Identification of Acetic Acid Bacteria isolated from Lanta Noi

รายงานการวจย เรอง

การพสจนเอกลกษณของแบคทเรยกรดน าสม ทคดแยกไดจากเกาะลนตานอย

จงหวดกระบ ประเทศไทย Identification of Acetic Acid Bacteria isolated from Lanta Noi

island, Krabi province Thailand

โดย

นางสาวธนขวญ บษบน ดร.ภทรพร รตนวาร นายทวศกด มะลมาศ

ไดรบทนอดหนนจากมหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา ปงบประมาณ 2554

รายงานการวจย

เรอง

การพสจนเอกลกษณของแบคทเรยกรดน าสม ทคดแยกไดจากเกาะลนตานอย จงหวดกระบ ประเทศไทย

Identification of Acetic Acid Bacteria isolated from Lanta Noi island, Krabi province Thailand

โดย

ผวจย สงกด

นางสาวธนขวญ บษบน มหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา ดร.ภทรพร รตนวาร ศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต

นายทวศกด มะลมาศ มหาวทยาลยขอนแกน

ไดรบทนอดหนนจากมหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา ปงบประมาณ 2554

49

บทคดยอ ชอรายงานการวจย : การพสจนเอกลกษณของแบคทเรยกรดน าสม ทคดแยกไดจากเกาะลนตานอย จงหวดกระบ ประเทศไทย ชอผวจย : นางสาวธนขวญ บษบน ชอผวจยรวม : ดร.ภทรพร รตนวาร : นายทวศกด มะลมาศ ปททาการวจย : 2554

.................................................................................................... การพสจนเอกลกษณของ แบคทเรยกรดน าสม ท ง 89 สายพนธทคดแยกไดจากดอกไมในเกาะลนตานอยจงหวดกระบ ประเทศไทย ดวยวธ หาความสมพนธเชงววฒนาการโดยเปรยบเทยบลาดบเบสบนบรเวณ 16S rDNA กบสายพนธอางองและวธ Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตวคอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst NI สาหรบแบคทเรยกลม Gluconobacter และ Sty I และ SnaB I สาหรบแบคทเรยกรดน าสมกลม Asaia จากผลการทดลองสามารถจดจาแนกแบคทเรยกรดน าสมท ง 89 สายพนธ ทคดแยกไดจากดอกไมในเกาะลนตานอยจงหวดกระบออกเปน Gluconobacter japonicus 42 สายพนธ Gluconobacter cerinus 4 สายพนธ Gluconobacter oxdans 1 สายพนธ Gluconobacter albidus 2 สายพรธ, Asaia bogorensis 19 สายพนธ, Asaia siamensis 10 สายพนธ, Asaia spathodeae 8 สายพนธ และ Asaia Krungthepensis 3 สายพนธ

www.ssru.ac.th

50

Abstract Research Title : Identification of Acetic Acid Bacteria isolated from Lanta Noi island, Krabi province Thailand Author : Ms. Tanakwan Budsabun Cooperative author : Ms. Phattraporn Rattranawaree : Mr. Taweesak Malimas Year : 2011

................................................................................................. A total of 89 strains of acetic acid bacteria were isolated from Lanta noi island Krabi province Thailand were examined for their species identification beased on the 16S rDNA sequenceing and the restriction analyses of the 16s-23s rDNA internal transcribed spacer (ITS) regions with 4 restriction endonuclease Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, and Bst NI for genus Gluconobacter and the restriction analyses of the 16S rDNA regions with 2 restriction endonuclease Sty I and SnaB I for genus Asaia . The result obtained indicate that 42 strains are referred to the Gluconobacter japonicus, 4 strains are referred to the Gluconobacter cerinus, 1 strasin is referred to the Gluconobacter oxdans and 2 strains are referred to the Gluconobacter albidus, 19 strains are referred to the Asaia bogorensis, 10 strains are referred to the Asaia siamensis, 8 strains are referred to the Asaia spathodeae and 3 strains are referred to the Asaia Krungthepensis.

www.ssru.ac.th

51

กตตกรรมประกำศ

ขอขอบคณ ดร.ภทรพร รตนวาร และคณ ทวศกด มะลมาศ ทใหคาปรกษาทางดานเทคนคทางการวเคราะห ขอขอบคณสาขาวชาชววทยาประยกต, สาขาวชาเคม และ สาขาวชา จลชววทยา มหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทาและ BIOTEC culture collection Lab (BCC) ทกรณาใหความอนเคราะหดานเครองมอ อปกรณ สถานทและสารเคมทใชในงานวจย นางสาว ธนขวญ บษบน 30 กนยายน 2554

www.ssru.ac.th

52

สำรบญ

เรอง หนำ บทคดยอ (๑) ABSTRACT (๒) กตตกรรมประกาศ (๓) สารบญ (๔) สารบญตาราง (๕) สารบญภาพ (๖) สญญาลกษณและคายอ (๘) บทท 1 บทนา 1 บทท 2 ตรวจเอกสาร 3 บทท 3 อปกรณ และวธการวจย 9 บทท 4 ผลการวจย 15 บทท 5 สรปผลการวจยและวจารณผลการวจย 33 บรรณานกรม 43 ภาคผนวก 47

ประวตผวจย 49

www.ssru.ac.th

53

สำรบญตำรำง ตำรำงท หนำ 3.1 การหาภาวะทเหมาะสมในการเพมปรมาณ DNA เปาหมายดวยวธ PCR 11 3.2. การเพมปรมาณ DNA เปาหมายดวยวธ PCR 11 4.1 แสดงผลการเปรยบเทยบลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA 24 ระหวางแบคทเรยกรดน าสมทคดแยกไดจากเกาะลนตานอย จงหวดกระบกบแบคทเรยกรดน าสมสายพนธอางองโดยใช โปรแกรมEZ taxon 5.1 แสดงผลสรปการจดจาแนกแบคทเรยกรดน าสมทพบใน 39 เกาะลนตานอยจงหวดกระบและดอกไมทคดแยกได

www.ssru.ac.th

54

สำรบญภำพ ภำพท หนำท 2.1 แสดงความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรย 4 ผลตกรดน าสมสายชใน family Acetobacteraceae โดยอาศย พ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธ ตามลาดบววฒนาการบรเวณ 16S rDNA 4.1 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสม 16 ทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ ทจดอยในจนส Gluconobacter โดยอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและ ความสมพนธตามลาดบววฒนาการบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวนโดยใช 800R เปนไพรเมอรเพยงไพรเมอรเดยว 4.2 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสม 17 ทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ ทจดอยในจนส Asaia โดยอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบ ววฒนาการบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวนโดยใช 800R เปนไพรเมอร เพยงไพรเมอรเดยว 4.3 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสม 20 ทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ กลม G1 สายพนธ ME4201,S501 และ D2301 ทจดอยในจนส Gluconobacter โดยอาศยพ นฐาน การวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการของลาดบ เบสบรเวณ 16S rDNA 4.4 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสม 21 ทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ กลม G3 สายพนธ D3501 และ S2702 ทจดอยในจนส Gluconobacter โดยอาศยพ นฐาน การวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการของ ลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA 4.5 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสม 22 ทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ กลม G4 สายพนธ Ma25 และ Me2203 ทจดอยในจนส Gluconobacter โดยอาศยพ นฐาน การวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการของ ลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA 23

www.ssru.ac.th

55

สำรบญภำพ(ตอ)

ภำพท หนำท 4.6 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสม 23 ทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ กลม A1 สายพนธ S2201,S2202 และ S35 ทจดอยในจนส Asaia โดยอาศยพ นฐานการวเคราะห ลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการของลาดบเบสบรเวณ 16S rDNAโดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) 4.7 แสดงรปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองบนแผนเจลอะกาโรสเมอ 25 ถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Mbo IIและ Sdu I 4.8 แสดงรปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองบนแผนเจลอะกาโรสเมอ 26 ถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Taq I และ BstN I 4.9 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA 27 ของGluconobacter ท ง 9 สายพนธ ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ16S-23S rDNA gene ITS ดวย เอนไซม restriction endonucleases รป ( E ) ถกตดดวยเอนไซม MboII รป (F) ถกตดดวยเอนไซม Sdu I (Bsp1286 I ) 4.10 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA ของ 28 Gluconobacter ท ง 9 สายพนธ ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ 16S-23S rDNA gene ITS ดวย เอนไซม restriction endonucleases รป ( G ) ถกตดดวยเอนไซม Taq I รป (H ) ถกตดดวยเอนไซม BstN I 4.11 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA 29 ของGluconobacter D2301,S501 และ ME4201 ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ16S-23S rDNA gene ITS ดวย เอนไซม restriction endonucleases MboII และBsp 1286 I 4.12 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA 29 ของGluconobacter D2301, S501 และ ME4201 ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ 16S-23S rDNA gene ITS ดวย เอนไซม restriction endonucleases Taq I และ BstN I 4.13 แสดงรปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองบนแผนเจลอะกาโรส 30 เมอถกตดดวย เอนไซมตดจาเพาะ Sty I 4.14 แสดงรปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองบนแผนเจลอะกาโรส 31 เมอถกตดดวย เอนไซมตดจาเพาะ SnaB I 4.15 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA 32 ของ Asaia ท ง 3 สายพนธ ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ 16S rDNA gene ดวย เอนไซม restriction endonucleases รป ( I ) ถกตดดวยเอนไซม Sty I รป (J ) ถกตดดวยเอนไซม SnaB I

www.ssru.ac.th

บทท1 บทน ำ

จากงานวจย ทผานมาของ นางสาวธนขวญ บษบน นายทวศกด มะลมาศ และ ดร.ภทรพร รตนวาร เรอง ความหลากหลายของอะซตกแอซด แบคทเรย ทคดแยกไดจากดอกไม ในเกาะลนตานอยจงหวดกระบ ปพ.ศ.2552 ซงไดรบทนวจยจากมหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา ไดทาการคดแยกแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชจากตวอยางดอกไม จากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ ในเบ องตนดวยวธทางสณฐานวทยาและวธทางชวเคม พบแบคทเรยกรดน าสมท งหมด 90 สายพนธ และไดทาการจดจาแนกในเบ องตน ถงระดบสกล พบแบคทเรยกรดน าสมสกล Asaia จานวน 39 สายพนธ สกล Gluconobacter จานวน 47 สายพนธ และเปน Unidentify จานวน 4 สายพนธ

การศกษาในคร งน จงจะทาการจดจาแนก แบคทเรยกรดน าสมท งหมด 90 สายพนธ ทคดแยกไดจากดอกไม จากเกาะลนตานอยจงหวดกระบกลมน ในระดบสปชสดวย เทคนคการหาความสมพนธของลาดบเบสบนบรเวณจาเพาะของสารพนธกรรม (DNA Sequencing) โดยจะทาการหาลาดบเบสทบรเวณ 16S rDNA โดยในเบ องตนจะทาการหาลาดบเบสทบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวนกอน (partial sequence) โดยใชไพรเมอร(primer) เพยงเสนเดยวคอ 800R นาผลทไดมาวเคราะหความสมพนธเพอหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon และหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒน (Phylogenetic Tree) โดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 สายพนธทไมสามารถสรปผลการวเคราะหไดดวยการวเคราะหลาดบเบสแบบบางสวน จะทาการวเคราะหลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA แบบสมบรณ (Full Sequence) โดยใชไพรเมอรเพมข นอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F นาผลทไดมาวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon และหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนง จากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) โดยแบคทเรยกรดน าสมทอยในจนส Gluconobacter ทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S - 23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ BstN I (yukphanและคณะ,2004) สวนแบคทเรยทจดอยในจนส Asaia จะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S rDNA โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 2 ตว คอ Sty I และ SnaB Iหากยงไมสามารถสรปผลการวเคราะหเพอทาการจดจาแนกพบแบคทเรยกรดน าสมในระดบสปชสได จะทาการวเคราะหเพมเตมดวย วธการหาเปอรเซนตความคลายคลงกนของสารพนธกรรม (DNA-DNA Hybridization) ระหวาง แบคทเรยกรดน าสม ทคดแยกไดจากงานวจยกบ แบคทเรยกรดน าสมสายพนธอางอง (Type strains) ตอไป

1.1 วตถประสงคของกำรวจย 1.1.1 พสจนเอกลกษณแบคทเรยกรดน าสมทคดแยกไดจากเกาะลนตานอย จงหวดกระบ 1.1.2 เพอใหไดขอมลดานความหลากหลายทางชวภาพของแบคทเรยกรดน าสม ในเกาะลนตานอยจงหวดกระบในระดบสปชส

www.ssru.ac.th

2

1.2. ผลทคำดวำจะไดรบ 1.2.1 สามารถจดจาแนกแบคทเรยกรดน าสม ทคดแยกไดจากดอกไมในเกาะลนตานอยจงหวดกระบ จนถงระดบสปชส 1.2.2 ไดขอมลดานความหลากหลายของ แบคทเรยกรดน าสม ทพบในดอกไมในเกาะลนตานอยจงหวดกระบ 1.2.3 ไดขอมลพ นฐานทสามารถนาไปตอยอดงานวจย เพอใชประโยชนแบคทเรยกรดน าสมทคดแยกไดในระดบอตสาหกรรมตอไป 1.3 ระยะเวลำทท ำกำรวจย

