéine virale Gag, la gp 120 et des composants ESCRT -1 essentiels pour le
bourgeonnement viral [104]. De plus, le CD81 a également été associé au récepteur CD4
[105] et participe à des phénomènes de co-stimulation des cellules T qui augmentent la
transcription et la production virale du VIH -1 dans les cellules infectées [106]. Les résultats
restent cependant contestés, justifiant ainsi la nécessité de poursuive des études plus
approfondies.
2.6.3.2 Le transfert viral
La dissémination du VIH -1 s'effectue lors de contact cellule-cellule grâce à la
formation d'une synapse virologique (VS) qui s'apparente fortement à la synapse
immunologique. Le terme de « synapse immunologique » est apparu récemment [107]. Il
désigne la zone de contact entre une cellule du système immunitaire à vocation effectrice
(lymphocyte T ou B, cellule NK) et une cellule présentant l ' antigène (APC) qui peut être
une cellule B, un macrophage, une cellule dendritique ou toute cellule cible ayant à sa
29
surface des déterminants antigéniques reconnus spécifiquement par la cellule effectrice. Il
n'existe pas « une» synapse immunologique (rS) unique et canonique, mais « des»
synapses immunologiques distinctes, compte tenu des caractéristiques moléculaires des
différents acteurs cellulaires mis en jeu, et des différentes fonctions assurées: détecter la
présence d'un antigène à la surface d'une APC, pour une cellule T naïve, pour être «
activée» et proliférer; détecter la présence d'un antigène à la surface d'une cible et la tuer,
pour une cellule T CDS+ activée; délivrer des cytokines localement à une cellule B pour
provoquer sa différenciation, dans le cas d'une cellule T CD4+ activée [IOSJ. Le terme rs caractérise donc l ' intégralité des jonctions ayant lieu aux jonctions intercellulaires. La
différence majeure entre la synapse immunologique et la synapse virologique est que cette
dernière favorise le contact entre deux cellules sans effectuer une fusion à proprement
parlé. En effet les deux cellules en contact sont considérées comme étant deux entités
indépendantes [109]. D'autres différences entre les synapses immunologique et virale sont
illustrées dans la figure 12.
La synapse virologique
Taline et LFA l
o
c ., T lin
La synapse immunologique
Jonction synaptique
~ 10
li
Figure 12: Différences et similitudes entre les synapses virale et immunologique
Adaptée et traduite d 'une image originale illustrée [109}
30
La transmission virale la plus étudiée est celle qui s'effectue entre la cellule
dendritique et le lymphocyte T CD4+ et sera décrite ultérieurement. En ce qui concerne le
transfert viral entre le macrophage et le lymphocyte T CD4+, il est important de noter que
leur contact, via la formation de jonctions serrées, est de courte durée. En effet, c'est après
l'incorporation de la protéine virale Gag (environ six heures) dans les lymphocytes que ces
derniers se détachent des macrophages [110]. Dans un tout autre contexte, l'existence d'un
stress oxydatif au cours d'une infection VIH-l est bien établie. Ce stress oxydatif résulte
aussi bien d'un déficit accru en certains facteurs anti-oxydants (tels que la vitamine E,
caroténoïdes, glutathion, zinc, sélénium) que de la production exagérée de radicaux libres
pro-oxydants d'origine cellulaire. L'une des particularités de l'infection par le VIH-l est
que les conditions de stress oxydatif sont favorables à la réplication du virus. En effet, la
présence de radicaux libres augmente significativement la transmission virale lors du
contact macrophage-lymphocyte T CD4+ [111].
2.6.4 Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques (DC) sont responsables d'initier les réponses immunitaires
et la tolérance aux antigènes du « soi » (ou autoantigènes). Pour ce faire, ces cellules sont
dotées de la capacité de phagocyter des résidus tissulaires, des agents pathogènes ou des
cellules tumorales. Cette phagocytose est l'élément déclencheur de l'activation des cellules
dendritiques leur permettant ainsi de quitter leur statut de cellules immatures. L'activation
des DC induit l'expression de récepteurs de chimiokines (CCR 7) permettant leur migration
vers les zones lymphoïdes (plaques de Peyer et nœuds lymphatiques mésentériques). Une
fois dans les ganglions, les DC interagissent avec les lymphocytes T et B, déterminant ainsi
les réponses immunitaires. Lorsqu'elles sont immatures, les DC ont des mécanismes de
captation de l'antigène plus développés que les autres cellules présentatrices, incluant
l'endocytose via des récepteurs comme celui du mannose, ainsi que la macropinocytose. La
majeure partie des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II
(CMHII) des DC immatures sont intracellulaires. Lorsque les DC arrivent à maturité, elles
développent un compartiment riche en CMHII, peu acide, qui conserve sur de longues
périodes l'ensemble des antigènes ainsi que des CMHII prêtes à échanger leur chaîne
invariante contre un peptide. Lorsque ce compartiment s'acidifie et que la chaîne invariante
est clivée, la stœchiométrie d'association des peptides transformés et des CMHII est
31
optimale. Enfin, lorsqu'elles sont matures, les DC expriment la majeure partie de leurs
CMHII à la surface et perdent leur capacité de captation des antigènes [112]. Le choix entre
l'induction d'une réponse immune ou le maintien de la tolérance au soi, dépend des signaux
rencontrés par les DC en périphérie, et plus particulièrement de la présence de ligands de la
famille de récepteurs Toll-like (TLR). Les DC sont présentes dans la plupart des organes
non lymphoïdes comme sentinelles sous forme de cellules interstitielles qui captent les
antigènes. Dans le thymus, elles jouent un rôle clé dans la sélection négative des
lymphocytes T (élimination précoce de lymphocytes auto-réactifs) [113]. Au niveau de la
peau ou des muqueuses pluristratifiées (vagin, col de l'utérus, etc.), elles sont représentées
par des DC dermiques et les cellules de Langerhans, qui sont des cellules dendritiques
interstitielles immatures situées dans l'épiderme [112].
Les DC sont impliquées dans de nombreuses pathologies dépendantes du système
immunitaire (maladies infectieuses, autoimmunes, mais aussi dans la plupart des cancers).
Elles sont aujourd'hui au cœur de nombreuses stratégies vaccinales dans ces différentes
pathologies.
Il a indéniablement été prouvé que les DC, capable de lier et capturer du VIH-1,
constituent un réservoir viral important tout en favorisant le transfert du VIH -1 aux
lymphocytes T CD4+. En effet, nous savons que le virus du VIH-1 peut lier la DC via
quatre types de récepteurs, le récepteur CD4, les récepteurs aux chimiokines CCR5 et
CXCR4, le récepteur DC-SIGN et le récepteur DCIR.
Le récepteur DC-SIGN semble jouer un rôle important pour l'entrée du virus du
VIH-1 dans les DC. Celles-ci peuvent alors jouer le rôle d'un « cheval de Troie» (illustré
précédemment) et préserver les particules virales sous forme infectieuse avant de les
transmettre aux lymphocytes T CD4 + dans les tissus ganglionnaires. En effet, le récepteur
DC-SIGN ne reste pas simplement à la surface des DC, mais il est rapidement dirigé à
l'intérieur de la DC lorsque le VIH -1 s'y attache [114]. Ce récepteur entraîne le matériel
biologique qui lui est associé dans un compartiment de destruction des protéines: les
lysosomes. De manière étonnante, le VIH-1 parvient à s'extraire de cet environnement et à
résister aux compartiments de digestion des protéines des DC.
32
2.6.4.1 L'infection des De Malgré les nombreuses études existantes, il est difficile de caractériser correctement
l'impact de l'infection virale sur les DC. Contrairement aux lymphocytes T CD4+, les DC
in vivo et in vitro sont faiblement infectées par le VIH-1 [115]. L'infection via les
récepteurs CCR5 est plus efficace que celle médiée par les récepteurs CXCR4 [116]. Ceci
peut être expliqué par la faible expression de CXCR4 à la surface des DC ou par
l'incapacité de ces cellules à fusionner efficacement avec des souches virales X4-tropiques
[117]. À cause de leur phénotype, l'infection des DC se distingue également lorsqu' elles
sont dites « matures» ou « immatures» (Tableau 2, adapté de [112]).
Tableau 2: Phénotype des De
En effet, lorsque les DC sont immatures, elles expriment principalement CCR5 (et à
un faible niveau CXCR4), et donc laissent surtout entrer des souches M-tropiques, qui se
reproduisent alors vigoureusement (sans être elles-mêmes en division). Lorsqu'elles
arrivent à maturité, elles diminuent l'expression de CCR5 et se mettent à exprimer
fortement le CXCR4 ; elles sont alors capables de transmettre aux lymphocytes T des
souches R5 ou X4 [112]. En revanche, le virus s'y reproduit beaucoup moins. Lorsque les
DC matures sont infectées, elles sont incapables de reproduire le virus, quel que soit son
tropisme: il semble exister un blocage à l'étape de la transcription inverse [118-120].
33
L'expression du CXCR4 est augmentée sous l'action de cytokines type TH2 (1L4, TGF -~ 1)
et est diminuée sous l'action de 1'1FN -y, ce qui suggère un lien entre le déséquilibre
TH1/TH2 de l'infection au V1H-1 et l'émergence des souches X4 [121].
2.6.4.2 Le transfert viral
La contamination par le V1H -1 se produit essentiellement par les muqueuses digestives,
rectales ou vaginales. Ces muqueuses sont couvertes d'une couche de cellules épithéliales
polarisées qui présentent une organisation soit pluristratifiée (vagin, exocol, anus, prépuce),
soit mono stratifiée (rectum, endocol, intestin) [122]. En fonction de l'épithélium, le passage
du virus à travers ces muqueuses peut se faire de différentes façons : (1) par transcytose
rapide à travers une barrière épithéliale monostratifiée sans infection de cette dernière, (2)
par l'interaction du V1H-1 et des DC avec ou sans infection suivi d'un transfert aux
lymphocytes T CD4+ et (3) par les microtraumatismes des muqueuses donnant libre accès
aux cellules du sang.
Pour activer le lymphocyte T CD4+, la DC doit établir un contact direct, étroit et
stable. La stabilité du contact est assurée par des molécules d'adhérence qui permettent la
constitution d'une synapse immunologique entre les deux cellules. Les longs prolongements
cytoplasmiques de la DC mature favorisent le contact avec le lymphocyte T naïf. Une DC
peut interagir de différentes façons avec le V1H-1 (Figure 13). En premier lieu (1), un
virion intact peut être endocytosé dans des corps multivésiculaires (MVB) grâce au
récepteur DC-S1GN, recyclé à la membrane plasmique et transmit à la cellule T CD4+ lors
de la formation de la synapse immunologique/virologique. Ce mode de transmission est
appelé transfert en trans, ou transfert précoce. (2) Après fusion, le virus peut également être
intégré dans le génome de la DC. Ce mode de transmission est appelé transfert en cis, ou
transfert tardif. (3) Mais le virus peut aussi être capturé à la surface cellulaire via DC-S1GN
et maintenu à la surface jusqu'à la transmission à la cellule T CD4+.
•
1 Bourgeonnement
Cellule dendrit ique Noyau
Cellule T CD4+
Projection cellulaire (actine)
b
Figure 13: Transmission du VIH-l d'une DC à une cellule T CD4+
Adaptée et traduite d 'une image originale illustrée[123]
34
La transmission du VIH-l est plus efficace lorsqu'elle s'effectue à la synapse
immunologique (ombrée en orange dans la figure 12). Ce contact favorise une
accumulation importante de virions à la surface des DC et l'exposition de récepteurs CD4
et CCR5 à la surface des cellules T CD4+. Les virions, relâchés à la synapse par des
mécanismes d'exocytose ou par bourgeonnement à la surface membranaire, migrent à la
cellule T grâce à de longues extensions polarisées fonnées d' actine. Certains virions sont
associés à des vésicules membranaires. Les exosomes sont de petites vésicules
membranaires (50-100 nm) sécrétées par certaines cellules, en particulier les réticulocytes
et les cellules présentatrices de l'antigène (CP A) [124]. Ils sont produits par
bourgeonnement de la membrane endosomale vers l'intérieur du compartiment générant
des structures multivésiculaires. La fusion des MVB avec la membrane plasmique entraîne
35
la libération des vésicules internes, alors appelées exosomes, dans le milieu extracellulaire.
Les exosomes ont été décrits pour la première fois il y a une vingtaine d' années lors ' de la
maturation des réticulocytes, et sont envisagés comme un moyen utilisé par la cellule de se
débarrasser de protéines, devenues obsolètes au stade érythrocytaire [125,126]. Plus
récemment, la sécrétion d'exosomes a été démontrée chez d' autres cellules
hématopoïétiques comme les CP A, qui exploiteraient ce mécanisme pour réguler la réponse
immunitaire. En effet, les exosomes de CPA contiennent des molécules du CMH de classe 1
et II liées aux peptides antigéniques ainsi que des facteurs de co-stimulation (e.g. CD86)
[127], permettant une activation de lymphocytes T in vitro [128] et la régression de tumeurs
[129,130]. Le VIH-l peut accroitre son infectivité en bourgeonnant avec les exosomes afin
d'être libérés dans le milieu extracellulaire [123]. Ceci s' effectue en détournant la
machinerie cellulaire en charge du tri des protéines dans les MVB [131]. Les signaux
libérés à la synapse amènent à l'activation du lymphocyte T CD4+ provoquant ainsi la
translocation au noyau de facteur de transcription, tels que NF -KB et NF AT. Ces derniers
peuvent ensuite se lier à la région L TR du génome viral et activer la transcription des gènes
viraux. Plusieurs équipes de recherche ont étudiées, simultanément, les effets du VIH-l sur
la formation de ces synapses [132,133].
Leurs travaux, publiés en 2006, montrent que l'infection des lymphocytes T CD4+
par le VIH -1 affecte leur capacité à former des synapses immunologiques fonctionnelles.
Cet effet pourrait expliquer les états anormaux d'activation et/ou l'apoptose des cellules T
CD4+ infectées par le VIH-l. La protéine virale Nef, dont le rôle est encore mal compris,
serait responsable de ce phénomène (Figure 14). Dans des conditions normales (a), le
récepteur des cellules T (TCR) et les molécules LCK, responsables de la phosphorylation
des récepteurs CD4, continuent leur trafic aux endosomes précoces. Après l'activation de la
cellule T, les TCR et les LCK sont recyclés à la synapse immunologique. Lors d'une
infection au VIH -1 (b), la signalisation de ces éléments est altérée par la protéine virale Nef
diminuant ainsi leur recyclage à la synapse.
b Ave< infection
Cel LeTnatve
A99IutIRltlon
~ du LCKet TCJI ila~
Figure 14: altération de la synapse immunologique par le VIH-l
Adaptée et traduite d 'une image originale illustrée [i33}
36
37
Chapitre II. La co-infection VIH-I/SIDA et malaria
« Bien avant le VIH-l, le paludisme et la tuberculose étaient des causes majeures de
morbidité et de décès. Désormais, le spectre de la co-infection et de la résistance aux
médicaments aggrave le défi qui consiste à identifier et à traiter les personnes atteintes du
SIDA, de la tuberculose ou du paludisme, ainsi qu 'à prévenir d 'autres infections. »
ONUSIDA
Malheureusement, l'avancée de la recherche scientifique ainsi que la prIse de
conscience collective sur l'impact des grandes épidémies mondiales ont mis en avant ce
problème de santé publique que représentent les co-infections. Les exemples de co
infections avec le VIH -1 sont nombreuses: hépatites, leishmaniose, tuberculose, paludisme
(ou malaria) et bien d'autres encore. Aujourd'hui, les personnes co-infectées doivent être
avertis des risques entraînés. La liste des interactions et des effets secondaires des
médications actuelles prouve clairement qu'il faut rester serein dans l'évaluation des
chances réelles de bons résultats, avant une mise sous traitement. Il est capital de ne pas
sous estimer les risques entraînés par des traitements de bithérapie, au moment où se
profilent pour un avenir proche, des trithérapies, et donc des chances futures de meilleurs
résultats. Il faut rapidement redéfinir les indications de traitements en fonction de critères
d'urgence et de bénéfice/risque selon l'état des connaissances actuelles. Les co-infections
ont longtemps fait l'objet d'un déni, sur le mode « le SIDA d'abord ». Les dernières
évaluations de co-infections, encore peu nombreuses aussi bien dans le secteur scientifique
que dans celui de la santé publique, mettent en avant des chiffres aussi impressionnants
qu'alarmants.
Alors que les pays développés célèbrent l'éradication de certaines maladies, telle que la
tuberculose, les choses ne sont pas aussi simple pour les continents en développement tels
que l'Afrique, l'Asie et l'Amérique Latine. En affaiblissant les défenses immunitaires des
personnes infectées, l'arrivée du VIH-1 ouvre la voie à une recrudescence d'épidémies sans
précédent. C'est pour cela, qu'en tant que scientifique il est de notre devoir d'accroître les
38
recherches basées sur les co-infections afin d'élaborer des vaccins plus efficaces, des
traitements courts et peu coûteux et de définir des méthodes de dépistage simplifiés.
Chez un patient co-infecté, il n'est pas toujours clair s'il existe un effet additif ou
synergique des virus et! ou parasites. À titre d'exemple, les données actuelles montrent que :
• Le VIH -1 augmente le risque de passage à la chronicité de l' infection aux virus de
l'hépatite B et C [134,135].
• La tuberculose se développe de façon beaucoup plus rapide, puisque leur système
immunitaire est déjà affaibli et que la tuberculose augmente la charge virale du
VIH-1 [136,137].
• Le VIH -1 augmente le risque de Leishmaniose viscérale de 10 à 100 fois chez les
personnes vivant en zones endémiques [138]. De plus, les leishmanies chez un sujet
VIH -1 positif vont accélérer la réplication du virus du VIH -1 et aggraver son
immunosuppression [139].
Cependant les co-infections ne mènent pas systématiquement à une aggravation de
l'infection par le VIH-1. En effet, des chercheurs ont montré que le Trypanosoma cruzi,
parasite responsable de la maladie de Chagas, est capable de freiner la multiplication du
VIH-1 dans le placenta humain [140]. Une autre grande co-infection est celle concernant le
VIH-1 et le Plasmodium, parasite responsable de la malaria.
1 Aspects épidémiologiques de la co-infection
La malaria et l'infection par le VIH-1 sont à notre époque deux problèmes majeurs de
santé publique, responsables de plusieurs millions de décès chaque année. En 2006, environ
la moitié de la population (3 .3 milliards) vivait dans des régions à risque potentiel de
transmission de la malaria, et un tiers dans des régions à haut risque ( 1.2 milliards) [141].
La même année, le VIH -1 faisait environ 40 millions de personnes infectées à travers le
monde. Les zones d'endémie pour le VIH-1 et la malaria se superposent et concernent
l'Afrique sub saharienne , l'Asie du Sud-Est, l'Amérique latine et les Caraïbes (Figure 15).
Toutefois, la distribution des deux infections est hétérogène en fonction des régions, des
39
conditions climatiques et du mode de vie des populations. Les populations adultes urbaines
sont plus exposées à 1'infection par le VIH -1 , alors que la malaria concerne davantage les
jeunes enfants et les femmes enceintes vivant en zone rurale [142]
Figure 15: Distribution globale de la malaria (à gauche) et de l'infection au VIH-l (à droite)
Adaptée d 'images originales illustrées par l 'Organisme Mondiale de la Santé en 2006
Dans une zone de forte prévalence pour les deux infections, un modèle mathématique
d'évaluation de 1'impact réciproque des deux infections, démontre que 1'infection au VIH-1
pourrait être responsable d'une augmentation de prévalence de la malaria de 5,1 %, soit un
surcroît de 980 000 épisodes palustres depuis 1980 (et vice-versa, la malaria pourrait être
responsable d'un surcroît de 2,1 % d'infections VIH-1, soit 8500 cas) [143].
2 Aspects immunologiques de la co-infection
Dans les zones intenses de transmission de la malaria, l'exposition au parasite est
répétée depuis le plus jeune âge. Ceci permet le développement progressif dès le jeune l'âge
d'une immunité naturelle et avant tout partielle [144]. En effet, même si cette immunité
protège d'une forme grave de la maladie ou de la mort, la malaria est saisonnière car
dépendante du développement des parasites et des vecteurs ce qui empêche donc le
développement d'une immunité à long terme. Ces populations présentent ainsi une forme
asymptomatique de la maladie et une faible parasitémie. Cette forme d'immunité est non
seulement fragile mais a aussi la caractéristique de s'estomper rapidement. En d'autres
termes, après avoir quitté une zone endémique pour une période supérieure à un an les
individus doivent être considéré comme étant non-immunisé [145]. Les mécanismes de
1'immunité contre la malaria mettent en jeu des acteurs de l'immunité innée (phagocytes
mononucléés, cellules dendritiques et lymphocytes) et adaptative. Comme pour le VIH -1 ,
40
les lymphocytes T CD4+ ont un rôle important dans le développement et le maintien de
cette réponse immunitaire en induisant la production de cytokines Th 1 comme l 'IFN -y et les
immunoglobulines d'isotype IgG 1 et IgG3. Ces anticorps sont des effecteurs majeurs de la
clairance parasitaire notamment par leur capacité de neutralisation et d'opsonisation [146].
De ce fait, un patient atteint par le VIH-l pourra développer une réponse anti-malarique, si
ce dernier n'est pas complètement immunodéprimé. Les perturbations immunitaires
induites par le VIH-l sont donc susceptibles d'affaiblir la qualité de la réponse immune
anti-malarique aboutissant à un défaut de contrôle de la croissance parasitaire [147].
3 Impact de l'infection du VIH-l et de la malaria en co
infection
3.1 Chez les adultes
Il a récemment été montré que l'incidence des parasitémies asymptomatiques et des
épisodes malariques était significativement plus élevée chez les patients infectés par le
VIH-l. De plus, le risque d'accès de fièvre lors de crises malariques était trois fois plus
élevé chez les patients VIH -1 + [148]. Deux autres études de cohorte de patients VIH-l
réalisées en Ouganda [149] et au Malawi [150] ont montré une corrélation inverse entre
l'incidence des accès de fièvre et le degré d'immunodépression, les crises malariques étant
d'autant plus fréquents que le taux des lymphocytes T CD4+ était plus bas. Que les études
cliniques aient lieu dans des pays où les épidémies de malaria sont considérées comme
stables (c'est-à-dire où le risque d'infection est constant) ou non, les résultats demeurent
cependant controversés [146].
Bien que la majeure partie des études se concentre sur le rôle de l'infection du VIH-l
sur celle de la malaria une étude récente à mis en avant la possibilité que la malaria pouvait,
chez un patient co-infecté, augmenter la charge virale par une activation du système
immunitaire similaire à celle observée lors d'infections bactériologiques [151,152]. En
effet, lors d'une infection symptomatique de malaria, les patients ont des concentrations
sept fois plus importantes de charge virale sanguine.
41
3.2 Lors de la transmission mère enfant
L'infection VIH -1 et le paludisme ont chacun des effets nuisibles sur la grossesse. La
transmission verticale du VIH-l, c'est-à-dire de la mère à l'enfant, peut avoir lieu à
différents moments de la grossesse: (1) antepartum, soit par passage transplacentaire [153] ,
(2) intrapartum, soit durant le travail et l'accouchement [154], ou (3) postpartum, soit dans
le contexte de l'allaitement maternel [155]. La transmission mère-enfant du VIH-l peut
augmenter de 15% lors d'un allaitement prolongé. Ceci demeure problématique dans les
pays en développement, où il n'est pas toujours possible de recourir à l' allaitement
artificiel. Parmi les conséquences d'une infection au VIH-l, on relève l' anémie maternelle,
l'hypotrophie néonatale et un excès de mortalité postnatale [156-158]. L'anémie, source de
complications pour la femme enceinte (fausse couche, hypotrophie néonatale), est aussi une
conséquence de la malaria, ainsi que la recrudescence des crises malariques au cours de la
grossesse [159-161]. La majorité des quelques études effectuées sur la co-infection VIH-l
malaria concerne l'impact que cela peut avoir sur la transmission entre la mère et l ' enfant
dans les pays en développement [162-167]. Toutes ces études ont montré une augmentation
des niveaux et de la prévalence de la parasitémie chez les femmes séropositives, lors de la
délivrance de l'enfant et au niveau placentaire. De plus, toujours chez les femmes
séropositives, le risque de malaria ainsi que l'infection placentaire augmente avec le
nombre de grossesses. Le degré d'anémie maternelle est aussi plus important chez les
patientes co-infectées par la malaria et VIH-l qu'au cours des grossesses de patientes
infectées par l'un des deux seulement, plaidant pour une action synergique des deux
infections [158,168,169]. En termes de conséquences néonatales, les grossesses menées
chez des patientes co-infectées présentaient un risque plus important de prématurité et de
retard de croissance intra-utérin [164,166,169]. La prévention de la malaria chez la femme
enceinte est donc essentielle et envisageable grâce à une chimioprophy laxie (par exemple :
sulfadoxine-pyriméthamine en une prise mensuelle) associée à l'utilisation de moustiquaires
imprégnées d'insecticides, ce d'autant plus en cas d'infection par le VIH-l [167].
L'augmentation de la charge virale chez la femme enceinte est un risque important
de transmission mère-enfant. En effet, plusieurs études estiment qu'une augmentation de 10
fois de la charge virale du VIH -1 peut augmenter de 2.5 fois la transmission du VIH -1 de la
42
mère à l'enfant [170-1 74]. Chez les femmes enceintes, la malaria est associée à une
infiltration des monocytes dans le placenta [175-177] et une augmentation de l'expression
du récepteur CCR5 à la surface des macrophages résidents [178]. Associé à l'expression de
cytokines pro-inflammatoires (e.g. TNF-a) favorisant la réplication du VIH-1, ceci pourrait
augmenter la charge virale placentaire et donc la transmission à l'enfant [1 79-182].
4 Les traitements anti-malariques et antirétroviraux en
combinaison
Théoriquement, il est logique d'imaginer que les l'infection au VIH-1 puissent
entraîner une baisse de l'efficacité des traitements anti-malariques. Cependant, les études
actuelles restent très départagées sur ce sujet mais suggèrent que le risque d'échec
thérapeutique est plus important chez les patients VIH-1 avec un taux de lymphocytes T
CD4+ inférieur à 200/mm3 [146].
À ce jour il n'existe pas de traitements recommandés lors de la co-infection
VIH/SIDA-malaria. Les effets que peuvent avoir les médicaments antirétroviraux sur les
médicaments anti-malariques (et inversement) ne sont pas sujets à beaucoup d' études. Des
études cliniques montrent que la chimiothérapie anti-malarique peut cependant être
bénéfique pour le patient car elle favorise une diminution significative de la prévalence des
deux infections. Cependant, les conséquences de cette co-administration médicamenteuse
dépendent des drogues et des combinaisons choisies. L'énumération des récents
traitements, leur impact sur le métabolisme du patient ainsi que leurs interactions possibles
sont très bien résumés dans la référence suivante [183] et illustrés dans un tableau en
annexe. Une grande majorité des études se focalise sur l'impact de drogues telles que la
méfloquine ou la chloroquine, malheureusement proscrites [184]. D'autres étudient les
mécanismes d'interactions entre les drogues rétrovirales (essentiellement les inhibiteurs de
protéases) et les drogues anti-malariques. Les inhibiteurs de protéase du VIH-1 sont
d'abord métabolisés dans l'intestin puis dans le foie par les cytochromes CYP3A (CYP3A4
et CYP3A5) pour lesquels ils ont une forte affinité, ce qui leur confère des propriétés
inhibitrices. Les drogues anti-malariques sont, elles aussi, métabolisées par le cytochrome
ce qui pose problème pour leur co-administration. En effet, certaines études démontrent des
43
interactions possiblement néfastes entre ces drogues [185-188]. Cependant, de nouveaux
espoirs sont placés sur les études impliquant l'utilisation d'artémisinine et ses dérivés en bi
ou trithérapie [186,189,190]. Par exemple, la co-administration de l'anti-malarique
Coartem® (artéméther-Iuméfantrine) et l'inhibiteur de protéase Kaletra® (lopinavir
ritonavir) a été démontrée efficace mais les réponses des patients était hautement variables
et parfois même toxiques.
Selon Médecin Sans Frontières, l'utilisation inappropriée des médicaments anti
malariques au siècle dernier a largement contribué à un taux de mortalité élevé,
particulièrement chez les enfants de moins de cinq ans. Leur diffusion à large échelle,
toujours administrés en monothérapie, a été mal gérée et perpétuée en dépit de l'apparition
de niveaux inacceptables de résistance (e.g. chloroquine). Pourtant, la dernière décennie a
vu apparaître une nouvelle classe de médicaments extraits d'une plante, l'Artemisia annua :
l ' artémisinine et ses dérivés. Lorsqu'elle est utilisée correctement, par voie orale ou sous
forme injectable et surtout en combinaison avec d'autres médicaments, l'efficacité de
l'artémisinine est de plus de 95% pour traiter la malaria. Cette combinaison a pour effet de
prolonger et de renforcer l'effet du traitement, mais aussi de retarder l'apparition de
résistances; on parle alors de combinaisons thérapeutiques à base d'artémisinine (ACT). En
juin 2008, seuls quatre pays et territoires africains n'avaient pas encore adopté les ACT
comme traitement de première intention. Cette évolution a été favorisée par un accord passé
en 2001 entre l'Organisation Mondiale de la Santé et le laboratoire pharmaceutique
Novartis, en vertu duquel ce dernier s'est engagé à fournir aux services publics de santé une
ACT, l'artéméther-Iuméfantrine, à prix coûtant. La distribution d'ACT a commencé à
augmenter fortement en 2006. Le nombre de doses fournies, pour la plupart en Afrique, est
passé de six millions en 2005 à 49 millions en 2006 [141]. À ce jour, l'utilisation de ces
combinaisons reste notre seule arme face à cette co-infection meurtrière.
44
Chapitre III. Le Plasmodium falciparum
« Les membres de la famille des Apicomplexa ont une importance médicale et vétérinaire
considérable, étant responsables d'une large gamme de maladies humaines et animales
incluant la malaria, la toxoplasmose, les sporidioses et coccidoses. »
D. Soldati-Favre
La malaria, ou paludisme, est causé par un protozoaire du genre Plasmodium, qui
infecte alternativement les hôtes humains et des moustiques du genre Anopheles. Il s'agit
d'un organisme eucaryote complexe appartenant à l'embranchement des Sporozoa et à
l'ordre des Hœmosporidae et résulte d'une endosymbiose ancienne avec une algue rouge
[191]. La caractéristique majeure de ces parasites est leur acquisition d'organelle spécifique
telle que le complexe apical. Ce dernier consiste en une projection conique de la membrane
Proéminence apicale avec anneau polaire
Micronèmes ____ ~~ .... ~.,
Rhoptries
Granules denses __ --...-.,..
Microtubules
Membrane interne avec vésiscules subpelliculées
Mitochondrie ~ ...... "'
Apicoplaste
Noyau
Réticulum endoplasmique
Membrane plasmique
membrane cellulaire conçue pour se
faufiler dans les tissus et entrer en
contact avec la cellule-hôte, par
l'intermédiaire d'un groupe d'organelles
uniques: deux rhoptries, un anneau
polaire et un nombre de micronèmes et
de granules denses [192] . Ces
organelles contiennent différentes
substances qui sont «injectées» dans
la cellule-hôte au cours de l'invasion au
moyen d'un système de conduits qui
lient ces organelles entre elles, puis
s'ouvrent au pôle apical de la cellule
Figure 16: Organisation des organelles du P. falciparum (Figure 16).
Traduite et adaptée d'une image originale illustrée [i93]
45
Les substances relarguées jouent un rôle crucial en déstabilisant la membrane cellulaire, ce
qui aboutit à la formation d'une poche d'invasion, qui va éventuellement envelopper le
mérozoïte à l'intérieur d'une cavité membranaire: la vacuole parasitophore. Lorsque le
mérozoïte a envahit le globule rouge, les « granules denses» sont amenés à la surface du
parasite où ils déversent leur contenu dans la vacuole parasitophore, contribuant à
l'augmentation de la surface de cette membrane.
Le genre Plasmodium comporte plus de 100 espèces, dont quatre infectent
l' homme: Plasmodiumfalciparum, la principale espèce pathogène pour l'homme, P. vivax,
P. ovale et P. malariae. D'autres espèces plasmodiales qui infectent les singes (par
exemple P. knowlesi et P. cynomolgi) ou les rongeurs (P. yoelii, P. berghei, P. chabaudi et
P. vinckei) sont étudiées comme modèles expérimentaux. Des cas de malaria ont été décrits
chez l'homme avec des espèces plasmodiales de singe, notamment P. knowlesi [194].
Parmi les quatre espèces à l'origine d'infections chez l'homme, le P. falcïparum provoque
les infections les plus graves, souvent mortelles. Le génome nucléaire de P. falciparum
(souche 3D7), comprend 22.8 millions de paires de bases, réparties sur 14 chromosomes
[195]. La composition en bases est tout à fait atypique car comportant une très forte
proportion d' adénines et les thymines, représentant près de 80 % des bases du génome
entier. Environ 5300 gènes codent des protéines toutes aussi atypiques dues à leur
composition en acides aminés et parce qu'elles sont en moyenne 20 % plus longues que les
protéines homologues connues dans les autres organismes. Toutes ces difficultés
accumulées font que des caractéristiques fonctionnelles n'ont pu être proposées que pour
40% des gènes de P. falciparum et ceci, grâce à l'identification de gènes homologues de
fonctions connues dans d'autres espèces. Il reste donc 60% de gènes hypothétiques (,,-,3000),
dont la fonction est totalement inconnue. L'annotation de son génome a identifié des cibles
thérapeutiques potentielles à divers stades. Pourtant, la connaissance des voies
métaboliques, de la biologie et de la physiologie cellulaire reste encore très fragmentaire
d'où la nécessité de développer les modèles expérimentaux appropriés pour évaluer de
nouvelles cibles d'intervention.
