IDENTIFICACIÓN DEL PROGRAMA/PROYECTO

INFORME TÉCNICO DE AVANCE O FINAL DEPROGRAMAS Y PROYECTOS DE CTeI

CÓDIGO: M101PR03F09Versión: 00

Fecha: 2014-03-26Página 1 de 23

1. IDENTIFICACIÓN DEL PROGRAMA/PROYECTO

1.1 Información General

Programa Tipo de informe: Parcial Informe No. deTítulo

Evaluación de soportes de colágeno tipo I modificados microestructuralmente para su asociación a extractos vegetales con actividad cicatrizante en el tratamiento de Código 110156934982

Número de la convocatoria 569-2012Número de contrato 717-2013Programa Nacional o área de Colciencias al cual se encuentra adscrito el

PROGRAMA NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

Nombre del investigador principal

Marta Raquel FontanillaEntidades ejecutoras y beneficiarias

Universidad Nacional de ColombiaFecha de inicio del programa/proyecto

30 de diciembre de 2013Fecha de entrega del informe

6 de Febrero de 2015Ciudad/País Bogotá-Colombia

2. TABLA DE CONTENIDO3. RESUMEN...........................................................................24. SINOPSIS TÉCNICA (Máximo 500 palabras)............................................35. CUMPLIMIENTO DE OBJETIVOS.........................................................4

X X 1 3




5.1. Cumplimiento del(os) objetivo(s) general(es)..................................45.2. Cumplimiento de los objetivos específicos......................................5

6. DESCRIPCIÓN DE OTROS RESULTADOS OBTENIDOS.........................................77. RESULTADOS ADICIONALES..........................................................8

8. CUMPLIMIENTO DE LA METODOLOGÍA....................................................89. CRONOGRAMA DE EJECUCIÓN A LA FECHA, DIFICULTADES Y PLAN DE CONTINGENCIA...........810. PROYECCIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS FRENTE A LOS IMPACTOS REGISTRADOS EN EL PROYECTO/PROGRAMA (SI APLICA)........................................................911. ASPECTOS FINANCIEROS...........................................................1312. DISCUSIÓN Y ANÁLISIS...........................................................1313. CONCLUSIONES...................................................................1414. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................1415. LISTA DE ANEXOS................................................................14

3. RESUMEN




En Colombia, las estadísticas demuestran una alta incidencia de pérdida de continuidadde la piel dadas por quemaduras (861 casos reportados al 22 mayo de 2010); cáncer (880casos reportados en el 2008); úlceras (1.7 millones de personas sufren diabetes yaproximadamente el 50% pueden presentar úlceras), traumas de alta energía y heridaspor armas de fuego. Las heridas con avulsión de tejidos se tratan quirúrgicamente conautoinjertos y/o colgajos. El tratamiento ideal es el autoinjerto, pero cuando laslesiones son extensas las zonas donantes son limitadas y aumenta la morbilidad. Losproductos de la ingeniería de tejidos se constituyen en una fuente alternativa cuandoel tejido donante es escaso o cuando las condiciones generales del paciente nopermiten la obtención de sus propios tejidos. Los sustitutos tisulares o tejidosartificiales son elaborados con soportes de materiales biodegradables, sembrados o nocon células. Agencias regulatorias, como la FDA y la EMA, han aprobado sustitutos depiel de diferente naturaleza para usos clínicos diversos.El grupo de investigación en ingeniería de tejidos, desarrollo y estandarizó unprocedimiento para elaborar soportes de colágeno tipo I (CS). Los soportes fueronsembrados con fibroblastos aislados de mucosa oral de conejos y después de incubar, seobtuvo tejido conectivo mucoso artificial autólogo (AACT). Los sustitutosdesarrollados fueron evaluados como injertos en heridas de espesor parcial de mucosaoral de los conejos fuente de los fibroblastos. El tejido artificial injertado seintegró, no produjo rechazo y fue recambiado por tejido natural. Los resultadosobtenidos por el grupo indican que la utilización de tejido artificial optimiza eltratamiento pero eleva su costo. Una alternativa accesible para tratar áreas cruentases usar soportes de colágeno sin células que contengan compuestos bioactivos usadospor la tradición popular como promotores del cierre de heridas. En un proyecto enejecución financiado por Colciencias (Contrato RC 406-2011), el grupo está evaluando




en un modelo animal lagomorfo (Nueva Zelandia) de heridas de piel de espesor total de2 cm de diámetro, la actividad de soportes de colágeno I bovino que incluyen en sumicroestructura micropartículas de gelatina-colágeno (SC-GC) solos o asociados conextractos de flores caléndula. En la práctica clínica las áreas cruentas generadas pordiferentes lesiones son proporcionalmente grandes, por eso es importante evaluar labiocompatibilidad de estos soportes en zonas cruentas de áreas de diferente tamaño. Elobjetivo de esta propuesta es realizar esa evaluación en el modelo animal establecidopor el grupo, evaluando la eficacia del cierre de heridas de extractos de Aloe veraasociados con soportes de colágeno tipo I modificados microestructuralmente con laintención de extrapolar los resultados a humanos.