ตลาคม 2553 – กนยายน 2554 1.4 สถำนทท ำกำรวจย หองปฏบตการจลชววทยา ศนยวทยาศาสตร คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา

www.ssru.ac.th

3

บทท 2 ตรวจเอกสำร

การจดจาแนกอะซตกแอซดแบคทเรยจนถงระดบสปชน นมอยหลายวธ ยกตวอยางเชน

การจดจาแนกโดยใชวธการวเคราะหรปแบบดเอนเอ ทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) , เทคนคการหาลาดบเบสบนบรเวณจาเพาะของสารพนธกรรม (DNA Sequencing) และวธการหาเปอรเซนตความคลายคลงกนของสารพนธกรรม (DNA-DNA Hybridization)

แบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชจดอยใน Family Acetobacteraceae ซง family Acetobacteraceae ซงมท งหมด 13 สกล ดงน Acetobacter (Beijerinck, 1898), Gluconobacter (Asai, 1935), Acidomonas (Urakami et al., 1997), Gluconacetobacter ( Yamada et al., 1997 ), Asaia (Yamada et al., 2000) , Kozakia (Lisdiyanti et al., 2002) , Swaminathania (P.Loganathan and Nair, 2004), Saccharibacter (Jogima et al., 2004), Neoasaia (Yukphan, 2005), Granulibacter (Green berg et al., 2006) , Tanticharoenia (Yukphan, 2008), Ameyamaea (Yukphan, 2009), Neokomagataea (Yukphan, 2011), โดยการจดจาแนกดงกลาวอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบ นวคลโอไทด และความสมพนธตามลาดบววฒนาการบรเวณ 16S rDNA (ดงรป ท 1.) ( Sievers et al., 1994 ; Yamada et al., 2000 ) รวมไปถงลกษณะทาง ฟโนไทดของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายช เปนสาคญ Family Acetobacteraceae และสกลตางๆ

ในป 1898 Beijerinck ไดพบสกล Acetobacter ซงเปนแบคทเรยแกรมลบ รปทอนตองการอากาศในการดารงชวต และสามารถผลตกรดอะซตกจากเอทานอลและไดต ง Acetobacter aceti เปนสายพนธแรกในสกลน

ในป 1935 Asai เสนอสกลท 2 ของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชและใหชอวา Gluconobacter ชงมลกษณะแตกตางจากสกล Acetobacter โดยทสายพนธของสกล Acetobacter สามารถออกซไดซเอทานอลไปเปนอะซตกไดอยางรวดเรว ( Beijerinck, 1989 ) ในขณะทสายพนธของสกล Gluconobacter สามารถออกซไดซกลโคสไปเปนกรดกลโคนกไดอยางรวดเรวกวาสกลของ Acetobacter

ในป 1942 Vaughn จาแนกชนดของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชตามการออกซไดซอะซเตทและแลคเตทเปน 2 กลมคอ กลมทสามารถออกซไดซอะซเตทไปเปนคารบอนไดออกไซดกบน าและกลมทไมสามารถออกซไดซอะซเตท อยางไรกตาม การจาแนกโดยวธน ไมสามารถบงช ชนดของแบคทเรยดงกลาวในระดบสกลได

www.ssru.ac.th

4

ภำพท 2.1 แสดงลกษณะควำมสมพนธทำงสำยกำรววฒนำกำรของแบคทเรยผลตกรดน ำสมสำยช ใน Family Acetobacteraceae โดยอำศยพ นฐำนกำรวเครำะหล ำดบนวคลโอไทดและควำมสมพนธตำมล ำดบววฒนำกำรบรเวณ 16S rDNA ทมำ: Greenberge et al., 2006

ในป 1954 Leifson พบวาการทดสอบการออกซไดซอะซเตทและแลคเตทและชนดของแฟลกเจลลา สามารถจาแนกชนดของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชเปน 2 สกล คอกลมทม แฟลก เจลลารอบเซลล (peritrichous flagella) และสามารถออกซไดซอะซเตท และแลกเตทไดคอ Acetobacter และกลมทมแฟลกเจลลาทข วเซลล (polar flagella) และไมสามารถออกซไดซ อะซเตท และแลกเตทซงเปนสกลใหม เรยกวา “Acitomonas” ซงมลกษณะเหมอนกบสกล Gluconobacter ทเสนอโดย Asai ในป 1935

www.ssru.ac.th

5

ในป 1961 De Ley กลาววา Gluconobacter oxydans พบกอน Acitomonas oxydans จงจด Acitomonas oxydans เปน Gluconobacter oxydans

ในป 1964 Asai และคณะ พบวา 2 สกลของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชเปนสายพนธ ทม polar flagellated intermediate ซงไมสามารถออกซไดซอะซเตท แตสามารถออกซไดซ แลคเตทได

ในป 1968 Yamada และคณะ ไดศกษาการกระจายของสารประกอบยบควโนน พบวาสายพนธทม polar flagellated intermediate จะม Q-8 เปนยบควโนนหลก นอกจากน ยงพบวา สกล Acetobacter และสกล Gluconobacter ม Q-9 และ Q-10 เปนยบควโนนหลกตามลาดบ

ในป 1980 Swings และคณะ ไดเสนอวาสายพนธทม polar flagellated intermediate เปนสกล Frateuria ซงเปนสกลใหมใกลเคยงกบ Pseudomonas และ Xanthomonas โดยอาศยพ นฐานของ DNA : rRNA : hybridization ในป 1983 Yamada และคณะ ไดเสนอ subgenus Acetobacter และ Gluconacetobacter ในสกล Acetobacter โดยใชพ นฐานการกระจายของสารประกอบยบควโนน

ในป 1983 Gossele และคณะ กบ De Lay (1984) และคณะ ไดต งอะซตกแอซดแบคทเรยข น 2 สกล คอ Acetobacter และ Gluconacetobacter ใน Family Acetobacteraceae

ในป 1989 Urakami และคณะ ไดต งสกลท 3 ข นใน family Acetobacteraceae เรยกวา Acidomonas ซงสกลน จะมลกษณะเฉพาะดงน คอ ชอบกรด เจรญไดในททมอากาศเลกนอยและเปนแบคทเรยทผลตน าสมสายชทสามารถเจรญไดในเมทานอล ผลการศกษาน ไดรบการสนบสนนจาก Bulygina et al.,(1992)โดยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทด 5S rRNA และการศกษาของ Yamada et al., (1997) โดยใชพ นฐานการวเคราะหลาดบ นวคลโอไทดของ 16S rRNA และยบควโนน

ในป 2000 Yamada และคณะ เสนอสกลท 5 ของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชซงมชอวา Asaia ซงคดแยกไดจากดอกชงโค (Bauhinia purpurea, Linn.) ดอกพยบหมอก (Plumbago auriculata, Lam. Lead Wort.) และน าขาวเหนยวหมก จากประเทศอนโดนเซย ซงแบคทเรยสกลน สามารถเจรญไดดในอาหารเล ยงทมความเขมขน ของน าตาลกลโคสสงถง 30%

ในป 2002 Lisdiyanti และคณะ เสนอสกลท 6 ของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชซงมชอวา Kozakia ซงแยกไดจากน าตาลปาลมสน าตาลและธญพชในบาหล ประเทศอนโดนเซย ซงแบคทเรยสกลน มลกษณะพเศษคอ สามารถผลต levan-like polysaccharide จากน าตาลซโครสได

ในป 2002 Treck และ Teuber รายงานการจดจาแนกแบคทเรยผลตกรดน าสมสายชดวยวธการการวเคราะหรปแบบดเอนเอดวยเอนไซมตดจาเพาะ บรเวณ16S-23S rDNA internal transcribed spacer regions (16S-23S rDNA ITS –RFLP) ดวย เอนไซมตดจาเพาะ 2 ชนดคอ HaeIII และ HpaII ซงพบวาวธการดงกลาวใหผลตรงกบการจดจาแนกเดมเพยง 1 ใน 12 กลมเทาน น

ในป 2003 Lisdiyanti และคณะ รายงานการศกษาความหลากหลายของแบคทเรยทมความสามารถในการผลตกรดน าสมสายชใน ประเทศ อนโดนเซย ประเทศไทย และประเทศฟลปปนส และพบวา สกล Acetobacter พบในอาหารหมกดองและผลไม, สกล Gluconobacter พบไดท งในอาหารหมกดอง ผลไม ดอกไม และอนๆ, สามารถพบสกล Asaia จากดอกไม และสามารถพบสกล Kozakia ไดใน ธญพชบางชนดและในน าตาลปาลมสน าตาล

www.ssru.ac.th

6

ในป 2004 Yukphan และคณะ รายงานการศกษาการจดจาแนกสกล Gluconobacter ไดดวยวธการวเคราะหหาความสมพนธทางสายววฒนาการของลาดบนวคลโอไทด (16S-23S rDNA ITS sequencing) และการวเคราะห 16S-23S rDNA ITS –RFLP ดวยเอนไซมตดจาเพาะ 2 ชนดคอ MboII และ Bsp1286I ซงในคร งน นจากการศกษาดวยวธน พบวา สามารถจดจาแนกแบคทเรยในสกล Gluconobacter ในระดบสายพนธได

ในป 2004 Loganathan และ Nair เสนอสกลท 7 ของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชซงมชอวา Swaminathania ซงแยกไดจากบรเวณดนรอบราก ราก และลาตนขาวพนธพ นเมอง (Porteresia coarctata Tateoka) บรเวณปาชายเลนในประเทศอนเดย แบคทเรยสายพนธทแยกไดมลกษณะพเศษคอ สามารถเจรญในสภาวะทม 3% เกลอ (NaCl) และ 1 % KNO3 ได

ในป 2004 Jogima และคณะ เสนอสกลท 8 ของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายช ซงแยกไดจากเกสรดอกไมในประเทศญปน และต งชอวา Saccharibacter floricola แบคทเรย สายพนธน จดเปน osmophilic acetic acid bacteria เนองจากเจรญไดเฉพาะในสภาวะทมน าตาลกลโคส เขมขนรอยละ 20-30

ในป 2005 Yukphan และคณะ เสนอสกลท 9 ของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายช และต งเปนสกล Neoasaia ซงแยกไดจากดอกขงแดง (Alpinia purpurata, (vieill.) K. Schum.) ในจงหวดเชยงใหม, ประเทศไทย

ในป 2005 Trcek ไดรายงานถงวธการจดจาแนกแบคทเรยผลตกรดน าสมสายชดวยการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดบรเวณ pyroloquinoline quinone (PQQ)-dependent alcohol dehydrogenase (ADH) gene และยนยนผลการแสดงออกของยนบรเวณดงกลาว เพอเสนอวาสามารถใชในการจดจาแนกแบคทเรยได เนองจากมบรเวณอนรกษ (conserved regions) และบรเวณแปรผน (variation regions) อยซงมคณสมบตเชนเดยวกบ 16S rDNA แตอยางไรกตามวธการดงกลาวยงมขอมลไมเพยงพอในการจดจาแนกเพยงลาพงไดและยงมขอจากดอยในบางสกล เชน Asaia เพราะกระบวนการแสดงออกของยนถกยบย งหรอ ADH ไมเกดกจกรม อยางไรกด Trcek ยงเสนอแนะวาวธน สามารถใชลาดบนวคลโอไทดบรเวณดงกลาวเปนเปาหมายในการวเคราะห PCR-specific primer product โดยเสนอใหใช ลาดบนวคลโอไทดของ Acetobacter aceti เปนตนแบบของ specific primer เพอตรวจหา PCR product ไดโดยตรง สาหรบตรวจหาแบคทเรยผลตกรดน าสมสายชในอตสาหกรรมผลตน าสมสายชหรออนๆ ได ซงเปนวธการทาง ชวโมเลกลทวเคราะหไดรวดเรวยงข น

ในป 2006 Yukphan และคณะไดรายงานการจดจาแนกสกล Asaia ดวยวธการ16S-23S rDNA ITS –RFLP ดวยเอนไซมตดจาเพาะ 2 ชนดคอ TaqI และ MvaI และพบวาวธการดงกลาวสามารถใชในการจดจาแนกไดในระดบสายพนธไดเพยงบางสายพนธเทาน น แตอยางไรกตามวธการดงกลาวยงสามารถใชเปนขอมลทางดานชวโมเลกลประกอบกบการวเคราะหหาลาดบ นวคลโอไทดบรเวณ 16S rDNA เพอจดจาแนก Asaia ในระดบสายพนธได ในปเดยวกนน Yukphan และคณะไดรายงานและเสนอการจดจาแนก Asaia ในระดบสายพนธดวยวธการวเคราะห 16S rDNA-RFLP โดยใช เอนไซมตดจาเพาะ 3 ชนด คอ StyI, BsaJI และ SnaBI พรอมกบใช16S-23S rDNA ITS –RFLP รวมวเคราะหอกดวย