46
1 Le cycle du P. falciparum
Figure 17: Le cycle du Plasmodium falciparum
Traduite et adaptée d'une image originale illustrée [196]
Le cycle de développement du Plasmodium comprend une phase de multiplication
asexuée qui se déroule chez l'homme, et une phase de multiplication sexuée qui se déroule
chez un moustique femelle (Anophèle). Le cycle schizogonique asexué chez l'homme se
passe en deux étapes (avec début de la phase sexuée) : une étape hépatique et une étape
érythrocytaire (Figure 17). L'aspiration du sang peut durer jusqu'à trois minutes et la
femelle peut absorbe plus du double de son poids en sang. C'est au cours de piqûres sur un
homme ou un animal parasité, que les femelles contractent le parasite, et à l'occasion de
piqûres ultérieures qu'elles peuvent le retransmettre [197]. Les sporozoïtes inoculés
peuvent être directement phagocytés par les cellules résidentes du site d'inoculation, mais
la majeure partie des parasites migre au foie en moins de 30 minutes. C'est à cet endroit
qu'ils subissent une maturation ou un état de latence [198]. En effet, chez certaines espèces
(P. ovale et P. vivax) un stade cryptozoïte peut se produite où les parasites restent cachés
dans le foie. Ces derniers peuvent se réveiller plusieurs mois ou années plus tard pour
reprendre leur cycle. La maturation hépatique aboutie en un temps variable selon l'espèce
plasmodiale et la multiplication des sporozoites. Ces derniers repoussent en périphérie le
noyau de la cellule et finissent par constituer une masse multi-nucléée appelée schizonte ou
47
corps bleu. La cellule finit par éclater, libérant ainsi de nombreux mérozoites. Pour le
Plasmodium falciparum ce cycle est unique alors qu'il peut être multiplié pour les autres
espèces, avec production d'hypnozoïtes, cellules plasmodiales quiescentes, rendant compte
de la longévité de leurs récurrences. Après une schizogonie intra-hépatique qui dure de 7 à
21 jours en fonction des espèces plasmodiales, les mérozoites libérés gagnent la circulation
sanguine. Ils pénètrent dans une hématie (globule rouge), se transforment en trophozoïtes
puis en schizontes qui se multiplient. L'éclatement du globule rouge libère les schizontes
qui peuvent aller coloniser d'autres hématies. Après plusieurs cycles apparaissent des
gamétocytes mâles et femelles. Ce cycle de maturation de 48h ou 72h rend compte de
l'évolution cyclique variable de la fièvre. Celle-ci nécessite un taux-seuil d'hématies
parasitées pour se manifester. Le cycle sporogonique sexué chez l'anophèle à lieu lors d'un
repas sanguin pris chez un patient atteint par la malaria. Seuls les gamétocytes vont
conduire à la formation de sporozoïtes inoculés. La température doit être comprise entre 16
et 20°C selon l'espèce plasmodiale et le cycle dure de 10 à 40 jours [199].
2 Le cycle érythrocytaire
Les globules rouges sont un environnement peu hospitalier pour le développement du
P. falciparum. En effet, ces cellules anucléées n'offrent pas d'organites intracellulaires
permettant un transport efficace des nutriments nécessaires au développement du parasite.
La survie du Plamodium exige donc la mise en place de compartiments membranaires. Des
transformations lipidiques et protéiques sont également essentielles pour la prolifération du
parasite après l'infection érythrocytaire de l'hôte.
2.1 Les compartiments membranaires de l'érythrocyte infecté
Le cycle intra-érythrocytaire est particulièrement rapide selon les espèces. Il est à
l'origine de l'accès malarique et de son signe le plus marquant, une fièvre intense.
Au moment de l'invasion de l'érythrocyte, le parasite, lui-même bordé par sa
membrane plasmique (MPP), s'entoure d'une vacuole parasitophore (VP) dont la
membrane (MVP) forme une barrière entre le parasite et le cytoplasme de l'érythrocyte. La
MPP et la MVP sont capables de s'invaginer pour former le cytostome, une vacuole
48
d'endocytose qui permet au parasite de capturer l'hémoglobine du globule rouge dont il se
nourrit.
Cytoplu •• parultoi,.
(stade anneau) (stade trophozoïte) 0-24 h 24- 36 h
(stade schizonte) 36-48 h
Plasmodium A Jl (stade méroloïte) <'------, Mérozoïtes libres réinfectant des érythrocytes Ç-/
FM
(stade trophozoïte) 24 -36 h
Figure 18: Cycle intra-érythrocytaire du P. falciparum
Adaptée d'une image originale illustrée [200}
Lors de son développement dans les globules rouges, le Plasmodium évolue en trois
étapes. Le stade mérozoïte, issu de la prolifération initiale du parasite dans le foie, est
capable d'infecter un érythrocyte. Il va s'enfermer dans une vacuole parasitophore (stade
anneau) (Figure 18A). Au stade trophozoïte, la néosynthèse de ses protéines est intense et
leur trafic via de nombreux compartiments membranaires que le parasite étend dans le
cytosol du globule rouge est efficace. Le parasite se développe ensuite en schizonte, et
celui-ci se divise pour donner de nombreux mérozoïtes, lesquels, après rupture de la
membrane érythrocytaire, vont pouvoir infecter d'autres érythrocytes. Au stade trophozoïte,
49
l'ultrastructure schématique de l'érythrocyte infecté démontre que le parasite contient des
organites internes comme le noyau, le réticulum endoplasmique (RE), le golgi, une
mitochondrie (Mito), un apicoplaste (A), un cytostome (C), lequel fusionne avec la vacuole
digestive (VD) dans laquelle l'hémoglobine est dégradée en un déchet, le pigment
malarique dit hématine ou hémozoïne (Hz) (Figure 18B). Le parasite, entouré d 'une
membrane plasmique (MPP), est logé dans une vacuole parasitophore (VP) dont la
membrane (MVP) peut se différencier en structures membranaires et vésiculaires (TVN)
comme les fissures de Maurer (FM). Le parasite adresse de nombreuses protéines
parasitaires via ces structures jusqu'à la membrane du globule rouge (ME), au niveau de
laquelle celles-ci forment des protubérances (Knob) impliquées dans la cytoadhérence du
Plasmodium dans les vaisseaux sanguins, phénomène responsable notamment du
neuropaludisme. Les flèches en orange décrivent succinctement les chemins qu 'empruntent
les protéines parasitaires pour être adressées dans les compartiments du parasite, ou bien à
partir de la vacuole parasitophore vers le cytosol du globule et au-delà de sa membrane
[200].
2.2 La formation de l'hémozoïne
Depuis longtemps, l'accumulation d'un pigment « granuleux noirâtre» a été observée
dans les organes de patients morts. En 1717, Morton et Giovanni Lancisi écrivaient un
mémoire intitulé « De Noxii Paludum EjJluviis eorumque remediis » dans lequel le pigment
Figure 19: Cristaux d'HZ dans la vacuole digestive
est décrit dans la rate et le cerveau, observation faite
également par d'autres auteurs et que Meckel renouvelle
en 1847. En 1879 Afanasiev ajoute que le pigment semble
être contenu dans des «corps protoplasmiques». Il
précède de peu la découverte par Laveran à Bône
(Algérie) du parasite de la malaria. En effet, c'est en 1880,
que ce médecin de l'armée française observe dans une
préparation de sang d'un malade fiévreux des filaments
très mobiles s'agitant autour d'un globule rouge. Pendant longtemps, l'accumulation de ce
pigment était la seule façon de diagnostiquer convenablement la malaria.
50
L'hémozoïne (HZ), aussi appelé pigment malarique ou pigment palustre, est un
dimère formé par la dégradation de l'hémoglobine dans un globule rouge infecté par le
Plasmodium (Figure 19, adaptée de [201]). En effet, 1 'hémoglobine, spécialisée dans le
transport d'oxygène de la périphérie vers les tissus, représente 95 % des protéines contenues
dans un globule rouge mature [202]. Le parasite se procure donc les acides aminés dont il a
besoin soit par digestion des protéines érythrocytaires (en particulier l'hémoglobine) ou du
pool d'acides aminés libres du plasma; certains acides aminés sont synthétisés à partir du
glucose par le parasite lui-même (par exemple la glutamine). L'hémoglobine est digérée au
niveau de la vacuole digestive du parasite, donnant de l'hème et de la globine, qui est elle
même hydrolysée en acides aminés par une série de protéases parasitaires (incluant des
sérine-protéases, des aspartine-protéases et des cystéine-protéases) [203]. Jusqu'à 75% du
contenu en hémoglobine de l'érythrocyte infecté peut être digérée par le parasite [204].
Néanmoins, la structure moléculaire des dérivés de l'hémoglobine (notamment l 'hème)
construite autour d'un atome de fer lui est potentiellement toxique. Ainsi, le parasite
l'évacue en couplant ces groupements héminiques entre eux et en les chassant de la vacuole
digestive. C'est l'association de ces groupements héminiques qui forme une molécule
d'hémozoïne [205]. L 'HZ circule dans l'organisme et finit par atteindre l'hypothalamus dont
elle perturbe le fonctionnement. Elle est ainsi responsable des très fortes fièvres qui
accompagnent la malaria. L'augmentation du nombre de parasite dans l'organisme
augmente le taux d'hémozoïne dans le sang et
aggrave les fièvres [206]. La libération de ce
pigment dans la circulation de l'hôte peut
également aVOIr une certaine toxicité,
particulièrement dans les macrophages (où ce
pigment s'accumule sans que la cellule soit
Figure 20: Accumulation de l'HZ (rate) capable de s'en débarrasser) et il a été suggéré
que le pigment puisse jouer un rôle déterminant dans la physiopathogénèse de l'anémie
associée au paludisme [207]. Le pigment peut s'accumuler dans les cellules du système
réticulo-endothelial, où il peut rester pendant de nombreuses années après l'infection
(Figure 20, Adaptée d 'une image du LSTMIC) [208].
51
3 L'hémozoïne et la réponse immunitaire de l'hôte
Les cellules immunitaires de l'hôte humain phagocytent avidement l'HZ dès sa
libération dans la circulation sanguine, les trophozoïtes contenant l'HZ (aproximativement
9 à 10 par cellules), et les schizontes [209]. En effet, trois heures après le début de la
phagocytose l'hémozoïne est incorporée dans 79 % des monocytes, occupant 30 % du
volume total de la cellule [210,211].
3.1 Les effets inhibiteurs de l'HZ
Lors d'une infection au Plasmodium falciparum plusieurs dommages de la réponse
cellulaire ont été observés tels qu'une diminution de la réponse immunitaire suite à la
présence antigénique, une asthénie de la prolifération des cellules T CD4+ et un déclin de la
production d'anticorps. En effet, les cellules présentatrices d'antigènes, ayant phagocytées
de larges quantités d'HZ, seraient incapables de présenter correctement le CMHII à leur
surface membranaire altérant ainsi la présentation peptidique aux lymphocytes T auxiliaires
[208,212]. Lors de l'interaction entre cellules présentatrices de l'antigène et les
lymphocytes T, les premières produisent de l'interleukine 1 (IL 1) afin d'induire la
prolifération des seconds. Les lymphocytes T synthétisent alors de l'interféron gamma
(IFN -y) qui permet l'intensification de l'expression du CMHII et la présentation de
l'antigène. L' immunosuppression associée à la malaria serait la résultante de ce mécanisme
et pourrait être observée avec une mesure de la production d'IFN-y.
Au cours de son développement dans le globule rouge, le Plasmodium falciparum est
soumis à un choc oxydatif qui peut être létal pour le parasite. Celui-ci doit donc mettre en
place un système de défense dirigé contre les espèces activées de l'oxygène. En effet, lors
du cycle intra-érythrocytaire, le parasite dégrade 1 'hémoglobine de 1 'hôte pour favoriser son
développement. Afin de se protéger contre les effets toxiques de la dégradation, l'hème est
cristallisé en hémozoïne. Cependant, cette réaction engendre l'accumulation de molécules
de fer et de peroxydes d'hydrogène pouvant être à l'origine d'un stress oxydatif [213]. Pour
contrecarrer ce stress, le Plasmodium possède une métalloprotéine dotée d'une activité
enzymatique (superoxyde dismutase, SOD) importante qui lui permet de se défendre contre
les radicaux libres tels que le peroxyde d'hydrogène [214]. Un des marqueurs du stress
52
oxydatif est le 4-hydroxynonénal (4-HNE). Ce produit irréversible de la peroxydation des
lipides membranaires est extrêmement toxique pour les cellules où il s'accumule, entraînant
directement leur apoptose. Schwarzer et collaborateurs ont démontré qu'une forme de
faible poids moléculaire de 4-HNE pouvait inhiber l'expression de CMHII mimant les
effets observés lors de la phagocytose de l'HZ [209]. Associés à l'affaiblissement de
l'expression de molécules d'adhésion favorisant le contact entre d'une cellule présentatrice
d'antigène et un lymphocyte T (ICAM-1), ces mécanismes peuvent expliquer l'immuno
déficience associée à la malaria [208].
3.2 Inhibition de la différenciation et de la maturation des cellules
dendritiques
Les monocytes sont inefficaces pour initier une réponse immune pnmalre mais
lorsqu'ils sont différenciés en OC ils jouent un rôle important dans les réponses
immunitaires innées et adaptives. Les monocytes précurseurs des DC sont présents dans la
circulation sanguine où ils vont phagocyter l'HZ, migrer au site d'inflammation et se
différencier. Les DC sont capables de reconnaitre une grande diversité de pathogènes grâce
à leurs récepteurs membranaires (récepteurs Scavenger et Toll-like receptor ou TLR) [215].
Elles capturent les antigènes grâce à différents mécanismes endocytiques des pathogènes et
les présentent, après digestion, sous forme de peptides associés aux molécules du CMH II
ou 1 aux lymphocytes T CD4+ ou CD8+, respectivement. Cette augmentation de
l'endocytose des antigènes résulte d'une stimulation de l'activité des extensions
membranaires de la cellule dendritique et dépend du cytosquelette d'actine de la cellule
dendritique [216]. La présentation antigénique est un phénomène rapide, transitoire,
atteignant un maximum 30 à 45 minutes après l'engagement des TLR, et évolue vers une
perte progressive de la capacité d'endocytose [217]. L'activation des TLR, outre la
stimulation de l'activité membranaire de la OC, conduit à un désassemblage rapide des
podosomes, des regroupements d'extensions cytoplasmiques riches en actine impliqués
dans la migration des cellules, à l'expression de molécules de surfaces telles que le CD80 et
CD86 primordiales pour l'activation des lymphocytes T naïfs, ainsi que la sécrétion de
cytokines médiatrices de la réponse immunitaire (IL-12 ou interféron de type 1) [218].
53
L'influence du Plasmodium, et plus particulièrement des pigments de la malaria, lors de la
différenciation et la maturation des DC demeure controversée (Tableau 3) [219-232].
Tableau 3: Résumé des études de l'effet du Plasmodium sur les De
Dose élevées falciparum iRBC Humain
Doses faibles
Pas de maturation fa lciparum HZ Humain
TLR9 falciparum iRBC Humain Souris
Dialogue entre DC et cellules NK falciparum iRBC Humain
TLR9,MyD88 falciparum HZ Souris
Phagocytose des globules rouges, IL-I2 chabaudi iRBC Souris
Regroupement cellulaire entre DC et chabaudi HZ Souris
cellule T
Apoptose des De chabaudi iRBC Souris
TH!
DC régulatrices yoelii iRBC Souris
Souches létales, TNFa yoelii iRBC Souris
Souches non létales
Plusieurs études ont montrés que les globules rouges infectés par le Plasmodium
falciparum étaient responsables d'une modulation négative de l'activation et de la
maturation des DC dérivées de monocytes [221,233]. Cette modulation négative,
dépendante d'une interaction avec le récepteur scavenger CD36 (reconnu pour se lier aux
cellules apoptotiques), se traduit par une absence d'expression des molécules du CMH, des
molécules d'adhésion et de co-stimulation, ainsi qu'une absence de production d'IL-12
normalement observée en présence de LPS [222]. Concernant l'HZ, il a été montré que ce
pigment pouvait également inhiber la maturation des DC dû à une diminution de
l'expression de CMHII et de molécules de costimulation: CD83, CD80, CD54, CD40 et
CDla [234,235]. Un mécanisme dépendant de l'expression à la hausse du récepteur
PPAR-y, connu pour inhiber la différenciation des DC [236], serait responsable de cet effet.
Les récepteurs nucléaires PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) sont des
54
facteurs de transcription qui, après avoir formé un hétérodimère avec le récepteur des
rétinoïdes (RXR) , sont activés par la fixation de leurs ligands spécifiques (naturels ou
synthétiques) et vont réguler la transcription de gènes cibles [237].
Une étude contradictoire à également montré que l' HZ purifiée pouvait, via le TLR9
dépendant de la voie de signalisation MyD88, induire la maturation des DC en augmentant
l' expression de CD83, CD86 et CD 1 a [238,239]. Les principales différences entre ces
études sont la purification des pigments, la concentration d'HZ choisie et l' analyse des
marqueurs de maturation (pourcentages de cellules positives contre intensité moyenne de
fluorescence ou MFI). En effet, dans la première étude les De sont traitées avec des
pigments d'hémozoïne phagocytés par des globules rouges, alors que pour la deuxième
étude elles sont traitées avec une concentration de 10 f.lM d'HZ purifiée.
3.3 Activation des neutrophiles par l'HZ
Les monocytes et les neutrophiles sont systématiquement recrutés au site d' infection
et d'inflammation. Grâce à leur capacité de phagocyter les pathogènes et d' éliminer les
globules rouges infectés via des mécanismes dépendants de la dégradation enzymatique,
d' espèces réactives d'oxygène (ROS) et d'intermédiaires réactifs dérivés de l'azote (RNI)
ces cellules sont essentielles pour la défense de l'hôte [240]. En effet, l'HZ a souvent été
associé à une production d'oxyde nitrique (NO) en réponse à une activation des
macrophages murins par l'IFN-y et à une stimulation par le TNF [241]. Chez l'homme, les
macrophages ne semblent pas pouvoir produire de quantités significatives de NO, mais
d'autres cellules comme les neutrophiles en sont capables [242]. Cependant, lorsque ces
mécanismes sont suractivés ils sont souvent associés à une augmentation de la sévérité de
la malaria [243,244]. La sévérité de la malaria a également été associée au niveau de TNF-a
[243], à l'activation des neutrophiles [244] et à la forte concentration d' HZ présente dans le
monocytes et les neutrophiles circulants [245]. Le TNF-a est un médiateur majeur des
réponses inflammatoire, de l' induction des fonctions cellulaires des leucocytes et de la
diminution de la parasitémie dans les étapes précoces de l'infection. Un excès de cette
cytokine provoque une obstruction microvasculaire néfaste car, par une surexpression des
ligands favorisant l'adhésion cellulaire, elle est responsable de la séquestration des
plaquettes, des érythrocytes et des leucocytes infectés [246]. Lors d'une infection au
55
Plasmodium la surexpression de TNF-a est induite par les macrophages activés suite à la
rupture des schizontes [247], à certaines molécules parasitaires comme les
glycosylphosphatidylinositol (GPI) [248], à des complexes immuns contenant des IgE anti
malarique [249] et à l'accumulation d'HZ [250]. En association avec sa capacité inductrice
de TNF -a, il a également été prouvé que l'HZ pouvait activer les neutrophiles causant la
production de cytokines pro-inflammatoires (IL-8) et l ' attraction d'autres cellules
phagocytaires au site d'inflammation.
3.4 Les autres effets de l'HZ
Le développement d' une anémie sévère lors d'une infection au P. falciparum, une
cause importante de mortalité, est la conséquence de la destruction massive de globules
rouges et d'une dégradation de l' érythropoïèse (processus de production des globules
rouges dans la moelle osseuse). Le mécanisme de l' anémie est sûrement multifactoriel, et
reste encore mal compris. Cependant, il s'associe à une destruction cellulaire, qui touche
indifféremment les globules rouges parasité et non parasitées. Un travail récemment mené
en Zambie a démontré le rôle d'un facteur inhibiteur de la migration des macrophages
(MlF) dans le développement érythroïde [251]. MlF est un facteur important pour la
régulation de la réponse inflammatoire innée et est responsable de la suppression de
l' érythropoïèse. Ainsi, les auteurs ont démontré que l' HZ stimule les macrophages à
sécréter diverses cytokines (TNF-a et IFN-y) qui en synergie avec MlF inhibent la
hématopoièse. Toutes les fonctions effectrices du macrophage sont amplifiées peu après
l' infection. Bien qu' ils soient activés spécifiquement par des cytokines produites par les
lymphocytes T (IFN-y, GM-CSF, IL-3 et IL-4), les macrophages peuvent également être
activés par des mécanismes indépendant des cellules T : (1) l'IFN-y provenant des cellules
NK stimulées par l 'IL-12 produite elle-même par les macrophages et (2) le TNF -a produit
par le macrophage en réponse au Plasmodium active à leur tour d'autres macrophages. Le
TNF-a, comme MlF, peut être nocif autant que bénéfique pour l' hôte, cela dépend des
quantités produites et de sa diffusion dans la circulation. En effet, le TNF -a et MlF
corrèlent avec la gravité de la maladie dans le cas d'une infection au Plasmodium
[252,253]. En quantité trop importante, la production de ces cytokines peut donc être
néfaste pour son hôte et provoquer un stress oxydatif ou un choc septique [252,254].
56
Un autre facteur responsable de la suppression de l'érythropoïèse est l ' inhibition
systémique de la production d'IL-12. Une étude suggère que l'HZ inhibe la production
d'IL-12 par un mécanisme indépendant des voies de l'IL-10 et de la p38 MAPK [241].
Cette synergie est importante puisque lors d'une infection par Plasmodium, la phagocytose
d'érythrocytes infectés ainsi que non infectés est fortement stimulée et peut contribuer aux
changements des profils de cytokines (TH1 vers TH2) observés pendant l'infection [255].
Par ses localisations (cerveau et autres organes), le Plasmodium doit traverser de
nombreuses membranes basales et s'infiltrer dans la matrice extracellulaire impliquant
probablement des gélatinases A (MMP-2) et/ou B (MMP-9) ou d'autres métalloprotéinases
matricielles (MMPs). De plus comme nous venons de le voir le TNF -u exerce de multiples
actions dont se rajoute sa capacité de stimuler la synthèse de MMP-9 impliqué dans la
migration cellulaire [256]. Ainsi la sécrétion de MMPs par les monocytes-macrophages
pourrait participer à la dissémination parasitaire et à la traversée des différentes barrières
biologiques. La phagocytose de l'HZ a été proposée comme possible inducteur de
l'activation de MMP-9 et donc de l'accumulation de TNF-u soluble dépendant de la
sécrétion de MMP-9 [257]. Par conséquent l'HZ et MMP-9 coopèrent pour augmenter la
production de TNF-u afin de provoquer des dommages de la membrane basale favorisant
ainsi l' extravasion des cellules sanguines dans les tissus péri vasculaires.
3.5 L'HZ comme cible thérapeutique possible
La formation de l'HZ est un phénomène unique, spécifique du parasite Plasmodium,
elle représente donc une cible de choix pour l'élaboration de médicaments anti-malarique.
La première drogue possédant une activité anti-malarique était le bleu de méthylène et une
modification de la molécule à donné naissance à la chloroquine. À cause des premiers cas
de chloroquirésistances en 1960, il a été important de développer de nouvelles molécules.
Les composés quinines apparus pour la première fois en 1944 sont suspectés comme étant
des inhibiteurs de la détoxification de l'hème [258-260]. Des études détaillées sur les anti
malariques quinoléiques (4-aminoquinoline) ont démontré qu'un atome chlorine présent
dans la structure de cette molécule inhibait efficacement la formation de l 'hémozoïne [261-
263]. L'inhibition de l'HZ est donc une action fondamentale de la chloroquine. Cependant,
ce mécanisme d' action est moins efficace pour la quinine et la méfloquine [264,265]. La
57
formation de l'HZ peut également être altérée par différentes drogues dérivées ou non de la
chloroquine (Tableau 4, adapté de [266]).
Tableau 4: Drogues anti-malariques inhibant la formation d'HZ
Hawley 1998 [267]
Slater 1992 [268]
Slater 1992 [268]
Slater 1992 [268]
Hawley 1998 [267]
Hawley 1998 [267]
Olliaro 2001 [269]
Warhurst 2007 [270]
Vennerstrom 1999 [271]
Hawley 1998 [267]
Non publié
Biot 2005 [272]
Non publié
Atamna 1996 [273]
Non utilisée depuis 1970
Utilisation limitée depuis les résistances
Utilisation efficace lorsque résistance à la chloroquine mais toxique
Utilisation efficace lorsque résistance à la chloroquine lors de malaria sévère
Utilisation efficace lorsque résistance à la choloquine mais chère et cas de résistance
Active contre les parasites résistants à la chloroquine mais cardiotoxique
Lien avec l'HZ suspecté mais non prouvé, utilisé en association avec l'artéméther
Drogues en développement
En phase clinique l, Il et III comme thérapie de combinaison
En phase clinique III
En phase clinique III
Similarité avec l'amodiaquine, en développement pré-clinique
En phase clinique Il
Analogue de la chloroquine
Étude pilote en cours
À cause des nombreuses résistances à ces médicaments, les combinaisons de
drogues restent actuellement le traitement de choix: l' artéméther (A), un dérivé de
l'artémisinine, et la luméfantrine (L), auparavant nommée benflumétol, un amino-alcool
apparenté à l'halofantrine (Coartem®, Riamet®). Ces deux molécules interfèrent avec
l'utilisation de 1 'hémoglobine par le parasite dans sa vacuole nutritive, mais à des niveaux
58
différents incluant l'inhibition de la formation d'HZ. Elles se différencient aussi par leur
efficacité sur la disparition des parasites (rapide pour l'artéméther, plus lente pour la
luméfantrine) et par leur pharmacocinétique. Les études réalisées en zone tropicale depuis
1997 avec A-L dans le traitement curatif des accès simples à P. falciparum chez l'adulte,
utilisant 4 comprimés (A : 20 mg, L : 120mg) administrés 2 fois par jour pendant 2 ou 3
jours ont montré des taux de guérison de 87 à 97 % [274].
3.6 L'HZ et le VIH-l
Dans les études de co-infection entre le VIH-1 et le Plasmodiumfalcuparum l' impact
de la phagocytose de l'HZ n'a été associée qu'à deux mécanismes: (1) les pigments d'HZ
sont associés à une augmentation de la sécrétion de MIP-1 u et P par les cellules
mononucléaires circulant dans le sang (PB MC) [275] et à une diminution significative de la
sécrétion d'IFN-y par les cellules placentaires mononucléées (IVBMC) [276].
Les protéines inflammatoires MIP jouent un rôle important dans la réponse
immunitaire lors de la malaria placentaire (PM). Comparativement aux femmes non
infectées, les femmes PM+ et les femmes co-infectées (PM+ et VIH-1+) présentaient une
concentration de MIP-1 P significativement élevée et associée à une augmentation de la
parasitémie et à des concentrations de pigments d'HZ dans le sang. Sachant que le VIH-1
n'influence pas la sécrétion de ces cytokines, cette étude a conclue que la sensibilité accrue
au paludisme des femmes enceintes infectées par le VIH-1 n'est pas associée à une
modulation de la sécrétion des MIP [275]. Cependant, un an plus tard, cette même équipe
de recherche a prouvé qu'une modification des profils de sécrétion des cytokines, par
l'accumulation d'HZ, induit une inhibition de l'immunité protective des patients infectés ou
non par le VIH-1. En effet, l'HZ augmente de façon dose-dépendante la sécrétion d'IFN-y
et TNF -u par les cellules mononucléées du sang intervilleux de femmes atteintes de malaria
placentaire (IVBMC). Les résultats ont également prouvés que l'accumulation d'HZ
influence différemment la sécrétion des cytokines chez les femmes non-infectées par le
VIH-1 en inhibant la synthèse d'IFN-y [276].
Chapitre IV. La phagocytose des pigments malariques (hémozoïne ou HZ) rend les macrophages humains moins permissifs à l'infection du VIH-l
59
Ce chapitre fait l' objet d'une publication actuellement en révision dans la revue
Journal of Virology. Par conséquent, le texte ainsi que les résultats peuvent être sujet à des
modifications avant leur publication.
Juliette Diou a participé à l'essentiel du travail de laboratoire, est responsable des
figures 1 à 9 et a participé à la rédaction de l'article. Sonia Gauthier a participé à la figure
5. Mélanie Tardif a participé à la rédaction de l' article. Rémi Fromentin a participé aux
figures 8 et 9. Robert Lodge a participé à l'utilisation du microscope de « live cell » de la
figure 1. David J. Sullivan Jr. a fourni l'PfHZ.
1 Résumé
Il existe très peu d'études axées sur les mécanismes pathophysiologiques expliquant
les interactions synergiques de la co-infection entre le P. falciparum, agent causatif de la
malaria, et le VIH -1. En effet, la plupart des études sont essentiellement cliniques,
épidémiologiques ou thérapeutiques. Il est connu que le Plasmodium dégrade
l'hémoglobine afin d'assurer son développement dans son hôte humain. Cette réaction
induit la production de molécules hème qui, étant toxique pour le parasite, seront
rapidement cristallisées en HZ. Initialement les pigments d'HZ étaient considérés comme
une substance inerte s'accumulant dans certains organes. Cependant des études récentes ont
démontré que les pigments malariques étaient à l'origine de l'induction d'une réponse
inflammatoire importante. Alors qu'in vitro les modèles utilisés sont souvent des cellules
murines (J774), l'objectif de notre étude était de déterminer l'influence des pigments
malariques sur l'infection au VIH -1 dans les macrophages humains dérivés de monocytes
60
(MDM) provenant de donneurs sains. Nous démontrons que la phagocytose de l'HZ inhibe
significativement l'infection virale dans ces cellules. Cette interruption du cycle viral aurait
lieu à une étape localisée entre la transcription inverse et l'intégration du VIH -1 dans le
génome de la cellule hôte. Des études supplémentaires sont ainsi nécessaires afin de mieux
comprendre les interactions complexes régissant les conséquences fatales de la co-infection
entre le P. falciparum et le VIH -1.
61
2 Article
Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages
less permissive to HIV -1 infection
Juliette Diou l, Sonia Gauthier l
, Mélanie R. Tardifl, Rémi Fromentin l
,
Robert LOdge l, David J. Sullivan Jr.2
, and Michel J. Tremblayl *
1 Centre de Recherche en Infectiologie, Centre Hospitalier de l 'Université Laval, and
Faculté de Médecine, Université Laval, Québec (Québec), Canada
2The Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins
University, Baltimore, Maryland, United States of America
*Corresponding author, mailing address:
Laboratoire d'Immuno-Rétrovirologie Humaine
Centre de Recherche en Infectiologie, RC709
2705 Boul. Laurier, Québec (QC)
Canada, G1V 4G2.
Phone: 1 (418) 654-2705. Fax: 1 (418) 654-2212
Electronic address: Inichel. j .treln.blav(q~crchul.ulaval. ca
Nonstandard abbreviations: hemozoin (HZ), synthetic hemozoin (sHZ), hemozoin isolated from Plasmodium falciparum cultures (PfHZ), human monocyte-derived macrophages (MDMs), murine heat-stable antigen (HSA), relative light units (RLU), reverse transcription complex (RTC).
62
Abstract
Very few studies have investigated the pathophysiologic mechanisms responsible for
what seems to be a synergistic interaction between Plasmodium falciparum (P. falciparum) ,
the causative agent of malaria, and HIV -1 in dually infected patients. An in-depth analysis
of potential interactions between P. falciparum and HIV -1 in primary human target cells is
also lacking. It has been shown that Plasmodium parasites detoxify heme mole cule s, which
are generated by hemoglobin degradation, into a pigment called hemozoin (HZ). Although
it was initially thought that HZ acts as an inert waste byproduct, recent research has
demonstrated that the malaria pigment modulates significantly the immune system.
Therefore, the primary objective of this study was to determine whether exposure of
primary human monocyte-derived macrophages (MDMs) to the malaria pigment influences
the process of HIV -1 infection. We report here that HIV -1 replication is significantly
diminished in Hz-Ioaded MDMs. The HZ-mediated reduction in virus replication is due to
a block, at a step in the virus life cycle occurring between the completion of full-Iength
reverse transcripts and integration of viral DNA within the host chromosome.
Understanding the pathological mechanisms involved in P. falciparum and HIV-l co
infection is of high importance because of possible therapeutic ramifications.
63
Introduction
Malaria and acquired immune deticiency syndrome (AIDS) are responsible for
major health problems in many regions of the world. By the end of 2007, an estimated 33.2
million people were living with human immunodeticiency virus type-1 (HIV -1), of whom
2.5 million were newly infected (67). Plasmodium falciparum (P. fa lciparum) , the
infectious agent of malaria, is though to be responsible for 1.5-2.7 million deaths and 350-
500 million acute illnesses annually (10, 68). Together, both infectious diseases cause more
than 4 million deaths a year. To a substantial extent P. falciparum and HIV -1 infections are
concentrated in the same geographical regions. The resulting co-infection and interactions
between the two pathogens have major public health implications. Studies based on P.
falciparum and HIV -1 co-infection, whether clinical or laboratory, have been inconclusive
to fully understand the exact mechanisms by which those two microorganisms interact.
HIV -1 is a single-stranded RNA retrovirus which can infect a number of different
target cells, including CD4-expressing macrophages and T-helper lymphocytes. The
infection begins with the interaction of the virus-encoded external glycoprotein 120 (i.e.
gp120) with cell surface CD4 molecule and chemokine co-receptor CCR5 or CXCR4. As
the virus enters the cell, the conversion of the viral genomic RNA into double-stranded
DNA is achieved by the virus-produced reverse transcriptase. Once reverse transcription
has occurred, the pre-integration complex, promoted by HIV -1 DNA Flap formation,
undergoes uncoating at the nuclear pore (5). U ncoating is an essential step in viral
replication cycle and the exact mechanism(s) involved remains controversial to this day.
Thereafter, the viral DNA migrates to and enters the host cell nucleus and becomes
integrated into the cell DNA with the help of the integrase enzyme. The provirus can then
remain latent or be active, generating new virions emerging from the host cell membrane.
At the end of the 20th century, malaria was diagnosed by the presence of a dark
pigment in various organs of patients (26). Later, Brown began a long and continuing
debate by suggesting that those pigments were involved in various physiopathological
aspects of malaria (11). The parasite multiplies by ingesting hemoglobin found in the host's
64
cytosol. This process leads to hemoglobin degradation as a source of amino acids and the
formation of free heme, which is a byproduct known to be highly toxic to the parasite. The
principal and essential first step in detoxification of heme is its incorporation into an
intracellular crystal called malarial pigment or hemozoin (HZ) (56). Results from in vitro
and in vivo studies indicate that, after the parasite ' s schizont rupture in red blood cells,
crude HZ and a variety of attached components of parasite and host origin (e.g. lipids and
phospholipids, lipid derivatives and proteins) are avidly taken up by phagocytes (i.e.
circulating neutrophils and monocytes and resident macrophages) (1, 18). Interestingly, it
has been demonstrated that HZ can persist in macrophages of infected individuals for
several months (43, 56, 57).
Blood-circulating monocytes when in tissues differentiate into macrophages and
dendritic cells in response to danger stimuli (39). Due to their migratory behavior and their
key functions in immune system responses, it is not surprising that cells of the monocyte
macrophage lineage are the preferential targets of both P. falciparum and HIV -1 infections
(2, 42). Like with P. falciparum, macrophages have been described as being important in
HIV -1 infection by contributing to the pathogenesis of the disease throughout the course of
infection (31). Indeed, tissue macrophages can be infected with HIV -1 under both in vitro
and in vivo conditions. F ollowing infection with HIV -1, macrophages are resistant to the
virus-mediated cytopathic effects and serve throughout the course of infection as long-term
stable viral reservoirs capable of disseminating the virus to tissues.