4. SINOPSIS TÉCNICA (Máximo 500 palabras)

La meta de este proyecto es evaluar in vitro (pruebas de citotoxicidad) e in vivo (estudiospreclínicos en un modelo murino), la biocompatibilidad de soportes de colágeno tipo Imodificados mediante la incorporación de microesferas de gelatina-colágeno, asociadoso no con extractos de Aloe vera. En la primera etapa de este proyecto, que hace parte delas actividades del primer año de su ejecución, se determinó la citotoxicidad de losextractos vegetales de Aloe vera, encontrándose que concentraciones del extracto menoreso iguales al 10% v/v no son citotóxicas; igualmente, que concentraciones entre el 0.5%v/v y 4% v/v favorecen la proliferación celular de fibroblastos L929. Igualmente, seestandarizó el sistema de obtención y preservación del extracto de la planta;igualmente, se comenzó la optimización del procedimiento para obtener soportesmediante la agregación de micropartículas de gelatina-colágeno y la planificación delos experimentos animales..




5. CUMPLIMIENTO DE OBJETIVOS

5.1. Cumplimiento del(os) objetivo(s) general(es)

OBJETIVOGENERAL:

Desarrollar soportes de colágeno tipo Imicroestructurados asociados a extractos vegetalesde Aloe vera y evaluar preclínicamente lacicatrización de heridas de heridas de espesortotal de diferentes aéreas (1cm2, 2cm2 y 3cm2)injertadas con los soportes desarrollados.

% decumplimiento:

25%

RESULTADOOBTENIDO

ANEXO SOPORTE DELDESARROLLO Y OBTENCIÓN DE

RESULTADOSDIFICULTADES OBSERVACIONES

Se evaluó lareactividadbiológica deextractosacuosos deAloe vera enun rango deconcentraciones de 0-100% v/v,encontrandoqueconcentraciones menores

Anexo1: Ensayos decitotoxidad de extractos deAloe vera.

Los extractosacuosos de Aloe verason altamenteinestables en lascondiciones demanipulación yalmacenamientoutilizadasinicialmente,siendo evidente lapresencia dereacciones deoxidación (Cambiode color).




o iguales al10% v/v nosoncitotóxicas;además, seencontró queconcentraciones entre el0.5% v/v y4% v/vfavorecen laproliferación celular defibroblastosL929.

Se está trabajandoen estabilizar losextractos medianteliofilización yalmacenamiento encondiciones dehermeticidad yoscuridad.

Se estándesarrollando prototiposde soportesmediante laaglomeracióndemicropartículas degelatina y

Anexo 2. Imágenes de lossoportes desarrolladospor aglomeración departículas.

La reproducibilidadlote a lote de lasmicropartículaselaboradas es baja.Se estánestandarizando lascondiciones deproceso para lograrmayorreproducibilidad en




gelatina-colágeno.

los atributoscríticos de proceso(Tamaño departícula yestabilidad)

5.2. Cumplimiento de los objetivos específicos

OBJETIVOESPECÍFICO: 1

Evaluar in vitro la actividad citotóxica de losdiferentes extractos, oleosos y acuosos, de Aloe verapara determinar su concentración mínima tóxica.

% decumplimiento:

70%

RESULTADO OBTENIDO PRODUCTO(si aplica)

ANEXO SOPORTE DELDESARROLLO YOBTENCIÓN DERESULTADOS

OBSERVACIONES

Se evaluó lareactividad biológicade extractos acuososde Aloe vera en un rangode concentracionesde 0-100% v/v,encontrando queconcentracionesmenores al 10% v/v noson citotóxicas,

Ensayos de citotoxidaddel extractos de Aloevera.

Anexo1:




además se encontróque concentracionesentre el 0.5% v/v y4% v/v favorecen laproliferación celularde fibroblastos L929.


Diseñar soportes de colágeno I microestructuradosque sirvan como sistemas bifásicos para laasociación y liberación de metabolitos secundariosde extractos vegetales de Aloe vera.

% decumplimiento:

15%



OBSERVACIONES

Se estándesarrollandoprototipos desoportes mediante laaglomeración demicropartículas degelatina y gelatina-colágeno.