Greenberg และคณะ (2006) เสนอสกลท 10 ของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชซงมชอวา Granulibacter โดยคดแยกไดจากผปวย chronic granulomatous ในประเทศสหรฐอเมรกา

www.ssru.ac.th

7

ในป 2007 Malimas และคณะไดเสนอสปชสใหมในจนส Gluconobacter คอ Glucobacter kondonii เพมข นจากทมอยเดม 3 สปชสไดแก G.oxydans , G.cerinus, G.frateurii โดยอาศยความแตกตางของลาดบเบสบน16s-23s rDNA บรเวณ ITS( DNA sequencing) และทาการทดสอบหาความแตกตางของสารพนธกรรมดวยวธ DNA-DNA hybridization โดยใชวธ photobiotin labeling method

ในป 2008 Malimas และคณะไดเสนอสปชสใหมในจนส Gluconobacter เพมข นอก 2 สปชสคอ Glucobacter roseus และ Glucobacter sphaericus โดยระบความแตกตางของแตละสปชสโดยอาศยความแตกตางของลาดบเบสบน16s-23s rDNA บรเวณ ITS( DNA sequencing) ,การจดจาแนกโดยใชวธการวเคราะหรปแบบดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจล ทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (Restriction Fragment Length Polymorphism )รวมกบทาการทดสอบหาความแตกตางของสารพนธกรรมดวยวธ DNA-DNA hybridization โดยใชวธ photobiotin labeling method

2.1 ลกษณะของแบคทเรยทผลตกรดน ำสมสำยชในจนส Gluconobacter

แบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชเปนแบคทเรยแกรมลบ เซลลรปรางรจนถงทอน ขนาดของเซลลประมาณ 0.6-0.8 x1.0-4.0 ไมโครเมตร การจดเรยงตวของเซลลมหลายลกษณะอาจพบเปนเซลลเดยว จบกนเปนค หรอเรยงตอกนเปนสายยาวคลายโซ ลกษณะโคโลนของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชมสชมพ สขาวหรอสครม ตองการอากาศในการดารงชวต (obligately aerobic ) มออกซเจนเปนตวรบอเลกตรอนตวสดทาย( terminal electron acceptor ) ในกระบวนการเปลยนแปลงอาหาร สายพนธทไมสรางรงควตถสน าตาล จะพบมากในสกล Acetobacter และGluconacetobacter แบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชอยใน Family Acetobacteraceae ซงเปนแบคทเรยทชอบกรด (acidophillic) จดอยใน α -subdivision ของ Proteobacteria (De Ley et al., 1984 ; และ Sieve et al., 1994) สายพนธทอยใน family น สามารถเจรญไดดทมความเปนกรด-ดางตาและสามารถออกซไดซเอทานอลไปเปนกรดอะซตกได โดยเกดปฏกรยา แอลกอฮอลดไฮโดรจเนส (alcohol dehydrogenase) หรอ (ADH) และอลดไฮด ดไฮโดรจเนส (aldehyde dehydrogenase) หรอ (ALDH) ซงอยบนเยอหมไซโทพลาสซมและในหวงโซ การหายใจ ลกษณะความแตกตางของแตละสกลของแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายช แบคทเรยผลตกรดน าสมในจนส Gluconobacter (Asai, 1935) เซลลมรปรางรถงเปนทอน ขนาด 0.5-1.0 x 2.6-4.2 ไมโครเมตร พบเปนเซลลเดยวหรอเปนคไมคอยพบตอกนเปนสายยาว อาจพบเปนเซลลผดปกตขนาดใหญ (Holt et al.,1989) ไมสรางเอนโดสปอร ตดสแกรมลบ มท งแบบเคลอนทไดและเคลอนทไมได ถาเคลอนทไดจะม polar flagella 3-8 อนโคโลนสขาวหรอสครม มลกษณะคลายกบสกล Acetobacter แตแตกตางกนทไมสามารถออกซไดซอะซเตทและเลกเตทไปเปนคารบอนไดออกไซดและน า(De Ley and Swing, 1984) มยบควโนน-10 (Q-10) (Yamada et al., 1968) ผลการทดสอบออกซเดส (oxidase) การรดวซไนเตรท (nitrate reduction) และการผลตอนโดล (indole) เปนลบ ไมยอยเจลลาตน สรางคโตนจากโพลแอลกอฮอลอยางรวดเรว (strong ketogenesis) สรางจากกรดน าตาลด-กลโคส และด-ไซโลสทกสายพนธมการผลตกรด 2-คโตน กลโคนก (2-ketogluconic acid ) และกรด 5-คโตน กลโคนก (5-ketogluconic acid ) อณหภมทเหมาะสมสาหรบการเจรญคอ 25-30 องศาเซลเซยส แตไมเจรญทอณหภม 37 องศาเซลเซยส ชวง

www.ssru.ac.th

8

ความเปนกรด-ดางทเหมาะสมตอการเจรญคอ 5.5-6.0 สวนใหญสามารถเจรญไดทพเอสตา (pH 3.6) (Holt et al., 1994) ปจจบนมสมาชกท งหมด 12 สายพนธ ไดแก G. oxydans, G. cerinus, G. albidus, G. thailandicus (Somboon et al., 2004) , G. frateurii, G. japonicus, G. kondonii, (Malimas.et al. ,2007), G. roseus , (Malimas.et al.,2008) , G. sphericus (Malimas.et al.,2008) G. kanchanaburensis (Malimas.et al.,2011), G. wancherniae (Yukphan.et al.,2010), G.nephelii (Komanee.et al.,2011) 2.2 ลกษณะของแบคทเรยทผลตกรดน ำสมสำยชในจนส Asaia Asaia มลกษณะแตกตางจากแบคทเรยทผลตกรดน าสมสายชตวอนๆ เนองจากไมสามารถผลตกรดหรอผลตอะซตกไดนอยในปจจบน สกล Asaia แบงออกเปน 5 สายพนธดวยกน คอ Asaia bogorensis (Yamada et al., 2000), A. siamensis (katsura et al., 2001), A. krunkthepensis (Yukphan et al., 2004), A. lannaensis (Malimas.et al.,2008) และ A. spathodeae (Komanee.et al.,2011) มท งสายพนธทเคลอนทไดและเคลอนทไมได สายพนธทเคลอนทไดจะมแฟลกเจลลาแบบรอบเซลล สามารถเจรญไดในอาหารทดสอบทมความเปนกรด-ดาง 3.0 อณหภม 30 องศาเซลเซยส และสามารถเจรญในสภาวะทมน าตาลกลโคสความเขมขน 30 เปอรเซนตได แตถกยบย งการเจรญในอาหารทดสอบทมกรดอะซตกความเขมขน 0.35 เปอรเซนต ไมสามารถเจรญ ในอาหารทมเฉพาะเมทานอลเปนแหลงคารบอน สามารถผลตไดไฮดรอกซอะซโตน (dihydroxyacetone) จากกลเซอรอลไดนอยมาก สามารถผลตกรด 2- คโตกลโคนก (2-ketogluconic-acid) และกรด 5-คโตกลโคนก (5-ketogluconic-acid) แตไมสามารถผลตกรด 2,5 ไดคโตกลโคนค (2,5-diketogluconic-acid) จากน าตาลด- กลโคส ผลตกรดจากน าตาล ด-กลโคส( D-glucose ) ด-แมนโนส (D-mannose) ด-ฟลกโตส (D-fructose) แอล-ซอรโบส (L-sorbose) ไรบทอล (ribitol) กลเซอรอล (glycerol)และเมลลไบโอส (melibiose) แตไมสามารถผลตกรดจากน าตาลแลคโตสและมอลโตส Asaia bogorensis สามารถผลตกรดจากน าตาลดอลซทอล(dulcitol) ได แต A. siamensis ไมสามารถผลตกรดจากน าตาลดอลซทอล (dulcitol) ได และ ม ยบควโนน 10 (Q-10) เปนยบควโนนหลก

www.ssru.ac.th

9

บทท 3

อปกรณ และวธกำรวจย

3.1 อปกรณทใชในกำรทดลองและ เคมภณฑ 3.1.1 สารเคม

ฟนอล (Phenol ) คลอโรฟรอม (Chloroform ) ไอโซเอมลแอลกอฮอล (iso-Amylalcohol ) กรดอะซตกเขมขน (Glacial acetic acid) โซเดยมอะซเตท แอนไฮดรส (Sodium acetate anhydrous) แอลกอฮอลบรสทธ (Absolute ethanol) แอลกอฮอล 70 เปอรเซนต (70% Alcohol) แอลกอฮอล 95 เปอรเซนต (95% Alcohol) กลเซอรอล (Glycerol) ด-กลโคส (D-glucose) เบตา-ด-กาแลกโตซเดส –สเตรปตาวดน (β-D-galactosidase-streptavidin) เบตา-ด-กาแลกโตไพราโนไซด(4MUF-β-D-galactopyranoside ) เดรกแทนซลเฟต( Dextran sulfate ) โพลไวนลไพโรลโดน (Polyvinyl pyrolidone ) ฟอรมาไมด (Fomamide ) ฟคอล 400 (Ficoll 400 ) โบวนซรมอลบมนแฟกเตอร ว (Bovine serum albumin factor V ) สารละลายโฟโตไบโอตน (Photobiotin solution ) แซลมอนสเปรม ดเอนเอ (Salmon sperm DNA )

3.1.2 จลนทรยทดสอบ ประกอบดวยสายพนธอางองดงน Acetobacter aceti NBRC 14818T

Gluconobacter oxydans NBRC 14819 T Gluconobacter frateurii NBRC 3264 T Gluconobacter cerinus NBRC 3267 T Gluconobacter thailandicus F149-1T Gluconobacter albidus NBRC 3250 T Gluconobacter kondonii NBRC 3266 T Gluconobacter roseus NBRC 3990 T Gluconobacter sphericus NBRC 12467 T Gluconobacter japonicus NBRC 3271 T Gluconobacter japonicus NBRC 3269

www.ssru.ac.th

10

Asaia bogorensis BCC 12264T Asaia siamensis BCC 12268T Asaia krungthepensis BCC 12978T Asaia lannaensis BCC 15733T Asaia spathodeae BCC 36458T

3.1.3 อปกรณอนๆทใชในการทดลอง ชดแยกสารพนธกรรมดวยไฟฟา(Gel-Electrophoresis Instrument) เครองบนทกภาพเจล(Gel-documentation)

เครองปนเหวยง (centrifuge) ไมโครปเปต (micropipette)

3.2 กำรสกด DNA ส ำหรบกำรเพมปรมำณดวยวธ PCR ในการสกด DNA จากเซลลจลนทรยเพอนามาเพมปรมาณดวยวธ PCR มรายละเอยด

ดงน 3.2.1 แขวนลอยเซลลจลนทรยใน TE buffer 360 µl (pH 8)

3.2.2 เตมเอนไซมไลโซไซม บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท 3.2.3 เตม 10% SDS 40 µl บมทอณหภม 55 องศาเซลเซยสนาน 10 นาท 3.2.4 เตม 400 µl ของสารประกอบ Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol(25:24:1) 3.2.5 นาไปปนเหวยงตกตะกอนทความเรว 13000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท 3.2.6 เตมสารประกอบ Chloroform:Isoamyalcohol(24:1)ปรมาตร 400 µl 3.2.7 ปนตกตะกอนอกคร งทความเรว 13000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท 3.2.8 เตม 3 M โซเดยมอะซเตต 1ตอ10 โดยปรมาตร 3.2.9 เตมเอธานอลเยน 2 เทาโดยปรมาตร 3.2.10 ทาการเกบ DNA ดวยแทงแกว 3.2.11 รอจน DNA ทพนอยรอบแทงแกวแหง 3.2.12 ละลาย DNA ทไดในน ากลน 100-200 µl 3.2.13 เกบสารละลาย DNA ท-20 องศาเซลเซยส 3.3 กำรเพมจ ำนวน DNA ดวยวธ PCR

3.3.1 การเพมปรมาณ DNA ดวยวธ PCR บรเวณ 16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) โดยใช ไพรเมอร 2 เสนคอ 1522F-16S(5’-TGC GG(CT)TGG ATC ACC TCC T-3’ , ตาแหนง1522-1540) และ38-R-23S (5’-GTG CC(AT) AGG CAT CCA CCG-3’, ตาแหนง38-22) การเพมจานวน DNA ดวยวธ PCR แบงออกเปน 3 ข นตอนคอข นตอนแรกหาความเขมขนทเหมาะสมของ DNA template และหาสภาวะทเหมาะสมสาหรบการทา ปฏกรยา PCRข นตอนทสองคอการเพมจานวน DNA เปาหมายดวยวธ PCRข นตอนทสามเปนการทาให DNA ทไดบรสทธ