Sorne of the diseases seen in the setting of P. falciparum and HIV -1 co-infection
have been well described in a recent review paper (59). Although it is now appreciated that
malaria and HIV -1 are causing bidirectional and synergistic infections, there is still a
paucity of data with regard to the mechanism(s) by which each pathogen impacts the other.
Therefore, given the overlapping geographic distribution of both diseases and the urgent
need for basic research in this area, the aims of this study were articulated as follow: (1)
investigating whether exposure to the purified malaria pigment HZ influences HIV-1
replication in primary human macrophages and, if so, (2) understanding the mechanism(s)
by which HZ can modulate virus infection.
65
Materials and methods
Antibodies. The anti-HIV-1 p24 hybridomas 31-90-25 and 183-H12-5C were obtained from
the American Type Culture Collection (Manassas, VA) and NIH AIDS Repository Reagent
Pro gram (Germantown, MD). Antibodies were purified by using MAbTrap protein affinity
columns according to the manufacturer's instructions (Pharmacia Technology AB, Uppsala,
Sweden). Alexa Fluor® 488 phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR) is a high-affmity
probe for F-actin conjugated with green-fluorescent Alexa Fluor® 488 dye. The Vybrant®
DiD cell-Iabeling solution (Molecular Probes) is a dye delivery solution that can be added
directly to normal culture media to uniformly label suspended or attached culture cells for
use in cell-cell fusion, cellular adhesion and migration applications. The rat M1/69
monoclonal antibody reacts with the mouse CD24 molecule (BD Pharmingen, Mississauga,
ON), also known as Heat Stable Antigen (HSA). This antibody was used in combination
with Alexa Fluor® 555 goat anti-rat IgG (Molecular Probes).
Cel/s. Human embryonic kidney 293T cells were obtained from the ATCC and cultured in
Dulbecco' s modified Eagle's medium supplemented with 10% foetal bovine serum.
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors were isolated by Ficoll
Hypaque gradient and plated in 75 cm2 flasks (lx107 cells/mL) for 2 hours in order to
separate, by adherence to plastic, monocytes from the other non-adherent cells. After
several washes with endotoxin-free phosphate-buffered saline (PBS) (Sigma-Aldrich,
Oakville, ON), monocytes were cultured in complete RPMI -1640 medium supplemented
with 5% heat-inactivated autologous serum in the presence of M-CSF (100 ng/mL) for a
minimum of six days. Finally, MDMs were recovered by scraping with a soft cell scraper
following incubation with Accutase and plated in 48-well plates at a final concentration of
5x104 cells per well in complete RPMI-1640 medium supplemented with 5% autologous
serum. Flow cytometry analyses revealed that the studied MDMs preparations were
constituted mostly of CD 14+ cells (i.e. 2:: 99 %) and very few contaminating CD3+ T cells
(i.e. about 0.1 %) (data not shown).
66
Plasmids. The full-Iength R5-tropic infectious molecular clone of HIV -1 pNL4-3Balenv
was generated by replacing the X4-tropic NL4-3 env gene with Bal strain (kindly provided
by R. Pomerantz, Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA) (21). The NL4-
3Luc + Env-R+ vector produces envelope-deficient HIV -1 particles coding for the luciferase
reporter gene. Single-cycle reporter viruses were pseudotyped with JR-FL and VSV-G
envelope leading to NL4-3Luc+Env-R+/JR-FL and NL4-3Luc+Env-R+NSV-G virus,
respectively. The R5-tropic envelope-encoding JR-FLenv vector was kindly supplied by N.
R. Landau (The Salk Institute for Biological Studies, San Diego, CA), whereas pHCMV-G
was obtained from the AIDS Repository Reagent Program. The latter molecular construct
codes for the broad host-range vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G (VSV -G)
and is placed under the control of the human cytomegalovirus promoter. The pNLHSA
IRES molecular construct was obtained by replacing the eGFP gene in the NLENG1-IRES
vector (NL4-3 backbone) (36) with the coding sequence for mouse HSA (7). Furthermore,
the Bal envelope from the pNL4.3Balenv plasmid was inserted in the pNLHSA-IRES to
produce fully infectious R5-using virus coding for cell surface murine HSA (a vector called
NL4-3Bal-HSA).
sHZ preparation. Production of sHZ was achieved uSlng a previously described
methodology with slight modifications (29). Briefly, 90 mg of hemin chloride (Sigma
Aldrich) was solubilized in DMSO (crystallization solvent) and added to a 4 M acetate
solution at pH 5.0. The suspension was stirred with a magnet for 6 hours at 65°C. After
adding a volume of 10 % SDS, the suspension was centrifuged at 12,500 g for 25 minutes.
The pellet was then sonicated twice at the lowest setting in a solution made of 100 mM
sodium bicarbonate (pH 9.0) and 0.5% SDS and centrifuged again. The pellet was then
washed three times in SDS 2%, at least five times in sterile H20 and once in endotoxin-free
PBS to eliminate residual SDS. The final pellet was resuspended in endotoxin-free PBS and
aliquoted to obtain a solution of 652 f.lg/ml sHZ. Natural HZ directly isolated from P.
falciparum cultures (Pfl-IZ) was prepared using an established technique of seriaI washes in
SDS, protease K digestion, 6 M urea washes and further SDS and water washes
67
HZ quantitation. Total heme content of HZ was determined as described by Sullivan and
co-workers (62) Parasite HZ or crystallized he me was incubated for 1 hour in 2% SDS /20
mM NaOH to solublize crystal into monomeric heme, which has a molar extinction
coefficient of 1 x 105 at 400 nm.
Cel! viability assay. MDMs (5x104 cells) were first treated with different concentrations of
sHZ for 24 hours and next incubated or not with NL4-3Balenv for 16 days at 37°C. Cells
were then washed once with PBS and resuspended in fresh RPMI 5 % autologous serum
where a MTS solution was added according to manufacturer protocol (ThermoFisher
Scientific, catalogue number PRG5421). After 45 minutes at 37°C, absorbance of the
formazan product was measured at 490 nm from the assay plate and was directly
proportional to the number of living cells in culture.
Virus production. Viruses were produced by the calcium phosphate co-precipitation method
in 293T cells as described previously (22). Briefly, 293T cells were transfected with pNL4-
3Balenv or NL4-3Bal-HSA to produce fully infectious R5-tropic HIV -1 particles. In
addition, 293T cells were co-transfected with pNL4-3Luc+Env-R+ and pJR-FLenv or
pHCMV -G to obtain pseudotyped HIV -1-based reporter viruses. Virus preparations were
normalized for virion content by using an in-house enzymatic assay specific for the major
viral p24 protein. In this test, 183-H12-5C and 31-90-25 are used in combination to
quantify p24 levels (9). AIso, infectivity of virions produced here was verified by testing
virus preparation on an indicator cellline (TZM-bl). This cellline is a genetically modified
HeLa cell line expressing large amounts of cell-surface CD4, CCR5 and CXCR4 (61).
These cells carry separate integrated copies of the luciferase and ~-galactosidase genes
under the control of the HIV -1 promoter and are highly sensitive to infection with different
HIV -1 variants. Virus preparations that did not allow sufficient reporter gene activity were
discarded.
Measurements of HSA-expressing cel!s, luciferase activity and p24 content. Following
infection of MDMs with NL4-3Bal-HSA virus, the percentage of HSA-expressing cells
was estimated by flow cytometry. In brief, cells were stained either with an isotype-
68
matched irrelevant control antibody (i.e. IgG 1) or M1/69 followed by an Alexa Fluor® 555
goat anti-rat IgG antibody, washed and fixed with paraformaldehyde. Further on, aIl cells
were resuspended in a solution of PBS and measurements were made with an Epics® XL
F ACS (Beckman Coulter; Fullerton, CA) (excitation, 490 nm; emission, 525 nm). Single
stained cells were also used as controls for compensation adjustments. For MDMs infected
with luciferase-encoding virus, reporter gene activity was monitored in cell lysates as
previously described (52). Replication of NL4-3Balenv virus was assessed by quantifying
the accumulation of p24 protein in cell-free supematant recovered from infected MDMs
and loaded on an ELISA plate to perform our in house sensitive double-antibody sandwich
ELISA test (9).
Live cel! microscopy. Images illustrated in Fig. 1 were obtained using time lapse imaging,
performed on a W A VE/FX spinning disk confocal microscope (Quorum Technologies,
Guelph, ON) equipped with a cell culture incubation chamber, a 60X glycerol objective and
using the appropriate lasers and emission filters for fluorescent sources or white light for
differential interference contrast. Images were processed using V olocity Software
(Improvision, Waltham, MA). Briefly, MDMs were plated in an eight chamber Lab-Tek™
slide (lx105 cells per weIl). Prior to cell culture incubation in the spinning disk, cells were
treated with the DiD cell-Iabeling solution (1 :500 dilution) and left in the chamber for 2
hours to stabilized CO2 and temperature levels. Later, sHZ (10 J.lg/ml) was added directly
onto the cells. Recording was made during 24 hours. Digital images were processed with
ImageJ (version1.36b) and Velocity (version 4.2.1, Improvision). All the images were
taken under similar experimental conditions (i.e. exposure time, 60 X magnification and
intensification) .
Confocal microscopy. MDMs were seeded on coverslips, exposed to sHZ for 24 hours and
infected with NL4.3Bal-HSA virus for 7 days. The cells were then fixed with 2%
paraformaldehyde and permeabilized using 0.1 % Triton X-100. Nonspecific binding was
blocked with 1% bovine serum albumin, 20% goat serum and 10% human serum in PBS.
Cells were stained for actin cytoskeleton with Alexa Fluor 488® phalloidin and virus
infected cells were revealed with the rat anti-HSA monoclonal antibody used in
69
combination with Alexa fluor 555®-conjugated anti-rat. After several washes, slides were
mounted in SlowFade medium (Molecular Probes, Eugene, OR). Stained cells were
visualized by confocal laser scanning microscopy (Fluoview FV300; Olympus, Melville,
NY). Digital images were processed with Velocity (version 4.2.1, Improvision). All the
images were taken under similar experimental conditions (i.e. exposure time, 60 X
magnification and intensification).
Kinetics of HIV-l infection. MDMs were infected with a fixed amount of virus (i.e. 5 ng of
p24 per 5x104 cells). In the case of infection with HIV -1 pseudotypes, viruses were left in
the medium throughout the experiment while during infection with fully competent HIV-1
particles, half of the supematant was collected and fresh medium was added every 3 days.
In most studies, cells were treated with different concentrations of sHZ at 24 hours before
infection. Conceming post-infection assay, MDMs were firstly infected with HIV-1 and
then treated with sHZ at 0, 4, 24, 48, or 72 hours.
Virus entry assay. MDMs (5x104 cells) were first treated with different concentrations of
sHZ for 24 hours and next incubated either with NL4-3Balenv or NL4-3Luc+Env-R+/JR-FL
virus (5 ng ofp24) for 60 min at 37°C. Cells were then washed once with PBS, treated with
trypsin for 5 min at 37°C to remove all unintemalized virions, washed three times and then
immediately lysed in ice-cold lysis buffer (20 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM sodium
chloride, and 0.50/0 Triton X-100). Finally, the p24 contents were evaluated by ELISA.
Real-time peRo For detection and quantification of full-Iength reverse transcripts and
integrated viral DNA copies, genomic DNA from a total of 1x106 MDMs either left
unexposed or treated for 24 hours with Hz (10 J.lg/ml) and infected for up to 48 hours with
different virus preparations (i.e. NL4-3Balenv, NL4-3Bal-HSA, or NL4-3Luc+Env-R+/JR
FL) was extracted using the DNeasy Blood & Tissue Kit from QIAGEN (Mississauga,
ON).
Quantification of fulliength reverse transcripts was achieved by subjecting 25 ng of
DNA to a real-time PCR test in 25 J.lL reaction containing 2 X TaqMan Universal PCR
Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1 J.lM of the HIV-1-specific sense
primer M667, 1 J.lM of the HIV-1-specific antisense primer M661, and 0.3 J.lM of the
70
TaqMan probe HIV -5' -carboxyfluorescein (Biosearch Technologies, Novato, CA) (63).
HIV -1 standards consisted of 25 ng of DNA from uninfected cells.
For monitoring integrated viral DNA copies, DNA was quantified and subjected to a
combined Alu-HIV-l PCR and real-time PCR as described by Suzuki and co-workers (64).
Briefly, genomic DNA (100 ng) from MDMs either left untreated or treated with sHZ (5
and 1 ° Jlg/ml) and infected for 48 hours with different HIV -1 stocks (i.e. NL4-3Balenv,
NL4-3Bal-HSA, or NL4-3Luc+Env-R+/JR-FL) was first amplified with an Alu-sequence
specific sense primer (65) and HIV -1-specific antisense primer (i.e. M661). N ext, 5 JlL of
25-fold diluted PCR products were subjected to a real-time PCR assay in 25 JlL reaction
containing 2 X TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 2 JlM of the
HIV-l-specific sense primer M667, 2 JlM of the HIV-1-specific antisense primer AA55,
and 0.3 JlM of the TaqMan probe HIV-5'-carboxyfluorescein (Biosearch Technologies)
(64). The cycling conditions used for the Applied Biosystems 7500 sequence detection
system included a hot start (50°C for 2 min and 95°C for 10 min), followed by 40 cycles of
denaturation (95°C for 1 min) and extension (63 oC for 1 min) with end point acquisition.
NL4-3Balenv DNA was used for the standard curve (i.e. from 469 ta 30,000 copies). AlI
HIV -1 standards contained 1 ng of DNA from uninfected cells as carrier.
Statistical analysis . . Results presented are expressed as means ± standard error of the men
(SEM) of at least triplicate samples. All of the experiments were repeated at least two times
and each figure combines the results obtained with all the different donors. Because there
might be sorne donor-to-donor variations, most figures are expressed as percentages of
inhibition calculated with Prism version 3.03. Statistical significance between groups was
deterrnined by analysis of variance. Calculations were made with Prism version 3.03. P
values < 0.05 were considered statistically significant. The statistical significance of the
results was defined by performing a one-way analysis of variance with Dunnett' s post tests
to compare treated and untreated control samples. In sorne cases, t tests analysis were made
on raw data.
71
Results
Chemical synthesis and phagocytosis of malaria pigments
Synthetic HZ, when prepared in vitro under acidic conditions, is spectroscopically
identical and morphologically similar to the native HZ isolated directly from P. falciparum
cultures (64). Moreover, both synthetic and native HZ undergo the same process when
intemalized by phagocytes (49, 51, 53). Consequently, most of our experiments were
performed with synthetic HZ. Synthetic HZ (sHZ) was chemically produced in our
laboratory as described in Materials and Methods. The quality of our newly produced sHZ
was authenticated by measurement of nitric oxide levels following a brief exposure of the
murine macrophage cell line J774 to sHZ as described previously (8, 29). Our sHZ
preparations were found to be biologically active (data not shown).
The first set of experiments was aimed to evaluate the ability of primary human
monocyte-derived macrophages (MDMs) to engulf sHZ. To this end, MDMs were exposed
to sHZ and phagocytosis of the malaria pigment was monitored during 24 hours using a
spinning disk confocal microscope. Acquisition was saved every four minutes and
representative pictures (i.e. time-range from 0 to r-..J 3 h) were chosen. As shown in Fig. 1,
malaria pigments were phagocytosed efficiently by MD Ms as a result of what seems to be
filopodia extension (34). Phagocytosis was not only observed during the chosen time-range
but also during the entire recording. For that reason, treatment of MDMs with sHZ was
made 24 hours prior HIV -1 infection, unless otherwise specified. Furthermore, a single cell
can phagocyte several crystals of malaria pigments, but the number of phagosomes
containing sHZ was restricted (Le. a maximum of 1 to 3 per individual cell).
sHZ inhibits HIV-l replication in MDMs in a dose-dependant manner without
affecting cell viability regardless of the viral preparations.
Next, we utilized sHZ to measure its putative impact on HIV-1 infection in MDMs
(Fig. 2A). First, MDMs were initially treated for 24 hours with different concentrations of
sHZ (ranging from 0.1 to 25 f.lg/ml) and infected with fully infectious R5-tropic virus (i.e.
NL4-3Balenv) for 16 days. Results reveal that as soon as 3 days post infection (dpi), sHZ
72
concentrations of 5, 10 and 25 f..lg/ml significantly inhibit HIV -1 infection (4.1 ± 0.2 SEM,
2.3 ± 0.2 SEM and 0,7 ± 0,04 SEM, respectively) when compared to untreated infected
cells (Ctrl, 8.0 ± 0,6 SEM). Tendency repeats itself at 6 dpi (8.4 ± 0.3, 3.7 ± 1.0 and 0.2 ±
0.2 compared to 18.5 ± 1.6 SEM for control), 9 dpi (14.3 ± 0.7, 6.0 ± 0.9 and 0.7 ± 0.1
compared to 36.0 ± 4.0 SEM for control), 12 dpi (15.4 ± 3.2, 7.1 ± 1.5 and 0.9 ± 0.2
compared to 37.1 ± 3.4 SEM for control) and 16 dpi (19.2 ± 3.5,8.6 ± 0.9 and 1.5 ± 0.1
compared to 40.9 ± 2.4 SEM for control). Importantly, cell viability was not affected by the
chosen concentrations of sHZ as monitored by the fluorescent cytotoxic MTS assay (Fig
2B) and annexin V /7 AA -D test (data not shown).
Cells were then infected with four different R5-tropic HIV -1 virus preparations, i.e.
fully infectious NL4-3Balenv and NL4-3Bal-HSA as well as single-cycle reporter virus
(NL4-3Luc+Env-Rl pseudotyped either with JR-FL envelope (NL4-3Luc+Env-R+/JR-FL) or
single-cycle HIV -1 reporter virus pseudotyped with vesicular stomatitis virus G protein
(VSV-G) envelope (NL4-3Luc+Env-R+NSV-G). Unlike most of the previous reporter
constructs, the NL4-3 Bal-HSA molecular construct will lead to the production of fully
competent viruses with no deletions in env, vpr, or nef Moreover, NL4-3Bal-HSA virus
codes for a cell surface reporter molecule, namely the murine heat-stable antigen (HSA)
CD24 (7). Virus infection was estimated at 6 days post-infection for all virus stocks tested
either be measuring the p24 content, luciferase activity, or percentage of HSA-expressing
cells. Results from virus infection experiments revealed that HIV -1 infection of MDMs
with NL4-3Balenv was inhibited in a dose-dependent fashion by sHZ (e.g. percentages of
inhibition of21 ± 4.1 at 0.1 ~g/ml, 29 ± 5.2 at 1 ~g/m1 and 46 ± 4.6 at 10 ~g/ml) (Fig. 3A).
Infection of MDMs in the absence of sHZ led to a virus production of 115 ± 24.5 ng/ml of
p24. Infection with HIV-1 reporter virus pseudotyped with JR-FL envelope was also
reduced in a dose-dependent manner by sHZ (e.g. percentages of inhibition of 26 ± 2.7 at
0.1 ~g/ml, 45 ± 5.8 at 1 ~g/ml and 85±7.1 at 10 ~g/ml) (Fig. 3B). Luciferase activity
detected in untreated control cells was equal to 64 ± Il.1 relative light units (RL U). Similar
observations were made when we used reporter virus that can enter target cells through
endocytosis and independently of CD4 and chemokine coreceptor (i.e. NL4-3Luc+Env
R+NSV-G virus) (Fig. 3C). However, as expected~ reporter gene activity detected in
73
untreated and treated MDMs was more important than when infection was performed with
JR-FL pseudotypes (e.g. 2,310 ± 1,557 RLU in untreated control cells). Again, a
comparable sHZ-mediated reduction in virus production (about 40% at 25 Jlg/ml) was seen
when MDMs were inoculated with fully competent HIV -1 particles that can express, in
addition to all virus proteins, the murine cell surface molecule HSA (Fig. 3D) (e.g.
percentages of HSA-expressing cells were equal to 7.2 ± 1.3 in untreated control cells).
The physiological significance of our findings was addressed by comparing side-by
side our sHZ preparation with natural HZ directly isolated from P. falciparum cultures
(PtHZ). Details of the procedure for the isolation of natural malaria pigments isolation have
already been described previously (55). As illustrated in Fig. 4, infection of MDMs with
single-cycle HIV-1 reporter virus pseudotyped with JR-FL envelope was inhibited at
comparable significant levels in presence of sHZ and PtHZ (i.e. percentages of inhibition of
73 and 78, respectively). Given that isolation of malaria pigments from P. falciparum
cultures is a complex and tedious process, the following series of investigations were
carried out exclusively with sHZ.
sHZ-Ioaded MDMs are sensitive to HIV-l infection
ln view of the results shown above, we wanted to define whether the sHZ
dependent diminution of HIV -1 gene expression is only occurring in cells loaded with
malaria pigments. Accordingly, we performed confocal microscopy analyses using MDMs
pretreated for 24 hours with increasing concentrations of sHZ and then infected with fully
competent HSA-encoding virus. Data from Fig. 5 demonstrated that the physical presence
of sHZ in the cell does not prevent HIV -1 infection and virus gene expression. Indeed,
through the use of classical confocal microscopy (upper panel) and confocal differential
interference contrast microscopy (bottom panel), we were able to monitor at a single-cell
level the frequency of sHZ-Ioaded MDMs and cells productively infected with HIV-1.
Furthermore, at the highest concentration (i.e. 10 and 25 Jlg/ml) more then 80 % of the
general population of MDMs accumulate sHZ in their cytoplasm. Although it is clear that a
single cell can harbor sHZ and allow HIV -1 production, virus gene expression was rarely
seen in MDMs filled with high quantities of sHZ. Indeed, an in-depth analysis of several
74
hundred ceIls indicated that when an estimated 75% of the ceIl' s cytoplasm was fiIled with
sHZ those MDMs where weakly infected or not at aIl (see bottom panel of the figure).
sHZ inhibits an early intracellular event in HIV -1 Iife cycle
In a previously published study aimed at studying HIV -1 dynamics in cells isolated
from HIV -l-infected patients, the duration of the virus replicative cycle in vivo was
evaluated at 1.2 days on average (54). Moreover, the average HIV-1 generation time from
release of a virion until it infects another ceIl and causes the release of a new generation of
viral particles was estimated to be 2.6 days (54). Consequently, to identify which step(s) in
the virus life cycle is affected by the malaria pigment, MDMs were infected with NL4-
3Luc+Env-R+/JR-FL virus and treated at different time points with two different
concentrations of sHZ. When 5 flg/ml of sHZ was added at ° and 4 hours post-infection, a
significant decrease in virus-encoded reporter gene activity was measured (i.e. percentages
of inhibition of 48.2 % and 38.9 %, respectively) (Fig. 6). A similar diminution was seen
when 10 flg/ml of sHZ was added at 0, 4 and 24 hours post-infection (i.e. percentages of
inhibition of 58.3, 45.8 and 38.7, respectively). Moreover, a more significant decrease in
virus gene expression was detected when sHZ was added 24 hours before HIV -1 infection
(i.e. percentages of inhibition of 70.6 with 5 flg/ml and 79.4 with 10 flg/ml). Importantly,
the addition of sHZ at 48 and 72 hours post-infection has no effect on HIV -1 expression,
thus suggesting that malaria pigments are modulating an early event in the HIV -1 life cycle.
N ext, we attempted to identify more precisely how sHZ can limit HIV -1 replication in
MDMs. We evaluated whether ingestion of sHZ could reduce entry of virions within the
studied target ceIls. To this end, MDMs were infected for 1 hour either with fully infectious
NL4-3Balenv or NL4-3Luc+Env-R+/JR-FL virus, trypsinized and extensively washed to
remove unintemalized viral entities. FinaIly, MDMs were lyzed and p24 concentrations
were quantified. No significant changes in virus intemalization were noted when MDMs
were treated with two different concentrations of sHZ before HIV -1 infection (Fig. 7).
Knowing malaria pigments had no impact on HIV-1 entry, we then monitored HIV-
1 reverse transcription by quantifying complete virus reverse transcripts at different time
points (i.e. at 0, 2, 4, 8, 24 and 48 ho urs post-infection) in MDMs pretreated with 1 0 ~g/ml
75
of sHZ. Results obtained by real-time PCR assays indicate that the number of full-length
viral DNA copies is not reduced upon a pretreatment with sHZ (Fig. 8), therefore
suggesting that the reverse transcription process is not a target of malaria pigments. Herne
was used as positive control for RT activity inhibition as mentioned by Staudinger and
collaborators (data not shown) (60).
Thereafter, integrated viral DNA copies were estimated also by real-time PCR in
MDMs pretreated with two different concentrations of sHZ and infected with competent
HIV -1 particles. Regardless to the viral stocks tested (data not shown), HIV -1 integration
was significantly inhibited by a pretreatment with sHZ (Fig. 9). For example, integrated
proviral DNA copies were reduced by 39, 63 and 24% in sHZ-treated MDMs inoculated
with NL4-3Balenv, NL4-3Bal-HSA and NL4-3Luc+Env-R+/JR-FL virus, respectively.
76
Discussion
Little is known about the possible impact of malaria pigments on HIV -1 replication
in human primary cells known to harbor the virus under natural conditions. Indeed, most
studies are clinical and relate to HZ and its influence on mother-to-child transmission of
HIV-l (16, 46, 47). We chose to focus our studies on malaria pigments because the
presence of HZ in monocytes and neutrophils was described as a marker for disease
severity (27). Furthermore, pigmented neutrophils were associated with cerebral malaria
and death in children with severe malaria (38). AIso, changes in the immune system make
women particularly vulnerable to life threatening infections from malaria during pregnancy.
ln addition to the acute effects, malaria causes anemia in children and pregnant women and
increases their vulnerability to other diseases. Repeated bouts of malarial fever in young
children reduces their immunity and interferes with feeding, thus increasing their
vulnerability to other diseases and death (28). Patients infected with P. falciparum will
mount a proinflammatory cytokine response that may, in tum, influence their innate
susceptibility to malaria infection, malaria-related morbidity, or death from malaria. Lastly,
because of the morphological changes occurring in host cells after HZ phagocytosis,
several studies have shown significant functional impairments in human cells caused by the
malaria pigment (e.g. a defective generation of the oxidative burst, ability to repeat
phagocytosis and protein kinase C activity) (43, 56, 57). As a result, the more important
HIV -1 load observed in Plasmodium-infected individuals (35) may be the result of the
incapacity of the immune system to appropriately control other microbial infections
possibly due to HZ-mediated disorders of innate immune cells. As so, we were interested in
studying the impact of malaria pigments on HIV -1 life cycle in human primary MDMs.
Because the majority of studies aimed at deciphering the possible HZ-modulated
immune functional deficiencies were using transformed or immortalized cell lines, we
firstly investigated whether co-infection results obtained with those cell lines were
representative of results obtained with primary human cells such as MDMs. Preliminary
studies showed an increase of HIV -1 infection in the human acute monocytic leukemia cell
line, THP-l, upon a pretreatment with sHZ (data nat shawn). Surprisingly, when similar
77
studies were conducted with MDMs, sHZ was found to exert an opposite effect on H1V-1
replication. The explanation for this discrepancy is currently unknown and deserves to be
more fully addressed. N evertheless, primary human cells constitute a unique tool for
researchers and should, when possible, be preferred over transformed or immortalized cell
lines because they are more representative of the situation prevailing under in vivo
conditions.
Here we confirm that MDMs rapidly ingest large amounts of sHZ and demonstrate
for the first time that the malaria pigment causes a reduction in HIV -1 replication in this
cell type. 1t has been demonstrated that malaria pigment can induce a severe impairment of
phagocytic cells functions. Therefore, we used a red-fluorescent dye to stain acidic
compartments in live cells in order to appreciate interactions between sHZ and MDMs in
an attempt to shed light on how sHZ can modulate virus replication. At a given point, fully
functional cellular lysosomal compartments were interacting with sHZ-fed phagosomes but
were incapable to induce its degradation (data not shown). Taken into account that last
result and the possibility that the only presence of sHZ could preclude the uptake of HIV -1 ,
we tested the ability of MDMs to phagocyte GFP-labeled zymosan particles. Again, no
significant differences were noticed as compared to the untreated control cells (data not
shown).
The entry processs is the first critical step in the H1V -1 replicative cycle. 1t has been
reported that HIV -1 is entering macrophages by endocytosis and viral receptor-mediated
fusion (40, 69). Because of the massive uptake of sHZ in MDMs, we hypothesized that
viral entry could be modulated in those cells explaining why the infection process is
reduced. Unexpectedly, similar amount of viral particles was detected in both untreated and
sHZ-loaded MDMs. With our approach we cannot discriminate between endocytosis
mediated versus fusion-mediated viral gateway. However, it is well known that endocytosis
is mainly a dead-end for HIV-1 (19). Fusion at the plasma membrane remains the most
efficient way used by H1V -1 to productively infect a given cell type. This process requires
dynamic organization and high expression of CD4 and appropriate chemokine co-receptors
(e.g. CCR5 or CXCR4). No variation in CD4 and CCRS expression were detected in sHZ-
78
treated MDMs compared to untreated control cells (data not shown). Altogether, these data
suggest that the reduction of viral infection observed in sHZ-Ioaded MDMs is not caused
by a decrease in HIV -1 entry.
F ollowing entry in the cytosol, incoming subviral complexes interact with the actin
cytoskeleton and the microtubule network to reach the nuclear pore (3, 15, 41). Any factor
interfering with the actin and/or the microtubule network may affect the transit of the
reverse transcription complex (RTC) to the nucleus and consequently the completion of the
virus replicative cycle. The impact of sHZ engulfment on actin and microtubule networks
remains unknown. However, based on data reported by Moller and colleagues who showed
that uptake of indigestible particles induces cellular stiffness, impairs phagocytic activity
and delays intracellular transport in macrophages (45), it can be proposed that sHZ can
interfere with the integrity of the cytoskeletal network. Although we cannot exclude that
the intracellular transport is affected by the ingestion of sHZ, phagocytosis assays with
opsonized-zymosan have clearly revealed that the ability of sHZ-fed MDMs to phagocyte
these particles seems unaffected (data not shown). These results indicate that the
cytoskeletal network remain functional in sHZ-Ioaded MDMs and can thus be used by
HIV -1 to move toward the nucleus.
It is now accepted that reverse transcription (RT) is initiated within an integral
capsid core during the transit toward the nucleus (5) and completed at the nuclear pore.
Interestingly, it has been established that agents affecting cytoskeleton crystallization alter
as weIl the RT process and viral infection (12). Accordingly, we investigated whether the
ability ofHIV-1 to complete RT was affected in sHZ-Ioaded MDMs compared to untreated
control cells. Results from a sensitive RT -PCR test that can detect full-iength reverse
transcripts suggested that this event is not modulated by sHZ. However, when we have
quantified the level of the integrated proviral DNA copies, we found that sHZ-Ioaded
MDMs contain less proviral DNA inserted within the host chromosome than in untreated
control cells. Therefore, sHZ is most likely impairing a step taking place between
completion of the RT process and integration of viral genome into the host DNA. Events
occurring between these two different steps include the formation of viral DNA Flap (4, 24)
79
and a three-stranded DNA structure acting as a cis-determinant of the HIV -1 genome
nuclear import, which promotes uncoating at the nuclear pore and rapid translocation
within the nucleus (5). It is possible that the stress generated by the engulfment of sHZ
renders MDMs more refractory to virus infection by promoting degradation of the RTC
and/or disturbing the uncoating and the nuclear import. It has been well recognized that
sorne stressors exert a general control of the nuclear trafficking by affecting various
components of the transport machinery (32). For example, heat shock and oxidative stress
trigger nuclear accumulation of the importin-a in the nuclei of growing cells (32, 33, 44).
Interestingly, it has been demonstrated that the HIV -1 RTC is translocated in the nucleus
through a mechanism relying on the viral protein Vpr and the cellular importin-a in human
macrophages (30, 48, 66). Considering that ingestion of malaria pigments induces oxidative
stress in macrophages (58, 65), we hypothesized that it could explain why a treatment of
MDMs with sHZ leads to a decrease in HIV-1 integration. Indeed, it is possible that the
sHZ-mediated induction of oxidative stress causes a nuclear import block by anchoring the
importin-a in the nucleus, a phenomenon preventing translocation of the HIV -1 genome
and its subsequent integration in the host DNA genome. On the other hand, preliminary
results have revealed that sHZ-Ioaded MDMs contain less intracellular ATP than untreated
control cells (data not shown). Knowing that translocation of the HIV -1 pre-integration
complex to the nucleus is an active transport process which requires A TP (13, 14) and that
HIV -1 integrase (IN) was shown to bind A TP (37), it can be postulated that ingestion of
malaria pigments could inhibit HIV-1 infection also via an ATP-dependent pathway.
Furthermore, nuclear accumulation of HIV -1 IN does not result from passive diffusion but
rather from an active transport that occurs through the nuclear pore complex (NPC) that
may require ATP either to interact with the mediators of its import or for translocation (20).
A more recent contradictory study also suggest that IN nuclear import appears to be
dependent on the importin-a/p heterodimer rather then ATP (25). Thus sHZ-mediated
induction of oxidative stress could also impair nuclear import of IN. Experiments are
currently underway to address these scenarios.
Our observations that HIV -1 replication was reduced to the same extent when using
similar concentrations of synthetic (i.e. sHZ) and native HZ (i.e. PfHZ) provide physiologie
80
significance to this work. The clinical relevance of our results is further supported by the
previous demonstration that, during infection, the amount of HZ following erythrocyte
rupture can reach a concentration as high as 100 Jlg/ml (62). Importantly, our findings were
made using a maximal concentration of 25 Jlg/ml of sHZ.
Although data from the most recent clinical and epidemiological studies suggest that
malaria and HIV -1 infections act synergistically to increase parasite and viral load, we
demonstrate here that the malaria-derived HZ molecule displays a negative impact on HIV-
1 replication in a cell type recognized as a major cellular reservoir for this retrovirus. It
seems contradictory that a major constituent of P. falciparum would reduce virus gene
expression when parasite proteins have been demonstrated to increase viral replication (6,
23). Our data are also opposite to that of the Perkins group who found that heme crystals
increased viral load in simian monocytes first stimulated with TNF-u. (50). The reason(s)
for such a discrepancy probably stems from the fact that P. falciparum and HIV-1
interactions are multifaceted and complexe Moreover, emphasis should be made on the fact
that the CUITent work was centered on a single target of HIV -1 and ignored other cellular
compartments known to play a key role in HIV -1 pathogenesis (e.g. CD4+ T cells and
dendritic cells). P. falciparum displays a very complex life cycle and can causes dangerous
complications in infected patients. Thus, understanding the relationships between P.
falciparum and HIV -1 remain an important task.
ln conclusion, we demonstrate that infection of primary human macrophages with
four different HIV -1 constructs is significantly reduced by sHZ. This diminution is
associated with a restriction at the level of integration of HIV -1 genome within host
chromosome. Thus, it can be postulated that remnant HZ present in the reticuloendothelial
cells after cure of malaria diseases or with chronic infection can diminish HIV -1 replication
in tissue resident macrophages. Given that HIV -1 can reside within different cellular
reservoirs, additional and more comprehensive basic studies are needed to fully understand
the consequences of P. falciparumlHIV -1 interactions. This is vital to discover promising
drug combinations and promote new prevention strategies to treat worldwide co-infected
individuals.