Imágenes de lossoportes desarrolladospor aglomeración departículas.

Anexo 2.


Evaluar en un modelo murino (Rata Wistar)preclínica e histomorfométricamente el proceso decicatrización de heridas cutáneas de espesor total

% decumplimiento:

0%




de diferentes áreas (1cm2, 2cm2 y 3cm2), tratadas ono con soportes de colágeno I asociados a extractosde Aloe vera



OBSERVACIONES

Con base en losresultados que elgrupo ha obtenido enproyectos anterioresy en la revisión quese está realizandosobre la versatilidaddel modelo animal autilizar, se estáplanificando unestudio piloto conanimales del modelopropuesto y unoalternativo (cobayo).El proceso hace partede la tesis demaestría enfarmacología de unamédica veterinaria.

Dependiendo delos resultadosdel ensayoanimal piloto,se continuará ono con elmodelo murinoconsiderado enla propuestaaprobada porColciencias




6. DESCRIPCIÓN DE OTROS RESULTADOS OBTENIDOS

OTROSRESULTADOS

INDICADOR DECUMPLIMIENTO

DESCRIPCIÓN DELRESULTADO OBTENIDO ANEXO SOPORTE

Formación derecurso humano(Estudiante deDoctorado)

Formación de unestudiante deDoctorado.

Vinculación alproyecto de unestudiante deDoctorado enCienciasFarmacéuticas y unaestudiante deMaestría enCiencias-Farmacología.

Anexo 3. Hoja de vidaacadémica estudiante deDoctorado.Anexo 4. Hoja de vidaacadémica estudiante deMaestría.

Evento Realización delcurso congresointernacional eningeniería detejidos ymedicinaregenerativa.

Curso Internacionalen Ingeniería deTejidos, MedicinaRegenerativa yNuevos Materialespara el Diseño deSistemas deLiberación enEnfermedades de AltoImpacto

Anexo 5. Dossier del curso.http://www.bogota.unal.edu.co/curso-internacional-en-ingenieria-de-tejidos-medicina-regenerativa-y-nuevos-materiales-para-el-diseno-de-sistemas-de-liberacion/




Socioeconómico.Bogota 08-10 deOctubre de 2013.Participación de 12investigadoresNaciones y 9nacionalesrelacionados con laIT y MR. Asistieronaproximadamente 250personas.

7. RESULTADOS ADICIONALES

DESCRIPCIÓN DEL RESULTADO ADICIONAL ANEXO SOPORTENo aplica

8. CUMPLIMIENTO DE LA METODOLOGÍAObjetivo Observaciones sobre la metodología

Evaluar in vitro la actividad citotóxicade los diferentes extractos, oleosos yacuosos, de Aloe vera para determinar su

Se actualizó las metodología inicialmentedescrita en el proyecto para que cumplacon los lineamientos y recomendaciones de




concentración mínima tóxica. la norma ISO 10993-5 (Parte 5: Pruebas decitotoxicidad in vitro)

Diseñar soportes de colágeno Imicroestructurados que sirvan comosistemas bifásicos para la asociación yliberación de metabolitos secundarios deextractos vegetales de Aloe vera.

Se están haciendo modificaciones a lametodología descrita por Kucharska ycolaboradores. (Kucharska, Walenko et al.2010). No se describen las modificaciones,porque hasta ahora se comenzó a hacer elanálisis de los resultados obtenidos enlas diferentes intervenciones realizadas.

Evaluar en un modelo murino (Rata Wistar)preclínica e histomorfométricamente elproceso de cicatrización de heridascutáneas de espesor total de diferentesáreas (1cm2, 2cm2 y 3cm2), tratadas o nocon soportes de colágeno I asociados aextractos de Aloe vera.

Se está estudiando la versatilidad delmodelo animal y técnica quirúrgica paradar cumplimiento al objetivo. Teniendo encuenta estos y resultados anteriores delgrupo, se decidirá si se mantiene elmodelo animal propuesto o se introduce unanimal también del orden Rodentia, pero demayor tamaño.