3.3.1.1 DNA ทสกดไดจะถกนามาทดสอบหาสภาวะทเหมาะสมในการเพมปรมาณ DNA ดวยวธ PCR ดงแสดงรายละเอยดไวในตารางท 3.1.

www.ssru.ac.th

11

ตารางท 3.1 การหาภาวะทเหมาะสมในการเพมปรมาณ DNA เปาหมายดวยวธ PCR

3.3.1.2 เพมจานวน DNA เปาหมายดวยวธ PCRโดยนาภาวะทเหมาะสมรวมถงความ เขมขนทเหมาะสมของ DNA template ในการทา PCR จากข นตอนท 3.4.1 มาทาการเพมปรมาณ DNA เปาหมายดงไดแสดงรายละเอยดไวในตารางท 2 ตารางท 3.2. การเพมปรมาณ DNA เปาหมายดวยวธ PCR

www.ssru.ac.th

12

3.3.2 การทาให DNA ทไดจากการเพมปรมาณดวยวธ PCR บรสทธ โดยนาDNA ทได จากการเพมปรมาณดวยวธ PCR จะถกทาใหบรสทธดวย QIA quick column ซงมรายละเอยดดงน 3.3.3.1 เตม สารละลาย PBI 450 µl ลงในหลอดเซนตฟวขนาด 1.5 มลลลตร 3.3.3.2 เตมสารละลาย DNA ทไดจากการทา PCR 95 µl ผสมใหเขากน 3.3.3.3 ถายสารละลายท งหมดลงใน QIAquick column 3.3.3.4 ปนเหวยงท 8000 รอบตอนาทเปนเวลา 30 วนาท ท งสวนใส 3.3.3.5 เตม PE บฟเฟอร 750 µl ลงใน QIAquick column 3.3.3.6 ปนเหวยงท 10000 รอบตอนาทเปนเวลา 1 นาท ท งสวนใส 3.3.3.7 QIAquick column ไปยงหลอดเซนตฟวขนาด 1.5 มลลลตรอนใหม 3.3.3.8 เตม EB บฟเฟอร 30 µl ลงไปใน QIAquick columnบมทอณหภมหองนาน 10 นาท 3.3.3.9 ปนเหวยงท 10000 รอบตอนาทเปนเวลา 1 นาท 3.3.3.10 เกบ DNA ทไดไวท -20 องศาเซลเซยส 3.4 กำรวเครำะห DNA ดวยวธ Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP) 3.4.1 สาหรบจนส Gluconobacter จะนา DNA ทไดจากการเพมปรมาณดวยวธ PCR ทบรเวณ 16S - 23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) และถกทาใหบรสทธแลวจะถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตวคอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst NI แบงสภาวะในการทาปฏกรยาออกเปน 4 ปฏกรยาทแตกตางกนตามชนดของเอนไซมตดจาเพาะ ทาการตดตามผลการทดลองดวยวธ agarose gel electrophoresis โดยใช 1.7 µl ของ 50 bp DNA ladder(ผสมกบ 1.2 µl 6x loading dye) เปน markerและเปรยบเทยบรปแบบของช น DNA บนแผนอะกาโรสเจลโดยเทยบกบดเอนเอของสายพนธอางองไดแก Gluconobacter oxydans NBRC 14819T, G.cerinus NBRC 3267T, G.frateurii NBRC 3264T, G.albidus NBRC 3250T, G.thailandicus F149-1T, G.kondonii NBRC 3266T, G.roseus NBRC 3990T, G. sphericus NBRC 12467

T,G. japonicus NBRC 3271 Tและ G. japonicus NBRC 3269

www.ssru.ac.th

13

3.4.2 สาหรบจนส Asaia จะนา DNA ทไดจากการเพมปรมาณดวยวธ PCR ท16S rDNA และถกทาใหบรสทธแลวจะถกดวยเอนไซมตดจาเพาะ 2 ตวคอ Sty I และ SnaB I แบงสภาวะในการทาปฏกรยาออกเปน 2 ปฏกรยาทแตกตางกนตามชนดของเอนไซมตดจาเพาะ ทาการตดตามผลการทดลองดวยวธ agarose gel electrophoresis โดยใช 1.7 µl ของ 50 bp DNA ladder (ผสมกบ 1.2 µl 6x loading dye) เปน markerและเปรยบเทยบรปแบบของช น DNA บนแผนอะกาโรสเจลโดยเทยบกบดเอนเอของสายพนธอางองไดแก Asaia bogorensis BCC 12264T, A. siamensis BCC 12268T, A. krungthepensis BCC 12978T, A. lannaensis BCC 15733T, A. spathodeae BCC 36458T 3.5 กำรหำภำวะตนก ำเนดเดยวกนของ DNA ดวยวธ DNA-DNA Hybridization

3.5.1 การตดฉลาก DNA probe ดวย photobiotin 3.5.1.1 ดดสารละลาย ดเอนเอ ความเขมขน 1 มลลกรม/มลลลตร ปรมาตร 10

ไมโครลตร ใสในหลอดไมโครเซนตรฟวจขนาด 1.5 มลลลตร 3.5.1.2 เตมสารละลาย photobiotin ความเขมขน 1 มลลกรม/มลลลตร ปรมาตร 15 ไมโครลตร 3.5.1.3 นาสารละลายท งหมดไปสองดวยแสงไฟจากหลอด sun lamp (300 W) นาน 30 นาท ถาเปนชนดใหความรอนสงใชเวลา 15 นาท โดยใหหลอดเซนตรฟวจแชอยในน าแขง 3.5.1.4 เตม Tris-HCl buffer pH 9 ความเขมขน 0.1 M ปรมาตร 100 ไมโครลตร นาไปตมในน าเดอดนาน 10 นาท 3.5.1.5 เตม n-butanol 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากน จากน นนาไปเซนตรฟวจทความเรว 12,000 รอบตอนาทเปนเวลา 20 วนาท 3.5.1.6 ดดเอาสารละลายช นบนทมสสมท งใหหมด 3.5.1.7 เตม n-butanol 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากน จากน นนาไปเซนตรฟวจทความเรว 12000 รอบตอนาทเปนเวลา 20 วนาท 3.5.1.8 ดดเอาสารละลายช นบนทมสสมท งใหหมด 3.5.1.9 นาสารท งหมดทไดไปตมในน าเดอดนาน 15 นาท หลงจากน นทาใหเยนทนทดวยน าแขง 3.5.1.10 นาไปใสในอางน าคลนความถสง(sonicator bath) นาน 10 วนาท 3.5.1.11 นาไปผสมกบสารละลายไฮบรไดเซชนตามปรมาตรทไดคานวณไว 3.5.2 การตดฉลาก photobiotin ท DNA 3.5.2.1 นาDNAของสายพนธทตองการทดสอบ,สายพนธอางอง(Type strains),และ Calf thymus ปรมาณ 10 ไมโครกรม ไปตมในน าเดอดนาน 10 นาทหลงน นทาใหเยนทนทในน าแขง 3.5.2.2 ปรบปรมาตรใหเปน 400 ไมโครลตร ดวยน ากลน 3.5.2.3 เตมสารละลาย 2x PBS ปรมาตร 500 ไมโครลตร

www.ssru.ac.th

14

3.5.2.4 เตมสารละลาย MgCl2 ความเขมขน 0.1 M ปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากน 3.5.2.5 เตม DNA ลงใน microdilution well หลมละ 100 ไมโครลตร 3.5.2.6 บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 2 ชวโมง 3.5.2.7 เทสารละลาย DNA ออกลางดวยสารละลาย 1xPBS 2 คร ง

3.5.2.8 บมทอณหภม 60 องศาเซลเซยสเปนเวลา 2 ชวโมง 3.5.2.9 เตมสารละลาย pre-hybridization หลมละ100 ไมโครลตร 3.5.2.10 บมทอณหภมเทากบ Tm นาน 1 ชวโมง 3.5.2.11 เท pre-hybridization ท ง เตม hybridization solution ทม DNA

probeทตดฉลากดวย photobiotin ทเตรยมไวแลวในขอ 3.6.1 ปรมาณหลมละ 100 ไมโครลตร 3.5.2.12 บมทอณหภมเทากบ Tm เปนเวลา 15-18 ชวโมง

3.5.3 การตรวจวดผลการทดลองดวยวธ Colourimetric method 3.5.3.1 ลาง microdilution well จากขอ 3.6.2 ดวย 0.2x SSC buffer 3 คร ง 3.5.3.2 เตม Solution I ลงใน microdilution well หลมละ 100 ไมโครลตร 3.5.3.3 บมทอณหภม 30 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท 3.5.3.4 เท Solution I ท ง เตม Solution II ลงใน microdilution well หลมละ

100 ไมโครลตร 3.5.3.5 บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท 3.5.3.6 ลาง microdilution well ดวย 1x PBS 3 คร ง 3.5.3.7 เตม Solution III ลงใน microdilution well หลมละ 100 ไมโครลตร 3.5.3.8 บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท 3.5.3.9 เตม H2SO4 ความเขมขน 2M หลมละ 100 ไมโครลตร 3.5.3.10 วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 450 นาโนเมตร ดวยเครอง

microplate reader 3.5.3.11 คานวณหาคารอยละของ DNA homology

www.ssru.ac.th

15

บทท 4 ผลกำรวจย

จากการนาแบคทเรยกรดน าสมท ง 90 สายพนธทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ มาทาการจดจาแนกสปชสโดยวธ การหาความสมพนธของลาดบเบสบนบรเวณจาเพาะของสารพนธกรรม (DNA Sequencing) โดยจะทาการหาลาดบเบสทบรเวณ 16S rDNA โดยในเบ องตนทาการหาลาดบเบสทบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวนกอน (partial sequence) โดยใช ไพรเมอร(primer) เพยงเสนเดยวคอ 800R นาผลทไดมาวเคราะหความสมพนธเพอหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon ผลการทดลองพบวาแบคทเรยกรดน าสมท ง 90 สามารถจดอยในจนส Gluconobacter 49 สายพนธ, จนส Asaia 40 สายพนธ และ Frateuria 1 สายพนธคอสายพนธ ME2204 จากน นทาการแบงกลมของแบคทเรยกรดน าสมท งหมดตามขอมลเบ องตนทไดจากผลการเปรยบเทยบลาดบเบสทบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวน โดยใช 800R เปน ไพรเมอรเพยงเสนเดยว ออกเปน 2 กลม เพอนาขอมลมาหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒน(Phylogenetic Tree) โดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 โดยกลมแรกเปนแบคทเรยกรดน าสมทอยในจนส Gluconobacter ผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.1 และ กลมท สอง เปนแบคทเรยกรดน าสมทอยในจนส Asaia ผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.2 จากผลการทดลองทแสดงในภาพท 4.1 สามารถจดจาแนกแบคทเรยกรดน าสมทอยในจนส Gluconobacter ทคดแยกไดจากเกาะลนตานอยออกเปน 6 กลมดงน 1. กลม G1 เปนกลม Gluconobacter ทยงไมสามารถจดจาแนกสปชสไดแตมความใกลเคยงกบ G. frateurii และ G. japonicus สามาชกในกลมน ม 34 สายพนธไดแก D2103, S503, S502, S501, S4302, S4301, ME4203, ME4202, ME4201, ME3904, Me3903, ME39, MA3903, MA3902, MA3901, Ma3502, MA2006, MA2005, MA2004, MA2003, MA1201, G3901, G2802, G2801, G2704, G2703, G2702, G2404, G2002, D2702, D2302, D2301, MA2001, G3902 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะสมเลอก Gluconobacter เพอเปนตวแทนของกลมน ข นมา 3 สายพนธไดแก ME4201, S501 และ D2301 เพอนามาหาลาดบเบสของ 16S rDNA ของ Gluconobacter กลมน แบบสมบรณ ( full sequence) โดยใชไพรเมอรเพมอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F นาผลทไดมาวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon อกคร งหนงผลการทดลองดงแสดงไวในตารางท 4.1 และนาลาดบเบสของ 16S rDNA full sequence หาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนงผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.3 จากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอยนยนจดจาแนก Gluconobacter ในกลมน โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst N I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.11 และ 4.12

www.ssru.ac.th

16

ภาพท 4.1 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสมทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ ทจดอยในจนส Gluconobacter โดยอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวนโดยใช 800R เปนไพรเมอรเพยงไพรเมอรเดยว

www.ssru.ac.th

17

ภาพท 4.2 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสมทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ ทจดอยในจนส Asaia โดยอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวนโดยใช 800R เปนไพรเมอรเพยงไพรเมอรเดยว