81
Acknowledgments
The authors appreciate the excellent technical contribution of Odette Simard,
Caroline Côté, Renaud Tremblay and Marc-André Roy. We express our gratitude to
Caroline Gilbert for critical and constructive comments for this study.
ID. holds a Doctoral Award from the CIHR HIV/AIDS research program and
M.J.T. holds the Canada Research Chair in Human Immuno-Retrovirology (Tier 1 level).
The authors have no conflicting financial interests.
82
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92
Figure legends
Figure 1. Phagocytosis of sHZ by MDMs. Cells were first plated at a concentration of
1 x 105 cells per well and treated next with DiD cell-Iabelling solution. Thereafter, MDMs
were exposed to sHZ (10 f.lg/ml). Images were obtained using time lapse imaging,
performed on a W A VEIFX spinning disk confocal microscope. Similar experimental
conditions were maintained for all images throughout a 24 hours recording (Le. exposure
time every 4 minutes, 60 X magnification and intensification levels). Representative images
of sHZ phagocytosis by MDMs selected here illustrate the fluorescence imaging of stained
cells (A) and the differential interference contrast images of unstained cells (B). Digital
Images were processed with ImageJ (version1.36b) and Velocity (version 4.2.1,
Improvision).
Figure 2. sHZ inhibits HIV-l replication in MDMs in a dose-dependant manner
without affecting cell viability. MDMs were either left untreated (ctrl) or treated with
increasing concentrations of sHZ (0.1 to 25 f.lg/ml) for 24 hours. Next, cells were infected
for 16 days with fully infectious virus (Le. NL4-3Balenv) (A). The extent of virus infection
was measured by estimating p24 contents every three days. At 16 dpi, cell viability was
measured using MTS assay as described in materials and methods (B). In sorne instance,
MDMs were not infected and utilized as a positive control for cell viability (called mock).
Results are schematic representation of data from triplicate samples ± SEM of three
independent experiments. Statistical analysis was performed on the results from all
experiments. Asterisks denote statistically significant data (* *, P < 0.01).
Figure 3. sHZ inhibits HIV-l replication in MDMs regardless of virus preparation.
MDMs were either left untreated (ctrl) or treated with increasing concentrations of sHZ (0.1
to 25 f.lg/ml) for 24 hours. Next, cells were infected for 6 days with fully infectious virus
(Le. NL4-3Balenv) (A), single-cycle HIV-1 reporter virus pseudotyped either with JR-FL
(B) or VSV -G envelope (C) and fully competent virus coding for the cell surface reporter
murine HSA molecule (D). The extent of virus infection was measured by estimating p24
contents (A), luciferase activity (B and C), or percentage of HSA-positive cells by flow
93
cytometry (D). Data shown correspond to percentages of inhibition of HIV-1 infection.
Those results were calculated by comparing MDMs which have been treated with sHZ and
later infected versus untreated MDMs only infected with HIV -1. Results are mean ± SEM
of data from triplicate samples of several independent experiments (i.e. 2, 5, 6 and 4
respectively to the illustrated order). Statistical analysis was performed on the results from
aIl experiments. Asterisks denote statistically significant data (* , P < 0.05; **, P < 0.01).
Figure 4. HIV-l replication is similarly reduced by sHZ and PfHZ. MDMs were either
left untreated (ctrl) or treated with sHZ and PtHZ (10 f.1g/ml) for 24 hours. Thereafter, ceUs
were infected for 6 days with single-cycle HIV -1 reporter virus pseudotyped with JR -FL
envelope. FinaUy, luciferase activity was measured using a luminometer and converted in
percentages of inhibition as described in Fig. 2. Statistical analysis was performed on the
results. Asterisks denote statisticaUy significant data (**, P < 0.01).
Figure 5. HIV-l replication can occur in sHZ-loaded MDMs. Cells were either left
untreated (0) or treated with increasing concentrations of sHZ (1 to 25 f.1g/ml) for 24 hours.
Thereafter, ceUs were infected for 6 days with fuUy infectious reporter virus coding for
murine HSA. FinaIly, cells were mounted and processed for confocal microscopy analysis.
MDMs were stained with Alexa Fluor 488-labeUed phalloidin to reveal the F-actin
cytoskeleton (red) and a conjugated antibody specific for HSA to reveal HIV -l-infected
cells (green). Red arrows on the bottom panel illustrate example of ceUs with at least 75%
of sHZ accumulation in their cytoplasm. Micrographs are representative of 3 independent
donors.
Figure 6. sHZ inhibits an early event in HIV-l Iife cycle. MDMs were infected for 6
days with single-cycle HIV -1 reporter virus pseudotyped with JR-FL envelope. Next, ceUs
were either left untreated (ctrl) or treated with the indicated concentrations of sHZ at
different time points after (i.e. 0, 4, 24, 48 and 72 hours) and 24 hours before HIV-1
infection (PRE). Luciferase activity was measured using a luminometer. Virus infection is
illustrated in percentages of inhibition as described in Fig. 2. Results are mean ± SEM of
data from triplicate samples of four independent experiments. Statistical analysis was
94
performed on the results from all experiments. Asterisks denote statistically significant data
(*, P < 0.05; **, P < 0.01).
Figure 7. Virus entry is not affected by sHZ. MDMs were either left untreated (ctrl) or
treated with sHZ (Le. 5 and 10 Ilg/ml) for 24 hours. Next, cells were incubated for 1 hour at
37°C with fully competent NL4-3Balenv (A) and single-cycle HIV-1 reporter virus
pseudotyped with JR-FL envelope (B). The virus-cell mixture was extensively washed and
treated with trypsin (5 min at 37°C), washed again, and finally lysed. The viral content was
measured using the p24 assay. In sorne instance, MDMs were put in contact with HIV-1 for
less than a minute (called mock). Results are mean ± SEM of data from triplicate samples
of five independent experiments. Statistical analysis was performed on th~ results from all
experiments and no significant variations were measured.
Figure 8. sHZ has no impact on HIV-l reverse transcription. MDMs were either left
untreated (ctrl) or treated with 10 Ilg/ml of sHZ for 24 hours. Thereafter, cells were
maintained in absence ofHIV-1 (mock) or infected for the indicated time periods (Le. 0,2,
4, 8, 24 and 48 hours) with fully competent NL4-3Balenv. Finally, for each specifie time
point, genomic DNA was extracted to quantify full-Iength HIV-1 reverse transcripts.
Results are mean ± SEM of data from duplicate samples of three independent experiments
(from A to C). Statistical analysis was performed on the results from all experiments and no
significant variations were measured.
Figure 9. sHZ is affecting viral integration in MDMs. MDMs were either left untreated
(ctrl) or treated with 5 Ilg/ml of sHZ for 24 hours. Next, cells were infected for 48 hours
with fully competent NL4-3Balenv. Genomic DNA was extracted and quantification of
integration events was achieved using a real-time PCR protocol described in Materials and
Methods. Results are mean ± SEM of data from triplicate samples of six independent
experiments. Asterisks denote statistically significant data (* * *, P < 0.001).
95
Figure 1
A
Figure 2
A 50 ----Ctrl
_ • ..,., 0..1
,-. 40 -+- 1
~ ---- 5 0'1 30 S ~),- 10
~ 20 ' ~w{~- 25 a..
B
10
0 '" o 3 6 9 12 16
DPI
M>ck Orl 0.1 '1 5 10 25
5HZ (10Jjg/ml:)
96
**
97
Figure 3
A
100
90 c: :S 80 :a 6 70 ** :E .5 ~ 60 ** --0 :5 50 ** ~ ~ ; 40 * .•
~ Ï 30 0> 0 20
Q..
10'
B 0
100 ** ..•
90 .§ 80 * 'Ir: +-" :zs 5 7'0 :ê .5 i 60 (5 ** ~
Ji 50 ...- 40 .S! ~
~ > **' :f 3'0
l '0 2'0
10
0 C
100
90
.~ 80 * 'ft ** iS c 70 :E 0 .** .S ~ 60 0 8, :5 50
* S ~ 40
i :ï: 30 e èS 20 ~ 10
0 0
-IDa
90 ' c .2 80 :s c: 70 ** .~ 0
~ 60 15 ~ 50 ~ ...- 40 ~ :> B :r 30 ~ (5 20 (l) a..
~10
0
0 0.1 1 5 10 25
sHZ (p'g/m l )-
Figure 4
1:00 .
90
BO ·
70
60
50 ·40 ··· 30 .. ··
20
10
** **
O~· ----~----~~----~~----~--
Ctrl sHZ PfHZ
98
99
Figure 5
5HZ (J,lQ/ml)
o 1 5 10 25
Figure 6
lO a
Pre: Oh: 4h:
2.4h: ·48h: 72h:
+
- +
- +
- +
- +
- +
**
+
- +
- +
- +
- +
- +
_5 E3 '10
100
Figure 7
A
03000
E .......... 0> 0-'-' 2000 v ~
B
o L- -----
4000
c- 3000 E ~
~ ~2000
~ Q.
1000
I l\l~itl)f.;î~~1 Moc k t~ -_V_ vv _v_-_-_-_-__ I Ctrl _5 :[ v __ vv_~OO"OO I 1 0
It~it1ti:ffi[1{i~~1 Mock : Ctrl
_ 5 [ _ .. oooo v:110
101
Figure 8
A
It .~
<C Z Cl tG ... :>
B ..........
.... 0 .~
>< ............
i 15. 0 u « ~ t! '>
c
4
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2 '
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4
3
2 0~2
0.1
0 .0
4 · .. ··
2
1
0 "
o 2 4 8 24 Hours post-infection
0 2 4 a. 24 Hours post-infection
o 4 B 24 Hours p;o,st-in'fe,etion
48
48
48
(~j~;~[{ti.%0JI Mock
_ Ctrl
_sHZ
fvlock _ 'Ctrl
'_sHZ,
Mock _ Ctrl
_sHZ
102
103
Figure 9
100 90
c: 0 80 ~ c: :0 0 70 ..t::. ~ CU c: "- 60 '0
Cl <1> +J
50 (]) c::: .'-Cl ~ as 40 ....., :> c::
***
~ :c 30 s.... "-Cl) 0 20 a.
10 0
Ctrl sHZ
104
Chapitre V. La maturation des cellules dendritiques dérivées de monocytes par les pigments malariques augmente le transfert précoce du VIH -1 aux lymphocytes T CD4 +
Ce chapitre fait l'objet d'une publication qui sera prochainement soumise. Par
conséquent, le texte ainsi que les résultats peuvent être sujet à des modifications avant leur
publication.
Le travail de laboratoire et la rédaction de l'article ont été effectués par Juliette Diou.
Mélanie Tardif a participé à la rédaction de l'article.
1 Résumé
Ensemble les infections au P. falciparum et au VIH-1 sont responsables de plus de
quatre millions de mort par an. À notre connaissance il n'existe aucune étude orientée sur
l'influence des pigments malariques sur la dissémination du VIH -1. Ainsi, nous émettons
l 'hypothèse selon laquelle l'HZ pourrait augmenter le transfert viral aux lymphocytes T
CD4 +. Notre étude supporte le postulat voulant que les pigments malariques (HZ) soient
responsables d'une augmentation significative du transfert précoce du VIH-1 aux
lymphocytes T CD4+. Après avoir confirmé que cette augmentation n'était pas une
conséquence de l'infection virale dans ces cellules, nous avons démontré que la présence
d'sHZ avait pour conséquence la diminution du co-récepteur CCR5, effet souvent observé
dans les DC matures. Ainsi, des études de microscopie et de cytométrie de flux ont
démontré que la présence d'sHZ induisait un profil de maturation des cellules dendritiques
(DC) serait similaire à celui induite lors d'un traitement au LPS/IFN-y. Dans un contexte de
co-infection, nos observations suggèrent que l'HZ accroit la capacité du VIH-1 à prendre
avantage de ce mécanisme afin de mieux propager son infection aux lymphocytes T CD4+.
2 Article
Maturation of human monocyte-derived dendritic cells induced by
malaria pigments increases HIV -1 early transfer to CD4+ T cells
Juliette Dioul, Mélanie R. Tardifl and Michel 1. Tremblayl.
105
J Laboratory of Human Immunoretrovirology, Research Center in Infectious Diseases,
CHUL Research Center, Quebec, Quebec, Gl V 4G2 Canada
* Corresponding author, mailing address:
Laboratory of Human Immuno-Retrovirology
Research Center in Infectious Diseases, RC709
CHUL Research Center
2705 Laurier Blvd., Quebec (QC), Canada, G 1 V 4G2
Phone: 1 (418) 654-2705. Fax: 1 (418) 654-2212
Electronic address: Inichel. j. tremblay(~[)crchul. ulava1.ca
106
Abstract
Together, Plasmodium falciparum (P. falciparum) and HIV -1 infections cause more
than four million deaths a year. No study has been published conceming the impact of
malaria pigments (hemozoin or sHZ) on the dissemination of human immunodeficiency
virus type 1 (HIV-1). As so, we propose a premise where malaria pigments present in
human dendritic cells (DCs) could increase HIV -1 transfer to CD4 + T cells. Indeed,
consequences of the persistent presence of sHZ in human DCs demonstrated an increased
capacity of those cells to disseminate HIV -1 to CD4+ T cells. In contrast, we noted that in
the presence of sHZ, DCs were less permissive to HIV -1 infection. This restriction seems
partly due to the down expression of CCRS on DCs in response to sHZ and also by the
induction of DCs maturation as proven by microscopy and F ACS analysis. Therefore,
exposure of DCs to malaria pigment provokes their maturation rende ring them more potent
to trans-infect CD4+ T cells.
107
Introduction
Current understanding of the human immune response to malaria and HIV -1 leads
scientists to believe that both infections could influence the clinical course of the other.
Indeed, miscellaneous types of infections are associated with at least a transient increase in
HIV -1 viral load. Hence, it is logical to expect malaria to do the same and potentially
accelerate HIV -1 disease progression (Whitworth, 2006). In a previous study, it was shown
that HIV viral load levels nearly doubled during co-infection with Plasmodium falciparum
(P. falciparum) , thus increasing viral transmission (Kublin et al., 2005). Indeed, the study
concluded that the increase in HIV -1 viral load when contracting malaria could be
sustained long enough to increase the risk of HIV -1 transmission to other people.
Unfortunately, mechanisms by which the parasite influences the course of HIV -1 infection
remain unclear. Considering that both pathogens cause more than four millions deaths a
year and that they can be present in the same endemic regions, studies attempting to clarify
the complex interplay between them are crucial for the development of therapeutic strategy
in co-infection context (WHO, 2002).
HIV -1 infection is associated with immune hyperactivation that ultimately lead to
systemic immunosuppression, a condition in which the immune system fails to limit the
opportunistic infections. It has been previously reported that this immune activation is in
part mediated by microbial translocation occurring upon mucosal immune dysfunction in
HIV -l-infected individuals (Paiardini et al., 2008). Once entered in the tissues or the
bloodstream, microbial products activate innate immune cells like macrophages and
dendritic cells (DCs), which stimulate CD4+ T lymphocytes. This phenomenon is benefic
for HIV -1 since activated CD4 + T cells are the most permissive targets permitting viral
replication.
Even if cell-free viruses can directly infect DCs, viral transmission through cell-to
cell interactions was described as a better way to get powerful infection (Lederman et al.,
2006). DCs are ones of the most efficient cells transferring viral particles to CD4 + T
lymphocytes. In their immature form, DCs capture HIV -1 in the mucosa and transmit them
108
to surrounding effector CD4 + T cells, which massively replicate HIV -1 (Pope and Haase,
2003). This mode of transfer (i.e. , early transfer) occurs when viruses, bound onto plasma
membrane or located within endosomal compartments in immature DCs (lM-DCs), are
concentrated and transmitted thru the DC-CD4+ T cell synapse. Another round of transfer
(i.e., late transfer) , dependent on productive virus replication in immature DCs, can also
occur involving cell-to-cell interactions between DCs and CD4+ T cells. Although viral
transfer can take place in peripheral tissues and mucosal interfaces, most of the cell
mediated viral transfer takes place in lymphoid organs. Maturation of HlV -1 loaded DCs
triggers their migration toward draining lymph nodes where virions are transferred to CD4+
T cells during the formation of the virological synapse. Mature DCs are less susceptible to
HIV -1 infection but are recognized to increase viral dissemination to CD4+ T cells
(Izquierdo-U seros et al., 2007).
Although, malaria-associated immunosuppression is not very well understood, it has
long been associated with the parasitic production of malaria pigments (Coban et al. , 2002;
Doherty, 2007; Metzger et al., 1995). Malaria pigments, also known as hemozoin (HZ), are
synthesized by the parasite during detoxification of heme in infected red blood cells, and
released in circulation upon cell rupture (Pisciotta and Sullivan, 2008). HZ clumps were
shown to be homogeneously distributed inside the cells without adhering to the extemal
surface of DCs (Skorokhod et al. 2004). Controversial results on the outcome of HZ
phagocytosis by immature DCs have been reported (Millington et al., 2006; Millington et
al. , 2007; Skorokhod et al. , 2005; Skorokhod et al. , 2004; Urban and Todryk, 2006).
Discrepancies have been described to depend on the Plasmodium species, the inoculation
dose of malaria pigment and the type of Des under investigation (Urban and Todryk,
2006). Furthermore, even if Plasmodium and HIV -1 co-infections are a major public health
concern, no publication has studied the impact of malaria pigments on the establishment
and dissemination of human immunodeficiency virus type 1 (HIV -1) infection in targeted
cells. Accordingly, this study investigates whether HZ engulfment by immature DCs can
change their susceptibility to HIV -1 infection and their ability to transfer viral particles to
CD4+ T lymphocytes.
109
Results
In the presence of sHZ, DCs transfer more efficiently HIV -1 to CD4+ T lymphocytes.
As previously mentioned, HIV -1 can be transferred from DCs to CD4+ T cells via a
process involving two distinct phases: an initial transfer phase (i.e., early transfer) and a
second kinetic phase (i.e., late transfer) that is dependent on productive virus infection. We
first monitored the impact of the presence of sHZ in immature DC on both early and late
transfer of HIV -1 toward CD4+ T cells. In sorne conditions, a non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitor, efavirenz (EFV), was added to discriminate which type of transfer
was modulated by the presence of sHZ. Hence, EFV prevents the late transfer without
affecting the early one. Unloaded and sHZ-Ioaded DCs were pretreated or not with the
EFV, infected with NL4.3Balenv for one hour, extensively washed and then co-cultivated
with activated autologous CD4+ T cells. Results presented in Figure 1 show that at the early
stages of co-culture, sHZ-Ioaded DCs transfer viruses in greater amount (,.....2 fold increase)
as compared with the untreated cells. p24 content measured in the supematants after 2 days
of co-culture (2 dpcc) is a pool of newly synthesized virions from DCs and from infected
CD4+ T lymphocytes following viral transfer (early transfer). After 4 dpcc, most of virions
present in the supematants come from HIV -1 infection in CD4+ T cells. Therefore, to study
the impact of stimuli on early transfer, we focused on the first days of co-culture. The right
panel of figure 1 shows a histogram with means ± SEM at 2 dpcc of data from triplicate of
seven independent experiments. T 0 discriminate which transfer is favored in presence of
sHZ, EFV was added in sorne conditions. Results demonstrated that treatment with EFV
decreased viral transfer by 83% in immature DCs confirming that most of viral
transmission cornes from late transfer. However, transfer mediated by sHZ-matured DCs is
not affected by EFV as much as transfer mediated by immature DCs (530/0). These data
indicate that in sHZ-Ioaded DCs, about half of viruses are transferred from early transfer
and halffrom DC infection. Similar trend was obtained with cells matured with LPS/lFN-y,
which is consistent with reported data showing an augmentation of the early transfer but a
decrease of viral infection in those matured cells (Fahrbach et al., 2007; Izquierdo-Useros
et al. , 2007; Sanders et al., 2002) (data not shown). Taken together, these results confirmed
that sHZ present in DCs enhances their ability to transfer HIV -1 to CD4+ T cells and
110
suggest that sHZ-Ioaded DCs are less susceptible to HIV -1 infection as it was already
reported for LPSIIFN-y.
sHZ phagocytosis prevents HIV -1 infection in human DCs.
Next, we wanted to further confirm whether intemalization of sHZ by IM-DCs
influence the outcome of their HIV -1 infection (Fig. 2). First, DCs were initially treated for
48 hours with 10 flg/ml of sHZ. Cells were then infected with a fully infectious R5-tropic
HIV-1 virus preparation (NL4.3Balenv). Supematants were harvested after 3, 6, 9 and 12
days post-infection. As we have previously described, the left panel shows that the peak of
infection in DCs occurs later than the one observed for infected CD4+ T cells (12 dpi
compared to 6 dpi respectively). Data show that until 6 dpi, replication in DCs is very low
(less than 2 ng/ml of p24). However, the amount of viral particles detected in supematants
starts to increase at 9 dpi. The negative impact induced by sHZ on DCs infection starts at 6
dpi. As expected, LPSIIFN-y completely inhibits replication in DCs as it was previously
reported (data not shown). The right panel contains data with means ± SEM at 12 dpi of
data from triplicate of three independent experiments. Results confirm that HIV -1 infection
of DCs was inhibited in a dose-dependent fashion by sHZ. Indeed, at only 5 Jlg/rnl of sHZ
HIV-1 infection was already inhibited at 41 %, at 82 % with 10 Jlg/ml and 87 % with 25
Jlg/ml. Here, infection of unloaded IM-DCs (25 ng/ml ± 4 SEM of p24) is used as the
negative control (Ctrl) for maturation. For the LPS-induced maturation, the inhibition of
HIV -1 infection reaches 0.8 ng/ml ± 0.2 SEM of p24 that represent 97 % of inhibition.
AIso, cell viability was not affected by the chosen concentrations of sHZ as rnonitored by
the fluorescent cytotoxic MTS assay (data not shown).
sHZ induces a down expression of CeRS in human DC.
The mechanisrn involved in the inhibition ofHIV-1 infection in sHZ- and LPS/IFN
y-treated DCs could depend on the expression of the CCR5 coreceptor (Fig.3). Indeed,
CCR5 expression is significantly decreased in LPS/IFN-y- (1.4 % of positive cells
± 0.9 SEM) and sHZ-treated (2.4 % of positive cells ± 0.5 SEM) cells when cornpared to
immature DCs (5.6 % of positive cells ± 1.8 SEM). When CCR5 expression for each
condition considers aIl donors, statistical significance is obtained with LPS/IFN-y. Results
111
are also illustrated in percentage of CCR5 expression compared to control (upper right
panel). In this case, higher statistical differences of CCR5 expression for LPS/IFN-y- and
sHZ-treated DCs is obtained when compared to non-treated-DCs (hypothetical value of
100%) in a donor-dependant manner. Indeed, our results show that, just like LPS/IFN-y
induced maturation (21,5 % ± 7,2 SEM), after sHZ phagocytosis, only 38,8 % ± 13,3 SEM
of DCs express CCR5 when compared to untreated cells (hypothetical value of 100%).
sHZ induces maturation of human De. Since decrease expression of CCR5 is a typical haIlmark of DCs maturation, we
further analyze the shape and the expression of other markers to confirm that sHZ induces
maturation of DCs. In vivo maturation of dendritic cells upon reverse transmigration across
the endothelial barrier was shawn to take place within 48 hours (Randolph et al., 1998).
Taking this into account, after 48 hours of sHZ treatment we did comparative microscopy
and FACS analysis with DCs cultured with LPS/INF-y, which have been shown to induce
complete maturation of immature DCs (Alldawi et al., 2005). Upon microscopic analysis of
iDCs cultured in the presence of sHZ, we observed a phenotype resembling to one observed
with LPS/IFN-y stimulation (Fig 4A). Indeed, sHZ- and LPS/IFN-y-stimulated ceIls are
elongated and stick on the botlom of the weIl, two phenomenon characterizing mature DCs.
To further confirm that DCs expose to sHZ acquire a mature phenotype, we performed
FACS analysis to verify the expression of maturation markers. We chose specific makers
currently used to study DCs maturation such as (1) DC-SIGN, a calcium-dependent pattem
recognition lectins reported to be expressed on DCs (Lai et al., 2006), (2) CD83 which is a
member of the immunoglobulin superfamily expressed primarily by mature dendritic ceIls
(Kuwano et al., 2007) and (3) HLA-DR which as been reported to be up regulated upon
DCs maturation (Obermaier et al., 2003). As shawn for microscopic results, iDCs exposed
to LPS/IFN-y or sHZ for 48 hours induced the expression of specific maturation markers
(Figures 3B to 3D). Indeed, as for LPS/IFN-y-mediated maturation, in-vitro-obtained iDCs
treated with sHZ results in a reduction of DC-SIGN expression (1603 ± 159,622 ± 186 and
617 ± 192 for untreated IM-DCs, LPS/IFN-y and sHZ respectively) and an increase in
CD83 (72 ± 31 ,692 ± 279 and 408 ± 204) and HLA-DR (476 ± 85,1106 ± 441 and 842 ±
428), resulting in a mature population that expresses less DC-SIGN and more CD83 and
112
HLA-DR. For each condition, FACS analysis results are obtained by measuring the
percentage of positive cells multiplied with their geometric mean (MFI).
113
Discussion
To this day no publication has studied the impact of malaria pigments on the
infection and dissemination of human immunodeticiency virus type 1 (HIV-1). The
working hypothesis of this work was to study consequences of the persistent presence of
hemozoin in human DCs, on cell maturation and on HIV-1 propagation to CD4+ T cells.
It is now weIl accepted that DCs and HIV -1 viruses interact through numerous and
complex molecular networking (Engering et al., 2002; Gilbert et al. , 2007). Once captured
by immature DCs viral particles can be stored into multivesicular bodies, remain bound on
cell surface as intact virions through C-type lectins or be preserved as an integrated
provirus following entry by CD4- and CCR5-mediated fusion. Upon exposure to dangerous
signaling, HIV -l-loaded DCs start to maturate and migrate toward lymphoid tissues
enriched in CD4+ T cells, a process promoting viral dissemination. It is well known that
mature DCs exhibit less susceptibility to viral infection but transmit more efticiently viral
particles to target CD4+ T cells (Granelli-Pipemo et al., 1998; Piguet and Steinman, 2007).
Ineffective HIV -1 replication in mature DCs can be explained by various hypotheses. The
main hypothesis supporting this phenomenon concems the expression of the co-receptor
CCR5. Indeed, while immature DCs express high levels of CCR5 on their surface, mature
DCs express low amount of this chemokine receptor, which is a marker for peripheral
tissue homing (Sallusto et al., 1998; Sato et al., 2001). Instead, mature DCs express the
chemokine receptor CCR 7 which is essential for their trafticking and entering to secondary
lymphoid organs (Humrich et al., 2006; Sallusto et al., 1998; Sato et al. , 2001).
Consequently, it is unsurprising that maturation of DC renders cells less susceptible to
infection by R5 viruses since down-regulation of CCR5 prevents efficient viral fusion and
thus productive infection (Cavrois et al., 2006; Granelli-Pipemo et al., 1998; Zaitseva et al. ,
1997). It is also important to notice that exposure of DCs to stimuli inducing cell
maturation, like LPS, can triggers synthesis of soluble factors as type 1 interferon (IFN)
that can limit HIV -1 replication. Even this notion has not been reported for the infection of
DCs, it was recently described for macrophages (Equils et al., 2006; Liu et al., 2006;
114
Simard et al., 2008). Although, we have demonstrated that HZ-loaded cells did not increase
IFN expression (unpublished data), more analysis are needed for DC.
Here we show that treatment of immature DCs with a physiological concentration of
HZ induces LPS/IFNy-like maturation when we compared the expression of activation
markers. Indeed, as described in the literature, DCs are considered mature when cellular
markers as CD83 and HLA-DR are increased and DC-SIGN decreased (Arrighi et al. ,
2004; Granelli-Pipemo et al., 1998; Kuwano et al., 2007; Obermaier et al. , 2003).
DC-SIGN and the pathogen-recognition receptors of the C-type lectin as crucial factor for
the maturation status of DCs (Arrighi et al., 2004; Granelli-Pipemo et al., 1998). AIso, our
results concur with observations made by Coban and collaborators where activation of DCs
maturation by sHZ was similar to that of pro-inflammatory cytokines, bacterial and viral
products (Coban et al., 2002). Even if the expression of chosen cytokines are similar,
intracellular trafficking and other cytokines expression might be variable depending on the
stimulus. According to our data on early transfer, sHZ-matured DCs transmit viral particles
more efficiency than LPS/IFN-y-matured DCs. However, those cells are less susceptible to
infection as it has been described for LPS-mediated mature DCs. In opposition with
immature DCs for which 80 % of viral transmission was abrogated in the presence of EFV,
viral transfer from sHZ-Ioaded DCs was inhibited around 50 %. These results suggest that
half of the transferred viruses come from newly synthesized virions and the other come
from bound or intemalized HIV -1. Furthermore, sHZ-Ioaded DCs were less susceptible to
viral infection, which was confirmed by DCs infection experiments. The mechanisms by
which sHZ-mediated DCs maturation influence the transit of HIV-1 into DCs remain
unclear. It is possible that intracellular transport of HIV -1 is affected by the ingestion of
sHZ since malaria pigments can occupy as much as 30 % of the total volume of the cell
(Schwarzer et al., 2008). We have already demonstrated that the trafficking of HIV-1
within sHZ-Ioaded macrophage is impaired. Indeed, while entry and reverse transcription
remains untouched, integration of proviruses is affected in cells having engulfed sHZ
(submitted paper). Therefore, we can speculate that the same phenomenon occurs in DCs.
However, since sHZ phagocytosis induces cell maturation, it is also plausible that the
inhibition of viral infection is mainly caused by a down-regulation of CCRS. Indeed, our
115
results show that, just like LPSIIFN-y-induced maturation (21,5 % ± 7,2 SEM), after sHZ
phagocytosis, only 38,8 % ± 13,3 SEM of DCs express CCR5 when compared to untreated
cells (hypothetical value of 100%). Down-regulation of CCR5 expression, well established
during maturation of DCs, may also occur at the mRNA level, either by decreased
transcription or increased degradation. It was shown that LPS stimulation resulted in a
complete down-regulation of CCR5 mRNA levels after 40 hours (Sallusto et al. , 1998).
However, during malaria infection, a 3-fold increased in CCR5 expression was reported.
While, phagocytosis of hemozoin was not shown to directly induce CCR5 expression, the
mechanisms involved here could require the contribution of specifie pro-inflammatory
cytokines expression (Tkachuk et al., 2001). Although this study was not done on Des,
those results allow us to assume that if CCR5 expression is regulated by the expression of
specialized cytokines during malaria infection, blockade of HIV -1 infection by DCs
maturation will not be as strong as compared to cells treated with only LPS/IFN -y.
Signaling cascades induce by sHZ binding and engulfment in human DCs remains
unknown. Based on our result, we can speculate that intemalization of sHZ by DCs and the
inability of these cells to degrade this molecule, act as a dangerous intracellular signal
leading to up-regulation of co-stimulatory molecules as well as DC maturation. Although
the effect of LPS/IFNy on viral infection can be related on type 1 interferon production, we
do not believe that the effect of sHZ-mediated DC maturation on viral infection is linked to
the expression of those cytokines. Indeed, we have already demonstrated, at least in
macrophages, that sHZ do not induce measurable secretion of type 1 interferon
(unpublished data), suggesting that the inhibition of HIV -1 replication in sHZ-Ioaded DCs
is not caused by this phenomenon. The enhanced ability of sHZ-mediated mature DCs to
transfer HIV -1 to CD4+ T cell could be related to sHZ-induce paralysis of intracellular
trafficking. The accumulation of endocytosed viruses close to the plasma membrane might
facilitate their transmission toward CD4+ T cells during cell-to-cell interactions. It is well
known that increased expression of the adhesion molecule like 1 CAM -1 facilitates synapse
between DCs and T cells and therefore transmission of viral particles. In response to
Plasmodium and to malaria pigments, DCs have been found to synthesize interferon
gamma (IFN-y), TNF-a (Tumor Necrosis Factor), and interleukin 12 (IL-12) (Coban et al. ,
116
2002; Jaramillo et al., 2004). Moreover, it has been reported that monocytes and
macrophages ingested with sHZ secrete large amounts of TNF -u, IL-l~, IL-6, macrophage
inflammatory proteins 1 alpha and 1 beta, IL-I0, IL-12 and macrophage migration
inhibitory factor (Biswas et al., 2001; Martiney et al., 2000; Mordmuller et al. , 1998;
Pichyangkul et al., 1994). Overall, those secretions are important for the outcome of the
immune response including activation and differentiation of CD4+ T cells. By showing a
maturation-like profile, sHZ-Ioaded DCs might be more potent to activate T cells through
the expression of adhesion and co-stimulating molecules as weIl as cytokines. Since
activated T cells represent the most efficient target permitting HIV -1 replication, the
induction of DC maturation by the presence of sHZ in the environment might promote viral
dissemination and replication.
In conclusion, we have proven that malaria pigments phagocytosis induces
LPS/IFN-y-like maturation. sHZ is also responsible for an increase of HIV -1 early transfer
from M-DCs to CD4+ T cells and a dose-dependent inhibition of the viral replication in
sHZ-Ioaded DCs. Knowing that during parasitic infection the concentration of hemozoin
after erythrocytes rupture may be as high as 100 f.lg/ml (Parroche et al., 2007), studies
understanding the relationships between Plasmodium falciparum and HIV -1 remain an
important task. Additional and more comprehensive basic studies are needed to fully
understand the cellular consequences of such deadly interactions. This is essential to
discover promising drug combinations and promote new prevention strategies to treat
worldwide co-infected individuals.
117
Experimental Procedures
Reagents. Recombinant hum an interleukin-2 (rhIL-2) and efavirenz (EFV) were obtained
from the AIDS Repository Reagent Program (Germantown, MD). Lipopolysaccharide
(LPS) was purchased from Sigma (St-Louis, MO). IL-4 and Interferon-gamma (IFN-y)
were purchased from R&D systems (Minneapolis, MN), whereas granulocyte macrophage
colony-stimulating factor (GM-CSF) was a generous gift from Cangene (Winnipeg, MB).
The culture medium of monocyte-derived dendritic cells (DCs) consisted of RPMI-1640
supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS), penicillin G (100 U / ml),
streptomycin (100 U / mL), primocine (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD), and
glutamine (2 mM).
Antibodies. The following antibodies were all purchased from eBioscience (San Diego,
CA): fluorescein isothiocyanate (FITC)-tagged anti-DC-SIGN monoclonal Ab (clone eB
h209), Phycoerythrin (PE) anti-human CD1a (clone HI149), FITC anti-human CD14 (clone
61D3) and PE anti-human HLA-DR (clone LN3). FITC-tagged anti-human CD83 (clone
HB 15e) and PE-tagged CCR5 (clone 2D7) were purchased from BD Biosciences (Franklin
Lakes, NJ). Anti-p24 (clone 183-H12-5C and 31-90-25) hybridomas were obtained from
the AIDS Repository Reagent Pro gram and the American Type Culture Collection
(Manassas, V A). This antibody was purified by using MAbTrap protein affinity columns
according to the manufacturer's instructions (Pharmacia Technology AB, Uppsala,
Sweden).