9. CRONOGRAMA DE EJECUCIÓN A LA FECHA, DIFICULTADES Y PLAN DE CONTINGENCIA

ACTIVIDADES OBJETIVORELACIONA

DO

FECHA DEEJECUCIÓ

N

CAMBIOSSOLICITADOS YAPROBADOS POR

PLAN DECONTINGENCIA(si aplica)




COLCIENCIAS(si aplica)

1 Marzo2014-Diciembre2014

Se estánoptimizando losprocedimientopara laelaboración desoportes decolágeno Imicroestructurados que sirvancomo sistemasbifásicos parala asociación yliberación demetabolitossecundarios deextractosvegetales de Aloevera, a través dela aglomeración

2 Enero2014-Diciembre2014

Se solicitó aColciencias endocumento connúmero deradicación 2014-243-009771-2autorización paracambiar los equiposa adquirir con losrubros aprobadosinicialmente. Loanterior, debido aque el equipoinicialmentesolicitado seadquirió conrecursos de otrosproyectos.

Se han utilizadoequipos de otrasdependencias de laUniversidadNacional y de laFundación Institutode Inmunología deColombia.




demicropartículasde gelatina ygelatinacolágeno.

10. PROYECCIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS FRENTE A LOS IMPACTOS REGISTRADOS ENEL PROYECTO/PROGRAMA (SI APLICA)

TIPO DE IMPACTO DESCRIPCIÓN DELIMPACTO

PROYECCIÓN DELIMPACTO

IMPACTOS CIENCIA Y TECNOLOGÍA La evaluación deldesempeño preclínico desoportes de colágenotipo I modificados

microestructuralmentepara la carga y

liberación de extractosvegetales en heridas depiel de espesor total,permitirán el desarrollode nuevas metodologíaspara mejorar soportes

que promuevan la

No Aplica.




ingeniería de tejidos invivo

IMPACTOS EN EL CONOCIMIENTO DELCAMPO DE ESTUDIO

La evaluación preclínicade soportes de colágeno

tipo I asociados aextractos de Aloe veraque favorezcan los

procesos decicatrización de heridas

en piel, ayudará aestablecer la seguridady eficacia de soportes

de colágeno Imodificados para liberar

prolongadamenteprincipios pro-cicatrizantes.

No Aplica.

IMPACTOS SOBRE LA PRODUCTIVIDAD YCOMPETITIVIDAD DE LA ENTIDAD O EL

SECTOR RELACIONADO.

El desarrollo de esteproyecto permitirá darleuna identidad propia alas investigaciones enmedicina regenerativa eingeniería de tejidos enColombia en el ambiente

científico

No Aplica.




internacional, debido ala aplicación novedosade la etnofarmacología apartir de los recursosnaturales colombianos.Además, esta propuestacontempla evaluar nuevosusos del colágeno en laproducción de sistemasde entrega controlada deextractos vegetales conpotencial aplicación enla ingeniería de tejidos

y las cienciasfarmacéuticas.

IMPACTOS EN LAS POLÍTICAS PÚBLICAS Los resultados de esteproyecto son compatiblescon los lineamientos de

eficiencia,competitividad y

productividad del país.De acuerdo con el Plan

Regional deCompetitividad Bogotá yCundinamarca 2010-2019,

No Aplica.




el eje estratégicosectorial en su

estrategia 5, busca elapoyo a la

transformaciónproductiva y desarrollode clusters a través denueve proyectos. En dosde estos proyectos se

busca el fortalecimientodel sector salud paraposicionar a Colombiacomo líder. Nuestra

propuesta se enmarca enlos objetivos de estosproyectos porque: Sirve

a la comunidadpropiciando el acceso de

la población a losservicios de salud en

condiciones de equidad.Promueve el desarrollocientífico médico a

través de estrategiasque mejoren calidad,




reduzcan la inequidad ylos costos, y permitanla integración docente y

científica con lasinstituciones de este

sector. Apoya elfortalecimiento de laoferta de servicios debienestar; promueve lainvestigación y el

desarrollo en el sectorsalud para posicionar aColombia como líder anivel científico.

IMPACTOS REGIONALES Esta propuesta se ajustaa las estrategias del

Plan Regional deCompetitividad Bogotá yCundinamarca 2010-2019,

formuladas parafortalecer al sector

salud. En la elaboraciónde productos basados en

colágeno I quedesarrolla nuestro

No Aplica.




grupo, se empleanresiduos de las empresasde sacrificio bovino,las cuales se han

clasificado dentro delgrupo productivo quegenera subproductoscontaminantes en unarelación del 30% delpeso vivo animal. Elempleo que nosotroshacemos de los estosresiduos disminuye elefecto contaminante delos mismos porque no seincurre en emisión de

compuestos tóxicos parael medio ambiente, ya

que son inactivados porneutralización. Además,esta propuesta brinda

oportunidades de trabajoa personal especializado

que generalmenteno encuentra oferta




laboral en el país, yaque no hay compañías que

elaboren productosbiofarmacéuticos, que

les permitan aplicar susconocimientos y les

brinden oportunidadespara innovar en esta

área.