www.ssru.ac.th

18

2. กลม G2 เปนกลม Gluconobacter ทจดอยใน G.frateurii หรอ G.japonicus สามาชกในกลมน ม 3 สายพนธไดแก D2801, D2802 และ G2001ดงน นการทดลองในข นตอไปจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอทาการจดจาแนก Gluconobacter ในกลมน ในระดบสปชส โดยจะทาเลอก สายพนธ D2801และ G2001 เปนตวแทนของกลมเพอทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst NI ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 3. กลม G3 เปนกลม Gluconobacter ทไมสามารถจดจาแนกสปชสไดแตมความใกลเคยงกบ G. frateurii และ G. japonicas สามาชกในกลมน ม 5 สายพนธไดแก D3501, D3502, MA2601, MA3503, S2702 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะสมเลอก Gluconobacter เพอเปนตวแทนของกลมน ข นมา 2 สายพนธไดแก D3501 และ S2702 เพอนามาหาลาดบเบสของ 16S rDNA ของ Gluconobacter กลมน แบบสมบรณ ( full sequence) โดยใชไพรเมอรเพมอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F นาผลทไดมาวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon อกคร งหนงผลการทดลองดงแสดงไวในตารางท 4.1 และนาลาดบเบสของ 16S rDNA full sequence หาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนงผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.4 จากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอยนยนจดจาแนก Gluconobacter ในกลมน โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst NI ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 4. กลม G4 เปนกลม Gluconobacter ทไมสามารถจดจาแนกสปชสไดแตมความใกลเคยงกบ G. cerinus สามาชกในกลมน ม 4 สายพนธไดแก Ma25, Ma2602, Me2203, Me3902 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะสมเลอก Gluconobacter เพอเปนตวแทนของกลมน ข นมา 2 สายพนธไดแก Ma25 และ Me2203 เพอนามาหาลาดบเบสของ 16S rDNA ของ Gluconobacter กลมน แบบสมบรณ ( full sequence) โดยใชไพรเมอรเพมอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F นาผลทไดมาวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon อกคร งหนงผลการทดลองดงแสดงไวในตารางท 4.1 และนาลาดบเบสของ 16S rDNA full sequence หาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนงผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.5 จากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอยนยนจดจาแนก Gluconobacter ในกลมน โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst NI ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 5. กลม G5 เปนกลม Gluconobacter ทจดอยใน G.oxydans หรอ G.roseus สามาชกในกลมน ม เพยง 1 สายพนธไดแก Ma1207 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะทาการวเคราะหสายพนธ Ma1207 เพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอทาการจดจาแนก Ma1207 ในระดบสปชส โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS

www.ssru.ac.th

19

โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst NI ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 6. กลม G6 เปนกลม Gluconobacter ทจดอยใน G.albidus หรอ G.kondonii หรอ G. sphaericus สามาชกในกลมน ม 2 สายพนธไดแก S1203 และ S1204 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะทาการวเคราะหสายพนธ S1203 และ S1204 เพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอทาการจดจาแนก Gluconobacterท งสองตวน ในระดบสปชส โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ BstN I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 จากผลการทดลองทแสดงในภาพท 4.2 สามารถจดจาแนกแบคทเรยทอยในจนส Asaia ทคดแยกไดจากเกาะลนตานอยออกเปน 4 กลมคอ 1. กลม Asaia bogorensis สมาชกในกลมน ม 19 สายพนธไดแก S2203, S2703, ME503, ME502, ME501, MA502, MA501, Ma1209, Ma1204, Ma1203, G2402, G12, D4202, D4201, D2701, D2401, D2104, D2102, D2101 ท งหมดถกจดจาแนกเปน Asaia bogorensis 2. กลม Asaia siamensis สมาชกในกลมน ม 10 สายพนธไดแก G2401, G2403, MA1202, MA1205, MA1206, S1201, S1202, S2101, S2102, S2103 ท งหมดถกจดจาแนกเปน Asaia siamensis 3. กลม Asaia spathodeae สมาชกในกลมน ม 8 สายพนธไดแก D2105, G2701, MA1101, ME2201, ME2202, ME2205, S2701, S4304 ท งหมดถกจดจาแนกเปน Asaia spathodeae 4. กลม A1 กลมน เปน Asaia ทยงไมสามารถจดจาแนกชนดได สมาชกในกลมน ม 3 สายพนธไดแก S2201, S2202, S35 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะหาลาดบเบสของ 16S rDNA ของ Asaia กลมน แบบสมบรณ ( full sequence) โดยใชไพรเมอรเพมอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F นาผลทไดมาวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon อกคร งหนงผลการทดลองดงแสดงไวในตารางท 4.1 และนาลาดบเบสของ 16S rDNA full sequence มาหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนงผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.6 จากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอยนยนจดจาแนก Asaia ในกลมน โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S rDNA โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 2 ตว คอ Sty I และ SnaB I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.15

www.ssru.ac.th

20

ภาพท 4.3 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสมทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ กลม G1 สายพนธ ME4201,S501 และ D2301 ทจดอยในจนส Gluconobacter โดยอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการของลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA

www.ssru.ac.th

21

ภาพท 4.4 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสมทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ กลม G3 สายพนธ D3501 และ S2702 ทจดอยในจนส Gluconobacter โดยอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการของลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA

www.ssru.ac.th

22

ภาพท 4.5 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสมทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ กลม G4 สายพนธ Ma25 และ Me2203 ทจดอยในจนส Gluconobacter โดยอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการของลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA

www.ssru.ac.th

23

ภาพท 4.6 แสดงลกษณะความสมพนธทางสายการววฒนาการของแบคทเรยผลตกรดน าสมทคดแยกไดจากดอกไมจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ กลม A1 สายพนธ S2201,S2202 และ S35 ทจดอยในจนส Asaia โดยอาศยพ นฐานการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดและความสมพนธตามลาดบววฒนาการของลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA

www.ssru.ac.th

24

ตารางท 4.1 แสดงผลการเปรยบเทยบลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA ระหวางแบคทเรยกรดน าสมทคด แยกไดจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบกบแบคทเรยกรดน าสมสายพนธอางองโดยใช โปรแกรม EZ taxon

ตวแทนแบคทเรยกรดน าสมสายพนธทคดแยกไดจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบ

แบคทเรยกรดน าสมสายพนธอางองทมความใกลเคยงมาทสด

รอยละของความเหมอนของลาดบเบสบรเวณ 16S rDNA ระหวางสายพนธทนามาเปรยบเทยบกบสายพนธอางอง

D3501 Gluconobacter japonicas NBRC 3271T

99.9

S2702 Gluconobacter japonicas NBRC 3271T

99.9

Ma25 Gluconobacter cerinus NBRC 3271T

99.9

Me2203 Gluconobacter cerinus NBRC 3271T

99.9

D2301 Gluconobacter japonicas NBRC 3271T

99.9

S501 Gluconobacter japonicas NBRC 3271T

99.8

ME4201 Gluconobacter japonicas NBRC 3271T

99.9

S35 Asaia krungthepensis AA08T(BCC 12978T)

99.8


99.8


99.8

ทาการวเคราะหดเอนเอแบคทเรยกรดน าสมจนส Gluconobacter โดยใชวธ RFLP โดย

ทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตวคอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst NI ทาการวเคราะหดเอนของอะซตกแอซดแบคทเรยจนส Gluconobacter สายพนธ ME4201, S501 , D2301, D2801, G2001 D3501 , S2702, Ma25 , Me2203, Ma1207, S1203และ S1204 ทถกตดโดยเอนไซมตดจาเพาะโดยเทยบกบดเอนเอของสายพนธอางอง 10 สายพนธไดแก Gluconobacter oxydans NBRC 14819 T, Gluconobacter frateurii NBRC 3264 T, Gluconobacter cerinus NBRC 3267 T, Gluconobacter thailandicus F149-1T, Gluconobacter albidus NBRC 3250 T, Gluconobacter kondonii NBRC 3266 T, Gluconobacter roseus NBRC 3990 T, Gluconobacter sphericus NBRC 12467 T, Gluconobacter japonicus NBRC 3271 T, Gluconobacter japonicus NBRC 3269

www.ssru.ac.th

25

(A)

(B) ภาพท 4.7 แสดงรปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองบนแผนเจลอะกาโรสเมอถกตดดวย เอนไซมตดจาเพาะ Mbo IIและ Sdu I รปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองทถกเพมปรมาณดวยวธ PCR ตรงบรเวณ16S-23S rDNA gene ITS บนแผนเจลอะกาโรสเมอถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (restriction endonucleases) : รป ( A ) ถกตดดวยเอนไซม Mbo II, รป ( B ) ถกตดดวยเอนไซม Sdu I(Bsp1286 I ) โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) และใชสายพนธอางอง 10 สายพนธซงมรายละเอยดดงตอไปน หมายเลข 1 คอ G.oxydans NBRC14819T; หมายเลข 2 คอ G.frateurii NBRC 3264T; หมายเลข 3 คอ G.cerinus NBRC3267T; หมายเลข 4, คอ G.thailandicus F149-1 หมายเลข 5 คอ G.albidus NBRC3250T; หมายเลข 6, คอ G.kondonii NBRC3266T; หมายเลข 7 คอ G.roseus NBRC 3990T; หมายเลข 8 คอ G.sphericus NBRC12467T; หมายเลข 9 คอ G.japonicus NBRC 3271T; หมายเลข 10 คอG. japonicu NBRC3269T; M หมายถง 50-bp DNA marker

www.ssru.ac.th

26

(C)

(D) ภาพท 4.8 แสดงรปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองบนแผนเจลอะกาโรสเมอถกตดดวย เอนไซมตดจาเพาะ Taq I และ BstN I รปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองทถกเพมปรมาณดวยวธ PCR ตรงบรเวณ16S-23S rDNA gene ITS บนแผนเจลอะกาโรสเมอถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (restriction endonucleases) : รป ( C ) ถกตดดวยเอนไซม Taq I และ รป ( D ) ถกตดดวยเอนไซม BstN I. โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) และใชสายพนธอางอง 10 สายพนธซงมรายละเอยดดงตอไปน หมายเลข 1 คอ G.oxydans NBRC14819T; หมายเลข 2 คอ G.frateurii NBRC 3264T; หมายเลข 3 คอ G.cerinus NBRC3267T; หมายเลข 4, คอ G.thailandicus F149-1 หมายเลข 5 คอ G.albidus NBRC3250T; หมายเลข 6, คอ G.kondonii NBRC3266T; หมายเลข 7 คอ G.roseus NBRC 3990T; หมายเลข 8 คอ G.sphericus NBRC12467T; หมายเลข 9 คอ G.japonicus NBRC 3271T; หมายเลข 10 คอG. japonicu NBRC3269T; M หมายถง 50-bp DNA marker

www.ssru.ac.th

27

(E)

(F)

ภาพท 4.9 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA ของGluconobacter ท ง 9 สายพนธ ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ16S-23S rDNA gene ITS ดวย เอนไซม restriction endonucleases รป ( E ) ถกตดดวยเอนไซม MboII รป (F) ถกตดดวยเอนไซม Sdu I (Bsp1286 I ) โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) โดย หมายเลข 1 คอ D3501; หมายเลข 2 คอ S2702; หมายเลข 3 คอ Ma 25; หมายเลข 4 คอ Me2203; หมายเลข 5 คอ Ma1207; หมายเลข 6 คอ S1203; หมายเลข 7 คอ S1204; หมายเลข 8 คอ D2801; หมายเลข 9 คอ G2001; M หมายถง 50-bp DNA marker

www.ssru.ac.th

28

(G)

(H) ภาพท 4.10 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA ของGluconobacter ท ง 9 สายพนธ ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ 16S-23S rDNA gene ITS ดวย เอนไซม restriction endonucleases รป ( G ) ถกตดดวยเอนไซม Taq I รป (H ) ถกตดดวยเอนไซม BstN I โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) โดย หมายเลข 1 คอ D3501; หมายเลข 2 คอ S2702; หมายเลข 3 คอ Ma 25; หมายเลข 4 คอ Me2203; หมายเลข 5 คอ Ma1207; หมายเลข 6 คอ S1203; หมายเลข 7 คอ S1204; หมายเลข 8 คอ D2801; หมายเลข 9 คอ G2001; M หมายถง 50-bp DNA marker

www.ssru.ac.th

29

ภาพท 4.11 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA ของGluconobacter D2301,S501 และ ME4201 ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ16S-23S rDNA gene ITS ดวย เอนไซม restriction endonucleases โดยหมายเลข 1, 2 และ 3 ถกตดดวยเอนไซม MboII , หมายเลข 4, 5 และ 6 ถกตดดวยเอนไซม Bsp 1286 I โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) โดยหมายเลข 1 และ 4 คอ D2301, หมายเลข 2 และ 5 คอ S501, หมายเลข 3 และ 6 คอ ME4201, M หมายถง 50-bp DNA marker

ภาพท 4.12 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA ของGluconobacter D2301, S501 และ ME4201 ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ 16S-23S rDNA gene ITS ดวย เอนไซม restriction endonucleases โดยหมายเลข 1, 2 และ 3 ถกตดดวยเอนไซม Taq I , หมายเลข 4, 5 และ 6 ถกตดดวยเอนไซม BstN I โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) โดยหมายเลข 1 และ 4 คอ D2301, หมายเลข 2 และ 5 คอ S501, หมายเลข 3 และ 6 คอ ME4201, M หมายถง 50-bp DNA marker

www.ssru.ac.th

30

ทาการวเคราะหดเอนเอแบคทเรยกรดน าสมในจนส Asaia โดยใชวธ Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP) โดยทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S rDNA โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 2 ตวคอ Sty I และ SnaB I ทาการวเคราะหดเอนของ Asaia สายพนธ S2201, S2201 และ S35 ทถกตดโดยเอนไซมตดจาเพาะโดยเทยบกบดเอนเอของสายพนธอางอง 5 สายพนธไดแก Asaia bogorensis BCC 12264T, Asaia siamensis BCC 12268T, Asaia krungthepensis BCC 12978T, Asaia lannaensis BCC 15733T, Asaia spathodeae BCC 36458T