Cel/s. Human embryonic kidney 293T cells were obtained from the ATCC and cultured in
Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10 % foetal calf serum (FCS).
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors were isolated by Ficoll
Hypaque gradient and plated in 75 cm2 flasks (1 x 107 cells/mL) for two hours in order to
separate, by adherence to plastic, monocytes (CD14+) from the other non-adherent cells. To
generate immature monocyte-derived dendritic cells (IM-DCs), purified CD14+ cells were
cultured in complete culture medium that was supplemented every other day with a cocktail
of GM-CSF (1000 U / mL) and IL-4 (200 U / mL) during 6 days. The percentage of ceUs
118
expressing the surface markers CD3 and CD19 was evaluated to assess contamination with
T and B cells, respectively. Experiments were perforrned with cell preparations that
contained a minimal amount of contaminants (ie, DC: purity > 95%; CD4+ T cells: purity >
98%) (Lambert et al., 2008). Autologous CD4+ T cells were isolated using a negative
selection kit according to the manufacturer's instructions (StemCell Technologies) and the
AutoMACS technology (Miltenyi Biotec, Auburn, Califomia). These cells were activated
with phytohemagglutinin L (PHA-L; 1 flg / mL) and maintained in complete culture
medium supplemented with rhIL-2 (30 U / ml) at a density of 2 x 106 cells / ml.
Plasmids and virus productions. pNL4.3Balenv are full-Iengh infectious molecular clone of
HIV-l. pNL4.3Balenv is a R5 (macrophage)-tropic strain where the NL4-3 env gene is
replaced with a R5-tropic Bal strain (Dornadula et al., 1999). This HIV -1 strains was kindly
provided by R. Pomerantz (Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA). Viruses were
produced by the calcium phosphate co-precipitation method in 293 T cells as described
previously (Fortin et al. , 1997). The virus-containing supematants were harvested at day 2
after infection, filtered through a 0.22 flm cellulose acetate syringe filter, ultracentrifugated,
and norrnalized for virion content by using an in-house enzymatic assay specifie for the
major viral p24 protein. In this test, 183-HI2-5C and 31-90-25 are used in combination to
quantify p24 levels (Bounou et al. , 2002).
Hemozoin production. Synthetic hemozoin (sHZ) production was modified from a previous
methodology (Jaramillo et al., 2003) but optimized in our laboratory. Briefly, 90 mg of
hemin chloride (Sigma-Aldrich) was solubilized in DMSO (polymerization solvent) and
added to a 4 M acetate solution at pH 5.0. The suspension was stirred with a magnet for 6
hours at 65 oC. After adding a volume of 10 % SDS, the suspension was centrifuged at
12,500 g for 25 minutes. The pellet was then sonicated twice at the lowest setting in
100 mM sodium bicarbonate, pH 9.0, 0.5 % SDS and centrifuged again. The pellet was
then washed three times in SDS 2 %, at least five times in sterile H20 and once ln
endotoxin free PBS to wash out residual SDS. The final pellet was resuspended ln
endotoxin free PBS and aliquoted to obtain a solution of 652 f.lg/ml synthetic hemozoin.
119
Hemozoin quantitation. Total heme content of hemozoin was determined, as described by
Sullivan et al. (Sullivan et al., 1996). Parasite hemozoin or polymerized he me was
incubated for 1 h in 2 % SDS / 20 mM NaOH to solublize polymer into monomeric heme,
which has a molar extinction coefficient at 400 nm of 1 X 105.
HIV-l infection. After differentiation, DCs were plated at 1 x 105 cells in a final volume of
100 fJ.I in 96-well plate. After treatment or not (Ctrl) with increasing concentration of sHZ
for 24 hours, ce Us were infected with a fixed amount of virus (i.e. 5 ng of p24 per 5 x 104
cells). Every 3 days and for a period lasting 9 days, half of the medium was removed and
kept frozen at 20 oC until assayed. Virus production was estimated by measuring p24 levels
in culture supematants by ELISA.
HIV-l transfer assay. IM-DCs (33 x 105 ceUs in 100 fJ.L) treated or not with sHZ
(5 fJ.g / ml) or LPS/IFN-y (100 ng/ml and 1000 V/ml respectively) for 48 hours and then
exposed to HIV-1 (10 ng p24) for 60 minutes at 37°C. Next, the virus-ceU mixture was
washed 3 times with PBS to remove unadsorbed virions. In sorne experiments, cells were
also treated for 15 minutes with the anti-HIV-1 drug EFV (50 nM). Finally, IM-DCs were
co-cultured with autologous PHA-activated CD4+ T ceUs at a ratio of 1 : 3 in complete
RPMI-1640 medium supplemented with IL-2 (30 V / mL) in 96-well plates in a final
volume of 200 fJ.L. Virus production was estimated by measuring p24 levels in cell-free
culture supernatants.
Flow cytometry ana lys is . Before staining, ceUs were incubated for 15 minutes at 4 oC with
10 % pooled human sera to block nonspecific binding sites and washed once with
phosphate-buffered saline (PBS) supplemented with 0.5 % bovine serum albumin (BSA).
To monitor cell surface expression of CD83, DC-SIGN, and HLA-DR on DCs, samples
from various healthy donors treated or not with sHZ or LPS /IFN-y were incubated with
specifie antibodies or with an appropriate isotype-matched irrelevant control Ab (for
non-specifie staining) for 30 min at 4 oC. CeUs were then washed with PBS / 0.5 % BSA
and fixed in 2 % paraformaldehyde and analyzed by F ACS (Epies ELITE ESP; Coulter
ElectronÎcs) .
120
Statistical analysis. Results presented are expressed as means ± SEM of at least triplicate
samples. AlI of the experiences were repeated at least three times; each figure combines the
results obtained with aIl the different donors. Statistical significance between groups was
determined by analysis of variance. Calculations were made with Prism version 3.03 . P
values < 0.05 were considered statistically significant. The statistical significance of the
results was defined by performing a one-way analysis of variance with Dunnett' s post tests
to compare treated and control samples or with Bonferroni' s post tests to compare aIl pairs
of columns. In figure 3 (upper right panel), we used column statistics to determine whether
the mean of each column differs from sorne hypothetical value coupled with one-sample t
test which assumes that the data are sampled from a Gaussian distribution.
121
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127
Acknowledgments
The authors appreciate the excellent technical contribution of Odette Simard,
Caroline Côté, Renaud Tremblay and Marc-André Roy. We express our gratitude to
Caroline Gilbert for critical and constructive comments for this study.
J.D. holds a Doctoral Award from the CIHR HIV/AIDS research program and
M.lT. holds the Canada Research Chair in Human Immuno-Retrovirology (Tier 1 level).
Furthermore, this study was supported by funding from the Canadian Foundation for AIDS
Research.
The authors have no conflicting financial interests.
128
Figure legends
Figure 1. sHZ increases viral transfer of HIV -1 from DCs to autologous CD4+ T cells.
DCs were treated with sHZ (10 ~g/ml) for 48 hours, infected with NL4.3Balenv virus for
an hour and co-cultured with autologous CD4+ T cells. Supematants were harvested at 2, 4,
6 and 9 dpcc (days post-co-culture) and p24 contents were quantified by ELISA (left
panel). Results are the mean ± SEM of data from triplicate from one representative
experiment. The right panel illustrated means ± SEM at 2 dpcc of data from triplicate of
seven independent experiments which were done in the presence or in absence of EFV (50
nM). Statistical analysis was performed on the results from all experiments. Asterisks
denote statistically significant data (*, P < 0.05; ***, P < 0.001).
Figure 2. sHZ-Joaded DCs are Jess permissive to HIV -1 infection. DCs were treated
with 1 0 ~g/ml of sHZ (left panel) or with increasing concentration ranging from 0.1 to
25 ~g / ml (right panel) for 48 hours. Then cells were infected with full-Iength HIV-1
preparations (NL4.3Balenv), supematants were harvested at 3, 6, 9 and 12 dpi and p24
concentrations were measured by ELISA. The left panel represent the mean ± SEM of data
from triplicate of one representative experiment and the right panel is the mean ± SEM at
12 dpi from triplicate of three independent experiments. Statistical analysis was performed
on the results from all experiments. Asterisks denote statistically significant data (* *, P <
0.01).
Figure 3. sHZ-Joaded DCs down-regulate CCR5 expression. Immature DCs were
treated with sHZ (10 ~g / ml) or with LPS/IFN-y (100 ng/ml/1000 U/ml) for 48 hours and
CCR5 expression on those cells was compared to untreated iDCs (Ctrl) by FACS analysis.
Donors are differentiated by colors coding within different conditions (Ctrl, LPS/IFN-y and
sHZ) and their mean of CCR5 expression is identified with solid black bars. Results are
also illustrated in percentage of CCR5 expression compared to control (upper right panel).
In this case, higher statistical differences of CCR5 expression for LPS/IFN -y- and sHZ
treated DCs is obtained when compared to non-treated-DCs (hypothetical value of 100%)
in a donor-dependant manner. Results are mean ± SEM of data from triplicate of five
129
independent experiments. Statistical analysis was perforrned on the results from aIl
experiments. Asterisks denote statistically significant data (**, P < 0.01; (*** , P < 0.001).
Figure 4. sHZ induces maturation ofIM-DCs. lM-DCs were exposed to sHZ (10 flg/ml)
or LPS/IFN-y (100 ng/ml/lOOO V/ml) and phenotypic changes were monitored using a both
microscopy (A) and flow cytometry analysis (B to D). For maturation analysis three
specifie makers were chosen: DC-SIGN (B), CD83 (C) and HLA-DR (D) and compared to
immature DCs (Ctrl). For each condition, FACS analysis results are obtained by measuring
the percentage of positive cells multiplied by the mean fluorescence intensity (MFI).
Results are mean ± SEM of data from triplicate of three independent experiments.
Statistical analysis was perforrned on the results from all experiments. Asterisks denote
statistically significant data (**, P < 0.01).
Figure 1
1550
1!:~ ~ - ;:.. ....... i ~o . . V . a 350 c - 50 ·
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130
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Figure 2
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131
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132
Figure 3
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133
Figure 4
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Ctrl LPSIIFN-y sHZ
Chapitre VI. Les cellules dendritiques dérivées de monocytes traités à l'hémozoïne possèdent un phénotype partiel de maturation favorisant l' insfection en trans et la réplication du VIH -1 dans les lymphocytes T CD4 +
134
Ce chapitre fait l'objet d'une publication qui sera prochainement soumise. Par
conséquent, le texte ainsi que les résultats peuvent être suj ets à des modifications avant leur
publication.
Le travail de laboratoire et la rédaction de l'article ont été effectués par Juliette
Diou. Mélanie Tardif a participé à la rédaction de l'article
1 Résumé
La co-infection malaria/VIH -1 résulte en une augmentation de la charge virale et en
une accélération de la progression du SIDA. L'objectif de cette étude est d' approfondir
l'hypothèse selon laquelle les pigments malariques peuvent influencer l'infection et la
dissémination du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+. Contrairement à notre étude effectuée
précédemment, nous avons, isolés des monocytes par adhérence et nous les avons
différentiés en cellules dendritiques (MDDC) en présence ou en absence de pigments
malariques (sHZ). Après validation de notre modèle, nous démontré que la présence d'sHZ
induisait un changement phénotypique différent celui des MDDC immatures (CD14±, DC
SIGN+ et CD1a+) et matures (CD83+ DC-SIGN- et HLA-DR+). De plus, la présence d' sHZ
induisait une augmentation significative du tranfert viral aux lymphocytes T CD4+ ainsi que
la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Nos résultats révèlent un
nouveau mécanisme par lequel l'HZ induirait un environnement favorable à la prolifération
des lymphocytes expliquant ainsi comment le P. falciparum peut aggraver l'infection au
VIH -1 chez les patients co-infectés.
135
2 Article
Dendritic cells derived from hemozoin-Ioaded monocytes have a partial
maturation phenotype that promote trans-infection and HIV replication
in CD4+ T cells
Juliette Diou l, Mélanie R. Tardifl, Michel 1. Tremblay 1 *
1 Research Center in Infectious Diseases, CHUL Research Center, Faculty of Medicine,
Laval University, Quebec, Quebec, Canada
* Corresponding author, mailing address:
Laboratory of Human Immuno-Retrovirology
Research Center in Infectious Diseases, RC709
CHUL Research Center
2705 Laurier Blvd., Quebec (QC), Canada, G 1 V 4G2
Phone: 1 (418) 654-2705. Fax: 1 (418) 654-2212
Electronic address: michel.j. [email protected]
Conceived and designed the experiments: JD MRT MJT. Performed the experiments: JD.
Analyzed the data: ID MRT MJT. Contributed reagents/materials/analysis tools: MJT.
Wrote the paper: JD MJT.
136
Abstract
Mal ari alHIV -1 coinfection results in a raise of viral load and an acceleration of
disease progression. The aims of this study were to investigate whether malaria pigments
(also hemozoin or HZ) could influences HIV -1 infection and transfer from monocytes
derived dendritic cells (MDDCs) to CD4+ T cells when HZ is initially intemalized in
monocytes before their differentiation in dendritic cells. We demonstrated here that HZ
treatment during MDDCs differentiation induces a different phenotype when compared to
mature (LPS/IFN-y) and immature cells. Furthermore, presence of sHZ into MDDCs
significantly increases HIV -1 transfer to autologous CD4+ T cells and prime infected CD4+
T cells for viral replication, two phenomenons that may be related on the ability of mature
MDDCs to interact and activate CD4+ T cells. Altogether our findings suggest a new
mechanism that could partially explain the increased HIV -1 virus production during
Plasmodium falciparum co-infection. Understanding the cellular interactions involved
during malariaIHIV -1 co-infection is an important challenge that could help, promote and
develop new strategies to treat worldwide co-infected individual.
137
Introduction
Together, Malaria and acquired immune deficiency syndrome (AIDS) cause more
than 4 million deaths a year. By the end of 2007, an estimated 33.2 million people were
living with human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1), of whom 2.5 million were
newly infected (1). Plasmodiumfalciparum (P.falciparum), the infectious agent of malaria,
is though to be responsible for 1.5 to 2.7 million deaths and 350 to 500 million acute
illnesses annually (2,3).
Plasmodium falciparum proliferation within the hosts' erythrocytes results in a
variety of clinical manifestations like unarousable coma, severe anemia, renal failure,
jaundice and many more (4). AlI the symptoms cited here were directly or indirectly
associated with persistent presence of malaria pigment within erythrocytes and leukocytes
(e.g. monocytes and macrophages). Indeed, to properly infect, the parasite needs to grow by
ingesting amino acids found in the host's hemoglobin (5). This process leads to hemoglobin
degradation and the formation of a product that is highly toxic to the parasite, namely free
heme. The principal and essential first step in detoxification of heme is its incorporation
into an intracellular crystal called malarial pigment or hemozoin (HZ) (6). As parasites
mature and rupture, HZ is ingested by phagocytes present in the blood circulation to finally
accumulate in tissues, e.i. liver, bone marrow and spleen. In fact, in a study made by
Sullivan and collaborators in 1996, malaria pigments were found to weigh as much as
0.2 % of the liver total wet weight after only 18 days (7). At this point, HZ was suggested
to be a maker for chronicity of malaria infection.
Monocytes and neutrophils being resilient phagocytes are recruited to the area of the
parasitic infection. Consequently, monocytes will phagocyte free HZ and/or HZ-Ioaded red
blood cells. As much as 79 % of HZ was found in monocytes, representing approximately
30 % of the total cell weight (8). Monocytes are essential for replenishing resident
macrophages and dendritic cells under normal states, and generating an immune response.
Actually, in response to inflammation signaIs, monocytes can move quickly to sites of
infection and differentiate into macrophages and immature dendritic cells (IMDDCs). Upon
antigens uptake and inflammatory stimuli, IMDDCs start to migrate to the peripherallymph
nodes where they maturate and acquire molecules (9) rendering them potent antigen-
138
presenting cells (APCs) proficient to stimulate naïve T lymphocytes. In this regard, the best
known marker for mature DCs is CD83 in addition to CD80 and CD86 that act as co
stimulatory molecules for complete T cells activation.
Human immunodeficiency virus (HIV) is a lentivirus that can lead to acquired
immunodeficiency syndrome (AIDS), a condition in which the immune system begins to
fail, leading to life-threatening opportunistic infections. HIV -1 primarily infects vital cells
in the human immune system such as helper T cells (specifically CD4+ T ceUs),
macrophages and dendritic cells. MDDCs are part of the first cells encountered by the virus
during sexual transmission. They play an important role by transmitting HIV to CD4+ T
cells once the virus has been captured in the mucosa by MDDCs (10). As described
previously (11-15), HIV-1 is transferred from MDDCs to CD4+ T cells via a process
involving two distinct phases. Transport of viruses located within endosomal compartments
in immature MDDCs (iMDDCs) to the MDDC-CD4+ T cell synapse is called the initial
transfer phase (i.e., early transfer). This event is followed by a second kinetic phase (i.e. ,
late transfer) dependent on productive virus infection of iMDDCs and eventual transfer of
progeny virus to CD4+ T cells.
Cellular mechanism between HIV and malaria are largely undefined and often
contradictory. In endemic regions, where HIV-1 and Plasmodium falciparum infections
overlap, contamination of other opportunistic pathogens and chronic latent malaria were
hypothesized to be responsible for the increased evolution of HIV infection to AlOS (16).
ln this regard, we decided to investigate the mechanisms by which HZ promote HIV
infection and dissemination by exploring first differentiation of HZ-Ioaded monocytes into
MODCs and macrophages and their ability to activate C04+ T lymphocytes and secondly
the ability of the HZ-Ioaded MOCs to capture and transfer viral particles to target T cells.
139
Results
In Plasmodium infected individuals, an important level of circulating monocytes are loaded
with HZ. Upon infection or inflammation, these cens migrate to peripheral tissues to
differentiate into macrophages or dendritic cens. In order to mimic this phenomenon, we
designed an experimental model in which monocytes were exposed to sHZ (10 J.lg/ml) and
differentiated for six days with a mixture of GM-CSFIIL-4 to obtain MDDCs (fig. 1).
Because circulating DCs represent less then 1 % in hum an blood, we used monocytes
known to be a usual progenitor for the generation of in vitro MDDCs when cultured with
cytokine cocktail of GM-CSF and IL-4 [17-20]. Latest studies differentiate MDDCs from
CD14+ monocytes separated with magnetic beads [21-23]. For the purpose of our study,
monocytes were separated from PBMCs by adhesion. The use of similar protocols have
already been seen in previous reports [24,25]. As for others, when cultured in vitro in the
presence of GM-CSF and IL-4, monocytes acquire specifie markers and features of
immature myeloid DCs (e.g., DC-SIGN and CD1a), while losing markers typical of
monocytes and macrophages such as CD14 (data not shown) [18,26,27]. The first set of
experiments was aimed to evaluate the ability of primary monocytes to differentiate in
iMDDCs in presence of sHZ treatment during monocytes differentiation. To this end,
monocytes and CD4 T cells were isolated from PBMCs of healthy blood donors as
described in material and methods. At day 0, sorne cells were treated with a chosen amount
of sHZ and compared to untreated cells. AIso, after four days, sorne untreated cens were
treated with LPS and IFN-y to generate mature MDDCs. Indistinctively, an cells were
treated with GM-CSF and IL-4 to differentiate monocytes in MDDCs and analyzed by flow
cytometry.
sHZ induces a transitional maturation pattern of human MDDCs
We first assessed whether the phenotype ofMDDCs was changed in the presence of
sHZ within the precursor cens or upon LPS/IFN-y stimulation (positive ctrl). Microscopie
analysis of monocytes cultured in the presence of sHZ, and differentiated in MDDCs,
seemed to present an intermediate state of maturation when compared to immature MDDCs
(Ctrl) and LPS/IFN-y-treated MDDCs (fig. 2, left panel). 1t is important ta notice that most
140
MDDCs derived from HZ-Ioaded monocytes contain HZ but at different level.
Furthermore, MDDCs matured in presence of LPSIIFNy, remained attached on the bottom
of the weIl whereas immature MDDCs remain in suspension. To visualize the impact of
sHZ- and LPS/IFN-y-mediated MDDCs maturation, we chose four specific makers (fig. 2,
right panel). DC-SIGN which is a calcium-dependent pattern-recognition lectins was
reported to be predominantly expressed on immature dendritic cells [28], CD83 which is
expressed by mature dendritic cells [29], RLA-DR which as been reported to be up
regulated upon MDDCs maturation [17] and CCR7 which is associated with MDDC
maturation and promotes their migration from tissues to lymphoid organs [30]. When
compared to immature MDDCs (14 ± 3.3; 913 ± 153.9; 838 ± 126.8 and 5 ± 1.5,
respectively), LPS/IFN-y-induced maturation of MDDCs is characterized by and a
significant increase of CD83 (442 ± 2.4), HLA-DR (1807 ± 351.4) and CCR7 (67 ± 14.8)
expression and a decrease of DC-SIGN (198 ± 46.9). Although only results for CD83 (72 ±
Il.4) and CCR7 (17 ± 4.3) expression showed a significant increase in MDDCs treated
with sHZ, DC-SIGN expression decreases to sorne extent (555 ± 103.3). Not surprisingly,
in contrast to LPS/IFN-y, sHZ treatment slightly decreases HLA-DR (580 ± 126.1)
expression as already described in the literature [31,32]. Interestingly, in contrast to
LPS/IFN -y stimulation, the presence of sHZ within precursor cells did not increase CD80
and CD86 expression after DCs differentiation confirming that we obtained an intermediate
maturation profile with those cells (data not shown).
sHZ-fed monocytes-derived MDDCs (sHZ-MDDCs) transfer more efficiently HIV-l
to CD4+ T lymphocytes.
MDDCs play a relevant role in HIV infection. They capture viruses and transmit
them to CD4+ T cells which highly replicate RIV. Because results prove that sHZ presence
in monocytes is responsible for phenotypic modifications of immature MDDCs, we studied
the possible impact ofthose changes on HIV 1 transfer to autologous CD4+ T cells. For that
purpose, monocytes differentiated in MDDCs (with or without HZ) were infected for an
hour with a fully infectious R5-tropic HIV 1 virus preparation (NL4.3Balenv), extensively
washed and co-cultured with autologous CD4+ T cells. Supematant containing newly
synthesized virions were drawn every two days for a period of six days after co-culture
141
(dpcc). A significant increase was noticed in the case of sHZ-fed monocytes after 2 (37 ± 3
SEM) and 4 days (484 ± 28 SEM) of co-culture, when compared to the control (1 ± 0.3 and
35 ± 6 SEM, for 2 and 4 days respectively) (Fig. 3).
sHZ prevents HIV-l infection in human MDDCs partially explained by a down
expression of CCRS.
Next, we wanted to verify whether sHZ-fed MDDCs, responsible for a significant
increase in HIV-1 transfer to CD4+ T cells, could influence the outcome ofHIV-1 infection
and explain the observed phenomenon. To do so, monocytes were initially treated
throughout differentiation with sHZ (10 Jlg/ml). Cells were then infected with a fully
infectious R5-tropic HIV-1 virus preparation (NL4.3Balenv). Virus infection was estimated
every 3 days for duration of 12 days post-infection (DPI) by measuring the p24 content in
supernatants. Results reveal that HIV -1 infection of MDDCs is inhibited at soon as 6 days
(2.4 ± 1.2 SEM) and significantly at 9 (5 ± 2.4 SEM) and 12 DPI (14 ± 3 SEM) by sHZ
treatment when compared to the control (5.7 ± 1.9 SEM, 18.8 ± 5.5 SEM and 35 ± 9 SEM,
respectively) (Fig. 4A). Analysis of results obtain with LPS/IFN-y treatment (1 .2 ± 0.9
SEM, 2 ± 0.9 SEM and 6 ± 3 SEM, respectively) suggests that sHZ-MDDCs mimic mature
MDDCs response to HIV -1 infection. Additionally, cell viability is not affected by the
chosen concentrations of sHZ as monitored by the fluorescent cytotoxic MTS assay (data
not shown).
In sHZ- and LPS/IFN-y-treated DCs, down-expression of the CCR5 co-receptor can
partially explain HIV -1 inhibition in those cells. Indeed, we show that CCR5 expression is
significantly decreased in LPSIIFN-y- (1.4 % of positive cells ± 0.9 SEM) and sHZ-treated
cells (2.9 % of positive cells ± 0.8 SEM) when compared to immature DCs (5.7 % of
positive cells ± 1.7 SEM) (fig. 4B).
sHZ-MDDCs increases HIV -1 replication of CD4+ T cells.
To resume, sHZ-MDDCs when compared to iMDDCs and mMDDCs have
transitional maturation pattern: CD8310wDC-SIGNlowHLA-DRlowCCR710w. AIso, sHZ
treated MDDCs transfer more efficiently HIV -1 viruses to CD4+ T lymphocytes.
Preliminary data demonstrated that HIV -1 replication remain unaffected in sHZ-treated
142
CD4+ T cells when compared to untreated cells (data not shown). As so, we wanted to
verify whether HIV -1 infection of CD4+ T cells was altered upon co-culture with sHZ
loaded MDDCs. To do so, autologous activated CD4+ T cells were infected for two hours
with a fully infectious R5-tropic HIV -1 virus preparation (NL4.3Balenv), extensively
washed and co-cultured with monocytes differentiated in MDDCs (with or without HZ).
Supematant containing newly synthesized virions were drawn every two days for a period
of six days after co-culture (dpcc). When cells were co-cultured with sHZ-MDDCs, we
measured a significant increase of CD4+ T cells infection at 2 (3.3 ± 0.1 SEM) and 4 dpcc
(179.4 ± 23.1 SEM) when compared to the control (1.2 ± 0.2 and 54.8 ± 2.2 SEM,
respectively) (fig. 5). Those results let us helieve that increased HIV -1 replication in CD4+
T cells may he due to sHZ-induced immune activation ofMDDCs.
143
Discussion
During Plasmodium infections, host erythrocytes help the parasite to develop and
proliferate by degrading hemoglobin as a source of amino acids. As the parasite mature and
rupture, free HZ and HZ-fed erythrocytes are ingested by phagocytes and later accumulated
in the reticuloendothelial system of the host [5,32-34]. A study mentioned that Plasmodium
jalciparum-infected erythrocytes could adhere to iMDDCs, inhibit their maturation and
subsequently reduce their capacity to stimulate both memory and naïve T cell responses
[35]. Although phagocytosis of parasitized erythrocytes was shown to inhibit important
cellular functions of human macrophages and DCs [36,37], purified hemozoin was found
to enhance DCs maturation [38]. With crude HZ preparation, the role of malaria pigments
and those of other contaminating proteins, membranes and glycosylphosphatidylinositol
(GPI) are difficult to distinguish [38]. Other studies describe conflicting results on the
impact of HZ on the host immune system, particularly on DCs functions, but only in
murine models [39-43]. To our knowledge, studies focused on the impact of malaria
pigments on HIV -1 infection and dissemination in and by DCs, have never been
considered. Here we show that sHZ-fed monocytes differentiated in DCs (MDDCs) play an
important role in HIV -1 dissemination to CD4+ T cells and viral replication.
MDDCs share characteristics with myeloid DCs, immature dermal DCs and
interstitial DCs [13,44]. As so, instead of using immature human myeloid MDDCs [38],
we chose to isolate monocytes from healthy blood donors and differentiate them in the
presence or not of sHZ pigments by GM-CSF and IL-4 treatment to obtain immature Des.
Usually, the exposure of immature MDDCs to dangerous signaling triggers their maturation
allowing them to migrate toward lymphoid tissues enriched in CD4+ T cells. Maturation of
MDDCs downregulates the expression of CCR5, a marker for peripheral tissue homing
[45,46] and upregulates the expression of the chemokine receptor CCR7 which is essential
for their trafficking and ente ring into secondary lymphoid organs [45-47]. During DCs
maturation, other markers are upregulated including CD83, CD80, CD86 and HLA-DR,
while others like DC-SIGN decrease. It is now evident that immature MDDCs can be partly
activated leading to a semi-mature phenotype [48]. Partially mature Des are characterized
144
by a moderate expression of costimulatory molecules and low cytokine production. They
express also CCR7 that permit their continuous migration to lymph node a phenomena
contributing to the peripheral immune tolerance [49,50]. In the present study we observed
that thru the significant increase of CD83 and CCR7 expression, sHZ-fed MDDCs present
an intermediate state of maturation when compared to immature and LPS/IFNy-induced
mature MDDCs (iMDDCs and mMDDCs, respectively). Monocytes, macrophages and
iMDDCs contain preformed intracellular CD83, and its rapid surface expression upon
activation is post-translationally regulated in a process involving glycosylation [51].
Although its functions on MDDCs remain unclear, studies have indicated roles of CD83 in
the modulation of antigen presentation and CD4+ T cell differentiation in the thymus [52].
However, CD83 implication in the activation of CD4+ T cells was not yet confrrmed [53].
In combination with the expression of co-stimulatory receptors, sHZ-Ioaded MDDCs
almost certainly secrete soluble factors favoring T cell activation that remain to be
determined.
Although sHZ treatment was not sufficient in inducing a complete maturation
profile of MDDCs, we wanted to corroborate previous reports suggesting that malaria
pigments inhibited MDDCs maturation when HZ-Ioaded MDDCs are challenged with other
stimuli like LPS. Indeed, it was reported that MDDCs from HZ-Ioaded monocytes are less
responsive to a second stimulus like LPS. Indeed, they have showed that HZ-Ioaded
MDDCs stimulated with LPS express less CD83 and CD80, two markers for MDDCs
maturation, than LPS-challenged unfed cells [37]. As so, in addition to our experimental
approach described in material and methods, we treated sHZ-MDDCs with LPSIIFN-y two
days prior flow cytometry analysis. Results show that the presence of HZ did not prevent
increased expression of maturation markers in response to LPS/IFN -y (data not shown).
However, as previously reported by others, levels of CD83, CD80, CD86 and CCR7
measured in HZ-Ioaded MDDCs were slightly decreased when compared to LPS/IFN-y
matured cells. Hence, the engulfment of sHZ by monocytes modulates their subsequent
differentiation into MDDCs leading the apparition of DCs barring an alternative phenotype
to the one obtained with conventional HZ-unfed DCs. Supplementary experiments are
needed to clarify their biological functions and the type
145
DCs and HIV -1 vIruses interact through numerous and complex molecular
networking [11,54]. Viral particles captured by immature MDDCs are stored into
multivesicular bodies, remain bound on ceU surface as intact virions through C-type lectins
or are preserved as an integrated provirus foUowing entry by CD4- and CCR5-mediated
fusion. LPS/IFNy-induced mature MDDCs express low amount of CCR5 that prevents
efficient viral fusion and thus productive infection rendering these ceUs less susceptible to
viral infection [12,55-57]. Sorne stimuli inducing MDDCs maturation like LPS can also
triggers synthesis of soluble factors as type 1 interferon that can limit HIV -1 replication
[58-60]. Although maturation renders MDDCs less permissive to viral infection, the ability
of these ceUs to trans-infect CD4+ T ceUs is strongly enhanced. Accordingly, our results
demonstrate that upon sHZ-treatment, phenotypic modifications of MDDCs significantly
increase viral transfer to CD4+ T ceUs. Mechanisms by which sHZ-mediated MDDCs like
maturation influence the transit ofHIV-l into MDDCs remain unclear. We prove that viral
dissemination is not promoted by an increase of newly synthesized virions as viral infection
is decreased in sHZ-Ioaded MDDCs. Indeed, just like LPS/IFN-y-induced maturation, after
sHZ phagocytosis, we measured significant 51 % decrease of CCR5 expression when
compared to iMDDCs (5.7 and 2.9, respectively) (fig 4B).
ln response to Plasmodium and to malaria pigments, MDDCs have been found to
synthesize interferon gamma (IFN-y), TNF-a (Tumor Necrosis Factor), monocyte
chemoattractant protein (MCP)-I, interleukin 6 (IL-6) and IL-12 [38,61]. Furthermore,
primary MDDCs are known to produce higher levels of IL 12 than macrophages and
monocytes. Indeed, the fact that MDDCs are likely to deliver IL 12 to CD4+ T ceUs
clustered around them makes this source of IL-12 even more effective for T cell stimulation
[62]. OveraU, cytokines and chemokines secretions are important for the outcome of the
immune response including activation and differentiation of CD4+ T cells. Here we prove
that the environmental cytokine production induced by sHZ- treatment promotes CD4+ T
cell activation. Interestingly, without inducing LPS/IFN-y maturation of sHZ-fed MDDCs,
we noticed that those cells already expressed a three fold increased amount of CCR7 when
compared to iMDDCs (Fig. 2). Those results prove that it could be possible for sHZ-fed
146
MDDCs to migrate to lymphatic tissues and interact with CD4+ T cells without necessarily
be activated by a second stimulus like LPS.
Based on our results, we propose a schematic representation on the impact of
malaria pigment phagocytosis by human phagocytic cells on the infection and
dissemination of HIV -1 to autologous CD4+ T cells (Fig. 6). In humans, malaria infection
begins with the bite of an infected female Anopheline mosquito. After standard
development of sporozoites in hepatocytes and invasion of the merozoites form of
Plasmodium species in red blood cells (RBC), HZ is synthesized triggering the burst of
infected red blood cells and the release of HZ in circulation. Free HZ is then heavily
engulfed by monocytes which circulate in bloodstream until their migration into peripheral
tissues where they will differentiate into phagocytic cells upon inflammatory stimuli
(iMDDCs or macrophages). By the expression of CCR7, those HZ-Ioaded differentiated
cells will migrate to lymphoid tissues which are predisposed areas for HIV multiplication.
HZ-fed MDDCs will capture viral particles and then transfer them to CD4+ T cells. Infected
CD4+ T cells that migrate to peripheral tissues will be further activated by resident HZ
loaded monocyte-derived cells, resulting in a significant increase of HIV -1 infection and
viral dissemination.
In conclusion, we propose a new mechanism in which malaria pigments could play
an important role in acceleration HIV -1 disease progression. Indeed, we provide strong
evidence where the intemalization of malaria pigments modifies the type of differentiation
and maturation of MDDCs rendering them more potent to trans-infect and prime CD4+ T
lymphocytes for HIV replication. Additional and more comprehensive basic studies are
needed to fully understand the complex cellular consequences of such deadly interactions.
This is essential to discover promising drug combinations and promote new prevention
strategies to treat worldwide co-infected individuals.
147
Material and methods
Reagents. Recombinant human interleukin-2 (rhIL-2) and efavirenz (EFV) were obtained
from the AIDS Repository Reagent Program (Germantown, MD). Lipopolysaccharide
(LPS) was purchased from Sigma (St-Louis, MO). IL-4 and Interferon-gamma (IFN-y)
were purchased from R&D systems (Minneapolis, MN), whereas granulocyte macrophage
colony-stimulating factor (GM-CSF) was a generous gift from Cangene (Winnipeg, MB).