IMPACTOS EN LA CALIDAD DE VIDA DELA POBLACIÓN

Los resultados obtenidosen este proyecto

permitirán desarrollaruna alternativa de

tratamiento de lesionescon avulsiones de piel,más económica y de fácilacceso a la poblaciónColombiana de bajos

recursos.

No Aplica.

11. ASPECTOS FINANCIEROSVer anexo 6. Informe financiero.




12. DISCUSIÓN Y ANÁLISISLa primera etapa para la evaluación de soportes de colágeno tipo I modificadosmicroestructuralmente para su asociación a extractos vegetales con actividadcicatrizante en el tratamiento de heridas de piel de espesor total, fue la evaluaciónde la citotoxicidad de geles de Aloe vera, aislado de muestras adquiridas de tresdiferentes cultivos (Guamo Tolima, Agua de Dios Cundinamarca y Tocaima Cundinamarca),con el objetivo de disminuir la variabilidad en la composición de metabolitos activos,característica de los extractos vegetales. Se realizó el protocolo descrito en lanorma ISO 10993- 5, que evalúa la viabilidad celular de fibroblastos L929 en contactocon el extracto vegetal mediante el metabolismo mitocondrial del MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 difenil bromuro de tetrazolium]. Los resultados mostraron quediluciones inferiores al 10% v/v no son citotóxicas (presentan valores de viabilidadcelular superiores al 70% y según la norma cuando el porcentaje de viabilidad celulares superior a este valor el producto no es citotóxico). Cabe resaltar, que aconcentraciones del extracto entre 0,05% hasta 4% v/v hay un aumento en el porcentajede viabilidad con respecto al control (células cultivadas en medio de cultivo DMEM sinextracto vegetal), lo cual sugiere que el extracto induce proliferación celular (Veranexo 1). En la etapa preliminar de optimización de la microestructura de los soportesde colágeno, se están desarrollando y estandarizando las metodologías requeridas parala elaboración de soportes mediante la agregación y fusión parcial de micropartículasde colágeno-gelatina, que además de servir de microambiente para la migración,adhesión y proliferación celular, sirvan de reservorios que controlen la liberación delos metabolitos activos que componen los extractos de Aloe vera. En el anexo 2 seobservan los soportes mediante la agregación y fusión parcial de micropartículas decolágeno-gelatina, Como se aprecia en las imágenes, estos soportes presentan




estructura de poro abierto. EL proceso de elaboración de estos soportes consta de tresetapas: elaboración de micropartículas, agregación de micropartículas y fusión parcialde las partículas mediante el entrecruzamiento con glutaraldehído. Con éstametodología se obtienen soportes con diferente tamaño de poro, interconectividad yforma (Kucharska, Walenko et al. 2010). La etapa final de entrecruzamiento conglutaraldehido mejora y modula las propiedades mecánicas y de biodegradación de lossoportes, por tal motivo, en la siguiente fase se estudiará el efecto de laconcentración de glutaraldehido y el tiempo de entrecruzamiento sobre la morfologíadel soporte, propiedades mecánicas y estabilidad a la degradación enzimática (Enpresencia de colagenasa).

13. CONCLUSIONES

Se estableció la concentración de Aloe vera que permite obtener el porcentaje deviabilidad aceptado por la ISO 10993-5. Del mismo modo, se determinaron lasconcentraciones en que el extracto favorece la proliferación de fibroblastos L929.Adicionalmente, se ha avanzado en la estandarización del procedimiento para laelaboración de soportes a partir de la agregación y fusión parcial de micropartículasde colágeno-gelatina, identificando los pasos críticos de manufactura que permiten laobtención de soportes con las características microestructurales adecuadas para suaplicación en ingeniería de tejidos.

14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS




Kucharska, M., K. Walenko, B. Butruk, T. Brynk, M. Heljak and T. Ciach (2010). "Fabrication and characterization of chitosan microspheres agglomerated scaffolds for bone tissue engineering." Materials Letters 64(9): 1059-1062.

15. LISTA DE ANEXOSAnexo1: Ensayos de citotoxidad del extractos de Aloe vera.Anexo 2. Imágenes de los soportes desarrollados por aglomeración de partículas.Anexo 3. Hoja de vida académica estudiante de Doctorado.Anexo 4. Hoja de vida académica estudiante de Maestría.Anexo 5. Dossier del curso Internacional en Ingeniería de Tejidos, Medicina Regenerativa y Nuevos Materiales para el Diseño de Sistemas de Liberación en Enfermedades de Alto Impacto Socioeconómico.Anexo 6. Informe financiero.

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