ภาพท 4.13 แสดงรปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองบนแผนเจลอะกาโรสเมอถกตดดวย เอนไซมตดจาเพาะ Sty I รปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองทถกเพมปรมาณดวยวธ PCR บรเวณ 16S rDNA gene บนแผนเจลอะกาโรสเมอถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (restriction endonucleases) Sty I โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) และใชสายพนธอางอง 5 สายพนธซงมรายละเอยดดงตอไปน หมายเลข 1 คอ Asaia bogorensis BCC 12264T หมายเลข 2 คอ Asaia siamensis BCC 12268T หมายเลข 3 คอ Asaia krungthepensis BCC 12978T หมายเลข 4, คอ Asaia lannaensis BCC 15733T หมายเลข 5 คอ Asaia spathodeae BCC 36458T M หมายถง 50-bp DNA marker

www.ssru.ac.th

31

ภาพท 4.14 แสดงรปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองบนแผนเจลอะกาโรสเมอถกตดดวย เอนไซมตดจาเพาะ SnaB I รปแบบของช นสวน DNA ของสายพนธอางองทถกเพมปรมาณดวยวธ PCR บรเวณ 16S rDNA gene บนแผนเจลอะกาโรสเมอถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ (restriction endonucleases) SnaB I โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) และใชสายพนธอางอง 5 สายพนธซงมรายละเอยดดงตอไปน หมายเลข 1 คอ Asaia bogorensis BCC 12264T หมายเลข 2 คอ Asaia siamensis BCC 12268T หมายเลข 3 คอ Asaia krungthepensis BCC 12978T หมายเลข 4, คอ Asaia lannaensis BCC 15733T หมายเลข 5 คอ Asaia spathodeae BCC 36458T M หมายถง 50-bp DNA marker

www.ssru.ac.th

32

( I )

( J ) ภาพท 4.15 แสดงรปแบบ DNA บนแผน agarose gel ของการตดช นสวนของ DNA ของ Asaia ท ง 3 สายพนธ ทไดจากการเพมปรมาณ ดวยวธ PCR ทบรเวณ 16S rDNA gene ดวย เอนไซม restriction endonucleases รป ( I ) ถกตดดวยเอนไซม Sty I รป (J ) ถกตดดวยเอนไซม SnaB I โดยใช 50 bp DNA เปน DNA เทยบขนาด(marker) โดย หมายเลข 1 คอ S2201; หมายเลข 2 คอ S2202; หมายเลข 3 คอ S35 M หมายถง 50-bp DNA marker

www.ssru.ac.th

33

บทท 5 สรปผลกำรวจยและวจำรณผลกำรวจย

จากการคดแยกแบคทเรยทผลตกรดน าสมจากดอกไมในเกาะลนตานอยจงหวดกระบพบแบคทเรยกรดน าสมท งส น 90 สายพนธ ทาการจดจาแนกแบคทเรยกรดน าสมท ง 90 สายพนธ โดยในเบ องตนทาการวเคราะหความสมพนธของลาดบเบสบนบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวนโดยใชไพรเมอร 800R เพยงเสนเดยวในการเพมปรมาณ ดเอนเอ บรเวณ 16S rDNA เนองจากชวงประมาณ600 เบสแรกของลาดบเบสบน 16S rDNA เปนชวงทมบรเวณแปรผนสงกวาสวนอน(variation region)นาลาดบเบสทไดมาทาเปรยบเทยบหาแบคทเรยทใกลเคยงกนมากทสดกบแตละสายพนธของแบคทเรยกรดน าสม ทคดแยกไดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon พบวาในเบ องตนแบคทเรยท ง 90 สายพนธจดอยในจนส Gluconobacter 49 สายพนธ, จนส Asaia 40 สายพนธ และ Frateuria 1 สายพนธคอสายพนธ ME2204 จากน นนาลาดบเบสบนบรเวณ 16S rDNA แบบบางสวนโดยใช ไพรเมอร 800R เพยงเสนเดยวในการเพมปรมาณ ดเอนเอของแบคทเรยกรดน าสมท ง 89 สายพนธ มาหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5โดยแบงการทดลองออกเปน 2 กลม คอ กลม Gluconobacter และ กลม Asaia ผลการสรางแผนภมวงศวานววฒนของกลม Gluconobacter แสดงไวดงภาพท 4.1 สวนแผนภมวงศวานววฒนของกลม Asaia แสดงไวดงภาพท 4.2

จากผลการทดลองทแสดงในภาพท 4.1 สามารถจดจาแนกแบคทเรยกรดน าสมทอยในจนส Gluconobacter ทคดแยกไดจากเกาะลนตานอยออกเปน 6 กลมดงน 1. กลม G1 เปนกลม Gluconobacter ทยงไมสามารถจดจาแนกสปชสไดแตมความใกลเคยงกบ G. frateurii และ G. japonicus สามาชกในกลมน ม 34 สายพนธไดแก D2103, S503, S502, S501, S4302, S4301, ME4203, ME4202, ME4201, ME3904, Me3903, ME39, MA3903, MA3902, MA3901, Ma3502, MA2006, MA2005, MA2004, MA2003, MA1201, G3901, G2802, G2801, G2704, G2703, G2702, G2404, G2002, D2702, D2302, D2301, MA2001, G3902 ท ง 34 สายพนธน เมอสงเกตผลการทดลองทไดจากการหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนแลวคาดวา ท ง 34 สายพนธน นจดอยในสปชสเดยวกนดงน นการทดลองในข นตอไปจงสมเลอก Gluconobacter เพอเปนตวแทนของกลมน ข นมา 3 สายพนธไดแก ME4201, S501 และ D2301 ซงมาจากแหลงตวอยางทแตกตางกน เพอนามาหาลาดบเบสของ 16S rDNA ของ Gluconobacter กลมน แบบสมบรณ โดยใชไพรเมอรเพมอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F นาผลทไดมาวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon อกคร งหนงผลการทดลองดงแสดงไวในตารางท 4.1 จากผลการทดลองวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxonพบวาท ง 3 สายพนธมความใกลเคยงกบ Gluconobacter japonicas มากทสด จากน นนาลาดบเบสของ 16S rDNA full sequence ของท ง 3 สายพนธมาหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนงผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.3 จากผลการทดลองหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนพบวากงของท ง

www.ssru.ac.th

34

3 สายพนธยงอยเปนกลมเดยวกนและแสดงใหเหนถงความเปนสปชสเดยวกนนอกจากน ยงแสดงใหเหนวามความสมพนธใกลชดกบ G. Japonicus มากกวาสายพนธอนจากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอยนยนจดจาแนก Gluconobacter ในกลมน โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst N I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.11 และ 4.12 เมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Mbo II และ Sdu I พบวาท ง 3 สายพนธมรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ G.frateurii NBRC 3264T; G.thailandicus F149-1T ; G.japonicus NBRC 3271Tและ G. japonicus NBRC3269 ผลการทดลองไดแสดงไวในภาพท 4.11 จงไดทาการวเคราะหเพมเตมบนบรเวณ16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) โดยใชเอนไซมตดจาเพาะเพมข นอก 2 ตวคอ Taq I, และ Bst N I จากผลการทดลองทแสดงไวในภาพท 4.12 พบวา Gluconobacter ท ง 3 สายพนธ คอ ME4201, S501 และ D2301 มรปแบบของดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลตรงกบ G.japonicus NBRC 3271T จงสรปไดวา ME4201, S501 และ D2301 เปนGluconobacter สายพนธเดยวกนคอ G.japonicus และสรปวาแบคทเรยกรดน าสมกลม G1 เปน G.japonicus

2. กลม G2 เปนกลม Gluconobacter ทจดอยใน G.frateurii หรอ G.japonicus สามาชกในกลมน ม 3 สายพนธไดแก D2801, D2802 และ G2001เมอสงเกตผลการทดลองทไดจากการหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนดงแสดงไวในภาพท 4.1 แลวคาดวา ท ง 3 สายพนธน นจดอยในสปชสเดยวกนดงน นการทดลองในข นตอไปจงสมเลอก Gluconobacter เพอเปนตวแทนของกลมน ข นมา 2 สายพนธไดแก D2801 และ G2001 เปนตวแทนของกลมซงมาจากแหลงตวอยางทแตกตางกน ดงน นการทดลองในข นตอไปจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอทาการจดจาแนก Gluconobacter ในกลมน ในระดบสปชส โดยทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst N I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 เมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Mbo II และ Sdu I พบวาท ง 2 สายพนธมรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ G.frateurii NBRC 3264T; G.thailandicus F149-1T ; G.japonicus NBRC 3271Tและ G. japonicus NBRC3269 ผลการทดลองไดแสดงไวในภาพท 4.9 จงไดทาการวเคราะหเพมเตมบนบรเวณ 16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) โดยใชเอนไซมตดจาเพาะเพมข นอก 2 ตวคอ Taq I, และ Bst N I จากผลการทดลองทแสดงไวในภาพท 4.10 พบวา Gluconobacter ท ง 2 สายพนธ คอ D2801 และ G2001 มรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลตรงกบ G.japonicus NBRC 3271T จงสรปไดวา D2801 และ G2001 เปน Gluconobacter สายพนธเดยวกนคอ G. japonicus และสรปวาแบคทเรยกรดน าสมกลม G2 คอ G. japonicus 3. กลม G3 เปนกลม Gluconobacter ทไมสามารถจดจาแนกสปชสไดแตมความใกลเคยงกบ G. frateurii และ G. japonicas สามาชกในกลมน ม 5 สายพนธไดแก D3501, D3502, MA2601, MA3503, S2702 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะสมเลอก Gluconobacter เพอเปนตวแทนของกลมน ข นมา 2 สายพนธไดแก D3501 และ S2702 ซงมาจากแหลงตวอยางทแตกตางกน

www.ssru.ac.th

35

เพอนามาหาลาดบเบสของ 16S rDNA ของ Gluconobacter กลมน แบบสมบรณ โดยใชไพรเมอรเพมอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F จากผลการทดลองวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxonพบวาท ง 2 สายพนธมความใกลเคยงกบ Gluconobacter japonicas มากทสด ผลการทดลองดงแสดงไวในตารางท 4.1 จากน นนาลาดบเบสของ 16S rDNA full sequence ของท ง 2 สายพนธมาหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนงผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.4 จากผลการทดลองหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนพบวากงของท ง 2 สายพนธยงอยเปนกลมเดยวกนและแสดงใหเหนถงความเปนสปชสเดยวกนนอกจากน ยงแสดงใหเหนวามความสมพนธใกลชดกบ G. Japonicus มากกวาสายพนธอนจากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอยนยนจดจาแนก Gluconobacter ในกลมน โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst N I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 เมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Mbo II และ Sdu I พบวาท ง 2 สายพนธมรปแบบของ ดเอนเอบนแผน อะกาโรสเจลเหมอนกบ G.frateurii NBRC 3264T; G.thailandicus F149-1T ; G.japonicus NBRC 3271Tและ G. japonicus NBRC3269 ผลการทดลองไดแสดงไวในภาพท 4.9 จงไดทาการวเคราะหเพมเตมบนบรเวณ16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) โดยใชเอนไซมตดจาเพาะเพมข นอก 2 ตวคอ Taq I, และ Bst N I จากผลการทดลองทแสดงไวในภาพท 4.10 พบวา Gluconobacter ท ง 2 สายพนธ คอ D3501 และ S2702 มรปแบบของดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลตรงกบ G.japonicus NBRC 3271T จงสรปไดวา D3501 และ S2702 เปนGluconobacter สายพนธเดยวกนคอ G.japonicus และสรปวาแบคทเรยกรดน าสมกลม G3 เปน G.japonicus 4. กลม G4 เปนกลม Gluconobacter ทไมสามารถจดจาแนกสปชสไดแตมความใกลเคยงกบ G. cerinus สามาชกในกลมน ม 4 สายพนธไดแก Ma25, Ma2602, Me2203, Me3902 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะสมเลอก Gluconobacter เพอเปนตวแทนของกลมน ข นมา 2 สายพนธไดแก Ma25 และ Me2203 เพอนามาหาลาดบเบสของ 16S rDNA ของ Gluconobacter กลมน แบบสมบรณ ( full sequence) โดยใชไพรเมอรเพมอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F นาผลทไดมาวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon อกคร งหนง ผลการทดลองดงแสดงไวในตารางท 4.1 จากผลการทดลองวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสด โดยใชโปรแกรม EZ Taxonพบวาท ง 2 สายพนธมความใกลเคยงกบ Gluconobacter curinus มากทสด จากน นนาลาดบเบสของ 16S rDNA full sequence ของท ง 2 สายพนธ มาหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒน โดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนงผลการทดลองแสดงดงภาพท 4.5 จากผลการทดลองหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนพบวากงของท ง 2 สายพนธยงอยเปนกลมเดยวกน และแสดงใหเหนถงความเปนสปชสเดยวกน นอกจากน ยงแสดงใหเหนวามความ สมพนธใกลชดกบ G. curinus มากกวาสายพนธอน จากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอยนยนจดจาแนก Gluconobacter ในกลมน โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตด

www.ssru.ac.th

36

จาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst N I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 เมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Mbo II พบวาท ง 2 สายพนธ มรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ G.curinus NBRC 3267T ผลการทดลองไดแสดงไวในรปท 4.9( E ) ไดทาการวเคราะหเพมเตมบนบรเวณ16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) โดยใชเอนไซมตดจาเพาะเพมข นอก 1 ตวคอ และ Sdu I จากผลการทดลองทแสดงไวในรปท 4.9( F ) พบวา Gluconobacter ท ง 2 สายพนธ คอ Ma25 และ Me2203 มรปแบบของดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลตรงกบ G.curinus NBRC 3267T จงสรปไดวา Ma25 และ Me2203 เปน Gluconobacter สายพนธเดยวกนคอ G.curinus และสรปวาแบคทเรยกรดน าสมกลม G4 เปน G.curinus 5. กลม G5 เปนกลม Gluconobacter ทจดอยใน G.oxydans หรอ G.roseus สามาชกในกลมน ม เพยง 1 สายพนธไดแก Ma1207 ผลของการวเคราะหสายพนธ Ma1207 เพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอทาการจดจาแนก Ma1207 ในระดบสปชส โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ BstN I ผลการทดลองดงแสดงไวในรปท 4.9 และ 4.10 เมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Mbo II พบวามรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ G. oxdans NBRC 14819T; G. roseus NBRC 3990T; และ G. sphericus NBRC12467T และเมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Sdu I พบวามรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ G. oxdans NBRC 14819T, G. condonii NBRC 3266T และ G. sphericus NBRC12467T ผลการทดลองไดแสดงไวในภาพท 4.9 จงไดทาการวเคราะหเพมเตมบนบรเวณ16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) โดยใชเอนไซมตดจาเพาะเพมข นอก 2 ตวคอ Taq I, และ Bst N I จากผลการทดลองทแสดงไวในรปท 4.10 พบวา Ma1207 มรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะเหมอนกบ G. oxydans NBRC14819T, G. frateurii NBRC 3264T, G. cerinus NBRC 3267T, G.thailandicus F149-1T, G. roseus NBRC 3990T, G. sphericus NBRC12467T, G. japonicus NBRC 3271T, G. japonicu NBRC3269T และมรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Bst N I เหมอนกบ G. oxydans NBRC 14819T และ G. japonicus NBRC 3271T จงสรปไดวา Ma 1207 เปน G.oxydans 6. กลม G6 เปนกลม Gluconobacter ทจดอยใน G. albidus หรอ G. kondonii หรอ G. sphaericus สามาชกในกลมน ม 2 สายพนธไดแก S1203 และ S1204 ดงน นการทดลองในข นตอไปจะทาการวเคราะหสายพนธ S1203 และ S1204 เพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอทาการจดจาแนก ในระดบสปชส โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S-23S rDNA ITS โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 4 ตว คอ Mbo II, Sdu I (Bsp 1286 I), Taq I, และ Bst N I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.9 และ 4.10 เมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Mbo II พบวา S1203 และ S1204 มรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ G. albidus NBRC 3250T และเมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Sdu I พบวามรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ G. oxydans NBRC14819T ,G. albidus NBRC 3250T และ G. sphericus NBRC12467T ผลการทดลองไดแสดงไวในรปท 4.9 จากน นไดทาการวเคราะหเพมเตม

www.ssru.ac.th

37

บนบรเวณ16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer (ITS) โดยใชเอนไซมตดจาเพาะเพมข นอก 2 ตวคอ Taq I, และ Bst N I จากผลการทดลองทแสดงไวในรปท 4.10 พบวา S1203และS1204 มรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Taq I เหมอนกบG. albidus NBRC 3250T และ G. kondonii NBRC 3266Tและมรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Bst N I เหมอนกบ Gluconobacter cerinus NBRC 3267 T, Gluconobacter albidus NBRC 3250 T, Gluconobacter kondonii NBRC 3266 T, Gluconobacter roseus NBRC 3990 T, Gluconobacter sphericus NBRC 12467 T จงสรปไดวา S1203 และ S1204 เปน G. albidus

จากผลการทดลองทแสดงในภาพท 4.2 สามารถจดจาแนกแบคทเรยทอยในจนส Asaia ทคดแยกไดจากเกาะลนตานอยออกเปน 4 กลมคอ 1. กลม Asaia bogorensis สมาชกในกลมน ม 19 สายพนธไดแก S2203, S2703, ME503, ME502, ME501, MA502, MA501, Ma1209, Ma1204, Ma1203, G2402, G12, D4202, D4201, D2701, D2401, D2104, D2102, D2101 เมอพจารณาจากแผนภมวงศวานววฒนในภาพท 4.2 พบวาสมาชกในกลมน คอสปชสเดยวกนและท งหมดถกจดจาแนกเปน Asaia bogorensis 2. กลม Asaia siamensis สมาชกในกลมน ม 10 สายพนธไดแก G2401, G2403, MA1202, MA1205, MA1206, S1201, S1202, S2101, S2102, S2103 เมอพจารณาจากแผนภมวงศวานววฒนในภาพท 4.2 พบวาสมาชกในกลมน คอสปชสเดยวกนและท งหมดถกจดจาแนกเปน Asaia siamensis 3. กลม Asaia spathodeae สมาชกในกลมน ม 8 สายพนธไดแก D2105, G2701, MA1101, ME2201, ME2202, ME2205, S2701, S4304 เมอพจารณาจากแผนภมวงศวานววฒนในภาพท4.2พบวาสมาชกในกลมน คอสปชสเดยวกนและท งหมดถกจดจาแนกเปน Asaia spathodeae 4. กลม A1 กลมน เปน Asaia ทยงไมสามารถจดจาแนกชนดได สมาชกในกลมน ม 3 สายพนธไดแก S2201, S2202, S35 ท ง 3 สายพนธน เมอสงเกตผลการทดลองทไดจากการหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนแลวคาดวา ท ง 3 สายพนธน นจดอยในสปชสเดยวกนดงน นการทดลองในข นตอไปจะหาลาดบเบสของ 16S rDNA ของ Asaia กลมน แบบสมบรณ ( full sequence) โดยใชไพรเมอรเพมอก 3 ไพรเมอรคอ 518F, 1492R และ 27F นาผลทไดมาวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxon อกคร งหนงผลการทดลองดงแสดงไวในตารางท 4.1 และนาลาดบเบสของ 16S rDNA full sequence มาหาความสมพนธเชงววฒนาการโดยการสรางแผนภมวงศวานววฒนโดยใชโปรแกรม BioEdit และ โปรแกรม MEGA 5 อกคร งหนงผลการทดลองแสดงดงรปท 4.6 จากผลการทดลองวเคราะหหาสายพนธทมความใกลเคยงกนมากทสดโดยใชโปรแกรม EZ Taxonพบวาท ง 3 สายพนธมความใกลเคยงกบ Asaia krungthepensis มากกวาสายพนธอนจากน นจะทาการวเคราะหเพมเตมดวยเทคนก Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เพอยนยนจดจาแนก Asaia ในกลมน โดยจะทาการวเคราะหบนบรเวณ 16S rDNA โดยใชเอนไซมตดจาเพาะ 2 ตว คอ Sty I และ SnaB I ผลการทดลองดงแสดงไวในภาพท 4.15 เมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ Sty I เปรยบเทยบกบ Asaia สายพนธอางองท ง 5 สายพนธไดแก Asaia bogorensis BCC 12264T, Asaia siamensis BCC 12268T , Asaia krungthepensis BCC 12978T , Asaia lannaensis BCC 15733T, Asaia spathodeae BCC 36458T

www.ssru.ac.th

38

พบวา S2201, S2202, S35 มรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ Asaia siamensis BCC 12268T , Asaia krungthepensis BCC 12978T, Asaia spathodeae BCC 36458T และเมอวเคราะหจากรปแบบของดเอนเอทถกตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ SnaB I เปรยบเทยบกบ Asaiaสายพนธอางองพบวาท ง 3 สายพนธมรปแบบของ ดเอนเอบนแผนอะกาโรสเจลเหมอนกบ Asaia krungthepensis BCC 12978T เพยงสายพนธเดยวจงสรปไดวา S2201, S2202, S35 คอ Asaia krungthepensis ผลการทดลองทผานมาท งหมดสามารถสรปการจดจาแนกแบคทเรยกรดน าสมทคดแยกไดจากเกาะลนตานอยจงหวดกระบท ง 89 สายพนธในระดบสปชสดงแสดงไวในตารางท 5.1

www.ssru.ac.th

39

ตารางท 5.1 แสดงผลสรปการจดจาแนกแบคทเรยกรดน าสมทพบในเกาะลนตานอยจงหวดกระบและ ดอกไมทคดแยกได

ลาดบท Code Genus ดอกไมทพบ

1. Ma501 Asaia bogorensis

เอนอา Osbekia stellate Ham.


3. Me501 Asaia bogorensis



6. S501 Gluconobacter japonicus



9. Ma1101 Asaia spathodeae กง Xyris pauciflora Willd.

10. G12 Asaia bogorensis

คอรนฟลาวเวอร Centaurea cyanus

11. Ma1201 Gluconobacter japonicus

12. Ma1202 Asaia siamensis




16. Ma1206 Asaia siamensis

17. Ma1207 Gluconobacter oxydans


19. S1201 Asaia siamensis


21. S1203 Gluconobacter albidus

22. S1204 Gluconobacter albidus

www.ssru.ac.th

40

ตารางท 5.1 (ตอ)


23. G2001 Gluconobacter japonicus

ดาด Begonia sp.








ปอทะเล Hibicus tillaceus



33. D2101 Asaia bogorensis


35. D2103 Gluconobacter japonicus


37. D2105 Asaia spathodeae

38. Me2201 Asaia spathodeae

กระถนณรงค Acacia auriculiformis


40. Me2203 Gluconobacter cerinus

41. Me2204 Frateuria sp.


43. S2201 Asaia krungthepensis


45. S2203 Asaia bogorensis

www.ssru.ac.th

41

ตารางท 5.1 (ตอ)


46. D2301 Gluconobacter japonicus หางนกยง Caesalpinia pulcherrima Sw. 47. D2302 Gluconobacter japonicus

48. G2401 Asaia siamensis

เอ องหมายนา Costus speciosus

49. G2402 Asaia bogorensis

50. G2403 Asaia siamensis



53. Ma25 Gluconobacter cerinus กระทอ Zingiber ottensii

54. Ma2601 Gluconobacter japonicus Unknown

55. Ma2602 Gluconobacter cerinus

56. G2701 Asaia spathodeae

Unknown




60. S2701 Asaia spathodeae


62. S2703 Asaia bogorensis




กระตดแมว Desmodium magaphyllum




www.ssru.ac.th

42

ตาราง 5.1 (ตอ)


69. Ma3502

Gluconobacter japonicus

กระถนเทพา Acacia mangium






Unknown





79. Me39 Gluconobacter japonicus 80. Me3902 Gluconobacter cerinus 81. Me3903 Gluconobacter japonicus 82. Me3904 Gluconobacter japonicus 83. Me4201 Gluconobacter japonicus

Unknown 84. Me4202 Gluconobacter japonicus 85. Me4203 Gluconobacter japonicus 86. D4201 Asaia bogorensis 87. D4202 Asaia bogorensis 88. S4301 Gluconobacter japonicus

พดจบ,พดปา Ervatamia eornaria.stapf

89. S4302 Gluconobacter japonicus 90. S4304 Asaia spathodeae

www.ssru.ac.th

43

เอกสำรอำงอง Asai, T. , H. lizuka and K.Komagata. 1964. the flagellation and taxonomy of genera Gluconobacter and Acetobacter with reference to the existence of intermediate strain. J. GEN. Appl. Microbiol. 10: 95-126. Barends, T. R. M. , J. J. Polderman-Tijmes, P. A. Jekel, C. Williams, G. Wybenga, D. B. Janssen and B. W. Dijkstra. 2006. Acetobacter turbidans α-Amino Acid Ester Hydrolase. The Journal of Biological Chemistry Vol. 28, No. 9, pp. 5804-5810. Boesch, C. , J. Trcek, M. Sievers and M. Teuber. 1998. Acetobacter intermedius, sp. Nov. Syst. Appl. Microbiol. 21: 220-229 Dutta, D. and R. Gachhui. 2006. Novel nitrogen-fixing Acetobacter nitrogenifigens sp. Nov., isolated from Kombucha tea. International Journal of systematic and Evolutionnary Microbiology, 56, 1899-1903. Greenberg, D. E. , S. F. Porcella, F. Stock, A. Wong, P. S. Conville, P. R. Murray, S. M. Holland and A. M. Zelazny. 2006. Granulibacter bethesdensis gen. nov., sp. Nov., a distinctive pathogenic acetic acid bacterium in the family Acetobacteraceae. International Journal of systematic and Evolutionnary Microbiology, 56, 2609-2616. Katsura, K. , H. Kawasaki, W. Potacharoen, S. Saono, T. Seki, Y. Yamada, T. Uchimura and K. Komagata. 2001. Asaia siamensis sp. Nov. , an acetic acid bacterium in the Alpha -proteobacteria Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 559- 563. Komagata, K. 2000. and K. Suzuki. 1987. Lipid and cell wall analysis in bacteria systematics. Methods Microbiol. 19: 161-207. Kommanee, J., Tanasupawat, S., Yukphan, P., Malimas, T., Muramatsu, Y.,Nakagawa,

Y.,and Yamada, Y. 2010. Asaia spathodeae sp. nov., an acetic acid bacterium in the α-Proteobacteria. The Journal of General and Applied Microbiology. 56:81-87 .