The culture medium of monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) consisted of RPMI-
1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin G (100 U/mL) ,
streptomycin (100 U/mL) , primocine (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD), and
glutamine (2 mM).
Antibodies. The following antibodies were aIl purchased from eBioscience (San Diego,
CA): fluorescein isothiocyanate (FITC)-tagged anti-DC-SIGN monoclonal Ab (clone eB
h209), PE anti-human HLA-DR (clone LN3). PE-tagged anti-human CD3 (clone HIT3a),
PE-tagged anti-human CD19 (clone HIBI9) and FITC-tagged anti-human CD83 (clone
HBI5e) and PE-tagged CCR5 (clone 2D7) was purchased from BD Biosciences (Franklin
Lakes, NJ). Anti-p24 (clone 183-HI2-5C and 31-90-25) hybridomas were obtained from
the AIDS Repository Reagent Program and the American Type Culture Collection
(Manassas, VA). This antibody was purified by using MAbTrap protein affinity columns
according to the manufacturer's instructions (Pharmacia Technology AB, Uppsala,
Sweden).
Cells. Human embryonic kidney 293T cells were obtained from the ATCC and cultured in
Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10 % foetal calf serum (FCS).
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors were isolated by Ficoll
Hypaque gradient and plated in 75 cm2 flasks (1 x 107 ce Ils/mL ) for two hours in order to
separate, by adherence to plastic, monocytes (CDI4+) from the other non-adherent cells. To
generate immature monocyte-derived dendritic cells (iMDDCs), purified CDI4+ cells were
cultured in complete culture medium that was supplemented every other day with a cocktail
of GM-CSF (1000 U / mL) and IL-4 (200 U / mL) during 6 days. The percentage of cells
expressing the surface markers CD3 and CD19 was evaluated to assess contamination with
148
T and B cells, respectively. Experiments were performed with cell preparations that
contained a minimal amount of contaminants (less to 2 % of CD4+ T lymphocytes and less
of 1 % for B lymphocytes (data not shown). Autologous CD4+ T cells were isolated using a
negative selection kit according to the manufacturer' s instructions (StemCell Technologies)
and the AutoMACS technology (Miltenyi Biotec, Auburn, California). These cells were
activated with phytohemagglutinin L (PHA-L; 1 Jlg 1 ml) and maintained in complete
culture medium supplemented with rhIL-2 (30 U 1 ml) at a density of2 x 106 cells 1 ml.
Plasmids and virus productions. pNL4.3Balenv is a full-Iengh infectious molecular clone of
HIV -1. This virus is a R5 (macrophage )-tropic strain where the NL4-3 env gene is replaced
with a R5-tropic Bal strain (63) kindly provided by R. Pomerantz (Thomas Jefferson
University, Philadelphia, PA). Viruses were produced by the calcium phosphate co
precipitation method in 293 T cells as described previously (64). The virus-containing
supernatants were harvested at day 2 after infection, filtered through a 0.22 Jlm cellulose
acetate syringe filter, ultracentrifugated, and normalized for virion content by using an in
house enzymatic assay specific for the major viral p24 protein. In this test, 183-H12-5C and
31-90-25 are used in combination to quantify p24 levels (65).
Hemozoin production. Synthetic hemozoin (sHZ) production was modified from a previous
methodology (66) but optimized in our laboratory. Briefly, 90 mg of hemin chloride
(Sigma-Aldrich) was solubilized in DMSO (polymerization solvent) and added to a 4 M
acetate solution at pH 5.0. The suspension was stirred with a magnet for 6 hours at 65 oC.
After adding a volume of 10 % SDS, the suspension was centrifuged at 12,500 g for 25
minutes. The pellet was then sonicated twice at the lowest setting in 100 mM sodium
bicarbonate, pH 9.0, 0.5 % SDS and centrifuged again. The pellet was then washed three
times in SDS 2 %, at least five times in sterile H20 and once in endotoxin free PBS to wash
out residual SDS. The final pellet was resuspended in endotoxin free PBS and aliquoted to
obtain a solution of 652 Jlg/ml synthetic hemozoin.
Hemozoin quantitation. Total heme content of hemozoin was determined, as described by
Sullivan et al. [73]. Parasite hemozoin or polymerized herne was incubated for 1 h in 2 %
149
SDS / 20 mM NaOH to solublize polymer into monomeric heme, which has a molar
extinction coefficient at 400 nm of 1 X 105.
HIV-l infection. After differentiation, MDDCs were plated at 1 x 105 cells in a final volume
of 100 JlI in 96-well plate. After treatment (or not, e.g. mock) with increasing concentration
of sHZ for 24 hours, cells were then infected with a fixed amount of virus (Le. 5 ng of p24
per 5 x 104 cells). Every 3 days and for a period lasting 9 days, half of the medium was
removed and kept frozen at 20 oC until assayed. Virus production was estimated by
measuring p24 levels in culture supematants by ELISA.
HIV-l transfer assay. Monocytes were differentiated in MDDCs in the presence of sHZ
(10 Jlg/ml) or LPS /IFN-y (100 ng/ml and 1,000 V/ml respectively) or without treatment
(Ctrl) with a cocktail of GM-CSF /IL-4 during 6 days. Inducing maturation of iMDDCs
with LPS/IFN-y is a well-known method previously described by others and was used here
as a positive control (11, 68). Later, those sHZ-fed MDDCs or mMDDCs were infected
with for one hour with fully infectious R5 NL4.3Balenv viruses. Next, the virus-cell
mixture was washed 3 times with PBS to remove unadsorbed virions and co-cultured with
autologous CD4+ T cells at a ratio of 1 : 3 in complete RPMI-1640 medium supplemented
with IL-2 (30 V / ml) in 96-well plates in a final volume of 200 JlL. Virus production was
estimated by measuring p24 levels in cell-free culture supematants every two days for a
period of 6 days. In another protocol uninfected MDDCs, differentiated in the same
conditions mentioned previously, were co-cultured with activated autologous CD4+ T cells
that have been infected for 2 hours with NL4.3Balenv and extensively washed.
Flow cytometry analysis. Before staining, cells were incubated for 15 minutes at 4 oC with
10 % pooled human sera to block nonspecific binding sites and washed once with
phosphate-buffered saline (PBS) supplemented with 0.5 % bovine serum albumin (BSA).
To monitor cell surface expression of CD83, DC-SIGN, HLA-DR and CCR7 on monocytes
and MDDCs, samples from various healthy donors treated or not with sHZ or LPS /IFN-y
were incubated with specific antibodies or with an appropriate isotype-matched irrelevant
control Ab (for non-specifie staining) for 30 min at 4 oC. CeUs were then washed with
150
PBS /0.5 % BSA and incubated with an appropriate R-PE- or FITC-conjugated goat anti
mouse IgG for 30 min at 4 oC. After two washes with PBS / 0.5 % BSA, ceIls were fixed in
2 % paraformaldehyde and analyzed by FACS (Epies ELITE ESP; CouIter Electronics).
Statistical analysis. ResuIts presented are expressed as means ± SEM of at least triplicate
samples. AlI of the experiences were repeated at least three times; each figure combines the
resuIts obtained with aIl the different donors unless otherwise mentioned. In figure 4B,
resuIts of five experiments were always used for these analyses even when resuIts of one
representative experiment were presented in a Figure. Because CCR5 expression levels
vary largely among various MDDC preparations, a repeated measures ANGV A test had to
be used. Statistical significance between groups was determined by analysis of variance.
Calculations were made with Prism version 3.03. P values < 0.05 were considered
statisticaIly significant. Mostly, statistical significance of the resuIts was defined by
performing a one-way analysis of variance with Dunnett's post tests to compare treated and
control samples or with Bonferroni' s post tests to compare aIl pairs of columns.
151
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kinases in HIV -1 transfer from dendritic cells to CD4+ T lymphocytes. J Immunol
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158
Figure legends
Figure 1. Differentiation of monocytes into MDDCs by adhesion of human PBMCs.
PBMCs were isolated from healthy blood donors, after two hours incubation
monocytes were selected by adherence, plated in six well plates (1 x 106 cells per ml) in a
final volume ofthree millilitres. MDDCs were then treated with sHZ (10 J.lg/ml) at day 0 or
with LPS/IFN-y (100 ng/ml and 1000 V/ml, respectively) at day 4. In all conditions GM
CSF (1000 V/mL) and IL-4 (200 V/mL) were added every two days to induce
differentiation of monocytes into MDDCs.
Figure 2. sHZ phagocytosis induces a transition al maturation pattern of human
MDDCs.
After six days in culture, cells were visually observed by inverted microscopy at
10 x magnification, drawn and treated for F ACS analysis for expression of specifie
dendritic cells maturation markers such as CD83, DC-SIGN, HLA-DR and CCR7. sHZ
phagocytosis significantly increases CD83 and CCR 7 expression and decreases expression
of DC-SIGN and HLA-DR. Results are mean ± SEM of several independent experiments (6
for DC-SIGN and HLA-DR, 3 for CD83 and 5 for CCR7). Statistical analysis was
performed on the results from all experiments. Asterisks denote statistically significant data
(*, P < 0.05; **, P < 0.01 and ***, P < 0.001).
Figure 3. sHZ-fed MDDCs transfer more efficiently HIV-1 to CD4+ T cells.
Immature MDDCs (Ctrl) and MDDCs treated with sHZ (10 J.lg/ml) or with
LPS/IFN-y (100 ng/ml and 1000 V/ml, respectively) were plated in 96-well plate and co
culture with activated CD4+ T cells in a ratio of 1 : 3, respectively. Prior to co-culture,
MDDCs were infected for one hour with fully infection R5 viruses (NL4.3Balenv). p24
concentrations were measured every two days for a period of six days. Compared to control
cells or LPS/IFN-y, sHZ-fed MDDCs significantly increase HIV -1 transfer to CD4+ T cells
at 2 and 4 dpcc. Results are representative of quadruplicates from three independent
experiments mean ± SEM. Statistical analysis was performed on the results from all
experiments. Asterisks denote statistically significant data (***, P < 0.001).
159
Figure 4. sHZ-fed MDDCs are less susceptible to HIV-l infection.
Immature MDDCs (Ctrl) and MDDCs treated with sHZ (10 flg/ml) or with
LPS/IFN-y (100 ng/ml and 1000 U/ml, respectively) were plated in 96-well plate (1 x 105
cells per well) and infected for with fully infection R5 viruses (NL4.3Balenv). p24
concentrations were measured every three days for a period of 12 days (A). Compared to
control cells, HIV -1 infection is significantly decreased in sHZ-fed MDDCs. AIso,
immature MDDCs were treated with sHZ (10 flg / ml) or with LPS/IFN-y and CCR5
expression on those cells was compared to untreated iMDDCs (Ctrl) by FACS analysis.
Donors are differentiated by sign co ding within different conditions (Ctrl, LPS/lFN -y and
sHZ) and their mean of CCR5 expression is identified with solid black bars. Results are
mean ± SEM of five independent experiments. Statistical analysis performed here are
presented as relative CCR5 expression of sHZ- or LPS/IFN-y-treated cells compared to
control cells. Asterisks denote statistically significant data (*, P < 0.05; **, P < 0.01).
Figure 5. sHZ-fed MDDCs promote replication in infected CD4+ T cells.
Immature MDDCs (Ctrl) and MDDCs treated with sHZ (10 Ilg/ml) were plated in
96-well plate and co-culture with CD4+ T cells in a ratio of 1 : 3, respectively. Prior to co
culture, CD4 + T cells were infected for two hours with fully infection R5 viruses
(NL4.3Balenv) and p24 concentrations were measured every two days for a period of six
days. Compared to control cells, sHZ-fed MDDCs significantly increase HIV-1 infection of
CD4+ T cells at 2 and 4 dpcc. Results are representative of triplicates from three
independent experiments. Statistical analysis was performed on the results from all
experiments. Asterisks denote statistically significant data (**, P < 0.01; ***, P < 0.001).
Figure 6. Schematic representation of the impact of HZ phagocytosis by MDCs on the
infection and dissemination of HIV -1 to CD4+ T cells.
In hurnans, malaria infection begins with the bite of an infected female Anopheline
mosquito (1). After standard development of sporozoites in hepatocytes (2) and invasion of
the merozoites forrn of Plasmodium species in red blood cells (3), free hemozoin is
phagocytosed by circulating monocytes (4). HZ-Ioaded monocytes travel to peripheral
160
tissues where they will differentiate into phagocytic cells upon inflammatory stimuli
(immature DCs or macrophages) (5). Monocytes-derived cells (MDCs) loaded with HZ
come in contact with infected or uninfected CD4 + T cells in peripheral tissues and may
promote their activation (6). At this stage, activation of CD4+ T cells increases the
possibility of uninfected cells to become infected by free virions or by trans-infection.
Following a second stimulus, activated HZ-MDDCs (with or without a second activation
stimulus) migrate to lymphoid tissues where they will also activate resting CD4+ T cells
and thus increase efficient transfer of HIV -1 that enhance viral infection (7).
161
Supplementary information
Figure SI. Impact of HZ phagocytosis by MD Ms on the infection and dissemination of
HIV -1 to CD4+ T cells.
PBMCs were isolated from healthy blood donors, after two hours incubation,
monocytes were selected by adherence. Fresh RPMI with 5 % autologous sera and M-CSF
(100 ng/ml) was added to the cell culture treated or with sHZ (10 J-lg/ml). After six days in
culture, cells were visually observed by inverted microscopy at 20 x magnification (A and
B). At this point, sHZ phagocytosis did not seem to alter monocytes differentiation in
MDMs. MDMs treated or not with sHZ (10 J-lg/ml) were plated in 96-well plate and co
culture with activated CD4+ T cells in a ratio of 1 : 3, respectively (C). Impact of sHZ
phagocytosis on HIV -1 infection was also monitored and showed a significantly decreased
(D). Finally, MDMs treated or not with sHZ (10 J-lg/ml) were co-cultured with infected
CD4 + T cells in a ratio of 1 : 3 (E). sHZ phagocytosis not only increased transfer from
MDMs to CD4+ T cells (C) but also increased infection in those cells (E). Experimental
procedures were followed as described for MDDCs. Results are representative of triplicates
from five independent experiments. Statistical analysis was performed on the results from
aIl experiments. Asterisks denote statistically significant data (*, P < 0.05; **, P < 0.01;
***, P < 0.001) ..
Figure 1
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162
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163
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165
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-Infected
Parasite Life Cycle Anopheles
Gan,biae in Human
CD4+ T Lymphocytes
4 _
Infected Macrophages
o CD4+ T Lymphocytes 0
167
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o~~~~~~~~~~~ o 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
DPI --- MOM-mock -o-MDM-HZ
o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
DPI ---Ctrl -o-sHZ
169
Chapitre VII. Discussion générale
« L'acquis ou ce qu'on croit acquis peut être un facteur d'inertie pour l'esprit. L'esprit
scientifique relate avant tout de la capacité de chacun à savoir poser des problèmes. »
Inconnu
Les chiffres concernant la co-infection du Plasmodium et du VIH-1 parlent d'eux
mêmes: l'épidémie mondiale du SIDA cause 5400 décès par jour en 2008 et la malaria
près d'un million de cas mortels, pour la plupart chez les enfants de moins de cinq ans. La
mobilisation croissante des recherches scientifiques sur ce sujet est donc spontanée et
authentique. Jusqu'à maintenant, la majorité des données scientifiques sont essentiellement
issues de recherches cliniques, lesquelles favorisent, à juste titre, les études sur la
transmission de la mère à l'enfant. Cependant, afin de comprendre les mécanismes
régissant la synergie évidente entre la malaria et le VIH-1/SIDA, et surtout potentiellement
néfaste pour l'hôte infecté, les études fondamentales offrent plusieurs possibilités. Parmi les
différentes avenues possibles, nous avons favorisé l'étude des pigments malariques (HZ)
sur la modulation de l'infection par le VIH -1.
Comme nous l'avons vu dans l' introduction, peu de données existent sur l'impact de
l'HZ sur l' infection du VIH-1 dans les cellules primaires constituant des cibles
préférentielles du virus. Cependant, la présence d'HZ dans les monocytes est associée à la
sévérité de la maladie [250]. Lors du cycle intra-érythrocytaire de l' infection au
Plasmodium, la dégradation de l'hémoglobine en globine représente la source majoritaire
de nutriments nécessaires au bon développement du parasite. Cette dégradation produit
également de grande quantité de molécules d'hème (ferriprotoporphyrine IX) qui, par sa
capacité de s'attaquer facilement aux membranes du parasite et de l'hôte, est cristallisée en
HZ par le Plasmodium. De nombreuses études stipulent que l'accumulation de ces
pigments dans les érythrocytes ainsi que leur phagocytose par les macrophages et les DC
humains, induit une détérioration de plusieurs fonctions cellulaires [235,277]. D'autres
études décrivent des résultats conflictuels sur l' impact de l'HZ sur le système immunitaire
170
de l'hôte, particulièrement sur la maturation et les fonctions des DC [227,239,278-280].
Cependant, il est important de noter que toutes ces études sont essentiellement effectuées
dans des modèles murins. Notre travail ne cherche pas à diminuer l'importance de ces
études mais à confirmer si ces observations sont facilement transposables à l'homme. En
effet, les préparations d'HZ issues du Plasmodium peuvent être potentiellement
contaminées par des débris de membranes, par des protéines ou encore par les GPI
(glycosylphosphatidylinositol) ce qui peut camoufler le véritable impact de l'HZ. En effet,
les mérozoïtes parasitaires qui s'adhèrent aux globules rouges, se réorientent par rapport à
la membrane érythrocytaire et modifient les structures membranaires pour envahir les
hématies en formant des vacuoles parasitophores. Ils échappent alors aux anticorps.
Plusieurs protéines parasitaires sont impliquées dans ce processus complexe (par exemple
MSP-1) [281]. Quant à lui, le GPI serait impliqué dans la libération de médiateurs pro
inflammatoires au moment de la rupture des schizontes [281]. Dans le but de n 'étudier que
l'effet de l'HZ sur les cellules myéloïdes, nous avons choisi d'utiliser une forme purifiée
des pigments malarique à savoir l'HZ synthétique. Les pigments d'HZ peuvent également
être purifiés directement à partir de culture de Plasmodium falciparum. Cependant, n ' ayant
pas eu l'occasion de mettre en place ce protocole dans notre laboratoire, nous avons choisi
d'établir une collaboration avec le Dr. David J. Sullivan Jr. (Malaria Research Institute,
Université Johns Hopkins, États-Unis) afin de nous les procurer et de les comparer à nos
préparations d'HZ. Sachant, que l'HZ synthétique (sHZ) et native (PfHZ) sont intemalisés
de façon similaire par les phagocytes [282-284], notre choix a été réconforté par le fait que
l 'HZ purifiée pouvait augmenter significativement la maturation des DC [238].
À notre connaissance, aucune étude scientifique ne relate de l'impact des pigments
malarique sur l'infection du VIH -1 dans les cellules humaines. Cependant, une étude
réalisée sur des rhésus macaques (Macaca mulatta) infectés par le SIV, a toutefois
démontrée que l' sHZ pouvait induire une activation immunitaire promouvant une
augmentation de la réplication virale dépendante de l'expression de TNF -Q [285]. Nos
objectifs étaient donc d'identifier les mécanismes impliqués dans la modulation de
l'infection du VIH-1 suite à une phagocytose de l'HZ par les macrophages (1) et les DC (2)
isolés à partir de PBMC de donneurs sains, et de mettre en place un modèle de co-culture
171
illustrant le rôle de ces cellules phagocytaires dans la dissémination du VIH -1 aux
lymphocytes T CD4+ (3).
1 La phagocytose de l'sHZ rend les MDM moins permissifs à
l'infection du VIH-l
Alors qu'aucune donnée n' existe sur la co-infection dans les macrophages humains,
la phagocytose des pigments d' sHZ a pourtant été associée à plusieurs altérations de la
réponse immunitaire de l'hôte. En effet, la réponse inflammatoire déclenchée par les
pigments malariques provoque une augmentation de la sécrétion de cytokines et de
chimiokines spécifiques (ex: TNF-a, IFN-y, MIP-l /CCL3, MIP-1 /CCL4, MIP-2/CXCL2
et MCP-l/CCL2) [241,257].
Les intermédiaires réactifs de l'oxygène . sont formés en permanence dans les
mitochondries et dans les phagolysosomes au cours de la phagocytose. Ces dérivés actifs de
l'oxygène participent à la destruction de nombreux microorganismes. La capacité des
macrophages à produire ces composés radicalaires dépend de leur état d'activation ainsi
que leur environnement cellulaire. En effet, l'explosion respiratoire est déclenchée et
n'atteint un niveau efficace qu'après activation des macrophages par des cytokines telle que
l'IFN-y ou TNF-a [286,287]. Ces cytokines servent d'agent stimulateur en se fixant sur un
récepteur transmembranaire adéquat; l'IFN-y (dépendante de la sécrétion d'IL-12) favorise
le recrutement de macrophages et le TNF -a activent non seulement les autres monocytes,
mais aussi les polynucléaires neutrophiles.
A partir de là, une cascade d'événements se produit afin d'éliminer les corps
étrangers présents selon une voie dépendante de l'oxygène (l 'explosion oxydative ou
oxydative burst). Brièvement, une protéine kinase (e.g. Phosphoinositide 3-kinases ou
PI3K) phosphoryle les phospholipides qui seront par la suite dégradées par la
phospholipase C, pour générer deux messagers: le IP3 (un activateur du taux de Ca2 +
intracellulaire) et diacylglycérol (un activateur de serine/thréonine kinases C ou PKC). Les
PKC favorisent l'activité productrice de la NADPH oxydase en synthétisant de l'anion
172
superoxyde. En effet, la NADPH oxydase est un complexe enzymatique membranaire
localisé à la membrane plasmique ou au phagosome permettant la production d'anions
superoxydes en transférant un électron qui s'associe aux molécules d'oxygène. Ces anions
superoxydes sont les précurseurs d'autres espèces oxygénées comme le peroxyde
d 'hydrogène aboutissant à la destruction des micro-organismes. Si ces produits sont libérés
de façon exagérée dans le milieu extracellulaire, ils peuvent engendrer des dommages
cellulaires comme décrit dans le cas de l'HZ (inhibition de la PKC, augmentation de la
production d'oxyde nitrique, modulation de l'expression de cytokine, dommage de la
phagocytose etc.) [212,288-293]. En premier lieu nous avons donc voulu suivre les étapes
de la phagocytose de l'HZ par les MDM humains afin d'observer si les cellules contenant
de l'HZ étaient capables de subir une infection classique au VIH-l. Pour ce faire nous
avons visualisé la phagocytose de l' sHZ en temps réel sur une période de 24 heures. Les
résultats qui ont découlés de cette expérience nous ont permis de conclure que les MDM
étaient prompts à phagocyter l' sHZ et que ces derniers pouvaient également être infectés
par des souches virales marquées à la GFP. De plus, notre étude était contraire aux
expériences relatant l'incapacité des macrophages murins à subir un deuxième cycle de
phagocytose après l'ingestion de l'sHZ. Les phagosomes regorgeant d'sHZ pouvaient
également interagir avec la machinerie endosomale sans toutefois en déclencher sa
dégradation.
De façon inattendue, des expériences d'infection ont distinctement démontré que les
MDM ayant phagocytés de l'sHZ sont significativement moins permissifs à l'infection
virale. En effet, en prétraitement à l'infection, l'sHZ inhibe de façon dose-dépendante la
production de nouveaux virions. Le fait que la phagocytose de l' sHZ n'affecte pas
l'infection virale lorsqu'ils sont ajoutés après le virus, démontre que les pigments n'altèrent
pas la viabilité de nos cellules et que le mécanisme responsable de ce phénomène doit
nécessairement avoir lieu lors des étapes précoces du cycle viral. Nos études nous ont
permis de démontrer que la phagocytose d'sHZ par les MDM affecte une étape du cycle
viral située entre la réverse transcription et l'intégration du VIH -1 dans le génome
cellulaire. L'intégration virale est dépendante de la formation de l'ADN Flap, dernière
étape de la rétrotranscription, qui signale la décapsidation permettant ainsi l' import de
173
l'ADN viral dans le noyau [57]. Il est possible que la phagocytose de l'sHZ, pouvant
représenter jusqu'à 75% du volume cellulaire, génère un stress empêchant la translocation
du complexe de transcription inverse (RTC) dépendant de protéines virales (ex: V pr) et
cellulaires [294-296]. Le transport actif du VIH-1 met en jeu un signal de localisation
nucléaire (NLS) présent sur la séquence primaire du cargo à transporter, et des facteurs
cellulaires, les karyophérines (ou importines), qui forment une famille de protéines régulant
les échanges nucléocytoplasmiques [297]. Les importines u, capables de reconnaître les
séquences de localisation nucléaire présentes sur les protéines à destination du noyau,
s'associent aux importines B afin de permettre leur transport à travers le complexe du pore
nucléaire (CPN) [298]. Afin de se rendre au noyau, le complexe de pré-intégration (PIC) du
VIH -1 doit donc faire face à l'importante viscosité du cytoplasme, au sein duquel le
mouvement des macromolécules par simple diffusion est sûrement très limité et ne
permettrait pas un ciblage vers une destination cellulaire précise. La localisation du PIC
vers la région périnucléaire résulte donc plutôt d'un transport actif le long du réseau
microtubulaire. Alors que la présence des pigments d'HZ n'ont jamais été associés à une
défaillance du cytosquelette microtubulaire, il n'est pas impossible d'imaginer que leur
phagocytose pourrait déstabiliser le transport protéique à l'intérieur des cellules. Une toute
autre hypothèse suggère que l'établissement d'un stress oxydatif provoque une diminution
de la production d'ATP [299,300] qui est essentielle à la translocation du complexe de pré
intégration viral. En effet, des études préliminaires montrent que la production d' A TP est
inversement proportionnelle à l'ajout d'sHZ. Les détails de cette observation seront
discutés plus en profondeur dans les perspectives.
Ces résultats suggèrent que les interactions entre le Plasmodium et le VIH-1 sont
éminemment complexes. En effet, l'augmentation de la charge virale décrite lors d'études
épidémiologiques et cliniques ne semble pas provenir du priming du MDM suivant la
phagocytose de l'HZ. Par conséquent, nous avons décidé de poursuivre nos investigations
en étudiant l'impact de la phagocytose de l' sHZ dans les DC ainsi que dans des systèmes
plus complexes de co-cultures.
174
2 L'sHZ induit une maturation des De immatures similaire à
celle induite par le LPSIIFN-y
L'infection au VIH -1 est associée à une hyperactivation du système immunitaire
résultant invariablement à une immunosuppression favorisant l'apparition d'infections
opportunistes. Il a été prouvé que l'activation du système immunitaire est partiellement due
à une translocation microbienne ayant lieu aux muqueuses déjà naturellement vulnérables
au VIH-1 [301]. La présence des produits microbiens dans les tissus et la circulation
sanguine active les cellules du système immunitaire inné (macrophages et cellules
dendritiques) favorisant ainsi la stimulation des lymphocytes T CD4+. Ce mécanisme est
bénéfique pour le VIH-1 car les cellules T CD4+ sont les cibles les plus permissives à la
réplication virale. Malgré l'existence de données controversées sur la réponse des DC à la
phagocytose de pigments malariques, l'impact de l' sHZ sur l'infection et la dissémination
du VIH-1 demeure inexploré. Nous avons donc voulu connaitre les conséquences de l'ajout
d'sHZ sur les DC immatures différentiées à partir des monocytes issues des PBMC de
donneurs sains.
Il est maintenant bien accepté que les DC et le VIH -1 intéragissent via des
interactions complexes et multiples. Une fois capturée par les DC immatures, les particules
virales peuvent demeurer dans des corps multivésiculaires, être maintenues à la surface
cellulaire grâce à leur liaison avec des lectines de type C et/ou être intégrées comme
provirus par l'intermédiaire des récepteurs CD4 et CCR5 [24,25]. Notre étude démontre
que la phagocytose de pigments d'sHZ par les DC immatures induit une activation similaire
à celle observée lors de l'ajout d'un cocktail LPS/IFN-y. En effet, ces cellules sont
caractérisées par le phénotype suivant: DC-SIGN- CD83+ HLA-DR+ CD86low CD80low
CD54low CCR7+ CCR5- (Fig. 1 chapitre 5 et Annexe 2). Cependant, il est important de noter
que l'expression de CD86, CD80 et CD54 était moins fortes que celle obtenue par le
traitement avec le LPS et l'IFN-y. Le fait que ce phénotype n'a pas été reporté dans la
littérature ne facilite pas l'interprétation de nos résultats. Cependant, il a été récemment
publié que l'induction de l'expression des molécules telles que CD86 et HLA-DR en
l'absence de l'expression de CCR7 et CD83 favorisait un phénotype d'activation de la DC
tout en la séquestrant au site d'inflammation [302]. Si l'on effectue le raisonnement
175
inverse, on peut supposer que la phagocytose des pigments d' sHZ favorise la migration des
DC aux organes lymphoïdes secondaires sans toutefois lui conférer un phénotype complet
d'activation. Ceci pourrait partiellement expliquer son accumulation dans les tissus tels que
la rate et le foie.
Alors que la phagocytose des pigments d'sHZ présente un profil de maturation
similaire à celui observé lors d'un traitement LPSIIFN-y, on observe pour ces deux
conditions une augmentation du transfert précoce (ou trans) du VIH-1 aux cellules T CD4+.
Cependant nos résultats suggèrent que les mécanismes impliqués dans le transfert viral
n'impliquent pas les mêmes voies de signalisation lorsque les cellules sont traitées à l' sHZ
ou au LPS/IFN-y. En effet, lors d'une stimulation au LPS, le TLR-4 interagit avec les
molécules MD2 et CD14 pour activer la voie NF-KB [303,304]. Cette activation des DC est
en partie secondaire à la production de cytokines comme les IFN de type 1 favorisant
l'augmentation de la dissémination du VIH-1 aux cellules T CD4+. Les cascades de
signalisation déclenchées lors d'une stimulation à l' sHZ sont encore peu connues. Les
cytokines et chimiokines sécrétées par la phagocytose des pigments d' sHZ et autres
protéines parasitaires du Plasmodium falciparum (ex: IFN-y, TNF-a, IL-12, IL-1~, IL-6,
MIP-1a et ~, IL-10, IL-12 et MlF) est important ,pour déterminer l'issue de la réponse
immunitaire incluant l'activation et la différentiation des cellules T CD4+ [238,305-309].
En effet, certaines cytokines pro- et anti-inflammatoires sont décrites pour moduler la
réplication du VIH-1 : TNF-a [310,311], IL-1~ [312], IL-6 [312-315] et IL-10 [311,316-
318]. Les effets des cytokines sur l'infection par le VIH -1 peuvent être de type inhibitrice,
stimulatrice ou biphasiques, en fonction de la concentration, du lieu de la sécrétion et du
moment auquel elles sont produites par rapport à l'infection virale [319].
La maturation des DC rend celles-ci mOIns permIssIves à l'infection virale
[120,320]. La principale hypothèse de ce phénomène concerne l'inhibition de l'expression
du corécepteur CCR5 à la surface des DC matures. Ainsi, les DC immatures expriment
principalement le CCR5 et lorsqu'elles deviennent matures, l'expression du CCR5 diminue
tandis que l'expression du CXCR4 prédomine, un phénomène important pour la migration
vers les organes lymphoïdes secondaires [118,321,322]. Alors que la dissémination du
176
VIH-1 est réduite de 80% après le traitement à l'EFV (inhibiteur de la transcriptase du
VIH-1) des DC matures (LPS/IFN-y), on n'observe toutefois qu'une inhibition de 50% du
transfert viral après un traitement à l' sHZ. Il a été déterminé que l'expression de cytokines
pro-inflammatoires induite par la présence d'HZ pourrait contribuer à une hausse de la
réplication virale [178]. Ces résultats suggèrent qu'une partie de la dissémination virale
s'effectue à partir de virus liés à la membrane et l'autre à partir de virions nouvellement
synthétisés. Effectivement, l' sHZ inhibe de façon dose-dépendante l'infection virale dans
les DC. Dans le contexte des macrophages, nous avons déjà démontré que le cycle viral
était affecté par la phagocytose d' sHZ. Il est fort possible que les mêmes phénomènes aient
lieu dans les De. Or, comme l'inhibition est plus marquée à partir du jour 9 post-infection,
alors la réinfection semble davantage compromise que l'infection initiale. Par conséquent,
nous avons voulu savoir si les pigments malariques pouvaient réguler à la baisse
l'expression du corécepteur CCR5. Les résultats démontrent que seulement 5% de DC
expriment le CCR5 en comparaison aux DC immatures après 48h. Probablement que
l'expression disparait complètement à plus long terme ce qui empêche toute réinfection,
cependant cette supposition demande confirmation. De façon contradictoire, une
surexpression de CCR5 dans les macrophages placentaires a été noté lors de l'infection au
Plasmodium [178]. Les différences observées entre l'infection dans les DC maturées en
présence d'sHZ ou de LPS/IFN-y peuvent s'expliquer de différentes façons. En effet,
comme observé pour les macrophages, la sécrétion d'IFN de type 1 pourrait expliquer
l'inhibition de l'infection virale des DC suite à un traitement au LPS [323-325]. En effet, la
sécrétion d'IFN de type 1 inhibe la réplication du VIH-1. Par contre, dans nos conditions,
l'HZ ne semble pas induire la production de ce type d'IFN.
3 Les changements phénotypiques induits par l'sHZ dans les
cellules phagocytaires dérivées de monocytes augmentent le
transfert du VIH-l aux cellules T CD4+
Nous avons choisi d'étudier le concept de co-infection dans le cadre où la
phagocytose de l'HZ pouvait avoir un impact soit sur les cellules immunitaires de l'hôte
préalablement infectés (1) ou encore sur les monocytes, De et macrophages qui vont être
177
infectées par le VIH-1 (2). Les monocytes étant les premières cibles de l'accumulation de
l 'HZ chez l'hôte, nous avons cherché à comprendre si cette dernière pouvait augmenter
l ' infection virale dans ces cellules minoritairement considérés comme cible du VIH -1 . En
étudiant les dommages que pouvait provoquer l ' infection du VIH -1 sur les populations
cellulaires de l'hôte, une étude clinique à démontrée que l ' augmentation d ' un sous-groupe
de monocytes (CD 163 + CD 16+) corrélait avec la quantité de virus présent dans le sang de
patients infectés [90]. Ceci peut être expliquer par la présence d'une plus grande expression
de CCR5 et d 'APOBEC3G de haut poids moléculaire, la forme de faible poids moléculaire
étant reconnue pour induire une résistance à l' infection du VIH -1 dans les monocytes
CD16- [326]. En se basant sur ces nouvelles informations, nous voulions savoir si la
phagocytose de l'sHZ par une population composite de monocytes isolés à partir de PBMC
pouvait aggraver l' infection virale. Cependant, avant et après la phagocytose d'sHZ nous
n'avons pu doser une infection virale appréciable. Il serait donc intéressant de répéter nos
expériences en utilisant des monocytes CD16+. De plus, la phagocytose de pigments d ' sHZ
sur des macrophages infectés et sur une population de lymphocytes T CD4+ n 'a eu aucun
effet sur l ' infection virale.
Pour avoir un impact sur le cycle viral, l'HZ doit donc être phagocyté. Cependant
étant donné la faible présence de macrophages dans la circulation sanguine, nous avons
développé un nouveau modèle de différentiation de monocytes, lesquels ont été
préalablement exposés aux pigments malariques. Les cellules ainsi différenciées en
macrophages ou en DC ont ensuite été mises en co-culture avec les lymphocytes T CD4+
activés provenant du même donneur. Après avoir été infecté par le P. falciparum, l 'HZ,
grâce à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, déclenche le recrutement de
monocytes (différentiés en macrophages ou en DC) et de neutrophile [306] détecté dans le
foie [327] et dans le placenta [181]. Contrairement aux résultats précédents, nous avons
démontré que la phagocytose de pigments malariques par les monocytes différentiés en DC
(sHZ-MDDC) induit un profil de maturation intermédiaire lorsque comparé avec des DC
immatures et matures (LPS/IFN-y). En effet, ces sHZ-MDDC présentent le phénotype
suivant: DC-SIGN1ow CD8310w HLA-DR- CD86- CD80- CD54- CCR7/oW CCR5- (Fig. 2
chapitre 6 et Annexe 3). Cependant, après stimulation au LPS/IFN-y, les sHZ-MDDC
178
possèdent un profil de maturation similaire aux monocytes différentiés en DC matures (Fig.
S2 chapitre 6). Les divergences entre nos résultats et ceux publiés dans la littérature sont
dues à l'utilisation d'HZ purifiée plutôt que des érythrocytes contenant de l'HZ. Les
infections par Plasmodium sont caractérisées par une augmentation significative du
pourcentage de macrophages apoptotiques. Pendant l'infection, les macrophages ingèrent
une grande quantité de globules rouges parasités (GRP) et accumulent ainsi dans leur
cytoplasme de l'HZ. Des résultats récents non publiés indiquent que la phagocytose de
GRP, mais pas de l'HZ ou de GRS, déclenche l'apoptose des macrophages et la sécrétion
de facteurs immunosuppressifs solubles inhibant la prolifération des cellules T CD4+ et
CDS+ [328]. Des travaux sont en cours pour identifier les voies de signalisation impliquées.
Il est intéressant de noter, qu'en l'absence de traitement au LPS/IFN-y, un
pourcentage non négligeable de sHZ-MDDCs exprime le récepteur de chimiokines CCR7
indispensable pour la migration et l'entrée de ces cellules dans les organes lymphoïdes
secondaires [120,329,330]. Ceci implique que la phagocytose de l' sHZ provoque une
différentiation des monocytes en DC, certes différente de celle induite par la présence de
LPSIIFN-y, mais toutefois capable d'inciter une interaction avec les lymphocytes T CD4+
présents dans les organes lymphoïdes secondaires. La mise en co-culture de sHZ-MDDC en
présence de lymphocytes T CD4+ autologues induit une augmentation du transfert viral de
37 et 14 fois à 2 et 4 jours respectivement. Comme décrit précédemment, les cytokines et
chimiokinessécrétées suite à la phagocytose d' sHZ peuvent expliquer cette importante
dissémination virale aux cellules T CD4+. Les mêmes tendances ont également été
observées pour l'infection des MDDC. Ainsi, les monocytes différentiés en présence d' sHZ
voient leur infection au VIH-l diminuer de plus de 40% et ce peu importe qu' ils deviennent
des macrophages ou des DC.
Afin de mIeux interpréter nos résultats, nous voulions savoir si les pigments
malariques pouvaient stimuler la prolifération des lymphocytes T CD4+. En effet, en
comparaison aux monocytes et macrophages, l'expression d' IL-12 est fortement induite par
les DC favorisant ainsi la stimulation des lymphocytes T CD4 +. Au contraire, lorsque les
DC sont stimulées par le LPS ou le TNF -u, elles sont moins efficaces à induire une
179
production d'IL-12 [331]. Alors que les MDDC matures (LPS/IFN-y) n'ont aucun effet sur
la prolifération en comparaison aux MDDC immatures, la phagocytose de pigments d'sHZ
induit une augmentation de l'index de prolifération (de 1.6 à 2.4) des lymphocytes T CD4+
probablement du à une forte expression de TNF-a, d'IL-12, de MCP-1 et d'IL-6 [331]. En
considérant ces résultats, il est donc logique de penser que la présence d' sHZ dans les DC
rend celles-ci plus efficace dans leur capacité à stimuler et donc amplifier la réplication
dans les lymphocytes T CD4+ préalablement infectés. Ainsi nous avons mis en culture des
sHZ-MDDC non-infectés en présence de lymphocytes T CD4+ infectés. Confirmant nous
résultats, nous avons observés une augmentation de l'infection virale ('" 3 fois) qui est
possiblement imputable à une stimulation des sHZ-MDDC sur la prolifération des
lymphocytes T CD4+. En effet, les pigments malariques ne pouvant être dégradés, les DC
ne serviront pas de cellules présentatrices antigéniques mais seront stimulées par la
présence d'HZ afin de générer un environnement favorable à l'activation des cellules T
CD4+ afm de répandre l'infection du VIH-1.
Ces observations ont également été effectuées avec les monocytes différenciés en
macrophages en présence de pigments malariques (Fig S3 chapitre 6). Au même titre que
les macrophages différentiés, les monocytes sont capables d'assurer l'entrée virale jouant
ainsi un rôle dans la dissémination du VIH-l [89,95]. Les monocytes différentiés en
macrophages en présence de pigments d'sHZ (sHZ-MDM) sont visuellement et
phénotypiquement identiques aux MDM contrôles (CD141ow HLA-DRlow CD1a- DC
SIGN-) (Annexe 4). Cependant, lorsque les sHZ-MDM sont mis en co-culture avec des
lymphocytes T CD4+ autologues, le transfert viral est significativement accentué (1.5; 8;
56; 5 et 1.2 fois plus important comparé au MDM contrôles aux jours 2, 4, 6, 9 et 12
respectivement). Nous savons que la présence d'HZ dans les MDM altère significativement
l'infection virale en bloquant le cycle du VIH-1 à une étape cruciale située entre la réverse
transcription et l'intégration. Ceci implique donc que les MDM possèdent, tout comme les
DC, la capacité de disséminer le VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ sans nécessairement être
infectés. En effet, dans ces expériences de transfert nous rappelons que les MDM sont mis
en contact avec le virus pendant une heure et que les virus attachés à la membrane cellulaire
sont éliminés par un traitement à la trypsine. De plus, une étude récente a montré que les
180
virions assemblés dans des vésicules intracellulaires de macrophages primaires pouvaient
rester infectieux sur de longs laps de temps [98]. Effectivement, des virus isolés de lysats
cytoplasmiques peuvent activement infecter en trans des lymphocytes six semaines après
l'inhibition de la réplication virale. Alors que le traitement d'sHZ effectué directement sur
les MDM favorise son accumulation dans plus de 90% des cellules, lors de la
différentiation des monocytes en présence de pigments malariques approximativement 600/0
des MDM semblent contenir de l'HZ favorisant ainsi l'infection virale d'une plus grande
portion de la population. La production de virions dans les MDM contrôles et les sHZ
MDM suivent la même tendance jusqu'à neuf jours post-infection. Cependant, à plus long
terme la présence d'sHZ rend les MDM significativement moins permissifs au VIH-I.en
effet, à 12 jours post-infection, seulement 24% des sHZ-MDM sont infectés par le VIH-l.
Des résultats préliminaires suggèrent que l'augmentation du transfert viral serait
principalement dépendant des cellules n'ayant pas phagocytées d'HZ. En effet, après avoir
traité les MDM avec de l'EFV, on observe une inhibition significative de l'infection virale.
Par conséquent, les MDM ayant phagocytés l'HZ induisent une sécrétion de cytokines
capables d'activer les lymphocytes T CD4+, et donc de favoriser le transfert du VIH-l à
partir des cellules non affectées par la phagocytose des pigments malariques.
La phagocytose de l' sHZ par une population composite de monocytes différentiés
en DC et en macrophages déclenche ainsi une réponse immunitaire suffisamment
importante pour induire la sécrétion de cytokines favorisant la prolifération des
lymphocytes T CD4+. Cette réponse a pour conséquence une augmentation significative du
transfert viral et de l'infection des lymphocytes T CD4+.
4 Interactions possibles entre les pigments malariques et le
VIH-l dans le cerveau
Par des mécanismes encore inconnus, nous savons que les pigments malariques,
après être libérés dans la circulation sanguine, s'accumulent dans des organes vitaux tels
que le cerveau. Le VIH -1 peut également atteindre le cerveau, principalement lorsque le
taux de CD4 est bas. En effet, le système immunitaire et le cerveau sont deux cibles
181
préférentielles de l'infection virale dans l'organisme. Par ailleurs, le cerveau est
fréquemment considéré comme un sanctuaire du VIH-1, c'est-à-dire un tissu non
complètement atteignable par les traitements actuels. On observe deux situations bien
distinctes : l'atteinte neurologique au cours de la primo-infection, et l'atteinte cérébrale
tardive. L'encéphalopathie à VIH -1 peut prendre différentes formes. A un stade précoce,
l'atteinte est modérée, s'exprimant par des troubles de l' attention ou de la concentration,
affectant les activités les plus élaborées de la vie quotidienne, sans maux de tête ni fièvre.
Plus tard, les signes sont plus sévères, avec troubles cognitifs plus importants (ex:
désorientation dans le temps et dans l'espace, perte de mémoire et difficulté d'élocution)
parfois associés à des troubles moteurs, des crises convulsives voire des troubles de
conscience. Par infiltration des macrophages infectés, la protéine gp 120 serait directement
impliquée dans la neuro-dégénérescence des patients atteins du SIDA. En effet, il a été
prouvé que cette protéine virale pouvait entraîner la mort de certains neurones adultes et
bloquer la fabrication de nouveaux neurones en empêchant la division des cellules souches
neuronales dans l'hippocampe, région cruciale pour la mémoire et l'apprentissage [332].
De plus, l' analyse physiopathologique de patients atteint de malaria sévère à mise en
évidence la présence de sites d'inflammation entrainés par l' accumulation de macrophages
ayant phagocytés de l'HZ, de neutrophiles et des cellules plasmiques [333]. Les effets du
TNF-a en synergie avec d'autres cytokines pro-inflammatoires dans la régulation et
l'augmentation des récepteurs d'adhérence des cellules endothéliales est un autre facteur
contribuant à la pathogénèse de la malaria cérébrale [334]. En conclusion, par les cytokines
et chimiokines produites suite à la présence des pigments malariques, il serait intéressant de
savoir si la malaria pourrait contribuer à l'accélération de l'encéphalopathie induite par le
VIH-1.
5 Perspectives à court terme
150
J!:100 C
8 50
a
/? ~.
Figure 21: Dosage de l'ATP intracellulaire dans les MDM
182
Dans un premIer temps nous
souhaitons approfondir nos études
concernant l'impact des pigments
malariques dans les macrophages
humains. En effet, nous avons
observé que l'internalisation de
l' sHZ bloquait le cycle viral du
VIH -1 à une étape située entre la
transcription Inverse et
l'intégration. Nous voudrions
effectuer des expériences
similaires dans les DC afin de
savoir si les mêmes tendances
peuvent y être observées. De plus, nous souhaiterions mieux identifier le(s) mécanisme(s)
impliquée s) dans l'inhibition du cycle viral. Notre hypothèse principale était que le stress
oxydatif induit par la phagocytose d'sHZ provoquait une diminution de la production
d' A TP essentielle à la translocation du complexe de pré-intégration viral. Des études
préliminaires effectuées sur trois donneurs indépendants montrent que la production d' A TP
est inversement proportionnelle à l'ajout d' sHZ (Fig. 21). La production de nitrique oxyde
(NO) étant difficilement mesurable dans les macrophages humains nous prévoyions
d'effectuer une analyse en cytométrie de flux en dosant les molécules suivantes: la
dichloro-fluorescéine (DCF) ou la dihydro-méthidine. En effet, la mitochondrie génère
l'énergie sous forme d'ATP grâce au processus de phosphorylation oxydative qui a lieu au
niveau de la membrane interne et les ROS peuvent faciliter la perturbation de la membrane
mitochondriale et favoriser ainsi l'ouverture des canaux. Dans la mesure où l'ouverture de
ces pores interfère avec le transport d'électrons de la chaîne respiratoire ainsi qu'avec la
production de l' A TP, il serait alors possible de mesurer la DCF qui est reconnue comme
étant une technique efficace dans l'évaluation de l'état d'oxydoréduction de la cellule.
Ainsi, en observant une augmentation de l'expression de la DCF on pourrait en conclure
183
que la diminution d'ATP intracellulaire dans nos MDM serait attribuable à l'induction d'un
stress oxydative causé par l'HZ.
Deuxièmement, nous avons émis l 'hypothèse que le transfert viral de la DC aux
lymphocytes T CD4+ pouvait être accru à cause de la place que prenait l'HZ dans la cellule.
En effet, la proximité du virus à la membrane plasmique, causée par la grosseur importante
des phagosomes contenant l'HZ, suggère qu'il pourrait être important de vérifier la
fonctionnalité des importines et des mécanismes de transport intracellulaire en présence
d'HZ. Pour ce faire, il faudrait alors utiliser des techniques pointues de microscopie afin
d'observer la dynamique et la flexibilité de polymères cellulaires telle que les microtubules
et les filaments d'actine favorisant le transport du virus au noyau (analogues structuraux du
phosphate). Ces techniques étant semi-quantitatives, on pourrait suivre le génome viral par
des approches d'hybridation à l'aide d'une sonde ADN fluorescente. Cependant, il a été
rapporté que ces études étaient limitées par la sensibilité de la méthode nécessitant souvent
de fortes quantités de virus altérant l'interprétation des résultats [298]. Une autre technique
pourrait être le fractionnement cellulaire couplé à l'identification des complexes protéiques
viraux et cellulaires par immunobuvardage. Cependant, nous avons démontré dans des
études préliminaires non publiées que la présence d'HZ influençait l'isolement des
organelles cellulaires en modifiant leur gradient de densité. La technique favorisée reste
donc l'utilisation d'une protéine de fusion GFP-Vpr fluorescente incorporée dans les
particules virales afin de suivre le comportement intracellulaire de particules du VIH-1 dans
les cellules infectées [56].
Finalement, nous souhaiterions connaître les conséquences de la surexpression du
récepteur CXCR4 sur les DC induite par la phagocytose des pigments malariques (Fig. 2).
Effectivement, lors de l'analyse phénotypique des DC, traitées ou différentiées en présence
d'sHZ, nous avons remarqué une hausse significative de l'expression du récepteur CXCR4.
Il est connu que les DC immatures expriment principalement CCR5 et lorsqu'elles
deviennent matures, l'expression du CCR5 diminue tandis que l'expression du CXCR4
prédomine. Par conséquent, pour les macrophages nous nous attendrions à obtenir des
résultats similaires que ceux observés lors de l'infection avec un virus R5-tropique.
CXCR4
75
01----"111..-Ctrli LPS1IFN-'v 5HZ
Figure 22: Expression du CXCR4 dans les DC
aux lymphocytes T CD4+.
184
Cependant, contrairement aux
lymphocytes T CD4+, les DC
in vivo et in vitro sont
faiblement infectées par le
VIH -1. Ceci pouvant être
expliqué par l ' incapacité de
ces cellules à fusionner
efficacement avec des
souches virales X 4-tropiques,
il se pourrait que cette
augmentation n'ait aucun
impact sur le transfert viral
185
6 Perspectives à long terme
L'étape la plus ardue et probablement la plus importante sera d'identifier les profils
de sécrétion de cytokines et de chimiokines induits par la présence d'HZ dans les cellules
phagocytaires. Pour ce faire, dans les différentes étapes de mono et de co-cultures, nous
avons récolté les sumageants afin de les analyser au Luminex™ [335]. La Technologie
Luminex™ est une technologie récente qui, fondée sur le principe de la cytométrie en flux,
allie l'utilisation de microsphères fluorescentes et une double lecture après excitation par
deux lasers. Actuellement, un panel de 100 billes renfermant un ratio différent de
fluorescence rouge et orange est utilisable. Ces différentes billes peuvent être couplées à
leur surface avec des anticorps, permettant ainsi la détection de cytokines in vitro et in vivo.
Par conséquent, nous pourrions étudier, dans un contexte de co-infection, les cytokines
connues pour moduler l'infection rétrovirale du VIH-l (ex: IL-l, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6,
IL-10, IL-12, IL13, TNF-a et p, TGF-p, IFN-a, IFN-p et IFN-y) et la parasitémie lors d'une
infection par le P. falciparum (IL-lP, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, MIP-la et p,
TNF-a et ~, RANTES, TGF-p, MlF, IFN-y et MCP-l). Cette étude nous permettra ainsi
d'identifier l'influence d'un tel l'environnement dans nos modèles de co-infection.
Les monocytes ne sont pas les seules cellules sanguines à phagocyter l'HZ.
D'ailleurs, l'activation des neutrophiles par les pigments malariques serait impliquée dans
la pathologie de la malaria. En effet, l' sHZ induit une forte expression de MIP-2 (IL-8 chez
l'humain impliqué dans le recrutant des neutrophiles) et l'induction d'une activité
myélopéroxydase, enzyme clé du métabolisme oxydatif et de la réaction inflammatoire
[250]. Les polynucléaires neutrophiles (PN) jouent un rôle majeur dans la défense de
l'organisme contre différents agents pathogènes. Cependant stimulés de façon excessive ou
inapropriée, ils sont source d'une importante quantité de formes réactives de l'oxygène
(FRO) libérées dans le milieu environnant et susceptibles d'entraîner des lésions tissulaires
sévères. Il serait donc intéressant d'étudier l'impact de la phagocytose des pigments
malariques par les neutrophiles et leur portée sur les cellules infectées par le VIH -1.
N os études ont avant tout démontrées que pour reproduire efficacement le contexte
d'une co-infection, il était primordial d'utiliser des systèmes complexes de co-cultures. À
186
plus long terme nous aimerions étudier l'impact de l'HZ dans un modèle ex vivo
d'amygdales humaines. L'avantage de ce modèle est qu'il contient différents types de
cellules du système immunitaire pouvant interagir entres eux. En effet, notre laboratoire à
développé un système où des blocs d'amygdales provenant de patients sont déposés dans
un transwelllui-même déposés sur des membranes de collagène. Cette culture cellulaire
favorise l'élaboration d'un modèle permettant de recréer l'activation des lymphocytes en
maintenant la cytoarchitecture des organes lymphoïdes secondaires grâce aux membranes
de collagènes. Des histocultures d'amygdales ont en effet démontré la présence de
lymphocytes T, de lymphocytes B, de De folliculaires et de macrophages localisés aux
centres germinatifs [336]. Cependant, la quantité de cellules phagocytaires étant minoritaire
dans ces blocs d'amygdales, nous envisageons d'effectuer une co-culture d'amygdales avec
des DC ou MDM ayant phagocytés des pigments d'HZ. Ainsi nous pourrons observer
l'influence des cytokines et chimiokines sécrétées par la présence des pigments malariques
sur l'infection virale des amygdales. L'interprétation des résultats devra prendre en compte
que cette co-culture s'effectue dans un contexte allogénique. De plus, l'isolement des
différentes populations cellulaires, grâce à l'utilisation de billes magnétiques et d'anticorps
spécifiques, nous permettra peut-être d'en comprendre les mécanismes d'interaction.
187
Chapitre VIII. Conclusions
L'infection au Plasmodium fa lciparum , agent responsable de la malaria, débute par
la piqure d'une Anophèle femelle parasitées par la forme sporozoïte du P. falciparum
lesquels sont transmis à l'homme. Après un développement des sporozoïtes dans les
hépatocytes et une invasion des mérozoïtes, le parasite dégrade activement l'hémoglobine
afin de se développer lors de son cycle intra-érythrocytaire. Cette dégradation va provoquer
la libération de pigments d'HZ, libres ou séquestrés dans les érythrocytes, qui seront
phagocytés par les monocytes. Par un mécanisme encore méconnu, ces monocytes vont
servir de transporteurs des pigments malariques qui seront accumulés dans les tissus tels
que le foie, la rate ou la moelle osseuse. Ces pigments d'HZ vont provoquer l' activation
d'une réponse inflammatoire locale et l'organisme humain sera incapable de s'en
débarrasser et cela bien après l'abrogation de la parasitémie.
Chez l'humain, le VIH-1 est disséminé grâce à la migration des DC et des
macrophages à partir des muqueuses. Cependant, une dissémination virale est également
possible par les lymphocytes présents dans les épithéliums et la lamina propria
endocervicale (partie interne du col de l'utérus) [337]. Lors d'une co-infection causée par le
Plasmodium et le VIH -1, il est à prévoir que les cellules responsables de la dissémination
virale auront phagocytés des quantités plus ou moins variables de pigments malariques.
Dans un premier temps, nous avons démontré que les macrophages ayant phagocytés de
l'sHZ étaient moins permissifs à l'infection au VIH-1. De plus, lorsque les DC immatures,
présentes dans les organes périphériques, entrent en contact avec l' sHZ elles subiront une
maturation semblable à celle décrite suite à une infection par des bactéries Gram négative
(LPS). Alors que cette maturation va rendre les DC moins permissives à l' infection au
VIH -1, elle va cependant favoriser la dissémination virale précoce aux lymphocytes T
CD4 +. L'élément incontournable des infections parasitaires au P. falciparum est le fait
qu'elles sont cycliques dans les régions endémiques. De ce fait, il n'est pas impossible
d'imaginer qu'un individu ayant déjà subi une infection parasitaire et virale puisse à
nouveau être infecté par le P. falciparum. Ainsi, les monocytes circulants phagocyteront à
188
nouveau de larges quantités d'HZ. Il a été prouvé qu'après rupture des érythrocytes, la
concentration de pigments malariques pouvait atteindre jusqu'à 100 f.lg/ml [206].
Après une activation par un stimulus, les DC immatures ont la capacité de changer
de morphologie afin d'assurer la transmission du VIH -1 aux lymphocytes T CD4 + localisés
dans les organes lymphoïdes secondaires. Alors que les monocytes différentiés en
macrophages en présence d'sHZ ne semblaient pas être visuellement et phénotypiquement
différents des MDM contrôle, ils provoquaient cependant une maturation spécifique des
DC. En comparaison aux MDDC immatures et matures (LPS/IFN-y), la phagocytose d'sHZ
semblait favoriser la migration de ces MDDC aux organes lymphoïdes secondaires sans
toutefois lui conférer un phénotype complet d'activation. En effet, en présence ou en
absence d'un deuxième stimulus (LPS), les sHZ-MDDC expriment une quantité non
négligeable de CCR 7 à leur surface. Malgré une activation incomplète, la présence de
pigments malariques dans les DC induit une sécrétion de cytokines de type pro- et anti
inflammatoire, ce qui conduit à une augmentation de l'activation des lymphocytes T CD4+.
Ces résultats ont également été observés pour la différentiation des monocytes en
macrophages. En conséquence, la phagocytose d'HZ augmente non seulement le transfert
du VIH-1 mais également la réplication dans les lymphocytes T CD4+ suite au contact avec
la DC maturée en présence d'HZ. Notre étude a donc permis de mettre en évidence un
mécanisme pouvant expliquer l'augmentation transitoire de la charge virale observée lors
d'épisodes malariques. Cependant, d'autres études sont nécessaires afin de mieux
comprendre les interactions cellulaires impliquées lors d'une co-infection par le P.
falciparum et le VIH -1. Ces études sont vitales pour identifier et promouvoir le
développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives favorisant
l'amélioration de la qualité de vie des patients co-infectés.
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220
Annexe 1 : Interactions potentielles entre les drogues anti-malariques et anti-VIH-l
Traitements Pharmacocinétique
An tirétroviraux Anti- Anti-
Action Intéraction malarique VIH-l
inhibiteur nuc/éosidique de la transcriptase inverse Zidovudine (AZT) - Oui Inhibition de la RT du VIH-l Niveau d' AZT augmenté par ATQ
Suppression de la moelle Risque de myelosuppresion avec DS, PYR et CTX
épinière Lamivudine/emitricitabine
Oui Inhibition de la RT du VIH-l CTX diminue les niveaux de 3TC (3 TC/FTC) -
Stavudine (d4T) - Oui Inhibition de la RT du VIH-l Peut modifier les niveaux de CTX Abacavir (ABC) - Oui Inhibition de la RT du VIH-I -Tenofovir (TDF) - Oui Inhibition de la RT du VIH-I -
inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse Efavirenz (EFV) - Oui Inhibition de la RT du VIH-l Hépatotoxicité possible avec ADQ/artésunate
Peut augmenter ADQ, LF et les niveaux d'artésunate Peut augmenter QNE
Peut interagir avec CQ, MFQ, PG, PYR, SP et les drogues dérivées d'artélnisinine
Nevirapine (NVP) Non Oui Inhibition de la RT du VIH-I Peut inhiber le métabolism de LF et dérivés d'artémisine Diminution des niveaux QNE
Inhibiteurs de protéase
Ritonavir (RTV) Oui Oui Inhibition de la protéase Peut altérer le métabolisme de ATQ, CQ, QNE, PG, PYR, SP et dérivés
1
aspartique du VIH-l d'artémisinine 1
Mécanisme anti-malarique Peut altérer AUC quand administré avec MFQ
non connus Action synergique avec MFQ
Implication dans la cytoadhésion du Plasmodiumfa/ciparum etQC
Diminue l'expression de Peut avoir des interactions avec p-glycoprotéine
CD36 sur les macrophages Peut inhiber les pompes p-
Activité antirétrovirale et anti-malarique glycoprotéine
Suite ~
221
Traitements Pharmacocinétique
Antirétroviraux Anti- Anti- Action Intéraction
malarique VIH-l Inhibition de la protéase
Saquinavir (SQV) Oui Oui aspartique du VIH-l
Peut avoir des implications de la cytpadhésion de P. falciparum Action anti-malarique
inconnue Action anti-malarique
Diminution l' action de RTV à cause de MFQ pouvant altérer SQV synergique avec MFQ et CQ
Diminue l' expression de Peut interagir avec d'autres drogues au niveau des pompes p-CD36 sur les macrophages glycoprotéines (Pgp)
Peut inhiber Pgp Activité anti-malarique et antirétrovirale
Lopinavir (LPV) Oui Oui Inhibition de la protéase
Peut altérer les PK d' ATQ, QNE, MFQ, LF et dérivés d' artémisinine aspartique du VIH-l
Action anti-malarique Peut interagir avec d'autres drogues au niveau des pompes p-inconnue glycoprotéines
Peut inhiber Pgp Activité anti-malarique et antirétrovirale Inhibition de la protéase
Atazanavir (ATZ) Oui Oui aspartique du VIH-l
Peut altérer les PK d' A TQ, QNE, MFQ, LF et dérivés d' artémisinine Action anti-malarique
inconnue Activité anti-malarique et antirétrovirale
Tipranvir (TPV) - Oui Inhibition de la protéase Peut altérer le métabolisme de DS, A TQ, QNE, MFQ, LF, CTX et dérivés
aspartique du VIH-l d'artémisinine
Oarunavir (DRV) - Oui Inhibition de la protéase
Peut altérer le métaboljsme d'ATQ, QNE et dérivés d'artémisinine aspartique du VIH-l
Administration avec LF contre-indiquée Anti-malariques
Dérivés d'artémisinine Oui - Action controversée VoirEFV,~, RTV, SQV, LPV,ATZ,TPV,DRV
Chloroquine (CQ) Oui Modéré Action controversée VoirRTV Action anti-malarique
Activité anti-malarique et antirétrovirale synergique avec SQV, RTV
Quinine (QNE) Oui - Action controversée VoirNVP, RTV, SQV, LPC, ATA, TPV, DRV Action controversée
Augmente l' activité antivirale de SQV Mefloquine (MFQ) Oui Oui Action anti-malarique
synergique avec SQV, RTV Activité anti-malarique et antirétrovirale
Suite.
222
Traitements Pharmacocinétique
Antirétroviraux Anti- Anti-
Action Intéraction malarique VIH-l
Inhibe Action controversée Voir TPV, ATZ, SQV, RTV, EFC Primaquine Oui l'IN Effets antiviraux similaires de Inhibe des isoformes p450 donc risques modérés d ' interactions avec
VIV CQ plusieurs drogues Amodiaquine (ADQ) Oui Modéré Action controversée Voir EFV, activité anti-malarique et antirétrovirale
Piperaquine (PIP) Oui - Action controversée Augmente la toxicité de l' AZT Pyrimethamine (PYR) Oui - Antifolate Voir AZT, CTX, RTV
Sulfadoxine (S) Oui - Antifolate Voir RTV, EFV, CTX
Dapsone (DS) Oui - Antifolate Voir AZT, SQV, TRV
Augmente la sensibilité chez les patients VIH-I +
Proguanil (PG) Oui - Antifolate VoirRTVEFV L ume fantrine (LF) Oui - Action controversée VoirEFV, NVP, SQV, LPV, ATZ, TPV, DRV
Atovaquone (ATQ) Oui - Inhibe la chaine du transport Voir AZT,RTV, LPV, ATZ, TPV, DRV
des électrons Autres drogues
Cotrimoxazole (CTX) Oui Oui Antifolate Voir AZT, TPV Peut induire résistance S-PYR
223
Annexe 2 Phénotype des De immatures traitées à l'sHZ
C086 C080
5 400
4000 300
Li: 3000 Li: :E :E 200
2000
1000 1000
0 0 Ctrl LPS/IFN-y 5HZ Ctrl LPS/IFN-y 5HZ
C054 CCR7
20 7500
5000 LL u::: S :E 10
2500
0 0 Ctrl LPS/IFN-y 5HZ Ctrl LPS/IFN-y 5HZ
CCRS
4
3
2
a Ct ri LPS/IFN-y 5HZ
Annexe 3 : Phénotype des monocytes dérivés en De en présence d' sHZ
C086 C080
5000 3000
2000
i 1000
0 Ctrl LPS/IFN-y sHZ Ctrl LPS/IFN-y sHZ
C054 CCR7
100
75
Li: Li: ~ ::E 50
25
0 Ctrl LPSIIFN-y sHZ Ctrl LPS/IFN-y sHZ
ceRS 10.
7.
i 5.
2.
0 .0 Ctrl LPS/lFN-y 5HZ
224
Annexe 4 : Phénotype des monocytes dérivés en macrophages en présence d' sHZ
CD14
*.
t~nm?ilj Monocytes
B 7500
f 60,OO[ S 4500 c -; 3000
i 1~g~ a 75 :J Li: 50 c : 25 ::1
o·
.. MDMs (Ctrl)
De-SIGN
HLA-DR **
c::J HZ-MDMs (sHZ 10)
225
Annexe 5 : Article 4
Discrimination between exosomes and HIV-l: Purification ofboth vesicles from
cell-free supernatants.
226
Réjean Cantin2, Juliette Diou2, Dave Bélanger2, Alexandre M. Tremblay2 and Caroline
Gilbertl ,3
Centre de recherche en rhumatologie et immunologie l, Centre de recherche en
infectiologie2, Faculty of Medicine, Laval University, Québec, Canada.
* 3 Corresponding author, mailing address:
Dr Caroline Gilbert
Centre de recherche en rhumatologie et immunologie
T 1-49
2705 Boul Laurier,
Québec (QC), Canada, G 1 V 4G2
Phone: (418) 654-2772. Fax: (418) 654-2765
E.mail: [email protected]
Note: This work was funded by start-up funds to C.G. from the Centre Hospitalier Universitaire de Québec and the centre de recherche en rhumatologie et immunologie (CRRI).
227
ABSTRACT
Although enveloped retroviruses bud from the cell surface of T lymphocytes, they
use the endocytic pathway and the internaI membrane of multivesicular bodies for their
assembly and release from macrophages and dendritic cells (DCs). Exosomes,
physiological nanoparticles produced by hematopoietic cells, egress from this same
pathway and are similar to retroviruses in terrns of size, density, the molecules they
incorporate and their ability to activate immune cells. Retroviruses are therefore likely to
contarninate in vitro preparations of exosomes and vice versa and sucrose gradients are
inefficient at separating them. However, we have found that their sedimentation velocities
in an iodixanol (OptiprepTM) velocity gradient are sufficiently different to allow separation
and purification of both vesicles. Using acetylcholinesterase as an exosome marker, we
demonstrate that Optiprep ™ velocity gradients are very efficient in separating exosomes
from HIV-1 particles produced on 293T cells, primary CD4+ T cells, macrophages or DCs,
with exosomes collecting at 8.4-12% iodixanol and HIV-1 at 15.6%. We also show that
immunodepletion with an anti-acetylcholinesterase antibody rapidly produces highly
purified preparations of HIV -1 or exosomes. These findings have applications in
fundamental research on exosomes and/or AIDS, as well as in clinical applications where
exosomes are involved, more specifically in tumor therapy or in gene therapy uSlng
exosomes generated from DCs genetically modified by transfection with virus.
Key words: exosomes, purification, HIV -1 , acetylcholinesterase, primary cells
Abbreviations: AChE; acetylcholinesterase; MPs; microvesicles.
228
INTRODUCTION
Microvesicles or membrane micro-particles (MPs) originating from the plasma
membrane are usually heterogeneous in size «1 f.lM) and can emanate from aIl types of
blood cells as weIl as from endothelial cells. They are present at low levels in nonnal
extracellular fluids but their release is greatly increased by cellular activation. They are
known to play a role in inflammation, cancer, haemostasis, thrombosis and neurological
disorders (Ikeda et al., 2003; Mackman, 2006; Horstman et al., 2007; Tesselaar et al.,
2007). Their quantification in blood can also be used to monitor the state of sorne of the
diseases listed above. Exosomes, which represent an apparently distinct class of MP
originating inside the cell (endosomes), have recently attracted particular attention because
of their specific role in antigen presentation and hence their potential role in various cancer
therapies (Hao et al., 2007; Dai et al., 2008). Although several methods have been
developed to purify MPs, none of these can discriminate between MPs and exosomes.