Kommanee, J., Tanasupawat, S., Yukphan, P., Malimas, T., Muramatsu, Y.,Nakagawa, Y.,and Yamada, Y. 2011. Gluconobacter nephelii sp. nov., an acetic acid bacterium in the class Alphaproteobacteria. Int J Syst Evol Microbiol. 61:2117-2122.

www.ssru.ac.th

44

Lisdiyanti, P. , H. Kavasaki, T. Seki, Y. Yamada, T. Uchimura and K.Komagata. 2000. Systematic study of the genus Acetobacter with description of Acetobacter indonesiensis sp. Nov. , Acetobacter tropicalis sp. Nov., Acetobacter orieanensis ( Henneberg 1906 ) comb. Nov. , Acetobacter lovanieensis ( Frateur 1950 ) comb. Nov. , and Acetobacter estunensis ( Carr 1958 ) comb. Nov. J. Gen. Appl. Microbiol. 46: 147-165. Lisdiyanti, P. , H. Kavasaki, Widyastuti, Y. , S. Saono, T. Seki, Y. Yamada, T. Uchimura and K.Komagata. 2002. Kozakia baliensis gen. Nov. , sp. Nov. , a novel acetic acid bacteria in the Alpha -proteobacteria Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1-5. Malimas,T.,Yukphan,P.,Tahashi,M.,Kaneyasu,M.,Potacharoen,W.,Tanasupawat,S.,

Nakagawa,Y.,Tanticharoen,M and Yamada,Y.2007. Gluconobacter kondonii sp. nov., an acetic acid bacterium in the α-Proteobacteria. J.Gen .Appl. Microbiol.,53,301-307

Malimas,T.,Yukphan,P.,Tahashi,M.,Kaneyasu,M.,Potacharoen,W.,Tanasupawat,S., Nakagawa,Y.,Tanticharoen,M and Yamada,Y.2008. Gluconobacter roseus(ex Asai) sp. nov., nom.rev.,a pink-colored acetic acid bacterium in the Alphaproteobacteria. J.Gen .Appl. Microbiol.,54,119-215 Malimas,T.,Yukphan,P.,Tahashi,M.,Kaneyasu,M.,Potacharoen,W.,Tanasupawat,S., Nakagawa,Y.,Tanticharoen,M and Yamada,Y.2008. Gluconobacter sphaericus(Ameyama 1975) comb. nov., a brown pigment-producing bacterium in the Alphaproteobacteria. J.Gen .Appl. Microbiol.,54,211-220 Malimas, T., Yukphan, P., Takahashi, M., Kaneyasu, M., Potacharoen, W., Tanasupawat, S., Nakagawa, Y., Tanticharoen, M and Yamada, Y.2008. Asaia lannaensis sp. nov., a New Acetic Acid Bacterium in the Alphaproteobacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72: 666-671. Ohmori, S., H. Masai, K. Arima and T. Beppu. 1980. Isolation and Identification of acetic acid bacteria for submerged acetic acid fermentation at hight temperature. Agric. Biol. Chem. 44: 2904-2906. Saeki, A., G. Theeragool, K. Matsushita, H. Toyama, N. Lotong and O. Adachi. 1997. Development of thermotolerant acetic acid bacteria useful for vinegar fermentation at higher temperature. Biosc. Biotech. Biochem. 61(1):138- 145. Saeki, A., M. Taniguchi, K. Matsushita, H. Toyama, G. Theeragool, N. Lotong and O. Adachi. 1997. Microbiological aspects of acetate oxidation by acetic acid bacteria, unfavorable phnomena in vinegar fermentation. Biosc. Biotech. Biochem. 61(2): 317- 323.

www.ssru.ac.th

45

Silva, L. R. , L. Cleewerck, R. Rivas, J. Swings, M. E. Trujillo, A. Willems and E. Velazquez.2006. Acetobacter oeni sp. Nov., isolated from spoiled rad wine. International Journal of systematic and Evolutionnary Microbiology, 56, 21-24. Swinngs, J. , M. Gillis and K. Kersters. 1992. Phenotypic identification of acetic acid bacteria, Identification Methods. Appl. Environ. Microbiol. 103-110. Uhlig, U. , K. Karbaum, and A. Steudel. 1986. Acetobacter methanolicus sp. Nov. an acidophiclic facultatively methylotrophic bacterium. Int. J. Syst Bacteriol. 36: 317-322. Urakami, T. , J. Tamaoka, K. Suzuki and K. Komagata. 1989. Acidomonas gen. Nov. , Incorporating Acetobacter methanolicus as Acidomonas methanolica comb. Nov. Int. J. Syst Bacteriol. 39(1): 50-55 Yamada, Y. , K. Katsura, J. Kawasaki, Y. Widyastuti, S. Saono, T. Seki, T. Uchimura and K. Komagata. 2000. Asaia bogorensis gen. Nov. , sp. Nov. , an unusual acetic acid bacterium in the Alpha-proteobacteria Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1-5. Yamada, Y. , R. Hosono, Lisdiyanti, P. , Y. Widyastuti, S. Saono, T. Uchimura and K. Komagata.1999. Identification of acetic acid bacteria from Indonesian sources, especially of isolates classified in the genus Gluconobacter. J. Gen. Appl. Microbiol. 45: 23-28. Yukphan, P. , T. Malimas, M,Takahashi, W. Potacharoen, T.Busabun, S. Tanasupawat Y.Nakagawa,M. Tanticharoen and Y. Yamada. 2004.Re-identification of Gluconobacter strains based on restriction analysis of 16S-23S rDNA internal transcribed spacer regions. J. Gen. Appl. Microbiol. 50: 189-195. Yukphan, P. , T. Malimas, W. Potacharoen, S. Tanasupawat, M. Tanticharoen and

Y. Yamada. 2005. Neoasaia chiangmaiensis gen. nov., sp. Nov., a novel osmotolerant acetic acid bacterium in the Alpha -Proteobacteria. J. Gen. Appl. Microbiol. 51: 301-311. Yukphan, P., Malimas, T., Muramatsu, Y., Takahashi, M., Kaneyasu, M.,Tanasupawat, S., Nakagawa, Y., Suzuki, K., Potacharoen, W. and Yamada, Y. 2008. Tanticharoenia sakaeratensis gen. nov., sp. nov., a New Osmotolerant Acetic Acid Bacterium in the α-Proteobacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem.72:672-676 . Yukphan, P., Malimas, T., Muramatsu, Y., Takahashi, M., Kaneyasu, M,, Potacharoen, W., Tanasupawat, S., Nakagawa, Y., Hamana, K., Tahara, Y., Suzuki, K., Tanticharoen, M and Yamada, Y. 2009. Ameyamaea chiangmaiensis gen. nov., sp. nov., an Acetic Acid Bacterium in the α-Proteobacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem.73:2156-2162 .

www.ssru.ac.th

46

Yukphan, P., Malimas, T., Lundaa, T., Muramatsu, Y., Takahashi, M., Kaneyasu, M.,Tanasupawat, S., Nakagawa, Y., Suzuki, K., Tanticharoen, M and Yamada, Y. 2010. Gluconobacter wancherniae sp. nov., an acetic acid bacterium from Thai isolates in the α-Proteobacteria. The Journal of General and Applied Microbiology. 56:67-73. Yukphan, P., Malimas, T., Muramatsu, Y., Potacharoen, W., Tanasupawat, S., Nakagawa, Y., Tanticharoen, M and Yamada, Y. 2011. Neokomagataea gen. nov., with Descriptions of Neokomagataea thailandica sp. nov. and Neokomagataea tanensis sp. nov., Osmotolerant Acetic Acid Bacteria of the α- Proteobacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75:419-426.

www.ssru.ac.th

47

ภำคผนวก

Pre-hybridization solution 100xdenhardt solution 5 ml Salmon sperm DNA (10mg/ml) 1 ml 20xSSC 10 ml Formamide 50 ml Sterilized Distilled water 34 ml Total 100 ml Hybridization solution Pre-hybridization solution 100 ml Dextran sulfate 5 ml

100xdenhardt solution Bovine serum albumin(fractor V) 2 g Polyvinylpyrrolidone 2 g Ficoll 400 2 g Sterilized Distilled water 100 ml Preserved in freezer Salmon sperm DNA(10mg/ml) Salmon sperm DNA 0.01 g 10 mM Tris-EDTA buffer pH 7.6 1 ml Boiling for 10 min,immediately cold in ice,sonicate for 3 min 20xSSC(autoclave) Nacl 87.5 g Sodium citrate 44 g Distilled water 500 ml Solution I for Colorimetric BSA 0.25 g Triton-X-100 50 µl PBS(sterilized) 50 ml

www.ssru.ac.th

48

Solution II for Colorimetric Solution I 20 ml Streptavidin-POD-conjugate 5 µl Solution III for Colorimetric TMB(10mg/ml in DMFO) 100 µl 0.3%H2O2 100 µl 0.1 M Citric acid in 10% DMFO+ 0.2 M Na2HPO4 buffer pH 6.2 5 ml

www.ssru.ac.th

ประวตผวจย ชอ – นามสกล นางสาวธนขวญ บษบน MISS TANAKWAN BUDSABUN เพศ หญง วน-เดอน-ปเกด 3 เมษายน 2512 ต าแหนงปจจบน อาจารย ระดบ 7 สถานทตดตอ(ทท างาน) 1 ถนนอทองนอก สาขาวชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร และเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา เขตดสต กรงเทพมหานคร 10300 โทรศพท ทท างาน 0-2243-2246-7 ตอ 131 ทอย (ทบาน) 52/24 หมท 5 ต าบลบางกรวย อ าเภอบางกรวย จงหวดนนทบร 11130 โทรศพท 0-2447-5992 มอถอ 08-9115-6315 E-mail address : [email protected]

ประวตการศกษา ระดบ สาขา สถาบน

ปรญญาตร วทบ. ชววทยา มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ (ภาคใต) ปรญญาโท วทม. จลชววทยาทางอตสาหกรรม จฬาลงกรณมหาวทยาลย

ผลงานการวจย ธนขวญ บษบน .2553.ความหลากหลายทางชวภาพของแบคทเรยกรดน าสมทพบในอาหารหมก

ดองในเขตดสตกรงเทพมหานคร.รายงานการวจยมหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา ธนขวญ บษบน ทวศกด มะลมาศ และภทรพร รตนวาร. การคดแยกและจดจ าแนกแบคทเรย

กรดน าสมจากลกแปงสรา.รายงานการประชมวชาการ ม.อบ.วจย คร งท 3.วนท 28-29 กรกฎาคม 2552

ธนขวญ บษบน ทวศกด มะลมาศ และภทรพร รตนวาร.2551.การพสจนเอกลกษณของ Gluconobacter โดยวธ Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)และวธ DNA-DNA hybridization.รายงานการวจยมหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา ธนขวญ บษบน และ ทวศกด มะลมาศ .2550.ความหลากหลายของอะซตกแอซดแบคทเรย ทคด แยกไดจากลกแปงสรา.รายงานการวจยมหาวทยาลยราชภฏสวนสนนทา

www.ssru.ac.th

mailto:[email protected]

2

Pattaraporn Yukphan, Taweesak Malimas, Mai Takahashi, Wanchern Potacharoen, Tanakwan Busabun, Somboon Tanasupawat, Yasuyoshi Nakagawa, Morakot Tanticharoen, and Yuzo Yamada.2004. Re-identification of Gluconobacter strains based on restriction analysis of 16S-23S rDNA internal transcribed spacer regions. J. Gen. Appl. Microbiol.50:189 – 195

สาขาวชาทเชยวชาญ จลชววทยา - อนกรมวธานของแบคทเรย

- สรรวทยาของจลนทรย - จลนทรยอตสาหกรรม - พนธศาสตรของแบคทเรย

ภาระงานปจจบน 1. งานประจ า

1.1 เปนอาจารยสอนสาขาวชาจลชววทยาของคณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย รายวชาทรบผดชอบในการสอนมดงน คอ

- จลชววทยา - จลนทรยอตสาหกรรม - สรรวทยาของจลนทรย - อนกรมวธานของแบคทเรย - พนธศาสตรของจลนทรย

www.ssru.ac.th

Identification of Acetic Acid Bacteria isolated from Lanta Noi

Documents

Transcript of Identification of Acetic Acid Bacteria isolated from Lanta Noi