Exosomes are 30-100 nm intravacuolar membrane vesicles that arise from the
multivesicular body (MVB) biogenesis pathway. They are expelled into the extracellular
milieu upon fusion of the MVB vesicle with the plasma membrane (Stoorvogel et al.,
2002). Exosome release by viable cells is a feature of several activated cells, including
tumour, epithelial and haematopoietic cells (Ahn and Johnstone, 1993; van Niel and
Heyman, 2002; Altieri et al., 2004; Abusarnra et al., 2005; Segura et al., 2005a; Peche et
al., 2006; Taylor et al., 2006). Several functional molecules have been shown to be present
in exosomes (Skokos et al., 2001; Segura et al., 2005a; Segura et al., 2005b), for example,
the TNF receptor (Hawari et al., 2004), the transferrin receptor (Baynes et al., 1991), the
Fas ligand (Vidal et al., 1997; Abusarnra et al., 2005; Alonso et al., 2005; Segura et al.,
2005b), MHC class II molecules, co-stimulatory molecules, enzymes (Baynes et al., 1991;
Alonso et al., 2007) and heat shock proteins (HSP) (Lancaster and Febbraio, 2005). Since
their first identification by Allen (Allan et al., 1980) and Johnstone (Johnstone et al.,
1987)(Johnstone et al., 1987)(Johnstone et al., 1987)(Johnstone et al., 1987)(Johnstone et
al., 1987)(Johnstone et al., 1987)(Johnstone et al., 1987), important roles for these
microvesicles in several biological processes have been suspected. Functional involvement
of exosomes, plausibly related to the presence (on their surface) of molecules such as those
229
cited above, has been described in the regulation of the immune response, particularly in
tolerance induction (Karlsson et al., 2001; Peche et al., 2003; Van Niel et al. , 2003;
Larregina et al., 2004; Frangsmyr et al., 2005; Kapsogeorgou et al., 2005; Mallegol et al. ,
2005; Ostman et al., 2005; Quah and O'Neill, 2005; Segura et al., 2005a; Admyre et al. ,
2006; Kim et al., 2006a; Peche et al., 2006; Taylor et al., 2006), antigen presentation
(Raposo et al., 1996; Kleijmeer et al., 2001; Thery et al., 2002; Clayton et al. , 2003 ; Peche
et al., 2003; Andre et al., 2004; Chaput et al., 2004), cancer immunotherapy (Zitvogel et al. ,
1998; Amigorena, 2000; Quah and O'Neill, 2000; Andre et al., 2001; Mignot et al. , 2006),
control of receptor expression (Ahn and Johnstone, 1993; Hawari et al. , 2004; Levine,
2004) possibly in cellular communication and in the mechanisms involved in cell death or
in the control of inflammation (Levine, 2004; Abusamra et al., 2005; Kim et al. , 2006b).
Exosomes can thus activate or inactivate different pathways on surrounding cells,
depending on their molecular composition, which is influenced by the activation state of
the secreting cell (Fomina et al., 2003). This class of MP shares several physical and
biochemical proprieties with retroviruses, such as the use of the endosomal machinery to
bud. The relationship between exosome biogenesis and retrovirus assembly has not yet
been elucidated to a satisfactory degree. Several Hnes of evidence point to the participation
of the MVB biogenesis intracellular machinery during the budding process of HIV-l
particles, especially in antigen-presenting cells like macrophages and dendritic cells (DCs).
While the HIV-l budding process is located at the cytoplasmic membrane in CD4+ T cells,
virions are localized in endosomes in macrophages and in iDCs, suggesting that the viral
budding process occurs within MVB vacuoles (Nguyen et al., 2003; Gould et al. , 2004;
Morita and Sundquist, 2004; Booth et al., 2006). This hypothesis, also known as the Trojan
horse hypothesis, is based on comparative studies of exosomes and HIV -1 particles
(Nguyen et al., 2003) and on observations of other similar viral budding processes (Derse et
al., 1987). It is suggested that retroviruses have exploited the exosome release process
during evolution for their production and propagation, allowing at the same time a
protection against the immune response of the host.
In general, exosomes are slightly smaller and more heterogeneous in size (30-100
nm) than HIV -1 particles (100 nm). Nevertheless, exosomes are similar to retroviruses not
only in size, but also in terms of the molecules the y incorporate and their ability to activate
230
immune cells. The most obvious similarity between these particles is the common presence
of several host molecules. For example, incorporation of MHC-II molecules by virions and
by exosomes has been described (Cantin et al., 1996; Cantin et al. , 2001; Raposo et al. ,
2002; Vincent-Schneider et al., 2002; Gansuvd et al., 2003). In addition, several cell
surface molecules such as integrins (CD11a, CD18), co-stimulatory molecules (CD28,
CD54) and complement neutralizing molecules (CD55, CD59) have been associated with
both particles (Thery et al., 1999; Thery et al., 2001; Nguyen et al., 2003; Cantin et al. ,
2005). Finally, the buoyant density of exosomes ranges from 1.13 to 1.21 g/l (Thery et al. ,
2001), which is very close to the values measured for HIV-1 particles (1.16 to 1.18 g/l)
(Wang et al., 1999). In view of the above-mentioned morphological, physical and
biochemical criteria, it is not surprising that physical separation between exosomes and
HIV-1 is difficult to achieve (Nguyen et al., 2003; Gould et al., 2004; Kramer et al. , 2005).
Velocity gradients appear to have met with sorne success (Dettenhofer and Yu, 1999),
although exosome contamination was not measured.
In our study, using the exosome marker acetylcholinesterase (AChE) and electron
microscopy, we observed that the AChE-containing fraction (collecting at 8.4-12%
iodixanol) included only exosomes and the AChE-free fraction (at 15.6%) contained only
infectious virions (i.e. the mature form), confirming that exosomes can be separated from
HIV-1 virions by OptiprepTM velocity gradient. We also show that immunodepletion using
an anti -acety lcholinesterase antibody rapidly produces both highly purified HIV -1 and
highly purified exosome preparations. This is the first study to use both methods to separate
exosomes from HIV -1. Most significant is that our findings suggest specific techniques for
the purification of exosomes with potential application to tumour treatment or for the
preparation of pure retrovirus for gene therapy as well as for fundamental HIV-1/exosome
research.
231
MATERIALS AND METHODS
Reagents: Phytohemagglutinin-L (PHA-L), acetylthiocholine and 5,5-dithio-bis(2-
nitrobenzoic acid) were purchased from Sigma (St-Louis, MO). Interleukin-2 (IL-2) was
obtained through the AIDS Repository Reagent Program (Germantown, MD). OptiprepTM
(60% iodixanol w/v in water) was obtained from Axis-Shield (Dundee, UK). Prote in AlG
was purchased from Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Complete culture
media consisted of RPMI 1640 or DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum
(FBS), penicillin G (100 U/ml), streptomycin (100 U/ml) and glutamine (2 mM), which
were aIl purchased from Wisent (St-Bruno, QC, Canada).
Antibodies: Monoclonal anti-ICAM-1 Ab RR1/1.1.1 was supplied by R. Rothlein
(Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT). Anti-acetylcholinesterase (clone AE-1) and anti
ICAM-1 (clone R6.5) hybridomas were obtained from the American Type Culture
Collection ATCC (Manassas, VA). Antibodies were purified by mAbTrap protein affinity
columns according to the manufacturer's instructions (Pharmacia Technology AB, Uppsala,
Sweden).
Cells: The human embryonic kidney cell line 293T was obtained from ATCC and
maintained in DMEM complete medium. The indicator ceIlline TZM-bl, a modified HeLa
cell line expressing CD4 and CCR5, was obtained through the AIDS Repository Reagent
Program (Germantown, MD), maintained in DMEM complete medium and then used as
described previously (Wei · et al., 2002; Zhao et al., 2005; Thibault et al., 2007). Primary
human CD4+ T cells were isolated by using a negative selection kit according to the
manufacturer's instructions (StemCeIl Technologies). They were activated with PHA-L
(1 Jlg/ml) and maintained in complete RPMI supplemented with IL-2 (30 U/ml) at a density
of 2 x 106 cells/mi as described previously (Gilbert et al., 2007a; Gilbert et al. , 2007b).
Bovine exosomes were excluded from aIl culture media by ultracentrifugation of the FBS at
100,000xg OIN.
Production of virus stocks: Virions of HIV-1 variant NL4-3Balenv were produced by
transient transfection in human embryonic kidney 293 T cells as described previously
(Cantin et al. , 1997). Plasmids used included pNL4-3balenv (R5-tropic) and pNL4-3 (X4-
232
tropic). The pNL4-3Balenv vector (provided by R. Pomerantz, Thomas Jefferson
University, Philadelphia, PA) was generated by replacing the env gene of the T-tropic HIV-
1 strain NL4-3 with that of the macrophage-tropic HIV -1 Bal strain, thus resulting in an
infectious molecular clone with macrophage-tropic properties (Domadula et al. , 1999). The
other molecular constructs and HIV -1 strains were obtained through the AIDS Repository
Reagent Program. Several virion preparations were obtained from primary cells. Briefly,
peripheral blood was obtained from normal healthy donors and peripheral blood
mononuclear cells (PBMCs) were prepared by centrifugation on a Ficoll-Hypaque density
gradient. Virions of NL4-3 were produced by acute infection of primary human CD4+ T
cells for seven days. Purified CD4+ T cells (1 x 107 cells) were exposed to the virus (500 ng
p24gag) for 120 min at 37°C in 1 ml of RPMI after which 5 ml of complete RPMI
supplemented with IL-2 were added. On day 3, 2 x 107 PHA-L and IL-2 activated cells
were added to the infected cells and the supematant was collected on the seventh day.
Virions of NL4-3Balenv were produced by infection of PBMCs or primary monocyte
derived macrophages (MDM) for 6 or 9 days respectively. Briefly, PBMCs (1 ,5 x 107
cells/ml) were infected with virions (500 ng/ml) or plated in 75 cm2 flasks to obtain MDM.
After 2 hrs, non-adherent cells containing CD4+T cells were keep for purification by
negative selection and AUTOMacs, while adherent cells were washed with phosphate
buffered saline (PBS) and isolated monocytes were cultured in RPMI + IL2 for seven days
in the presence of M-CSF (100 ng/ml). On day 7, MDM were incubated with 200 ng of
virus per flask. Flow cytometry analyses revealed that the studied MDM preparations were
constituted mostly of CD14+ cells (2:99%) and very few contaminating CD3+ cells (about
0.1 %). Virions were recovered on day 9 and purified by ultracentrifugation and Optiprep
gradient. The virus-containing supematants were filtered through a 0.22 ~m cellulose
acetate syringe filter and normalized for virion content using an in-house double-antibody
sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) specific for p24gag prote in
(Bounou et al., 2002).
Pulsing IM-MDDCs with HIV-l: Immature monocyte-derived dendritic cells (IM-MDDC)
were generated from purified human monocytes (i.e. CD14+ cells) using a monocyte
positive selection kit according to the manufacturer' s instructions (MACS CD 14 micro
beads, STEMCell Technologies, Vancouver, BC) as described previously (Gilbert et al. ,
233
2007a). IM-MDDC cells were cultured in complete culture medium supplemented every
other day with GM-CSF (1,000 U/ml) and IL-4 (200 U/ml) for se ven days. The percentage
of cells expressing surface markers CD3 and CD19 was evaluated to assess contamination
with T and B ceIls, respectively. Experiments were performed with nearly pure preparations
(DC> 95%; CD4+ T > 98%). IM-MDDC cells (6 x 106 in a final volume of 2 ml) were
exposed to HIV-l (600 ng of p24) for 48 hr at 37°C. After incubation, cell-free
supematants were collected and subjected to sequential centrifugation before Optiprep
separation. Virus production was estimated by measuring p24 levels in culture supematants
by ELISA.
Purification of HIV-l particles by velocity gradients: Filtered viruses from 293T ceIls,
CD4+ T cells, MDM or IM-MDDCs were first concentrated by ultracentrifugation in an
Optima L-90K Beckman Coulter apparatus (Fullerton, CA) for 45 min at 28,000 rpm
(100,000xg) in a 70 Ti rotor. The pellet containing virions and microvesicles/exosomes was
resuspended in 500 Jil ofPBS. HIV-1 viral particles were then centrifuged through a 6-18%
Optiprep ™ density gradient as described previously (Dettenhofer and Yu, 1999). The virus
preparations were then centrifuged using the Optima L-90K apparatus for 75 min at 52,000
rpm in a NVT65 rotor. Gradient fractions were collected from the top. The virus
concentration in each stock was quantified using an in-house sensitive double antibody
sandwich ELISA specific for p24gag protein (Bounou et al., 2002).
Virus infection assays: To quantify infectious viral particles in each Optiprep ™ gradient
fraction, 100 Jil were incubated for 48 hrs with indicator cell line TZM-bl (1.5 x 104
ceIls/well, 200 Jil final volume), which carries a stably integrated luciferase reporter gene
under the control of the HIV -1 regulatory element known as the long terminal repeat (Wei
et al., 2002; Zhao et al., 2005; Thibault et al., 2007). AlI experimental points were done in
triplicate. Luciferase activity was determined following a modified version of a protocol
(Berube et al., 1996; Barbeau et al., 1997). Briefly, following the incubation period, 100 Jil
of cell-free supematant were withdrawn from each weIl and 25 Jil of cell culture lysis buffer
(25 mM Tris phosphate, pH 7.8,2 mM dithiothreitol, 1% Triton X-100 and 10% glycerol)
were added before incubation at room temperature for 30 min. An aliquot of cell extract
(20 Jil) was mixed with 100 Jil of luciferase assay buffer (20 mM Tricine, 1.07 mM
234
(MgC03)4·Mg(OH)2·5 H20, 2.67 mM MgS04, 0.1 mM EDTA, 270 f.lM coenzyme A,
470 f.lM luciferin, 530 f.lM ATP and 33.3 mM dithiothreitol) and the luciferase reaction was
monitored on a Dynex MLX microplate luminometer for 20s/well after a 2-5s delay.
Acetylcholinesterase activity assay: Acetylcholinesterase activity was measured following a
procedure described previously (Ellman et al. , 1961). Briefly, 100 f.ll of each Optiprep ™
fraction were suspended in 100 f.ll of 1.25 mM acetylthiocholine in PBS pH 8 mixed with
0.1 mM 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) in PBS pH 7 in a final volume of 200 f.ll. The
incubation was performed at room temperature but the exosomes and the substrate solution
were pre-warmed at 37°C for 10 min before starting the optical density readings. Changes
in absorption were monitored at 450 nm for 10 min with a plate reader spectrophotometer
(ELX808, BIO-TEK instruments, Winooski, VT, USA).
SDS-PAGE and Western blot analyses: 100 f.ll of each OptiprepTM gradient fraction were
added to an equal volume of boiling 2X sample buffer and kept at 100°C for 7 min as
described previously (Gilbert et al., 2002). The samples were then subjected to SDS
polyacrylamide gel electrophoresis with a 7.5-20% gradient and transferred to Immobilon
PVDF membrane (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Immunoblotting was done
using a monoclonal anti-p24gag antibody (183-H12-5C) supplied by the AIDS Repository
Reagent Pro gram (Germantown, MD) and revealed using a Renaissance detection system
(NEN Life Science, Boston, MA) with HRP-conjugated secondary anti-mouse antibodies
(Amersham, Mississauga, ON, Ca) at a dilution of 1/20,000.
ICAM-l detection microplate assay: ICAM-1 was quantified ln exosome/HIV-1
preparations by an in-house enzymatic sandwich-type immunoassay. Briefly, flat bottom
96-well plates (BD Falcon microplate) were initially coated with the anti-ICAM-1 (R6.5) or
isotype control (lgG2a) antibody (50 f.lg/ml) in carbonate buffer. After removal of excess
antibody by three washes with washing solution (PBS/Tween 20 0.1 %) and blocking non
specific sites with blocking solution (PBS/Tween 20 0.1 %/BSA 1 %) for 1 hr at room
temperature, the plates were washed and held overnight at 4°C, loaded with 75 f.ll of each
gradient fraction mixed with an equal volume of 0.5% Triton X-100 lysis buffer. The plates
were then washed three times and a second antibody, biotiny lated anti -1 CAM -1 (R 1.1.1),
235
was added at 0.5 Ilg/ml, in blocking solution for 1 hr at room temperature. The plates were
then washed three times and a streptavidin-peroxidase conjugate (streptavidin-HRP-40;
Research Diagnostics) was added, followed by incubation for 30 min at room temperature.
The plates were then washed and ICAM-l-containing particles were measured by adding
the TMB-S substrate (Research Diagnostics), followed by 50 III of lM H3P04 to terminate
the reaction and reading the absorbance at 450 nm.
Electron Microscopy Procedure and Examination of Negative Stain Specimens: The protocol
described by Hammond et al. and Alain et al was performed with each analytical fraction
(Hammond et al., 1981; Alain et al., 1987). Briefly, microvesicle preparation was fixed with an equal
volume of2% paraformaldehyde and 50 - 200 ilL were concentrated in a micro-ultracentrifuge
tube (Beckman Airfuge) with a formvar-coated electron microscopy grid at the bottom at
l20,000xg (20psig) for 5 minutes in an Airfuge ultracentrifuge (Beckman, Palo Alto, CA,
USA). The grids were dried on bibulous paper and stained for 1 min with a drop of 3%
phosphotungstic acid (pH 6.0). The concentration, shape and overall appearance of the
microvesicles were examined with a Hitachi 7100 (Hitachi, Japan) transmission electron
mIcroscope.
lmmunodepletion of exosomes in viral preparations: 100 III of ultra-centrifuged cell
supematant was diluted in 400 ~l of PBS and contacted with protein A1G beads pre-coated
with anti-acetylcholine or isotypic control antibody at 10 Ilg/20 III ofbeads for 1 br at room
temperature on a rotating platform. Immune complexes were then recovered by
centrifugation and the supematants were subjected to a second round of immunodepletion
under the same conditions. The final supematants and the beads were kept for p24gag
evaluation and acetylcholinesterase activity assay.
236
RESULTS
Highly purified Optiprep ™ veloeity gradient HIV-l partieles
Microparticles, exosomes and HIV -1 have similar buoyant densities and the first
two constitute the major contaminants of viral preparations (Bess et al., 1997; Gluschankof
et al., 1997). Sucrose gradients are not efficient in separating these cellular vesicles. In
order to study the role of exosomes in HIV -1 infection, a more efficient separation method
is needed. The adequacy of the OptiprepTM velocity gradient protocol used in this study was
tested on a preparation obtained from 293T cells infected with NL4-3Balenv. The
Optiprep ™ separation medium possesses intrinsic properties such as neutral pH and
physiological osmolarity (Ford et al., 1994; Van Veldhoven et al., 1996; Dettenhofer and
Yu, 1999), which make it highly suitable for efficient separation of viral entities from
cellular debris and microvesicles (Moller-Larsen and Christensen, 1998; Dettenhofer and
Yu, 1999; Hermens et al., 1999; Zolotukhin et al., 1999). In this study, HIV-l particles or
exosomes in cell-free supematant filtered through O.22-Jlm membrane were concentrated
by ultracentrifugation at 100,OOOxg for 45 min, re-suspended and then separated by
centrifugation through a 6-18% Optiprep ™ velocity separation gradient. Dettenhofer et al.
was the first to de scribe efficient separation of microvesicle contaminants from HIV-l
preparations (Dettenhofer and Yu, 1999). This efficiency is confirmed in Figure 1, which
shows p24gag protein concentrated mainly in fraction 15.6. To establish a correlation
between infectivity and the amount of p24gag, we infected the indicator cell line TZM-bl
with an equal volume of each OptiprepTM fraction (Fig. lB). The luciferase and b
galactosidase genes are integrated separately into the TZM b 1 genome under the control of
the HIV -1 promoter. Furthermore, these cells are rendered highly sensitive to infection by
different HIV -1 variants by virtue of the expression of both CXCR4 and CCR5 HIV -1 co
receptors. Infectivity assays on TZM-bl cells (panel B) prove that fraction 14.4 to 16.6
contains fully infectious viruses. Examination by electron microscopy (not shown)
confirmed that fractions 15.6 and 16.8 contain homogeneous viral particles at a
concentration of about 1 ° Il particles/ml.
Measurement of AChE activity in each OptiprepTM gradient fraction
237
T 0 assess whether the purified virus preparation still contained any contaminating
exosomes, we took advantage of the acetylcholinesterase (AChE) marker, which is
exosome-specific and has been used previously with success (Rieu et al. , 2000; Gastpar et
al. , 2005). AChE is involved in the regulation of acetylcholine levels by hydrolysis into
choline and acetate near the neuromuscular and neuroeffector junctions. This enzyme is
also expressed on leucocytes and erythrocytes as well as on several celllines such as 293 T,
Daudi, CEM hum an leukemic T cells and others. This glycosylphosphatidylinositol
anchored acetylcholinesterase and other GPI proteins also localized in the MVB are part of
the exosome membrane (Johnstone et al., 1987; Gastpar et al., 2005). The distribution of
exosome-containing fractions along the gradient was evaluated by measuring AChE
activity. Figure 2 shows that AChE activity is concentrated in fractions 8.4 to 12, indicating
that exosomes sediment primarily outside the gradient zone where HIV -1 virions are found.
Microscopic observations indicate about 109 particles/ml in these fractions (data not
shown). Fractions 8.4 to 12 are thus rich in exosomes, while fraction 15.6 contains fully
infectious HIV -1 viruses. These results confirm the efficiency of the Optiprep ™ velocity
gradient method in separating quasi-similar vesicles such as exosomes and HIV -1.
Purification on OptiprepTM gradient of partic/es derived fram uninfected and infected
CD4+ Tcells
The human T cellline Jurkat T and primary CD4+ T cells have been found to release
exosomes into the supematant following activation (Blanchard et al. , 2002). HIV -1 actively
replicates in CD4+ T cells, which are considered to be a major reservoir of virions in vivo.
In order to extend our previous observations to a more physiological context, we overlaid
the 100,000xg pellet obtained from NL4-3 infected or uninfected (MOCK) purified CD4+ T
cell supernatants on an Optiprep ™ gradient. Figures 3A and 3B reveal that the p24gag
protein was detected only in the fraction obtained from infected cells (panel A) and is
concentrated in fraction 15.6, as observed for 293T cells (Figure lA). Moreover,
acetylcholinesterase activity was again found highest in OptiprepTM fractions 8.4 to 12 for
MOCK (data not shown), infected CD4+ T cells (Figure 3B), infected MDM (Figure 4A) or
HIV-1 pulsed IM-MDDC (Figure 4B). These results indicate that exosomes derived from
supernatants ofHIV-1 pulsed primary cells such as CD4+ T, MDM or IM-MDDC are found
238
ln Optiprep ™ velocity gradient fractions other than those to which HIV -1 particles
gravitate. This set of experiments emphasizes that physiological target ceUs of HIV-l
secrete exosomes that can be efficiently separated by this method for aU ceU types currently
used for viral production.
The presence ofhost surface molecules on exosomes and HIV-l
The presence of host molecules on both types of vesicle has been described by
several authors, ICAM-l remaining the most studied (Fortin et al., 1997; Fortin et al. , 2000;
Tardif and Tremblay, 2003; Segura et al., 2005b). ICAM-l via its interaction with LFA-l
plays several roles in HIV -1 pathogenesis and also in immune responses (Gilbert et al. ,
2005; Lebedeva et al., 2005; Sprent, 2005; Gilbert et al., 2007b). Moreover, the presence of
ICAM-l and likely that ofLFA-1 on microvesicles such as exosomes is involved in antigen
presentation (Segura et al., 2005a; Sprent, 2005). Figure 3C shows the distribution of
ICAM-l in each OptiprepTM gradient fraction from infected CD4+ T ceUs, as detennined by
the plate capture technique. These results show that this technique is specific, since it is
presumed that the anti-ICAM-l biotinylated antibody detects any false positive signal, yet
the signal obtained with the IgG2a control antibody is constant. Moreover, we detected
ICAM-l (Figure 3C) and LFA-l (data not shown) in the OptiprepTM fraction that was
positive for both AChE and for the p24gag protein. These results show that LFA-l or ICAM-
1 are indeed included in exosomes and in HIV -1 particles and that the presence of host
molecules in supematants of infected primary cells is not associated exclusively with
virions. All of these results confinn that the Optiprep ™ gradient substantiaUy purifies HIV-
1 in the presence of MPs and/or exosomes in primary cells.
Immunodepletion of exosomes in viral preparations
Based on the above results, alternative rapid methods of purifying exosomes were
perfonned using immunodepletion of AChE-positive vesicles directly from 100,000xg
centrifugation pellets. Immune complexes fonned from ultra-centrifuged cell supernatants
diluted in PBS and incubated with prote in AlG beads pre-coated with anti-AChE or with
isotypic IgG 1 control antibody were recovered by centrifugation and the supernatants
subjected to a second cycle of immunodepletion under the same conditions. Figures SA and
239
5B show respectively the AChE and p24gag prote in contents of the supematants and beads.
About 95% of the AChE activity was recovered with the anti-AChE-beads after the fust
round of precipitation. Equal amounts of p24gag were present in the final supematants and
starting material, considering the dilution in PBS. Furthermore, panels C, D and E confirm
that formation of immune complexes with protein AlG efficiently pulled down exosomes
(108 particles/ml, Figure 5D), while the HIV -1 particles (1010 particles/ml) stayed in the
supematant (Figure 5E vs 5C). It is thus possible to separate exosomes from HIV -1 virions
by specifie immunodepletion.
The purification protocols are illustrated schernatically in Figure 6.
240
DISCUSSION
Among the several kinds of MPs, exosomes share the most similarities with HIV-1
particles in terms of size and gradient density. In fact, the densities of both exosomes and
HIV -Ion sucrose gradient are very similar (1.13 to 1.21 g/mL for exosomes and 1.16 to
1.18 g/mL for HIV -1). Moreover, both vesicles use the MVB machinery to bud (Raposo et
al. , 2002). FinaIly, the presence of surface molecules such as ICAM-1, LFA-1 , CD55,
CD59, MHC-II, MHC-I and several others has been reported for both particles (Thery et
al. , 2001; Cantin et al., 2005). These similarities aIl render the separation or purification of
these particles very difficult. In this study, we present evidence that a velocity gradient can
be an efficient tool for separating exosomes from HIV -1 preparations. We also show the
effectiveness of a new immuno-depletion method based on the presence of AChE to
remove exosomes from HIV -1 preparations. This new method is quick and reliable for
separating exosomes from HIV -1.
Application of these separation methods to studying the functional role of host
molecules incorporated on HIV -1 could tum out to be of significant value. Achieving very
highly purified HIV -1 preparations in these kinds of experiments is a definite advantage.
These methods could also provide the opportunity for specific isolation of exosomes
secreted by a variety of cell types and could prove useful in experiments in which purified
exosome preparations are needed to study their roles in several biological processes.
Indeed, these purification steps are crucial in studies involving mixtures of exosomes and
HIV-l (or for that matter, other retroviruses) as starting mate ri al. We strongly believe that
an improved and standardized method of exosome purification should lead to more
comparable results among different laboratories and lessen discrepancies such as those seen
among several studies in recent years and would probably also facilitate the interpretation
of results in forthcoming published reports in this area.
Most studies published so far have used different techniques to measure exosomes
and MPs. A common way to get exosome preparations from cell culture supernatants is to
employ high-speed centrifugation and obtain a pellet containing exosomes. However, these
pellets remain contaminated by apoptotic MPs, or as shown in more specific studies, by
retroviruses. To overcome this problem, we overlaid an OptiprepTM velocity gradient with a
241
100,000 xg centrifugation pellet. Given that apoptotic vesicles are associated with histones
and therefore much denser, (1.24 to 1.28 g/ml) in the gradient, they collect in a different
fraction than exosomes (Thery et al., 2001). The presence of apoptotic vesicles in the late
fraction of the gradient is possible for the following reason: apoptotic vesicles exhibit a
characteristic histone protein molecular weight pattern, which is weakly visible by
Coomassie blue staining in our preparations. Furthermore, as illustrated in our results, HIV-
1 particles also collect in a different fraction. The results obtained with an Optiprep ™
velocity gradient offer the unique advantage in separating exosomes from both apoptotic
vesicles and HIV -1 in a single step.
The difficulty in separating exosomes from HIV -1 particles is due to their physical
and biological similarities. The use of specific membrane antigens to separate them is often
suboptimal since exosomes and HIV -1 have approximately the same antigen expression
pattern: CD81, lysosomal marker CD63 and several other surface molecules. This is why
flow cytometry, ELISA or bead capture techniques based on specific markers are not
sufficiently discriminating for the separation of exosomes, MPs and HIV -1. An alternative
method, using an anti-CD45, has described by Ott (Trubey et al., 2003; Chertova et al. ,
2006), although this technique allows separation of MPs derived from leucocyte plasma
membranes only and does not eliminate exosomes originating from the endosomal
membrane. Immunodepletion using both antibodies (anti-CD45 and anti-AChE) could be
useful for obtaining very pure virion preparations from hematopoietic cells. Among the
antigens we tested, only AChE was a specific marker of exosomes. AChE appears to be
excluded from HIV -1, since the major portion of its activity is recovered in the early
OptiprepTM fractions (8.4 to 12), in which no virus is detected. This provides a unique way
of capturing exosomes while excluding HIV -1 particles. Based on this observation,
depletion of 100,000xg pellets with anti-AChE antibody-coated protein AlG agarose
appears as excellent means of rapidly purifying the virions or capturing exosomes.
Both methods (OptiprepTM gradient and immunodepletion) can be used to purify
exosomes and electron microscopy coupled with AChE assay may be useful for quantifying
them. Altogether, the above observations prove that the OptiprepTM gradient can be used to
242
purify infectious HIV -1 particles to a high degree and the recovery of the totalload overlaid
on the OptiprepTM gradient was not greater than 40%.
Establishing an efficient method of separating exosomes from HIV -1 or from other
retroviruses is of utmost importance, given a recent study showing that iDes release HIV-1
in association with exosomes and that this association promotes HIV -1 infectivity (Wiley
and Gummuluru, 2006). In that study, sucrose gradients and immunocapture were used to
purify virions and exosomes. Using OptiprepTM, we obtained fractions containing exosomes
only and fractions containing exosome-free virions from infected dendritic cells (Figure
4B).
In summary, the results of the present study show that a relatively simple method of
purifying exosomes is now available. The novelty of our observations lies in the
characterization and standardization of a protocol for purifying exosomes and/or for
obtaining pure virions. We may expect these methods to make a significant contribution to
obtaining specialized MPs for use in vaccination or gene therapy.
ACKNOWLEDGMENTS
We express our gratitude to Lahlou Hadji for constructive comments and critical reading of
the manuscript. We thank Dr. Stephen Davids for excellent proofreading. We are also
grateful to M. Robert Alain for his assistance with the electron microscopy analyses.
243
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255
FIGURES
FIGURE 1: Purification of HIV-l particles using an OptiprepTM gradient. NL4-
3Balenv was produced by transient transfection in human embryonic kidney 293T cells and
purified as described in Materials and Methods. The 100,000xg NL4-3Balenv pellet was
overlaid on the Optiprep ™ gradient. (A) p24gag protein as quantified by ELISA. (B) 100 JlI
of each OptiprepTM fraction were contacted with 15,000 TZM-bl cells for 48 hr prior to
lysis for infectivity determination by luciferase assay. Values represent three independent
experiments.
FIGURE 2: Exosome presence measured as AChE activity in OptiprepTM gradient
fractions. The 100,OOOxg NL4-3Balenv pellets were overlaid on the OptiprepTM gradient.
AChE activity was evaluated in each fraction by colorimetry. Values represent at least six
independent experiments.
FIGURE 3: OptiprepTM gradient purification of HIV -1 particles derived from CD4+ T
cells. NL4-3 was produced by infection of CD4+ T cells and purified as described in
Materials and Methods. OptiprepTM gradient was overlaid with 100,000xg pellet of
uninfected (MOCK) or infected cells. The p24gag protein in each fraction was detected by
Western blot (A) with anti-p24 antibody and by ELISA (B, black rectangles).
Acetylcholinesterase activity was quantified by colorimetric assay as described in Materials
and Methods (B, open rectangles). Data shown are representative of six independent
experiments. HIV-1 and exosomes containing ICAM-I were quantified by ELISA (C).
OptiprepTM gradient was overlaid with 100,000xg pellet from cells pulsed with NL4-
3Balenv. Plates were initially coated with isotypic IgG2a control or anti-ICAM-1 antibody
and ICAM-I was revealed by biotinylated anti-ICAM-1 antibody and streptavidin
peroxidase conjugate as absorbance at 450 nm. Values represent six independent
experiments.
256
FIGURE 4: OptiprepTM gradient purification of HIV-l particles derived from MDM
and IM-MDDC. MDM (panel A) or IM-MDDC (panel B) were incubated in RPMI with
immunodepletion-purified NL4-3Balenv produced on PBMCs as described in Materials and
Methods. Cell-free supematants were collected and subjected to sequential centrifugation.
The pellets containing exosomes and HIV-1 were re-suspended in 400 f.ll of PBS and
exosomes were separated from HIV-1 particles by OptiprepTM gradient. Exosomes were
quantified in each individual OptiprepTM fraction (Open rectangles) by measuring AChE
activity. Virions were quantified using an anti-p24gag ELISA (black rectangles). Data
correspond to means ± SD of three donors.
FIGURE 5: Purification of exosome preparations by immunodepletion with anti
AChE. Immune complexes formed by incubating 100 f.ll ofNL4-3Balenv 100,000xg pellet
(starting material) diluted in 400 f.ll of PBS with protein A/G beads pre-coated with anti
AChE (AE-1) or isotypic IgG1 control antibody were recovered by centrifugation.
Supematants were subjected to a second cycle of immunodepletion under the same
conditions. The second supematant and associated beads were kept for AChE activity (A)
and p24gag (B) assays. Data shown are representative of three independent experiments.
Transmission electron micrographs of the 100,000xg pellet (C), the first-cycle anti-AChE
coated beads (D) and the second-cycle supematant (E).
FIGURE 6: Schematic representation of the purification protocols.
257
Figure 1
A B
4100°1 ~. 31000 21000 ~ 11000 ~ . ri n
~ 1~! .=.0 ==00 onl 111111 1 6.0 7,2 8,4 9.ô 10 .. 8 12.0 13.2 14,4 15.,6, 16.8 18.0 Sum 6.0 7.2 8.4 9,,6 10.8 12.0 13.2 14.4 15.6 16.8 18.0
Figure 2
400
300 ~ ~s:
~ «J. 200 w .c (J <C
100
258
Surn. 6.0 7~28.4 9.6 10.8 12.0 13~2 14.,4 15,.6 16.8 18.0
259
Figure 3
A B 500 - 400
400 0
A ~ 300 --~ 'G co w 200 .c u .oC
B 100
6-,0 7,2 S.4 9,6 10,8 12,013,2 14,4 15.616,8 -1S,Q 0
c 0.75
~ 0,50
1 025 ~ ~ ____________ LL
0.-00 6,01,2 8,49,6 10,8 '1:2,0 13.,2 14,415,6 16,8 lltO
Figure 4
A
B
0 >-.... oS; ;; (,) cu w .c (.) cc(
o ~ ~>
125
100
75
50
25
0 6.0 7.2 8.4 9.6 10.8 12.0 13.2 14.4 15.6 16.818.0
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6.0 7.2 8.4 9.6 10.8 12.0 13.2 14.4 15.6 16.8 18.0
260
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10
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Figure 5
A 100 ·· c:::J !gG1
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1500
1000
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261
c::::J rgOl
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262
Figure 6
Exosomes or virus purification
